FI120351B - Teollinen leivinhiivakanta, sen valmistusmenetelmä ja käyttö, sekä leivintaikina ja sen valmistusmenetelmä - Google Patents

Description

Teollinen leivinhiivakanta, sen valmistusmenetelmä ja käyttö, sekä leivintaikina ja sen valmistusmenetelmä - Industriell bakjäststam, dess framställningsförfarande och användning, samt bakdeg och dess tillverkningsförfarande 4

Keksinnön kohteena on menetelmä leivinhiivakannan valmistamiseksi, jolla on Lti (alhaisessa lämpötilassa inaktiivinen) -fenotyyppi, nimittäin ominaisuus olla käytännöllisesti katsoen inaktiivinen mutta säilyä elossa taikinassa lämpötilassa, joka on 8 pienempi tai yhtä suuri kuin 14 °C, jossa taikina ei jäädy, ja olla käytännöllisesti katsoen inaktiivinen 18 °C:een asti maltoosi-väliaineessa.

Keksinnön kohteena on myös teollinen Saccharomyces cerevisiae -leivinhiivakanta, 12 joka kyetään saamaan edellä mainitulla leivinhiivakannan valmistusmenetelmällä.

Keksinnön kohteena on lisäksi keksinnön mukaisen teollisen leivinhiivakannan käyttö tuotettaessa leipomoartikkeleita paistettavaksi uunissa jääkaappisäilytyksen jälkeen.

16

Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä jääkaappilämpötilassa säilytetyn ja pakatun leivintaikinan valmistamiseksi ja leivintaikina, joka sisältää vähintään vettä, jauhoa ja keksinnön mukaista leivinhiivaa.

20

On tunnettua, että hiivoilla kohotetun leivintaikinan maku ja rakenne ovat aivan ylivoimaiset verrattuna ominaisuuksiin taikinalla, joka on kohotettu kemiallisilla aineilla. Tunnetaan myös kaupallisia leipomoartikkeleita, kuten taikina leipärullia ja 24 croissantteja varten, jotka on tarkoitettu säilytettäväksi jääkaapissa ennen fermen-tointia ja leipomista, ja jotka siitä huolimatta sisältävät kemiallista nostatusainetta.

Niinpä julkaisussa EP 0,487,878 kuvataan hiivakantojen käyttö, joilla on Lti-ominai-28 suus, ts. ominaisuus, etteivät ne ole kovin aktiivisia jääkaappilämpötilassa mutta jäävät eloon näissä lämpötiloissa [Lti on akronyymi englanninkieliselle ilmaukselle "low-temperature inactive" (alhaisessa lämpötilassa inaktiivinen)], nostatusaineeksi leivänvalmistusartikkelien valmistukseen paistettavaksi uunissa jääkaappiolosuh-32 teissä säilytyksen jälkeen. Nämä hiivat ovat kuitenkin liian tarmokkaita, ts. vapauttavat liian paljon kaasua korkeissa jääkaappilämpötiloissa, ts. välillä 8 ja 12 °C, tai jopa 14 °C, joita tosiasiassa havaitaan usein, toisinaan pidennettynä ajanjaksoina 2 jääkaappiolosuhteissa säilytettyjen tuotteiden teollisen varastoinnin tavallisissa olosuhteissa. Tämän kiivauden voidaan katsoa johtuvan, näissä kannoissa, erityisesti MAL-alleelin läsnäolosta, joka MAL-alleeli on aktiivinen eikä katabolisen reitin repres-4 soima, mutta myös näiden kantojen Lti-luonteen riittämättömästä valinnasta. Lopuksi näitä hiivoja ei myöskään ole optimoitu vastaamaan suotuisasti kaikkiin olosuhteisiin, joita niiden teolliseen tuotantoon vaaditaan, kuten esimerkiksi hyvän kui-vattavuuskapasiteetin tai suuren kasvatussaannon.

8

Samoin julkaisuissa WO 93/01724 ja EP 0,556,905 kuvataan hiivakantojen käyttö, joilla on samanlainen ominaisuus kuin julkaisussa EP 0,487,878 kuvattu. Kuvatut kannat kuuluvat kuitenkin Lts-mutanttien luokkaan [Lts on akronyymi englannin-12 kieliselle ilmaukselle "low-temperature sensitive" ("alhaiselle lämpötilalle herkkä"); Singh et ai., 1974, Genetics 77, 651-659], joilla on usein nopea elinkykyisyyden menetys jääkaappilämpötiloissa. Lisäksi nämä hiivat sopeutuvat huonosti optimaaliseen teolliseen tuotantoon ja käyttöön. Itse asiassa ne ovat haploidisia ja auksotrofisia 16 laboratoriohiivoja, jotka tuskin voidaan kasvattaa perinteisillä teollisilla väliaineilla. Lisäksi niiden kasvupotentiaali ja niiden tuottavuus näillä väliaineilla ovat luultavasti alhaiset verrattuna kasvupotentiaaliin ja tuottavuuteen teollisella leivänvalmistus-hiivakannalla, kuten esimerkiksi kannalla "Levure de boulangerie bleue" (LBB) (sini-20 nen leivinhiiva) (Lesaffre, Ranska). Lisäksi myös näiden kantojen geneettinen stabiilisuus on luultavasti riittämätön niiden teollista tuotantoa varten. Osa tuotannolla olisi tosiaankin vaarana Lts-luonteen menettäminen. Lopuksi nämä kannat pystyvät tuskin jäämään eloon perinteisen kuivauksen jälkeen samalla tavalla kuin teollisuus-24 leipomokanta kestäisi sellaisen kuivauksen elossa.

Julkaisussa WO 93/01724 kuvataan myös tapa valmistaa pakattua ja jääkaappiläm-pötilassa pidettyä leivintaikinaa, joka sisältää nostatusaineena Lts-hiivoja. Tässä 28 menetelmässä mainittu taikina valmistetaan sekoittamalla mainitut hiivat ainakin hiivan ja veden kanssa, sitten tämä taikina lisätään astiaan ja suljetaan, sitten taikina kohotetaan mainitussa astiassa, jota pidetään jääkaappilämpötilassa. Täten saadaan paineistettu astia, joka sisältää jääkaappilämpötilassa olevaa taikinaa, jossa 32 Lts-hiivojen oletetaan olevan käytännöllisesti katsoen inaktiivisia joko ajanjakson, jossa astiaa säilytetään alhaisessa lämpötilassa.

3

Eri syistä tämä menetelmä ei kuitenkaan ole tyydyttävä. Ensiksi, astian avauksen aikana havaitaan taikinan nopea turpoaminen, joka johtuu sen paineenalennukses-ta. Epäonneksi tämä turpoaminen on sellaista, että sillä on taipumus tuhota taikinan 4 perinteisen rakenteen.

Lisäksi Lts-hiivat pystyvät luultavasti vapauttamaan liian paljon kaasua ja aromeja korkeissa jääkaappisäilytyslämpötiloissa, ts. välillä 8 ja 12 °C tai jopa 14 °C, joita 8 itse asiassa havaitaan usein jääkaapissa säilytettyjen tuotteiden teollisuusvarastoin-nin tavallisissa olosuhteissa. Siten usean viikon varastointiajan jälkeen on vaara, että astian sisäinen paine voisi todennäköisesti aiheuttaa sen räjähtämisen. Lisäksi on mahdollisena vaarana, että sekä taikinassa että astian ilmakehässä läsnä olevien 12 aromien konsentraatio on sellainen, että se saattaisi modifioida taikinan perinteisiä haju- ja organoleptisiä laatuja.

