KR101080540B1 - 발효에 의한 황 함유 정밀 화학물질의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 S-아데노실메티오닌 신타제 (metK) (E.C.2.5.1.6)의 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 발현된 박테리아를 이용한, 발효에 의한 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌 및 L-시스테인의 신규한 제조 방법, 상기 돌연변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이것으로 형질전환된 재조합 미생물, 및 변형된 효소 활성을 갖는 신규한 metK 돌연변이체에 관한 것이다.
예를 들어, 메티오닌, 호모시스테인, S-아데노실메티오닌, 글루타티온, 시스테인, 비오틴, 티아민 및 리폰산과 같은 황 함유 정밀 화학물질은 천연 대사 과정을 통해 세포에서 생산되며, 식품, 사료, 화장료 및 제약 산업을 비롯한 수많은 산업에 이용된다. 일반적으로 "황 함유 정밀 화학물질"로 지칭되는 상기 물질은 유기산, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 비타민 및 보조인자를 포함한다. 가장 적당하게는, 이는 대량의 해당 목적 물질을 생산하고 분비하기 위해 개발된 박테리아를 성장시킴으로써 산업적 규모로 제조된다. 상기 목적에 특히 적합한 유기체는 그램 양성, 비병원성 코리네형 박테리아이다.
아미노산은 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corinebacterium glutamicum) 균주의 발효에 의해 생산되는 것으로 공지되어 있다. 그의 높은 중요성 때문에, 제조 방법은 끊임없이 개선되고 있다. 제조 방법에 대한 개선은 예를 들어 교반 및 질소 공급과 같은 발효 기술, 또는 예를 들어 발효 동안의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 하류 공정, 또는 미생물 자체의 고유 성능 파라미터의 측면과 관련될 수 있다.
균주 선택은 일련의 황 함유 정밀 화학물질로부터 일군의 목적하는 화합물을 생산하는 일련의 돌연변이 균주를 유발하였다. 특정 분자의 제조에 관한 상기 미생물의 성능 파라미터를 개선하기 위해 적용되는 방법은 돌연변이체의 돌연변이 유발, 선택 및 선정이다. 그러나, 이는 시간이 소요되고 어려운 방법이다. 상기 방식으로, 예를 들어 메티오닌 유사체인 α-메틸메티오닌, 에티오닌, 노르류신, N-아세틸노르류신, S-트리플루오로메틸호모시스테인, 2-아미노-5-헵텐산, 셀레노메티오닌, 메티오닌 술폭시민, 메톡신 또는 1-아미노시클로펜탄카르복실산과 같은 항대사산물에 내성이거나, 조절적으로 중요한 대사산물에 대해 영양요구성이고 예를 들어 L-메티오닌과 같은 황 함유 정밀 화학물질을 생산하는 균주가 수득된다.
재조합 DNA 기술의 방법은 또한 개별 아미노산 생합성 유전자가 증폭되고 아미노산 생산에 대한 효과가 연구된 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주의 균주 개선을 위해 수년간 사용되었다.
JP-A-06-020809호에는 S-아데노실메티오닌을 코딩하는 코리네형 박테리아인 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) MJ-233으로부터의 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 상응하는 아미노산 서열은 412개의 아미노산을 포함한다. 그 중에서도 다수의 다른 코리네형 박테리아의 상응하는 효소에 보존된 24 및 94 위치 각각에, 단백질은 시스테인 잔기를 갖는다. 개시된 아미노산 서열은 잔기 137과 154 사이에 특징적인 서열 절편을 갖는다. 돌연변이체의 생성 및 발효에 의한 황 함유 정밀 화학물질의 제조에서의 그의 용도는 상기 문헌에 기재되어 있지 않다.
WO-A-01/00843호에는 407개의 아미노산을 갖는 단백질을 코딩하고, 서열 16에 나타난 것과 같은 서열을 갖는 씨. 글루타미쿰으로부터의 metK 유전자가 개시되어 있다.
일반적으로, 발효에 의한 정밀 화학물질의 제조에서의 개선은 개선된 물질 유량 및 수율과 상호관련된다. 합성에 중요한 효소의 중간체 억제 또는 최종 생성물 억제를 방지하거나 감소시키는 것이 중요하다. 목적하지 않은 생성물 또는 부산물로의 탄소 유량의 전환의 방지 또는 감소는 또한 유리하다.
대사 효소의 효소 활성에 대한 대사산물의 효과가 연구될 수 있다. 이러한 효소의 예는 metA, metB, metC, metY, metH, metE, metF 및 미생물의 대사에서의 다른 효소일 수 있다. 메티오닌의 중요한 대사산물, 및 따라서 중요한 전환체는 S-아데노실메티오닌이다.
그러나, 동시에 S-아데노실메티오닌은 또한 메티오닌 생합성의 중요한 조절자이다. 예를 들어, 이. 콜라이에서 L-메티오닌의 생합성은 S-아데노실메티오닌에 의해 억제된다고 공지되어 있다. 상기 시스템에서, S-아데노실메티오닌은 리프레 서 metJ의 공동리프레서로서 작용한다 (문헌 [Weissbach, H. Brot, N. (1991) Mol Microbiol. 5 (7), 1593-1597]).
동시에, S-아데노실메티오닌의 합성은 관심의 목적하는 생성물인 L-메티오닌으로부터의 중요한 전환체이다. 따라서, 형성되는 S-아데노실메티오닌의 양을 감소시키는 것은 다음의 몇 가지 이유 때문에 바람직하다:
a) 형성되는 L-메티오닌의 양은 증가될 것이고,
b) 메티오닌 생합성 유전자의 억제는 감소될 것이고,
c) 메티오닌 생합성 효소의 피드백 억제는 감소될 것이다.
metK 유전자의 결실은 S-아데노실메티오닌의 형성을 방지하는 가장 간단한 방법일 것이다. 그러나, 문헌 [Wei, Y. and Newman, E.B. (2002) Mol. Microbiol. 43 (6), 1651-1656]에서, metK는 필수적 유전자로 기재되어 있고, 따라서 이는 당업자에게 발효에 의한 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 개선된 제조를 위한 출발점으로 보인다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 발효에 의한 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 신규한 개선된 제조 방법, 및 그에 따라 요구되는 수단을 제공하는 것이다.
놀랍게도, 상기 목적은 야생형 효소에 비해 그 활성이 변형된, 바람직하게는 감소된 S-아데노실메티오닌 신타제 돌연변이체를 코딩하는 metK 뉴클레오티드 서열을 코리네형 박테리아에서 발현시키는 것을 포함하는, 발효에 의한 황 함유 정밀 화학물질의 제조 방법을 제공함으로써 달성됨이 밝혀졌다. 예를 들어, S-아데노실 메티오닌 신타제 돌연변이체는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래되며, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 측정된, 야생형 효소보다 낮은 활성을 나타낸다.
본 발명의 제1 요지는
a) 변형된 S-아데노실메티오닌 신타제 (metK) 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 발현시키는, 목적하는 황 함유 정밀 화학물질을 생산하는 코리네형 박테리아 배양물을 발효시키는 단계;
b) 상기 황 함유 정밀 화학물질을 배지에서 및(또는) 박테리아 세포에서 풍부화시키는 단계; 및
c) 상기 황 함유 정밀 화학물질, 바람직하게는 L-메티오닌을 단리하는 단계
를 포함하는, 발효에 의한 1종 이상의 황 함유 정밀 화학물질의 제조 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에 따라, 돌연변이된 코리네형 박테리아는 또한 (예를 들어 g/l 발효액에서 발현된) 비돌연변이된 야생형에 비해 개선된 metY 활성 및(또는) 증가된 L-메티오닌 양을 갖는다.
본 발명에 따른 방법에서 구체적으로 사용되는 metK 코딩 서열은 야생형 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 치환된, 감소된 metK 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 코딩 뉴클레오티드 서열이다.
바람직하게는, metK 코딩 서열은 서열 23에 나타난 것과 같은 하기 아미노산 부분 서열을 갖는, metK 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 코딩 뉴클레오티드 서열이다:
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
상기 식에서,
X1 및 X2는 서로 독립적으로 임의의 아미노산을 나타내고;
X3은 Cys 이외의 아미노산을 나타낸다.
특히 바람직한 것은 metK 코딩 서열이 서열 22에 나타난 것과 같은 Val1 내지 Ala407의 아미노산 서열, 또는 그와 상동성이고 기능적 등가성을 갖는 단백질을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 metK 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 것인 방법이다.
본 발명에 따라 사용되는 metK 코딩 서열은 바람직하게는 서열 21에 나타난 것과 같은 코딩 서열, 또는 그와 상동성이고 metK 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
코딩 metK 서열은 바람직하게는 코리네형 박테리아에서 복제될 수 있거나 염색체 내로 안정하게 통합될 수 있는 DNA이거나, RNA이다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명에 따른 방법은
a) 플라스미드 벡터로 형질전환되고, 코딩 metK 서열의 하나 이상의 카피를 조절 서열의 제어 하에 운반하는 박테리아 균주를 사용하거나, 또는
b) 코딩 metK 서열이 박테리아 염색체 내로 통합된 균주를 사용함으로써 수행된다.
특히 바람직한 것은 또한 metK 야생형 효소의 활성의 전부 또는 일부가 예를 들어 야생형 효소의 코딩 서열의 결실에 의해서와 같이 제거된 상기 정의된 것과 같은 균주이다.
더욱이, 또한 목적하는 황 함유 정밀 화학물질의 생합성 경로의 하나 이상의 추가의 유전자가 증강된 박테리아 및(또는) 목적하는 황 함유 정밀 화학물질의 형성을 감소시키는 하나 이상의 대사 경로가 적어도 부분적으로 제거된 박테리아를 발효시키는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 이유로 본 발명에 따른 방법의 추가의 실시양태에 따라,
1) 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 유전자 lysC,
2) 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 asd,
3) 글리세린알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 gap,
4) 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 유전자 pgk,
5) 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자 pyc,
6) 트리오스-포스페이트 이소메라제를 코딩하는 유전자 tpi,
7) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 metA,
8) 시스타티오닌-감마 신타제를 코딩하는 유전자 metB,
9) 시스타티오닌-감마 리아제를 코딩하는 유전자 metC,
10) 메티오닌 신타제를 코딩하는 유전자 metH,
11) 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 glyA,
12) O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 유전자 metY,
13) 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 metF,
14) 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 serC,
15) 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 유전자 serB,
16) 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 cysE,
17) 시스테인 신타제를 코딩하는 유전자 cysK,
18) 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 hom
으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 과발현된 코리네형 박테리아를 발효시킨다.
본 발명에 따른 방법의 또다른 실시양태에 따라, 상기 언급된 1) 내지 18) 군의 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자가, 상응하는 단백질의 활성이 비돌연변이된 단백질에 비해 대사산물에 의해 더 낮은 정도로 영향을 받거나 영향을 받지 않고, 특히 본 발명에 따른 정밀 화학물질의 제조가 불리한 영향을 받지 않는 방식으로, 또는 그의 특이적 활성이 증가되는 방식으로 동시에 돌연변이된 코리네형 박테리아를 발효시킨다.
본 발명에 따른 방법의 또다른 실시양태에 따라,
19) 호모세린 키나제를 코딩하는 유전자 thrB,
20) 트레오닌 데히드라타제를 코딩하는 유전자 ilvA,
21) 트레오닌 신타제를 코딩하는 유전자 thrC,
22) 메소-디아미노피멜레이트 D 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 ddh,
23) 포스포에놀-피루베이트 카르복시키나제를 코딩하는 유전자 pck,
24) 글루코스-6-포스페이트-6 이소메라제를 코딩하는 유전자 pgi,
25) 피루베이트 옥시다제를 코딩하는 유전자 poxB,
26) 디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자 dapA,
27) 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 dapB, 또는
28) 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 lysA
로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 특히 상응하는 유전자의 발현율을 감소시킴으로써 동시에 약화된 코리네형 박테리아를 발효시킨다.
본 발명에 따른 방법의 또다른 실시양태에 따라, 하나 이상의 상기 19) 내지 28) 군의 유전자가 상응하는 단백질의 효소 활성이 부분적으로 또는 완전히 감소되는 방식으로 동시에 돌연변이된 코리네형 박테리아를 발효시킨다.
본 발명에 따른 방법에서 바람직하게 사용되는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 종이다.
본 발명은 더욱이
a) 바람직하게는 상기 정의에 따른 감소된 metK 활성을 갖는 L-메티오닌 생산 미생물을 발효 배지에서 배양하고 발효시키는 단계;
b) L-메티오닌 함유 발효 배양액으로부터 물을 제거하는 단계;
c) 발효 동안 형성된 바이오매스 0 내지 100 중량%를 제거하는 단계; 및
d) b) 및(또는) c)에 따라 수득된 발효 배양액을 건조하여 동물 사료 첨가제를 목적하는 분말 또는 과립 형태로 수득하는 단계
를 포함하는, 발효 배양액으로부터의 L-메티오닌 함유 동물 사료 첨가제의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 상기 정의에 따른 감소된 metK 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 감소된 활성을 갖는 metK 돌연변이체에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 상기 정의에 따른 돌연변이된 metK 유전자를 발현시키는 재조합 코리네형 박테리아, 특히 metK 야생형 효소를 더이상 발현시키지 않는 재조합 코리네형 박테리아에 관한 것이다.
