CN117737104A - 一种利用适应性实验室进化合成3-羟基丙酸的方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种利用适应性实验室进化合成3‑羟基丙酸的方法，属于生物技术领域。所述发明的特征在于，扩增橙色绿屈挠菌mcr基因构建质粒pA2s‑mcr，将其转入E.coli中。在所述E.coli基因组上，用CRISPR/Cas9技术，敲除ldhA基因，并用accDA与accBC基因替代pta/poxB基因。构建特异性响应3‑HP以启动下游氯霉素抗性基因(CmR)与红色荧光蛋白(mCherry)表达的传感器质粒pYB‑0055‑mCherry‑CmR，获得工程菌，将所得工程菌在含高浓度氯霉素的M9培养基中驯化，并逐步提高氯霉素浓度，筛选得到高产3‑HP的工程菌E.coli 3‑HP‑2。本技术为大规模生产3‑HP提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用适应性实验室进化合成3-羟基丙酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
3-羟基丙酸(3-HP)在化工原材料中占有非常重要的地位，作为一种高经济价值的平台化合物，可用于生产一系列散装化学品，其不仅可以作为前体用于丙烯酸、丙二酸等多种化学品的合成，也可作为许多绿色环保材料生产的原材料，被广泛应用于医学、化工、材料等各个领域。基于3-HP的优异性能，2004年8月，美国能源部的报告将之列为全球最具潜力的12种化工产品之一。目前主要以化学法和生物法来进行3-HP的合成。化学合成法生产3-HP，对环境保护和可持续发展产生了很大的不利影响，而生物制备主要依赖可再生的生物质，对环境更加友好且可持续，因此更加具有前景。
发明内容
本发明目的在于运用合成生物学技术设计了一种利用适应性实验室进化合成3-HP的方法。该方法利用基于生物传感器的适应性实验室进化技术调控3-HP的生物合成，能够筛选出高产3-HP的进化工程菌株。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案；
一种利用适应性实验室进化合成3-HP的方法，其特征在于该方法按照以下步骤进行：
(1)扩增出橙色绿屈挠菌的mcr基因，构建得到重组质粒pA2s-mcr，通过化学转化法转入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得可以合成3-HP的工程大肠杆菌；
(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除底盘大肠杆菌E.coliBL21(DE3)基因组上乳酸合成通路中编码NAD依赖发酵型D-乳酸脱氢酶的ldhA基因，减少3-HP合成过程中乳酸的形成；
(3)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将表达accD与accA亚基的基因序列插入到染色体的pta(编码磷酸三酯酶)基因座，将表达accB与accC亚基的元件插入到染色体的poxB(编码丙酮酸氧化酶)基因座，构建了工程菌Q1Z2减少3-HP合成过程中乙酸的形成，并同时减少工程菌株由质粒数量所引起的代谢负担；
(4)基于在恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中存在一种特异性响应3-HP的基因表达系统PpHpdR/PhpdH，构建了响应3-HP的生物传感器质粒pYB-0055-mCherry-CmR，并将其与步骤(1)构建质粒转入步骤(3)所述的工程菌Q1Z2中，通过生物传感器感知菌株发酵液中3-HP的浓度并启动下游基因表达，将工程菌株的3-HP产量与其在高浓度氯霉素筛选压力下的生长状况偶联；
在含有高浓度氯霉素的M9培养基中不断传代培养，并逐步提高培养基中氯霉素浓度，通过检测菌株的生长状况，最终筛选得到高产3-HP的工程菌E.coli 3-HP-2。
附图说明
图1为本发明构建质粒pA2s-mcr的图谱；
图2为本发明构建质粒pA2s-mcr酶切验证图；
图3为本发明MCR与ACC相关蛋白表达电泳图；
图4为本发明重组大肠杆菌pta/poxB/ldhA基因编辑后对应位点电泳检测图；
图5为本发明重组质粒pYB-0055-mCherry-CmR的构建图谱；
图6为本发明菌株与对照菌株合成3-HP产量图。
具体实施方式
本发明将结合下列实施例进行详细说明，并包括各实施例间的任意组合。
实施例1：过表达mcr构建合成3-HP菌株
