CN110423706A - 面包酵母b-n+m及其制备方法、引物组和它们在发酵不加糖冷冻面团中的应用 - Google Patents

面包酵母b-n+m及其制备方法、引物组和它们在发酵不加糖冷冻面团中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种面包酵母B‑N+M及其制备方法、引物组和它们在发酵不加糖冷冻面团中的应用，涉及酵母技术领域。该面包酵母B‑N+M缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1，并且过表达麦芽糖酶编码基因MAL62。能够部分切断海藻糖分解途径，同时提高了海藻糖合成能力与麦芽糖代谢能力，从而提高酵母细胞内海藻糖含量，进而增强其耐冷冻性能，并且还能够提升冷冻前后的发酵性能，缓解了现有技术中存在的面包酵母在冷冻面团低温贮藏的过程中受环境胁迫，导致菌体死亡，令解冻后酵母菌的产气能力下降，面团膨胀不足，品质变劣的技术问题。

Description

面包酵母B-N+M及其制备方法、引物组和它们在发酵不加糖冷 冻面团中的应用
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，尤其是涉及一种面包酵母B-N+M及其制备方法、引物组和它们在发酵不加糖冷冻面团中的应用。
背景技术
面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称酿酒酵母或出芽酵母，属于酵母属、酿酒酵母种，面包酵母的细胞形态通常呈椭圆形或者是球形，它是一种真核单细胞微生物。酵母中含有丰富的营养物质，例如蛋白质、维生素、氨基酸等。面包酵母用于面包的发酵过程中，能利用面粉中的营养物质进行发酵，产生CO2从而使面团蓬松柔软，并产生一些醇酯等风味物质，从而使面包色香味俱全，是一种重要的微生物发酵剂和疏松剂。
冷冻面团技术将面团冷冻与产品烘焙分离，其高效、低成本的特性使其在近年来被广泛应用。然而，面团经过长期冷冻后产品的质量往往严重下滑，其原因是面包酵母在冷冻面团低温贮藏的过程中会经受脱水、冰晶、冻融等极端环境的胁迫，导致菌体大量死亡，令解冻后酵母菌的产气能力明显下降，面团膨胀不足，品质劣变。现代化的生产过程中通常采用加大酵母投入量、使用外源添加剂等方式缩短冷冻面团的发酵时间以保证冷冻面团的膨胀效果，但往往因此造成发酵风味的改变或者因添加剂用量不易控制等问题导致食品安全隐患和产品质量的不稳定。只有改善菌株的品质才能从根本上解决上述诸多问题，因此获得具有强复苏能力的耐冷冻酵母菌成为发展冷冻面团技术的关键。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株面包酵母面包酵母B-N+M，缓解了现有技术中存在的面包酵母在冷冻面团低温贮藏的过程中受环境胁迫，导致菌体死亡，令解冻后酵母菌的产气能力下降，面团膨胀不足，品质变劣的技术问题。
本发明的第二目的在于提供上述面包酵母B-N+M的制备方法，该制备方法所敲除的中性海藻糖酶编码基因100％缺失，不易产生回复突变。
本发明的第三目的在于提供用于构建上述面包酵母B-N+M的引物组，该引物组能够扩增出用于敲除中性海藻糖酶编码基因NTH1并过表达麦芽糖酶编码基因MAL62的片段，并能在酵母菌株中自发整合并进行同源重组。
本发明的第四目的在于提供上述面包酵母B-N+M，上述面包酵母B-N+M的制备方法，或用于构建上述面包酵母B-N+M的引物组在发酵不加糖冷冻面团中的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一株面包酵母B-N+M，所述面包酵母B-N+M缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1；过表达麦芽糖酶编码基因MAL62。
优选地，使用强启动子过表达麦芽糖酶编码基因MAL62；
优选地，所述强启动子包括PGK1。
优选地，出发酵母菌包括BY-14。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述面包酵母B-N+M的制备方法，该制备方法包括将基因敲除组件转化至出发酵母菌中敲除中性海藻糖酶编码基因NTH1；所述基因敲除组件含有用于和中性海藻糖酶编码基因NTH1同源重组的同源臂；所述基因敲除组件还包含使麦芽糖酶编码基因MAL62过表达的元件和麦芽糖酶编码基因MAL62；
优选地，所述使麦芽糖酶编码基因MAL62过表达的元件包括强启动子，优选包括PGK1。
优选地，所述基因敲除组件中还含有标记基因，所述制备方法还包括同源重组后去除面包酵母中标记基因的步骤；
优选地，所述标记基因包括KanMX。
优选地，所述基因敲除组件为NA-KanMX-PGK1P-MAL62-PGK1T-NB重组基因盒，NA为中性海藻糖酶编码基因NTH1的上同源臂；NB为中性海藻糖酶编码基因NTH1的下同源臂；
优选地，NA含有如SEQ ID NO.13所示序列；
优选地，NB含有如SEQ ID NO.14所示序列。
优选地，所述基因敲除组件包括若干待拼接片段，相邻位置待拼接片段首尾含有同源区段；且首个待拼接片段为中性海藻糖酶编码基因NTH1的上同源臂片段，末尾待拼接片段为中性海藻糖酶编码基因NTH1下同源臂片段，所述待拼接片段还包括用于过表达麦芽糖酶编码基因MAL62的元件片段和麦芽糖酶编码基因MAL62片段。
