CN103923955B - 一种生产l-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产L‑丙氨酸的方法，涉及基因工程和发酵工程领域，是利用天冬氨酸‑β‑脱羧酶交联聚集体固相酶生产L‑丙氨酸。本发明方法使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌中获得天冬氨酸‑β‑脱羧酶的编码基因，诱导天冬氨酸‑β‑脱羧酶的表达，再对其进行化学交联得到天冬氨酸‑β‑脱羧酶交联聚集体固相酶，以其为酶，以L‑天冬氨酸作为底物，生产L‑丙氨酸。每升反应液中，L‑天冬氨酸底物浓度达1800g/L，酶促反应20小时后摩尔转化率达99.9%。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种利用天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶生产L-丙氨酸的方法。
背景技术
L-丙氨酸是一种应用十分广泛的氨基酸，其外观为白色结晶性粉末，无臭有甜味，溶于水和乙醇，难容于乙醚。在食品上广泛添加于化学调味品、饮料、有机酸、酒类及腌制品中，作为一种重要的添加剂，同时具有增鲜保鲜的作用。L-丙氨酸在医药上主要是合成维生素B6和氨基丙醇的重要原料，是组成复合氨基酸注射液和口服液的原料。随着对L-丙氨酸不断研究和开发,在医药和食品等行业的应用不断扩大，并有日益增长的趋势。L-丙氨酸产品全球年需要量将超过30000吨。
目前利用固定化细胞酶转化法是最为有效的工业化生产L-丙氨酸之一。即利用菌体中的天冬氨酸-β-脱羧酶以L-天冬氨酸为原料，酶法脱梭生成L-丙氨酸。由于天冬氨酸-β-脱羧酶位于菌体内，作为底物的L-天冬氨酸必须通过菌体的细胞壁和细胞膜，导致反应速度慢，在工业化生产过程中，生产周期长达4-5天。菌体内含有杂酶，特别是氨基酸消旋酶作用于L-丙氨酸产出D-丙氨酸，影响产品质量。因此迫切需要一种生产周期短，产物浓度高，杂质少的生产L-丙氨酸的方法。
发明内容
本发明克服上述固相化细胞生产L-丙氨酸技术不足，利用基因工程技术表达天冬氨酸-β-脱羧酶，制备天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶，再利用此固相酶。
本发明的第一个目的是提供天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶的制备方法，包括：
（1）使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌（Pseudomonas dacunhae）中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因；
（2）PCR产物连接载体、转化大肠杆菌，超声波破碎菌体，收集上清液，再进行分离纯化；
（3）用化学交联方法得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。
本发明的第二个目的是提供一种生产周期短，产物浓度高，杂质少的生产L-丙氨酸的方法。
本发明的生产L-丙氨酸的方法含有以下步骤：
（1）使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌（Pseudomonas dacunhae）中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因；
（2）PCR产物连接载体、转化大肠杆菌，超声波破碎菌体，收集上清液，再进行分离纯化；
（3）用化学交联方法得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶；
（4）以磷酸盐缓冲液对步骤（3）获得的酶进行定容，再加入L-天冬氨酸生产L-丙氨酸。
其中，步骤（1）中PCR方法所用的引物为：
正向引物：5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′；
反向引物：5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′。
其中斜体字母部分分别为酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图1，回收目的片段，测序验证为正确扩增，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
其中，步骤（2）中PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在20-30℃使用乳糖作为诱导剂，诱导天冬氨酸-β-脱羧酶表达。
具体为将PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取1个阳性克隆，接种于含50mg/ml卡那霉素抗性的10ml LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8时，取2ml转接于2000mL的含2.5g/L甘油的LB液体培养基中，36-38℃，200-220rpm振荡培养，待OD600值约达2.0时，加入终浓度为2-6g/L的乳糖，24-26℃诱导6-24h。
在本发明的一个实施例中，将PCR产物连接入载体pET-28b，构建表达载体pET-Asd，将该表达载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞。
本发明方法中，还包括对诱导的培养液在4-6℃，8000rpm离心，收集菌体，菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮，即湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5-6mL缓冲液，在冰浴中以超声波破碎菌体，破碎后，4-6℃，8000rpm离心收集上清。
本发明方法的步骤（2）中分离纯化的方法为硫酸铵分段沉淀法，具体为向上清液中加入5%饱和度的硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后在4-6℃，8000-10000rpm离心10min，取上清，再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液，边加边搅拌，静置1-5h，4-6℃，8000-10000rpm离心10min，收集沉淀物。
其中，步骤（3）所述的化学交联方法是以戊二醛作为交联剂，对纯化的天冬氨酸-β-脱羧酶进行固定化处理，得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。
进一步地，是将分离纯化收集到的沉淀按照1g：10-12mL的比例滴加50%的戊二醛交联剂，混合均匀于4-6℃下交联22-24h后离心，取沉淀物，用蒸馏水洗涤3-5次，再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，分离得到沉淀即制得天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。
