DE69500047T2

DE69500047T2 - Industrielle, kaltinaktive Backhefe

Info

Publication number: DE69500047T2
Application number: DE69500047T
Authority: DE
Inventors: Johannes Baensch; Christof Gysler; Peter Niederberger
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1994-03-16
Filing date: 1995-03-10
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2015-03-11
Also published as: DK0663441T3; HK1006577A1; FI120351B; CN101343617B; FI951183A0; EP0663441B1; ES2092912T3; NO950996D0; NO950996L; ZA951479B; FI951183A; US5776526A; CA2143477A1; JP2000139326A; JP3442021B2; BR9501091A; CA2143477C; AU1239295A; AU682236B2; CN1118007A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entwicklung von industriellen Backhefestämmen mit LTI-Eigenschaft, Hefestämme mit LTI-Eigenschaft, die Verwendung dieser Stämme bei der Herstellung eines Backteigs, ein Verfahren zur Herstellung eines gekühlten Backteigs, der einen dieser Hefestämme enthält, und einen die erfindungsgemäßen Stämme aufweisenden Backteig.
Es ist bekannt, daß der Geschmack und die Textur eines Backteigs, der durch Hefen aufgegangen ist, besser als die eines Teigs sind, der durch chemische Mittel getrieben wurde. Man kennt ferner handelsübliche Backwaren wie Teige für Semmeln und Croissants, die dazu bestimmt sind, vor dem Gären und Backen im Kühlschrank aufbewahrt zu werden, die jedoch ein chemisches Treibmittel enthalten.
Deshalb beschreibt EP 0487878 die Verwendung von Hefestämmen, die eine LTI-Eigenschaft oder einen LTI-Phänotyp ausprägen, mit anderen Worten, eine Eigenschaft, unter Kühlung wenig aktiv zu sein, jedoch bei diesen Temperaturen lebensfähig zu bleiben (LTI ist die Abkürzung des engl. Ausdrucks "Low temperature inactive"), als Treibmittel für die Herstellung von Backwaren, die nach Aufbewahrung unter Kühlung im Ofen zu backen sind. Diese Hefen sind jedoch zu stark, d.h. entwickeln zu viel Gas bei hohen Kühltemperaturen, d.h. zwischen 8 und 12ºC und auch 14ºC, die jedoch gewöhnlich, manchmal über längere Zeit, unter den gebräuchlichen industriellen Bedingungen der Lagerung von Kühlprodukten beobachtet werden. Diese Stärke kann insbesondere dem Vorhandensein eines aktiven und nicht durch einen Katabolismus reprimierten Allels zugeschrieben werden, aber auch einer unzureichenden Selektion des LTI-Charakters dieser Stämme. Schließlich sind diese Hefen auch nicht optimiert, um auf günstige Weise alle für ihre industrielle Erzeugung erforderlichen Bedingungen zu erfüllen, wie beispielsweise eine gute Trocknungsfähigkeit oder eine hohe Wachstumsausbeute.
Auf dieselbe Weise beschreiben WO 93/01724 und EP 0556905 die Verwendung von Hefestämmen, die eine ähnliche Eigenschaft haben, wie sie in der EP 0487878 beschrieben wird. Die beschriebenen Stämme gehoren jedoch zu einer Klasse von LTS-Mutanten (LTS ist die Abkürzung des engl. Ausdrucks "Low temperature sensitive"; Singh et al., 1974, Genetics 77, 651-659), die häufig einen schnellen Verlust ihrer Lebensfähigkeit bei Kühltemperaturen zeigen. Außerdem sind diese Hefen für eine Erzeugung und eine optimale industrielle Verwendung schlecht geeignet. Es handelt sich nämlich um haploide und auxotrophe Laborhefen, die kaum dazu geeignet sind, auf herkömmlichen industriellen Medien kultiviert zu werden. Außerdem sind ihre Wachstumsfähigkeit und ihre Produktivität auf diesen Medien wahrscheinlich im Vergleich zu denen eines industriellen Backhefestamms wie beispielsweise des Stamms "Levure de boulangerie bleue" (LBB) (Lesaffre, Frankreich) gering. Außerdem ist die genetische Stabilität dieser Stämme wahrscheinlich ebenfalls unzureichend, um ihre industrielle Erzeugung in Betracht kommen zu lassen. Es bestünde nämlich die Gefahr, daß ein Teil der Erzeugung den LTS-Charakter verliert. Schließlich sind diese Stämme wahrscheinlich kaum in der Lage, eine gebräuchliche Trocknung auf dieselbe Weise zu überleben, wie sie ein industrieller Backhefestamm überleben kann.
WO 93/01724 beschreibt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines verpackten und gekühlten Backteigs, der als Treibmittel LTS-Hefen besitzt. Bei diesem Verfahren stellt man den Teig her, indem man diese Hefen mindestens mit Mehl und Wasser mischt, bringt man anschließend diesen Teig in einen Behälter ein, den man hermetisch verschließt, und läßt dann den Teig in diesem Behälter gehen, den man bei einer Kühltemperatur aufbewahrt. Man erhält so einen unter Druck stehenden Behälter, der einen gekühlten Teig enthält, von dem anzunehmen ist, daß die LTS-Hefen während der gesamten Dauer der Lagerung des Behälters unter Kälte quasi inaktiv sind.
Dieses Verfahren ist jedoch aus verschiedenen Gründen nicht befriedigend. Erstens beobachtet man beim Öffnen des Behälters ein schnelles Aufblähen des Teigs infolge seiner Dekomprimierung, was zur Zerstörung der herkömmlichen Textur des Teigs führen kann.
Außerdem können die LTS-Hefen wahrscheinlich bei hohen Kühltemperaturen, d.h. zwischen 8 und 12ºC und auch 14ºC, die übrigens gewöhnlich bei den gebräuchlichen Bedingungen der industriellen Lagerung von Kühlprodukten beobachtet werden, viel zu viel Gas und Aromen freisetzen. So besteht die Gefahr, daß der Innendruck des Behälters nach einer Lagerzeit von einigen Wochen so hoch wird, daß der Behälter explodieren kann. Außerdem kann die Gefahr bestehen, daß die zugleich im Teig und in der Atmosphäre des Behälters vorhandene Aromakonzentration die gebräuchlichen olfaktonschen und organoleptischen Eigenschaften des Teigs beeinträchtigt.
Außerdem ist anzunehmen, daß die beschriebenen Hefen bei niedrigen Kühltemperaturen, d.h. bis zu 8ºC, kein Gas frei setzen und damit keine Aromen freisetzen, es sei denn, man läßt den Druck im Behälter übermäßig ansteigen. Deshalb ist anzunehmen, daß diese Aromen hauptsächlich während des Treibens des Teigs erzeugt werden, worauf nur noch wenige von ihnen erzeugt werden. Da die Aromen von Natur aus in stabil sind, kann der Teig auch deshalb während der Lagerung schnell seine organoleptischen Eigenschaften verlieren
Schließlich wurden die Hefen während des Schritts des Treibens des Teigs stark aktiviert, und es ist schwer daran zu denken, sie einfach zu inaktivieren, indem man den Teig, der sie enthält, einer Kühltemperatur unterwirft. Die Hefen haben nämlich jetzt einen sehr aktiven Gärungsmetabolismus.
Es wäre infolgedessen interessant, das Auftreten der charakteristischen Aromen einer Gärung durch Hefen während der gesamten Aufbewahrungszeit des Teigs zu begünstigen, ohne daß sie jedoch eine gewisse Konzentration überschreiten. Ebenso wäre es vorteilhaft, wenn man sich von den Beschränkungen freimachen könnte, die der Innendruck des Behälters auferlegt.
Ziel der Erfindung ist es, die Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen und so ein Verfahren zur Entwicklung von industriellen Backhefestämmen mit LTI-Eigenschaft, LTI- Hefen und ein Verfahren zur Herstellung eines gekühlten Backhefeteigs, der einen Stamm dieser LTI-Hefen enthält, zu schaffen.

