CN112574926B - 一种利用凝结芽孢杆菌制备含羟基羧酸及其盐的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用凝结芽孢杆菌制备含羟基羧酸及其盐的发酵培养基及发酵方法，所述发酵培养基中含有有机氮源和无机氮源，所述有机氮源和无机氮源的质量比为1:(1‑6)，优选1:(1.3‑2.5)。本发明提供的发酵培养基有效地控制了菌液的OD值，同时通过控制碳源的浓度实现了高转化率，达到了高OD值和高转化率之间的平衡且不会抑制发酵产物的产量，因此，利用本发明提供的发酵培养基制备含羟基羧酸及其盐，生产速率快，转化率高，最后得到的发酵液中产物浓度高，光学纯度高。

Description

一种利用凝结芽孢杆菌制备含羟基羧酸及其盐的发酵培养基 及发酵方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程技术领域，涉及一种利用凝结芽孢杆菌制备含羟基羧酸及其盐的发酵培养基及发酵方法。

背景技术

乳酸(Lactic Acid)，又名2-羟基丙酸，分子式是C₃H₆O₃，它是一种含有羟基的羧酸，具有多种用途，乳酸及其盐应用于食品、医药、化工等领域。

其中，乳酸钠应用于食品的保鲜、保湿、增香及制药原料，也可作为医药用于解除因腹泻脱水、糖尿病、肾炎等症引起的的酸中毒，也用作调味品，酪蛋白塑料的增塑剂、防冻剂、保湿剂、甘油的代用品、醇类防冻剂的防蚀剂；乳酸钾作为调味剂、乳化剂、吸湿剂、pH调节剂、增香剂、缓冲剂用于果酱、果冻及冰淇淋等；乳酸镁、乳酸钙作为食品添加剂广泛应用于食品、饮料、奶制品、面粉、营养液和制药等；乳酸铵用作饲料添加剂广泛应用于食品、饮料、乳制品、食盐、营养液、药品等。

同时以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物聚乳酸(polylactide,polylacticacid,PLA)是一种新型的生物降解材料。聚乳酸具有良好的机械物理性能、生物相容性、透气性、抗菌性、阻燃性及可降解性，因此可应用于汽车制造领域、纺织领域、一次性用品领域及生物医药领域等。

目前，乳酸生产方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法；作为大规模高效生产的主要方法，微生物发酵法不仅可以利用玉米、木薯等淀粉质物质水解产物，同时也可以利用木质纤维素等可再生能源分解所得到的碳水化合物作为主要原料，生产成本低，反应条件温和。

目前大规模乳酸发酵采用分批发酵，存在设备利用率低、发酵周期长、生产速率低等问题；部分半连续发酵及少数连续发酵模式随着连续发酵批次增加导致光学纯度低，从而影响聚乳酸的生产。同时，微生物生长需要一定的调整期，调整期过长是导致发酵周期长、生产速率低的一个重要因素。发酵液中碳水化合物的浓度过高带来的抑制作用与发酵最终产量的之间协调，高生产速率要求的高OD值与高转化率之间的协调，是微生物发酵生产乳酸及其乳酸盐应用中的一个重要问题。

因此，需要提供一种可以协调OD值和转化率的发酵液以及连续发酵方法以提高乳酸的产量，降低乳酸的生产成本。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用凝结芽孢杆菌制备含羟基羧酸及其盐的发酵培养基及发酵方法，本发明提供的发酵培养基有效地控制了菌液的OD值，同时通过控制碳源的浓度实现了高转化率，达到了高OD值和高转化率之间的平衡且不会抑制发酵产物的产量，因此，利用本发明提供的发酵培养基制备含羟基羧酸及其盐，生产速率快，转化率高，最后得到的发酵液中产物浓度高，光学纯度高。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种利用凝结芽孢杆菌制备含羟基羧酸及其盐的发酵培养基，所述发酵培养基中含有有机氮源和无机氮源，所述有机氮源和无机氮源的质量比为1:(1-6)，例如1:2、1:3、1:4、1:5等，优选1:(1.3-2.5)，例如1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.4等。