상응하는 야생형 균주에 비해, 바람직한 재조합 코리네형 박테리아는
a) 더 낮은 세포내 S-아데노실메티오닌 역가
b) 더 낮은 세포내 S-아데노실메티오닌 신타제 농도, 또는
c) S-아데노실메티오닌 형성 속도를 참고로 측정된 더 낮은 S-아데노실메티오닌 신타제 활성 중 하나 이상의 특성; 및 또한 경우에 따라
d) 개선된 metY 활성 또는
e) 증가된 L-메티오닌 양 중 하나 이상의 특성을 나타낸다.
a) 일반적 용어
metK (E.C.2.5.1.6)으로 또한 약칭되는 "S-아데노실메티오닌 신타제"의 생물학적 활성을 갖는 단백질이라는 용어는 L-메티오닌 및 ATP를 S-아데노실메티오닌으로 전환시킬 수 있는 단백질을 지칭한다. 당업자는 metK 단백질의 다른 세부사항에 익숙하다. metK의 효소 활성은 문헌 [Markham, G.D. et al. (1983) Methods in Enzymology 94:219-222]에서 발견되는 프로토콜인 효소 분석에 의해 검출될 수 있 다.
본 발명의 범위 내에서, "황 함유 정밀 화학물질"이라는 용어는 공유 결합된 하나 이상의 황 원자를 함유하고 본 발명에 따른 발효 방법에 의해 수득될 수 있는 임의의 화학적 화합물을 포함한다. 비제한적인 예는 메티오닌, 호모시스테인, S-아데노실메티오닌, 시스테인이며, 특히 메티오닌 및 S-아데노실메티오닌이다.
본 발명의 범위 내에서, "L-메티오닌", "메티오닌", "호모시스테인" 및 "S-아데노실메티오닌"이라는 용어는 또한 예를 들어 메티오닌-히드로클로라이드 또는 메티오닌 술페이트와 같은 상응하는 염을 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA)를 지칭하며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA의 형태를 취할 수 있다.
본 발명에 따라 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 의미하는 것으로 이해된다.
"대사산물"이라는 용어는 중간체로서 또는 최종 생성물로서 유기체의 대사에서 발생하고, 화학적 단위로서의 그의 특성 외에 또한 효소에 대한 조절 효과 및 그의 촉매 활성을 발휘할 수 있는 화학적 화합물을 지칭한다. 이러한 대사산물은 효소의 활성에 대한 억제 및 자극 효과 둘 다를 가질 수 있음이 문헌에 공지되어 있다 (문헌 [Biochemistry, Stryer, Lubert, 1995 W. H. Freeman & Company, New York, New York]). 문헌에는 또한 UV 방사선, 이온화 방사선 또는 돌연변이 유발 물질에 의해 게놈 DNA를 돌연변이시키고, 이어서 특이적 표현형을 선택하는 것과 같은 수단에 의해, 유기체에서 대사산물에 의한 영향이 변형된 효소를 제조하는 것이 가능하다고 기재되어 있다 (문헌 [Sahm H., Eggeling L., de Graaf A. A. Biological Chemistry 381(9-10):899-910, 2000]; [Eikmanns BJ., Eggeling L., Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94]). 상기 변형된 특성은 또한 표적화된 수단에 의해 수득될 수 있다. 상기 내용에서, 당업자는 또한 효소에 대한 유전자에서, 발현된 DNA 서열로부터 생성된 단백질이 특이적 신규한 특성을 갖는 방식으로 단백질을 코딩하는 DNA의 특이적 뉴클레오티드를 특이적으로 변형시키는 것을 알게 된다. 예를 들어, 이는 비변형된 단백질에 비해 변형된 대사산물의 조절 효과를 초래할 수 있다. 또한, 효소 활성은 감소된 반응 속도 또는 기질에 대한 친화도 변화를 초래하는 방식으로 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 내용에서, "발현시키다" 또는 "증강" 또는 "과발현"이라는 용어는 해당 DNA에 의해 코딩되는 미생물에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성의 생성 또는 증가를 기재한다. 상기 목적을 위해, 예를 들어 유전자를 유기체 내로 도입하거나, 존재하는 유전자를 또다른 유전자에 의해 대체하거나, 유전자 또는 유전자들의 카피 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 높은 활성을 갖는 해당 효소를 코딩하는 유전자를 사용할 수 있으며, 적절할 경우 상기 방법은 조합될 수 있다.
본 발명의 내용 내에서, "약화시킴" 및 "감소시킴"이라는 용어는 해당 DNA에 의해 코딩되는 미생물에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성의 약화 또는 감소를 기재한다. 상기 목적을 위해, 예를 들어 유기체에서 유전자를 결실시키거나, 존재하 는 유전자를 또다른 유전자에 의해 대체하거나, 유전자 또는 유전자들의 전사의 카피 수를 감소시키거나, 약한 프로모터를 사용하거나, 낮은 활성을 갖는 상응하는 효소를 코딩하는 유전자를 사용할 수 있으며, 적절할 경우 상기 방법은 조합될 수 있다.
본 발명에 따른 S-아데노실메티오닌 신타제 돌연변이체 또는 기능적 등가물의 "감소된 활성"은 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형, ATCC 13032로부터와 같은 천연 S-아데노실메티오닌 신타제의 활성과 비교함으로써 측정될 수 있다. 상기 목적을 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되고 S-아데노실메티오닌 신타제에 대한 유전자를 운반하는 플라스미드는 적합하게는 형질전환에 의해 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형, ATCC 13032 내로 도입된다. 더욱이, 야생형 효소 S-아데노실메티오닌 신타제를 발현시키는 적합한 플라스미드는 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형, ATCC 13032 내로 도입된다. 이렇게 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체를 적합한 배지에서 성장시키고, 동일한 OD600에서 대수 성장기 동안 배양한다. 그 후, 공지된 프로토콜에 따라 두 가지 형질전환체의 배양된 세포로부터 단백질 추출물을 제조한다. 그 후, 동일한 양의 상기 단백질 추출물 (단백질 확인에 따름)을 문헌 [Markham, G.D. et al. (1983) Methods in Enzymology 94: 219-222]의 방법에 의해 S-아데노실메티오닌 신타제 분석에 사용한다. 형성된 S-아데노실메티오닌의 방사능을 섬광 카운터에서 측정한다. 방사성 L-메티오닌의 특이적 활성 및 사용된 단백질의 양을 고려하여, S-아데노실메티 오닌 형성 속도를 단위 시간당 혼입된 방사능의 증가로부터 측정할 수 있다. 단위는 S-아데노실메티오닌 μmol/분×단백질 mg이다. 상기 속도를 야생형 효소와 돌연변이체 효소 간에 비교할 수 있다. S-아데노실메티오닌 신타제 활성을 갖는 다른 야생형 효소로부터 출발하여, 본 발명에 따라 유용한 돌연변이체를 동일한 원리로 생성할 수 있다.
"감소된 활성"은 본 발명에 따라 특히 돌연변이체의 특이적 활성이 야생형 활성의 약 1 내지 90%, 바람직하게는 3 내지 70%, 예를 들어 5 내지 10%의 잔류 활성으로 감소될 경우에 존재한다.
b) 본 발명에 따른 metK 단백질
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 변형된, 특히 감소된 상기 정의된 것과 같은 S-아데노실메티오닌 신타제 활성을 갖는 단백질을 코딩한다.
본 발명에 따라 유용한 돌연변이체는 바람직하게는 그램 양성 및(또는) 그램 음성, 특히 코리네형 박테리아의 metK 아미노산 서열 내의 하나 이상의 보존된 시스테인 잔기를 치환함으로써 수득된다. 보존된 시스테인 잔기는 서열 정렬을 이용하여 용이하게 확인할 수 있다. 박테리아 S-아데노실메티오닌 합성에서 보존된 시스테인의 비제한적인 예는 씨. 글루타미쿰으로부터의 효소의 Cys24 및 cys94이며, 이는 다수의 박테리아에서 발견된다.
본 발명에 따른 돌연변이체의 바람직한 군에서, Cys24 및(또는) Cys94 (씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 metK에 따름)는 시스테인 이외의 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환되며, 그에 의해 효소 활성은 상기 방식으로 감소된다.
본 발명의 범위 내에서, "기능적 등가물" 또는 구체적으로 개시된 폴리펩티드의 유사체는 이들과 다르지만, 예를 들어 기질 특이성과 같은 바람직한 생물학적 활성을 여전히 보유하는 폴리펩티드이다.
본 발명에 따라, "기능적 등가물"은 특히 하나 이상의 상기 언급된 서열 위치에서 구체적으로 언급된 아미노산보다 또다른 아미노산을 갖지만, 상기 언급된 생물학적 활성 중 하나를 여전히 보유하는 돌연변이체를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, "기능적 등가물"은 하나 이상의 아미노산 첨가, 치환, 결실 및(또는) 역위에 의해 수득가능한 돌연변이체를 포함하며, 본 발명에 따른 특징의 프로파일을 갖는 돌연변이체를 초래하는 한, 상기 언급된 변형체를 임의의 서열 위치에 위치시킬 수 있다. 특히, 기능적 등가물은 또한 돌연변이체와 비변형된 폴리펩티드 간의 반응성 패턴이 질적으로 일치할 경우, 즉 예를 들어 동일한 기질이 상이한 속도로 전환될 경우 존재한다.
당연히, "기능적 등가물"은 또한 다른 유기체로부터 수득될 수 있는 폴리펩티드, 및 천연 발생 변이체를 포함한다. 예를 들어, 상동성 서열 영역의 범위는 서열에 의해 확인될 수 있으며, 등가 효소는 본 발명의 구체적 목적의 관점에서 결정될 수 있다.
또한, "기능적 등가물"은 단편, 바람직하게는 개별 도메인 또는 서열 모티프, 또는 예를 들어 바람직한 생물학적 기능을 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함한다.
더욱이, "기능적 등가물"은 상기 언급된 폴리펩티드 서열 중 하나 또는 그로 부터 유래된 기능적 등가물 및 기능적 N- 또는 C-말단 결합에서 하나 이상의 추가의 기능적으로 상이한 이종 서열 (즉, 융합 단백질 잔기가 서로에 의해 실질적으로 기능적으로 불리하게 영향받지 않음)과의 융합 단백질이다. 이러한 이종 서열의 비제한적 예는 예를 들어 시그날 펩티드, 효소, 면역글로불린, 표면 항원, 수용체, 또는 수용체 리간드이다.
본 발명에 따라 또한 포함되는 "기능적 등가물"은 구체적으로 개시된 단백질에 대한 상동체이다. 상기 상동체는 구체적으로 개시된 서열 중 하나와 문헌 [Pearson and Lipman's algorithm, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448]을 사용하여 계산된 20%, 30% 이상, 또는 예를 들어 40%, 50% 이상, 바람직하게는 약 60%, 65%, 70% 또는 75% 이상, 특히 85% 이상, 예를 들어 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
특히 바람직한 돌연변이체 및 기능적 유사체는 상기 정의된 것과 같은 특징적 부분 서열을 함유하는 것들이다.
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
상기 식에서, X3은 시스테인 이외의 돌연변이, 특히 알라닌에 의해 도입된 아미노산이다. X3은 씨. 글루타미쿰의 metK 야생형 서열 (서열 16)의 Cys94에 상응한다. X2는 바람직하게는 Ala, Glu, Asp, Asn 또는 Arg를 나타내고, X1은 바람직하게는 Gly, Cys, Ser 또는 Ala를 나타낸다.
본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩티드의 상동체는 돌연변이 유발에 의해, 예를 들어 점 돌연변이 또는 단백질의 말단 절단에 의해 생성될 수 있다. 본 내용에 사용된 "상동체"라는 용어는 단백질 활성의 작용제 또는 길항제로서 작용하는 단백질의 변이 형태에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단백질의 상동체는 예를 들어 말단 절단된 돌연변이체와 같은 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 단백질 변이체의 변화된 라이브러리는 예를 들어 핵산 수준에서의 조합 돌연변이 유발에 의해, 예를 들어 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 효소적으로 리게이션함으로써 생성할 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드 서열로부터의 잠재적 상동체의 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있는 다수의 방법이 이용가능하다. 변성 유전자 서열은 DNA 합성기에서 화학적으로 합성할 수 있으며, 그 후 합성 유전자를 적합한 발현 벡터 내로 리게이션할 수 있다. 변성 유전자 세트를 사용하면 혼합물에서 잠재적 단백질 서열의 바람직한 세트를 코딩하는 모든 서열을 제공할 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3]; [Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323]; [Itakura et al., (1984) Science 198:1056]; [Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477]).
단백질 코돈 단편의 라이브러리는 또한 본 발명에 따른 단백질의 상동체를 스크리닝하고 이어서 선별하기 위한 단백질 단편의 변화된 집단을 생성하는데 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 코딩 서열 단편의 라이브러리는 코딩 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 절단이 분자당 약 한 번만 일어나는 조건 하에서 뉴클레아제로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 다양한 절단된 생성물의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA의 형성으로 DNA를 복원하고, S1 뉴클레아제로 처리함으로써 새롭게 형성된 가닥으로부터 단일 가닥 절편을 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 리게이션함으로써 생성할 수 있다. 상기 방법은 다양한 크기의 본 발명에 따른 단백질을 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 코딩하는 발현 라이브러리를 가능하게 한다.