优选地，所述基因敲除组件包括(a1)～(a6)待拼接片段：(a1)NA片段；(a2)PGK1P片段；(a3)MAL62片段；(a4)PGK1T片段；(a5)KanMX片段；和，(a6)NB片段；所述NA片段使用具有如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列的引物扩增得到；所述PGK1P片段使用具有如SEQ ID NO.3所示序列和SEQ ID NO.4所示序列的引物扩增得到；所述MAL62片段使用具有如SEQ ID NO.5所示序列和SEQ ID NO.6所示序列的引物扩增得到；所述PGK1T片段使用具有如SEQ ID NO.7所示序列和SEQ ID NO.8所示序列的引物扩增得到；所述KanMX片段使用具有如SEQ ID NO.9所示序列和SEQ ID NO.10所示序列的引物扩增得到；所述NB片段使用具有如SEQ ID NO.11所示序列和SEQ ID NO.12所示序列的引物扩增得到；
优选地，NA片段含有如SEQ ID NO.13所示序列；
优选地，NB片段含有如SEQ ID NO.14所示序列。
优选地，出发酵母菌包括BY-14。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了用于构建上述面包酵母B-N+M的引物组，所述引物组包括如下引物对：用于扩增NA片段的引物对，具有如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列；用于扩增PGK1P片段的引物对，具有如SEQ ID NO.3所示序列和SEQ ID NO.4所示序列；用于扩增MAL62片段的引物对，具有如SEQ ID NO.5所示序列和SEQID NO.6所示序列；用于扩增PGK1T片段的引物对，具有如SEQ ID NO.7所示序列和SEQ IDNO.8所示序列；用于扩增KanMX片段的引物对，具有如SEQ ID NO.9所示序列和SEQ IDNO.10所示序列；用于扩增NB片段的引物对，具有如SEQ ID NO.11所示序列和SEQ ID NO.12所示序列。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述面包酵母B-N+M，上述制备方法，或上述引物组，在发酵不加糖冷冻面团中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的面包酵母B-N+M，通过缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1，部分切断海藻糖分解途径；通过过表达麦芽糖酶编码基因MAL62，提高海藻糖合成能力与麦芽糖代谢能力，以此提高酵母细胞内海藻糖含量，增强其耐冷冻性能，并且还能够提升冷冻前后的发酵性能。本发明提供的面包酵母B-N+M对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景。
本发明还提供了上述面包酵母B-N+M的制备方法，该制备方法采用同源重组的方法缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1同时过表达麦芽糖酶编码基因MAL62。本发明提供的面包酵母B-N+M的制备方法所敲除的中性海藻糖酶编码基因NTH1 100％缺失，不易产生回复突变。
本发明提供的用于构建上述面包酵母B-N+M的引物组能够扩增出用于敲除中性海藻糖酶编码基因NTH1并过表达麦芽糖酶编码基因MAL62的片段，并能在酵母菌株中自发整合并进行同源重组。
本发明提供的上述面包酵母B-N+M，能够发酵不加糖冷冻面团，缓解了解冻后酵母菌的产气能力明显下降，面团膨胀不足，品质劣变的问题。本发明提供的面包酵母B-N+M的制备方法以及引物组，和上述面包酵母B-N+M基于相同的发明构思，因此应用于发酵不加糖冷冻面团中时能达到相同的技术效果，因此本发明提供的上述面包酵母B-N+M，上述面包酵母B-N+M的制备方法，或用于构建上述面包酵母B-N+M的引物组能够应用于发酵不加糖冷冻面团。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的重组面包酵母B-N+M-1的制备方法的流程；
图2为本发明实施例1提供的重组质粒pUC-NKABM的构建流程；
图3为本发明NA-KanMX-PGK1P-MAL62-PGK1T-NB重组基因盒与面包酵母出发菌株基因组的重组过程；
图4为本发明实施例1中质粒pUC-NKABM验证结果；
图5为本发明实施例1中转化子B-N+M-1基因组验证结果；
图6为本发明实施例1和实施例2中重组酵母菌中的KanMX抗性基因敲除验证结果；
图7为本发明实施例2中转化子B-N+M-2基因组验证结果；
图8为本发明实施例1中酵母菌株B-N+M-1的NTH1基因缺失的稳定性验证结果；
图9为本发明实施例2中酵母菌株B-N+M-2的NTH1基因缺失的稳定性验证结果；
图10为Cre/loxp重组系统的重组模式示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一株面包酵母，所述面包酵母缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1，并且过表达麦芽糖酶编码基因MAL62，本发明将缺失NTH1基因同时过表达MAL62基因的面包酵母命名为面包酵母B-N+M。本发明提供的面包酵母B-N+M不仅部分切断海藻糖分解途径，而且同时提高了海藻糖合成能力与麦芽糖代谢能力，因此能够提高酵母细胞内海藻糖含量进而增强其耐冷冻性能，并且还能够提升冷冻前后的发酵性能。本发明提供的面包酵母B-N+M对发酵设备及条件没有特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景。