Lisäksi oletetaan, etteivät kuvatut hiivat vapauta kaasua alhaisissa jääkaappilämpöti-16 loissa, ts. enintään 8 °C, eivätkä sen vuoksi vapauta aromeja seurauksena paineen dramaattisen kasvun aiheuttaminen astian sisäpuolella. Siten näiden aromien oletetaan muodostuvan pääasiassa taikinan kohotuksen aikana, minkä jälkeen niitä muodostuu harvoja. Sen mukaisesti, koska aromit ovat luonteeltaan epästabiileja, taikina 20 voi myös menettää nopeasti organoleptiset laatunsa varastoinnin aikana.

Lopuksi hiivat aktivoituvat kovasti taikinankohotusvaiheessa, ja eräs ongelma on niiden inaktivoimisen huomioon ottaminen yksinkertaisesti alistamalla niitä sisältä-24 vän taikinan jääkaappilämpötilalle. Itse asiassa hiivoilla on tällöin hyvin aktiivinen fermentatiivinen metabolia. Näin ollen olisi edullista edistää hiivafermentoinnin aro-miominaispiirteitä taikinan koko säilytysajanjakson aikana määrättyjä konsentraatioi-ta kuitenkaan ylittämättä. Samoin olisi edullista pystyä myös poistamaan astian si-28 säisen paineen määräämät rajat.

Keksinnön kohteena on tekniikan tason haittojen voittaminen, ja siten menetelmän ehdottaminen Lti-ominaisuuden omaavan leipomohiivan teollisten kantojen kehittä-32 miseksi, ja menetelmä mainittujen hiivojen kantaa sisältävän, jääkaapissa säilytettävän leivintaikinan valmistamiseksi.

4 Tätä varten keksinnön mukaiselle menetelmälle leivinhiivakannan valmistamiseksi on tunnusomaista se, että ensiksi haploidinen Saccharomyces cerevisiae -kanta, jolla on ominaisuus olla inaktiivinen lämpötilassa 3-10 °C, edullisesti yli 10 °C, risteytetään 4 haploidisen Saccharomyces cerevisiae -kannan kanssa, jolla on ainakin yksi MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen, ja sitten toisessa vaiheessa risteytetään segregantit, jotka on saatu itiöinnin jälkeen, ja lopulta valitaan prototrofinen diploidi kanta, jolla on Lti-fenotyyppi, alistamalla se leivintaikinas-8 sa C02-tuotantotestiin useiden päivien ajan lämpötiloissa välillä 3 ja 30 °C, ja Mal-fenotyyppi, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen, ja jolla on potentiaalia puolijatkuvassa prosessissa kasvuun.

12 Keksinnön mukaiselle menetelmälle jääkaapissa säilytettävän ja pakatun leivintai-kinan valmistamiseksi on tunnusomaista se, että valmistetaan ensin mainittu taikina sekoittamalla keksinnön mukaisia hiivoja ainakin veden ja jauhojen kanssa, ja sitten tämä taikina pakataan astiaan, joka sisältää kaasunpäästöventtiilin.

16

Keksinnön mukaiselle teolliselle Saccharomyces cerevisiae —leivinhiivakannalle on ensimmäisen aspektin mukaan tunnusomaista se, mitä ilmenee patenttivaatimuksen 5 tunnusmerkkiosasta, ja toisen aspektin mukaan se, mitä ilmenee patenttivaati-20 muksen 10 tunnusmerkkiosasta.

Keksinnön mukaiselle, keksinnön mukaisen teollisen leivinhiivakannan käytölle on tunnusomaista se mitä patenttivaatimuksessa 11 on esitetty.

24

Keksinnön mukaiselle leivintaikinalle on tunnusomaista se, että sitä säilytetään ainakin 1-2 päivää jääkaappilämpötilassa.

28 Ilmauksen "MAL-alleeli" ymmärretään tarkoittavan tässä selityksessä kompleksista geeniä, joka on osa MAL-geeniperhettä, joka koodittaa kolmea funktiota, a-glukosi-daasia, permeaasia ja säätelyproteiinia. Ja ilmauksen "MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen ekspression alainen" ymmärretään tarkoittavan MAL-alleelia, jos-32 sa sen funktioiden ekspressiota estää esimerkiksi glukoosin tai sakkaroosin läsnäolo kasvatusväliaineessa (indusoituva MAL-alleeli), tai MAL-alleelia, joka ekspressoi 5 funktioitaan mutta jonka funktiot itse repressoituvat esimerkiksi glukoosin tai sakkaroosin läsnäololla kasvatusväliaineessa (konstitutiivinen MAL-alleeli).

4 Samoin ilmauksen "potentiaali kasvatukseen" ymmärretään tarkoittavan kapasiteettia kasvattaa hyvällä saannolla ja hyvällä tuottavuudella menetelmällä, jota voidaan käyttää teollisesti, erityisesti leivinhiivan perinteiseen kasvatukseen, joka tunnetaan puolijatkuvana (sokeriliuoksen hidas ja vähitellen tapahtuva lisäys suspensioon il-8 mastaen, jotta vältettäisiin alkoholin muodostuminen biomassan tuotannon aikana ja saannon maksimoimiseksi).

Lisäksi käsitteen "prototrofinen" ymmärretään tarkoittavan hiivaa, joka kehittyy kas-12 vatusväliaineella, joka käsittää vain hiili-, typpi-, fosfaatti- tai rikkilähdettä, hivenaineita ja vähäiset määrät vitamiineja. Tätä väliainetta voidaan kutsua "minimaaliseksi väliaineeksi".

16 Lisäksi ilmauksen "jääkaappilämpötila" ymmärretään tarkoittavan kaikkia lämpötiloja 12 °C tai alle, joissa taikina ei jäädy.

Lopuksi käsite "taikina" tai "leivintaikina" tarkoittaa kuvauksen loppuosassa perin-20 teistä leivintaikinaa kuten esimerkiksi pizzataikinaa, leipätaikinaa tai croissanttaiki-naa. Nämä taikinat sisältävät erityisesti esimerkiksi ainakin sopivan määrän vehnä-jauhoja, suoloja, öljyä ja vettä.

24 Siten on mahdollista kehittää merkittäviä Lti-leivinhiivoja, joilla on ominaisuutena, että ne ovat inaktiivisia mutta elävät taikinassa jääkaappilämpötiloissa, ja ovat edelleen käytännöllisesti katsoen inaktiivisia jopa korkeammissa lämpötiloissa, ts. 18 °C:seen asti.

28 Näillä leivinhiivakannoilla on myös ominaisuutena, että ne ovat teollisuuskäyttöön sopivampia. Täten näillä kannoilla on samanlainen, tai jopa samanarvoinen kasvu-saanto kuin kaupallisella teollisella kannalla, kuten LBB-hiivalla. Nämä kannat ovat 32 myös huomattavan sopivia kuivaukseen niiden säilyttämiseksi ilman että ne menettävät aktiivisuuttaan merkittävästi takaisinhydraation jälkeen. Lopuksi olisi huomat- 6 tava myös näiden hiivojen hämmästyttävä geneettinen stabiilisuus niiden Lti-omi-naispiirteeseen liittyen.

4 Lopuksi, käyttämällä mainitun taikinan valmistukseen keksinnön mukaista menetelmää vältetään kaikki astian sisäiseen paineeseen liittyvät haitat. Täten voidaan käyttää joustavampaa pakkausmateriaalia. Myös taikinan maku on parantunut seurauksena jäännösaktiivisuudesta hiivoilla, jotka kehittävät aromeja koko säilöntäajanjak-8 son ajan aiheuttamatta kuitenkaan taikinan kohoamista, ja myös varastointiajanjak-sona muodostuneiden ylimääräisten aromien pakkauksen ulkopuolelle virtaamisen tuloksena.

