CN110358745A - 4-木糖醇脱氢酶突变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种4‑木糖醇脱氢酶突变体及其用途。该4‑木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第41位亮氨酸突变为甲硫氨酸、第179位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸的氨基酸序列。该4‑木糖醇脱氢酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。将该基因导入大肠杆菌获得含有该基因的基因工程菌，实现重组4‑木糖醇脱氢酶的制备，本发明提供的4‑木糖醇脱氢酶突变体热稳定性大幅度提高，可用于高效转化木糖醇制备L‑木酮糖。

Description

4-木糖醇脱氢酶突变体及其用途
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种4-木糖醇脱氢酶突变体及其用途。
背景技术
根据国际糖协会(ISRS)对稀有糖的定义:稀有糖是“在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。稀有糖虽然在自然界中含量少，但因具有潜在的生物活性和低毒性使其在膳食、保健、医药等领域发挥着重要作用。随着生活品质的提高，人们对膳食和健康的要求越来越高，对食品安全性和药物低毒性越来越关注。L-木酮糖(L-xylulose)是存在于多种生物体代谢途径的戊酮糖，其在自然界中浓度很低，是一种稀有糖。口服L-木酮糖可以抑制肠道蔗糖酶和麦芽糖酶活性，能有效地抑制餐后血糖升高，是降血糖食品的理想活性成分，L-木酮糖用于肿瘤治疗时能显著抑制恶性肿瘤细胞。此外，L-木酮糖可以作为其他稀有糖生产的前体物质。例如，L-木酮糖可以通过L-鼠李糖异构酶转化生产L-木糖和L-来苏糖。
根据Izumoring理论可以通过多种途径获得L-木酮糖。例如L-木糖和L-来苏糖通过醛糖异构酶的异构作用转化为L-木酮糖；L-核酮糖通过D-塔格糖3-差向异构酶作用于C-3位置羟基，通过差向异构作用转化为L-木酮糖；L-阿拉伯糖醇和木糖醇通过氧化还原酶的氧化作用转化为L-木酮糖。其中L-木糖、L-来苏糖、L-核酮糖和L-阿拉伯糖醇在自然界中含量极少，难以分离纯化且价格极其昂贵，无疑会提高L-木酮糖的生产成本。而木糖醇作为目前在商业领域应用最为广泛的稀有糖之一，已经实现工业化生产，价格相对低廉，易于获得。以木糖醇为底物，使得L-木酮糖的生产成本大大降低。
生物转化生产L-木酮糖，主要是通过菌体静息细胞催化氧化底物木糖醇。通常先培养菌体达到一定的浓度，通过过滤或离心方法收集并且洗涤培养的菌体细胞，再将这些细胞悬浮在含底物(主要为木糖醇)的反应体系中，在一定温度、pH和振荡条件下进行转化生产。该法反应条件温和，环境友好，成本较低且产品纯度高，易于实现规模化生产，基于长远考虑，生物转化法是最具潜力的，也是L-木酮糖生产技术的主要研究方向。微生物转化法生产L-木酮糖的研究最早见于1985年，美国康奈尔大学Doten等人在研究细菌性植物病原菌噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora，现更名为菠萝泛菌(Pantoea ananatis))的戊糖醇代谢过程中分离到1株能以木糖醇为唯一碳源的自发突变株(Doten et al.，1985)，该突变菌株检测到具有4-木糖醇脱氢酶(XDH)和L-木酮糖激酶的活性，这种新型4-木糖醇脱氢酶，木糖醇为底物KM达到48Mm，可以催化NADH为辅酶的L-木酮糖还原反应。随后，他们通过转位子突变诱变筛选得到木糖醇阴性突变体突变株，该突变株可以合成4-木糖醇脱氢酶，同时缺乏L-木酮糖激酶活性。突变体可以转化木糖醇生成L-木酮糖，而不能进一步磷酸化L-木酮糖，进入磷酸戊糖途径(Doten et al.，1985)。2006年芬兰赫尔辛基大学Aarnikunnas等人成功将菠萝泛菌中的4-木糖醇脱氢酶基因分离并在大肠杆菌(E.coli)中进行了表达，这是首次细菌来源的4-木糖醇脱氢酶基因克隆并表达成功。通过对4-木糖醇脱氢酶影响因素的研究表明，XDH受到镁离子调节，其最适p H在碱性范围(Aarnikunnas etal.，2006)。通过响应面法优化重组大肠杆菌的静息细胞转化木糖醇生成L-木酮糖的影响因素，其在生物反应器中以250g/L木糖醇为底物时，L-木酮糖的生产力达到1.09g/(gh)(Usvalampiet al.，2009)。