Zusammenfassung der Erfindung

Zu diesem Zweck kreuzt man in dem Verfahren zur Entwicklung eines industriellen Backhefestamms, der einen LTI-Phänotyp zeigt, d.h. die Eigenschaft, in einem Teig bei einer Temperatur von 14ºC oder weniger, bei der der Teig nicht gefriert, praktisch inaktiv zu sein, aber lebensfähig zu bleiben und in einem Maltosemedium bis 18ºC praktisch inaktiv zu sein, zunächst einen haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae, der die Fähigkeit aufweist, bei einer Temperatur von 3 bis 10ºC, vorzugsweise über 10ºC, inaktiv zu sein, mit einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae, der mindestens ein aktives Allel MAL, das jedoch einer Katabolit-Repression unterliegt, aufweist, und dann in einem zweiten Schritt die Segreganten kreuzt und schließlich einen diploiden prototrophen Stamm selektioniert, der einen LTI-Phänotyp, einen aktiven MAL-Phänotyp, jedoch unter Katabolit-Repression, und eine Wachstumsfähigkeit im Fed-batch-Verfahren aufweist.
Die erfindungsgemäßen industriellen Backhefen haben eine Wachstumsausbeute im Fed-batch-Verfahren von 0,1 bis 0,5 g Trockenbiomasse pro g Zucker, eine CO&sub2;-Erzeugung von weniger als 15 ml/h/kg Teig bis zu 8ºC, weniger als 20 ml/h/kg Teig bis zu 12ºC und außerdem weniger als 10 ml pro Gramm Preßhefe bis zu einer Temperatur von 18ºC nach 4 Tagen Kultur in Maltosemedium.
In dem Verfahren zur Herstellung eines gekühlten und verpackten Backteigs stellt man diesen Teig her, indem man erfindungsgemäße Hefen mindestens mit Wasser und mit Mehl mischt und dann diesen Teig in einem Behälter verpackt, der ein Gasaustrittsventil besitzt.
Der erfindungsgemäße Backteig enthält mindestens Wasser, Mehl und einen erfindungsgemäßen LTI-Hefestamm und wurde mindestens 1 bis 2 Tage unter Kühlung aufbewahrt.
Auf diese Weise konnte man bemerkenswerte LTI-Backhefestämme entwickeln, die die Eigenschaft besitzen, in einem Teig bei Kühltemperaturen inaktiv zu sein, jedoch zu über leben und sogar bei höheren Temperaturen, d.h. bis zu 18ºC, praktisch inaktiv zu sein.
Diese Backhefestämme besitzen ferner die Eigenschaft, für eine industrielle Verwendung geeigneter zu sein. Diese Stämme besitzen so eine Wachstumsausbeute, die nahe und sogar gleich der eines handelsüblichen industriellen Stamms wie der Hefe LBB ist. Diese Stämme eignen sich auch bemerkenswert gut für eine Trocknung zum Zweck ihrer Konservierung, ohne daß sie nach Rehydratisierung ihre Aktivität auf eine signifikante Weise verlieren. Schließlich ist die überraschende genetische Stabilität dieser Hefen hinsichtlich ihres LTI-Charakters zu erwähnen.
Dank des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens dieses Teigs vermeidet man schließlich alle mit dem Innendruck des Behälters verbundenen Nachteile. So kann man ein biegsameres Verpackungsmaterial verwenden. Ferner wird der Geschmack des Teigs durch die Restaktivität der Hefen, die während der gesamten Konservierungszeit Aromen entwicklen, ohne jedoch den Teig zu treiben, und auch durch das Austreten des Überschusses an während der Lagerphase erzeugten Aromen aus der Verpackung verbessert.
Schließlich sättigt sich der Teig im Laufe seiner Lagerung mit Gas, so daß er unmittelbar gebacken werden kann, da das Vorhandensein von Gas im Teig genügt, um ihn beim Backen expandieren zu lassen. Man spart sich so eine Vorstufe, in der der Teig gehen muß.
Unter "Allel MAL" versteht man in der vorliegenden Beschreibung ein komplexes Gen, das zur Familie der MAL-Gene gehirt, die für drei Funktionen kodieren, eine alpha-Glucosidase, eine Permease und ein Regulierungsprotein. Unter dem Ausdruck "aktives Allel MAL, jedoch unter Katabolit-Repression" versteht man ein Allel MAL, bei dem die Expression seiner Funktionen durch das Vorliegen beispielsweise im Glucose- oder Saccharosekulturmedium reprimiert wird (induzierbares Allel MAL), oder ein Allel MAL, das seine Funktionen exprimiert, dessen Funktionen selbst jedoch durch das Vorliegen beispielsweise im Glucose- oder Saccharosekulturmedium reprimiert werden (konstitutives Allel MAL).
Unter "LTI-Hefen" versteht man die Hefen, die die Eigenschaft oder den Phänotyp zeigen, in einem Teig bei einer Temperatur von gleich oder weniger als 14ºC, bei der der Teig nicht gefriert, praktisch inaktiv zu sein, jedoch zu überleben und bis zu 18ºC in einem Maltosemedium ebenfalls praktisch inaktiv zu sein.
Unter "Wachstumsfähigkeit" versteht man die Fähigkeit, mit einer guten Ausbeute und einer guten Produktivität in einem industriell verwendbaren Verfahren kultiviert werden zu können, insbesondere in dem unter dem Namen Fed-batch bekannten gebräuchlichen Backhefe-Kulturverfahren (langsame und allmähliche Beigabe einer Zuckerlösung zu einer Suspension unter Belüftung, so daß die Alkoholbildung während der Biomasseerzeugung vermieden wird und die Ausbeute maximiert wird).
Mit "prototroph" bezeichnet man eine Hefe, die sich auf einem Kulturmedium entwickelt, das ausschließlich eine Kohlenstoff-, Stickstoff-, Phosphat- und Schwefelquelle, Spurenelemente und Spuren von Vitaminen enthält. Dieses Medium kann "Minimalmedium" genannt werden.
Unter dem Ausdruck "Kühltemperatur" versteht man alle Temperaturen von 12ºC oder darunter, bei denen der Teig nicht gefriert.
In der folgenden Beschreibung wird schließlich mit dem Begriff "Teig" oder "Backteig" ein gebräuchlicher Backteig, wie beispielsweise ein Pizzateig, ein Brotteig oder ein Croissantteig, verstanden. Diese Teige können insbesondere mindestens beispielsweise eine geeignete Menge Weizenmehl, Salz, Öl und Wasser enthalten.

Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1:

Darstellung des CO&sub2;-Erzeugungsniveaus in Abhängigkeit von der Zeit bei 100 g Teig mit 1 % Presshefe bei 8ºC, 12ºC und 30ºC, bei den Stämmen NCIMB 40611, 40612 und einer Backhefe Hindelbank.

Figur 2:

Dreidimensionale Darstellung des CO&sub2;-Erzeugungsniveaus in Maltosemedium in Abhängigkeit von der Temperatur und der Zeit bei den Stämmen NCIMB 40612.