12 Lopuksi taikina kyllästyy varastoinnin aikana kaasulla, mikä tekee sen suoraan paistamisen mahdolliseksi, koska kaasun läsnäolo taikinassa on riittävä sen kohottamiseksi kun se paistetaan. Täten vältetään esivaihe taikinan kohottamiseksi.

16 Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi hiivakannan kehittämiseksi, jolla on Lti-ominaisuus, haploidinen Saccharomyces cerevisiae -kanta, jolla on Lti-omi-naisuus, risteytetään ensin haploidisen Saccharomyces cerevisiae -kannan kanssa, jolla on ainakin yksi MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression 20 alainen.

Tämän tekemiseksi on mahdollista valita haploidinen Saccharomyces cerevisiae -kanta, jolla on hyvä Lti-ominaisuus, ts. kapasiteetti olla inaktiivinen esimerkiksi välil-24 lä 3 ja 10 °C, edullisesti yli 10 °C:ssa.

On myös mahdollista valita Saccharomyces cerevisiae -kanta, jolla on ainakin yksi katabolisen repression alainen MAL-alleeli, joka on indusoitavissa, mikä tarkoittaa, 28 että α-glukositaadia ei ole konstitutiivisesti läsnä tässä hiivassa, jota kasvatetaan teollisessa kasvatusväliaineessa. Itse asiassa nämä väliaineet sisältävät, pääasiallisina sokereina, sokereita, jotka ovat vastuussa katabolisesta repressiosta, esimerkiksi glukoosia ja/tai sakkaroosia. Toisaalta tämä hiiva syntetisoi leivintaikinassa a-gluko-32 sidaasia käyttäen taikinan maltoosia vain jos hiiva olisi kuluttanut loppuun katabolisesta repressiosta vastuussa olevat sokerit. Siten on mahdollista valita esimerkiksi MAL2-, MAL3- tai MAL6-alleeli.

7

Lisäksi katabolisen repression alainen MAL-alleeli voi olla myös konstitutiivista, mikä tarkoittaa, että α-glukosidaasia on luonnollisesti läsnä hiivassa glukoosin tai sakkaroosin läsnäolon kasvatusvällaineessa repressoidessa sitä. Leivintaikinassa tämä 4 hiiva käyttää sitten taikinan maltoosia suoraan vain, kun hiiva on käyttänyt loppuun katabolisesta repressiosta vastuussa olevat sokerit. Täten on myös mahdollista valita esimerkiksi MAL2-8c-alleeli.

8 Sitten ensimmäisestä risteytyksestä peräisin olevat diploidiset jälkeläiset voidaan saattaa itiöimään tavanomaisella itiöintiväliaineella haploidisten segreganttien saamiseksi. Tässä vaiheessa on mahdollista tarkastaa haploidisten segreganttien Mal-ominaispiirre kasvattamalla niitä väliaineella, joka sisältää ainoana hiililähteenä mal-12 toosia, esimerkiksi YPM-agar -väliaineella (katso väliaineita koskevaa kappaletta).

On myös mahdollista tarkastaa haploidisten segreganttien Lti-ominaispiirre esimerkiksi kasvattamalla niitä YPD-agar -väliaineella (katso väliaineita koskevaa kappaletta) jääkaappilämpötilassa 8-10 °C ainakin 21 päivän ajan. Ainakin kolmen viikon 16 kuluttua Lti-koloniay, jotka jäävät eloon, mutta jotka pysyvät suhteellisen inaktiivisina, tunnistetaan näkyvän solukasvun puutteella. Tätä Iti-kandidaattien näkyvän so-lukasvun puutetta voidaan itse asiassa helposti verrata emä-ei-Lti-haploidisen kannan runsaan kasvun kanssa.

20

Sitten toisessa vaiheessa vastakkaista sukupuolta olevat segregantit risteytetään keskenään sopivalla väliaineella. Täten on mahdollista risteyttää samasta ensimmäisestä risteytyksestä saatuja segregantteja, tai eri ensimmäisestä risteytyksestä saa-24 tuja segregantteja, ts. risteymä kahdesta segregantista, joista kummallakin on vanhemmat, jotka voivat olla erit, ja joilla toinen vanhemmista voi olla sama. Täten saadaan suuri joukko diploidisia hiivakantoja, joilla on ominaispiirteiden suuri vaihtelevuus.

28

Diploidisten hiivojen prototrofinen luonne voidaan tarkistaa esimerkiksi kasvattamalla niitä minimaalisella väliaineella. Mal-fenotyyppi voidaan myös tarkistaa esimerkiksi kasvattamalla niitä YPM-agar -väliaineella. Hiivat, jotka ovat perineet vanhemmiltaan 32 yhden tai useita katabolisen repression alaisia MAL-geenejä, käyttävät täten maltoosia ja paljastetaan tällöin väliaineessa läsnä olevalla pH-indikaattorilla. Hiivojen diploidiluonne voidaan tarkastaa myös läsnäololla väliaineessa. Hiivojen diploidiluon- 8 ne voidaan tarkistaa myös esimerkiksi saattamalla ne itiöimään sopivassa väliaineessa. Lopuksi diploidikantojen Lti-ominaisuus voidaan tarkistaa esimerkiksi kasvattamalla niitä YPD-agar -väliaineella 21 päivän ajan jääkaappilämpötilassa 8 °C. Tässä 4 tapauksessa Lti-kannat kehittyvät edelleen hyvin hitaasti.

Lopuksi näiden diploidihiivakantojen joukosta valitaan prototrofinen kanta, jolla on Lti-fenotyyppi, Mal-fenotyyppi, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alai-8 sena, ja jolla on potentiaalia puolijatkuvassa prosessissa kasvatukseen.

Tässä vaiheessa voidaan sen vuoksi valita valintakriteerit, jotka ovat ankarammat ja läpi kota isem mat kuin aikaisempien vaiheiden aikana käytetyt. Täten on mahdollista 12 valita spesifinen Lti-ominaisuus esimerkiksi alistamalla kannat C02-tuottotestille lei-vintaikinassa useiden päivien aikana lämpötiloissa välillä 8 ja 14 °C.

Mainittu diploidikanta voidaan myös valita puolijatkuvatoimisessa prosessissa kasva-16 tuksen potentiaalin funktiona kehittämällä sen kasvatusväliaineessa, joka vaatii hiivoissa hiililähte(id)en respiratoorista metaboliaa.

Keksinnön mukaista kehitysmenetelmää käyttämällä on sen vuoksi mahdollista ke-20 hittää hiivakantoja, joilla on merkittävä Lti-ominaisuus. Itse asiassa MAL-geenin repressio aiheuttaa aktiivisuuden viiveen hiivoissa, jotka ovat läsnä taikinassa, joka alistetaan lämpötilalle, jossa nämä hiivat tulevat mahdollisesti jälleen aktiivisiksi. Tämä viive selitetään todellakin sillä tosiseikalla, että hiivojen on ensin käytettävä kataboli-24 sesta repressiosta vastuussa olevat sokerit ennen kuin ne voivat käyttää maltoosia, ja että näitä sokereita ei ole läsnä hiivojen optimaalisen fermentaatioaktiivisuuden varmistamiseen riittävää määrää.

28 Lisäksi tämä viive on vielä suurempi, kun Lti-hiivoilla on MAL-alleeli, joka on indusoitavissa mutta katabolisen repression alainen, koska hiivan on todellakin lisäksi syntetisoitava funktiot, jotka voivat käyttää maltoosia sen jälkeen kun hiiva on käyttänyt katabolisesta repressiosta vastuussa olevat sokerit. Nämä Lti-hiivat ovat tulok-32 sena vielä vähemmän herkkiä jääkaappilämpötiloja korkeampien lämpötilojen vaihteluille.

9 Näitä hiivoja voidaan sen vuoksi käyttää tuottamaan leipomoartikkeleita, jotka paistetaan uunissa jääkaappilämpötilassa säilytyksen jälkeen.