作为本发明的一种优选技术方案，在所述发酵培养基中，所述有机氮源的浓度为0.2-10g/L，优选0.2-6g/L，最优选4-6.5g/L，例如4.5g/L、5g/L、5.5g/L等，所述无机氮源的浓度为2-30g/L，优选5-15g/L，例如6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、14g/L等。

作为本发明的一种优选技术方案，所述发酵培养基中还含有100-300g/L的碳源，优选160-240g/L碳源，例如180g/L、200g/L、210g/L、220g/L、240g/L等，最优选200-220g/L。

本发明通过限定发酵培养基中的氮源的添加量，同时限定无机氮源和有机氮源的质量比，可以有效控制菌液在发酵过程中的OD₆₁₀值为10-30；同时限定发酵培养基中的碳源的初始添加浓度为菌种的耐受浓度，且限定的碳源的初始添加浓度可以实现较高的转化效率，因此本发明的发酵培养基可以实现高OD值和高转化率的平衡且不会抑制发酵产物的产量。因此，利用本发明提供的发酵培养基制备含羟基羧酸及其盐，生产速率快，转化率高，最后得到的发酵液中产物浓度高，光学纯度高。

作为本发明的一种优选技术方案，所述有机氮源选自牛肉膏、酵母膏、酵母粉、豆粕粉、花生粉、玉米浆或棉籽蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

作为本发明的一种优选技术方案，所述无机氮源选自尿素、硝酸盐或铵盐中的任意一种或至少两种的组合；

作为本发明的一种优选技术方案，所述碳源选自葡萄糖、戊糖、己糖、低聚糖、液化多糖或水解糖中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选葡萄糖。

本发明所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FYLR2，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2020371。

第二方面，本发明提供了第一方面所述的发酵培养基在制备含羟基羧酸及其盐中的应用，优选应用于制备乳酸及其盐。

第三方面，本发明提供了利用第一份方面所述发酵培养基连续发酵生产含羟基羧酸及其盐的方法。

作为本发明的一种优选技术方案，所述连续发酵方法包括如下步骤：将种子培养液接入第一方面所述的发酵培养基中以连续发酵培养，得到多批次含有含羟基羧酸的发酵液；

在所述连续发酵中，当前发酵装置中碳源残余量为40-120g/L时，优选为70-90g/L时，例如75g/L、80g/L、85g/L等，取出10-30vol％(例如15vol％、20vol％、25vol％等)的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵。

本发明通过限定碳源残余量来限定发酵液接种至后续发酵装置的时间，通过限定在碳源残余量优选为70-90g/L时进行转移来控制发酵周期，使得本发明的发酵周期较短，生产速率较高。

作为本发明的一种优选技术方案，所述连续发酵方法包括如下步骤：

(1)活化凝结芽孢杆菌；

(2)制备种子培养液；以及

(3)将种子培养液接入第一方面所述的发酵培养基中进行发酵培养，得到含有含羟基羧酸的发酵液；

在所述连续发酵中，当前发酵装置中碳源残余量为40-120g/L时，优选为70-90g/L时，取出10-30vol％的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵。

作为本发明的一种优选技术方案，在所述连续发酵方法中，在取出10-30vol％的发酵液后，当前发酵装置中继续发酵至碳源残余量≤0.5％，例如0.4％、0.3％、0.2％、0.1％等，甚至碳源残余量为0。

作为本发明的一种优选技术方案，在所述发酵培养过程中，将培养基的pH值控制在5.0-7.8，进一步优选在发酵培养0-4h内，将培养基的pH值控制在5.4-5.6，4h至碳源残余量为0.5-1.0％，将培养基的pH值控制在6.2-6.8，之后将pH值维持在7.4-7.8内0.5-0.6h。

