CN101343617B - 低温失活的工业用面包酵母 - Google Patents

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Abstract

制备具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其中首先将具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株与至少具有一个活化的受分解代谢抑制的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株杂交，然后在第二阶段，将分离子代进行杂交，最后，选出具Lti表现型、活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型以及具有在分批补料方法中具生长能力的原养型二倍体菌株。将所研制的菌株用于一种制备冷藏的经包装好的烤制用生面团的方法中，其中将该Lti酵母至少与水和面粉混合，然后将该生面团包装于含有排气阀门的容器中。

Description

低温失活的工业用面包酵母
本申请是申请日为1995年3月16日，申请号为95102496.5，发明名称为“低温失活的工业用面包酵母”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及一种研制具有Lti特性的工业用面包酵母菌株的方法，根据本发明方法研制的酵母菌株，所说菌株在制备烤制用生面团中的应用，制备含有这些酵母菌株之一的冷却烤制用生面团的方法以及根据本发明方法制备的烤制用生面团。
已知用酵母发酵的烤制用生面团的口味和质地比用化学试剂发酵的生面团有许多优点。商业上销售的面包房产品也是已知的。例如制作面包卷和croissants的生面团，这些产品在发酵和烙烤前打算保存在冰箱中，不过它们含有化学发酵剂。
相应地，EP 0,487,878描述了具有Lti特性的作为发酵剂的酵母菌株在制备制面包产品(其在冷藏后放在炉子中烘烤)中的应用，换句话说Lti特性是在冷藏期间活性非常低但在这些温度下能存活的特性(Lti是英语表达“低温失活”的首字母缩略词)。然而这些酵母太旺盛，即是说在稍高的冷却温度即8-12℃之间，或甚至于14℃时释放太多的气体，事实上，有时在通常的工业贮存冷藏产品条件下过长时间后普遍能观察到这种现象。这种活力尤其应归因于这些菌株中MAL等位基因的存在，该等位基因是活化的并且不受分解代谢途径的阻遏，而且这种活力还归因于未足够选择这些菌株的Lti特性。最终，这些酵母就不能最佳地顺利地响应其工业生产所需的所有条件，例如良好的干燥性能或高的生长率。
另外，WO 93/01724和EP 0,556,905描述了具有与EP 0,487,878中所述相似特性的酵母菌株的应用。但是，所描述的菌株属于Lts突变体类型(Lts是英语表达“低温敏感性”的首字母缩略词；Singh等人，1974，Genetics  77，651-659)，其通常在冷却温度下快速地丧失其生活力。此外，这些酵母适应最佳工业生产及应用的能力很差。的确，它们是单倍体和营养缺陷型实验室酵母，其在传统的工业用培养基上几乎不能生长。此外，与那些工业用制面包酵母菌株例如“Levure de boulangerie bleue”(LBB)(蓝面包酵母)(Lesaffre，France)相比，这些酵母在上述培养基上的生长潜力和生产率可能很低。而且，这些菌株的遗传稳定性可能也不足以适应其工业生产。的确在一些生产中有失去Lts特性的危险。最后，这些菌株几乎不能在与一种工业用面包酵母菌株能生存的干燥方式相同的传统干燥过程中存活。