4 Täten on mahdollista kehittää teollisia Saccharomyces cerevisiae -leipomokantoja, joilla on puolijatkuvassa prosessissa kasvatussaanto yli 0,5 g kuivaa biomassaa/g sokeria, ja C02-tuotanto alle 7 ml/tunti/kg taikinaa jopa lämpötilaan 8 °C, alle 12 ml/tunti/kg taikinaa 12 °C:seen asti. Tällä hiivalla on myös C02-tuotanto alle 10 8 ml/g puristettua hiivaa 18 °C:seen, 4 päivän kasvatuksen jälkeen maltoosia sisältävässä viljelmässä.

On myös mahdollista valita hiivakantoja, joiden C02-tuotanto on esimerkiksi alle 3 12 ml/tunti/kg taikinaa lämpötilaan 12 °C.

Täten saaduista Saccharomyces cerevisiae -kannoista talletettiin kaksi esimerkkeinä kansainvälisen Budapestin sopimuksen mukaisesti 28. tammikuuta 1994 kansainväli-16 seen talletuslaitokseen the National Collection of industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9 8DG, Skotlanti (Yhdistynyt kuningaskunta, jossa ne saivat tulonumerot NCIMB 40611 ja 40612.

20 Kannalla NCIMB 40611 on lisäksi seuraavat ominaispiirteet: - Morfologia: suhteellisen homogeenisen kokoisia ellipsin muotoisia soluja.

- Fermentointi: hiivoja, jotka pystyvät fermentoimaan sakkaroosia, glukoosia ja maltoosia.

24

Samoin kannalla NCIMB 40612 on seuraavat ominaispiirteet: - Morfologia: suhteellisen homogeenisen kokoisia ellipsin muotoisia soluja.

- Fermentointi: hiivoja, jotka pystyvät fermentoimaan sakkaroosia, glukoosia 28 ja maltoosia.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä jääkaappilämpötilassa säilytetyn ja pakatun leivintaikinan valmistamiseksi valmistetaan taikina sekoittamalla keksinnön mukaista 32 hiivaa ainakin veden ja jauhojen kanssa, sitten tämä taikina pakataan astiaan, joka käsittää venttiilin kaasun ulos päästämiseksi.

10

Ilmakehä astiassa voi koostua myös inertistä kaasusta kuten typestä tai hiilidioksidista, yksinään tai yhdistelmänä. Tämä ilmakehä voidaan luoda esimerkiksi imemällä hapen astiasta tyhjöllä ja injisoimalla sitten inerttikaasun ennen mainitun astian sul-4 kernistä. Tämä ilmakehä tekee erityisesti sienten kehittymisen estämisen mahdolliseksi.

Erityisesti on myös mahdollista sekoittaa hiivaa taikinan kanssa määrässä 0,1-1 % 8 puristetun tai takaisin hydratoidun hiivan kuiva-aineen perusteella.

Lisäksi nämä hiivat voivat sisältää trehaloosia. Ja taikinaan voidaan lisätä 1,2-2 % NaCkää luonnollisen taikinaflooran liiallisen kehittymisen vähentämiseksi.

12

Keksinnön mukaisella jääkaappilämpötilassa säilytetyllä taikinalla on rakenne ja aromi, jotka ovat tunnusomaiset taikinalle, jolla on sama koostumus ja joka on nostatettu perinteisellä leivinhiivalla. On kuitenkin mahdollista pitää keksinnön mukaista 16 jääkaappilämpötilassa säilytettyä taikinaa parempana, kun viimeksi mainittua säilytetään 2-60 päivän ajan normaaleissa jääkaappisäilytyslämpötiloissa.

Alla olevat esimerkit esitetään kuvauksena menetelmästä Lti-kantojen kehittämisek-20 si, menetelmästä keksinnön mukaisen taikinan valmistamiseksi, kehitysmenetelmällä saaduista Lti-kannoista ja pakatusta ja jääkaappilämpötilassa säilytetystä taikinasta, joka on saatu keksinnön mukaisella menetelmällä.

24 Ellei muuta mainita, %-osuudet esitetään painon mukaan. Näitä esimerkkejä edeltää erilaisten testien ja eri väliaineiden koostumuksen kuvaus ja piirrosten lyhyt esittely.

Testit 28 1. CO 9-tuota n to taikinassa: Tämän testin suorittamiseksi valmistetaan leivintaikina, joka toimii kasvatusväliai-32 neena. Tämä taikina sisältää 60,2 % jauhoa, 29,2 % vettä, 1,4 % NaChää, 7,2 % maapähkinäöljyä ja 2 % Lti-hiivoja tasolla 15 % kuiva-ainetta. Kaikkia valmistusaineita säilytetään 4 °C:ssa, ja taikina valmistetaan lämpötilassa välillä 4-8 °C.

11 Tätä varten valmistetaan ensin homogeenista hiivasuspensiota lisäämällä muutamia grammoja Lti-hiivasuspensiota tasolla 30 % kuiva-ainetta 50-ml:n Falcon-putkeen, ja lisäämällä ekvivalentin määrän vettä, jotta saataisiin suspensio tasolla 15 % kui-4 va-ainetta, ja sekoittamalla sitten koko seosta. Seuraavaksi sekoitetaan jauhot ja suola, sitten lisätään maapähkinäöljy ja vesi, ja lopuksi lisätään Lti-hiivasuspensio. Lopuksi taikinaa sekoitetaan, kunnes se ei enää tartu, työstämättä sitä kuitenkaan liikkaa. Sitten saadaan tasaista taikinaa. Sitten poistetaan 100 g tätä taikinaa ja siir-8 retään Risograph-laitteeseen (RDesign, USA), sitten mitataan välittömästi C02-kehitys.

Kaasun kehitys mitataan ensin 8 °C:ssa joka tunti 120 tunnin ajan. Sitten lämpötila 12 kohotetaan 12 °C:seen, ja kaasun kehitys mitataan joka tunti 120 tunnin ajan. Lopuksi lämpötila kohotetaan 30 °C:seen, ja kaasun kehitys mitataan joka 10. min 6 tunnin ajan. Sitten määritetään hiivojen aktiivisuus laskemalla kullekin lämpötilalle kaasunkehityksen alkukulmakertoimen (ml/tunti/kg taikinaa).

16 2. Kasvupotentiaali: Tämän testin tarkoitus on valita hiivakannat, joilla on samanlainen kasvukapasiteetti 20 kuin teollisilla hiivakannoilla.

Tämän tekemiseksi hiivakantoja kasvatetaan väliaineessa, joka indusoi samanlaisen metabolian kuin kannoilla, joita kasvatetaan puolijatkuvatoimisessa fermentoinnissa. 24 On todellakin tunnettua, että perinteisessä puolijatkuvatoimisessa prosessissa hiivat assimiloivat hiililähteet respiratorisilla metabolisilla reiteillä, että ne akkumuloivat vähän tai eivät lainkaan etanolia tai asetaattia, ja että ne pystyvät lisäksi reassimi-loimaan ne hyvin nopeasti respiratoorisilla reiteillä. Täten kannat valitaan kasvatta-28 maila niitä kasvatusväliaineella, joka vaatii hiivoilta hiililähte(id)en respiratoorisen metabolian suorittamisen.

Tätä varten hiivoja kasvatetaan Erlenmeyer-kolveissa (jotka käsittävät väliseiniä, 32 jotka edistävät väliaineen ilmastusta) YNEA-väliaineessa, joka sisältää hiililähteenä etanolia ja asetaattia. Lisätään pieni määrä hiivauutetta tarkoituksena matkia tavallisia teollisia väliaineita, kuten väliainetta, joka sisältää melassia. Lisäksi väliaine pus 12 kuroidaan sukkinaatilla ja suolahapolla happamaan pH-arvoon 4 edistämään asetaa-tin läsnäoloa happomuodossaan.