表达橙色绿屈挠菌来源丙二酰辅酶A还原酶质粒pA2s-mcr的构建丙二酰辅酶A还原酶(MCR)可利用丙二酰辅酶A两步合成3-HP。用OMEGA公司的细菌基因组提取试剂盒提取橙色绿屈挠菌基因组DNA，并利用引物MCR-F:5’-CATATGATGAGCGGAACAGGACGACTG-3’，MCR-R:5’-TATTTGATGCCTGGAGATCCTTACACGGTAATCGCCCGTC-3’扩增mcr基因。同时扩增质粒骨架pA2s其他原件，所用引物为ZT-F:5’-GGATCTCCAGGCATCAAATAAAA-3’，ZT-R:5’-CGCTTGGACTCCTGTTGATAGAT-3’；Str-F:5’-TATCAACAGGAGTCCAAGCGGGTCTGACGCTCAGTGGAACG-3’，Str-R:5’-AAGCTTTCATGTGCAGCTCCATAAGCA-3’；Tet-F:5’-GGAGCTGCACATGAAAGCTTAAGACCCACTTTCACATTT-3’，Tet-R:5’-CCTGTTCCGCTCATCATATGTATATCTCCTTCTTACTCCTCTTTAG-3’。扩增体系(50μl)：DDW 20μL，Primer-F 2μL，Primer-R 2μL，Template 1μL，2×Mix25μL。PCR扩增条件：95℃预变性3min之后，95℃变性15s，56-60℃退火15s，72℃延伸30s/Kb，共30个循环。72℃延伸5min之后得到目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测后使用OMEGA公司胶回收试剂盒Gel Extract Kit进行回收纯化。将最终得到的各基因片段采用吉布森连接，最终形成质粒pA2s-mcr(图1图2和图3)。将pA2s-mcr转入大肠杆菌BL21(DE3)，可获得工程菌株WY1。
实施例2：编码NAD依赖发酵型D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的敲除
大肠杆菌中，ldhA编码的D-乳酸脱氢酶是乳酸合成途径中的关键酶。以利用OMEGA公司细菌基因组提取试剂盒提取的大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，分别以引物ldhAup-F:5’-GCATTACCCAACGGCAAACG-3’/ldhA up-R:5’-AGAAAGTCTTTCTTGCCGCTCCCCTG CAAC-3’与ldhA down-F:5’-AGCGGCAAGAAAGACTTTCTCCAGTGATGT-3’/ldhA down-R:5’-GTGTTAGGCAGCATGGACTG-3’扩增用于同源重组的ldhA基因的上下游同源臂片段(均500bp左右)，经琼脂糖凝胶电泳验证条带单一且位置正确后进行回收纯化，打靶片段采取重叠延伸PCR(overlap PCR)的方法构建。为了获得带有与基因组中目的片段20bp碱基互补的sgRNA，以pTargetF-ldhA-F:5’-CTAGTCAACAGGTGAACGAGTCCTTGTTTTAGAGCT AGAAATAGC-3’/pTargetF-ldhA-R:5’-AAAACAAGGACTCGTTCACCTGTTGACTAGTATTA TACCTAGGAC-3’为引物对，以质粒pTargetF为模板，扩增出可以识别ldhA基因的pTargetF-ldhA，然后将扩增的PCR产物转化至DH5α感受态，次日挑取平板上的单克隆至液体培养基活化，测序验证筛选出正确序列的pTargetF-ldhA。取100ng pTargetF-ldhA与800ng打靶片段加入BL21(DE3)感受态细胞，电击转化后，待平板上长出大小适宜的菌落，挑取转化子，使用验证引物(待敲除基因上下游各700bp左右设计引物)进行菌落PCR验证，挑选出正确的阳性克隆BL21(DE3)ΔldhA(图4)。将质粒pA2s-mcr转入该ldhA基因缺失菌株，可得工程菌株WY2。
实施例3：乙酰辅酶A羧化酶accDABC基因的染色体整合