Figur 3:

Dreidimensionale Darstellung des CO&sub2;-Erzeugungsniveaus in Maltosemedium in Abhängigkeit von der Temperatur und der Zeit bei der Hefe "levure de boulangerie bleue" (LBB, zum Vergleich).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens zur Entwicklung eines Hefestamms mit LTI-Eigenschaft kreuzt man zunächst einen haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae mit LTI-Eigenschaft mit einem haploiden Stamm von Saccharomyces cervisiae, der mindestens ein aktives Allel MA1, jedoch unter Katabolit-Repression, aufweist.
Zu diesem Zweck kann man einen haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae wählen, der eine gute LTI-Eigenschaft besitzt, d.h. die Fähigkeit, beispielsweise zwischen 3 und 10ºC, vorzugsweise über 10ºC, inaktiv zu sein.
Man kann auch einen Stamm von Saccharomyces cerevisiae wählen, der mindestens ein Allel MAL unter Katabolit-Repression besitzt, das induzierbar ist, was bedeutet, daß die alpha-Glucosidase nicht konstitutiv in dieser in einem Industriekulturmedium kultivierten Hefe vorliegt. Diese Medien enthalten nämlich als Zucker hauptsächlich Zucker, die für die Katabolit-Repression verantwortlich sind, beispielsweise Glucose und/oder Saccharose. In einem Backteig dagegen synthetisiert die Hefe die alpha-Glucosidase, um die Maltose des Teigs nur zu verwerten, wenn die für die Katabolit-Repression verantwortlichen Zucker von der Hefe erschöpft wurden. Man kann so beispielsweise das Allel MAL2, MAL3 oder MAL6 verwenden.
Das Allel MAL unter Katabolit-Repression kann außerdem auch konstitutiv sein, was bedeutet, daß die alpha-Glucosidase in der Hefe natürlich vorhanden ist, wobei es gleichzeitig durch die Anwesenheit von Glucose oder Saccharose des Kulturmediums reprimiert wird. In einem Backteig verwertet diese Hefe direkt die Maltose des Teigs nur, wenn die für die Katabolit-Repression verantwortlichen Zucker von der Hefe erschöpft wurden. Man kann so beispielsweise das Allel MAL2-8c wählen.
Die aus der ersten Kreuzung hervorgegangenen diploiden Abkömmlinge können nun auf einem gebräuchlichen Sporulationsmedium zur Sporenbildung gebracht werden, um haploide Segreganten zu erhalten. In dieser Phase kann man den LTI- und MAL-Charakter der haploiden Segreganten testen, indem man sie im Fall des MAL-Charakters auf einem Medium, das als einzige Kohlenstoffquelle Maltose enthält, beispielsweise das YPM-Agar-Medium (vgl. Kapitel Medien), und im Fall des LTI-Charakters beispielsweise auf einem YPD-Agar- Medium mindestens 21 Tage lang bei einer Kühltemperatur von 8ºC kultiviert. Nach mindestens 21 Tagen werden die LTI-Kolonien, die am Leben geblieben sind, jedoch relativ aktiv bleiben, in Abhängigkeit von ihrer sichtbaren Zellentwicklung im Vergleich zu der des haploiden Nicht-LTI-Elternteils selektioniert. Man wählt vorzugsweise die Kolonien, die sich bei dieser Temperatur langsam entwickeln.
Anschließend kreuzt man in einem zweiten Schritt die Segreganten mit entgegengesetzten Geschlecht auf einem geeigneten Medium miteinander. Man kann hierbei Segreganten kreuzen, die von derselben ersten Kreuzung stammen, oder Segreganten kreuzen, die von einer anderen ersten Kreuzung stammen, d.h. eine Kreuzung von zwei Segreganten, die jeweils Eltern haben, die verschieden sein können, oder von denen einer der Elternteile der gleiche sein kann. Man erhält so eine große Anzahl von diploiden Hefestämmen, die eine hohe Diversität von Merkmalen besitzen.
Man kann den prototrophen Charakter der diploiden Hefen testen, indem man sie beispielsweise auf Minimalmedium kultiviert. Man kann ferner den MAL-Phänotyp testen, indem man sie beispielsweise auf dem Medium YPM-Agar kultiviert. Die Hefen, die von ihren Eltern eines oder mehrere MAL-Gene unter Katabolit-Repression geerbt haben, werden hierbei die Maltose verwerten und werden dabei durch den im Medium vorhandenen pH-Indikator nachgewiesen. Man kann ferner den diploiden Charakter der Hefen testen, indem man sie beispielsweise auf einem geeigneten Medium sporulieren läßt. Schließlich kann man die LTI-Eigenschaft der diploiden Stämme testen, indem man sie beispielsweise auf YPD-Agar- Medium 21 Tage lang bei einer Kühltemperatur von 8ºC kultiviert. Die LTI-Stämme entwickeln sich hierbei darin sehr langsam.
Schließlich selektioniert man aus diesen diploiden Hefestämmen einen prototrophen Stamm, der einen LTI-Phänotyp, einen aktiven MAL-Phänotyp, jedoch unter Katabolit-Repression, und eine Wachstumsfähigkeit im Fed-batch-Verfahren aufweist.
In diesem Schritt kann man also strengere und vollständigere Selektionskriterien anlegen, als sie während der folgenden Schritte verwendet werden. Man kann so eine besondere LTI-Eigenschaft selektionieren, indem man die Stämme einem Test der CO&sub2;-Erzeugung in einem Backteig während mehrerer Tage beispielsweise bei Temperaturen von 3 bis 30ºC, insbesondere von 8 bis 14ºC, unterwirft.
Man kann diesen diploiden Stamm auch in Abhängigkeit von einer Wachstumsfähigkeit, d.h. von einer exponentiellen Wachstumsrate im Fed-batch-Verfahren, selektionieren, indem man ihn in einem Kulturmedium entwickelt, das bei den Hefen eine Atmungsmetabolisierung der Kohlenstoffquelle(n) verlangt. Man kann hierbei Stämme selektionieren, die eine exponentielle Wachstumsrate besitzen, die gleich oder größer als 50 % der eines industriellen Vergleichshefestamms ohne LTI-Eigenschaft, wie beispielsweise des Stamms LBB, ist, vorzugsweise jedoch die Stämme, bei denen diese Rate gleich oder größer 65 % ist, und insbesondere die Stämme, deren Rate nahe oder gleich 100 % ist.
Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Entwicklungsverfahrens kann man also Hefestämme entwickeln, die eine bemerkenswerte LTI-Eigenschaft besitzen. Die Repression des MAL- Gens bewirkt nämlich eine Aktivitäsverzögerung der Hefen, die in einem Teig vorliegen, der einer Temperatur ausgesetzt ist, bei der diese Hefen wieder potentiell aktiv werden. Diese Verzögerung erklärt sich nämlich daraus, daß die Hefen zunächst die für die Katabolit-Repression verantwort lichen Zucker verwerten müssen, bevor sie die Maltose verwerten können, und daß diese Zucker nicht in so großer Menge vorliegen, daß sie eine optimale Gärungsaktivität der Hefen gewährleisten.
Diese Verzögerung ist außerdem noch stärker, wenn die LTI- Hefen ein induzierbares Allel MAL, jedoch unter Katabolit- Repression, besitzen, da nämlich die Hefe außerdem die Funktionen synthetisieren muß, die in der Lage sind, die Maltose zu verwenden, nachdem sie die für die Katabolit-Repression verantwortlichen Zucker verwertet hat. Die LTI-Hefen sind deshalb noch weniger empfindlich für Temperaturänderungen oberhalb der Kühltemperaturen.
Diese Hefen können deshalb bei der Erzeugung von Backwaren verwendet werden, die nach Konservierung unter Kühlung im Ofen zu backen sind.
Die erfindungsgemäßen Industriebackhefen können in dem vorliegenden Entwicklungsverfahren erhalten werden. Diese Industriebackhefestämme von Saccharomyces cerevisiae haben so eine Wachstumsausbeute im Fed-batch-Verfahren von 0,1 bis 0,5 g Trockenbiomasse pro g Zucker, eine CO&sub2;-Erzeugung von unter 15 ml/h/kg Teig bis zu einer Temperatur von 8ºC, unter 20 ml/h/kg Teig bis zu 12ºC und eine CO&sub2;-Erzeugung unter 10 ml/g Preßhefe bis zu 18ºC nach 4 Tagen Kultur in Maltosemedium.
Die erfindungsgemäßen Hefen haben vorzugsweise eine CO&sub2;-Erzeugung von weniger als 7 ml/h/kg Teig bis zu einer Temperatur von 8ºC, insbesondere 0,1 bis 7 ml/h/kg, und weniger als 12 ml/h/kg Teig bis zu 12ºC, insbesondere 0,1 bis 12 ml/h/kg.
Man kann auch Hefestämme selektionieren, die beispielsweise eine CO&sub2;-Erzeugung von weniger als 3 ml/h/kg Teig bis zu einer Temperatur von 12ºC haben.
Ebenso kann man Hefestämme selektionieren, die eine Wachstumsausbeute im Fed-batch-Verfahren beispielsweise gleich oder größer als 0,5 g Trockenbiomasse pro g Zucker haben.
Von verschiedenen auf diese Weise erhaltenen Stämmen von Saccharomyces cerevisiae wurden zwei als Beispiele nach dem Budapester Abkommen am 28.01.1994 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9 8DG, Schottland (Großbritannien), hinterlegt, wo ihnen die Nummern NCIMB 40611 und 40612 zugeteilt wurden.
Der Stamm NCIMB 40611 hat außerdem die folgenden Merkmale:
Morphologie: elliptische Zellen von einer relativ homogenen Größe.
Fermentation: Hefen, die Saccharose, Glucose und Maltose fermentieren können.
Ebenso besitzt der Stamm NCIMB 40612 die folgenden Merkmale:
Morphologie: elliptische Zellen von einer relativ homogenen Größe.
Fermentation: Hefen, die Saccharose, Glucose und Maltose fermentieren können.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines gekühlten und verpackten Backteigs stellt man einen Teig her, indem man eine erfindungsgemäße Hefe mindestens mit Wasser und Mehl mischt und dann diesen Teig in einem Behälter verpackt, der ein Gasaustrittsventil aufweist.
Man kann so den Teig bei Kühltemperaturen mischen und dann verpacken.
Die Atmosphäre des Behälters kann auch aus einem neutralen Gas wie Stickstoff oder Kohlendioxid allein oder in Kombination bestehen. Diese Atmosphäre kann erzeugt werden, indem beispielsweise der Sauerstoff aus dem Behälter durch Unterdruck abgesaugt wird und dann neutrales Gas eingeblasen wird, bevor dieser Behälter versiegelt wird. Diese Atmosphäre gestattet insbesondere die Vermeidung einer Pilzentwicklung.
Insbesondere kann man die Hefe dem Teig auch in einer Menge von 0,1 bis 1 % in Trockenmasse der gepreßten oder rehydratisierten Hefe beimischen.
Diese Hefen können außerdem Trehalose enthalten, und man kann dem Teig 1,2 bis 2 % NACL beigeben, um die übermäßige Entwicklung der natürlichen Flora des Teigs zu vermindern.
Der erfindungsgemäße gekühlte Teig kann unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens zur Herstellung eines Teigs hergestellt und verpackt werden. Dieser Teig besitzt außerdem die charakteristische Textur und das charaktenstische Aroma eines Teigs mit derselben Zusammensetzung, der durch herkömmliche Backhefen, wie die Hefe LBB, getrieben wurde. Man kann jedoch den gekühlten Teig der vorliegenden Erfindung bevorzugen, wenn dieser während mindestens 2 oder 3 Tagen bei üblichen Kühltemperatur aufbewahrt wird. Nach 2 oder 3 Tagen Aufbewahrung des Teigs bei Kühltemperaturen erzeugen die LTI-Hefen nämlich soviel Gas im Teig, daß dieser direkt aufgeht, wenn er gebacken wird. Man vermeidet so einen Schritt des Treibens des Teigs.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung des Verfahrens zur Entwicklung von LTI-Stämmen, des Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Teigs, der in dem Entwicklungsverfahren erhaltenen LTI-Stämme und des in dem vorliegenden Herstellungsverfahren erhaltenen verpackten und gekühlten Teigs. Die Prozentsätze beziehen sich, sofern nicht anderes angegeben, auf das Gewicht.
Diesen Beispielen geht eine Beschreibung von verschiedenen Tests und der Zusammensetzung verschiedener Medien voraus.

