CN103930391A - 通过经改良的重组菌株来生产异丙醇 - Google Patents

通过经改良的重组菌株来生产异丙醇 Download PDF

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Abstract

本发明涉及表达载体，其包含：编码形成具有使得能够将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶促活性的多肽复合物的多肽的核酸，任选地，至少一种编码具有使得能够将乙酰乙酸转化为丙酮的酶促活性的多肽的核酸，和至少一种编码具有使得能够将丙酮转化为异丙醇的酶促活性的多肽的核酸，所述核酸的表达由位于上述核酸上游的单一组成型启动子控制。

Description

通过经改良的重组菌株来生产异丙醇
COLLAS Florent;CONTRERAS-LOPEZ Ana;MARCHAL Rémy和CLEMENT Benjamin。
本发明涉及通过经改良的重组菌株来生产异丙醇的方法。
文献研究
异丙醇（也称为2-丙醇，或异丙基醇）主要用作用于制备墨水和表面活性剂的溶剂。它的其他应用涉及羧甲基纤维素（CMC）的防腐剂和溶剂的特性。异丙醇还被用于美容学基质的生产，用作杀虫剂的溶剂，或者在有机合成中用作材料来源。作为参考情况，可以提及在1990年在美国异丙醇的产量升高至四千五百万吨（Papa A,2005）。
现今，异丙醇通过本质上化学的方法来生产，所述方法在于按照直接途径或间接途径的丙烯的水合。间接途径采用两个步骤。在第一个步骤中，产生硫酸单异丙酯和硫酸二异丙酯的混合物，其在第二个步骤中被水解为异丙醇。直接途径采用在酸性“固化床”催化剂上在高压和低温下的丙烯的水合（Logsdon J.E.和Loke R.A.,2001）。
从1942至1958年，在台湾已经通过发酵途径来生产异丙醇（Rogers等人,2006）。发酵的底物为甘薯、木薯、小麦淀粉，然而微生物为野生菌株。现今，该异丙醇生产方法已经不再在工业上使用了。这是因为，用野生菌株所获得的低产量（对于拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）而言，2至3g/L的异丙醇）不允许建立经济上可行的方法。正如ABE（丙酮、丁醇、乙醇）溶剂生成发酵那样，IBE（异丙醇、丁醇、乙醇）发酵在20世纪60年代开始时就已经随着石油化学工业的发展而被放弃了。
由于生态学和经济学的考虑，对于通过微生物发酵来生产异丙醇的研究近些年来已经引起兴趣的恢复。产生异丙醇的发酵以IBE发酵的名称而为人所知。它与另一种产生溶剂的发酵（ABE发酵）的不同之处在于，它唯独地或大部分地通过消耗丙酮来产生异丙醇。产生溶剂的菌株属于梭菌属（Clostridium）。它们被再分类为四个物种：丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）、拜氏梭菌（C.beijerinckii）、金黄丁酸梭菌（C.aurantibutyricum）、糖多丁基丙酮梭菌（C.saccharoperbutylacetonicum）（Keis等人,2001）。
丙酮丁醇梭菌是在ABE发酵中经常使用的菌株。因此，用丙酮丁醇梭菌进行的发酵的主要产物为丙酮、乙醇和丁醇。异丙醇不由丙酮丁醇梭菌的野生菌株产生。异丙醇是从前命名为“丁酸梭菌（Clostridium butylicum）”的微生物的特征性产物（Osburn等人,1937；Langlykke等人,1937）。1983年，George等人证明，丁酸梭菌与拜氏梭菌类似。因此，在目前的分类中，拜氏梭菌这一物种包含从前被分类为丁酸梭菌的菌株。然而，不是所有的拜氏梭菌菌株都产生异丙醇。例如，拜氏梭菌菌株NRRL B593产生异丙醇，而拜氏梭菌菌株NRRL B592不产生异丙醇。
在拜氏梭菌中异丙醇的生物合成途径包括下列步骤：
(i)两分子的乙酰-CoA通过乙酰-CoA转移酶（EC2.3.1.9）（也称为硫解酶（Thl））而缩合成一分子的乙酰乙酰-CoA；
(ii)乙酰-CoA的CoA通过乙酰乙酰-CoA转移酶（Ca_CtfAB）（EC2.8.3.9）而转移至乙酸或丁酸，从而产生乙酰乙酸；
(iii)然后，乙酰乙酸通过乙酸脱羧酶（Ca_Adc）（EC4.1.1.4）而转化为丙酮和CO2；
(iv)最后，丙酮通过仲醇脱氢酶（Cb_s-Adh）（EC1.1.1.2）而转化为异丙醇。