유전자의 돌연변이 유발에 대한 다수의 기술이 종래 기술에 공지되어 있다: 문헌 [Coco, WM et al. 2001. DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes. Nature Biotechnol. 19:354-359]; DE 19953854; [Leung DW et al. 1989. A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction. Technique 1: 11-15]; [Stemmer WPC 1994. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:10747-10751]; 및 미국 특허 제5,811,238호. 상기 방법은 본 발명에 따라 유용한 돌연변이체를 생성하는데 사용될 수 있다.
점 돌연변이 또는 절단에 의해 생성된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하는, 그리고 선택된 특징을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 다수의 기술이 종래 기술에 공지되어 있다. 상기 기술은 본 발명에 따른 상동체의 조합 돌연변이 유발에 의해 성성된 유전자 라이브러리의 급속한 스크리닝에 적용될 수 있다. 고 처리량 분석이 가능한 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하는데 가장 빈번히 사용되는 기술은 유전자 라이브러리를 복제가능 발현 벡터 내로 클로닝하고, 적합한 세포를 생성된 벡터 라이브러리로 형질전환하고, 바람직한 활성의 검출이 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 단리를 단순화하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 증가시키는 기술인 반복 앙상블 돌연변이 유발 (Recursive ensemble mutagenesis (REM))은 상동체를 확인하기 위한 스크리닝 분석과 조합으로 사용될 수 있다 (문헌 [Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815]; [Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331]).
c) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 metK 효소를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어 cDNA 및 mRNA와 같은 단일 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 서열) 및 특히 합성 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 수득될 수 있는 그의 기능적 등가물에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 또는 이의 생물학적 활성 절편, 및 예를 들어 본 발명에 따른 코딩 핵산을 확인 또는 증폭하기 위한 혼성화 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 핵산 단편에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명에 따른 핵산 분자는 유전자의 코딩 영역의 3'- 및(또는) 5'-말단 비번역 서열을 함유할 수 있다.
"단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되며, 재조합 기술에 의해 제조될 경우 또한 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 없을 수 있거나, 화학적으로 합성될 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없을 수 있다.
더욱이, 본 발명은 구체적으로 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자, 또는 그의 절편을 포함한다.
본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 다른 세포 종류 및 유기체에서 상동성서열을 확인 및(또는) 클로닝하는데 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머의 생성을 가능하게 한다. 이러한 프로브 또는 프라이머는 통상적으로 약 12 이상, 바람직하게는 약 25 이상, 예를 들어 약 40, 50 또는 75 이상의 본 발명에 따른 핵산 서열의 센스 가닥 또는 상응하는 안티센스 가닥의 연속적인 뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다.
그리고, 본 발명에 따른 핵산 서열은 서열 21로부터 유래되며, 개별 또는 몇 개의 뉴클레오티드의 첨가, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 그와 달라지지만, 바람직한 특징 프로파일을 갖는 폴리펩티드를 계속 코딩한다. 이는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80% 또는 90% 이상, 바람직하게는 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 위치에서 상기 서열과 동일한 폴리뉴클레오티드의 형태를 취할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라, 구체적인 기원 유기체, 또는 숙주 유기체의 코돈 용법에 따라 침묵 돌연변이로서 알려진 것을 포함하거나 구체적으로 언급된 서열과 비교시 변형된 핵산 서열, 및 예를 들어 대립유전자 변이체와 같은 그의 천연 발생 변이체가 포함된다. 또다른 요지는 보존적 뉴클레오티드 치환 (즉, 해당 아미노산이 동일한 전하, 크기, 극성 및(또는) 용해도의 아미노산에 의해 대체됨)에 의해 수득될 수 있는 서열이다.
본 발명의 또다른 요지는 서열 다형성에 의해 구체적으로 개시된 핵산으로부터 유래된 분자이다. 상기 유전적 다형성은 천연 변이 때문에 개체군 내의 개체 간에 존재할 수 있다. 상기 천연 변이는 통상적으로 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 1 내지 5%의 변이도를 야기한다.
더욱이, 본 발명은 또한 상기 언급된 코딩 서열과 혼성화되거나 그에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝할 경우 발견되고, 적절할 경우 그로부터 PCR에 의해 적합한 프라이머로 증폭되고, 이어서 예를 들어 적합한 프로브를 사용하여 단리될 수 있다. 또다른 가능성은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 이용한 적합한 미생물의 형질전환, 미생물의 증식, 및 그에 따른 폴리뉴클레오티드의 증폭, 및 그의 후속적 단리이다. 더욱이, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 화학적으로 합성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드와 "혼성화될" 수 있는 특징은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 엄격한 조건 하에서 사실상 상보적인 서열에 결합하는 능력을 의미하는 것으로 이해되며, 비상보성 파트너 간의 비특이적 결합은 상기 조건 하에서 일어나지 않는다. 상기 목적을 위해, 서열은 70 내지 100%, 바람직하게는 90 내지 100%의 상보성을 나타낸다. 서로 특이적으로 결합할 수 있는 상보적 서열의 특징은 예를 들어 노던 또는 서던 블롯 기술에서, 또는 PCR 또는 RT-PCR에서의 프라이머 혼성화에서 이용된다. 통상적으로, 30 염기쌍의 길이로부터의 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 엄격한 조건은 예를 들어 노던 블롯 기술에서 비특이적으로 혼성화된 cDNA 프로브 또는 올리고뉴클레오티드의 용리를 위해 세척 용액, 바람직하게는 0.1 ×SSC 완충액, 0.1% SDS (20 ×SSC: 3M NaCl, 0.3M Na 시트레이트, pH 7.0)의 사용, 50 내지 70℃, 바람직하게는 60 내지 65℃의 온도를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 언급된 것과 같이, 높은 정도의 상보성을 나타내는 핵산만이 서로 결합된 채 남는다. 엄격한 조건의 설정은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다.
d) 코딩 metK 유전자 및 다른 유전자의 단리
효소 S-아데노실메티오닌 신타제 (EC 2.5.1.6)를 코딩하는 metK 유전자는 그 자체로서 공지된 방식으로 단리할 수 있다.
metK 유전자 또는 다른 유기체의 다른 유전자를 단리하기 위해, 첫번째 단계로서 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli; E. coli)에서 상기 유기체의 유전자 라이브러리를 확립한다. 유전자 라이브러리의 확립은 일반적으로 공지된 교재 및 참고 문헌에 상세하게 기재되어 있다. 언급될 수 있는 예는 교재 [Winnacker: Gene and Klone, Eine Einfuehrung in die Gentechnologie [Genes and clones, An introduction to genetic engineering] (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990)], 또는 참고 문헌 [Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]이다. 매우 널리 공지된 유전자 라이브러리는 이. 콜라이 K-12 균주 W3110이며, 이는 코하라 (Kohara) 등 (문헌 [Cell 50, 495-508 (198)])에 의해 λ 벡터에서 확립되었다.
코스미드 벡터 SuperCos I (문헌 [Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164)])과 같은 코스미드, 또한 pBR322 (문헌 [Bolivar; Life Sciences, 25, 807-818 (1979)]) 또는 pUC9 (문헌 [Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268])와 같은 플라스미드는 이. 콜라이에서 유전자 라이브러리를 확립하는데 사용될 수 있다. 숙주로서 특히 적합한 이. 콜라이 균주는 제한 결손 및 재조합 결손인 것들이다. 그 예는 균주 DH5αxmcr이며, 이는 문헌 [Grant et al. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 [Sanger et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977]에 기재된 바와 같이, 코스미드로 클로닝된 긴 DNA 단편을 이번에는 이어서 스크리닝에 적합한 통상의 벡터 내로 서브클로닝하고, 이어서 시퀀싱한다.
그 후, 생성된 DNA 서열을 예를 들어 스테이든 (Staden) (문헌 [Nucleic Acids Research (1986) 14, 217-232])에 의한 프로그램, 마크 (Marck) (문헌 [Nucleic Acids Research (1988) 16, 1829-1836])에 의한 프로그램, 또는 부틀러 (Butler)의 GCG 프로그램 (문헌 [Methods of Biochemical Analysis (1998) 39, 74-97])과 같은 공지된 알고리듬 또는 서열 분석 프로그램으로 연구할 수 있다.
당업자는 특히 참고 문헌 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)] 및 문헌 [Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]의 혼성화 수단에 의해 DNA 서열의 확인을 위한 프로토콜을 발견할 것이다. 당업자는 특히 참고 문헌 [Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 [Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 DNA 서열의 증폭을 위한 프로토콜을 발견할 것이다.
더욱이, 단백질의 N 및(또는) C 말단의 변형은 실질적으로 단백질의 기능에 영향을 미치지 않으며, 실제로 이들은 심지어 단백질을 안정화할 수 있음이 공지되어 있다. 당업자는 특히 문헌 [Ben-Bassat et al. (1987) Journal of Bacteriology 169: 751-757], [O'Regan et al. (1989) Gene 77: 237-251], [Sahin-Toth et al. (1994) Protein Sciences 3: 240-247], [Hochuli et al. (1988) Biotechnology 6: 1321-1325] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재에서 상기 주제에 대한 정보를 발견할 것이다.
e) 본 발명에 따라 사용되는 숙주 세포
본 발명에 따른 방법에 사용되는 숙주 세포는 바람직하게는 감소된 metK 활성이 하기 특성 중 하나 이상을 통해 검출될 수 있는 코리네형 박테리아이다:
a) 야생형 균주에 비해 감소된 세포내 S-아데노실메티오닌 역가
b) 감소된 세포내 S-아데노실메티오닌 신타제 농도 (총 단백질을 기준으로 적은 S-아데노실메티오닌 신타제), 또는
c) 감소된 세포내 S-아데노실메티오닌 신타제 활성 (S-아데노실메티오닌 신타제 단백질 함량을 기준으로 적은 S-아데노실메티오닌 신타제 효소 활성).
상기 특성 모두는 간단한 방식으로, 적절할 경우 상기 기재를 고려하여 당업자에 의해 측정될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 특히 숙주 세포로서 작용하는 미생물, 특히 벡터, 특히 하나 이상의 본 발명에 따라 정의된 것과 같은 metK 유전자를 갖는 셔틀 벡터 또는 플라스미드 벡터를 함유하는 코리네형 박테리아, 또는 감소된 활성을 갖는 본 발명에 따른 metK 유전자가 발현된 코리네형 박테리아에 관한 것이다.
상기 미생물은 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스로부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌을 생산할 수 있다. 이는 바람직하게는 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 박테리아이다. 코리네박테리움 속 중에서, L-아미노산을 생산하는 능력에 대해 전문가 집단에서 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 특히 언급되어야 한다.
코리네형 박테리아의 적합한 균주로 언급되어야 할 예는 코리네박테리움 속의 것들, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (씨. 글루타미쿰) 종의 것들, 예를 들어
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032,
코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806,
코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870,
코리네박테리움 테르모아미노제네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,
코리네박테리움 멜라세콜라 (Corynebacterium melassecola) ATCC 17965, 또는
브레비박테리움 (Brevibacterium) 속의 것들, 예를 들어
브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067
브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 및
브레비박테리움 디바리카툼 (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020,
또는 그로부터 유래된 균주, 예를 들어
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065,
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608이며,
이들은 또한 목적하는 정밀 화학물질 또는 그의 전구체(들)을 생산한다 (KFCC = Korean Federation of Culture Collection; ATCC = American Type Culture Collection).
f) 본 발명에 따른 발효의 수행
본 발명에 따라, 코리네형 박테리아는 본 발명에 따른 metK 유전자를 발현시킨 후 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌을 유리한 방식으로 생산함이 밝혀졌다.
효소, 예를 들어 S-아데노실메티오닌 신타제인 metK의 활성 또는 양을 감소시키기 위해, 다양한 방법이 개별적으로 또는 조합으로 당업자에 의해 취해질 수 있다. 해당 단백질의 농도는 본 발명에 따른 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 빈도를 감소시킴으로써 감소될 수 있다. 이는 코딩 유전자의 프로모터 영역, 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위를 변형시키거나 치환함으로써 당업자에 의해 달성될 수 있다. 코딩 영역의 하류에서 당업자는 종결자 또는 삽입 서열을 변형시켜 전사의 안정성을 감소시킬 수 있다. mRNA의 수명을 감소시키는 상기 방법은 상응하는 단백질의 발현 및 그에 따른 그의 농도를 감소시킬 수 있다.
발현된 효소의 수준에서, 융합된 서열은 파괴율을 증가시키고 그에 따라 또한 단백질 농도를 감소시킬 수 있다. 더욱이, 당업자는 코딩 유전자의 지정 또는 비지정 돌연변이 유발에 의해 활성, 기질 친화도 및 기질 특이성을 변형할 수 있다. 효소의 활성은 그 결과가 효소 반응의 반응 속도를 어느 정도, 또는 완전히 감소시키는 방식으로 상응하는 유전자에서 돌연변이에 의해 영향받을 수 있다. 이러한 돌연변이의 예는 당업자에게 공지되어 있다 (문헌 [Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001], [Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94]). 단백질의 돌연변이체는 또한 효소 복합체의 호모- 또는 헤테로다중화도를 감소시키거나 방해하고 따라서 다시 효소 특성의 열화를 초래할 수 있다.