酵母的耐冷冻能力与细胞内海藻糖、热休克蛋白等物质的含量以及细胞膜脂肪酸组成的比例、水通道蛋白和某些金属离子的动态平衡相关，其中胞内海藻糖对面包酵母抵御冷冻胁迫起着非常重要的作用。酵母海藻糖的分解代谢是在两类海藻糖酶的作用下进行的，它们是分别由ATH1基因编码的酸性海藻糖酶(Ath1)和由NTH1基因和NTH2基因编码的中性海藻糖酶(Nth1和Nth2)。在胞内海藻糖的分解代谢中，中性海藻糖酶Nth1起主要作用。
不加糖面团中，含量最为丰富的可发酵糖是麦芽糖，因此对麦芽糖的代谢能力影响着酵母的产气速度及发酵能力。酵母利用麦芽糖需要三类基因产物：①麦芽糖通透酶(由MALxT基因编码)、②麦芽糖酶(由MALxS基因编码)、③正调节蛋白(由MALxR基因编码)。x代表五个等效异位的MAL基因座之中的一个，每个MAL基因座均包括自身的麦芽糖通透酶、麦芽糖酶与正调节蛋白。在麦芽糖代谢过程中，酵母菌的麦芽糖通透酶将胞外的麦芽糖运输至胞内，并通过胞内的麦芽糖酶将其水解为2分子葡萄糖进入糖酵解途径并产生二氧化碳。麦芽糖酶是麦芽糖代谢的关键酶，过表达编码麦芽糖酶的MAL62基因能够增加胞内海藻糖积累量，并明显提升对冷冻环境的耐受能力。
因此，缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1和过表达麦芽糖酶编码基因MAL62能够提高面包酵母胞内海藻糖含量和麦芽糖代谢能力，从而提高了面包酵母在不加糖面团中的发酵力以及在冷冻面团中的耐冷冻能力，以获得适合不加糖冷冻面团的快速发酵面包酵母B-N+M。
在一些可选的实施方式中，缺失的中性海藻糖酶编码基因NTH1的GeneID为：851564。在一些可选的实施方式中，过表达的麦芽糖酶编码基因MAL62的Gene ID为：171888。
在一些可选的实施方式中，通过在麦芽糖酶编码基因MAL62上游插入强启动子，使麦芽糖酶编码基因MAL62过表达，强启动子(strong promoter)与RNA多聚酶有很高亲和力的启动子，能导致大量mRNA的产生。所述强启动子例如可以为但不限于为PGK1启动子或ADH启动子或，优选使用强启动子PGK1过表达MAL62基因，PGK1为磷酸甘油酸酯激酶基因来源的哺乳动物启动子，能显著提高外源基因在酵母中的表达。
需要说明的是，本发明不限制面包酵母B-N+M的出发菌株，本领域可接受的酵母菌株均可以通过缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1和过表达麦芽糖酶编码基因MAL62得到所述面包酵母B-N+M。在一些优选的实施方式中，出发酵母菌包括BY-14，BY-14是一株高效代谢麦芽糖的酵母突变菌株，保藏于天津科技大学天津市工业微生物重点实验室菌种保藏中心保藏(公众如有需要可以通过该菌种保藏中心获得)，无营养缺陷标记。
本发明还提供了上述面包酵母B-N+M的制备方法，本发明采用同源重组的方法缺失NTH1基因同时过表达MAL62基因。同源重组(Homologous Recombination)是指在两个DNA分子同源序列间进行的单链或双链片段的交换。同源重组不需要特异DNA序列，只要两条DNA序列相同或者基本相同，即可发生重组。
本发明提供的制备方法包括将基因敲除组件转化至出发酵母菌中敲除中性海藻糖酶编码基因NTH1；该基因敲除组件含有用于和NTH1基因同源重组的同源臂，同源重组的发生依赖于基因敲除组件与目的片段间存在一定的DNA序列同源片段，该同源片段即为基因敲除组件上的同源臂，因此该基因敲除组件含有和NTH1基因同源的同源臂，将该基因敲除组件转化至出发酵母菌中，利用同源重组敲除出发菌株中的NTH1基因。本发明提供的面包酵母B-N+M的制备方法所敲除的NTH1基因为100％缺失，不易产生回复突变。
所述基因敲除组件还包含使MAL62基因过表达的元件和MAL62基因，所述使MAL62基因过表达的元件可选的包括强启动子和/或增强子，以使同源重组后的MAL62基因过表达。可选地，所述元件包括强启动子，可以导致MAL62的转录水平提高，产生大量mRNA；可选地，所述元件包括增强子，增强子是指能够使基因转录频率明显增加的DNA序列，也可以提高MAL62的转录水平。可选地，可以在MAL62基因上游同时设置强启动子和增强子，以使MAL62基因的转录水平提高。
在一些优选的实施方式中，所述基因敲除组件中还含有标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选阳性重组面包酵母菌株。所述标记基因包括但不限于为具有卡那霉素抗性和G148抗性的新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ)基因，具有链霉素抗性可壮观霉素抗性的氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)基因，具有氯霉素抗性的氯霉素乙酰转移酶(cat)基因，或具有G418抗性标记的KanMX基因；优选使用G418抗性标记的KanMX基因。
在一些可选的实施方式中，将基因敲除组件采用醋酸锂转化法转化至出发酵母菌中，醋酸锂转化法是利用碱性Li+改变细胞膜的通透性，能够促使面包酵母形成感受态以易于吸收外源的DNA。
当目的基因转化至面包酵母后，标记基因滞留在面包酵母中并持久表达会给面包酵母的生长和增殖带来负担，还可能影响基因的表达以及基因的重排，因此在一些优选的实施方式中，所述制备方法还包括去除转化后的酵母菌株中标记基因的步骤，以保证面包酵母B-N+M及发酵产品的安全性。可以理解的是，可以选择本领域常使用的提出选择基因的方法，优选使用Cre/Loxp系统剔除KanMX基因。