在拜氏梭菌NRRL B593和拜氏梭菌NRRL B592（其分别产生和不产生异丙醇）中的酶促活性的比较显示，分泌异丙醇的能力与仲醇脱氢酶Cb_s-Adh的活性相关（Yan等人,1988）。已经从拜氏梭菌NRRL B593的无细胞提取物中纯化出了负责的酶（Ismaiel等人,1993）。为了比较目的，还纯化了拜氏梭菌NEST255的脱氢酶。拜氏梭菌菌株NRRL B593和拜氏梭菌菌株NEST255的仲醇脱氢酶依赖于NADP。在体外，它们如所预期的那样使用仲醇（异丙醇），但也使用伯醇，尤其是丁醇，然而具有较低的活性。酶的动力学研究已经确认，仲醇脱氢酶的生理学底物确实是丙酮而不是异丙醇（Chen等人,1995）。拜氏梭菌的仲醇脱氢酶（Cb-s-Adh）明显地不同于来自相同微生物的伯醇脱氢酶，后者在体内将丁醛还原为丁醇。
编码Cb_s-Adh的基因已被测序（Petretz等人,1997）。已经通过X射线测定了该酶的结构。Cb_s-Adh是一种含锌的同型四聚体酶，其包含四条具有351个氨基酸的多肽链。每个单体由两个结构域组成。第一个结构域（残基154-294）允许辅因子的结合，而第二个结构域整合了催化结构域（残基1-153和295-351）（Korkhin等人,1998；Goihberg等人,2010）。Cb_s-Adh以75%的序列同一性接近来自嗜热细菌布氏热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter brockii）的其同源物（Tb_s-Adh）。在特性方面，这两种酶由于其热稳定性而是不同的（Korkin等人,1999）。在Cb_s-Adh中，在氨基酸序列中将Gln100替换为Pro100显著提高了Cb_s-Adh的热稳定性（Goihberg等人,2007），其原本是较低的。
用拜氏梭菌的野生菌株，异丙醇的最大生产能力是相对低的（2至3g/L）（Chen等人,1986）。专利申请US2009/246842描述了一种在用表达载体进行转化的大肠杆菌（E.coli）菌株中生产异丙醇的方法，所述表达载体包含编码丙酮丁醇梭菌的乙酰-CoA转移酶的基因（Ca_thl）、编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA转移酶的基因（Ca_CtfAB）、编码丙酮丁醇梭菌的乙酸脱羧酶的基因（Ca_adc）和编码拜氏梭菌的仲醇脱氢酶的基因（Cb_s-adh）。在该载体中，仲醇脱氢酶的表达处于可被IPTG诱导的启动子PLlacO-1的控制之下，而基因Ca_thl、Ca_CtfAB和Ca_adc的表达处于丙酮丁醇梭菌的基因Ca_thl的天然启动子的控制之下。该方法的缺点是，需要使用富含营养（尤其是酵母提取物（5g.L-1））的生产培养基，以及诱导物，例如异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷或IPTG。此外，仲醇脱氢酶仅当在培养基中添加IPTG时才表达，这延迟了异丙醇的产生并限制了发酵的生产率。
国际申请WO11/037414描述了另一种能够生产异丙醇的方法。该方法在于使用用表达载体进行转化的梭菌属的微生物，所述表达载体包含编码丙酮丁醇梭菌的乙酸脱羧酶的基因（Ca_adc）、编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA转移酶的基因（Ca_CtfAB）和编码拜氏梭菌的仲醇脱氢酶的基因（Cb_s-adh）。该载体需要两个启动子：仅控制仲醇脱氢酶的表达的组成型启动子Ca_thlp，和控制蛋白质Ca_CtfAB和Ca_Adc的表达的诱导型启动子Ca_adcp。鉴于蛋白质Ca_CtfAB和Ca_Adc仅在溶剂生成阶段期间表达，因而仲醇脱氢酶在该阶段之前不具有底物（丙酮）。因此，异丙醇（发酵的终产物）仅在培养15小时后产生，这限制了用该生产方法的异丙醇的生产率。
因此，总是存在着对于开发出具有更好的生产率和更好的产率的异丙醇生产方法的需要。
本发明的目标是纠正现有技术的缺点，并提出具有更好的生产率和更好的产率的通过发酵来生产异丙醇的方法。
发明描述
发明人发现，有利地，可能通过使用其中引入了载体的重组微生物来生产异丙醇，所述载体包含编码将乙酰乙酰-CoA引向丙酮的代谢途径的酶（即CoA转移酶亚基A和B以及乙酰乙酸脱羧酶）的基因，以及编码拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脱氢酶的基因。
本发明的第一个目标旨在提供表达载体，其包含：
-编码形成具有使得能够将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶促活性的多肽复合物的多肽的核酸，
-至少一种编码具有使得能够将丙酮转化为异丙醇的酶促活性的多肽的核酸，和
-任选地，至少一种编码具有使得能够将乙酰乙酸转化为丙酮的酶促活性的多肽的核酸，