1991年日本香川大学稀有糖研究中心Izumori小组以D-山梨糖醇为唯一碳源从土壤中分离筛选得到1株能将塔罗糖醇氧化为阿洛酮糖的产碱杆菌(Alcaligenes)，该菌株体内多元醇脱氢酶具有转化木糖醇生产L-木酮糖的能力(Khan et al.，1991)。2007年日本香川大学稀有糖研究中心同一小组从土壤中分离得到的1株兼性嗜热菌，利用该菌株的静息细胞可以将木糖醇转化生成L-木酮糖，后将其鉴定为苍白芽胞杆菌(Bacillus pallidus)(Poonperm etal.，2007)。该菌株静息细胞在40℃下，甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 10)中活性最高，作用于2％木糖醇时转化率达到最高为85％。2010年，Takata等人将苍白芽胞杆菌体内4-木糖醇脱氢酶基因在大肠杆菌体内成功表达。将重组大肠杆菌静息细胞置于pH 11.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，以5％木糖醇为底物生产L-木酮糖，24h后木糖醇转化率达到35％(Takata et al.，2010)。
迄今为止，国内有关L-木酮糖生产方面的研究非常少，仅有两篇文献报道。2014年张玉宝等人从土壤中分离筛选得到1株可氧化木糖醇转化生产L-木酮糖的菌株ZN-14，经鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(张玉宝等.，2014)。利用该菌株的静息细胞以木糖醇溶液(20g/L，pH 9.0)为底物在37℃转化24h，转化率达到26.62％，酶活力为2.6U/mL。2019年，朱雯惠等人将Pantoea ananatis来源的4-木糖醇脱氢酶基因在重组枯草芽孢杆菌中表达发酵和反应条件优化(朱雯惠等.，2019)，并通过静息细胞反应得到最优的反应条件:底物质量浓度20g/L，缓冲溶液为甘氨酸-NaOH溶液(pH 10.0)，反应温度为45℃。以上条件下得到的最终酶活为5.183U/L，与LB培养基相比提高231.2％，转化率达17.74％。
到目前为止，仅有以上提到的四种野生型(菠萝泛菌、产碱杆菌、苍白芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌)不同微生物来源的4-木糖醇脱氢酶被报道，而且这些XDH热稳定性普遍较差，且活性较低导致L-木酮糖的产率低，限制了其工业应用范围。通常而言，在稀有糖工业化生产过程中，需要较高的操作温度。这是因为较高的反应温度可以带来很多的优势：提高反应效率(较高的反应速率和较低的扩散限制)，降低溶液的粘度，增加反应的稳定性，获得更高的产量(增加底物和产物的溶解度，促使反应平衡向吸热反应移动)，和减少微生物污染等。利用蛋白定向进化技术对野生型4-木糖醇脱氢酶进行改造，以获得活性高且热稳定性好、适合工业应用的4-木糖醇脱氢酶突变体，将是生物法制备L-木酮糖产业的关键。
参考文献
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Aarnikunnas J.S.,Pihlajaniemi A.,Palva A.,Leisola M.,A..Cloningand expression of a xylitol 4-dehydrogenase gene from Pantoea ananatis.ApplEnviron Microbiol,2006,(72):368–377
Usvalampi A.,Kiviharju K.,Leisola M.,M..Factors affecting theproduction of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli.Ind.Microbiol.Biotechnol.2009,(36):1323-1330
Khan A.R.,Tokunaga H.,Yoshida K.,Izumori K..Conversion of xylitol toL-xylulose by Alcaligenes sp.701B-Cells.Fermention Bioengineering,1991,72(6):488-490
Poonperm W.,Takata G.,Morimoto K.,Granstrom T.G.,IzumoriK..Production of L-xylulose from xylitol by a newly isolated strain ofBacillus pallidus Y25and characterization of its relevant enzyme xylitoldehydrogenase.Enzyme and Microbial Technology.2007,(40):1206-1212
Takata G，Poonperm W，Morimoto K，et al.Cloning and overexpression ofthe xylitol dehydrogenase gene from Bacillus pallidus and its application toL-xylulose production.Journal of the Agricultural Chemical Society ofJapan.2010,74(9):1 807-1 813.