Cre重组酶基因，最早来源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，是一种位点特异性重组酶，它能识别34bp部分回文的loxp序列(由2个13bp的反向重复序列和8bp非对称序列组成)，并根据loxp序列的排列方向的不同产生不同的重组或删除的结果。当两个loxp序列反向时，Cre酶的表达使其间的序列颠倒；两个loxp序列同向时，Cre酶的表达使loxp间的序列被切下成为游离态，并且两种反应都可逆，处于一种平衡状态；当两个loxp位点位于不同染色体上时，发生DNA链的交换或染色体易位。Cre/loxp重组系统的重组模式如图10所示。抗性基因KamMX为标记基因，其两侧带有2个同向的loxp序列，进行一次转化，再将含有Cre重组酶基因和zeocin标记基因的pGAPza载体二次转化，在半乳糖诱导下Cre基因表达重组酶蛋白时，成功删除标记基因KanMX。
在一些可选的实施方式中，所述基因敲除组件为NA-KanMX-PGK1P-MAL62-PGK1T-NB重组基因盒，其中NA为NTH1基因的上同源臂，优选含有如SEQ ID NO.13所示序列；NB为NTH1基因的下同源臂，优选含有如SEQ ID NO.14所示序列；KanMX为标记基因，PGK1P为强启动子，PGK1T为终止子，MAL62为麦芽糖酶编码基因。NA-KanMX-PGK1P-MAL62-PGK1T-NB重组基因盒可以用常规的方法获得，对重组基因盒的获得方法不做限定，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。也可用本领域已知的其它方法来构建基因突变的酵母菌。在一个具体的实施例中，可以按照下述方法构建：将MAL62基因与含有强启动子的pPGK1质粒连接，构建pPGKM质粒，得到PGK1P-MAL62-PGK1T(PGKM)片段；将NTH1基因两侧用于同源重组敲除该基因的序列NA和NB片段及来自载体的KanMX抗性基因扩增，并将这三个片段按照NA-KanMX-NB的顺序连接，得到含有NKAB的质粒；将重组质粒pPGKM中PGK1P-MAL62-PGK1T(PGKM)片段与pUC-NKAB质粒顺序连接，构建含有NKABM的重组质粒；以含有NKABM的重组质粒为模板进行PCR扩增，得到NA-KanMX-PGKM-NB重组基因盒；其中PGK1强启动子的质粒优选pUC质粒，带有KanMX抗性的载体优选Yep352载体。
在一些优选的实施方式中，所述基因敲除组件包括若干待拼接片段，相邻位置待拼接片段首尾含有同源区段；且首个待拼接片段为NTH1基因的上同源臂片段，末尾待拼接片段为NTH1基因下同源臂片段，所述待拼接片段还包括用于过表达MAL62基因的元件片段和MAL62基因片段；将所述若干带拼接片段转化至出发面包酵母，所述若干待拼接片段通过所述同源区段自发重叠连接，并通过为首的NTH1基因的上同源臂片段和NTH1基因下同源臂片段与出发面包酵母菌同源重组，将NTH1基因敲除，并将用于过表达MAL62基因的元件片段和MAL62基因片段整合至出发面包酵母菌株中。
采用直接将若干待拼接片段直接转化至面包酵母的方法，一次实验可以得到多片段在面包酵母中重组的结果，用时短，理想条件下最多一周，成功率可达90％以上。而采用传统的质粒方法构建同源重组片段，质粒每连接一个片段需要一个月时间，多个片段至少半年，而且大片段从质粒上拷贝下来后，极难导入酵母。
融合PCR技术采用具有互补末端的引物，能够形成具有重叠链的PCR产物，因此在一些优选的实施方式中，通过采用具有互补末端的引物扩增得到首尾含有同源区段的待拼接片段，可以省去构建同源重组载体，传统的同源重组载体的构建以限制性内切酶和DNA连接酶为基础通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来，比较费时费力。采用融合PCR技术构建首尾含有同源区段的待拼接片段，将所述若干待拼接片段转化至出发面包酵母使其自发重叠连接，可以简化实验步骤，提高实验效率。
在一个优选的实施例中，所述基因敲除组件包括待拼接片段(a1)～(a6)：(a1)NA片段；(a2)PGK1P片段；(a3)MAL62片段；(a4)PGK1T片段；(a5)KanMX片段；和，(a6)NB片段。其中NA片段优选含有如SEQ ID NO.13所示序列；NB片段优选含有如SEQ ID NO.14所示序列。
待拼接片段(a1)～(a6)分别通过如下表所示的引物扩增得到。
表1待拼接片段扩增引物
其中扩增NA片段的下游引物(SEQ ID NO.2)和扩增PGK1P片段的上游引物(SEQ IDNO.3)含有互补末端，使扩增后NA的3’端和PGK1P的5’端含有同源区段；相应的，扩增PGK1P片段的下游引物(SEQ ID NO.4)和扩增MAL62片段的上游引物(SEQ ID NO.5)含有互补末端，使扩增后PGK1P的3’端和MAL62的5’端含有同源区段；扩增MAL62片段的下游引物(SEQ IDNO.6)和扩增PGK1T片段的上游引物(SEQ ID NO.7)含有互补末端，使扩增后MAL62的3’端和PGK1T的5’端含有同源区段；扩增PGK1T片段的下游引物(SEQ ID NO.8)和扩增KanMX片段的上游引物(SEQ ID NO.9)含有互补末端，使扩增后PGK1T的3’端和KanMX的5’端含有同源区段；扩增KanMX片段的下游引物(SEQ ID NO.10)和扩增NB片段的上游引物(SEQ ID NO.11)含有互补末端，使扩增后KanMX的3’端和NB的5’端含有同源区段。