Tests

1. CO&sub2;-Erzeugung in einem Teig:

Zur Durchführung dieses Tests stellt man einen Backteig her, der als Kulturmedium dient. Dieser Teig enthält 60,2 % Mehl, 29,2 % Wasser, 1,4 % NaCl, 7,2 % Erdnußöl und 2 % LTI-Hefen mit 15 % Trockenmasse. Alle Zutaten werden bei 4ºC aufbewahrt und man stellt den Teig zwischen 4-8ºC her.
Zu diesem Zweck stellt man zunächst eine homogene Suspension von Hefen her, indem man einige Gramm einer Suspension von LTI-Hefen mit 30 % Trockenmasse in ein Falcon-Glas von 50 ml gibt, und indem man eine entsprechende Menge Wasser beigibt, so daß man eine Suspension mit 15 % Trockenmasse erhält, und indem man dann alles rührt. Anschließend mischt man das Mehl und das Salz, gibt dann das Erdnußöl und das Wasser bei und setzt schließlich die LTI-Hefe-Suspension zu. Schließlich rührt man den Teig, bis er nicht mehr klebt, ohne ihn jedoch zu sehr zu bearbeiten. Man erhält nun einen glatten Teig. Man entnimmt nun 100 g dieses Teigs und bringt sie in einen Risograph (RDesign, USA) ein, und mißt dann sofort die CO&sub2;-Entwicklung.
Die Gasentwicklung wird zunächst bei 8ºC 120 Stunden lang jede Stunde gemessen. Dann erhöht man die Temperatur auf 12ºC und mißt die Gasentwicklung 120 Stunden lang zu jeder Stunde. Schließlich erhöht man die Temperatur auf 30ºC und mißt die Gasentwicklung 6 Stunden lang alle 10 Minuten. Die Aktivität der Hefen wird nun bestimmt, indem man die Anfangssteigung der Gasentwicklung (ml/h/kg Teig) bei jeder der Temperaturen berechnet.