이러한 방식으로 변형된 유전자는 플라스미드에 존재하거나, 바람직하게는 염색체 내로 삽입될 수 있다. 상기 방식으로 변형되지 않은 원래 유전자는 또한 여전히 존재할 수 있으나, 바람직하게는 변형된 유전자로 치환된다.
코리네형 박테리아에서 측정된 것과 같은 효소, 예를 들어 S-아데노실메티오닌 신타제 (metK)의 활성을 감소시키기 위해, 인공적으로 생성된 돌연변이 또는 다른 유기체로부터의 천연 상동체와 같은 기능적 등가물을 코딩하는 유전자를 발현시키는 것으로 충분할 수 있다. 원래 유전자는 또한 존재할 수 있으나, 바람직하게는 변형된 또는 상동성 유전자에 의해 치환된다.
발효에 의해 코리네형 박테리아에서 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌을 제조할 경우, 본 발명에 따른 metK 유전자를 발현시킬 뿐만 아니라, 해당 생합성 경로, 시스테인 대사 경로, 아스파르테이트 세미알데히드 합성, 해당과정, 보충대사, 펜토스-포스페이트 대사, 아미노산 수송의 시트레이트 회로의 하나 이상의 효소를 증강시키는 것이 또한 유리할 수 있다.
따라서, 하나 이상의 하기 유전자를 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 제조를 위해 증강시킬 수 있다:
- 유전자 lysC, 아스파르테이트 키나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 281),
- 유전자 asd, 아스파르테이트 세미알데히드를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 282),
- 유전자 gap, 글리세린알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩함 (문헌 [Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086]),
- 유전자 pgk, 3-포스포글레세레이트 키나제를 코딩함 (문헌 [Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086]),
- 유전자 pyc, 피루베이트 카르복실라제를 코딩함 (문헌 [Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086]),
- 유전자 tpi, 트리오스-포스페이트 이소메라제를 코딩함 (문헌 [Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086]),
- 유전자 metA, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA- 서열 725),
- 유전자 metB, 시스타티오닌-감마 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3491),
- 유전자 metC, 시스타티오닌-감마 리아제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3061),
- 유전자 metT, 메티오닌-신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 1663),
- 유전자 glyA, 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 1110),
- 유전자 metY, 0-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 726),
- 유전자 metF, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2379),
- 유전자 serC, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 928)
- 유전자 serB, 포스포세린-포스파타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 334, DNA - 서열 467, DNA - 서열 2767)
- 유전자 cysE, 세린 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2818)
- 유전자 cysK, 시스테인 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2817),
- 유전자 hom, 호모세린 데히드로게나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 1306).
따라서, 코리네형 박테리에서 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 제조를 위해 상응하는 단백질이 비돌연변이된 단백질과 비교시 그의 활성의 관점에서 대사산물에 의해 덜 또는 전혀 영향을 받지 않도록, 또는 그의 특이적 활성이 증강되도록 하나 이상의 하기 유전자를 동시에 돌연변이시키는 것이 유리할 수 있다:
- 유전자 lysC, 아스파르테이트 키나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 281),
- 유전자 pyc, 피루베이트 카르복실라제를 코딩함 (문헌 [Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086]),
- 유전자 metA, 호모세린 0-아세틸트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 725)
- 유전자 metB, 시스타티오닌-감마 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3491)
- 유전자 metC, 시스타티오닌-감마 리아제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3601)
- 유전자 metH, 메티오닌 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 1663),
- 유전자 glyA, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 1110),
- 유전자 metY, 0-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 726),
- 유전자 metF, 메틸렌 테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2379),
- 유전자 serC, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 928)
- 유전자 serB, 포스포세린-포스파타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 334, DNA - 서열 467, DNA - 서열 2767)
- 유전자 cysE, 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2818)
- 유전자 cysK, 시스테인 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2817),
- 유전자 hom, 호모세린 데히드로게나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 1306)
더욱이, 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 제조를 위해, 본 발명에 따른 metK 유전자 중 하나의 발현에 추가로, 하나 이상의 하기 유전자를 약화하는 것, 특히 그의 발현을 감소시키거나 스위치-오프 (switch-off)하는 것이 유리할 수 있다:
- 유전자 thrB, 호모세린 키나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3453)
- 유전자 ilvA, 트레오닌 데히드라타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2328)
- 유전자 thrC, 트레오닌 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3486)
- 유전자 ddh, 메소-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3494)
- 유전자 pck, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3157)
- 유전자 pgi, 글루코스-6-포스페이트 6-이소메라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 950)
유전자 poxB, 피루베이트 옥시다제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2873)
- 유전자 dapA, 디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3476)
- 유전자 dapB, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3477)
- 유전자 lysA, 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3451).
더욱이, 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 제조를 위해, 코리네형 박테리아에서 본 발명에 따른 metK 유전자의 발현에 추가로, 상응하는 단백질의 효소 활성이 어느 정도 또는 완전히 감소되는 방식으로 하나 이상의 하기 유전자를 동시에 돌연변이시키는 것이 유리할 수 있다:
- 유전자 thrB, 호모세린 키나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3453)
- 유전자 ilvA, 트레오닌 데히드라타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2328)
- 유전자 thrC, 트레오닌 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3486)
- 유전자 ddh, 메소-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3494)
- 유전자 pck, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3157)
- 유전자 pgi, 글루코스-6-포스페이트 6-이소메라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 950)
- 유전자 poxB, 피루베이트 옥시다제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 2873)
- 유전자 dapA, 디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3476)
- 유전자 dapB, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3477)
- 유전자 lysA, 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제를 코딩함 (EP 1 108 790 A2; DNA - 서열 3451)
더욱이, 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 제조를 위해, 코리네형 박테리아에서 본 발명에 따른 metK 유전자의 발현 이외에, 바람직하지 않은 이차 반응을 제거하는 것이 유리할 수 있다 (문헌 [Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982]).
당업자는 과발현을 달성하기 위해 다양한 방법을 개별적으로 또는 조합으로 취할 수 있다. 즉, 해당 유전자의 카피 수를 증가시킬 수 있거나, 구조 유전자의 상류에 위치한 프로모터 영역 및 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 도입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 그리고, 유도성 프로모터는 발효에 의한 L-메티오닌의 제조 동안 발현을 증가시킬 수 있게 한다. 발현은 또한 mRNA의 수명을 연장시키는 방법에 의해 개선된다.
더욱이, 효소 활성은 또한 효소 단백질의 변성을 방지함으로써 증가된다. 유전자 또는 유전자 작제물은 상이한 카피 수를 갖는 플라스미드에 존재하거나 또는 염색체에 통합되고 증폭될 수 있다. 별법으로서, 해당 유전자의 과발현은 더욱이 배지 조성 및 발효 공정을 변형함으로써 달성될 수 있다.
당업자는 상기 주제에 대한 정보를 특히 문헌 [Martin et al. (Biotechnology 5, 137-146 (1987))], [Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))], [Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))], [Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))], 유럽 특허 제0472869호, 미국 특허 제4,601,893호, [Schwarzer and Puehler (Biotechnology 9, 84-87 (1991))], [Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))], [LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))], WO 96/15246호, [Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))], JP-A-10-229891호, [Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))], [Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996))] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재에서 발견할 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 조절 핵산 서열의 유전적 제어 하에 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물, 및 하나 이상의 상기 발현 작제물을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 본 발명에 따른 작제물은 각각의 경우에 코딩 서열과 작동적 결합된 해당 코딩 서열의 프로모터 5'-상류, 및 3'-하류, 종결 서열 및 적절할 경우 추가의 통상의 조절 요소를 포함 한다. "작동적 결합"은 코딩 서열의 발현시 각각의 조절 요소가 그의 의도된 기능을 수행할 수 있는 방식으로 프로모터, 코딩 서열, 종결자 및 적절할 경우 추가의 조절 요소의 서열적 배열을 의미하는 것으로 이해된다. 작동적 결합이 가능한 서열의 예는 활성화 서열 및 인핸서 등이다. 추가의 조절 요소의 예로는 선택적 마커, 증폭 시그날, 복제 원점 등을 들 수 있다. 적합한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다.
천연 조절 서열은 인공 조절 서열 이외에 실제 구조 유전자의 상류에 여전히 존재할 수 있다. 적절할 경우, 상기 천연 조절은 유전적 변형에 의해 제거될 수 있으며, 유전자 발현은 증가되거나 감소될 수 있다. 그러나, 유전자 작제물은 또한 제작에서 보다 단순할 수 있으며, 즉 추가의 조절 시그날이 구조 유전자 앞에 삽입되지 않고, 그의 조절을 갖는 천연 프로모터가 제거되지 않는다. 대신, 천연 조절 서열은 조절이 더이상 일어나지 않는 방식으로 돌연변이되고, 유전자 발현은 증가되거나 감소된다. 핵산 서열의 하나 이상의 카피는 유전자 작제물에 존재할 수 있다.
유용한 프로모터의 예는, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 프로모터 ddh, amy, lysC, dapA, lysA, 뿐만 아니라 문헌 [Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives, Sonenshein, Abraham L., Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington and Patek M. Eikmanns BJ. Patek J. Sahm H. Microbiology. 142 1297-309, 1996]에 기재된 것과 같은 그램 양성 프 로모터 SP02, 또는 그램 음성 박테리아에 유리하게 사용되는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, I-PR 또는 I-PL 프로모터이다. 또한 바람직한 것은 예를 들어 광 유도성, 특히 PrPl 프로모터와 같은 온도 유도성 프로모터와 같은 유도성 프로모터의 사용이다. 원칙적으로, 모든 천연 프로모터는 그의 조절 서열과 함께 사용될 수 있다. 그리고, 합성 프로모터는 또한 유리하게 사용될 수 있다.
상기 언급된 조절 서열은 핵산 서열의 표적화된 발현 및 단백질 발현을 가능하게 하고자 하는 것이다. 숙주 유기체에 따라, 이는 예를 들어 유전자가 유도 후에만 발현되거나 과발현되는 것, 또는 즉시 발현되고(거나) 과발현되는 것을 의미할 수 있다.
본 내용에서, 조절 서열 또는 인자는 바람직하게는 발현에 역효과, 즉 발현의 감소를 갖지 않는다. 즉, 감소는 프로모터 및(또는) 인핸서와 같은 약한 전사 시그날을 이용함으로써 전사적 수준에서 일어날 수 있다. 그러나, 전사의 감소는 또한 예를 들어 mRNA 안정성을 감소시킴으로써 가능하다.
본 내용에서, 조절 서열 또는 인자는 바람직하게는 발현에 긍정적 효과, 즉 발현의 증가 또는 감소를 갖는다. 즉, 조절 요소의 증강은 프로모터 및(또는) 인핸서와 같은 강한 전사 시그날을 이용함으로써 전사적 수준에서 유리하게 일어날 수 있다. 그러나, 전사의 증강은 또한 예를 들어 mRNA 안정성을 증가시킴으로써 가능하다.
발현 카세트는 metK 뉴클레오티드 서열 및 적합한 종결 시그날을 갖는 적합한 프로모터인 적합한 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열을 융합시킴으로써 생성된다. 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York New York], [PCR Methods, Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sinsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego], [PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser., Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey], [Totowa. T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], [T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기재된 것과 같은 통상의 재조합 및 클로닝 기술이 상기 목적을 위해 사용된다.
적합한 숙주 유기체에서의 발현을 위해, 재조합 핵산 작제물 또는 유전자 작제물은 유리하게는 숙주에서 유전자의 최적 발현을 가능하게 하는 숙주 특이적 벡터 내로 삽입된다. 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 ["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에서 발견될 수 있다. 플라스미드와는 달리, 벡터는 또한 예를 들어 파지, 트랜스포존, IS 요소, 파지미드, 코스미드, 및 선형 또는 원형 DNA와 같 은 당업자에게 익숙한 모든 다른 벡터를 의미하는 것으로 이해된다. 상기 벡터는 숙주 유기체에서 자율적으로 복제되거나, 염색체적으로 복제될 수 있다.
본 발명에 따른 metK 유전자는 예를 들어 에피솜 플라스미드에 의해 발현된다. 적합한 플라스미드는 코리네형 박테리아에서 복제된 것들이다. 예를 들어 pZ1 (문헌 [Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]), pEKEx1 (문헌 [Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)]) 또는 pHS2-1 (문헌 [Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)])과 같은 다수의 공지된 플라스미드 벡터는 잠재 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기재로 한다. 예를 들어 pCLiK5MCS, 서열 9, 또는 pCG4 (US-A 4,489,160호) 또는 pNG2 (문헌 [Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)]) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891호)을 기재로 한 것들과 같은 다른 플라스미드가 또한 사용될 수 있다.
다른 적합한 플라스미드 벡터는 예를 들어 hom-thrB 오페론의 복제 또는 증폭에 대한 문헌 [Remscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기재된 것과 같은 염색체 내로의 통합에 의한 유전자 증폭의 방법의 보조가 적용될 수 있는 것들이다. 상기 방법에서, 완전 유전자는 숙주 (전형적으로 이. 콜라이)에서 복제될 수 있으나 씨. 글루타미쿰에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 적합한 벡터는 예를 들어 pSUP301 (문헌 [Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)]), pKl8mob 또는 pKl9mob (문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]), [Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)]), pEM1 (문헌 [Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516]) 또는 pBGS8 (문헌 [Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342])이다. 예를 들어 pCLiK5MCS 통합 sacB, 서열 12와 같은 다른 플라스미드 벡터가 또한 사용될 수 있다.