张玉宝，赵祥颖，杨丽萍，等.一株产L-木酮糖菌株的分离筛选及鉴定.食品科学，2014，35(1):199-203.
朱雯惠，孟青，江波，张涛.重组枯草芽孢杆菌表达4-木糖醇脱氢酶的发酵和反应条件优化.食品与发酵工业.2019,45(9):21-28
发明内容
本发明人经前期研究挖掘到了来源于克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的4-木糖醇脱氢酶尽管具有高活性，归因于低热稳定性而得不到良好的催化效果。因此需利用定点突变开发一种具有改良的热稳定性4-木糖醇脱氢酶突变体(GenBank:STR65190.1)，提高其在催化生产L-木酮糖中的效率。
为实现上述目的，本发明利用分子对接建立底物(木糖醇)与酶(4-木糖醇脱氢酶)的复合物模型，对底物和酶结合的结构机理进行分析，选定可能影响4-木糖醇脱氢酶对木糖醇热稳定性的关键残基，通过定点突变得到了4-木糖醇脱氢酶突变体。该4-木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第41位亮氨酸突变为甲硫氨酸、第179位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸的氨基酸序列。
本发明的另一目的是提供该4-木糖醇脱氢酶突变体的制备方法。
本发明的又一目的是提供该4-木糖醇脱氢酶突变体的用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
4-木糖醇脱氢酶突变体基因，其野生型基因来源于克雷伯氏菌(GenBank:STR65190.1)，经过定点突变获得该4-木糖醇脱氢酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
一种4-木糖醇脱氢酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
包含所述的4-木糖醇脱氢酶突变体基因的重组载体。其可通过本领域常规方法将本发明的4-木糖醇脱氢酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成，重组质粒选自pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)，pQE2、pQE9、pQE30、pQE3 1、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-l、pGEX-6p-l、pGEX-6p-2、pBV220、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pBR322、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-28a(+)。同时，为了在枯草芽孢杆菌中表达，优选地，可以使用的重组质粒选自pWB980、pHT43、pBE2、pMUTIN4、pUB110、pE194、pMA5、pMK3、pMK4、pHT304、pHY300PLK、pBest502、pDG1363、pSG1154、pAX01、pSAS144、pDL、pDG148-stu、pDG641、pUCX05-bgaB、pHT01、pUB110、pTZ4、pC194、φ1或φ105。更优选，上述重组质粒是pMA5。
一种生产所述的4-木糖醇脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包含本发明所述的4-木糖醇脱氢酶突变体基因或本发明所述的重组载体。
所述的基因工程菌的宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞或枯草芽孢杆菌。更优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
本发明所述的4-木糖醇脱氢酶突变体基因、所述的重组载体、所述的基因工程菌在制备L-木酮糖中的应用。
一种4-木糖醇脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的基因工程菌，获得重组表达的4-木糖醇脱氢酶突变体。
本发明的4-木糖醇脱氢酶突变体在转化木糖醇制备L-木酮糖中的用途。
催化反应条件，底物浓度30g/l，反应时间6小时，温度45℃。
有益效果
本发明的4-木糖醇脱氢酶(XDH)突变体与现有技术的4-木糖醇脱氢酶相比，在保持原有的高催化活性下还具有更优良的热稳定性，这两点对较高温度条件下催化木糖醇生产L-木酮糖是优良的性能，在工业生产中可大大降低催化剂的用量和缩短反应时间,从而降低生产成本。根据本发明的实施例，突变体XDH在45℃保温2小时后，任保留了80％的酶活。在使用重组基因工程菌酶转化木糖醇糖生产L-木酮糖实验中，底物浓度30g/l时，XDH突变体的转化率为88.7％，相比提高了近2倍，酶活高且热稳性好，催化效率高。
由此生产的L-木酮糖能够有效地用作食品或药物的研究。
附图说明
图1是显示在本发明实施方案条件下NADH标准曲线。
图2是显示在本发明实施方案条件下温度对于XDH及其突变体活性影响。
图3是显示在本发明实施方案条件下XDH及其突变体的热稳定性。