本发明还提供了用于构建上述面包酵母的引物组，该引物组包括如下引物对；用于扩增NA片段的引物对，具有如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列；用于扩增PGK1P片段的引物对，具有如SEQ ID NO.3所示序列和SEQ ID NO.4所示序列；用于扩增MAL62片段的引物对，具有如SEQ ID NO.5所示序列和SEQ ID NO.6所示序列；用于扩增PGK1T片段的引物对，具有如SEQ ID NO.7所示序列和SEQ ID NO.8所示序列；用于扩增KanMX片段的引物对，具有如SEQ ID NO.9所示序列和SEQ ID NO.10所示序列；用于扩增NB片段的引物对，具有如SEQ ID NO.11所示序列和SEQ ID NO.12所示序列。
使用上述引物能够成功构建出相邻位置待拼接片段首尾含有同源区段的待拼接片段(a1)～(a6)：(a1)NA片段；(a2)PGK1P片段；(a3)MAL62片段；(a4)PGK1T片段；(a5)KanMX片段；和，(a6)NB片段。将上述待拼接片段(a1)～(a6)转化至面包酵母中，待拼接片段(a1)～(a6)通过所述同源区段自发重叠连接，并通过上同源臂片段：NA片段，和下同源臂片段：NB片段与出发面包酵母菌同源重组，将NTH1基因敲除，并将PGK1P片段、MAL62片段、PGK1T片段和KanMX片段整合至出发面包酵母菌株中，使整合后面包酵母菌株带有用于筛选阳性菌株的标记基因和高表达MAL62基因。
本发明还提供了上述面包酵母B-N+M，上述制备方法或上述引物组在发酵不加糖冷冻面团中的应用。本发明提供的面包酵母B-N+M缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1，能够部分切断海藻糖分解途径，因此能够提高酵母胞内海藻糖含量，从而提供了面包酵母的耐冷冻的能力。过表达MAL62基因提高了海藻糖合成能力与麦芽糖代谢能力，因此提升了面包酵母冷冻后的发酵性能。本发明提供的面包酵母B-N+M能够发酵不加糖冷冻面团，缓解了解冻后酵母菌的产气能力明显下降，面团膨胀不足，品质劣变的问题。本发明提供的面包酵母B-N+M的制备方法以及引物组，和上述面包酵母B-N+M基于相同的发明构思，因此应用于发酵不加糖冷冻面团中时能达到相同的技术效果，在此不再赘述。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1发酵面包酵母工程菌的构建
本实施例提供了一株面包酵母，命名为面包酵母B-N+M-1，该面包酵母B-N+M-1缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1，并且过表达麦芽糖酶编码基因MAL62。双倍体BY-14经过单倍体化生成单倍体菌株70a和17α，通过两次同源重组的方法构建基因工程单倍体菌株，去除KanMX抗性基因并杂交该单倍体菌株，生成双倍体基因工程菌株B-N+M-1，构建流程如图1所示。
重组质粒pPGKM的构建流程如图2所示。MAL62基因与含有强启动子的pPGK1质粒连接，构建pPGKM质粒。得到PGK1P-MAL62-PGK1T(PGKM)片段，NKABM重组过程如图2所示。通过PCR扩增技术，将NTH1基因两侧用于同源重组敲除该基因的序列NA和NB片段及来自pUG6质粒的KanMX抗性基因扩增，并以pUC19质粒为载体将这三个片段按照NA-KanMX-NB的顺序连接，得到pUC-NKAB质粒；将重组质粒pPGKM中PGK1P-MAL62-PGK1T(PGKM)片段与pUC-NBAK质粒顺序连接，构建pUC-NKABM重组质粒，以质粒pUC-NKABM为模板进行PCR扩增，得到NA-KanMX-PGKM-NB重组基因盒，NA-KanMX-PGK1P-MAL62-PGK1T-NB重组基因盒与面包酵母出发菌株基因组的重组过程如图3所示。各目的基因的PCR扩增体系及程序如表2所示：
表2
*表示退火温度按照所用引物的最适Tm值确定；退火时间按照扩增产物的大小确定。
扩增个片段的引物如表3所示：
表3实施例1中使用的扩增引物
引物序列 引物序列(5＇→3＇) 序列
Nth1-up TGATCCCGAAACAGGCTTATC SEQ ID NO.15
Nth1-down ACCCCGACTCGTCATCC SEQ ID NO.16
NA-U CCGGAATTCCGTCTTCTTCCATTGTCTT SEQ ID NO.17
NB-D ACATGCATGCCTAGGTTATCTATGCTGTCT SEQ ID NO.18
N-S ATCATCATCTGTAATCGCTTCACC SEQ ID NO.19
N-X TACAGCGGTAAAGTTTCTATGAGCA SEQ ID NO.20
PGK-up GGAAAGCTTAAGCTTTCTAACTGATCTATCCAAAACTGA SEQ ID NO.21
PGK-down GGAAAGCTTAAGCTTTAACGAACGCAGAATTTTC SEQ ID NO.22
验证构建pUC-NKABM重组质粒，结果如图4所示，其中泳道1：引物PGK-up与PGK-down扩增pUC-PGKM质粒得到的PGK1P+MAL62+PGK1T片段(3535bp)；泳道2：引物PGK-up与PGK-down扩增pUC-NKABM质粒得到的PGK1P+MAL62+PGK1T片段(3535bp)；泳道3：引物NA-U与NB-D扩增pUC-NKAB质粒得到的NA-KanMX-NB片段(2874bp)；泳道4：引物NA-U与NB-D扩增pUC-NKABM质粒得到的NA-KanMX-(PGK1P+MAL62+PGK1T)-NB片段(6374bp)；泳道5：线性化pUC-NKABM质粒(9060bp)；泳道6：线性化pUC-NKAB质粒(5560bp)；泳道M1；DL5000 marker泳道M2：1kb marker。