WO 93/01724还描述了一种制备含有作为发酵剂的Lts酵母的包装好的且冷藏过的烤制用生面团的方法。在该方法中，通过将所说酵母至少与面粉和水混合来制备所说生面团，然后将该生面团放入到一个容器中并密封，然后在所说的生面团在保持于冷却温度的所述容器中发酵。从而获得了含有冷却生面团的密封容器，其中在该容器贮存于低温的整个过程中所述Lts酵母实际上应该是失活的。
但是，由于各种原因该方法不是令人满意的。首先，在打开容器过程中，由于减压可观察到生面团快速膨胀。不幸的是，这种膨胀趋于毁坏生面团的传统质地。
此外，Lts酵母在稍高冷却温度即所说的8至12℃或者甚至于14℃温度下能释放太多的气体和气味，事实上在工业贮存冷却产品的常规条件下常常能观察到这种状况。从而，在贮存几个星期以后，该容器的内部压力就可能有引起容器爆炸的危险。再者，在生面团和容器的大气中存在的气味的浓度也具有改变生面团的传统嗅味以及感观质量的危险。
另外，在较低冷却温度，即所说的最高达8℃时，推测所述酵母没有释放使容器内压力急剧升高的气体，从而没有释放出气味。于是，推测这些气味主要是在生面团发酵期间产生的，发酵之后几乎没有气味产生。相应地，由于气味本性上是不稳定的，所以在贮存期间生面团也可快速地失去其感观质量。
最终，在生面团发酵期间酵母被高度激活，并且简单地通过将含有这些酵母的生面团贮存于冷却温度下因而带来了酵母易失活的麻烦。的确，此后酵母具有高度活跃的发酵代谢作用。
因而，在生面团的整个保存期间，促进酵母发酵的气味特性的出现，但是不要超出一定的浓度是有利的。还能消除由于容器的内部压力而强制产生的限制也是十分有利的。
本发明的主题是克服了现有技术中的缺点，从而提供了一种研制具有Lti特性的工业用面包酵母菌株的方法，以及一种制备含有所说酵母菌株的冷却的烤制用生面团的方法。
为此，在研制具有Lti特性的工业用面包酵母菌株的方法中，首先将具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株与至少具有一个MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株进行杂交，所述等位基因是活化的但受分解代谢抑制，然后在第二阶段，将分离的后代杂交，最后，选择出一种具有Lti表现型，具有一种活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型并且具有在分批补料发酵方法中生长的潜力的原养型二倍体菌株。
在制备冷藏的包装好的烤制用生面团的方法中，通过将本发明的酵母至少与水和面粉混合来制备所述生面团，然后将该生面团包装在具有排气阀门的容器中。
词语“MAL等位基因”在本发明说明书中是指一种复合基因，该基因是编码三种功能即α-葡糖苷酶、一种透性酶和一种调节蛋白的MAL基因族的一部分。词语“活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因”是指一种MAL等位基因，其功能的表达是例如受培养基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(称为诱导型MAL等位基因)，或是指一种MAL等位基因，其能表达其功能但它的功能本身例如受培养基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(称为组成型MAL等位基因)。
另外，词语“生长潜力”是指由工业生产上可使用的方法，尤其是由传统的面包酵母培养方法，已知称之为分批补料法(在通气条件下将糖溶液慢速地逐渐地加入到一种悬浮液中，以便避免在生物量产生期间形成乙醇并且达到最大产量)培养时具有高产量及高生产率的能力。
此外，术语“原养型”是指在仅含有碳源，氮源、磷酸盐或硫，微量元素以及微量维生素的培养基上繁殖的酵母。该培养基也称为“基本培养基”。
另外，词语“冷却温度”是指所有低于或等于12℃的温度，在该温度下生面团不会冻结。