本发明优选了在发酵过程中的pH值的调整，优选上述方式调整有利于提高产物产量及纯度，提高原料转化率。

作为本发明的一种优选技术方案，用于控制pH值的中和剂为酸、酸式盐、碱或碱式盐中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、碳酸氢钠、醋酸钠、焦磷酸钠、碳酸钠、氨水、盐酸、磷酸、甲酸、醋酸、二氧化碳、硫酸、乳酸、AMP-95、二乙醇胺、三乙醇胺或氨基乙酸中的任意一种或至少两种的组合，再进一步优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、氨水、盐酸、硫酸或乳酸中的任意一种或至少两种的，更进一步优选20-25％氢氧化钠溶液、20-25％氢氧化钾溶液、15-20％氢氧化钙溶液、10-15％碳酸钙溶液、15-20％氨水、20-25％盐酸、40-50％硫酸或80-90％乳酸溶液中的任意一种或至少两种的组合，最优选25％氢氧化钠溶液、20％氢氧化钾溶液、15％氢氧化钙溶液、10％碳酸钙溶液、18％氨水、20％盐酸、40％硫酸或80％乳酸溶液中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所述的活化、制备种子培养液以及步骤(3)的发酵培养的方法均可以选择目前常规的凝结芽孢杆菌的活化、种子培养、发酵的方法。

对于菌株活化：可以采用斜面培养法，在此进行举例说明：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上，45-55℃条件下，培养24～48h；优选地，斜面培养基中氮源10-30g/L，琼脂10-20g/L。

对于种子培养：将斜面培养物接种到种子培养基中，在pH＝5.0-7.5，温度为45-55℃，转速50-300rpm条件下通过种子培养基多批次连续活化制备种子培养液。

本发明需要制备具有如下特点的种子培养液：

OD₆₁₀为10-40，例如15、20、25、30、35等，消耗碳水化合物速率为5-25g/L/h，例如6g/L/h、8g/L/h、10g/L/h、15g/L/h、20g/L/h、22g/L/h等。

因此，本发明在制备种子培养液时，采用多批次连续活化，所述的多批次连续活化指的是通过调整活化培养次数控制种子培养液OD₆₁₀为10-40，消耗碳水化合物速率为5-25g/L/h，优选地，连续活化培养次数为2-5次。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的发酵培养基有效地控制了菌液的OD值，同时通过控制碳源的浓度实现了高转化率，达到了高OD值和高转化率之间的平衡且不会抑制发酵产物的产量；

(2)利用本发明提供的发酵培养基以及本发明提供的连续发酵方法制备含羟基羧酸及其盐，生产速率快，转化率高，最后得到的发酵液中产物浓度高，光学纯度高。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

性能测试方法：

利用下述测试方法对下述实施例提供的发酵液进行性能测试，方法如下：

(1)葡萄糖含量(g/L)的测定：利用生物传感分析仪SBA-40D(山东省科学院)进行测定；

(2)耗糖速率(g/L/h)：消耗的葡萄糖(g/L)÷消耗时间(h)；

(3)L-乳酸含量(g/L)和D-乳酸含量(g/L)的测定：采用Agilent1200液相色谱仪，采用手性分离柱；分别利用L-乳酸标准品和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中乳酸的含量；

(4)光学纯度：按以下公式计算样品中L-乳酸的光学纯度：

公式中，A_L为L-乳酸峰含量(g/L)，A_D为D-乳酸含量(g/L)；

(5)糖酸转化率(％)：乳酸产量(g)÷碳源总量(g)×100％；

(6)乳酸发酵生产能力(g/L/h)：乳酸产量(g/L)÷发酵时间(h)；

其中，作为标准品的D-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L0625-25mg；作为标准品的L-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为46937-500mg。

实施例1

本实施例提供了一种利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵培养基。

发酵培养基：葡萄糖220g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，轻质碳酸钙100g/L，酵母粉5.26g/L，硫酸铵6.06g/L，磷酸氢二铵6.14g/L，115℃灭菌20min。

实施例2

本实施例提供了一种利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵培养基。

与实施例1的区别在于，在本实施例中，酵母粉5g/L，硫酸铵2.75g/L，磷酸氢二铵3.2g/L。

实施例3

本实施例提供了一种利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵培养基。

与实施例1的区别在于，在本实施例中，酵母粉2.5g/L，硫酸铵2.75g/L，磷酸氢二铵6.4g/L。

实施例4

本实施例提供了一种利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵培养基。

发酵培养基：玉米液化糖化液总糖209.28g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，玉米浆干粉6.25g/L，硫酸铵5.5g/L，磷酸氢二铵3.2g/L，115℃灭菌20min。