2. Wachstumsfähigkeit:

Dieser Test dient dazu, Hefestämme zu selektionieren, die eine Wachstumsfähigkeit besitzen, die nahe der von Industriehefestämmen ist.
Zu diesem Zweck kultiviert man die Hefestämme in einem Medium, das einen Metabolismus induziert, der dem von durch Fed-batch-Fermentation kultivierten Stämmen ähnlich ist. Bekanntlich assimilieren die Hefen in einem gebräuchlichen Fed-batch-Verfahren die Kohlenstoffquellen durch Atmungsmetabolismus, akkumulieren kein oder wenig Ethanol und Acetat und sind außerdem in der Lage, diese sehr schnell durch Atmung wieder zu assimilieren. Man selektioniert so die Stämme, indem man sie auf einem Kulturmedium kultiviert, das von den Hefen eine Atmungsmetabolisierung der Kohlenstoffquelle (n) verlangt.
Zu diesem Zweck kultiviert man die Hefen in Erlenmeyer-Kolben (die Ablenkelemente zur Begünstigung der Belüftung des Mediums besitzen) in einem YNEA-Medium, das als Kohlenstoffquelle Ethanol und Acetat enthält. Eine geringe Menge Hefeextrakt wird beigegeben, um die gebräuchlichen Industriemedien nachzuahmen, wie ein Melasse enthaltendes Medium. Außerdem puffert man das Medium auf pH 4 mit Succinat und Chlorwasserstoffsäure, um das Vorhandensein von Acetat in Säureform zu begünstigen.
In diesem Test kultiviert man die Hefen, die man testet, in ml YPD-Medium bei 30ºC unter Rühren mit etwa 190 Drehungen pro Minute (rpm) 12 Stunden lang bei 30ºC vor. Dann beimpft man 100 ml YNE-Medium (das in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkelementen enthalten ist) mit 1 ml der Vorkultur und inkubiert 24 Stunden bei 30ºC unter Rühren (190 rpm). Schließlich beimpft man 100 ml YNEA-Medium (das in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkelementen enthalten ist) mit der vorhergehenden Kultur in einer solchen Menge, daß man eine DO&sub6;&sub0;&sub0; von nahe 0,1 erreicht, und inkubiert bei 30ºC 10 Stunden unter Rühren, wobei man die DO&sub6;&sub0;&sub0; alle 2 Stunden mißt.
Man selektioniert nun die Stämme, die die beste exponentielle Wachstumsrate aufweisen. Man wählt hierbei vorzugsweise die Stämme, deren exponentielle Wachstumsrate größer oder gleich 50 % derjenigen des Stamms LBB ist, insbesondere größer oder gleich 65 % und vor allem nahe oder gleich 100 %.

3. Ausbeute in Fed-batch-Kultur:

Man stellt eine Kultur der selektionierten Hefen unter industriellen Bedingungen der Fed-batch-Fermentation her.
Zu diesem Zweck kultiviert man zunächst die Hefen bei 30ºC unter Rühren in mehreren Behältern, die jeweils 400 ml YPD- Medium enthalten. Dann beimpft man mit 3 Litern der vorhergehenden Kulturen steril einen Fermenter von 30 Litern (Chemap, Schweiz), der 8 Liter "Vormelasse"-Medium enthält (siehe Kapitel "Medien"). Schließlich nimmt man eine Fermentation nach dem gebräuchlichen Fed-batch-Verfahren vor, indem man bei 30ºC unter zunehmendem Rühren (250-450 rpm) und zunehmender Belüftung (0,02-0,8 m³/h) 24 Stunden lang inkubiert, den pH-Wert durch Beigabe von entsprechenden Mengen NH&sub4;OH auf 4,5 hält, den erzeugten Schaum durch Beigabe von zunehmenden Mengen von Entschäumer, wie Contraspum 210, steuert (1,5 % Gew./Vol. Medium; Binggeli-Chemie, Schweiz) und regelmäßig eine entsprechende zunehmende Menge des Mediums "Melasse" bis zu einem Endvolumen von etwa 22 Liter beigibt.
Schließlich überträgt man das Produkt dieser letzten Fermentation steril in einen Fermenter von 300 Liter (Chemap, Schweiz) und nimmt wieder eine Fed-batch-Fermentation vor, indem man bei 30ºC unter zunehmendem Rühren (240-350 rpm) und zunehmender Belüftung (0,2 bis 10 m³/h) während 28 Stunden inkubiert, den pH-Wert durch Beigabe von geeigneten Mengen von NH&sub4;OH auf 4,5 hält, den erzeugten Schaum durch Beigabe von zunehmenden Mengen von Entschäumer wie Contraspum (5 % Gew./Vol.) steuert und regelmäßig eine geeignete zunehmende Menge des Mediums "Melasse" 26 Stunden lang bis zu einem Endvolumen von etwa 180 Liter beigibt.
Während der beiden letzten Stunden der Fermentation gibt man also keine Melasse mehr bei, man verringert so die Substratrückstandmenge im Medium, so daß man das Vorhandensein von Zuckern vermeidet, die das Wachstum der Hefen bei einer Kühltemperatur begünstigen würden.
Schließlich begünstigt man eben dadurch auch die Bildung von Trehalose in den Hefen. Dieser Speicherzucker ist relativ wichtig, um die Lebensfähigkeit der Hefen in einem gebräuchlichen Trocknungsverfahren zu erhöhen.
Die nachstehende Tabelle gibt die Menge "Melasse"-Medium an, die man bei den Fermentationen von 30 und 300 Liter in Abhängigkeit von der Zeit beigibt.
Man kühlt nun die Kultur des 300 Liter-Fermenters auf 12ºC, dann zentrifugiert man sie (Zentrifuge Westfalia), bis man etwa 20 % Trockenmasse erhält, und dann bringt man die Hefen, die sich im Wasser abgesetzt haben, wieder in Suspension. Man zentrifugiert anschließend diese Suspension noch einmal, indem man die Biomasse während dieser Zentrifugation mit etwa 300-400 Liter sterilem Wasser auf 100 Liter Suspension wäscht.
Man kann in dieser Phase Vitamin C zur Verringerung der Oxidation der Biomasse beigeben. Vitamin C besitzt auch den Vorteil, den pH-Wert auf 4,4 zu senken.
Schließlich zentrifugiert man die Biomasse (Zentrifuge "De Laval"), um Verunreinigungen zu beseitigen, bis man 28 % Trockenmasse erhält, und dann preßt man diese Biomasse (Presse Bücher), bis man eine Trockenmasse von 34 bis 35 % erhält. Man erhält auf diese Weise Preßhefen.
Man kann nun die Wachstumsausbeute der Hefen bestimmen. Zu diesem Zweck bestimmt man die Trockenbiomassemenge, die man bei der während der Fermentation beigegebenen Zuckermenge erhält (hauptsächlich in der Melasse vorhandene Saccharose).

4. Genetische Stabilität:

Die genetische Stabilität eines Hefestamms für eine besondere Eigenschaft, wie die LTI-Eigenschaft, ist ein entscheidender Faktor für die industrielle Benutzung eines solchen Stamms.
Zur Einschätzung dieser Stabilität sucht man Revertanten bzgl. der LTI-Eigenschaft. Zu diesem Zweck breitet man etwa 10&sup8; Zellen einer Zellenkultur im industriellen Fed-batch- Verfahren auf 10 Petri-Schalen aus, die ein YPD-Medium enthalten, inkubiert die Schalen bei 8ºC und bestimmt dann die Kolonien, die sich bei dieser Temperatur nach etwa 4 Wochen entwickeln.

