CN103497903B

CN103497903B - 一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法

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Publication number: CN103497903B
Application number: CN201310040752.6A
Authority: CN
Inventors: 张翠英; 肖冬光; 董建; 吴鸣月; 孙溪
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2015-11-04
Anticipated expiration: 2033-01-31
Also published as: CN103497903A

Abstract

一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法。本发明提供的酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces？cerevisiae)BT-N，保藏号为CGMCCNo7151。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，-20℃冷冻21d后细胞冷冻存活率为92.75％，相对发酵力为53.24％，与亲本菌株(冻存活率为35.36％，相对发酵力为28.46％)相比，分别增加了57.39％和24.78％。通过敲除面包酵母CICC31616中性海藻糖酶编码基因NTH1，同时选用强启动子PGK1过表达6-磷酸海藻糖合成酶编码基因TPS1来实现。选育得到的酵母菌株对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景。

Description

一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法。

背景技术：

冷冻面团技术是面包生产的一种新工艺，是将面包生产中的面团制作和烘烤两个环节相分离的过程。与传统面包制作法相比，冷冻面团法具有生产效率高、面包质量稳定、方便快捷等优点。但面团冷冻时，温度一般为18～-20℃，面团中的酵母在冷冻、冻藏和解冻过程中都会受到严重伤害，尤其是发酵后的面团经过冷冻工序后，酵母的存活率和产气能力显著下降。普通面包酵母冻存20天后，活力下降一半以上，导致解冻后的面团膨胀不足，醒发时间延长，且成品面包体积小、结构粗糙、口感差，产品质量明显下降。正是这些缺陷的存在，限制了冷冻面团技术的发展。在我国，对于冷冻面团的工艺研究较多，但有关面包酵母耐冷冻机制和菌种选育的研究较少，特别是在耐冷冻酵母产品方面还是一个空白，不仅制约了酵母工业的发展，同时也制约了冷冻面团技术在我国的推广应用。耐冷冻面包酵母的研究是冷冻面团技术在国内发展的潜力所在。

海藻糖是一种细胞在应对环境变化而合成的具有高抗性的物质，是生物体内的一种典型的应激代谢物。酵母的耐冻性与前发酵期开始时胞内海藻糖基本含量相关，海藻糖能保护细胞免受冻伤。目前普遍认为，海藻糖是面包酵母耐冷冻性的主要机制，胞内海藻糖含量越高，酵母耐冷冻能越好。增加胞内海藻糖含量是提高面包酵母耐冷冻性能的一种重要途径。

酵母海藻糖的分解代谢是在两类海藻糖酶的作用下进行的，它们是分别由ATH1基因编码的酸性海藻糖酶(Ath1)和由NTH1和NTH2基因编码的中性海藻糖酶(Nth1和Nth2)。在胞内海藻糖的分解代谢中，中性海藻糖酶Nth1起主要作用。海藻糖的合成酶比较复杂，6磷酸海藻糖合成酶(T6ps)和6磷酸海藻糖磷酸脂酶(T6pp)被认为是两个最重要的合成酶，分别由TPS1和TPS2编码，其中6磷酸海藻糖合成酶基因TPS1是催化海藻糖合成的关键基因。因此，为了提高面包酵母耐冷冻能力，可通过敲除海藻糖分解酶基因和过表达海藻糖合成酶基因提高面包酵母胞内海藻糖含量以增强细胞的耐冷冻性能。

发明内容：

本发明的目的是提供一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法。

本发明提供的酵母菌株是具有耐冷冻性能的酵母菌株，具体为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BTN。该菌株已于2013年1月18日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.7151。

所述酵母菌株具体可以通过敲除出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的中性海藻糖酶编码基因的部分或全部序列，并同时用强启动子过表达6磷酸海藻糖合成酶编码基因来实现。