在好氧发酵中，大肠杆菌溢出代谢产生的醋酸盐是主要的副产物之一。醋酸盐的形成主要有两条途径：在指数生长期占主导地位的pta/ackA途径和在稳定期占主导地位的丙酮酸氧化酶(由poxB基因编码)途径。将accDABC分段表达并整合至染色体pta/poxB位点，便可达到敲除副产物合成途径催化酶pta/poxB基因的同时过表达乙酰辅酶A羧化酶，减少丙二酰辅酶A途径所需质粒，减轻代谢负担的目的。以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，分别以引物对ptazh-l-F:5’-GCTATCCGCAACGGTAAATG-3’/ptaP119-l-R:5’-GCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGTTTATCCTCTTTCGTTACCG-3’和ptazh-r-F:5’-TAATCGTATTTCTCGTCATCATCCGCAGCT-3’/ptazh-r-R:5’-GACGGCCTCTTCTCCCATAC-3’、poxBzh-l-F-28:5’-GAACAAACAGCATATTAGTGTCCTGACG-3’/poxB-CPA1-R:5’-TTTTTGATAAAAAGGGTGGCATTTCCCGTC-3’和poxB-r-F-accBC:5’-CTCCAGGCATGGTTCTCCATCTCCTGAAT G-3’/poxBzh-r-R-29:5’-CTGCGACGATAAAGCAGAAGATAAATTCC-3’，扩增用于同源重组的pta与poxB位点的上下游同源臂片段(均700bp左右，pta上游同源片段扩增时引入短链启动子P119)；以质粒pTHS-CPA1为模板，以CPA1-F-poxB:5’-GCCACCCTTTTTATCAAA AAGAGTATTGAC-3’/CPA1-R:5’-TAAGATGGGGTATATCTCCTTCTTAAAAGATC-3’为引物，扩增出启动子CPA1；以质粒pE7a-acc为模板，以引物对accDA119-F:5’-TCAGTCCTA GGTATAATGCTAGCCTTTAATAAGGAGATATACC-3’/accDAzh-R:5’-GATGACGAGAAATA CGATTACTTTCTGTTCG-3’与accBCCPA1-F:5’-AGGAGATATACCCCATCTTAGTATATTAG TTAAG-3’/accBC-R-poxBR:5’-ATGGAGAACCATGCCTGGAGATCCTTACTC-3’扩增出用于整合的accDA与accBC亚基，Overlap PCR制备整合打靶片段。为了获得带有与基因组中目的片段20bp碱基互补的sgRNA，以pTargetF-pta-F:5’-CTAGTCCTTGGCGTGATCCGTGC AAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’/pTargetF-pta-R:5’-AAAACTTGCACGGATCACGCCAA GGACTAGTATTATACCTAGGAC-3’和pTargetF-poxB-F:5’-CTAGTGGCAACCTGCACTTAA TCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’/pTargetF-poxB-R:5’-AAAACTTGATTAAGTGCAGG TTGCCACTAGTATTATACCTAGGAC-3’为引物对，以质粒pTargetF为模板，扩增出可识别pta基因的pTargetF-pta与可识别poxB基因的pTargetF-poxB，然后将扩增的PCR产物转化至DH5α感受态，次日挑取平板上的单克隆至液体培养基活化，测序验证筛选出正确序列的pTa rgetF-pta与pTargetF-poxB。在敲入基因时，取100ng pTargetF-pta质粒与1.6μg打靶片段加入BL21(DE3)ΔldhA感受态细胞，电击转化后，待平板上长出大小适宜的菌落，挑取转化子，使用验证引物(待敲除基因上下游各700bp左右设计引物)进行菌落PCR验证，挑选出正确的阳性克隆BL21ΔldhAΔpta::119-accDA。之后，从pta位点正确整合accDA基因的菌株出发，按相同的方法制备菌株BL21ΔldhAΔpta::119-accDAΔpoxB::CPA1-accBC(图4)。将质粒pA2s-mcr转入该多基因位点编辑菌株，可得工程菌株WY3。
实施例4：生物传感器质粒pYB-0055-mCherry-CmR构建