转化NA-KanMX-PGKM-NB重组基因盒后，得到的转化子B-N+M-1基因组验证结果如图5所示，其中，泳道1：以亲本BY14a基因组为模板，引物Nth1-up与Nth1-down扩增结果；泳道2：以突变株B-N+M-1基因组为模板，引物Nth1-up与Nth1-down扩增结果；泳道3：以亲本BY14a基因组为模板，引物PGK-up与PGK-down扩增结果；泳道4：以突变株B-N+M-1基因组为模板，引物PGK-up与PGK-down扩增结果；泳道5：以B-N+M-1基因组为模板，N-S与N-X为引物扩增得到的NS-NA-KanMX-(PGK1P-MAL62-PGK1T)-NB-NX片段(尚未去除KanMX)；泳道M1：DL5000 marker。
去除KanMX抗性基因的方法如下：采用醋酸锂转化的方法将含有Cre重组酶的质粒pGAPza转入重组菌B-N+Mα/a中，在zeocin抗性平板上筛选出的转化子通过半乳糖诱导后，涂布于YEPD平板上，长出菌落后影印到含G418的培养基上，不能在G418平板上生长的菌即为KanMX抗性基因被去除的菌株，得到不带有遗传标记的突变株B-N+Mα/a(Kan-)。以KanMX-up、KanMX-down为引物经PCR验证，无KanMX条带，引物KanMX-up和KanMX-down如表4所示：
表4引物KanMX-up和KanMX-down
引物 引物序列(5'-3') 编号
KanMX-up CAGCTGAAGCTTCGTACGC SEQ ID NO.23
KanMX-down GCATAGGCCACTAGTGGATCTG SEQ ID NO.24
敲除结果如图6所示，图6中，M：DL5000 marker；1、2：以KanMX-up、KanMX-down为引物扩增实施例1、2构建的B-N+M(Kan-)菌株；3、4：以KanMX-up、KanMX-down为引物扩增实施例1、2构建的B-N+M菌株(含有1625bp的Kan基因)。
实施例2融合PCR法构建酵母菌株
本实施例提供了一株面包酵母，以面包酵母BY-14作为出发面包酵母菌株，该面包酵母缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1，并且过表达麦芽糖酶编码基因MAL62，该面包酵母命名为面包酵母B-N+M-2，与实施例1的区别在于，缺失NTH1基因和过表达MAL62基因通过如下方法实现：
首先使用如表1所述的引物分别扩增得到NA片段、PGK1P片段、MAL62片段、PGK1T片段、KanMX片段和NB片段，扩增体系和扩增程序如表5所示：
表5
*表示退火温度按照所用引物的最适Tm值确定；退火时间按照扩增产物的大小确定。
转化时各片段的浓度，具体转化的实验步骤如下：
(1)挑取一环酵母受体菌接种于5mL的YEPD液体培养基中，30℃，180rpm，培养14～16h，使菌体数达到5×106个/mL。
(2)将以上5×106个/mL浓度的菌液接入50mL YEPD培养基中，30℃，180rpm培养5h，当OD600＝0.4～0.6时停止培养(此时菌数可达2×107个/mL)。
(3)第(2)步的菌液立即冰浴10min，然后4℃，5000rpm离心5min，弃上清，再用25mL去离子水洗涤两次。
(4)弃去上清，加入1mL 0.1mol/L的LiAc(醋酸锂)缓冲液重悬菌体，4℃，5000rpm离心，弃去上清。
(5)再用20mL无菌水洗涤菌体一次，并将细胞重悬于500μL 0.1mol/L的LiAc(醋酸锂)缓冲液，最后按照每管50μL细胞重悬液(酵母感受态)分装至多个1.5mL离心管。
(6)将1mL鲑鱼精单链DNA置于1.5mL离心管中，煮沸5min后置于冰上急冷2min。
(7)向第5步制备分装好的酵母感受态内依次加入50％PEG 240μL，醋酸锂(1mol/L)36μL，单链DNA(2mg/mL)50μL，待转化DNA 34μL(各片段体积平均分配，浓度最低100ng/μL)。
(8)将上一步的混合液涡旋振荡混匀，于30℃静置培养30min。
(9)42℃热激40min，13000rpm离心1min，弃上清。
(10)沉淀用1mL YEPD液体培养基重悬，30℃100rpm修复培养4h。
(11)离心去上清，每1.5mL离心管用200μL无菌ddH2O重悬，按照每个平板100μL的计量涂布于G418抗性平板。
G418抗性平板上生长起来的酵母再使用表6引物验证连接的准确性：
表6
引物 引物序列(5'-3') 编号
验1-F AAAAGTTACTATTTCTGGCTCG SEQ ID NO.25
验1-R CCCTCTGTGGCGGTCTAT SEQ ID NO.26
验-2-F ACATGCTATGATGCCCACT SEQ ID NO.27
验-2-R ACGACTCGCAAACAAACG SEQ ID NO.28
验-3-F GGTACTGATAGTTGGGCTAC SEQ ID NO.29
验-3-R CAAGACTGTCAAGGAGGG SEQ ID NO.30
验4-F CTAACGCCGCCATCCAGT SEQ ID NO.31
验4-R GCTCCAAAGCCACCATCC SEQ ID NO.32