本发明所提供的构建上述酵母菌株BT-N的方法是，将PCR扩增重组质粒得到的重组基因盒(是否多一个盒字？导入出发菌株酿酒酵母中通过同源重组获得重组菌。

所述的重组质粒，是能够完全敲除酿酒酵母的中性海藻糖编码基因并同时过表达6磷酸海藻糖合成酶编码基因的重组质粒pUC-TNBAK。

所述中性海藻糖编码基因为NTH1基因，所述6-磷酸海藻糖合成酶编码基因为TPS1基因。

所述重组质粒上无任何营养缺陷型筛选标记。

所述中性海藻糖编码基因NTH1的GeneID为：851564；6磷酸海藻糖合成酶编码基因TPS1的Gene ID为：852423。

所述酵母菌株在其它发酵性能不受影响的情况下，在-20℃冷冻21d后的细胞存活率为92.75％，相对发酵力为53.24％，与出发菌株(冻存活率为35.36％，相对发酵力为28.46％)相比，分别增加了57.39％和24.78％。

本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述耐冷冻酵母菌株的基因序列，该基因序列是分别用N-S/K-S和PT-X/N-X2两对引物以所述耐冷冻酵母菌株基因组为模板扩增得到的片段，其序列如序列表1和序列表2所示。

有益效果：

一是本发明选育的酵母菌株所敲除的中性海藻糖编码基因为100％缺失，不易产生回复突变，同时过表达编码6磷酸海藻糖合成酶基因是通过基因组上整合实现的，不易在菌株传代中丢失，并且重组菌株中的KanMX抗性基因已经敲除，保证了菌株及发酵产品的安全性；二是本发明选育的酵母菌株不仅部分切断海藻糖分解途径，而且提高了海藻糖合成能力，能够提高酵母胞内海藻糖含量从而增强其耐冷冻性能，而其它发酵性能没有明显变化。发明选育的酵母菌株对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景。

附图说明：

图1是重组菌株构建的技术路线图。

图2是pUC-NBAK质粒构建过程。

图3是pUC-TNBAK质粒构建过程。

图4是重组片段与基因组的重组过程。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：耐冷冻酵母菌株的选育

(1)重组菌株的构建

重组菌株的构建流程如图1所示。双倍体出发菌株CICC31616经过单倍体化生成a型和α型单倍体菌株70a和17α，通过两次同源重组的方法构建重组单倍体菌株，去除KanMX抗性基因并杂交该单倍体菌株，生成双倍体重组菌株BT-N。

重组质粒pUC-TNBAK的构建流程如图2和图3所示。通过PCR扩增技术，将NTH1基因两侧用于同源重组敲除该基因的序列NA和NB片段及来自pUG6质粒的KanMX抗性基因扩增，并以pUC19质粒为载体将这三个片段按照NA-KanMX-NB的顺序连接，得到pUC-NBAK质粒；TPS1基因与含有强启动子的pUC-PGK连接，所得到的PGK_P-TPS1-PGK_T(PT)片段与上述质粒按照NA-KanMX-PT-NB的顺序连接，构建pUC-TNBAK重组质粒。

TNBAK重组过程如图4所示。以质粒pUC-TNBAK为模板进行PCR扩增，得到NA-KanMX-PT-NB重组基因盒。通过醋酸锂转化重组基因盒转入酵母单倍体细胞，通过NA和NB片段与酵母染色体上NTH1基因两侧的同源序列同源重组，从而整合到酵母染色体上并随染色体一起复制。转化后通过G418抗性筛选重组子，KanMX-PT片段同源重组替换了酵母染色体上的NTH1基因，从而实现NTH1基因的完全敲除同时利用强启动子PGK1过表达TPS1。

利用同源重组的方法分别敲除酵母CICC31616的a型和α型单倍体菌株70a和17α的葡萄糖阻遏因子编码基因NTH1，并同时过表达6磷酸海藻糖合成酶编码基因TPS1，得到a型和α型单倍体重组菌株ΔN+TPS1a和ΔN+TPS1α。将单倍体重组菌株中的抗性基因KanMX去除，并杂交获得双倍体重组菌株BT-N。