具体实施方式
下文中，将参考具体实施例对本发明进行更详细地描述。这些实施例仅仅是为了例证的目的，而非意欲限制本发明的范围。
实施例1：基因工程菌的建立
根据NCBI收录的4-木糖醇脱氢酶基因XDH(GenBank:STR65190.1)，商业合成该4-木糖醇脱氢酶基因片段，以该基因片段为模版，通过PCR扩增扩展该片段(片段两侧加NdeI和BamHI限制性内切酶片段)其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。并利用NdeI和BamHI限制性内切酶位点将基因插入pET-28a质粒中，从而产生重组质粒pET-28a-XDH。通过常规转化方法，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中建立4-木糖醇脱氢酶基因程菌。将转化得到的含有野生型XDH基因的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-XDH保藏在-80℃的超低温冰箱中。其中PCR扩增野生型XDH基因的引物为:
上游引物为:5'-CGCGGCAGCCATATGATGATTGAACCTGTGGCCTG-3'(SEQ ID NO.5)
下游引物为:5'-CTCGAATTCGGATCCTTACTTATCAGCTTTAATAA-3'(SEQ ID NO.6)
实施例2：定点突变
定点突变的引物采用Primer premier 5.0设计，引物设计的原则为：正反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为15bp，所需引入的突变包含在互补区域内。突变引物见表1。
表1突变引物
定点突变以pET-28a-XDH或pET-28a-XDH(L41M)重组质粒为模板，利用PrimerStarMix进行全质粒扩增，按照表2设置反应体系，扩增产物经过Dpn I酶消化去除PCR反应体系中的模板，然后在重组酶催化下将5’端和3’端进行同源重组，完成质粒的环化。最后将环化的扩增产物转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，并涂布在含卡那霉素的平板上，置于37℃培养箱中过夜培养。
表2定点突变体系
PCR程序为：95℃预变性300s，98℃变性10s，65℃退火15s，72℃延伸300s，反应30个循环后，再72℃延伸5min，最后4℃保温。PCR反应结束后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。然向每个PCR管中加入1μl Dpn I轻轻混匀后置37℃金属浴2h，之后将消化好的扩增产物按照表3中的配方进行重组反应。
表3重组反应体系
次日从平板中挑选含有突变质粒的重组大肠杆菌BL21三株，将上述重组菌从平板分别接种到装有5mL含有相应抗性的液体LB培养基(LB(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5)的50mL的摇管中，加入相应抗性，在摇床上37℃恒温培养12h，转速200rpm。培养结束后抽提质粒，送金斯瑞公司进行测序。最后将测序结果与野生型酶蛋白核酸序列进行比对，确定突变是否成功。
按照上述方法先进行单个位点突变得到重组表达菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-XDH(L41M)，再以进过一次突变后的重组质粒pET-28a-XDH(L41M)为模板进行二次突变，最后得到了测序正确的包含XDH突变体的双位点突变重组表达菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-XDH(L41M+I179F)。
实施例3：重组大肠杆菌发酵培养
将实施例1、实施例2所得的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-XDH、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-XDH(L41M+I179F)分别接种至装有5mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养8小时。取1ml菌体培养液转接至装有50mL TB发酵培养基((g/L)：蛋白胨15，酵母提取物25，氯化钠10，含卡那霉素50μg/mL)的250ml摇瓶中，于37℃，200rpm振荡培养3小时，再于25-30℃，200rpm发酵培养12-16小时后，低温离心(8000rpm，10min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(pH7.5，100mmol/L)清洗两次，分散于1ml同样的预冷的缓冲液中，于冰水中进行超声破碎。离心(8 000rpm,30min,4℃)，弃菌体碎片，得到野生型XDH及其突变体粗酶液。
实施例4：XDH的纯化