所述核酸的表达由位于上述核酸上游的单一组成型启动子控制。
“表达载体”是指环形的外源DNA分子，其能够自主地和不依赖于宿主细胞染色体DNA地进行复制，这使得能够借助于宿主细胞来进行包含在所述DNA分子中的基因的转录和翻译。
在本发明中，术语“载体”和术语“质粒”可以互相替代。
“启动子”是指这样的DNA区域，在该DNA区域处RNA聚合酶进行结合并且该DNA区域使该酶朝向基因转录将会开始的位点方向。
所述启动子可以是组成型的或诱导型的。
“组成型启动子”是指允许相关基因的连续转录的不受调节的启动子。
与组成型启动子相反，诱导型启动子允许响应于特定化合物的存在（例如，IPTG的存在）或者确定的外部条件（例如，高温）而发生的相关基因的转录。
“位于...核酸上游的...启动子”是指位于所述核酸的5’末端前面的启动子。
乙酰乙酰-CoA至乙酰乙酸的转化通过乙酰乙酰-CoA转移酶来进行。在大部分微生物中，该酶由两个被两个不同基因编码的亚基形成。因此，大肠杆菌的乙酰乙酰-CoA转移酶（Ato AD）由亚基A和D形成，而丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA转移酶（Ca_CtfAB）由亚基A和B构成。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及载体，其包含：
-编码乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸（Ca_CtfAB），和
-至少一种编码拜氏梭菌的仲醇脱氢酶的基因（Cb_s-adh）的核酸；和
-任选地，至少一种编码乙酰乙酸脱羧酶的基因（Ca_adc）的核酸。
拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脱氢酶基因的表达使得能够确保丙酮至异丙醇的转化以及异丙醇的分泌。表达该酶的重组菌株可以使几乎所有的丙酮和乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）分别还原为异丙醇和2,3-丁二醇。尽管已知拜氏梭菌菌株NRRL B593的酶Cb_s-Adh可以还原丙酮和丁酮，但是该酶对于乙偶姻的活性由发明人首次发现。
在一个更特别的实施方案中，本发明涉及载体，其包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:2具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，和
-任选地，由序列SEQ ID NO:4所示的核酸，或与序列SEQ IDNO:4具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸。
由序列SEQ ID NO:1所示的核酸编码丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰乙酰-CoA转移酶的亚基A（Ca_ctfA）。
由序列SEQ ID NO:2所示的核酸编码丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰乙酰-CoA转移酶的亚基B（Ca_ctfB）。
由序列SEQ ID NO:3所示的核酸编码拜氏梭菌的仲醇脱氢酶（Cb_s-adh）。
由序列SEQ ID NO:4所示的核酸编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脱羧酶（Ca_adc）。
两个肽序列之间或两个核酸序列之间的同一性百分比可以根据下式来进行计算：
相同残基的数目×100
最短序列的残基的数目。
上述核酸（或基因）的组合形成“ipa”操纵子。上述ipa操纵子的基因的表达由位于上述核酸（或基因）上游的单一组成型启动子控制。仅控制ipa操纵子的表达的组成型启动子准许ipa操纵子的组成性表达，这允许包含本发明的载体的重组菌株从发酵的头几个小时起就产生异丙醇。
由于导致异丙醇产生的基因的过早表达，溶剂生成的机制在包含根据本发明的载体的重组菌株中比在野生菌株中更早地被发动。因此，发酵的两个阶段，即酸生成（acidogenesis）和溶剂生成（solventogenesis），在包含根据本发明的载体的重组菌株中同时发生，这使得能够将发酵持续时间减少至少20小时。
在本发明的载体的构建中所使用的组成型启动子可以是由序列SEQ ID NO:5所示的编码丙酮丁醇梭菌ATCC824的硫解酶的基因的启动子，或由序列SEQ ID NO:6所示的丙酮丁醇梭菌ATCC824的磷酸转丁酰酶的基因的启动子。