5. CO&sub2;-Erzeugung unter einem Temperaturgefälle.

Man führt diesen Test in einem speziell hierzu geschaffenen Gerät aus, das einen Block mit Temperaturgefälle aufweist, der beispielsweise Kammern mit unterschiedlichen Temperaturen besitzt, in die man das untere Ende von Fermentationsgläsern einführen kann. Diese Gläser besitzen ein geschlossenes, mit einer Gradteilung versehenes oberes Ende, sowie einen an der Seite angeschlossenen Expansionskolben. Das von der Hefe erzeugte CO&sub2; sammelt sich im oberen, mit Skala versehenen Ende jedes Glases an, wobei das durch die Akkumulation des Gases bewegte Kulturmedium in den Expansionskolben eintreten kann.
Zur Durchführung dieses Tests beimpft man, 2 ml einer Kultur des zu testenden Stamms von einer Nacht auf YPD-Medium in 200 ml eines ersten Mediums, das 0,67 % einer Stickstoffbase ohne Aminosäuren, wie beispielsweise das von der Firma Difco unter dem Namen "yeast nitrogen base without amino acids" vertriebene Produkt, 0,5 % Hefeextrakt, 2 % Saccharose, 1 % Natriumsuccinat und konzentrierte Salzsäure zur Einstellung des pH auf 4,5 in einem 500 ml-Behälter enthält. Man inkubiert unter Rühren während 24 Stunden bei 30ºC.
Man trennt die Zellen ab, indem man 5 Minuten bei 20ºC unter 6000 gn zentrifugiert, und bringt sie in 200 ml eines zweiten Mediums in Suspension, das 0,67 % einer Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 0,3 % Hefeextrakt und 0,3 % Saccharose, 1 % Natriumsuccinat und konzentrierte Salzsäure zur Einstellung des pH auf 4,5 in einem 500 ml-Behälter enthält. Man inkubiert unter Rühren während 24 Stunden bei 30ºC.
Man trennt die Zellen ab, indem man 5 Minuten bei 4ºC unter 6000 gn zentrifugiert, und wäscht den erhaltenen Hefezellenrückstand zweimal mit 50 ml destilliertem Wasser.
Man suspendiert die Zellen in 10 ml destilliertem Wasser und überträgt sie in vorgewogene 15 ml-Polypropylen-Röhrchen mit Gradteilung. Man zentrifugiert sie 10 Minuten bei 4ºC unter 3000 gn. Man tropft die Röhrchen ab, wiegt die Heferückstände und bringt sie in einer Menge von 0,61 g Heferückstand, was 0,5 g Preßhefe mit einem Trockenmassegehalt von etwa 27 % entspricht, pro ml in einem dritten Me dium in Suspension, das 0,67 % Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 2 % Maltose, 1 % Natriumsuccinat und konzentrierte Salzsäure zur Einstellung des pHs auf 4,5 enthält. Man bringt 0,5 bis 0,3 ml (bei Temperaturen > 10ºC) oder 1 bis 3 ml (bei Temperaturen < 10ºC) in Fermentationsgläser der oben beschriebenen Art ein, die man zuvor jeweils mit 50 ml des dritten Mediums, d.h. des Maltosemediums, gefüllt hat und auf 4ºC gekühlt hat.
Man inkubiert die Fermentationsgläser bei den gewünschten Temperaturen in dem oben beschriebenen Temperaturgefälleblock. Man notiert die CO&sub2;-Erzeugung in gewählten Abständen, nachdem man die Gläser einige Sekunden in ein Bad mit Ultraschallrührung getaucht hat, um die im flüssigen Medium festgehaltenen CO&sub2;-Blasen freizusetzen.

Medien

Die Prozentsätze der Verbindungen sind in Gewicht/Volumen angegeben, sofern nichts anderes angegeben ist.
YPM-Agar: 1 % "Difco Bacto Yeast extract".
2 % "Difco Bacto Peptone".
2 % Maltose.
2 % "Difco Bacto Agar".
0,9 % Volumen/Volumen (viv) einer Lösung von
0,4 % (v/v) Bromkresolrot, das in reinem Ethanol gelöst ist.
YPD: 2 % "Difco Bacto Peptone".
1 % "Difco Bacto Yeast extract".
2 % Glucose.
YPD-Agar: YPD, das 2 % "Difco Bacto Peptone" enthält.
YNE: 0,67 % "Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosauren".
0,5 % "Difco Bacto Yeast extract".
1 % Na&sub2;-Succinat.
1,12 % (viv) HCl 5M.
0,7 % (v/v) Ethanol.
YNEA: YNE mit 0,3 % (v/v) Eisessig.
Vormelasse: Das Anfangsmedium der Fed-batch-Fermentation enthält das Vormelassemedium mit der folgenden Zusammensetzung:
100 kg entmineralisiertes Wasser
263 g (NH&sub4;)2HPO&sub4;
62 g MgSO&sub4;
8,6 g NaCl
7,82 g CaCl&sub2;
17 g Inositol
0,84 g Ca-Pantothenat
0,006 g Biotin
Melasse: 84,85 % sterile Melasse (Aarberg, Schweiz).
13,85 % Wasser.
1 % H2SO4.
Man nimmt die Sterilisierung der Melasse auffolgende Weise vor: man induziert die Keimung der kontaminierenden Sporen durch Wärmebehandlung bei 80ºC während 30 Minuten, man läßt bei Raumtemperatur 20 Stunden lang keimen, man sterilisiertm 2 Minuten lang bei 125ºC und trennt nach Kühlung die Ablagerungen durch zentrifugation (Zentrifuge Westfalia).

Beispiel 1

Man geht von einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae mit LTI-Eigenschaft aus, wie dem Stamm NCIMB 40613 mit dem Genotyp MATa mal3, lts500, der gemäß dem Budapester Abkommen am 28.01.94 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB98DG, Schottland (Großbritannien) hinterlegt wurde.
Man kreuzt diesen Stamm mit einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae mit einem aktiven Allel MAL, jedoch unter Katabolit-Repression und induzierbar, insbesondere mit dem Stamm NCIMB 40614 mit dem Genotyp MATa, trp5, ade7, ade1, MAL6, der am 28.01.94 nach dem Budapester Abkommen bei derselben Stelle wie oben hinterlegt wurde.
Man läßt die diploiden Hefen sporulieren, man isoliert die haploiden Sporen und dann kennzeichnet man den Paarungstyp durch herkömmliche Mittel, ihren MAL-Phänotyp durch Kultur auf YPM-Agar-Medium und ihren LTI-Phänotyp durch Kultur auf YPD-Agar-Medium bei 8ºC während 21 Tagen. Nach 21 Tagen un terscheiden sich die LTI-Kolonien durch ein geringes Wachstum verglichen mit dem des haploiden Nicht-LTI-Elternteils, d.h. des Stamms NCIMB 40614.
Etwa 25 % der haploiden Segreganten teilen die LTI- und MAL-Phänotypen und sind so selektioniert.
Dann kreuzt man die Segreganten entgegengesetzten Geschlechts miteinander und selektioniert nun diploide Stämme von prototrophen Hefen. Zu diesem Zweck testet man den MAL- Phänotyp, indem man sie auf YPM-Agar-Medium kultiviert. Etwa 50 % der diploiden Stämme teilen die LTI- und MAL-Phänotypen.
Man selektioniert auch eine LTI-Eigenschaft, indem man die Stämme dem oben beschriebenen CO&sub2;-Erzeugungstest in einem Backteig unterzieht. Etwa 100 % der diploiden Stämme haben eine CO&sub2;-Erzeugung von weniger als 15 ml/h/kg Teig bis zu 8ºC und weniger als 20 ml/h/kg Teig bis zu 12ºC. Außerdem haben 60 % der diploiden Stämme eine CO&sub2;-Erzeugung von weniger als 7 ml/h/kg Teig bis zu 8ºC und weniger als 12 ml/h/kg Teig bis zu 12ºC.
Man selektioniert auch eine Wachstumsfähigkeit im Fedbatch-Verfahren, indem man die Stämme gemäß dem oben beschriebenen Test "Wachstumsfähigkeit" kultiviert. Etwa 50 % der diploiden Stämme haben eine exponentielle Wachstumsrate, die höher als 65 % derjenigen des Vergleichstamms LBB ist. Etwa 30 % der diploiden Stämme haben eine exponentielle Wachstumsrate, die größer als 80 % derjenigen des Vergleichsstamms LBB ist. Etwa 12 % der diploiden Stämme haben eine exponentielle Wachstumsrate, die größer als 90 % derjenigen des Stamms LBB ist.
Von verschiedenen auf diese Weise erhaltenen Stämmen wurde beispielsweise der oben erwähnte Stamm NCIMB 40611 hinterlegt.
Dieser Stamm besitzt eine bemerkenswerte LTI-Eigenschaft. Wie Fig. 1 zeigt, die die in dem Test "CO&sub2;-Erzeugung in einem Teig" erhaltenen Ergebnisse veranschaulicht, ist dieser Stamm zwischen 3 und 12ºC praktisch inaktiv. Er hat nämlich eine CO&sub2;-Erzeugung von weniger als 3 ml/h/kg Teig bei einer Temperatur von 3 bis 12ºC. Man stellt auch fest, daß das CO&sub2;-Erzeugungsniveau bei 30ºC schnell ansteigt.
Außerdem zeigen die Ergebnisse, die in dem Test "CO&sub2;-Erzeugung unter einem Wärmegefälle" erhalten wurden, daß dieser Stamm nach 12 Tagen Kultur in Maltosemedium bis zu 18ºC ein Gas entwickelt.
Außerdem besitzt dieser Stamm eine exponentielle Wachstumsrate gleich 66 % derjenigen der Hefe LBB und eine Wachstumsausbeute im Fed-batch-Verfahren gemäß dem oben beschriebenen Test, die derjenigen gleichwertig ist, die auf dieselbe Weise bei dem Stamm LBB bestimmt wurde, d.h. etwa 0,5 g Trockenbiomasse pro g Zucker.
Schließlich findet man mit dem oben beschriebenen genetischen Stabilitätstest keine Revertanten. Dieser Stamm ist also besonders stabil.