实施例5

本实施例提供了一种利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵培养基。

与实施例4的区别在于，在本实施例中，玉米液化糖化液总糖240g/L。

实施例6

本实施例提供了一种于100m³发酵罐中制备乳酸的连续发酵方法。

本实施例使用的培养基组成如下：

斜面培养基：葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，轻质碳酸钙10g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.5，115℃灭菌30min；

种子培养基：葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L、硫酸铵11g/L，磷酸氢二铵12.8g/L；摇瓶种子培养添加50g/L轻质碳酸钙，115℃灭菌20min；

发酵培养基：实施例1提供的发酵培养基；

制备方法如下：

(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上，50℃条件下培养30h；

(2)种子培养：将斜面培养物接种到装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得50mL种子；将50mL种子接种到装有1L种子培养基的3L三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得1L种子；将1L种子接种到装有19L种子培养基的50L发酵罐中，温度50℃、转速100rpm、20％氨水自动控制pH值为6.5，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，残糖至20g/L，移种至装有140L种子培养基的200L发酵罐中，温度50℃、转速100rpm、20％氢氧化钙自动控制pH值为6.5，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，残糖至20g/L，移种至装有1.2m³种子培养基的2m³发酵罐中，温度50℃、转速100rpm、20％氢氧化钙自动控制pH值为6.5，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，残糖至20g/L，移种至装有10m³种子培养基的20m³发酵罐中，温度50℃、转速100rpm、20％氢氧化钙自动控制pH值为6.5，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，得到OD₆₁₀值为24.7，消耗碳水化合物速率为6.76g/L/h的种子培养液；

(3)发酵培养：将12m³种子培养液移种至装有48m³发酵培养基的100m³发酵罐中进行第一批次发酵培养，温度50℃、转速80rpm，在0-4h间，利用20％氢氧化钙溶液自动控制pH为5.5±0.1，4h至残糖0.5％，pH值控制6.5±0.3，残糖剩余0.5％后控制pH值7.6±0.2维持0.5h后停止添加20％氢氧化钙溶液，发酵培养残糖至80g/L时，将12m³发酵液移种至装有48m³发酵培养基的100m³发酵罐进行下一批次发酵培养，控制条件同第一批次发酵培养，剩余发酵液继续培养，每2h取样测OD₆₁₀值、残糖，发酵培养至残糖为0％时，停止发酵；

(4)发酵结束：重复步骤(3)10次，最后一批次发酵过程中不再取出发酵液，发酵至残糖为0；

实施例6随机抽取的部分批次的发酵结果见表1：

表1

由表1可知，利用本发明提供的发酵培养基以及连续发酵的方法制备乳酸具有较高的生产速率，可达5.85g/L/h以上，最优可达6.4g/L/h以上，原料转化率较高，可达89％以上，最优可达91％以上，得到的发酵液中乳酸浓度较高，在186g/L以上，光学纯度在99.6％以上。

实施例7-8

本实施例提供了一种于100m³发酵罐中制备乳酸的连续发酵方法。

与实施例6的区别在于，在本实施例中，发酵培养基为实施例2-3提供的发酵培养基。

随机选取实施例8某一个批次的发酵液，同时，选取相同批次的实施例6-7的发酵液进行对比，结果见表2：

表2

由实施例6和实施例7-8的对比可知，本发明提供的发酵培养基中的氮源满足有机氮源和无机氮源的质量比为1:(1.3-2.5)且有机氮源的浓度为4-6g/L，无机氮源的浓度为5-15g/L具有更好的发酵效果。

实施例9

本实施例提供了一种于50L发酵罐中制备乳酸的连续发酵方法。

本实施例使用的培养基组成如下：

斜面培养基：葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，轻质碳酸钙10g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.5，115℃灭菌30min；

种子培养基：玉米液化糖化液总糖120g/L，玉米浆干粉12.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L、硫酸铵11g/L，磷酸氢二铵6.4g/L，摇瓶种子培养添加50g/L轻质碳酸钙，115℃灭菌20min；