转化结果验证如图7所示，其中泳道1：验4引物对扩增实施例2的B-N+M-2，所得条带(897bp)；泳道2：验3引物对扩增实施例2的B-N+M-2，所得条带(1173bp)；泳道3：验2引物对扩增实施例2的B-N+M-2，所得条带(873bp)；泳道4：验1引物对扩增实施例2的B-N+M-2，所得条带(1181bp)。
本实施例中去除KanMX抗性基因的方法同实施例1，结果如图6所示。
效果例1转化子与亲本的发酵实验
将重组面包酵母B-N+M与亲本BY-14，进行不加糖面团发酵和模拟面团发酵，测定菌株的发酵性能并计算葡萄糖阻遏程度，结果见表7。由表7可知，亲本BY-14无糖面团发酵前1h产气780mL，78min结束发酵，葡萄糖阻遏程度为55.87％，重组面包酵母B-N+M-1的无糖面团发酵前1h产气1100mL，60min结束发酵，葡萄糖阻遏程度为39.66％，即重组菌株B-N+M-1比亲本BY-14的无糖面团发酵前1h多产气320ml，发酵时间缩短18min。葡萄糖阻遏程度降低了16.21％，与亲本菌株相比，重组菌株B-N+M-1的比发酵力提高了10.69％；面包酵母B-N+M-2的无糖面团发酵前1h产气1102mL，60min结束发酵，葡萄糖阻遏程度为39.6％，即重组菌株B-N+M-2比亲本BY-14的无糖面团发酵前1h多产气322ml，发酵时间缩短18min。葡萄糖阻遏程度降低了16.27％，与亲本菌株相比，重组菌株B-N+M-2的比发酵力提高了9.92％。上述说明重组面包酵母可以在更短的时间内，消耗更少的碳源获得更大的CO2产气量。
表7转化子与亲本的发酵特性
实验结果为三次重复的平均值。
效果例2转化子与亲本的耐冷冻实验
将重组面包酵母B-N+M与亲本进行预发酵后短期/长期冷冻实验，测定细胞的冷冻存活率和相对发酵力，结果见表8。由表8可知，亲本BY14胞内海藻糖含量为98.33mg/g，预发酵后冷冻存活率为40.26％，长期冷冻后存活率为36.95％，相对发酵力为35.04％。
重组面包酵母B-N+M-1的胞内海藻糖含量为136.82mg/g，预发酵后冷冻存活率为75.34％，长期冷冻后存活率为73.96％，相对发酵力为60.37％，即重组菌株比亲本BY14的胞内海藻糖增加了36.49mg/g，预发酵后冷冻存活率增加了35.08％，长期冷冻后存活率为增加了37.01％，相对发酵力增加了25.33％。
重组面包酵母B-N+M-2的胞内海藻糖含量为135.98mg/g，预发酵后冷冻存活率为74.97％，长期冷冻后存活率为74.1％，相对发酵力为61.25％，即重组菌株比亲本BY14的胞内海藻糖增加了37.65mg/g，预发酵后冷冻存活率增加了34.71％，长期冷冻后存活率为增加了37.15％，相对发酵力增加了26.21％。
由结果看出，NTH1基因完全缺失和麦芽糖酶的过表达可显著增加酵母前发酵期胞内海藻糖基本含量，同时减缓了冷冻初期海藻糖的分解速率，从而提高酵母的长短期冷冻存活率和相对发酵力。
表8菌株胞内海藻糖含量、冷冻存活率及相对发酵力
效果例3NTH1基因缺失的稳定性验证
使用表3中引物对NTH1-up和NTH1-down扩增实施例1和实施例2得到的面包酵母B-N+M的第1、5、15代菌株，结果如图8和图9所示，图8和图9中，泳道1、2、3泳道分别代表传代的第1、5、15代；泳道M为DL5000 marker。从图中可以看出，实施例1和实施例2两种方法制备得到的面包酵母B-N+M中的NTH1基因100％缺失，并且不易产生回复突变，当面包酵母B-N+M传代至第15代时NTH1基因仍100％缺失。
从上述实施例以及效果例可以看出，实施例1和实施例2采用的面包酵母B-N+M的制备方法，均能成功的缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1，提高胞内海藻糖；过表达麦芽糖酶编码基因MAL62，增强面包酵母的耐冷冻性能，提升冷冻前后的发酵性能；同时实施例1和实施例2采用的面包酵母B-N+M的制备方法能够使面包酵母中的NTH1基因100％缺失，并且不易产生回复突变；虽然实施例1和实施例2分别得到的重组面包酵母菌株B-N+M在性能上几乎没有区别，但是实施例1的制备方法需要半年甚至一年的工作量；而实施例2只需约两周就可以完成，因此在制备方法的效率方面来评价，实施例2的制备方法更优。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津农学院
<120> 面包酵母B-N+M及其制备方法、引物组和它们在发酵不加糖冷冻面团中的应
用
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aattgaatat caatttcatc atcag 25
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ttcagttttg gatagatcag ttagatctac tgattttttt tgttaatttt 50
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aaaattaaca aaaaaaatca gtagatctaa ctgatctatc caaaactgaa 50
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<213> 人工序列
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ctacttttta caacaaatat aaaacatgac tatttctgat catccagaaa 50