在一个特别的实施方案中，本发明的表达载体包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA转移酶的亚基A，和
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:2具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA转移酶的亚基B，和
-任选地，由序列SEQ ID NO:4所示的核酸，或与序列SEQ IDNO:4具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脱羧酶，和
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码拜氏梭菌的仲醇脱氢酶，
所述核酸的表达由位于上述核酸上游的单一组成型启动子控制，所述启动子选自由序列SEQ ID NO:5所示的启动子（thl启动子）和由序列SEQ ID NO:6所示的启动子。
在一个特别的实施方案中，本发明的载体包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:4所示的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:5所示的启动子。
该被命名为pFC007的载体，以从5’末端至3’末端的顺序，包含拜氏梭菌NRRL B593的编码仲醇脱氢酶的基因（Cb_s-adh）以及丙酮丁醇梭菌ATCC824的编码乙酰乙酸脱羧酶的基因（Ca_adc）和编码辅酶A转移酶的亚基A和B的基因（Ca_CtfAB）。载体pFC007允许在唯一的组成型启动子（丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰-CoA转移酶的基因（硫解酶，Ca_thl）的启动子）的控制之下“ipa7”操纵子的基因的过表达。因此，其各个酶（Cb_s-Adh、Ca_Adc和Ca_CtfAB）的产生从发酵的头几个小时起（大约4和10小时后）就开始了。
在另一个特别的实施方案中，本发明的载体包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:5所示的启动子。
该被命名为pFC006的载体包含拜氏梭菌NRRL B593（DSMZ6423）的编码仲醇脱氢酶的基因（Cb_s-adh）以及丙酮丁醇梭菌ATCC824的编码辅酶A转移酶的亚基A和B的基因（Ca_CtfAB）。这些基因处于唯一的丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酰-CoA转移酶基因（或者硫解酶或Ca_thl）的组成型启动子的控制之下。
根据本发明的表达载体还可以包含任何其他对于上面提及的酶的转录和翻译来说必需的元件，例如RBS（核糖体结合位点）区，一个或多个选择基因。
RBS区允许核糖体在基因的起始密码子之前结合至信使RNA分子。在本发明的载体中所使用的RBS区的序列可以是任何的本领域技术人员已知的原核生物来源的RBS区的序列。
在根据本发明的载体中选择基因的存在使得能够选择出经成功转化的微生物。在载体中的选择基因允许包含所述基因的微生物在某些特定条件下存活，或者导致可容易地定位的分子的存在。在本发明的载体中使用的选择基因可以是本领域技术人员已知的任何选择基因，尤其是允许微生物抵抗抗生素的基因，例如Amp或ErmB基因。
所述表达载体还包含复制起点，其允许在宿主微生物中所述载体的复制的起始。在本发明的载体中使用的复制起点可以是本领域技术人员已知的任何起点。
本发明还旨在提供用于以更好的生产率和更好的产率来生产异丙醇的重组微生物。
所述微生物包含有在本发明中所描述的表达载体。
特别地，所述微生物包含载体，所述载体包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:2具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，和
-任选地，由序列SEQ ID NO:4所示的核酸，或与序列SEQ IDNO:4具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，
所述核酸的表达由位于上述核酸上游的单一组成型启动子控制，所述启动子选自由序列SEQ ID NO:5所示的启动子（thl启动子）和由序列SEQ ID NO:6所示的启动子。
在一个有利的实施方案中，所述微生物包含载体pFC007。
在另一个有利的实施方案中，所述微生物包含载体pFC006。