所述出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CICC31616。

(2)基因工程菌株的特异性序列

获得的基因工程菌株BT-N染色体中含有两段特异性序列，可通过PCR扩增测序后进行菌株鉴定。

特异性片段扩增的引物序列为：

N-S：5’-ATCATCATCTGTAATCGCTTCACC-3’

K-S：5’-CCTTTTATATTTCTCTACAGGGGCG-3’

PT-X：5’-TTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGC-3’

N-X2：5’-TCAGAATGTATGTCCATGATTCGCC-3’

PCR扩增得到的两段特异性片段的DNA序列见序列表1和序列表2。

实施例2：耐冷冻酵母菌株发酵实验

(1)转化子与单倍体亲本的耐冷冻实验

将单倍体亲本70a和17α及其对应的重组单倍体同时进行液体模拟面团培养基冷冻实验，-20℃冷冻21天后，测定细胞存活率和相对发酵力，结果见表1。结果显示，亲本70a的胞内海藻糖含量为95mg/g，冻存活率为25％，相对发酵力为23.22％，其重组单倍体的胞内海藻糖含量为118mg/g，冻存活率为83.78％，相对发酵力为47.06％，即重组单倍体ΔN+TPS1a比亲本70a的胞内海藻糖含量增加了23mg/g，细胞冷冻存活率增加了58.78％，相对发酵力增加了23.86％。亲本17α的胞内海藻糖含量为155mg/g，冻存活率为44.67％，相对发酵力为35.47％；其重组单倍体的胞内海藻糖含量为171mg/g，冻存活率为99.23％，相对发酵力为63.78％，即重组单倍体ΔN+TPS1α比亲本17α的胞内海藻糖含量增加了16mg/g，细胞冷冻存活率增加了54.56％，相对发酵力增加了28.31％。由结果看出，NTH1基因完全缺失和6-磷酸海藻糖合成酶的过表达可增加酵母胞内海藻糖含量，减缓冷冻初期海藻糖的分解速率，从而提高酵母的冷冻存活率和相对发酵力。

表1单倍体菌株胞内海藻糖含量、冷冻存活率及相对发酵力

菌株	胞内海藻糖含量(mg/g)	冷冻存活率(％)	相对发酵力(％)
				70a	95	25.00	23.22

ΔN+TPS1a	118	83.78	47.06
				17α	155	44.67	35.47
ΔN+TPS1α	171	99.23	63.78

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

(2)双倍体重组菌和双倍体亲本的发酵实验

将70a的转化子ΔN+TPS1a与17α的转化子ΔN+TPS1α杂交，得到双倍体重组菌株BT-N。将双倍体重组菌株与双倍体亲本进行冷冻实验，测定细胞的冷冻存活率和相对发酵力，结果见表2。由表2可知，亲本CICC31616胞内海藻糖含量为128mg/g，冻存活率为35.36％，相对发酵力为28.46％，双倍体重组菌株BT-N的胞内海藻糖含量为147mg/g，冻存活率为92.76％，相对发酵力为53.24％，即双倍体重组菌株比双倍体亲本CICC31616的胞内海藻糖含量增加了16mg/g，细胞冷冻存活率增加了57.39％，相对发酵力增加了24.78％。

表2双倍体菌株胞内海藻糖含量、冷冻存活率及相对发酵力

菌株	胞内海藻糖含量(mg/g)	冷冻存活率(％)	相对发酵力(％)
				CICC31616	128	35.36	28.46
BT-N	147	92.75	53.24

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

Claims

1.一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株，所述菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No.7151，该菌株在-20℃冷冻21d后的细胞存活率为92.75％，相对发酵力为53.24％，胞内海藻糖含量为147mg/g。