증폭될 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터는 발효에 의해 목적하는 씨. 글루타미쿰 균주 내로 전달된다. 형질전환 방법은 예를 들어 문헌 [Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)], [Dunican and Shivnan, Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)] 및 [Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 제조된 미생물은 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌의 제조를 위한 배치 (batch) 방법, 공급 배치 (fed-batch) 방법 또는 반복 공급 배치 방법에 의해 연속적으로 또는 비연속적으로 성장시킬 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 개요는 교재 [Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 교재 [Storhas, Bioreaktoren and periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Units] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에서 발견할 수 있다.
사용되는 배양 배지는 적합하게는 해당 균주의 요구를 충족해야 한다. 다양한 미생물을 위한 배양 배지의 기재는 매뉴얼 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 발견된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 상기 배지는 통상적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및(또는) 미량 원소를 포함한다.
바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당이다. 매우 우수한 탄소 공급원의 예는 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스이다. 당은 또한 당밀과 같은 복합 화합물, 또는 당 정제의 다른 부산물을 통해 배지에 첨가될 수 있다. 다양한 탄소 공급원의 혼합물을 첨가하는 것은 또한 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 예를 들어 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방과 같은 오일 및 지방, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올, 및 예를 들어 아세트산 또는 락트산과 같은 유기산이다.
질소 공급원은 통상적으로 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄과 같은 암모늄 염, 질산염, 우레아, 아미노산, 또는 옥수수 침지액, 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등과 같은 복합 질소 공급원이다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물의 예로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 들 수 있다.
예를 들어 술페이트, 술파이트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술파이드와 같은 무기 황 함유 화합물, 뿐만 아니라 메르캅탄 및 티올과 같은 유기 황 화합물은 황 함유 정밀 화학물질, 특히 메티오닌의 제조를 위한 황 공급원으로서 사용될 수 있다.
인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염은 인 공급원으로서 사용될 수 있다.
봉쇄제는 용액 중 금속 이온을 유지하기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 특히 적합한 봉쇄제의 예로는 카테콜 또는 프로토카테큐에이트와 같은 디히드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 들 수 있다.
통상적으로, 본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 또한 비타민 또는 성장 촉진제와 같은 다른 성장 인자를 포함하며, 이들의 예로는 예를 들어 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 들 수 있다. 성장 인자 및 염은 대개 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 수득된다. 더욱이, 적합한 전구체는 배양 배지에 첨가될 수 있다. 배지 중의 화합물의 정확한 조성은 해당 실험에 크게 의존하며, 각각의 개별 경우에 대해 개별적으로 결정될 것이다. 배지의 최적화에 대한 정보는 교재 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 발견할 수 있다. 성장 배지는 또한 스탠다드 (Standard) 1 (머크 (Merck)) 또는 BHI (뇌 심장 주입물, 디프코 (DIFCO)) 등과 같은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다.
배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121℃에서 20분)에 의해 또는 여과 멸균에 의해 멸균된다. 성분은 함께 또는 적절할 경우 별도로 멸균된다. 배지의 모든 성분은 발효의 개시시에 존재할 수 있거나 또는 바람직할 경우 연속적으로 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.
배양 온도는 통상적으로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이며, 실험 동안 일정하게 유지되거나 변화될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 7.0 근처여야 한다. 발효를 위한 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물의 첨가에 의해 발효 동안 제어될 수 있다. 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 발포방지제는 발포체 발생을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 플라스미드 안정성을 유지하기 위해, 예를 들어 항생제와 같은 적합한 선택적으로 작용하는 물질이 배지에 첨가될 수 있다. 호기 조건을 유지하기 위해, 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물, 예를 들어 주위 공기를 배양물 내로 통과시킨다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 발효는 최대의 목적하는 생성물이 형성될 때가지 계속된다. 상기 목표는 통상적으로 10시간 내지 160시간 내에 달성된다.
상기 방식으로 수득된 발효 배양액, 특히 L-메티오닌을 포함하는 발효 배양액은 통상적으로 건조 바이오매스 7.5 내지 25 중량%를 함유한다.
추가의 이점은 적어도 마지막에, 그러나 특히 발효 기간의 30% 이상을 넘어서 당 제한 조건 하에 발효를 수행하는 것이다. 이는 상기 시간 동안 발효 배지에 서 이용가능한 당의 농도가 0 이상 내지 3 g/l에서 유지되거나 이 범위로 감소되는 것을 의미한다.
그 후, 발효 배양액을 더 가공처리한다. 요건에 따라, 바이오매스의 전부 또는 일부를 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리와 같은 분리 방법 또는 상기 방법의 조합에 의해 발효 배양액으로부터 제거하거나, 또는 상기 배양액으로부터 완전히 남겨둘 수 있다.
이어서, 발효 배양약을 공지된 방법으로, 예를 들어 회전 증발기, 박막 증발기, 강하막 증발기를 이용하여, 역삼투압에 의해 또는 나노여과에 의해 증점시키거나 농축할 수 있다. 그 후, 상기 농축된 발효 배양액을 동결 건조, 분무 건조, 분무 과립화에 의해, 또는 다른 방법에 의해 후처리할 수 있다.
그러나, 또한 황 함유 정밀 화학물질, 특히 L-메티오닌을 더 정제할 수 있다. 상기 목적을 위해, 바이오매스를 제거한 후, 생성물 함유 배양액을 적합한 수지를 이용한 크로마토그래피로 처리하여, 목적하는 생성물 또는 오염물의 전부 또는 일부를 크로마토그래피 수지 상에 체류시킨다. 상기 크로마토그래피 단계는 필요할 경우 동일하거나 다른 크로마토그래피 수지를 이용하여 반복할 수 있다. 당업자는 적합한 크로마토그래피 수지의 선택 및 그의 가장 효과적인 사용에 익숙하다. 정제된 생성물을 여과 또는 한외여과에 의해 농축하고 생성물의 안정성이 최대인 온도에서 저장할 수 있다.
단리된 화합물(들)의 확인 및 정제는 당업계의 기술에 의해 측정될 수 있다. 이들의 예로는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 분광학적 방법, 염색 방법, 박 막 크로마토그래피, NIRS, 효소 분석 또는 미생물학적 분석을 들 수 있다. 상기 분석 방법은 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140]; [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32]; [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70]; [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 and pp. 581-587]; [Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons]; [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 17]에 개요되어 있다.
하기 비제한적 실시예는 본 발명을 보다 상세히 기재한다:
도 1은 각각 야생형 효소 및 C94A 돌연변이체를 사용한 방사성 metK 분석의 결과를 나타낸다.
실시예 1
벡터 pCLiK5MCS의 제작
먼저, 벡터 pBR322의 암피실린 내성유전자 및 복제 원점을 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 1 및 서열 2를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)으로 증폭하였다.
서열 1
서열 2
pBR322에 상보적인 서열 이외에, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 1은 5'-3' 방향에 제한 뉴클레아제 SmaI, BamHI, NheI 및 AscI에 대한 절단 부위를 함유하며, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 2는 5'-3' 방향에 제한 엔도뉴클레아제 XbaI, XhoI, NotI 및 DraI에 대한 절단 부위를 함유한다. PCR 반응을 PfuTurbo 폴리메라제 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진 (Stratagene))를 사용하여 문헌 [Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]에 의한 것과 같은 표준 방법에 따라 수행하였다. 크기가 약 2.1 kb인 수득된 DNA 단편을 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아 (Amersham Pharmacia))를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. DNA 단편의 평활 말단을 급속 DNA 리게이션 키트 (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스 (Roche Diagnostics)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 서로에 리게이션하고, 리게이션 혼합물을 수용능 이. 콜라이 XL-1 블루 (Blue) (미국 라 졸라 소재, 스트라타진)를 사용하여 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포를 암피실린 (50 ㎍/ml) 함유 LB 아가 상에 플레이팅함으로써 선별하였다 (문헌 [Lennox, 1955, Virology, 1:190]).
개별 클론의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 (Qiaprep) 스핀 미니프렙 키트 (힐 덴 소재, 퀴아겐 (Qiagen))을 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하고, 제한 분해물을 검사하였다. 상기 방식으로 수득된 플라스미드를 pCLiK1로 나타낸다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 플라스미드 pWLT1 (문헌 [Liebl et al., 1992])로부터 출발하여, 카나마이신 내성 카세트를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 3 및 서열 4를 사용하여 증폭하였다.
서열 3:
서열 4:
pWLT1에 상보적인 서열과는 달리, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 3은 5'-3' 방향에 제한 엔도뉴클레아제 XbaI, SmaI, BamHI, NheI에 대한 절단 부위를 함유하며, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 4는 5'-3' 방향에 제한 엔도뉴클레아제 AscI 및 NheI에 대한 절단 부위를 함유한다. PCR 반응을 PfuTurbo 폴리메라제 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진)을 사용하여 문헌 [Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 수행하였다. 크기가 약 1.3 kb인 DNA 단편을 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 AscI (미국 비버리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))로 절단한 후, GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 다시 정제하였다. 벡터 pCLiK1을 또한 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 AscI로 절단하고, 알칼리 포스파타제 I (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 탈인산화하였다. 0.8% 강도 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 선형화된 벡터 (약 2.1 kb)를 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하였다. 상기 벡터 단편을 급속 DNA 리게이션 키트 (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 절단된 PCR 단편과 리게이션하고, 리게이션 혼합물을 수용능 이. 콜라이 XL-1 블루 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포를 암피실린 (50 ㎍/ml) 및 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 아가 상에 플레이팅함으로써 선별하였다 (문헌 [Lennox, 1955, Virology, 1: 190]).
개별 클론의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (힐덴 소재, 퀴아겐)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하고, 제한 분해물을 검사하였다. 상기 방식으로 수득된 플라스미드를 pCLiK2로 나타낸다.
벡터 pCLiK2를 제한 엔도뉴클레아제 DraI (미국 비버리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 절단하였다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 약 2.3 kb 벡터 단편을 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하였다. 상기 벡터 단편을 급속 DNA 리게이션 키트 (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 절단된 PCR 단편과 리게이션하고, 리게이션 혼합물을 수용능 이. 콜라이 XL-1 블루 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 아가 상에 플레이팅함으로써 선별하였다 (문헌 [Lennox, 1955, Virology, 1: 190]).
개별 클론의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (힐덴 소재, 퀴아겐)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하고, 제한 분해물을 검사하였다. 상기 방식으로 수득된 플라스미드를 pCLiK3으로 나타낸다.
PCR 반응을 위한 주형으로서 플라스미드 pWLQ2 (문헌 [Liebl et al., 1992])로부터 출발하여, 복제 원점 pHM1519를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 5 및 서열 6을 사용하여 증폭하였다.
서열 5:
서열 6:
pWLQ2에 상보적인 서열과는 달리, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 5 및 서열 6은 제한 엔도뉴클레아제 NotI에 대한 절단 부위를 함유한다. PCR 반응을 PfuTurbo 폴리메라제 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진)를 사용하여 문헌 [Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 수행하였다. 크기가 약 2.7 kb인 DNA 단편을 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NotI (미국 비버리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 절단한 후, GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 다시 정제하였다. 벡터 pCLiK3을 또한 제한 엔도뉴클레아제 NotI으로 절단하고, 알칼리 포스파타제 I (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 탈인산화하였다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 선형화된 벡터 (약 2.3 kb)를 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하였다. 상기 벡터 단편을 급속 DNA 리게이션 키트 (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 절단된 PCR 단편과 리게이션하고, 리게이션 혼합물을 수용능 이. 콜라이 XL-1 블루 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포를 카 나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 아가 상에 플레이팅함으로써 선별하였다 (문헌 [Lennox, 1955, Virology, 1: 190]).
개별 클론의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (힐덴 소재, 퀴아겐)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하고, 제한 분해물을 검사하였다. 상기 방식으로 수득된 플라스미드를 pCLiK5로 나타낸다.
pCLiK5를 제한 엔도뉴클레아제 SwaI, XhoI, AatI, ApaI, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI 및 SmaI에 대한 절단 부위를 함유하는 두 가지 합성 필수 상보적 올리고뉴클레오티드 서열 7 및 서열 8을 조합함으로써 다중 클로닝 부위 (MCS)에 의해 연장시켜 이들을 함께 95℃로 가열한 후 천천히 냉각시킴으로써 이중 가닥 DNA 단편을 만들었다.
서열 7:
서열 8:
벡터 pCLiK5를 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamHI (미국 비버리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)으로 절단하고, 알칼리 포스파타제 I (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 탈인산화하였다. 0.8% 농도 아 가로스 겔에서 전기영동한 후, 선형화된 벡터 (약 5.0 kb)를 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하였다. 상기 벡터 단편을 급속 DNA 리게이션 키트 (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 합성 이중 가닥 DNA 단편과 리게이션하고, 리게이션 혼합물을 수용능 이. 콜라이 XL-1 블루 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 아가 상에 플레이팅함으로써 선별하였다 (문헌 [Lennox, 1955, Virology, 1: 190]).
개별 클론의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (힐덴 소재, 퀴아겐)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하고, 제한 분해물을 검사하였다. 상기 방식으로 수득된 플라스미드를 pCLiK5MCS로 나타낸다.