其中步骤（4）中对7-9g的天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶使用0.1M，pH7.0的磷酸盐缓冲液定容至1L。
具体地，步骤（4）向天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶定容液中加入L-天冬氨酸的方法为，初始L-天冬氨酸的加入量为400-500g；反应4小时后，按每小时100g加入天冬氨酸，每升反应液中可转化L-天冬氨酸量高达1800g。
步骤（4）的反应温度为36-38℃。
步骤（4）反应期间每4h取样，16h后每1h取样，通过HPLC检测反应溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量，当L-丙氨酸含量不再增加时，即为反应终点。
对于步骤（4），本发明的一个实施例的HPLC检测使用的高效液相色谱仪Agilent1100series（安捷伦公司），高效液相色谱柱ZorbaxSBC18柱（5μm，4.6mm×250mm）（安捷伦公司）。
流动相：流动相A：0.02mol/L NaAc，pH6.2；流动相B：乙腈。采用线性梯度洗脱：时间（min）0-20，B（%）5-33。流速：1.0ml/min；柱温：30℃；二极管阵列检测器（DVD）工作条件：检测波长：360nm；参比波长：600nm。
本发明提供的生产L-丙氨酸的方法中，首先通过基因工程的方法制备得到天冬氨酸-β-脱羧酶，然后以戊二醛作为交联剂，对纯化的天冬氨酸-β-脱羧酶进行固定化处理，得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶，通过酶活测定及计算，本发明制得的天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶酶活为28000U/g。再利用制得的天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶，以L-天冬氨酸固体为底物制得L-丙氨酸，酶促反应20小时后摩尔转化率达99.9%，整个过程仅需4天，且杂质少。本发明方法简单有效，具有生产周期短，产物浓度高，杂质少的技术优点。
附图说明
图1为PCR方法扩增天冬氨酸-β-脱羧酶基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为天冬氨酸-β-脱羧酶SDS-PAGE图。
图3为天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体（×100）。
图4为L-天冬氨酸的HPLC图谱。
图5为天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶转化L-天冬氨酸（L-Asp），反应产物L-丙氨酸（L-Ala）HPLC图谱。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入各原料除特别说明外，均为市售。实施例1天冬氨酸-β-脱羧酶（Asd）基因的获得
以1μg德阿昆哈假单孢菌（Pseudomonas dacunhae）基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID NO.3的序列设计正向引物Asd-F为5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′；反向引物Asd-R为5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′。其中斜体字母部分分别为酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。取3μL PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。取100μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒（购自上海生工生物公司）的步骤回收目的片段，即Asd基因。测序验证为正确扩增，目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2天冬氨酸-β-脱羧酶基因表达载体的构建
实施例1中PCR产物经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切消化后，与用相同限制性内切酶消化的载体pET-28b（购自Novagen公司）进行连接反应，然后将连接的混合物转化大肠杆菌DH5α（购自promega公司），并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，构建的表达载体被称为pET-Asd。
实施例3天冬氨酸β-脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达及表达产物分离
将pET-Asd质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自promega公司）感受态细胞；挑取1个阳性克隆，接种于含卡那霉素抗性（50mg/ml）的10ml LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养至OD600约为0.6-0.8时，取2ml转接于2000mL的LB液体培养基中（加入2.5g/L甘油），37℃，220rpm振荡培养，待OD600值约达2.0时，加入终浓度为2-6g/L的乳糖，25℃诱导6-24h。然后对诱导的培养液在4℃，8000rpm离心，收集菌体，菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮（湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5mL缓冲液），在冰浴中以超声波破碎菌体，破碎后，4℃，8000rpm离心收集上清，取100μl上清加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，100℃沸水浴15min后，进行SDS-PAGE分析。结果见图2。
向100ml上清液中缓慢加入5%饱和度的硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后4℃，8000rpm离心10min，取上清，再向上清液中缓慢加入25%饱和度硫酸铵溶液，边加边搅拌，静置3h，4℃，8000rpm离心10min，收集沉淀物，即为含有天冬氨酸-β-脱羧酶组分。
实施例4天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体的交联