本发明的所述微生物可以选自梭菌属（Clostridium）的细菌，例如丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）、拜氏梭菌（C.beijerinckii）、糖多丁基丙酮梭菌（C.saccharoperbutylacetonicum）、糖丁醇梭菌（C.saccharobutylicum）；芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌，例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；或肠杆菌，例如大肠杆菌（E.coli）。
在一个特别的实施方案中，根据本发明的微生物为丙酮丁醇梭菌。
在一个更特别的实施方案中，根据本发明的微生物为丙酮丁醇梭菌菌株ATCC824。
在一个特别有利的实施方案中，本发明涉及包含载体pFC007的丙酮丁醇梭菌ATCC824的重组菌株。该重组菌株被命名为ATCC824(pFC007)。
在另一个特别有利的实施方案中，本发明涉及包含载体pFC006的丙酮丁醇梭菌ATCC824的重组菌株。该重组菌株被命名为ATCC824(pFC006)。
对于所述两种重组菌株（ATCC824(pFC007)和ATCC824(pFC006)），从培养的前10个小时起就可以检测到异丙醇的产生，而在丙酮丁醇梭菌ATCC824的野生菌株或者其中插入了仅包含编码拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脱氢酶的基因（Cb_s-adh）的载体的丙酮丁醇梭菌ATCC824的重组菌株中，痕量的溶剂（ABE）都无法检测到。
本发明的目标还在于提供以更好的生产率和更好的产率来生产异丙醇和/或D-和L-2,3-丁二醇的方法。
所述方法至少包括下列步骤：
-在允许产生异丙醇的条件（例如，由Gapes等人（Gapes,1996）所描述的培养基）下，在包含至少一种碳源和至少一种氮源的培养基中，培养根据本发明的微生物，
-从培养基中回收异丙醇和/或D-和L-2,3-丁二醇。
所述培养基是本领域技术人员已知的。
所述碳源可以为淀粉、葡萄糖、木糖、木质素纤维素水解物。
所述氮源可以为氨、酵母提取物、蛋白胨、尿素。
梭菌属、芽孢杆菌属或大肠杆菌细菌的微生物的培养条件是本领域技术人员已知的。
从培养基中异丙醇和/或D-和L-2,3-丁二醇的回收通过蒸馏来进行（Mujiburohman等人,2006）。
下面给出的实施例和附图使得能够更详细地说明本发明。然而，本发明的范围决不应当被限制于这些实施例或附图。
附图
图1：该图图解说明了从质粒pMTL500E开始的载体pFC007的构建。
图2：该图呈现了质粒pMTL500E的限制位点。
图3：该图图解说明了载体pFC007的限制图谱。
实施例
材料和方法
材料
在表1中呈现了在分子生物学操作（质粒载体的构建）期间所使用的试剂盒。
表1：在分子生物学操作期间所使用的试剂盒和材料
在本发明的实施例中所使用的菌株为：
●丙酮丁醇梭菌ATCC824，来自ATCC保藏，
●拜氏梭菌NRRL B593，来自DSMZ保藏（编号6423），
●大肠杆菌XL1bleu，用于质粒的克隆和维持，
●大肠杆菌DH10B（PAN2），用于质粒的甲基化。
溶剂（丙酮、乙偶姻、异丙醇、丁醇、丁二醇）和羧酸（丁酸和乙酸）的含量测定
将发酵样品（2mL）在20000g下离心5分钟，并将上清液用于发酵代谢物（葡萄糖、乙酸和丁酸、2,3-丁二醇、丙酮、乙醇、异丙醇和丁醇）的含量测定。对于每个样品，添加等体积的包含内标（30mM的4-甲基戊酸）的酸溶液（0.5mM H2SO4），然后将该混合物均质化并过滤（0.2μm,Whatman）。然后，在Shodex lonpack KC-811柱（RP）中注射并分析10μL的样品。在柱的出口处检测到所测定的化合物，这借助于两种检测器来进行：折光计（Waters2487），和分光光度计（Waters2487），其测量在210nm处的吸光度。所使用的洗脱剂为3mM的硫酸溶液，洗脱剂的流速为1mL/分钟，并且柱温固定在85℃。
载体的构建
在本发明的实施例中所使用或构建的载体的遗传结构概括在下面的表2中。
表2：载体的遗传结构
ermB：红霉素抗性基因；ampR：氨苄青霉素抗性基因；ttc：四环素抗性基因；Ca：该前缀表明该基因源自丙酮丁醇梭菌ATCC824；Cb：该前缀表明该基因源自拜氏梭菌NRRL B593；Ca_thl：硫解酶基因；Cb_s-adh：拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脱氢酶基因；Ca_adc：丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙酸脱羧酶基因；Ca_CtfAB：丙酮丁醇梭菌ATCC824的CoA转移酶基因。