시퀀싱 반응을 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 시퀀싱 반응을 세분화하고, ABI 프리즘 (Prism) 377 (바이터스타츠 소재, PE 어플라이드 바이오시스템스 (PE Applied Biosystems))에 의해 분석하였다.
생성된 플라스미드 pCLiK5MCS는 서열 9로서 열거되어 있다.
실시예 2
벡터 pCLiK5MCS 통합 sacB의 제작
PCR 반응을 위한 주형으로서 플라스미드 pK19mob (문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73(1994)])로부터 출발하여, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) sacB 유전자를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 10 및 서열 11을 사용하여 증폭하였다.
서열 10:
서열 11:
pK19mobsac에 상보적인 서열과는 달리, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 10 및 서열 11은 제한 엔도뉴클레아제 NotI에 대한 절단 부위를 함유한다. PCR 반응을 PfuTurbo 폴리메라제 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진)를 사용하여 문헌 [Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 수행하였다. 크기가 약 1.9 kb인 DNA 단편을 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다. DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NotI (미국 비버리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 절단한 후, GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 다시 정제하였다. 벡터 pCLiK5MCS을 또한 제한 엔도뉴클레아제 NotI으로 절단하고, 알칼리 포스파타제 I (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 탈인산화하였다. 0.8% 농도 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 크기가 약 2.4 kb인 벡터 단편을 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하였다. 상기 벡터 단편을 급속 DNA 리게이션 키트 (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 절단된 PCR 단편과 리게이션하고, 리게이션 혼합물을 수용능 이. 콜라이 XL-1 블루 (미국 라 졸라 소재, 스트라타진) 내로 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)]에 기재된 것과 같은 표준 방법에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 보유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 아가 상에 플레이팅함으로써 선별하였다 (문헌 [Lennox, 1955, Virology, 1: 190]).
개별 클론의 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (힐덴 소재, 퀴아겐)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 단리하고, 제한 분해물을 검사하였다. 상기 방식으로 수득된 플라스미드를 pCLiK5MCS 통합 sacB로 나타낸다.
시퀀싱 반응을 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 따라 수행하였다. 시퀀싱 반응을 세분화하고, ABI 프리즘 377 (바이터스타츠 소재, PE 어플라이드 바이오시스템스)에 의해 분석하였다.
생성된 플라스미드 pCLiK5MCS 통합 sacB는 서열 12로서 열거되어 있다.
실시예 3
씨. 글루타미쿰으로부터 metK 유전자의 단리 및 클로닝
염색체 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032 DNA를 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828]의 방법을 이용하여 제조하였다. 문헌 [Grossmann et al. (2000) FEMS Microbiology Letters 193:99-103]의 metK 서열로부터 출발하여 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
서열 13:
서열 14:
1640 염기쌍 DNA 단편을 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 것과 같은 표준 방법을 사용하여 상기 언급된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 PfuTurbo 폴리메라제 (스트라타진)을 사용하여 게놈 씨. 글루타미쿰 DNA로부터 증폭하였다.
단편을 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 통해 도입된 제한 효소 MluI 및 SmaI (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 이어서, DNA 단편을 GFXTMPCR, DNA 및 겔 밴드 정제 키트 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 단리하였다.
벡터 pCLiK5MCS, 서열 9를 또한 제한 효소 SmaI 및 MluI으로 절단하고, 알칼 리 포스파타제 I (만하임 소재, 로슈 디아그노스틱스)으로 제조자의 지시에 따라 탈인산화하였다. 벡터 및 DNA 단편을 T4 DNA 리가제 (프라이버그 소재, 아머샴 파마시아)로 리게이션하고, 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기재된 것과 같은 표준 방법을 사용하여 이. 콜라이 XL-1 블루 (스트라타진) 내로 형질전환시켰다.
플라스미드 DNA를 퀴아겐으로부터의 방법 및 물질에 의해 제조하였다. 시퀀싱 반응을 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467]에 기재된 것과 같이 수행하였다. 시퀀싱 반응을 분리하고, ABI 프리즘 377 (바이터스타츠 소재, PE 어플라이드 바이오시스템스)에 의해 평가하였다.
생성된 플라스미드 pCLiK5MCS/metKwt는 서열 15로서 열거되어 있다.
실시예 4
씨. 글루타미쿰 metK 유전자의 돌연변이 유발
씨. 글루타미쿰 metK 유전자의 지정 돌연변이 유발을 퀵체인지 키트 (QuickChange Kit) (스트라타진)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 돌연변이 유발을 플라스미드 pCLiK5MCS/metKwt, 서열 15에서 수행하였다. 시스테인 94를 알라닌 94에 대한 서열 16으로 치환하기 위해 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
서열 17:
서열 18:
상기 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용은 서열 15에서 위치 1056 (C가 G로 치환됨) 및 1057 (A가 C로 치환됨)에서의 뉴클레오티드 치환을 초래한다. metK 유전자에서의 생성된 아미노산 치환 Cys94Ala을 시퀀싱 반응에 의해 확인한 후, 형질전환 및 플라스미드 제조를 하였다. 플라스미드를 pCLiK5MCS/metKC94A로 나타내었고, 이는 서열 19로서 열거되어 있다.
SAM 신타제 (metK) 분석
플라스미드 pCLiK5MCS/metKwt, 서열 15로, 또는 플라스미드 pCLiK5MCS/metKC94A, 서열 19로 형질전환된 씨. 글루타미쿰 균주를 BHI/글루코스 배지 (37 g/l 제조된 뇌 심장 주입물 배지 (디프코), 10 mM (NH4)2SO4, 4% 글루코스)에서 30℃에서 20의 OD600으로 형질전환시켰다. 세포를 4℃에서 스핀 다운 (spin down)시키고, 펠릿을 차가운 생리 염수로 세척하였다. 재원심분리 후, 젖은 세포 펠릿 0.25 g을 붕괴 완충액 1 ml (50 mM 트리스 (Tris) pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM DTT)에서 4℃에서 재현탁시켰다. 박테리아 현탁액을 각 경우에 30초 동안 하이브에이드 (Hybaid)로부터의 리보라이저 (Ribolyser)에서, 그리고 하이브에이드로부터의 블루 리보라이저 튜브에서 회전 설정 6.0으로 3회 용해시켰다. 용해물을 에펜도르프 (Eppendorf) 원심분리기에서 13,000 rpm으로 45분 동안 원심분리함으로써 정화하고, 상층액을 물로 1:10으로 희석하였다. 단백질 함량을 문헌 [Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254]의 방법에 의해 측정하였다.
SAM 신타제의 효소 활성을 문헌 [Markham, G.D. et al. (1983) Methods in Enzymology 94: 219-222]의 방법에 의해 하기 변형으로 측정하였다:
15.15 μCi에 상응하는 100 mM 트리스 pH 8.0, 100 mM KCl, 20 mM MgCl2, 1.2 mM L-메티오닌, 10 mM ATP, 1 ㎕ 35S-L-메티오닌을 함유하는 100 ㎕의 반응 혼합물 (아머샴 SJ204, 특이적 활성 1 Ci/μmol)을 해당 단백질 용해물 100 ㎍으로 출발하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 0, 5, 10, 20, 30 및 60분 후, 반응 혼합물의 분취액 10 ㎕을 제거하고, 50 mM EDTA 20 ㎕을 사용하여 얼음 상에서 중단시켰다.
중단된 반응물 30 ㎕을 포스포셀룰로스 필터 유닛 (피어스 (Pierce), 번호 29520) 상에 놓고, 에펜도르프 원심분리기에서 6000 rpm으로 1분 동안 스핀 다운시켰다. 필터를 75 mM 인산 500 ㎕로 2회 세척한 후, 섬광액을 함유하는 카운팅 튜브에 넣었다. 형성된 S-아데노실메티오닌의 방사능을 섬광 카운터 (베크만 (Beckman))에서 측정하였다.
데이타는 첨부된 도 1에 나타나 있다.
방사성 L-메티오닌의 특이적 활성 및 사용된 단백질 양을 고려하여, S-아데노실메티오닌 형성 속도를 단위 시간당 혼입된 방사능의 증가로부터 측정할 수 있다. 단위는 S-아데노실메티오닌 μmol/분 ×단백질 mg이다. 상기 속도를 야생형과 돌연변이 효소 간에 비교할 수 있다.
실시예 6
씨. 글루타미쿰에서의 세포성 S-아데노실메티오닌 역가의 측정
pCLiK5MCS/metKwt (서열 15) 또는 pCLiK5MCS/metKC94A (서열 19)로 형질전환된 씨. 글루타미쿰 균주에서의 세포성 S-아데노실메티오닌 적정값을 측정하기 위해, 하기 방법을 사용하였다. 빙냉 생리 염수로 세척된 실시예 5에서 기재된 것과 같은 수득된 세포 펠릿을 트리클로로아세트산 (젖은 펠릿 0.1 g 당 TCA 200 ㎕)에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 5분 후, 현탁액을 에펜도르프 원심분리기에서 4℃ 및 13,000 rpm에서 5분 동안 정화하였다. 상층액 중 S-아데노실메티오닌 함량을 HPLC 전리층 5C 양이온 교환 컬럼, 주입 부피 10 ㎕, 이동상: 70% vol/vol 0.2 M 포름산암모늄 pH 4.0 30% vol/vol 메탄올; UV 검출 260 nm; 40℃; 체류 시간 8.5분)에 의해 측정하였다.
실시예 7
씨. 글루타미쿰의 metK wt 유전자를 metK C94A로 치환
씨. 글루타미쿰 KFCC10065의 metK 야생형 유전자를 돌연변이체 metK C94A로 대립유전자 치환하기 위해, 먼저 서열 19로부터의 metK C94A 서열을 pCLiK5MCS 통 합 sacB (서열 12) 내로 클로닝하였다. 상기 목적을 위해, 플라스미드 pCLiK5MCS/metKC94A (서열 19)를 제한 엔도뉴클레아제 BglII 및 XhoI (슈발바흐 소재, NEB)로 절단하였다. 생성된 1962 염기쌍 단편을 실시예 3에 기재된 것과 같이 정제하였다. 벡터 pCLiK5MCS 통합 sacB를 또한 BglII 및 XhoI으로 절단하고, 실시예 3에 기재된 것과 같이 정제하였다. 실시예 3에 기재된 것과 같이 벡터 및 단편을 리게이션하고, 이. 콜라이 XL-1 블루 내로 형질전환시켰다. 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱한 후, 확인하였다. 생성된 플라스미드 pCLiK5MCS 통합 sacB/metKC94A는 서열 20으로서 열거되어 있다.
플라스미드 pCLiK5MCS 통합 sacB/metKC94A를 문헌 [Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303]에 기재된 것과 같은 전기천공에 의해 씨. 글루타미쿰 KFCC10065 내로 형질전환시켰다. 프로토콜의 변형은 DE 10046870호에 기재되어 있다. 개별 형질전환체의 metK 좌위의 염색체 배열을 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning]에 기재된 것과 같은 서던 블롯 및 혼성화에 의한 표준 방법에 의해 확인하였다. 그에 의해 형질전환체는 상동성 재조합에 의해 metK 좌위에 삽입된 형질전환된 플라스미드를 갖는 것임이 확실시되었다. 이러한 콜로니를 항생제가 없는 배지에서 밤새 성장시킨 후, 상기 형질전환체를 수크로스 CM 아가 배지 (10% 수크로스) 상에 플레이팅하고, 300℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
벡터 pCLiK5MCS 통합 sacB/metKC94A에 존재하는 sacB 유전자가 수크로스를 독성 생성물로 전환시키기 때문에, 야생형 metK 유전자와 돌연변이된 metKC94A 유 전자 간의 제2 상동성 재조합 단계에 의해 결실된 sacB 유전자를 갖는 콜로니만이 성장할 수 있다. 야생형 유전자, 또는 sacB 유전자를 함께 갖는 돌연변이된 유전자는 상동성 재조합이 일어나는 동안 결실될 수 있다. 야생형 유전자와 함께 sacB 유전자가 제거될 경우, 돌연변이 형질전환체가 생성된다.
성장하는 콜로니를 선택하고, 그의 게놈 DNA를 제조하고, metK 유전자를 두 가지 방법에 의해 분석하였다. 첫번째로, 실시예 4에 기재된 것과 같은 두 가지 뉴클레오티드의 치환을 이용하였다. 진단 PCR 단편을 3' 말단에서의 두 가지 대립유전자 간에 분화될 수 있는 특이적 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 제2 metK 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 생성하였다. 두번째로, PCR 증폭 후 약 100개의 형질전환체의 metK 좌위를 돌연변이의 상류 또는 하류에 결합된 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머로 시퀀싱하였다. 몇 가지 돌연변이된 metK 클론을 수득하였다. 이러한 클론의 하나를 KFCC10065metKC94A로 명명하였다. 돌연변이체 C94A의 아미노산 서열은 서열 22에 상응한다.
실시예 8
균주 KFCC10065metKC94A를 이용한 메티오닌의 제조
실시예 6에서 생성된 균주 KFCC10065metKC94A를 BHI 배지 (디프코)를 함유하는 아가 플레이트 상에서 30℃에서 2일 동안 성장시켰다. 성장된 세포를 아가 플레이트로부터 염수에 현탁시키고, 1.5의 OD600 nm로 배지 II에 옮겼다. 배지 II는 하기와 같이 구성되었다.