为了纯化上述XDH及其突变体。采用GE公司的AKTA prime层析系统，使用5mL的HisTrapHP镍柱亲和层析。层析柱用pH 8.5，0.5M NaCl，20mM咪唑，20mM磷酸钠缓冲(缓冲液A)预平衡，洗脱缓冲液为pH 8.5，0.5M NaCl，0.5M咪唑，20mM磷酸缓冲(缓冲液B)，采用0％－100％缓冲B梯度洗脱，总洗脱时间为30min，然后将收集的活性蛋白过SephacrylS-300凝胶柱进一步脱盐去除杂蛋白，经280nm紫外检测仪监测，在高数值时收集目的蛋白。纯化后的酶进行冷冻干燥，得到冻干粉用于测定蛋白浓度和活性。
实施例5：XDH的酶活测定
XDH催化木糖醇生成L-木酮糖的氧化反应需要NAD+作为辅酶并生成NADH，通过测量单位时间内反应体系在340nm处吸光度的变化量来计算XDH的酶活力。在EP管中设置测酶活的反应体系：1.5M的木糖醇溶液100μL，2mM的NAD+溶液(使用100mM磷酸钠缓冲液新鲜配制，pH＝8.5)100μL，10mMβ-巯基乙醇100μL，500mM的磷酸钠缓冲液(pH 8.5)400μL，dd H2O200μL；对照组为1.5M的木糖醇溶液0μL，2mM的NAD+溶液100μL，10mMβ-巯基乙醇100μL，磷酸钠缓冲液(pH 8.5)400μL，dd H2O 300μL。体系中添加β-巯基乙醇作为还原剂，具有防止二硫键相互交联的作用，能维持酶的活性状态。
使用移液器将上述反应液充分混匀后，转移至96孔酶标板，向每个孔里加入200μl混匀后的反应液，分别设置3组200μl的平行反应体系。待酶标仪在30℃保温5分钟后加入等量的纯酶液激活反应，立即检测波长340nm处检测吸光值变化，如公式(1)所：
酶的比活力计算公式如下:
其中V-反应体系总体积(200μL)；D-稀释倍数；v-酶液体积(5μL)；C-蛋白浓度(mg/mL)；ε为NADH的摩尔消光系数(光程为1cm时，ε＝6.220mM-1cm-1)，此处采用NADH标准曲线方程(如图1)的斜率来校正，精确称量一定量的NADH，稀释不同倍数配置成不同浓度的NADH溶液，测定其在340nm处的吸光值，拟合线性方程，横坐标为NADH浓度，纵坐标为340nm波长下的吸光值。以每分钟生成1μmol NADH所需的酶量为一个活力单位(U)。蛋白定量采用TaKaRaBCA试剂盒测定。
实验结果，野生型XDH催化转化木糖醇的比活力为92.6U/mg冻干粉，而突变体XDH的酶比活力达到90.5U/mg冻干粉，相比野生型XDH的高活性只有略微下降。
实施例6：温度对XDH突变体活性的影响
(1)温度对野生型XDH及其突变体活力的影响
在不同温度条件下(25℃-60℃)按照实施例5所述方法测定实施例4中纯化后的XDH以木糖醇为底物的氧化活力，反应体系的缓冲液pH值为9.0。以最高的酶活力为100％，其对应的温度为最适温度，绘制XDH的温度-相对活力曲线。结果(如图2)显示，野生型XDH的最适温度为45℃，当反应温度超过50℃时酶活迅速下降，而XDH突变体的最适温度为50℃。
(2)野生型XDH及其突变体的热稳定性研究
将实施例4中纯化后的野生型XDH及其突变体酶分别置于45℃和50℃水浴条件下保温热处理，每隔一段时间取样测定剩余酶活。以初始的酶活力为最高酶活100％，绘制XDH的突变体的温度-相对活力曲线。结果(如图3)显示，野生型XDH在45℃保温2小时后酶活下降到60％以下，而其突变体在45℃保温2小时后，任保留了80％的酶活。
实施例7：重组基因工程菌酶转化木糖醇糖生产L-木酮糖
(1)两组静息细胞转化实验：1mL的反应体系中，加入1mL的用甘氨酸-NAOH缓冲液(50mM，pH 9.0)溶解的30g/L的木糖醇，按照实施例3所述发酵培养得到的50mL重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-XDH发酵液离心收集的菌体，45℃保温6h，然后煮沸10min以终止酶反应。
1mL的反应体系中，加入1mL的用甘氨酸-NAOH缓冲液(50mM，pH 9.0)溶解的30g/L的木糖醇，按照实施例3所述发酵培养得到的10mL重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-XDH(L41M+I179F)发酵液离心收集的菌体，45℃保温6h，然后煮沸10min以终止酶反应。
(2)用半胱氨酸咔唑比色法检测L-木酮糖的生成量。转化液经适当稀释后，移取1mL转化液，加入0.2mL 15g/L的半胱氨酸盐酸盐溶液，6mL体积分数为70％的硫酸溶液，摇匀后立即加入0.2mL 1.2g/L咔唑酒精溶液，70℃水浴保温10min，冷却10min。以空白调零，在560nm处测定吸光度。通过标准曲线计算生产的木酮糖含量。
反应6h后，含野生型XDH基因的重组菌催化生产L-木酮糖的转化率是45.2％，而突变体XDH的转化率为88.7％，相比提高了近2倍，由此表明，在较高温度下突变体XDH的反应催化活性要显著高于野生型XDH。
序列表
<110> 苏州科宁多元醇有限公司
<120> 4-木糖醇脱氢酶突变体及其用途
<141> 2019-08-22
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 202
<212> PRT
<213> 克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca )
<400> 1