从质粒pMTL500E（图2）开始来构建载体pFC007需要至少3个步骤（图1）。
步骤1：载体pFC002的构建
从质粒pMTL500E开始来构建载体pFC002。将质粒pMTL500E用限制酶sphI和xhoI在lacZ基因上进行消化。然后，使消化产物去磷酸化。通过PCR技术，分别在启动子Pthl的DNA序列的5’和3’处添加限制位点sphI和apaI，其中使用源自丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA（Nolling,J.等人,2001）（NCBI参考号：NC_003030.1（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_003030））的引物Ca_thlp-for和Ca_thlp_rev（表3）。通过PCR技术，分别在拜氏梭菌NRRL B593的基因Cb_s-adh的DNA序列的5’和3’处添加限制位点apaI和xhoI，其中使用引物Cb_s-adh-for和Cb_s-adh-rev（表3）。
将如此获得的PCR产物用限制酶apaI和xhoI进行消化。将来自PCR的经消化的质粒、经消化的启动子和经消化的基因连接在一起，从而产生称为pFC002的载体（图2）。该载体在大肠杆菌菌株XL1blue中进行维持和倍增。
步骤2：从质粒pFC002开始来构建载体pFC006
用限制酶xhoI和XbaI消化载体pFC002。从丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA开始一起扩增出编码Ca_CtfAB的基因，其中使用引物Ca_CtfAB for和Ca_CtfAB rev（表3）。用限制酶xhoI和speI消化PCR产物。将经消化的载体pFC002和包含基因Ca_CtfAB的经消化的DNA片段连接在一起。将如此获得的载体命名为pFC006（图1）。所述载体在大肠杆菌菌株XL1blue中进行维持和倍增。
步骤3：从质粒pFC006开始来构建载体pFC007
用限制酶xhoI和XbaI消化载体pFC006。从丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA开始扩增出编码Ca_Adc的基因，其中使用引物Ca_adc for和Ca_adc rev（表3）。用酶xhoI和SpeI消化PCR产物。将经消化的载体pFC006和包含基因Ca_adc的经消化的DNA片段连接在一起。将如此获得的载体命名为pFC007（图1和3）。所述载体在大肠杆菌菌株XL1blue中进行维持和倍增。
表3：用于构建ipa操纵子的引物
给所添加的限制位点（sphI、apaI、xhoI、SalI、xbaI和speI）加下划线。
核糖体结合位点以粗体标明。
前缀“Ca”表示，所述引物被用在丙酮丁醇梭菌的基因组DNA上。
前缀“Cb”表示，所述引物被用在拜氏梭菌NRRL B593的基因组DNA上。
通过类似的方法，可以将编码Ca_Adc的基因插入到载体pFC002中，以获得载体pFC005。
按照类似的方法，然后可以将编码Ca_CtfAB的基因插入到载体pFC005中，以获得载体pFC008。
丙酮丁醇梭菌的转化
首先，通过与质粒pAN1一起共转化到大肠杆菌菌株DH10B中来分别使载体pFC002、pFC006和pFC007甲基化。
然后，按照由Oultram(1988)所描述的实验方案，分别用经甲基化的载体pFC002、pFC006和pFC007转化丙酮丁醇梭菌ATCC824的野生菌株。将用pFC002、pFC006和pFC007转化的丙酮丁醇梭菌ATCC824的菌株分别命名为ATCC824(pFC002)、ATCC824(pFC006)和ATCC824(pFC007)。
重组菌株的遗传表征
为了确认在转化后在丙酮丁醇梭菌菌株ATCC824中上面所描述的载体之一的存在，用不同的引物对来进行特异于所述质粒的PCR。表4中所显示的结果确认了在所分析的重组菌株中载体的存在。
表4：通过PCR来鉴定在丙酮丁醇梭菌ATCC824中的
载体pFC005、pFC006或pFC007
重组菌株的发酵
在包含90g/L的葡萄糖的由Gapes等人（GAPES等人,1996）所描述的培养基中，用野生菌株，即拜氏梭菌NRRL B593和丙酮丁醇梭菌ATCC824，以及重组菌株，即分别用载体pFC006和pFC007转化的丙酮丁醇梭菌ATCC824，来进行发酵。发酵结果呈现在表5中。
表5：通过拜氏梭菌NRRL B593和丙酮丁醇梭菌ATCC824的野生菌株和重组菌株的对于葡萄糖的最终性能