在Pseudomonasputida中存在一种由3-HP诱导的基因表达系统PpHpdR/PhpdH。在该系统中，3-HP诱导LysR型转录调节因子激活参与3-HP降解的分解代谢基因的表达。以质粒pYB-eGFP和pUAM_O63-mcherry为模板，通过引物对PYB-F:5’-GCGTAATTTGAACAAGaaacgCAAAAGAAAATGCCG-3’/PYB-R:5’-GGCAGAATAATTGGTAACGAATCAGACAAT-3’、mCherry-F:5’-ACAGGCGCGAGGTTGCTCGAGCTCGGATGAGAGACCTGATGG-3’/mCherry-R:5’-CTCCATAGATCTACCCTCGAGACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’扩增出所需的pYB质粒载体和编码红色荧光蛋白(RFP)的mCherry基因。以P.denitrificans的基因组为模板，用引物0055-F2:5’-TCGTTACCAATTATTCTGCCAACAGTTCGC-3’/0055-R:5’-CGAGCTCGAGCAACCTCGCGCCTGTTTTTT-3’扩增PpHpdR/PhpdH系统。以质粒pA3c-rfp为模板，用引物CmR-F:5’-AAGTAACTCGAGGGTAGATCTATGGAGAAAAAAATCACTGG-3’；CmR-R:5’-CGTTTCTTGTTCAAATTACGCCCCGCCCTGCCAC-3’扩增出氯霉素抗性基因Chloramphenicol，通过电泳检测扩增的条带，用OMEGA胶回收试剂盒回收纯化。采用诺唯赞吉布森连接试剂盒连接纯化片段，得到重组质粒pYB-0055-mCherry-CmR。在该质粒中，我们将mCherry编码的红色荧光蛋白(RFP)、CmR编码的氯霉素乙酰转移酶和PpHpdR/PhpdH系统克隆到质粒pYB01中。同时，将mcherry和CmR置于PpHpdR/PhpdH系统的下游(图5)。利用这种生物传感器，CmR表达是由3-HP诱导的，只有从葡萄糖中有效产生3-HP的细胞才能在选择性压力氯霉素存在下存活。因此，在这种选择性压力条件下，获得3-HP过量生产阳性突变的细胞将逐渐占主导地位。
实施例5：基于生物传感器质粒的适应性实验室进化
将构建的质粒pYB-0055-mCherry-CmR与pA2s-mcr转入基因编辑菌株Q1Z2中，获得用于适应性实验室进化的亲本工程菌株WY4。挑取平板上亲本菌株的单菌落直接接种到含有50mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的改良M9培养基(20g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物)中，37℃，200rpm培养至平台期，将菌液稀释到新鲜改良M9培养基，初始OD600应为0.1左右。当新接种菌液的OD600达到0.8时，再次将其转接到初始OD600约为0.1的新培养基中，并添加200nmol/L ATC 136mg/L氯霉素。当培养至OD600约1.3-1.5时，用含有200nmol/L ATC和150mg/L氯霉素的培养基稀释细胞。重复以上步骤，通过逐渐增加氯霉素浓度来实现菌株向3-HP产量提高的方向进化，直至获取在高浓度氯霉素培养基中生长状况良好菌株。将所得菌株稀释并置于含有适当抗生素的LB琼脂培养基上，37℃过夜培养以获得单菌落。将单菌落挑至LB培养基过夜活化后转接M9培养基，发酵培养48h后采用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液的3-HP滴度。
实施例6：菌株3-HP产量的定量检测
将构建的WY1-WY3菌株以及最后适应性实验室进化所得3-HP-2菌株在补充有适当抗生素的LB培养基(200rpm，37℃)中过夜培养，次日转接改良M9培养基发酵培养，在50mL三角瓶中加入10mL改良M9发酵培养基(20g/L葡萄糖，2g/L酵母膏)，并添加终浓度100mg/L的氨苄青霉素溶液以及50mg/L的链霉素溶液，将活化后的种子液以3％接种量接入其中。37℃，200rpm振荡培养至OD600达0.8-1.2时，加入200nM的ATC进行诱导培养，2.5h后，添加40mg/L生物素和20mM NaHCO3，恒温振荡培养48h，其间每隔12h加入相应浓度的抗生素和诱导剂。
所述的改良M9培养基包含组分：葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，磷酸二氢钾13.1g/L，磷酸氢二钠6g/L，氯化钠0.5g/L，氯化铵2g/L，氯化钙0.1mM，硫酸镁50mM。其中葡萄糖、酵母提取物、氯化钙、硫酸镁单独配制为浓缩母液，其余组分混合配制为5倍浓缩液，待到使用该培养基时再于超净工作台中按相应终浓度混匀。