4 Testattavia hiivoja esikasvatetaan tässä testissä 5 ml:ssa YPD-väliainetta 30 °C:ssa sekoittaen nopeudella noin 190 r/min 12 min ajan 30 °C:ssa. Sitten 100 ml:aan YNE-vällainetta (joka sisältyy 500-ml Erlenmeyer-kolviin, jossa on väliseinät) siirros-tetaan 1 ml esiviljelmää, ja inkuboidaan 24 tunnin ajan 30 °C:ssa sekoittaen (190 8 r/min). Lopuksi 100 mkaan YNEA-väliainetta (joka sisältyy 500-ml Erlenmeyer-kolviin, jossa on väliseinät) siirrostetaan edeltävää viljelmää sellainen määrä, että saavutetaan 0D600-arvo lähellä 0,1, ja inkuboidaan 30 °C:ssa sekoittaen 10 tunnin ajan, mitaten 0D600arvon joka 2. tunti.

12

Sitten valitaan kannat, joilla on paras kasvukäyrä. Täten valitaan kannat, joilla on alkukasvunopeus ainakin 65 % LBB-kannan alkukasvunopeuteen verrattuna, edullisesti lähes tai täsmälleen 100 % vertailu-LBB-kannan alku kasvu nopeudesta.

16 3. Saanto Duoliiatkuvatoimisessa kasvatuksessa:

Valittujen hiivojen kasvatus suoritetaan teollisissa puolijatkuvatoimisen fermentoin-20 nin olosuhteissa.

Tätä varten hiivoja kasvatetaan ensin 30 °C:ssa sekoittaen useissa astioissa, jotka sisältävät kukin 400 ml YPD-väliainetta. Sitten 30-1 fermenttoriin (Chemap, Sveitsi), 24 joka sisältää 8 1 "promelasses" -väliainetta (katso "Väliaineet"kappaletta), siirrostetaan steriilisti 3 l:lla edeltäviä viljelmiä. Lopuksi suoritetaan fermentointi tavanomaisella puolijatkuvatoimisella prosessilla, inkuboiden 30 °C:ssa sekoittaen (250-450 r/min) ja lisätyllä ilmastuksella (0,02-0,8 m3/tunti) 24 tunnin ajan ylläpitäen pH-28 arvon 4,5 lisäämällä riittävät määrät NH4OH:ta, kontrolloiden muodostuneen vaan-don lisäämällä kasvavat määrät vaahtoamisenestoainetta kuten Contraspum 210 (1,5 % paino/paino väliaineesta; Binggeli-Chemie, Sveitsi) ja lisäämällä säännöllisesti riittävän kasvavan määrän "melassi"-väliainetta lopulliseen tilavuuteen noin 22 1. 32

Lopuksi tämän viimeisen fermentoinnin tuote siirretään steriilisti 300-1 fermenttoriin (Chemap, Sveitsi), ja suoritetaan jälleen puolijatkuvatoiminen fermentointi inkuboi- 13 den 30 °C:ssa sekoittaen (240-350 r/min) ja lisäten ilmastusta (0,2-10 m3/tunti), 28 tunnin ajan ylläpitäen pH-arvoa 4,5 lisäämällä riittävät määrät NH40H:ta kontrolloiden tuotettua vaahtoa lisäämällä kasvavat määrät vaahtoamisenestoainetta kuten 4 Contraspum (5 % paino/tilavuus), ja lisäämällä säännöllisesti riittävän, kasvavan määrän "melassi"-väliainetta 26 tunnin ajan lopulliseen tilavuuteen noin 180 I.

Fermentoinnin viimeisten kahden tunnin ajan ei sen vuoksi lisätä enää lisää melas-8 siä; täten pienennetään väliaineessa olevien tähteiden määrää, jotta vältettäisiin sokerien läsnäolo, jotka edistävät hiivojen kasvua jääkaappilämpötilassa.

Lopuksi, täten suositaan myös trehaloosin muodostusta hiivoissa. Tämä varastointi-12 sokeri on suhteellisen tärkeää hiivojen eloonjäännin lisäämiseksi perinteisessä kui-vausprosessissa.

Seuraavassa taulukossa 1 kuvataan "melassi"-väliaineen määrää, joka lisätään ajan 16 funktiona, 30-ja 300-1 fermentoinneille.

14

Taulukko 1 30-1 puoli- 300-1 puoli- jatkuvatoiminen jatkuvatoiminen . fermentointi fermentointi 4 - - - aika melassiväliaine melassiväliaine (tuntia) (g/tunti) (g/tunti) _1_ 62,5 600_ _2_ 62,5 600_ 8 3_ 62,5 700_ _4_ 62,5 800_ _5_ 71_ 900_ 6 79 1000 12 - - - _7_ 87_ 1100_ _8_ 95_ 1200_ _9_ 102_ 1300_ 16 10_ 110 1400_ _n_ 118 1500_ _12_ 133 1600_ _13_ 147_ 1700_ 20 _14_ _162 1800_ _15_ 177 1900_ _16_ 191 2000_ _17_ 206 2100_ 24 _18_ 220 2200_ _19_ 235 2300_ _20_ 249 2400_ 21 264 2500 _22_ 279 2600_ 23_ 293 2700_ _24_ 308 2800_ 25 III 2800 32 - - - 26 III 2800_ 27 /// 0 15

Sitten 300-1 fermenttoriviljelmä jäähdytetään 12 °C:seen, sitten sitä sentrifugoidaan (Westfalia-sentrifugi), kunnes saadaan kuiva-ainepitoisuus noin 20 %, ja sitten se-dimentoituneet hiivat suspendoidaan uudelleen veteen. Sitten tätä suspensiota sent-4 rifugoidaan uudelleen pesten biomassaa sentrifugoinnin aikana noin 300-400 1:11a steriiliä vettä/100 1 suspensiota.

On mahdollista lisätä tässä vaiheessa C-vitamiinia biomassan hapettumisen vähen-8 tämiseksi. C-vitamiinilla on myös etu, että se alentaa pH-arvon 4,4:ään.

Lopuksi biomassaa sentrifugoidaan ("De Laval" -sentrifugi) epäpuhtauksien poistamiseksi, kunnes saadaan kuiva-ainepitoisuus 28 %, sitten mainittua biomassaa pu-12 ristetään (Bucherpuristin), kunnes saavutetaan kuiva-ainepitoisuus 34-35 %. Täten saadaan puristettuja hiivoja.

Sitten on mahdollista määrittää hiivojen kasvusaannon. Tätä varten määritetään 16 fermentoinnin aikana lisättyjen sokerien (pääasiassa melassissa läsnä olevan sakkaroosin) määrää kohden saatu kuivan biomassan määrä.

4. Geneettinen stabiilisuus: 20

Hiivakannan geneettinen stabiilisuus määrätyn ominaisuuden suhteen on sellainen, että Lti-ominaisuus on sellaisen kannan teollistamiselle ratkaiseva tekijä.

24 Tämän stabiilisuuden määrittämiseksi tehdään tutkimus Lti-ominaisuuden taantumisista. Tätä varten teollisen puolijatkuvatoimisen fermentoinnin soluviljelmästä siir-rostetaan noin 108 solua 10 petrimaljalle, jotka sisältävät YPD-väliainetta, maljoja inkuboidaan 8 °C:ssa, sitten määritetään koloniat, jotka kehittyvät tässä lämpötilas-28 sa noin 4 viikon jälkeen.