*达到溶剂的最终产量的95%所需的时间
通过丙酮丁醇梭菌野生菌株ATCC824来进行葡萄糖的发酵
为了达到溶剂的最终产量的95%，需要大约50小时的发酵。在接种11小时后才能够检测到溶剂（丁醇）的存在。丙酮丁醇梭菌野生菌株ATCC824既不产生异丙醇也不产生2,3-丁二醇。丙酮的产量和乙偶姻的产量分别达到5.7g/L和0.6g/L。丁醇和乙醇的最终产量分别达到9.0g/L和1.3g/L。
通过丙酮丁醇梭菌重组菌株ATCC824(pFC002)来进行葡萄糖的发酵
丙酮丁醇梭菌ATCC824(pFC002)是已接受了载体pFC002的重组菌株。载体pFC002允许在其宿主中进行编码酶Cb_s-Adh的拜氏梭菌NRRL B593的仲醇脱氢酶基因（Cb_s-adh）的组成性表达。在重组菌株ATCC824(pFC002)中Cb_s-Adh的产生使得能够分别将丙酮和乙偶姻氢化为异丙醇和2,3-丁二醇。乙偶姻天然地由丙酮丁醇梭菌ATCC824的野生菌株产生。然而，该重组菌株不能够产生比拜氏梭菌NRRL B593的野生菌株更多的异丙醇。此外，菌株ATCC824(pFC002)具有不太好的发酵性能，因此菌株ATCC824(pFC002)的异丙醇和通常地溶剂的产量比丙酮丁醇梭菌ATCC824的野生菌株的丙酮产量低25%和比其溶剂产量低20%。在发酵结束时，乙酸和丁酸仍然是主要产物。酸的大量产生引起溶剂产率的下降，因为一部分糖类被用于产生酸了。
通过丙酮丁醇梭菌重组菌株ATCC824(pFC006)来进行葡萄糖的发酵
像重组菌株ATCC824(pFC002)那样，重组菌株ATCC824(pFC006)产生异丙醇和2,3-丁二醇，而不是丙酮和乙偶姻。
然而，与关于重组菌株ATCC824(pFC002)的产量谱相反，重组菌株ATCC824(pFC006)可以在更短的时间段内达到高水平的溶剂产量。对于该菌株，达到最终产量的95%所需的时间为大约30小时。丁酸的消耗比野生菌株和重组菌株ATCC824(pFC002)更有效，但仍然是不完全的。在该菌株中溶剂的产生比对于野生菌株和对于重组菌株ATCC824(pFC002)来说的更早地开始。从菌株ATCC824(pFC006)的培养的前10个小时起就可以检测到异丙醇的产生，而在野生菌株中或在菌株ATCC824(pFC002)中，痕量的溶剂都还仍然无法检测到。
此外，在菌株ATCC824(pFC006)中乙酸的掺入和丁酸的掺入两者相对于在野生菌株中而言均得到了改善，这使得能够具有比野生菌株的丙酮产率更好的异丙醇产率。对于菌株ATCC824(pFC007)，异丙醇、丁醇和乙醇的各自滴度为7.3g/L、11.8g/L和1.37g/L，换言之，比野生菌株高28%、31%和6%。生产率从野生菌株的0.41g/L.h增加至菌株ATCC824(pFC007)的0.69g/L.h。
菌株ATCC824(pFC006)产生两倍于菌株ATCC824(pFC002)的2,3-丁二醇，该2,3-丁二醇的产量增加可以归因于整体经改善的代谢流。
已证实，酸掺入的改善允许菌株ATCC824(pFC006)产生更少的酸并增加其溶剂产量。
然而，尽管酶Ca_CtfAB过表达，但乙酸的最终产量在菌株ATCC824(pFC006)中比在野生菌株中更高，这可能归因于由于整体经改善的代谢流而产生的高的酸产量。
通过用pFC007转化的丙酮丁醇梭菌ATCC824的重组菌株来进行葡萄糖的发酵
菌株ATCC824(pFC007)具有与菌株ATCC824(pFC006)相似的发酵谱。用于达到溶剂的最终产量的95%的时间少于30小时。酸生成正常开始。在菌株ATCC824(pFC007)中溶剂的产生在指数期期间开始，并且比在野生菌株中更早。在接种后仅4小时，就可以在菌株ATCC824(pFC007)的培养基中检测到异丙醇的存在，而在野生菌株的培养基中还仍然无法检测到丙酮。
此外，在菌株ATCC824(pFC007)中乙酸的掺入和丁酸的掺入两者相对于在菌株ATCC824(pFC006)中而言均得到了改善，这使得能够具有相对于菌株ATCC824(pFC006)或前面所描述的其他菌株而言更好的异丙醇产率。在菌株ATCC824(pFC007)中，异丙醇、丁醇和乙醇的各自滴度为8.4g/L、13.0g/L和1.71g/L，换言之，比野生菌株高46%、44%和36%。生产率从野生菌株的0.41g/L.h增加至菌株ATCC824(pFC007)的0.81g/L.h。
菌株ATCC824(pFC007)的2,3-丁二醇的产量与菌株ATCC824(pFC006)相似。如对于菌株ATCC824(pFC006)那样，该2,3-丁二醇的产量增加可以归因于整体经改善的代谢流。