发酵培养基：实施例4提供的发酵培养基；

制备方法如下：

(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上，50℃条件下培养30h；

(2)种子培养：将斜面培养物接种到装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得50mL种子；将50mL种子接种到装有1L种子培养基的3L三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得1L种子；将1L种子接种到装有19L种子培养基的50L发酵罐中，温度50℃、转速100rpm、20％氨水自动控制pH值为6.5进行1次种子活化，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，残糖至20g/L，将2L种子接种到装有18L种子培养基的50L发酵罐中进行2次种子连续活化，控制条件及工艺同1次种子连续活化；继续以相同方式共计进行第3批次连续种子培养，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，得到OD₆₁₀值为21.6，消耗碳水化合物速率为6.89g/L/h的种子培养液；

(3)发酵培养：将4.76L种子培养液移种至装有15.24L发酵培养基的50L发酵罐中进行发酵培养，温度50℃、转速80rpm，在0-4h间，利用20％氢氧化钙溶液自动控制pH为5.5±0.1，4h至残糖0.5％，pH值控制6.5±0.3，残糖剩余0.5％后控制pH值7.6±0.2维持0.5h后停止添加20％氢氧化钙溶液，发酵培养残糖至74.8g/L时，将30％发酵液取出进行后续的连续发酵，当前发酵罐中的料液继续发酵直至发酵罐中残糖为0％时，停止发酵；

(4)发酵结束：重复步骤(3)10次，最后一批次发酵过程中不再取出发酵液，发酵至残糖为0。

实施例10

本实施例提供了一种于50L发酵罐中制备乳酸的连续发酵方法。

与实施例9的区别在于，在本实施例中，发酵培养基为实施例5提供的发酵培养基。

随机取实施例9的一个批次得到的发酵液，同时，与相同批次的实施例10的发酵液进行对比，结果见表3：

表3

由表3可知，本发明通过优选发酵培养基中的碳源的起始添加浓度，可以在没有抑制作用的前提下得到产物浓度较高的发酵液。

实施例11

本实施例提供了一种于50L发酵罐中制备乳酸的发酵方法。

本实施例使用的培养基组成如下：

斜面培养基：葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，轻质碳酸钙10g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.5，115℃灭菌30min；

种子培养基：葡萄糖100g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L、硫酸铵11g/L，磷酸氢二铵12.8g/L，摇瓶种子培养添加50g/L轻质碳酸钙，115℃灭菌20min；

发酵培养基中含有：葡萄糖200g/L，豆饼粉6g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵5.5g/L，磷酸氢二铵6.4g/L，115℃灭菌20min；

制备方法如下：

(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上，50℃条件下培养30h；

(2)种子培养：将斜面培养物接种到装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得50mL种子；将50mL种子接种到装有1L种子培养基的3L三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得1L种子；将1L种子接种到装有19L种子培养基的50L发酵罐中，温度50℃、转速100rpm、18％氨水自动控制pH值为6.5进行1次种子活化，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，残糖至20g/L，将2L种子接种到装有18L种子培养基的50L发酵罐中进行2次种子连续活化，控制条件及工艺同1次种子连续活化；继续以相同方式共计进行第3批次连续种子培养，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，得到OD₆₁₀值为22.4，消耗碳水化合物速率为5.64g/L/h的种子培养液；

(3)发酵培养：将4L种子培养液移种至装有16L发酵培养基的50L发酵罐中进行发酵培养，温度50℃、转速80rpm，发酵培养过程用15％氢氧化钙溶液自动控制pH值，在0-4h间控制pH为5.5±0.1，4h至残糖0.5％，pH值控制6.5±0.3，残糖剩余0.5％后控制pH值7.6±0.2维持0.5h后停止添加中和剂，发酵罐中残糖为0％时，停止发酵。

实施例12-14

本实施例提供了一种于50L发酵罐中制备乳酸的发酵方法。

与实施例11的区别在于，在本实施例中步骤(3)调节pH值的方式为：

利用15％氢氧化钙溶液自动控制pH值整个发酵过程均为6.5(实施例12)；

利用15％氢氧化钙溶液自动控制pH值，在0-4h间控制pH为5.5±0.1，4h至残糖0％，pH值控制6.5±0.3(实施例13)；

利用15％氢氧化钙溶液自动控制pH值，在残糖量为0.5％之前，pH为6.5±0.3，残糖剩余0.5％后控制pH值7.6±0.2维持0.5h后停止添加中和剂(实施例14)。