5. CCVtuotanto lämpötilaaradientin alla.

32 Tämä testi suoritetaan erityisesti siihen suunnitellussa laitteessa, joka käsittää läm-pötilagradienttiyksikön, jossa on kammiot vaihtelevissa lämpötiloissa, esimerkiksi, joihin fermentointiputkien alapäät voidaan sijoittaa. Näissä putkissa on suljettu ja 16 mitta-asteikollinen yläpää, samoin kuin laajennuspullo, joka haaroittuu sivulta. Hiivan tuottama C02 kertyy kunkin putken mitta-asteikolliseen yläpäähän, jolloin on mahdollista, että kaasun kertymisen syrjäyttämä kasvatusväliaine voi kulkea laajen-4 nuspulloon.

Tämän testin suorittamiseksi 2 ml tutkittavan kannan yön yli -viljelmää YPD-väli-aineella siirrostetaan 200 ml:aan ensimmäistä väliainetta, joka sisältää esimerkiksi 8 0,67 % aminohapotonta typpipohjaa, kuten tuotetta, jota yhtiö Difco myy nimellä "yest nitrogen base without amino acids" ("hiivatyppipohja ilman aminohappoja"), 0,5 % hiivauutetta, 2 % sakkaroosia, 1 % natriumsukkinaattia, ja konsentroitua suolahappoa pH:n säätämiseksi happamaan pH-arvoon 4,5, 500-ml pullossa. Inku-12 bointia suoritetaan sekoittaen 24 tunnin ajan 30 °C:ssa.

Solut erotetaan sentrifugoimalla 6000 gn:llä 20 °C:ssa 5 min ajan, ja ne suspendoi-daan 200 ml:aan toista väliainetta, joka sisältää 0,67 % aminohapotonta typpipoh-16 jaa, 0,3 % hiivauutetta ja 0,3 % sakkaroosia, 1 % natriumsukkinaattia ja konsentroitua suolahappoa pH:n säätämiseksi happamaan pH-arvoon 4,5, 500-ml pullossa. Inkubointia suoritetaan sekoittaen 24 tunnin ajan 30 °C:ssa.

20 Solut erotetaan sentrifugoimalla 6000 gn:llä 4 °C:ssa 5 min ajan, ja saatu hiivasolu-pelletti pestään kahdesti 50 ml:lla tislattua vettä.

Solut suspendoidaan 10 ml:aan tislattua vettä, ja ne siirretään mitta-asteikollisiin ja 24 esipunnittuihin 15-ml polypropyleeniputkiin. Niitä sentrifugoidaan 3000 gn:llä 4 °C:ssa 10 min ajan. Putket valutetaan kuiviin, hiivapelletit punnitaan, ja suspendoidaan ml:aa kohden määrä 0,62 g hiivapellettiä, joka vastaa 0,5 g:aa puristettua hiivaa, jonka kuiva-ainepitoisuus on noin 27 %, kolmanteen väliaineeseen, joka si-28 sältää 0,67 % aminohapotonta typpipohjaa, 2 % maltoosia, 1 % natriumsukkinaattia ja konsentroitua suolahappoa pH:n säätämiseksi happamaan pH-arvoon 4,5. 0,5-3 ml (lämpötiloilla >10 °C) tai 1-3 ml (lämpötiloilla <10 °C) lisätään edellä kuvattuihin fermentointiputkiin, jotka on kukin aikaisemmin täytetty 50 ml:lla mainittua 32 kolmatta väliainetta, ts. maltoosia sisältävää väliainetta, ja joka on jäähdytetty 4 °C:seen.

17

Fermentointiputkia inkuboidaan edellä kuvatussa lämpötilagradienttiyksikössä halutuissa lämpötiloissa. C02-tuotanto merkitään muistiin valituilla aikaväleillä sen jälkeen kun putket on laskettu muutamaksi sekunniksi ultraäänisekoitushauteeseen 4 nesteväliaineeseen jääneiden C02-kuplien vapauttamiseksi.

Väliaineet 8 Yhdisteiden %-osuudet esitetään yksikössä paino/tilavuus-%, ellei muuta mainita.

YMP-aaar: 1 % "Difco Bacto Yeast extract" -hiivauutetta 2 % "Difco Bacto Yeast extract" -hiivauutetta 12 2 % maltoosia 2 % "Difco Bacto"-agaria 0,9 % tilavuus/tilavuus 0,4-%:ista (tilavuus/tilavuus) bromikresoli-punaliuosta liuotettuna puhtaaseen etanoliin.

16 YPD: 2 % "Difco Bacto Peptone" 1 % "Difco Bacto Yeast extract" 2 % glukoosia 20 YPD-aaar: YPD, joka sisältää 2 % "Difco Bacto Peptone" -peptonia YNE: 0,67 % Difcon aminohapotonta hiivatyppipohjaa 24 0,5 % "Difco Bacto Yeast extract" 1 % Na2-sukkinaattia 1,12 % (tilavuus/tilavuus) 5 M HCI:ia 0,7 % (tilavuus/tilavuus) etanolia 28 YNEA: YNE, jossa on 0,3 % (tilavuus/tilavuus) jääetikkaa 18 "Premolasses": Alkuperäisen puolijatkuvatoimisen fermentoinnin väliaine sisältää "premolasses" -väliainetta, jolla on seuraava koostumus: 4 100 kg demineralisoitua vettä 263 g (NH4)2HP04:ää 62 g MgS04:ää 8,6 g NaCkää 7,82 g CaCI2:ta 8 17 g inositolia 0,84 g Ca-pantotenaattia 0,006 g biotiinia 12 Melassi: 84,85 % steriiliä melassia (Aarberg, Sveitsi) 13,85 % vettä 1 % H2S04:ää 16 Melassin sterilointi suoritetaan seuraavalla tavalla. Kontaminoivien itiöiden germ-inointi indusoidaan lämpökäsittelyllä 80 °C:ssa 30 min ajan, annetaan itiöidä huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan, steriloidaan 125 °C:ssa 2 min ajan, ja sitten kerrostumat erotetaan jäähtymisen jälkeen sentrifugoimalla (Westfalia-sentrifugi).

20

Piirrokset

Kuviossa 1 esitetään C02-tuotannon taso ajan funktiona 100 g:lla taikinaa, joka si-24 sältää 1 % puristettua hiivaa, 8 °C:ssa, 12 °C:ssa ja 30 °C:ssa, kannoille NCIMB 40611, 40612, ja yhtiön Hindelbank leivinhiivalle.

Kuvioissa 2 ja 3 esitetään kolmiulotteisesti C02-tuotannon taso maltoosipitoisessa 28 väliaineessa lämpötilan funktiona ja kantojen NCIMB 40612 (Kuvio 2) ja "levure de boulangerie bleue" (sininen leivinhiiva) (LBB, vertailun vuoksi, Kuvio 3) kesto.

Esimerkki 1 32 Lähtömateriaalina käytetään haploidista Saccharomyces cerevisiae -kantaa, jolla on Lti-ominaisuus, kuten kantaa 40613, jolla on MATa, mal3, Its500 -genotyyppi, ja 19 joka talletettiin kansainvälisen Budapestin sopimuksen mukaisesti 28. tammikuuta 1994 kansainväliseen talletuslaitokseen the National Collection of industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9 8DG, 4 Skotlanti (Yhdistynyt kuningaskunta).

Tämä kanta risteytetään haploidisen Saccharomyces cerevisiae -kannan kanssa, jolla on MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen ja indusoitu-8 va, erityisesti kannan NCIMB 40614, jolla on MATa, trp5, ade7, adel, MAL6 -genotyyppi, ja joka talletettiin kansainvälisen Budapestin sopimuksen mukaisesti 28. tammikuuta 1994 samaan edellä kuvattuun talletuslaitokseen.