배지 IIA
0.6 g/l KH2PO4
0.4 g/l MgSO4
*7H20
25 g/l (NH4)2SO4
40 g/l 원당
60 g/l 당밀
이렇게 제조된 배지를 NH40H로 pH 7.8이 되게 하고, 120℃에서 30분 동안 멸균하였다.
배지 IIB
0.3 mg/l 티아민*HCI
1 mg/l 비오틴
2mg/l FeSO4
2mg/l MnSO4
0.1 mg/l 비타민 B12
배지 IIB를 별도로 제조하고, 여과 멸균하고, 배지 IIA에 첨가하였다. 두 가지 성분 IIA 및 IIB는 함께 배지 II를 형성한다.
배지 II (= IIA+B) 10 ml을 0.5 g 멸균 CaCO3를 함유하는 100 ml 엘른마이어 플라스크에서 상기 언급된 균주의 세포로 처리하고, 오비탈 진탕기 상에서 30℃에 서 200 rpm으로 72시간 동안 인큐베이션하였다.
배양액 중 형성된 메티오닌을 어글리언트 (Agilent)로부터의 아미노산 측정 방법으로 어글러언트 1100 시리즈 LC 시스템 HPLC 상에서 측정하였다. 오르토-프탈알데히드를 이용한 프리-컬럼 유도화는 형성된 아미노산의 정량을 가능하게 하였고, 아미노산 혼합물은 하이퍼실 (Hypersil) AA 컬럼 (어글리언트)에서 분리되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> BASF Aktiengesellschaft
<120> Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien
<130> M/43138
<160> 23
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
cccgggatcc gctagcggcg cgccggccgg cccggtgtga aataccgcac ag 52
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<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
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<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
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<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> multiple cloning site
<400> 7
tcgaatttaa atctcgagag gcctgacgtc gggcccggta ccacgcgtca tatgactagt 60
tcggacctag ggatatcgtc gacatcgatg ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc 120
tctagacccg ggatttaaat 140
<210> 8
<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> multiple cloning site
<400> 8
gatcatttaa atcccgggtc tagaggatcc caattgttaa ttaacgcaga agagcatcga 60
tgtcgacgat atccctaggt ccgaactagt catatgacgc gtggtaccgg gcccgacgtc 120
aggcctctcg agatttaaat 140
<210> 9
<211> 5091
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<400> 9
tcgatttaaa tctcgagagg cctgacgtcg ggcccggtac cacgcgtcat atgactagtt 60
cggacctagg gatatcgtcg acatcgatgc tcttctgcgt taattaacaa ttgggatcct 120
ctagacccgg gatttaaatc gctagcgggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc 180
agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg 240
gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta 300
gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt 360
aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg 420
cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 480
gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 540
gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 600
ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 660
gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 720
actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 780
tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 840
acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 900
cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 960
ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 1020
gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 1080
ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 1140
acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 1200
ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 1260
tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 1320
atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 1380
ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc cacgctagcg 1440
gcgcgccggc cggcccggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 1500
aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 1560
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 1620
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 1680
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 1740
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 1800
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 1860
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 1920
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 1980
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 2040
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 2100
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 2160
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 2220
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 2280
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 2340
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ggccggccgc 2400
ggccgcgcaa agtcccgctt cgtgaaaatt ttcgtgccgc gtgattttcc gccaaaaact 2460
ttaacgaacg ttcgttataa tggtgtcatg accttcacga cgaagtacta aaattggccc 2520
gaatcatcag ctatggatct ctctgatgtc gcgctggagt ccgacgcgct cgatgctgcc 2580
gtcgatttaa aaacggtgat cggatttttc cgagctctcg atacgacgga cgcgccagca 2640
tcacgagact gggccagtgc cgcgagcgac ctagaaactc tcgtggcgga tcttgaggag 2700
ctggctgacg agctgcgtgc tcggccagcg ccaggaggac gcacagtagt ggaggatgca 2760
atcagttgcg cctactgcgg tggcctgatt cctccccggc ctgacccgcg aggacggcgc 2820
gcaaaatatt gctcagatgc gtgtcgtgcc gcagccagcc gcgagcgcgc caacaaacgc 2880
cacgccgagg agctggaggc ggctaggtcg caaatggcgc tggaagtgcg tcccccgagc 2940
gaaattttgg ccatggtcgt cacagagctg gaagcggcag cgagaattat cgcgatcgtg 3000
gcggtgcccg caggcatgac aaacatcgta aatgccgcgt ttcgtgtgcc gtggccgccc 3060
aggacgtgtc agcgccgcca ccacctgcac cgaatcggca gcagcgtcgc gcgtcgaaaa 3120
agcgcacagg cggcaagaag cgataagctg cacgaatacc tgaaaaatgt tgaacgcccc 3180
gtgagcggta actcacaggg cgtcggctaa cccccagtcc aaacctggga gaaagcgctc 3240
aaaaatgact ctagcggatt cacgagacat tgacacaccg gcctggaaat tttccgctga 3300
tctgttcgac acccatcccg agctcgcgct gcgatcacgt ggctggacga gcgaagaccg 3360
ccgcgaattc ctcgctcacc tgggcagaga aaatttccag ggcagcaaga cccgcgactt 3420
cgccagcgct tggatcaaag acccggacac ggagaaacac agccgaagtt ataccgagtt 3480
ggttcaaaat cgcttgcccg gtgccagtat gttgctctga cgcacgcgca gcacgcagcc 3540
gtgcttgtcc tggacattga tgtgccgagc caccaggccg gcgggaaaat cgagcacgta 3600
aaccccgagg tctacgcgat tttggagcgc tgggcacgcc tggaaaaagc gccagcttgg 3660
atcggcgtga atccactgag cgggaaatgc cagctcatct ggctcattga tccggtgtat 3720
gccgcagcag gcatgagcag cccgaatatg cgcctgctgg ctgcaacgac cgaggaaatg 3780
acccgcgttt tcggcgctga ccaggctttt tcacataggc tgagccgtgg ccactgcact 3840
ctccgacgat cccagccgta ccgctggcat gcccagcaca atcgcgtgga tcgcctagct 3900
gatcttatgg aggttgctcg catgatctca ggcacagaaa aacctaaaaa acgctatgag 3960
caggagtttt ctagcggacg ggcacgtatc gaagcggcaa gaaaagccac tgcggaagca 4020
aaagcacttg ccacgcttga agcaagcctg ccgagcgccg ctgaagcgtc tggagagctg 4080
atcgacggcg tccgtgtcct ctggactgct ccagggcgtg ccgcccgtga tgagacggct 4140
tttcgccacg ctttgactgt gggataccag ttaaaagcgg ctggtgagcg cctaaaagac 4200
accaagggtc atcgagccta cgagcgtgcc tacaccgtcg ctcaggcggt cggaggaggc 4260
cgtgagcctg atctgccgcc ggactgtgac cgccagacgg attggccgcg acgtgtgcgc 4320
ggctacgtcg ctaaaggcca gccagtcgtc cctgctcgtc agacagagac gcagagccag 4380
ccgaggcgaa aagctctggc cactatggga agacgtggcg gtaaaaaggc cgcagaacgc 4440
tggaaagacc caaacagtga gtacgcccga gcacagcgag aaaaactagc taagtccagt 4500
caacgacaag ctaggaaagc taaaggaaat cgcttgacca ttgcaggttg gtttatgact 4560
gttgagggag agactggctc gtggccgaca atcaatgaag ctatgtctga atttagcgtg 4620
tcacgtcaga ccgtgaatag agcacttaag gtctgcgggc attgaacttc cacgaggacg 4680
ccgaaagctt cccagtaaat gtgccatctc gtaggcagaa aacggttccc ccgtagggtc 4740
tctctcttgg cctcctttct aggtcgggct gattgctctt gaagctctct aggggggctc 4800
acaccatagg cagataacgt tccccaccgg ctcgcctcgt aagcgcacaa ggactgctcc 4860
caaagatctt caaagccact gccgcgactg ccttcgcgaa gccttgcccc gcggaaattt 4920
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tggattctta ccgtggaaat tcttcgcaaa aatcgtcccc tgatcgccct tgcgacgttg 5040
gcgtcggtgc cgctggttgc gcttggcttg accgacttga tcagcggccg c 5091
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 10
gagagcggcc gccgatcctt tttaacccat cac 33
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 11
aggagcggcc gccatcggca ttttcttttg cg 32
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<211> 4323
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<400> 12
tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60
tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120
tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180
cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240
gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300
ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360
ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420
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atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600
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ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080
tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140
gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200
cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc 1260
tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca 1320
ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga 1380
tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc gcgccggccg 1440
gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 1500
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 1560
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 1620
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 1680
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 1740
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cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 2040
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 2100
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 2160
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 2220
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 2280
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340
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cattttcttt tgcgttttta tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct 2460
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atttttaaca caaggccagt tttgttcagc ggcttgtatg ggccagttaa agaattagaa 2700
acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac gtaatgccgt caatcgtcat ttttgatccg 2760
cgggagtcag tgaacaggta ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt 2820
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ctttgcagaa gtttttgact ttcttgacgg aagaatgatg tgcttttgcc atagtatgct 3000
ttgttaaata aagattcttc gccttggtag ccatcttcag ttccagtgtt tgcttcaaat 3060
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ccgtcaaaga ttgatttata atcctctaca ccgttgatgt tcaaagagct gtctgatgct 3240
gatacgttaa cttgtgcagt tgtcagtgtt tgtttgccgt aatgtttacc ggagaaatca 3300
gtgtagaata aacggatttt tccgtcagat gtaaatgtgg ctgaacctga ccattcttgt 3360
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gatgtgtcat ccgcattttt aggatctccg gctaatgcaa agacgatgtg gtagccgtga 3540
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tttgcagaag agatattttt aattgtggac gaatcaaatt cagaaacttg atatttttca 3660
tttttttgct gttcagggat ttgcagcata tcatggcgtg taatatggga aatgccgtat 3720
gtttccttat atggcttttg gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc 3780
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gttcatgtct ccttttttat gtactgtgtt agcggtctgc ttcttccagc cctcctgttt 3900
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caaagtatac actttgccct ttacacattt taggtcttgc ctgctttatc agtaacaaac 4020
ccgcgcgatt tacttttcga cctcattcta ttagactctc gtttggattg caactggtct 4080
attttcctct tttgtttgat agaaaatcat aaaaggattt gcagactacg ggcctaaaga 4140
actaaaaaat ctatctgttt cttttcattc tctgtatttt ttatagtttc tgttgcatgg 4200
gcataaagtt gcctttttaa tcacaattca gaaaatatca taatatctca tttcactaaa 4260
taatagtgaa cggcaggtat atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa 4320
atc 4323
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 13
gagagcccgg gaagaagggc tgcgacctcc tcat 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 14
ctctcacgcg tcatatgcag gtgaggtaac ccca 34
<210> 15
<211> 6631
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<400> 15
cgcgtcatat gcaggtgagg taaccccaaa agaggtaaaa cccgcgccac cgacttttca 60
ggagcgggga cgcgggtttt tgccatgaat ccgaagatac tacatcagat ttttaggcca 120
acttgagggc tgcgcgaagt tcatcaacgc ggtcgatagc ctcccaagga aggtccaaat 180
cagtgcgacc aaagtggccg taggcagcag tgtcagcgta gatcggacga agcagatcaa 240
gctcacggat aattgctgct ggacgcaggt caaagacctc caacacggca gcctgaatct 300
gctcgtcgct caggccttcc ttgttggtgt caaaggtttc aacgtaaagt ccgactggct 360
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cgatgttctt tgctacccaa cgcatggcgt atgcagcaga gcggtccacc ttgcttggat 480
ccttaccgga gaatgctcca ccaccatggc gagccatgcc accgtaggta tccacgatga 540
tcttgcggcc ggtcagaccc gcatcaccca tggggccacc cagaatgaag gaacctgaag 600
ggttgatcaa cacggtgatc tcaccggttg ccagatcctc aatgcctgcg tctttgatta 660
cccaatcaat gacgtgttcg cgcagttggg tttccaacca tgcacggtca acttctgggt 720
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cggttggctg agccacaaat acccttcttt cgaagaagtt gagaataaat agtcttaaat 1380
acaaaaaacc aatatagacc aagctgtcta aaactgcaat gtcagtggtc tagctggatt 1440
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gctgccgtgc tccacatcga ctaccccacc gtgagcatcc aaaatccagc cctcattgtg 1560
cttttgccca aacactttgc ccatgcccac ctcattacac atgaggaggt cgcagccctt 1620
cttcccggga tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag 1680
tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga 1740
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ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa 1860
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cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 3360
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 3420
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tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 3840
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg 3900
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ctcgagaggc ctgacgtcgg gcccggtacc a 6631
<210> 16
<211> 407
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 16
Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr
1 5 10 15
Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu
20 25 30
Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr
35 40 45
Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser
50 55 60
Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile
65 70 75 80
Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Cys Gly Val
85 90 95
Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp
100 105 110
Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg
115 120 125
Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu
130 135 140
Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser
145 150 155 160
Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg
165 170 175
Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg
180 185 190
Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu
195 200 205
Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp
210 215 220
Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile
225 230 235 240
Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met
245 250 255
Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly
260 265 270
Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser
275 280 285
Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn
290 295 300
Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr
305 310 315 320
Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp
325 330 335
Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu
340 345 350
Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu
355 360 365
Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg
370 375 380
Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu
385 390 395 400
Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala
405
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 17
gattcgacgg acgcaccgct ggcgtctcag tatccatc 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 18
gatggatact gagacgccag cggtgcgtcc gtcgaatc 38
<210> 19
<211> 6631
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<400> 19
cgcgtcatat gcaggtgagg taaccccaaa agaggtaaaa cccgcgccac cgacttttca 60
ggagcgggga cgcgggtttt tgccatgaat ccgaagatac tacatcagat ttttaggcca 120
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cagtgcgacc aaagtggccg taggcagcag tgtcagcgta gatcggacga agcagatcaa 240
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cccaatcaat gacgtgttcg cgcagttggg tttccaacca tgcacggtca acttctgggt 720
cgtgctgggt ggagatgaca acggtatcca ggtggctagg gcggtcttgc gcatcgtatg 780
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cctgggtcag acgacgtgac agtcggtgcg ccaacgcgat aggaagaggc atgtactctt 900
cggtttcgtt ggtggcgtag ccgaacatca ggccctggtc gccagcacct gcgcggtcgt 960
cttcttcaac gtcgccgttg gtgcgggctt cgtcggagtt atccacgccg tcagcgattt 1020
cctgggactg ctcaccgatg gatactgaga cgccagcggt gcgtccgtcg aatccaacct 1080
cagaggagtt gaatccgatt tcgatgagct tgttgcggac taattgaggg atctctacgt 1140
aagcgctggt acggacctcg ccaacaacat ggacgattcc ggtggtgacc acagtttcca 1200
ctgcgacgcg cgactgcgga tctttttcga gcagcgcgtc caaaatggta tcggaaatag 1260
catcacatat tttgtctgga tgtccctcag ttacagattc actggtgaac aaacggacgg 1320
cggttggctg agccacaaat acccttcttt cgaagaagtt gagaataaat agtcttaaat 1380
acaaaaaacc aatatagacc aagctgtcta aaactgcaat gtcagtggtc tagctggatt 1440
tttctagact tcgcgatacg ccagtgccgc gtcccaaatt tgcgcagcaa cctcgatttt 1500
gctgccgtgc tccacatcga ctaccccacc gtgagcatcc aaaatccagc cctcattgtg 1560
cttttgccca aacactttgc ccatgcccac ctcattacac atgaggaggt cgcagccctt 1620
cttcccggga tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag 1680
tccgcagaaa cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga 1740
aaacgcaagc gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga 1800
ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa 1860
ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg 1920
caggggatca agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 1980
tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 2040
acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 2100
ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 2160
gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 2220
tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 2280
tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 2340
gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 2400
tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 2460
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cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 2580
attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 2640
ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 2700
tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 2760
agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 2820
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ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca cgctagcggc 2940
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gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 3060
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gcttgtcctg gacattgatg tgccgagcca ccaggccggc gggaaaatcg agcacgtaaa 5100
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ctcgagaggc ctgacgtcgg gcccggtacc a 6631
<210> 20
<211> 5863
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<400> 20
tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gcaggtgagg taaccccaaa 60
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caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg 2880
ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc 2940
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ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 3480
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aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 3600
tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 3660
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ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 3780
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 3840
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 3900
cacctagatc cttttaaagg ccggccgcgg ccgccatcgg cattttcttt tgcgttttta 3960
tttgttaact gttaattgtc cttgttcaag gatgctgtct ttgacaacag atgttttctt 4020
gcctttgatg ttcagcagga agctcggcgc aaacgttgat tgtttgtctg cgtagaatcc 4080
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ccatttgccg ttcattttaa agacgttcgc gcgttcaatt tcatctgtta ctgtgttaga 4380
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gttcgtttct ttcgcaaacg cttgagttgc gcctcctgcc agcagtgcgg tagtaaaggt 5340
taatactgtt gcttgttttg caaacttttt gatgttcatc gttcatgtct ccttttttat 5400
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atgtgatggg ttaaaaagga tcggcggccg ctcgatttaa atc 5863
<210> 21
<211> 1224
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1224)
<223>
<400> 21
gtg gct cag cca acc gcc gtc cgt ttg ttc acc agt gaa tct gta act 48
Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr
1 5 10 15
gag gga cat cca gac aaa ata tgt gat gct att tcc gat acc att ttg 96
Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu
20 25 30
gac gcg ctg ctc gaa aaa gat ccg cag tcg cgc gtc gca gtg gaa act 144
Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr
35 40 45
gtg gtc acc acc gga atc gtc cat gtt gtt ggc gag gtc cgt acc agc 192
Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser
50 55 60
gct tac gta gag atc cct caa tta gtc cgc aac aag ctc atc gaa atc 240
Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile
65 70 75 80
gga ttc aac tcc tct gag gtt gga ttc gac gga cgc acc gct ggc gtc 288
Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Ala Gly Val
85 90 95
tca gta tcc atc ggt gag cag tcc cag gaa atc gct gac ggc gtg gat 336
Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp
100 105 110
aac tcc gac gaa gcc cgc acc aac ggc gac gtt gaa gaa gac gac cgc 384
Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg
115 120 125
gca ggt gct ggc gac cag ggc ctg atg ttc ggc tac gcc acc aac gaa 432
Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu
130 135 140
acc gaa gag tac atg cct ctt cct atc gcg ttg gcg cac cga ctg tca 480
Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser
145 150 155 160
cgt cgt ctg acc cag gtt cgt aaa gag ggc atc gtt cct cac ctg cgt 528
Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg
165 170 175
cca gac gga aaa acc cag gtc acc ttc gca tac gat gcg caa gac cgc 576
Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg
180 185 190
cct agc cac ctg gat acc gtt gtc atc tcc acc cag cac gac cca gaa 624
Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu
195 200 205
gtt gac cgt gca tgg ttg gaa acc caa ctg cgc gaa cac gtc att gat 672
Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp
210 215 220
tgg gta atc aaa gac gca ggc att gag gat ctg gca acc ggt gag atc 720
Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile
225 230 235 240
acc gtg ttg atc aac cct tca ggt tcc ttc att ctg ggt ggc ccc atg 768
Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met
245 250 255
ggt gat gcg ggt ctg acc ggc cgc aag atc atc gtg gat acc tac ggt 816
Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly
260 265 270
ggc atg gct cgc cat ggt ggt gga gca ttc tcc ggt aag gat cca agc 864
Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser
275 280 285
aag gtg gac cgc tct gct gca tac gcc atg cgt tgg gta gca aag aac 912
Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn
290 295 300
atc gtg gca gca ggc ctt gct gat cgc gct gaa gtt cag gtt gca tac 960
Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr
305 310 315 320
gcc att gga cgc gca aag cca gtc gga ctt tac gtt gaa acc ttt gac 1008
Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp
325 330 335
acc aac aag gaa ggc ctg agc gac gag cag att cag gct gcc gtg ttg 1056
Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu
340 345 350
gag gtc ttt gac ctg cgt cca gca gca att atc cgt gag ctt gat ctg 1104
Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu
355 360 365
ctt cgt ccg atc tac gct gac act gct gcc tac ggc cac ttt ggt cgc 1152
Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg
370 375 380
act gat ttg gac ctt cct tgg gag gct atc gac cgc gtt gat gaa ctt 1200
Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu
385 390 395 400
cgc gca gcc ctc aag ttg gcc taa 1224
Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala
405
<210> 22
<211> 407
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Plasmid
<400> 22
Val Ala Gln Pro Thr Ala Val Arg Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Thr
1 5 10 15
Glu Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Ala Ile Ser Asp Thr Ile Leu
20 25 30
Asp Ala Leu Leu Glu Lys Asp Pro Gln Ser Arg Val Ala Val Glu Thr
35 40 45
Val Val Thr Thr Gly Ile Val His Val Val Gly Glu Val Arg Thr Ser
50 55 60
Ala Tyr Val Glu Ile Pro Gln Leu Val Arg Asn Lys Leu Ile Glu Ile
65 70 75 80
Gly Phe Asn Ser Ser Glu Val Gly Phe Asp Gly Arg Thr Ala Gly Val
85 90 95
Ser Val Ser Ile Gly Glu Gln Ser Gln Glu Ile Ala Asp Gly Val Asp
100 105 110
Asn Ser Asp Glu Ala Arg Thr Asn Gly Asp Val Glu Glu Asp Asp Arg
115 120 125
Ala Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Asn Glu
130 135 140
Thr Glu Glu Tyr Met Pro Leu Pro Ile Ala Leu Ala His Arg Leu Ser
145 150 155 160
Arg Arg Leu Thr Gln Val Arg Lys Glu Gly Ile Val Pro His Leu Arg
165 170 175
Pro Asp Gly Lys Thr Gln Val Thr Phe Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Arg
180 185 190
Pro Ser His Leu Asp Thr Val Val Ile Ser Thr Gln His Asp Pro Glu
195 200 205
Val Asp Arg Ala Trp Leu Glu Thr Gln Leu Arg Glu His Val Ile Asp
210 215 220
Trp Val Ile Lys Asp Ala Gly Ile Glu Asp Leu Ala Thr Gly Glu Ile
225 230 235 240
Thr Val Leu Ile Asn Pro Ser Gly Ser Phe Ile Leu Gly Gly Pro Met
245 250 255
Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly
260 265 270
Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser
275 280 285
Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Met Arg Trp Val Ala Lys Asn
290 295 300
Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Ala Glu Val Gln Val Ala Tyr
305 310 315 320
Ala Ile Gly Arg Ala Lys Pro Val Gly Leu Tyr Val Glu Thr Phe Asp
325 330 335
Thr Asn Lys Glu Gly Leu Ser Asp Glu Gln Ile Gln Ala Ala Val Leu
340 345 350
Glu Val Phe Asp Leu Arg Pro Ala Ala Ile Ile Arg Glu Leu Asp Leu
355 360 365
Leu Arg Pro Ile Tyr Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg
370 375 380
Thr Asp Leu Asp Leu Pro Trp Glu Ala Ile Asp Arg Val Asp Glu Leu
385 390 395 400
Arg Ala Ala Leu Lys Leu Ala
405
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> variable partial sequence
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<220>
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<223> Xaa=beliebige Aminos?ure
<220>
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<222> (7)..(7)
<223> Xaa=von Cys verschiedene Aminos?ure
<220>
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<222> (6)..(6)
<223> Xaa=Ser oder Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=Gly oder Ala
<400> 23
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val
1 5
Claims (21)
- a) 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 S-아데노실메티오닌 신타제 (metK) 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 발현하는, L-메티오닌을 생산하는 코리네형 박테리아를 발효시키는 단계;b) 상기 L-메티오닌을 배지, 박테리아 세포 또는 둘다에서 풍부화시키는 단계; 및c) 상기 L-메티오닌을 단리하는 단계를 포함하는, 발효에 의한 L-메티오닌의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 서열 21을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 코리네형 박테리아에서, metK 활성이 야생형에 비해 감소된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 코딩 metK 서열이 코리네형 박테리아에서 복제될 수 있거나 염색체 내로 안정하게 통합된 DNA이거나, 또는 RNA인 방법.
- 제1항에 있어서,a) 조절 서열의 제어 하에 서열 22의 아미노산 서열을 코딩하는 플리스미드 벡터로 형질전환된 박테리아를 사용하거나, 또는b) 서열 22의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 박테리아 염색체내로 통합된 박테리아를 사용하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,a) 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 유전자 lysC,b) 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 asd,c) 글리세린알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 gap,d) 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 유전자 pgk,e) 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자 pyc,f) 트리오스-포스페이트 이소메라제를 코딩하는 유전자 tpi,g) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 metA,h) 시스타티오닌-감마 신타제를 코딩하는 유전자 metB,i) 시스타티오닌-감마 리아제를 코딩하는 유전자 metC,j) 메티오닌 신타제를 코딩하는 유전자 metH,k) 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 glyA,l) O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 유전자 metY,m) 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 metF,n) 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 serC,o) 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 유전자 serB,p) 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 cysE,q) 시스테인 신타제를 코딩하는 유전자 cysK, 및r) 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 hom으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 뉴클레오티드 서열이, 카피 수를 증가시키거나 또는 강한 프로모터를 사용함으로써, 상기 코리네형 박테리아에서 동시에 과발현되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,a) 호모세린 키나제를 코딩하는 유전자 thrB,b) 트레오닌 데히드라타제를 코딩하는 유전자 ilvA,c) 트레오닌 신타제를 코딩하는 유전자 thrC,d) 메소-디아미노피멜레이트 D 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 ddh,e) 포스포에놀-피루베이트 카르복시키나제를 코딩하는 유전자 pck,f) 글루코스-6-포스페이트-6 이소메라제를 코딩하는 유전자 pgi,g) 피루베이트 옥시다제를 코딩하는 유전자 poxB,h) 디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자 dapA,i) 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자 dapB, 및j) 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 lysA로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 뉴클레오티드 서열이, 상기 유전자를 결실시키거나 또는 천연 프로모터를 약한 프로모터로 치환시킴으로써, 상기 코리네형 박테리아에서 동시에 약화되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 종의 미생물을 사용하는 것인 방법.
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