最后，在其余的描述中，术语“生面团”或“烤制用生面团”是指传统的烤制用生面团，例如匹萨(pizza)生面团，面包生面团或croissant生面团。特别是这些生面团含有至少适当量的例如小麦面粉，盐类，油和水。
于是，可以研制具有在冷却温度下的生面团中失活但存活的特性甚至在更高的温度，即最高达18℃下实际仍失活的特性的出乎意料的Lti面包酵母菌株。
这些面包酵母菌株还具有更适合于工业上使用的特性。因此这些菌株具有类似于或甚至于等同于商品工业菌株例如LBB酵母的生长产率。这些菌株还出乎意料地适用于为了其保存目的而进行的干燥过程中，而在再水合后并不以显著方式失去其活性。最后，还应注意到这些菌株与其Lti特性相关的令人惊奇的遗传稳定性。
最终，使用制备本发明所述生面团的方法，可以避免与容器内部压力相关的所有缺陷。因而可以使用更具柔韧性的包装材料。并且，由于酵母的残留活性(所述酵母在整个保存期间产生气味但并未使生面团复活(rise))，还由于贮存期间产生的过量气味外溢至包装之外而改善了生面团的口味。
最终，在其贮存期间，生面团为气体所饱和，从而可直接烘烤该生面团，因为生面团中气体的存在足以使之在烘烤时复活。从而避开了发酵生面团的预备阶段。
为了实现研制具有Lti特性的酵母菌株的本发明方法，首先将具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株与至少具有一个活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株杂交。
为了达到该目的，可以选择一种具有良好Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株，所述Lti特性即是在例如3至10℃之间，较好的是在10℃以上时能失活。
还可以选择一种含有至少一个受分解代谢抑制的诱导型MAL等位基因的酿酒酵母菌株，所谓诱导型是指在工业培养基中栽培的该酵母其组成上并不存在α-葡糖苷酶。的确，这些培养基包含作为主要糖类的引起分解代谢抑制作用的糖类，例如葡萄糖和/或蔗糖。另一方面，在烤制用生面团中，仅当酵母已缺失引起分解代谢抑制的糖类时，该酵母才合成α-葡糖苷酶以便于利用生面团的麦芽糖。从而可以选择例如MAL2、MAL3或MAL6等位基因。
此外，受分解代谢抑制的MAL等位基因也是组成型的，即α-葡糖苷酶天然地存在于酵母中，尽管受培养基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制。在烤制用生面团中，仅当该酵母已缺失引起分解代谢抑制的糖类时该酵母才直接利用生面团的麦芽糖。因此可以选择例如MAL2-8c等位基因。
然后使来源于首次杂交的二倍体子代在传统的孢子形成培养基上形成孢子，以获得单倍体分离子代。在该阶段，通过在包含作为唯一碳源的麦芽糖的培养基，例如YPM-琼脂培养基(见培养基部分)上培养，可以核验单倍体分离子代的Mal特性。还可以例如通过在8-10℃的冷却温度下在YPD-琼脂培养基上(见培养基部分)至少培养21天而检验单倍体分离子代的Lti特性。至少三星期后，根据没有可见的细胞生长而鉴定出存活的但仍保持相对失活状态的Lti菌落。事实上，Lti候选株没有可见细胞生长相当于亲代非Lti单倍体菌株充分生长。
然后，在第二阶段，在合适培养基上相对性别的分离子代进行相互杂交。因此可将从相同的首次杂交获得的分离子代进行杂交，或将从不同的首次杂交获得的分离子代进行杂交，即是说，各自具有可能为不同亲本的，以及其亲本之一可能是相同的两个分离子代进行杂交。从而获得了具有每种各样特性的大量的二倍体酵母菌株。