Met Ile Glu Pro Val Ala Cys Cys Leu His Gly Leu Lys Ser Ala Asn
1 5 10 15
Ile His Ala Lys Asp Thr Val Leu Val Leu Gly Ser Gly Thr Ile Gly
20 25 30
Leu Val Ser Ala Gln Leu Ala Ala Leu Lys Gly Ala Ser Thr Val Ile
35 40 45
Val Ser Asp Leu Ser Arg Phe Lys Arg Glu Leu Ala Leu Lys Val Gly
50 55 60
Val Thr His Ala Ile Asp Pro Ala Asn Glu Asn Leu Glu Met Arg Val
65 70 75 80
Ala Glu Ile Thr His Asp Lys Gly Pro Asp Val Val Ile Ile Ala Ala
85 90 95
Gly Val Ser Ser Leu Val Ser Gln Ala Val Asn Ile Val Arg Arg Gly
100 105 110
Gly Arg Ile Val Val Phe Ser Pro Phe Asp Lys Asn Pro Val Val Glu
115 120 125
Ile Asp Ala Ser Arg Leu Phe Arg Asp Glu Ile Ser Ile Val Gly Thr
130 135 140
Tyr Ser Leu Thr Pro Tyr Glu Met Lys Glu Ala Ile Glu Ile Val Glu
145 150 155 160
Lys Asp Lys Ile Asn Thr Arg Asp Met Ile Thr His Thr Trp Pro Leu
165 170 175
Ser Arg Ile Gly Glu Ala Ile Glu Phe Ala Ala Asn Pro Glu Asn Asp
180 185 190
Val Leu Lys Val Ile Ile Lys Ala Asp Lys
195 200
<210> 2
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ile Glu Pro Val Ala Cys Cys Leu His Gly Leu Lys Ser Ala Asn
1 5 10 15
Ile His Ala Lys Asp Thr Val Leu Val Leu Gly Ser Gly Thr Ile Gly
20 25 30
Leu Val Ser Ala Gln Leu Ala Ala Met Lys Gly Ala Ser Thr Val Ile
35 40 45
Val Ser Asp Leu Ser Arg Phe Lys Arg Glu Leu Ala Leu Lys Val Gly
50 55 60
Val Thr His Ala Ile Asp Pro Ala Asn Glu Asn Leu Glu Met Arg Val
65 70 75 80
Ala Glu Ile Thr His Asp Lys Gly Pro Asp Val Val Ile Ile Ala Ala
85 90 95
Gly Val Ser Ser Leu Val Ser Gln Ala Val Asn Ile Val Arg Arg Gly
100 105 110
Gly Arg Ile Val Val Phe Ser Pro Phe Asp Lys Asn Pro Val Val Glu
115 120 125
Ile Asp Ala Ser Arg Leu Phe Arg Asp Glu Ile Ser Ile Val Gly Thr
130 135 140
Tyr Ser Leu Thr Pro Tyr Glu Met Lys Glu Ala Ile Glu Ile Val Glu
145 150 155 160
Lys Asp Lys Ile Asn Thr Arg Asp Met Ile Thr His Thr Trp Pro Leu
165 170 175
Ser Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Phe Ala Ala Asn Pro Glu Asn Asp
180 185 190
Val Leu Lys Val Ile Ile Lys Ala Asp Lys
195 200
<210> 3
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgattgaac ctgtggcctg ctgcctgcat gggctgaaat cagccaatat tcacgctaaa 60
gataccgttc tggttctggg gtccggcacg attggtctgg tgagcgctca gctcgccgct 120
ttaaaaggcg catcgaccgt catcgtatcc gatctctcgc gcttcaaacg tgaactggcg 180
ttaaaggtcg gcgtgaccca tgcgattgat cccgccaatg aaaatcttga aatgcgggtg 240