实施例11-14的测试结果见表4：

表4

由实施例11-14的对比可知，采用本发明优选地调节pH值的方法，转化率较高的同时光学纯度较高，产物中的乳酸浓度较高。

实施例15

本实施例提供了一种于50L发酵罐中制备乳酸的发酵方法。

本实施例使用的培养基组成如下：

斜面培养基：葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L，轻质碳酸钙10g/L，琼脂粉15g/L，pH为6.5，115℃灭菌30min；

种子培养基：玉米液化糖化液总糖120g/L，玉米浆干粉12.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L、硫酸铵11g/L，磷酸氢二铵6.4g/L，摇瓶种子培养添加50g/L轻质碳酸钙，115℃灭菌20min；

发酵培养基中含有：玉米液化糖化液总糖220g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，玉米浆干粉6.25g/L，硫酸铵5.5g/L，磷酸氢二铵3.2g/L，115℃灭菌20min；

制备方法如下：

(1)斜面培养：将凝结芽孢杆菌FYLR2接种于斜面培养基上，50℃条件下培养30h；

(2)种子培养：将斜面培养物接种到装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得50mL种子；将50mL种子接种到装有1L种子培养基的3L三角瓶中，温度50℃、转速120rpm摇床培养24h获得1L种子；将1L种子接种到装有19L种子培养基的50L发酵罐中，温度50℃、转速100rpm、20％氢氧化钾自动控制pH值为6.5进行1次种子活化，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，残糖至20g/L，以相同方式共计进行第3批次连续种子培养，每2h取样测OD₆₁₀值和残糖，得到OD₆₁₀值为21.7，消耗碳水化合物速率为6.47g/L/h的种子培养液；

(3)发酵培养：将4L种子培养液移种至装有16L发酵培养基的50L发酵罐中进行第一批次发酵培养，温度50℃、转速80rpm，在0-4h间，利用20％氢氧化钾溶液自动控制pH为5.5±0.1，4h至残糖1.0％，pH值控制6.5±0.3，残糖剩余1.0％后控制pH值7.6±0.2维持0.5h后停止添加20％氢氧化钙溶液，发酵培养残糖至80g/L时，将4L发酵液移种至装有16L发酵培养基的50L发酵罐进行下一批次发酵培养，控制条件同第一批次发酵培养，剩余发酵液继续培养，每2h取样测OD₆₁₀值、残糖，发酵培养至残糖≤0.5％时，停止发酵；

(4)发酵结束：重复步骤(3)50次，最后一批次发酵过程中不再取出发酵液，发酵至残糖为0；

实施例15随机抽取的部分批次的发酵结果见表5：

表5

由表5可知，利用本发明提供的发酵培养基以及连续发酵的方法制备乳酸可以实现连续发酵，并且连续生产30批次后产物的光学纯度也并未降低，生产速率并未下降，本发明的连续发酵方法具有较高的生产速率，可达6.18g/L/h以上，最优可达7.45g/L/h以上，原料转化率较高，可达88％以上，最优可达91％以上，得到的发酵液中乳酸浓度较高，在168g/L以上，最优可达179g/L以上，光学纯度在99.5％以上。

综上，由表1-5可知，利用本发明提供的发酵培养基以及制备方法可以实现连续发酵制备乳酸及其盐，至少连续生产30批次以上产物的光学纯度也并未降低，生产速率并未下降。

本发明的连续发酵方法具有较高的生产速率，最优可达7.45g/L/h以上，原料转化率较高，最优可达92％以上，得到的发酵液中乳酸浓度较高，最优可达193g/L以上，光学纯度最优可达99.7％以上。

对比例1

本对比例提供了一种于100m³发酵罐中制备乳酸的连续发酵方法。

与实施例6的区别在于，本对比例的发酵培养基组成成分如下：

葡萄糖220g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，轻质碳酸钙100g/L，酵母粉10g/L，硫酸铵3.71g/L，磷酸氢二铵3.75g/L，115℃灭菌20min。