例如将二倍体酵母培养于基本培养基上可以检验其原养型特性。通过在例如YPM-琼脂培养基上培养也可检验Mal表现型。因而从其亲本遗传了一个或多个受分解代谢抑制的MAL基因的酵母可以利用麦芽糖，并且然后由培养基中存在的pH指示剂显示这一特性。使之在例如合适的培养基上形成孢子也可检验酵母的二倍体性状。最后，通过例如在8℃的冷却温度下将其在YPD-琼脂培养基上培养21天可检验二倍体菌株的Lti特性。在这种情况下，Lti菌株在该培养基上生长非常缓慢。
结果，在这些二倍体酵母菌株中筛选出一种具有Lti表现型，具有活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型以及具有在分批补料方法中的生长的潜力的原养型菌株。
在该阶段，因而可选择比前面阶段所用的更严格更精确的筛选标准。从而可以通过检测菌株在例如8-14℃温度下几天之内在烤制用生面团中产生的CO2量而筛选特定的Lti特性。
也可以根据其在分批补料方法中的生长能力来筛选所说的二倍体菌株，即将其培养于要求酵母具有碳源呼吸代谢作用能力的培养基上。
从而通过使用本发明研制的方法，可以研制具有显著Lti特性的酵母菌株。的确，对MAL基因的抑制使生面团中存在的酵母的活性延迟产生，所述生面团处于其中所述酵母又具有潜在活性的温度下。这种延迟作用实际上可由下列事实解释，即酵母在能够利用麦芽糖之前必须首先利用引起分解代谢抑制作用的糖类，并且这些糖类存在的量不足以确保酵母的最适发酵活性。
另外，当Lti酵母具有诱导性的但受分解代谢抑制的MAL等位基因时，这种延迟作用甚至更大，因为事实上当酵母已经利用了引起分解代谢抑制的糖类之后，必须另外合成能具有利用麦芽糖的功能的产物。
结果Lti酵母对冷藏温度以上的温度变化更不敏感。
因此这些酵母可用于制备冷却保藏以后在炉子上烘烤的面包房产品。
因而可以制备在分批补料发酵过程中具有高于0.5克干生物量/每克糖的生长产率以及在最高达8℃温度时CO2产生量低于7ml/小时/每kg生面团，最高达12℃时CO2产生量低于12ml/小时/每kg生面团的工业用面包房酿酒酵母菌株。该酵母在含有麦芽糖的培养基中培养4天后，在最高至18℃时具有的CO2产生量还低于10ml/每克浓缩酵母。
还可以筛选例如在最高至12℃温度时CO2产生量低于3ml/小时/每kg生面团的酵母菌株。
在以上获得的各个酿酒酵母菌株中，其中两个菌株作为例子，已按布达佩斯条约规定，于94年1月28日保存于NationalCollection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box 31，135  Abbey Road，ABERDEEN AB98DG，Scotland(英国)，两菌株的保藏号为NCIMB 40611和40612。
菌株NCIMB 40611还有下列特征：
-形态学：为大小相对均匀的椭园形细胞。
-发酵特性：为能发酵蔗糖、葡萄糖和麦芽糖的酵母。
同样，菌株NCIMB 40612具有下列特性：
-形态学：为大小相对均匀的椭园形细胞。
-发酵特性：为能发酵蔗糖、葡萄糖和麦芽糖的酵母。
在制备本发明所述的冷却的包装好的烤制用生面团的方法中，通过将本发明所说的一种酵母至少与水和面粉混合制备一种生面团，然后将该生面团包装于含有排气阀门的容器中。
从而可以在冷藏温度下混合然后包装生面团。
该容器中的大气也可由一种惰性气体如氮气或二氧化碳单独组成或由其混合而成。例如通过抽真空从容器中吸出氧气，然后注入惰性气体，随后密封所说容器来制造所述大气环境。这种大气环境特别能避免真菌繁殖。
具体地讲，还可以将所述酵母与生面团混合，所述酵母量为0.1-1％的浓缩或再水化酵母的干物质量。
此外，这些酵母可以含有海藻糖。并且可向生面团中加入1.2-2％NaCl，以便减少天然生面团菌丛的过分繁殖。
本发明所述的冷藏生面团具有用传统面包酵母发酵的并具有上面所述相同组成的生面团所特有的质地和口味。但是当后者在正常冷藏温度下保存2-60天时优选本发明的冷藏生面团。