12 Diploidiset hiivat pannaan itiöimään, haploidiset itiöt eristetään, ja niiden sukupuoli-tyyppi karakterisoidaan perinteisellä tavalla, niiden Lti-fenotyyppi kasvattamalla YPD-agar-väliaineella 8 °C:ssa, ja niiden Mal-fenotyyppi kasvattamalla YPM-agar-väliaineella. Sitten vastakkaista sukupuolta olevat segregantit risteytetään keske-16 nään. Sitten valitaan diploidiset prototrofiset hiivakannat. Myös Mal-fenotyyppi tarkastetaan kasvattamalla niitä YPM-agar -väliaineella. Ja lopuksi, valitaan Lti-omi-naisuus alistamalla kannat C02-tuotantotestille edellä kuvatussa leivintaikinassa, ja potentiaali kasvaa puolijatkuvatoimisessa prosessissa kasvattamalla niitä edellä ole-20 van "kasvupotentiaali"-testin mukaisesti. Sitten valitaan kannat, joiden alkukasvuno-peus on yli 65 % vertailu-LBB-kantaan verrattuna.

Täten saaduista eri kannoista edellä mainittu kanta NCIMB 40611 talletettiin esi-24 merkkinä.

Tällä kannalla on huomattava Lti-ominaisuus. Kuten voidaan nähdä kuviosta 1, jossa kuvataan "C02-tuotanto taikinassa" -testin tulokset, tämä kanta on käytännöllisesti 28 katsoen inaktiivinen välillä 3 ja 12 °C. Sen C02-tuotanto on todellakin alle 3 ml/tunti/kg taikinaa lämpötilassa 3-12 °C. Havaitaan myös, että C02-tuotantotaso kohoaa nopeasti 30 °C:ssa.

32 Lisäksi tulokset, jotka saatiin "C02-tuotanto lämpötilagradientin alla" -testissä, osoittavat, että tämä kanta ei vapauta lainkaan kaasua 18 °C:seen asti, 12-päiväisen maltoosipitoisella väliaineella kasvatuksen jälkeen.

20

Lisäksi tämän kannan alkukasvunopeus on 66 % LBB-hiivan alkukasvunopeudesta, ja puolijatkuvatoimisessa prosessissa kasvusaanto, aikaisemmin kuvatun testin mukaan, joka on yhtä hyvä kuin samalla tavalla LBB-kannalle määritetty, ts. 0,5 g kui-4 vaa biomassaa/g sokeria.

Lopuksi edellä kuvatun geneettinen stabiilisuus -testin mukaan ei havaittu taantuneita hiivasoluja. Täten tämä kanta on erityisen stabiili.

8

Esimerkki 2 Lähtömateriaalina käytetään haploidista Saccharomyces cerevisiae -kantaa, jolla on 12 Lti-ominaisuus, kuten kantaa 40613, jolla on MATa, mal3, Its500 -genotyyppi, ja joka talletettiin kansainvälisen Budapestin sopimuksen mukaisesti 28. tammikuuta 1994 kansainväliseen talletuslaitokseen the National Collection of industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9 8DG, 16 Skotlanti (Yhdistynyt kuningaskunta).

Tämä kanta risteytetään haploidisen Saccharomyces cerevisiae -kannan kanssa, jolla on MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen ja konstitutii-20 vinen, erityisesti kannan NCIMB 40615, jolla on MATa, Ieu2, trpl, ura2, MAL2-8c, MAL3 -genotyyppi, ja joka talletettiin kansainvälisen Budapestin sopimuksen mukaisesti 28. tammikuuta 1994.

24 Diploidiset hiivat pannaan itiöimään, sitten segregantit risteytetään ja kannat valitaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Täten saaduista eri kannoista edellä mainittu kanta NCIMB 40612 talletettiin esi-28 merkkinä.

Kuten voidaan nähdä kuviosta 1, jossa kuvataan "C02-tuotanto taikinassa" -testin tulokset, tämä kanta on käytännöllisesti katsoen inaktiivinen välillä 3 ja 12 °C. Sen 32 C02-tuotanto on todellakin alle 7 ml/tunti/kg taikinaa lämpötilassa 3-8 °C, ja alle 12 ml/tunti/kg taikinaa ainakin 12 °C:seen, ja havaitaan myös, että C02-tuotantotaso kohoaa nopeasti 30 °C:ssa.

21

Lisäksi, kuten voidaan nähdä kuviosta 2, jossa kuvataan tulokset, jotka saatiin "C02-tuotanto lämpötilagradientin alla" -testissä, tällä kannalla on, lisäksi, C02-tuotanto alle 10 ml/g puristettua hiivaa 18 °C:seen asti, 4-päiväisen, maltoosipitoisessa väli-4 aineessa kasvatuksen jälkeen. Vertailun vuoksi tämä testi suoritettiin myös vertailu-LBB-kannalle (Kuvio 3).

Lisäksi tämän kannan alkukasvunopeus on 90 % LBB-hiivan alkukasvunopeudesta, 8 ja puolijatkuvatoimisessa prosessissa kasvusaanto, aikaisemmin kuvatun testin mukaan, joka on yhtä hyvä kuin samalla tavalla LBB-kannalle määritetty, ts. 0,5 g kuivaa biomassaa/g sokeria.

12 Lopuksi edellä kuvatun geneettinen stabiilisuus -testin mukaan ei havaittu taantuneita hiivasoluja. Täten tämä kanta on erityisen stabiili.

Esimerkki 3 16

Jotta Lti-leivinhiivoja voitaisiin varastoida pitkä ajanjakso jauheen muodossa, ne kuivataan seuraavalla tavalla. Käytetään kannan NCIMB 40612 viljelmää, joka on sentrifugoitu ja pesty, ja jonka kuiva-ainepitoisuus on noin 20 %. Sitten hiiva kuiva-20 taan perinteisellä tavalla, esimerkiksi tavalla, joka kuvataan US-patenttijulkaisussa 4,358,250. Täten saadaan kuivaa hiivajauhetta, jonka kuiva-ainepitoisuus on 96 %.

Sitten nämä hiiva rehydratoidaan seuraavalla tavalla. 10 % kuivaa hiivaa lisätään 90 24 %:iin vettä 30 °C:ssa, ja sekoitetaan sitten varovasti 20 min ajan, ja lopuksi lisätään vesimäärä 4 °C:ssa, jolloin saadaan hiivasuspensio, jolla on haluttu kuiva-ainepitoisuus.

28 Voidaan havaita, että dehydratoitu ja sitten rehydratoitu hiiva säilyttää täysin fer-mentatiivisen aktiivisuutensa.

Esimerkki 4 32

Valmistetaan jääkaappilämpötilassa säilytettävää ja pakattua leivintaikinaa, joka sisältää puristettua hiivakantaa NCIMB 40612. Tätä varten käytetään puristettua, 22 tuoretta NCIMB 40612-hiivan viljelmää aikaisemmin "Saanto puolijatkuvatoimisessa kasvatuksessa" -testissä kuvatulla tavalla.

4 Näiden puristettujen hiivojen (joiden kuiva-ainepitoisuus on noin 35 %) määrä sekoitetaan sitten jauhojen, veden, rasvan ja suolan kanssa, jolloin saadaan taikinaa, joka sisältää 0,2 % puristettua hiivakuiva-ainetta, 60 % jauhoja, 30 % vettä, 8 % margariinia ja 1,8 % NaCI:ää.

8

Sitten tämä taikina pakataan samalla tavalla kuin kuvataan EP-patenttijulkaisussa 0,158,590, sillä erolla, että muovipakkaus, joka on ilmanläpäisemätön, käsittää venttiilin kaasun ulos päästämiseksi, ts. venttiilin, joka sallii kaasun ulosvirtauksen pak-12 kauksen sisäpuolelta ulkopuolelle ja joka estää ilman sisäänvirtauksen pakkauksen ulkopuolelta sisäpuolelle. Lisäksi tämän pakkauksen sisäinen ilmakehä sisältää myös 50 % typpeä ja 50 % hiilidioksidia.