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agaaaagaaa aaaattgatc tatcgttatt tgacgaggta gattctacct 50
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tatatatata tatatattat ctcaagcata ggccactagt ggatctgata 50
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ttttttttgt ttcttgtttt ccgcgtactt cccgctgggc gaaaaaagaa atgaaaaaaa 120
gaaacgacag gagcatcgtg taggacgaag ccccttatcc cctagttacc gaagaaggcc 180
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<212> DNA
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<400> 32
gctccaaagc caccatcc 18

Claims (10)

1.一株面包酵母B-N+M，所述面包酵母B-N+M缺失中性海藻糖酶编码基因NTH1；过表达麦芽糖酶编码基因MAL62。
2.根据权利要求1所述的面包酵母B-N+M，其特征在于，使用强启动子过表达麦芽糖酶编码基因MAL62；
优选地，所述强启动子包括PGK1。
3.根据权利要求1或2所述的面包酵母B-N+M，其特征在于，出发酵母菌包括BY-14。
4.权利要求1-3任一项所述的面包酵母B-N+M的制备方法，其特征在于，将基因敲除组件转化至出发酵母菌中敲除中性海藻糖酶编码基因NTH1；所述基因敲除组件含有用于和中性海藻糖酶编码基因NTH1同源重组的同源臂；所述基因敲除组件还包含使麦芽糖酶编码基因MAL62过表达的元件和麦芽糖酶编码基因MAL62；
优选地，所述使麦芽糖酶编码基因MAL62过表达的元件包括强启动子，优选包括PGK1；
优选地，所述基因敲除组件中还含有标记基因，所述制备方法还包括同源重组后去除面包酵母中标记基因的步骤；
优选地，所述标记基因包括KanMX。
5.根据权利要求4所述的面包酵母B-N+M的制备方法，其特征在于，所述基因敲除组件为NA-KanMX-PGK1P-MAL62-PGK1T-NB重组基因盒，NA为中性海藻糖酶编码基因NTH1的上同源臂；NB为中性海藻糖酶编码基因NTH1的下同源臂；
优选地，NA含有如SEQ ID NO.13所示序列；
优选地，NB含有如SEQ ID NO.14所示序列。
6.根据权利要求4所述的面包酵母B-N+M的制备方法，其特征在于，所述基因敲除组件包括若干待拼接片段，相邻位置待拼接片段首尾含有同源区段；且首个待拼接片段为中性海藻糖酶编码基因NTH1的上同源臂片段，末尾待拼接片段为中性海藻糖酶编码基因NTH1下同源臂片段，所述待拼接片段还包括用于过表达麦芽糖酶编码基因MAL62的元件片段和麦芽糖酶编码基因MAL62片段。
7.根据权利要求6所述的面包酵母B-N+M的制备方法，其特征在于，所述基因敲除组件包括(a1)～(a6)待拼接片段：(a1)NA片段；(a2)PGK1P片段；(a3)MAL62片段；(a4)PGK1T片段；(a5)KanMX片段；和，(a6)NB片段；所述NA片段使用具有如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ IDNO.2所示序列的引物扩增得到；所述PGK1P片段使用具有如SEQ ID NO.3所示序列和SEQ IDNO.4所示序列的引物扩增得到；所述MAL62片段使用具有如SEQ ID NO.5所示序列和SEQ IDNO.6所示序列的引物扩增得到；所述PGK1T片段使用具有如SEQ ID NO.7所示序列和SEQ IDNO.8所示序列的引物扩增得到；所述KanMX片段使用具有如SEQ ID NO.9所示序列和SEQ IDNO.10所示序列的引物扩增得到；所述NB片段使用具有如SEQ ID NO.11所示序列和SEQ IDNO.12所示序列的引物扩增得到；
优选地，NA片段含有如SEQ ID NO.13所示序列；
优选地，NB片段含有如SEQ ID NO.14所示序列。
8.根据权利要求4-7任一项所述的面包酵母B-N+M的制备方法，其特征在于，出发酵母菌包括BY-14。
9.用于构建权利要求1-3任一项所述面包酵母B-N+M的引物组，所述引物组包括如下引物对：用于扩增NA片段的引物对，具有如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列；用于扩增PGK1P片段的引物对，具有如SEQ ID NO.3所示序列和SEQ ID NO.4所示序列；用于扩增MAL62片段的引物对，具有如SEQ ID NO.5所示序列和SEQ ID NO.6所示序列；用于扩增PGK1T片段的引物对，具有如SEQ ID NO.7所示序列和SEQ ID NO.8所示序列；用于扩增KanMX片段的引物对，具有如SEQ ID NO.9所示序列和SEQ ID NO.10所示序列；用于扩增NB片段的引物对，具有如SEQ ID NO.11所示序列和SEQ ID NO.12所示序列。
10.权利要求1-3任一项所述的面包酵母B-N+M，权利要求4-8任一项所述的制备方法，或权利要求9所述的引物组，在发酵不加糖冷冻面团中的应用。
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