对比例2

本对比例提供了一种于100m³发酵罐中制备乳酸的连续发酵方法。

与实施例6的区别在于，本对比例的发酵培养基组成成分如下：

葡萄糖220g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，轻质碳酸钙100g/L，酵母粉2g/L，硫酸铵7.7g/L，磷酸氢二铵7.76g/L，115℃灭菌20min。

随机选取对比例1的某一批次的发酵液，同时实施例6、对比例2选取同一批次的发酵液进行对比，结果见表6：

表6

由表6可知，在制备乳酸的发酵培养基中，同时采用有机氮源和无机氮源且有机氮源和无机氮源的质量比为1:(1-6)具有更好的发酵效果。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (17)

1.利用凝结芽孢杆菌连续发酵生产含羟基羧酸及其盐的方法，其特征在于，

所述方法包括如下步骤：将种子培养液接入发酵培养基中以连续发酵培养，得到多批次含有含羟基羧酸的发酵液；

在所述连续发酵中，当前发酵装置中碳源残余量为40-120g/L时，取出10-30vol％的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵；

所述发酵培养基中含有有机氮源和无机氮源，所述有机氮源和无机氮源的质量比为1:(1-6)；

所述发酵培养基中含有碳源，碳源选自葡萄糖或玉米液化糖化液；

所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)FYLR2，于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2020371。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机氮源和无机氮源的质量比为1:(1.3-2.5)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中，所述有机氮源的浓度为0.2-10g/L；所述无机氮源的浓度为2-30g/L；所述碳源浓度为100-300g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中，所述有机氮源的浓度为0.2-6g/L；所述无机氮源的浓度为5-15g/L；所述碳源浓度为160-240g/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中，所述有机氮源的浓度为4-6.5g/L，所述碳源浓度为200-220g/L。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述有机氮源选自牛肉膏、酵母膏、酵母粉、豆粕粉、花生粉、玉米浆或棉籽蛋白中的任意一种或至少两种的组合；

和/或，所述无机氮源选自尿素、硝酸盐或铵盐中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述含羟基羧酸及其盐为乳酸及其盐。

8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在连续发酵中，当前发酵装置中碳源残余量为70-90g/L时，取出10-30vol％的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连续发酵包括如下步骤：

(1)活化凝结芽孢杆菌；

(2)制备种子培养液；以及

(3)将种子培养液接入所述发酵培养基中进行发酵培养，得到含有含羟基羧酸的发酵液；

在所述连续发酵中，当前发酵装置中碳源残余量为70-90g/L时，取出10-30vol％的发酵液接种到后续的发酵装置中进行后续的连续发酵。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，在所述连续发酵中，在取出10-30vol％的发酵液后，当前发酵装置中继续发酵至碳源残余量≤0.5％。

11.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养过程中，将培养基的pH值控制在5.0-7.8。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养过程中，在发酵培养0-4h内，将培养基的pH值控制在5.4-5.6，4h至碳源残余量为0.5-1.0％，将培养基的pH值控制在6.2-6.8，之后将pH值维持在7.4-7.8内0.5-0.6h。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，用于控制pH值的中和剂为酸、酸式盐、碱或碱式盐中的任意一种或至少两种的组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，用于控制pH值的中和剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、碳酸氢钠、醋酸钠、焦磷酸钠、碳酸钠、氨水、盐酸、磷酸、甲酸、醋酸、二氧化碳、硫酸、乳酸、AMP-95、二乙醇胺、三乙醇胺或氨基乙酸中的任意一种或至少两种的组合。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，用于控制pH值的中和剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、氨水、盐酸、硫酸或乳酸中的任意一种或至少两种的组合。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，用于控制pH值的中和剂为20-25％氢氧化钠溶液、20-25％氢氧化钾溶液、15-20％氢氧化钙溶液、10-15％碳酸钙溶液、15-20％氨水、20-25％盐酸、40-50％硫酸或80-90％乳酸溶液中的任意一种或至少两种的组合。

17.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述种子培养液的OD₆₁₀值为10-40，消耗碳水化合物速率为5-25g/L/h。