通过拜氏梭菌野生菌株NRRL B593来进行葡萄糖的发酵
在与野生或重组的丙酮丁醇梭菌ATCC824菌株相同的条件下培养拜氏梭菌野生菌株NRRL B593。
在发酵34小时后，拜氏梭菌的野生菌株达到溶剂的最终产量的95%。相反地，该菌株的最终产量对于异丙醇而言仅为4.5g/L，对于丁醇而言仅为8.1g/L，和对于乙醇而言仅为0.1g/L，这比对于丙酮丁醇梭菌野生菌株ATCC824和对于重组的丙酮丁醇梭菌ATCC824菌株（菌株ATCC824(pFC006)和ATCC824(pFC007)）来说的更低。
正如所预期的，野生的拜氏梭菌NRRL B593菌株既不产生乙偶姻也不产生丁二醇。
结论
重组菌株ATCC824(pFC006)和ATCC824(pFC007)两者均具有比丙酮丁醇梭菌野生菌株ATCC824或拜氏梭菌野生菌株NRRL B593更好的溶剂生产率。用菌株ATCC824(pFC006)和用菌株ATCC824(pFC007)，溶剂生产率分别增加至1.8倍和2倍。这些结果显示，这两种菌株可以在比野生菌株更短的时间段内产生更多的溶剂。此外，菌株ATCC824(pFC007)显示出对于单阶段连续培养（单个发酵罐）的良好能力。所观察到的异丙醇、丁醇和乙醇的产量是对于拜氏梭菌菌株NRRL B593（Shrikant A.,2011）和丙酮丁醇梭菌菌株ATCC824(pFC007)（Godin等人,1990）已知的那些。
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Claims (9)

1.表达载体，其包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:1具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA转移酶的亚基A，和
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:2具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酰-CoA转移酶的亚基B，和
-任选地，由序列SEQ ID NO:4所示的核酸，或与序列SEQ IDNO:4具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码丙酮丁醇梭菌的乙酰乙酸脱羧酶，和
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，或与序列SEQ ID NO:3具有至少85%，特别地90%，尤其是95%的序列同一性的核酸，其编码拜氏梭菌的仲醇脱氢酶，
所述核酸的表达由位于上述核酸上游的单一组成型启动子控制，所述启动子选自由序列SEQ ID NO:5所示的启动子（thl启动子）和由序列SEQ ID NO:6所示的启动子。
2.根据权利要求1的表达载体，其特征在于，所述载体包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:4所示的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:5所示的启动子。
3.根据权利要求1的表达载体，其特征在于，所述载体包含：
-由序列SEQ ID NO:1所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:2所示的核酸，
-由序列SEQ ID NO:3所示的核酸，和
-由序列SEQ ID NO:5所示的启动子。
4.微生物，其包含根据权利要求1至3之一的表达载体。
5.根据权利要求4的微生物，其特征在于，所述微生物选自梭菌属细菌、芽孢杆菌属细菌或肠杆菌。
6.根据权利要求5的微生物，其特征在于，所述微生物选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖多丁基丙酮梭菌、糖丁醇梭菌。
7.根据权利要求5的微生物，其特征在于，所述微生物为枯草芽孢杆菌。
8.根据权利要求5的微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌。
9.生产异丙醇和/或D-和L-2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述方法包括：
-允许产生异丙醇的条件下，在含至少一种碳源和至少一种氮源的培养基中，培养根据权利要求4至8中任一项的微生物，
-从培养基中回收异丙醇和/或D-和L-2,3-丁二醇。
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