Beispiel 2

Man geht von einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae mit einer LTI-Eigenschaft aus, wie dem Stamm NCIMB 40613 mit dem Genotyp MATa, mal3, lts500, der am 28.01.1994 gemäß dem Budapester Abkommen bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O.Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9BDG, Schottland (Großbritannien), hinterlegt wurde.
Man kreuzt diesen Stamm mit einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae mit einem aktiven Allel MAL, jedoch unter Katabolit-Repression und konstitutiv, insbesondere dem Stamm NCIMB 40615 mit dem Genotyp MAT a, leu2, trpl, ura3, MAL2-8c, MAL3, der am 28.01.94 nach dem Budapester Abkommen hinterlegt wurde.
Man läßt die Diploiden sporulieren, kreuzt dann die Segreganten und selektioniert Stämme auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1. Die Prozentsätze von Stämmen mit einer bestimmten LTI-Eigenschaft und einer bestimmten Wachstumsfähigkeit sind ähnlich wie die in Beispiel 1.
Von verschiedenen auf diese Weise erhaltenen Stämmen wurde als Beispiel der oben erwähnte Stamm NCIMB 40612 hinterlegt.
Wie man in Fig. 1 sehen kann, die die in dem Test "CO&sub2;-Erzeugung in einem Teig" erhaltenen Ergebnisse zeigt, ist dieser Stamm zwischen 3 und 12ºC praktisch inaktiv. Er hat nämlich eine CO&sub2;-Erzeugung von weniger als 7 ml/h/kg Teig bei einer Temperatur von 3 bis 8ºC und weniger als 12 ml/h/kg Teig bei mindestens 12ºC, und man stellt ferner fest, daß das CO&sub2;-Erzeugungsniveau bei 30ºC schnell ansteigt.
Wie man außerdem in Fig. 2 sehen kann, die die in dem Test "CO&sub2;-Erzeugung unter einem Temperaturgefälle" erhaltenen Ergebnisse darstellt, hat dieser Stamm außerdem eine CO&sub2;- Erzeugung von weniger als 10 ml/g Preßhefe zu 18ºC nach 4 Tagen Kultur in Maltosemedium. Zum Vergleich wurde dieser Test auch bei dem Bezugssatz LBB durchgeführt (siehe Fig. 3).
Außerdem hat dieser Stamm eine exponentielle Wachstumsrate gleich 90 % derjenigen der Hefe LBB und eine Wachstumsausbeute im Fed-batch-Verfahren nach dem oben beschriebenen Test, die der auf dieselbe Weise bei dem Stamm LBB bestimmten Ausbeute gleichwertig ist, und zwar 0,5 g Trockenbiomasse pro g Medium.
Schließlich findet man in dem oben beschriebenen genetischen Stabilitätstest keine Revertanten. Dieser Stamm ist also ebenfalls besonders stabil.

Beispiel 3

Man trocknet die LTI-Backhefen, um sie lange Zeit in Pulverform aufbewahren zu können, auffolgende Weise: man verwendet eine zentrifugierte und gewaschene Kultur des Stamms NCIMB 40612 mit etwa 20 % Trockenmasse. Man trocknet anschließend die Hefe auf eine gebräuchliche Weise, beispielsweise so, wie in der Patentschrift US 4358250 beschrieben wird. Man erhält auf diese Weise ein Trockenhefepulver mit 96 % Trockenmasse.
Man rehydratisiert diese Hefen anschließend folgendermaßen: man gibt 10 % Trockenhefe zu 90 % Wasser mit 30ºC, mischt dann langsam während 20 Minuten und gibt schließlich eine solche Menge Wasser mit 4ºC bei, daß man eine Hefesuspension erhält, die einen gewünschten Trockensubstanzprozentsatz hat.
Es sei bemerkt, daß die entwässerte und dann rehydratisierte Hefe ihre Gärungsaktivität vollständig beibehält.

Beispiel 4

Man stellt einen gekühlten und verpackten Backteig her, der den Preßhefestamm NCIMB 40612 enthält. Zu diesem Zweck benutzt man eine frische gepreßte Kultur der Hefe NCIMB 40612, wie oben im Test "Ausbeute in Fed-batch-Kultur" beschrieben wird.
Man mischt dann eine Menge dieser Preßhefen (die etwa 35 % Trockenmasse enthalten) mit Mehl, Wasser, Fett und Salz so, daß man einen Teig erhält, der 0,2 % in Trockenmasse Preßhefe, 60 % Mehl, 30 % Wasser, 8 % Margarine und 1,8 % NaCl enthält.
Man verpackt anschließend diesen Teig auf die in der Patentschrift EP 0158590 beschriebene Weise, jedoch mit dem Unterschied, daß das Verpackungsplastik, das luftdicht ist, ein Gasaustrittsventil besitzt, d.h. ein Ventil, das den Gasaustritt vom Inneren der Verpackung nach außen gestattet und den Lufteintritt von außen ins Innere der Verpackung sperrt. Außerdem besteht die Atmosphäre im Inneren dieser Verpackung auch aus 50 % Stickstoff und 50 % Kohlendioxid.

Beispiel 5

Man stellt einen gekühlten und verpackten Backteig her, der den Preßhefestamm NCIMB 40611 enthält. Zu diesem Zweck benutzt man eine frische gepreßte Kultur der Hefe NCIMB 40611, wie oben im Test "Ausbeute in Fed-batch-Kultur" beschrieben wurde. Eine Menge der Preßhefekultur wird nun mit Mehl, Wasser, Fett und Salz in denselben Verhältnissen wie in Beispiel 4 gemischt und dann wird der Teig auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 verpackt.