将实施例3中收集的8g沉淀物滴加90ml50%的戊二醛交联剂，再次缓慢搅拌令其混合均匀。于4℃下交联22h后，在4℃，8000-10000rpm离心10min，取沉淀物，先用蒸馏水洗涤三次，再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，最终分离得到沉淀。待冰冻干燥后即为制得的天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶。光学显微镜下观察到，天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶是单体的多聚形式，形状不规则，颗粒较小（图3）。
实施例5天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶的酶活测定
在pH7.0，温度为37℃的条件下，每克天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶每分钟转化生成1μmol L-丙氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
取1g天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶，加入0.1M，pH7.0的磷酸盐缓冲液，定容至100ml，再加入10g L-天冬氨酸作为底物，37℃水浴30min后，高效液相色谱检测溶液中L-丙氨酸含量。
高效液相色谱仪Agilent1100series（安捷伦公司），高效液相色谱柱ZorbaxSBC18柱（5μm，4.6mm×250mm）（安捷伦公司）。
流动相：流动相A：0.02mol/L NaAc，pH6.2；流动相B：乙腈。采用线性梯度洗脱：时间（min）0-20，B（%）5-33。
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
二极管阵列检测器（DVD）工作条件：检测波长：360nm；参比波长：600nm。
通过HPLC检测酶促反应中底物（L-天冬氨酸）转化为产物（L-丙氨酸）的量来计算酶活，即从反应起始5分钟内每克天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶每分钟产生1μmol L-丙氨酸定义为1U,经HPLC检测酶促反应5分钟内L-丙氨酸摩尔量计算得天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶酶活为28000U/g。
实施例6天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶生产L-丙氨酸
用实施例4制得的8g天冬氨酸-β-脱羧酶聚集体固相酶为酶源，加入0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液，定容至1L，直接加入L-天冬氨酸固体，控制整个反应过程pH7.0，温度37℃。初始L-天冬氨酸加入量400-500g，反应4小时后，按每小时100g加入天冬氨酸，每升反应液中可转化L-天冬氨酸量高达1800g，0h取样检测，见图4，此时无L-丙氨酸生成。反应期间每4h取样，16h后每1小时取样，通过HPLC检测溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量，当L-丙氨酸含量不再增加时即为反应终点，第20h和第21h取样检测，测定溶液中L-丙氨酸都为1204g。根据计算摩尔转化率达99.9%，且第20小时HPLC检测（图4）杂峰的峰面积占总峰面积小于0.1%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用PCR方法从德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)中获得天冬氨酸-β-脱羧酶的编码基因；
其中，步骤(1)中PCR方法所用的引物为：
正向引物：5′-AAACATATGATGAGCAAGGATTATCGG-3′；
反向引物：5′-AAACTCGAGCTACTCCTTGCCCAGCGC-3′；
(2)PCR产物连接载体、转化大肠杆菌，超声波破碎菌体，收集上清液，再进行分离纯化；
其中，步骤(2)中PCR产物连接载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，在20-30℃使用乳糖作为诱导剂，诱导天冬氨酸-β-脱羧酶表达；还包括对诱导的培养液在4-6℃，8000rpm离心，收集菌体，菌体以0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液悬浮，即湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5-6mL缓冲液，在冰浴中以超声波破碎菌体，破碎后，4-6℃，8000rpm离心收集上清；
步骤(2)中分离纯化的方法为硫酸铵分段沉淀法，具体为向上清液中加入5％饱和度的硫酸铵溶液，边加边搅拌，然后在4-6℃，8000-10000rpm离心10min，取上清，再向上清液中缓慢加入25％饱和度硫酸铵溶液，边加边搅拌，静置1-5h，4-6℃，8000-10000rpm离心10min，收集沉淀物；
(3)用化学交联方法得到天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶；
其中，步骤(3)所述的化学交联方法是以戊二醛为交联剂，将分离纯化收集到的沉淀按照1g：10-12mL的比例滴加50％的戊二醛交联剂，混合均匀于4-6℃下交联22-24h后离心，取沉淀物，用蒸馏水洗涤3-5次，再用0.1M、pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，分离得到沉淀即制得天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶；
(4)以磷酸盐缓冲液对步骤(3)获得的酶进行定容，再加入L-天冬氨酸生产L-丙氨酸；其中，步骤(4)中对7-9g的天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶使用0.1M，pH7.0的磷酸盐缓冲液定容至1L；步骤(4)的反应温度为36-38℃；
步骤(4)向天冬氨酸-β-脱羧酶交联聚集体固相酶定容液中加入L-天冬氨酸的方法为：初始L-天冬氨酸的加入量为400-500g；反应4小时后，按每小时100g逐步加入天冬氨酸，每升反应液中可转化L-天冬氨酸量达1800g。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)反应期间每4h取样，16h后每1h取样，通过HPLC检测反应溶液中L-天冬氨酸和L-丙氨酸含量，当L-丙氨酸含量不再增加时，即为反应终点。
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