gcggaaatta cgcatgataa ggggcctgat gtggtgatca ttgcggctgg cgtatcatcg 300
ctggtttctc aggcggtgaa tattgttcgt cgcggcggca ggatcgtagt gttctctccg 360
tttgataaaa acccggtggt ggagattgac gccagccgct tgttccgcga cgaaatatct 420
atcgtcggca cctattcact gacgccttat gaaatgaaag aagctattga aatcgtagag 480
aaagataaaa ttaacaccag agatatgatt actcatacct ggccgctttc tcgtattggt 540
gaagctattg aatttgcggc aaatcctgaa aatgacgtgc ttaaagtgat tattaaagct 600
gataagtaa 609
<210> 4
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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gataccgttc tggttctggg gtccggcacg attggtctgg tgagcgctca gctcgccgct 120
atgaaaggcg catcgaccgt catcgtatcc gatctctcgc gcttcaaacg tgaactggcg 180
ttaaaggtcg gcgtgaccca tgcgattgat cccgccaatg aaaatcttga aatgcgggtg 240
gcggaaatta cgcatgataa ggggcctgat gtggtgatca ttgcggctgg cgtatcatcg 300
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gataagtaa 609
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcggcagcc atatgatgat tgaacctgtg gcctg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcgaattcg gatccttact tatcagcttt aataa 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagctcgccg ctatgaaagg cgcatcgacc gtcat 35
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcgatgcgc ctttcatagc ggcgagctga gcgct 35
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggccgctttc tcgtattggt gaagctattg aattt 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatagcttca ccaatacgag aaagcggcca ggtat 35

Claims (8)

1.一种4-木糖醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述4-木糖醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第41位亮氨酸突变为甲硫氨酸、第179位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸的氨基酸序列。
2.一种4-木糖醇脱氢酶突变体基因，其特征在于：所述4-木糖醇脱氢酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.一种包含权利要求2所述的4-木糖醇脱氢酶突变体基因的重组载体。
4.一种生产权利要求1所述的4-木糖醇脱氢酶突变体的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含权利要求2所述的4-木糖醇脱氢酶突变体基因或权利要求3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。
6.权利要求2 所述的4-木糖醇脱氢酶突变体基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4- 5 中任一项所述的基因工程菌在制备4-木糖醇脱氢酶中的应用。
7.一种4-木糖醇脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：培养权利要求4或5所述的基因工程菌，获得重组表达的4-木糖醇脱氢酶突变体。
8.权利要求1所述的4-木糖醇脱氢酶突变体在转化木糖醇制备L-木酮糖中的用途。
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