Beispiel 6

Man stellt einen gekühlten und verpackten Backteig her, der den rehydratisierten Hefestamm NCIMB 40612 enthält.
Man benutzt die Suspension von rehydratisierten Hefen NCIMB 40612 von Beispiel 3 mit 10 % Trockenmasse und stellt auf diese Weise einen Teig her, der 0,3 % in Trockenmasse rehydratisierte Hefen, 60 % Mehl, 30 % Wasser, 8 % Margarine und 1,7 % NaCl enthält. Dann verpackt man den Teig auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4.

Beispiel 7

Man verwendet den Teig von Beispiel 4, der einen Tag lang bei einer Kühltemperatur aufbewahrt wurde, und bäckt ihn dann direkt etwa 15 Minuten lang bei 220ºC.
Auf dieselbe Weise bäckt man die Teige von Beispiel 4, die jeweils unter Kühlung 7, 28 bzw. 60 Tage aufbewahrt wurden.
Zum Vergleich stellt man einen Teig her, der dieselbe Zusammensetzung wie der in Beispiel 4 beschriebene Teig hat, jedoch mit dem Unterschied, daß man anstatt der LTI-Hefen Backhefen LBB (Hirondelle, Lesaffre S.A. Frankreich) beigibt. Man läßt den Teig 45 Minuten bei Raumtemperatur gehen und bäckt ihn dann unter denselben Bedingungen wie oben.
Die drei gebackenen Teige, die 7, 28 und 60 Tage aufbewahrt wurden, haben einen Geschmack und eine Textur, die denen eines Teigs sehr nahe kommen, der durch Hefen auf die oben beschriebene herkömmliche Weise getrieben wurde.
Dagegen ist der Geschmack und die Textur des gebackenen Teigs, der einen Tag aufbewahrt wurde, etwas anders als die eines Teigs, der durch Hefen auf herkömmliche Weise getrieben wurde. Dies kann dadurch erklärt werden, daß die Hefen NCIMB 40612 während des ersten Tags der Aufbewahrung noch nicht so viel Aromen und Gas erzeugt haben, daß der Teig einem herkömmlichen Teig sehr nahe kommt.

Beispiel 8

Der Teig von Beispiel 5, der bei Kühltemperatur 2, 3, 7, 28 bzw. 60 Tage aufbewahrt wurde, wird direkt bei 220ºC etwa 15 Minuten gebacken.
Die vier gebackenen Teige, die 3, 7, 28 und 60 Tage aufbewahrt wurden, haben einen Geschmack und eine Textur, die denen eines Teigs sehr nahe kommen, der durch Hefen auf die oben beschriebene herkömmliche Weise getrieben wurde.
Der Geschmack und die Textur des gebackenen Teigs, der 2 Tage aufbewahrt wurde, sind jedoch etwas anders als die eines Teigs, der durch Hefen LBB getrieben wurde. Dies läßt sich dadurch erklären, daß die Hefen NCIMB 40611 in den beiden ersten Tagen der Aufbewahrung noch nicht so viel Aromen und Gas erzeugt haben, daß der Teig einem herkömmlichen Teig sehr nahe kommt.

Claims

1. Verfahren zur Entwicklung eines Backhefestamms, der einen LTI-Phänotyp ("Low temperature inactive") zeigt, d.h. die Eigenschaft, in einem Teig bei einer Temperatur von 14ºC oder weniger, bei der der Teig nicht gefriert, praktisch inaktiv zu sein, aber lebensfähig zu bleiben und in einem Maltosemilieu bis 18ºC praktisch inaktiv zu bleiben, in dem man zunächst einen haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae, der die Fähigkeit aufweist, bei einer Temperatur von 3 bis 10ºC, vorzugsweise über 10ºC, inaktiv zu sein, mit einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae kreuzt, der mindestens ein aktives Allel MAL, das jedoch einer Katabolit-Repression unterliegt, aufweist, und dann in einem zweiten Schritt die nach Sporulation erhaltenen Segreganten kreuzt und schließlich einen diploiden prototrophen Stamm selektioniert, der einen LTI-Phänotyp zeigt, wenn man ihn während mehrerer Tage bei Temperaturen von 3 bis 30ºC einem Test der CO&sub2;-Erzeugung in einem Backteig unterwirft, und einen aktiven MAL-Phänotyp, jedoch unter Katabolit-Repression, und eine Wachstumsfähigkeit im Fed-batch-Verfahren aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im zweiten Schritt Segreganten kreuzt, die jeweils aus einer anderen ersten Kreuzung hervorgegangen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive Allel MAL, jedoch unter Katabolit-Repression, in der Hefe konstitutiv oder induzierbar sein kann.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Feststellung der Wachstumsfähigkeit dieses zu selektionierenden haploiden Stamms im Fed-batch-Verfahren diesen in einem Kulturmedium entwickelt, das eine Atmungsmetabolisierung der Kohlenstoffquelle(n) verlangt.

5. In dem Verfahren nach Anspruch 1 herstellbarer Industriebackhefestamm von Saccharomyces cerevisiae, der eine Wachstumsausbeute im Fed-batch-Verfahren von 0,1 bis 0,5 g Trockenbiomasse pro g Zucker, eine CO&sub2;-Produktion von weniger als 15 ml/h/kg Teig bis zu 8ºC, weniger als ml/h/kg Teig bis 12ºC und weniger als 10 ml pro g Presshefe bis zu einer Temperatur von 18ºC nach 4 Tagen Kultur in Maltosemedium aufweist.

6. Stamm nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er eine exponentielle Wachstumsrate in einem Medium, das eine Atmungsmetabolisierung der Kohlenstoffquelle (n) verlangt, aufweist, die gleich oder häher als 50 % der einer keine LTI-Eigenschaft aufweisenden Industriebackhefe ist.

7. Stamm nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Wachstumsausbeute im Fed-batch-Verfahren von über 0,5 g Trockenbiomasse pro g Zucker aufweist.

8. Stamm nach den Ansprüchen 5 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß er bis 12ºC eine CO&sub2;-Produktion von weniger als 3 ml/h/kg Teig aufweist.

9. Stamm nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens ein aktives Allel MAL, jedoch unter Katabolit- Repression, besitzt.

10. Industriebackhefestamm, der aus der von den Stämmen Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40512 nach Anspruch 5 und NCIMB 40611 nach den Ansprüche 5 und 8 gebildeten Gruppe ausgewählt ist.

11. Verwendung eines Industriebackhefestamms nach einem der Ansprüche 5 bis 10 in der Herstellung von Backwaren, die nach Konservierung unter Kühlung im Ofen zu backen sind.

12. Verfahren zur Herstellung eines gekühlten und verpackten Backteigs, bei dem man einen Teig herstellt, indem man eine Hefe nach einem der Ansprüche 5 bis 10 mindestens mit Wasser und Mehl mischt und den Teig dann in einem Behälter verpackt, der ein Gasaustrittsventil aufweist.

13. Herstellungsverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den Teig bei Kühltemperaturen mischt und dann verpackt.

14. Herstellungsverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Teig unter einer Atmosphäre verpackt wird, die Stickstoff oder Kohlendioxid oder eine Mischung dieser beiden enthält.

15. Herstellungsverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hefe mit dem Teig in einer Menge von 0,1 bis 1 % in Trockenmasse Presshefe oder rehydratisierter Hefe mischt.

16. Herstellungsverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefen Trehalose enthalten.

17. Herstellungsverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Teig 1,2 bis 2 % NaCl beigibt.

18. Backteig, der mindestens Wasser, Mehl und Backhefe nach einem der Ansprüche 5 bis 10 enthält und mindestens 1 bis 2 Tage unter Kühlen konserviert ist.