16 Esimerkki 5

Valmistetaan jääkaappilämpötilassa säilytettävää ja pakattua leivintaikunaa, joka käsittää rehydratoitua hiivakantaa NCIMB 40612.

20 Käytetään esimerkin 3 rehydratoitua NCIMB 40612-hiivasuspensiota, joka sisältää 10 % kuiva-ainetta, ja valmistetaan täten taikina, joka sisältää 0,3 % rehydratoitua hiivakuiva-ainetta, 60 % jauhoja, 30 % vettä, 8 % margariinia ja 1,7 % NaCkää.

24 Sitten taikina pakataan samalla tavalla kuin esimerkissä 4.

Esimerkki 6 28 Käytetään esimerkin 4 taikinaa, jota on säilytetty jääkaappilämpötilassa 1 päivän, sitten taikinaa paistetaan suoraan 220 °C:ssa noin 15 min ajan. Samoin paistettiin samalla tavalla esimerkin 4 taikinoita, joita on säilytetty jääkaapissa 7, 28 ja 60 päivän ajan, vastaavasti.

Lopuksi valmistetaan vertailun vuoksi taikinaa, jolla on sama koostumus kuin esimerkissä 4 kuvattiin, ainoan eron ollessa, että Lti-hiivojen sijasta lisätään perinteisiä 32 23 leivinhiivoja. Taikinaa kohotetaan 45 min ajan huoneenlämpötilassa, sitten taikinaa paistetaan samoissa edellä kuvatuissa olosuhteissa.

4 Kolmella paistetulla taikinalla, joita säilytettiin 7, 28 ja 60 päivän ajan, on hyvin samanlainen maku ja rakenne kuin taikinalla, joka nostatettiin hiivoilla edellä kuvatulla perinteisellä tavalla.

8 Toisaalta paistettu taikina, jota säilytettiin 1 päivän ajan, on hieman erilainen maku ja rakenne kuin taikinalla, joka kohotettiin hiivoilla perinteisellä tavalla. Tämä voidaan selittää sillä tosiseikalla, että Lti-hiivat eivät ole ensimmäisen säilytyspäivän aikana vielä tuottaneet riittävästi aromia ja kaasua, jotta taikina olisi hyvin saman-12 laista kuin perinteinen taikina.

Claims (18)

24

1. Menetelmä leivinhiivakannan valmistamiseksi, jolla on Lti (alhaisessa lämpötilassa 4 inaktiivinen) -fenotyyppi, nimittäin ominaisuus olla käytännöllisesti katsoen inaktiivinen mutta säilyä elossa taikinassa lämpötilassa, joka on pienempi tai yhtä suuri kuin 14 °C, jossa taikina ei jäädy, ja olla käytännöllisesti katsoen inaktiivinen 18 °C:een asti maltoosi-väliaineessa, tunnettu siitä, että ensiksi haploidinen Saccharomyces 8 cerevisiae -kanta, jolla on ominaisuus olla inaktiivinen lämpötilassa 3-10 °C, edullisesti yli 10 °C, risteytetään haploidisen Saccharomyces cerevisiae -kannan kanssa, jolla on ainakin yksi MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen, ja sitten toisessa vaiheessa risteytetään segregantit, jotka on saatu itiöinnin 12 jälkeen, ja lopulta valitaan prototrofinen diploidi kanta, jolla on Lti-fenotyyppi, alistamalla se leivintaikinassa C02-tuotantotestiin useiden päivien ajan lämpötiloissa välillä 3 ja 30 °C, ja MaI-fenotyyppi, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen, ja jolla on potentiaalia puolijatkuvassa prosessissa kasvuun. 16

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisessa vaiheessa risteytetään segregantteja, jotka ovat kumpikin peräisin eri ensimmäisestä risteytyksestä. 20

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen, voi olla hiivassa konstitutiivinen tai se voidaan indusoida siinä. 24

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun valitun diploidikannan puolijatkuvatoimisessa prosessissa kasvun potentiaalin varmistamiseksi se kehitetään kasvatusväliaineessa, joka vaatii hiililähteen tai -lähteiden res- 28 piratorista metaboliaa.

5. Teollinen Saccharomyces cerevisiae -leivinhiivakanta, joka kyetään saamaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnettu siitä, että se on valittu ryh- 32 mästä, jonka muodostavat Saccharomyces cerevisiae -kannat NCIMB 40612 ja NCIMB 40611 ja, että sillä on kasvusaanto puolijatkuvatoimisessa prosessissa yli 0,5 g kuivaa biomassaa/g sokeria, C02-tuotanto alle 7 ml/tunti/kg taikinaa 8 °C:een asti, 25 alle 12 ml/tunti/kg taikinaa 12 °C:een asti, ja alle 10 ml/g puristettua hiivaa lämpötilaan 18 °C asti, 4-päiväisen, maltoosipitoisessa väliaineessa kasvatuksen jälkeen.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen kanta, tunnettu siitä, että sillä on alkukasvu- nopeus väliaineessa, joka vaatii hiililähte(id)en respiratorista metaboliaa, joka kasvunopeus on ainakin 65 % teollisen leivinhiivan, jolla ei ole Lti-ominaisuutta, kasvunopeudesta. 8

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen kanta, tunnettu siitä, että sillä on kasvusaanto puolijatkuvatoimisessa prosessissa suurempi kuin 0,5 g kuivaa biomassaa/g sokeria (sokereita). 12

8. Patenttivaatimuksen 5 tai 7 mukainen kanta, tunnettu siitä, että sen C02-tuo-tanto on alle 3 ml/tunti/kg taikinaa 12 °C:een asti.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen kanta, tunnettu siitä, että sillä on ainakin yksi MAL-alleeli, joka on aktiivinen mutta katabolisen repression alainen.

10. Teollinen leivinhiivakanta, tunnettu siitä, että se on valittu ryhmästä, jonka 20 muodostavat Saccharomyces cerevisiae -kannat NCIMB 40612, joka on patenttivaatimuksen 5 mukainen, ja NCIMB 40611, joka on patenttivaatimusten 5 ja 8 mukainen.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 5-10 mukaisen teollisen leivinhiivakannan käyttö tuotettaessa leipomoartikkeleita paistettavaksi uunissa jääkaappisäilytyksen jälkeen.

12. Menetelmä jääkaappilämpötilassa säilytetyn ja pakatun leivintaikinan valmista-28 miseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan taikinaa sekoittamalla jonkin patenttivaatimuksista 5-10 mukaista hiivaa ainakin veden ja jauhojen kanssa, sitten taikina pakataan astiaan, joka käsittää venttiilin kaasun ulos päästämiseksi.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että taikina sekoitetaan ja sitten pakataan jääkaappilämpötiloissa. 26

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että taikina pakataan ilmakehässä, joka sisältää typpeä tai hiilidioksidia tai niiden seosta.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että hiivaa sekoitetaan taikinan kanssa määrä 0,1-1 % puristetun tai rehydratoidun hiivan kuiva-ainepitoisuutena.

16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että hiivat sisältävät trehaloosia.

17. Patenttivaatimuksen 12 mukainen valmistusmenetelmä, tunnettu siitä, että 12 taikinaan lisätään 1,2-2 % NaCkia.

18. Leivintaikina, joka sisältää vähintään vettä, jauhoa ja jonkin patenttivaatimuksen 5-10 mukaista leivinhiivaa, tunnettu siitä, että sitä säilytetään ainakin 1-2 päivää 16 jääkaappilämpötilassa. 27