取1.5mL发酵培养后的菌液，12000rpm离心12min，取上清过0.22μm滤膜过滤除菌备用。用高效液相色谱法测定发酵液中3-HP的浓度(1525；Waters；CA；USA)。将处理好之后的样品通过300mm×7.8mm的Xlast Suguar-H柱洗脱，流动相为5mmol/L H2SO4，洗脱时流速为0.4mL/min，洗脱时间为20min。柱温和样品池温度分别为65℃和45℃。各菌株发酵液中3-HP浓度对比如图6。
Claims (4)
1.一种利用适应性实验室进化合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于，该方法按照以下步骤进行：
1)PCR扩增橙色绿屈挠菌的mcr基因，构建重组质粒pA2s-mcr，其特征在于，将橙色绿屈挠菌的mcr基因利用无缝克隆技术引入质粒，构建质粒pA2s-mcr，用丙二酰辅酶A还原酶(MCR)催化丙二酰辅酶A的两步NADPH依赖性还原生产3-HP，获得工程菌株WY1；
2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除大肠杆菌E.coliBL21(DE3)基因组上乳酸合成通路中编码NAD依赖发酵型D-乳酸脱氢酶的ldhA基因，消减3-HP合成通路中乳酸的积累；
3)利用CRISPR/Cas9技术，将含有P119启动子的accD与accA的基因插入染色体pta(编码磷酸三酯酶)基因座上，将含有CPA1启动子的accB与accC基因插入到染色体的poxB(编码丙酮酸氧化酶)基因座，构建工程菌Q1Z2减少3-HP合成通路中乙酸的形成，并同时避免工程菌株因携带质粒引起的代谢负担；
4)构建能特异性响应3-HP以启动下游基因表达的生物传感器质粒pYB-0055-mCherry-CmR，其特征在于，所用的启动子来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因表达系统PpHpdR/PhpdH，启动子强度可在一定程度上随3-HP浓度增加而提升，启动子下游包含氯霉素抗性基因(CmR)与红色荧光蛋白基因(mCherry)用于监测3-HP浓度变化；
5)将步骤1)与步骤4)构建的质粒转入到步骤3)构建的工程菌Q1Z2中获得响应响应3-HP的工程菌，通过生物传感器感知菌株发酵液中3-HP的浓度并启动下游基因表达，建立工程菌合成3-HP产量与其在高浓度氯霉素筛选压力下的生长状况偶联；
6)将步骤5)获得的工程菌在含有10-20g/L葡萄糖，2-3g/L酵母提取物，50-100mg/L链霉素和50-100mg/L氨苄青霉素的改良M9培养基中37℃，200rpm培养，当菌液OD600＝0.6-0.8时，再次将其转接到初始OD600约为0.1的新培养基中，并添加100-200nmol/LATC 115-150mg/L氯霉素，当菌液OD600约1.3-1.5时，用含100-200nmol/LATC 125-160mg/L氯霉素培养基稀释细胞，逐渐增加氯霉素浓度来逐步提高3-HP产量；
7)在含有高浓度氯霉素的M9培养基中不断传代培养，并逐步提高培养基中氯霉素浓度，通过检测菌株的生长状况与荧光强度，最终筛选得到高产3-HP的工程菌E.coli 3-HP-2，将其保藏到中国微生物菌种保藏中心。
2.权利要求1所述的一种利用适应性实验室进化合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于，工程菌E.coli 3-HP-2在补充有适当抗生素的LB培养基中200rpm，37℃，培养12-16h后以3％接种量接入到改良M9培养基发酵培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600达0.8-1.2时，加入200nM的ATC进行诱导培养，2.5h后，添加40mg/L生物素和20mM NaH CO3，恒温振荡培养48h，其间每隔12h加入相应浓度的抗生素和诱导剂，采用高效液相色谱检测发酵液的3-HP浓度。
3.权利要求1所述的一种利用适应性实验室进化合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于，所用改良M9培养基的特征为，50mL三角瓶中加入10mL含有10-20g/L葡萄糖和2-3g/L酵母膏的M9发酵培养基，并添加终浓度50-100mg/L的氨苄青霉素和50-100mg/L的链霉素。
4.用高效液相色谱法对比工程菌株WY1和工程菌E.coli 3-HP-2合成3-HP产量，发现工程菌E.coli 3-HP-2合成3-HP比工程菌WY1提高8.5倍。
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