下面列举的实施例是为了说明研制Lti菌株的方法，制备本发明所述生面团的方法，由该研制方法获得的Lti菌株，以及由本发明制备方法得到的包装好的冷藏生面团。
除非另有说明，所述百分数是指重量百分数。在描述各个实施例之前先描述各种试验，各种培养基的组分以及附图的简要说明。
试验
1.生面团中CO2的产生量
为了实施该试验，制备用作为培养基的烤制用生面团。该生面团包含60.2％面粉，29.2％水，1.4％NaCl，7.2％花生油，以及2％Lti酵母(其中含15％干物质)。所有成分保存于4℃，并且在4-8℃之间制备该生面团。
为此，首先将含30％干物质的几克Lti酵母悬液置于50mlFalcon管中，并加入相同量的水，以得到含15％干物质的悬液，然后振荡整个试管而制备一种均匀酵母悬液。接着，将上述面粉和盐混合，然后加入花生油和水，最后加入Lti酵母悬液。最后，拌合该生面团，直到不再粘滞，但不要操作过长时间。从而获得了一种光滑生面团。然后取出100克的这种生面团转移到Risograph(RDesign，USA)，然后立即检测放出的CO2。
首先在8℃每隔1小时检测放出的气体，共检测120小时。然后将温度升高到12℃，并每隔1小时检测放出的气体，共检测120小时。最后，将温度升高到30℃，并每隔10分钟检测放出的气体，共检测6小时。然后计算每一温度时气体形成的起始斜率(ml/h/kg生面团)而测出酵母活性。
2.生长能力
该试验目的是为了筛选与工业用酵母菌株具有相似生长能力的酵母菌株。
为此，将酵母菌株培养于一种培养基上，该培养基诱导与在分批补料发酵法中培养的菌株相类似的代谢作用。的确，已知在传统的分批补料发酵法中，酵母通过呼吸代谢途径同化碳源，它们很少积累或不积累乙醇或乙酸盐，并且它们还能通过呼吸途径非常快速地将乙醇或乙酸盐再同化。从而通过将其在需要酵母能完成碳源的呼吸代谢途径的培养基上培养而筛选出所需酵母。
为了上述目的，将酵母培养于锥形瓶(含有促进培养基通气的挡板)中，该瓶中装有包含作为碳源的乙醇和乙酸盐的YNEA培养基。为了模拟常规的工业培养基如含有糖蜜的培养基，加入小量酵母提取物。再者，用琥珀酸盐和盐酸将培养基的pH值缓冲到4，以有利于乙酸盐以其酸形式存在。
在该试验中，将检测的酵母于30℃在5ml YPD培养基中预培养，并在30℃以约190转/分钟(rpm)的转速搅拌12小时。然后，将1ml预培养物接种到100ml YNE培养基(装在含有挡板的500ml锥形瓶中)上，并于30℃搅拌(190rpm)培养24小时。最后，将前面的培养物接种于100ml YNEA培养基(装于含有挡板的500ml锥形瓶中)，接种量为使培养液OD600接近于0.1，在30℃搅拌培养10小时，每隔2小时检测OD600。
然后，选择具有最佳生长曲线的菌株。从而筛选起始生长速率至少相当于LBB菌株的65％，优选接近于或相当于对照LBB菌株的100％的菌株。
3.分批补料培养法的产率
在分批补料发酵的工业生产条件下培养选出的酵母。
为此，首先将酵母于30℃振荡培养于各含有400ml YPD培养基的几个容器中，然后无菌条件下将3升前面的培养物接种于含有8升“原糖蜜”培养基(见“培养基”部分)的一个30升发酵罐(Chemap，瑞士)。最后，根据传统分批补料方法进行发酵，即在30℃搅拌(250-450rpm)及增加通气量(0.02-0.8m3/小时)的条件下培养24小时，通过加入适当量的NH4 OH而使p H维持在4.5，通过加入增大量的消沫剂如Contraspum  210(1.5％重量/培养基体积；Binggeli-Chemie，瑞士)而控制所产生的泡沫，并且有规模地加入适当的加大量的“糖蜜”培养基，直至终体积为约22升。
最终，在无菌条件下将最后发酵产物转移到一个300升发酵罐(Chemap，瑞士)中，并且再进行一个分批补料发酵阶段，即在30℃，搅拌(240-350rpm)和增加通气量(0.2至10m3/h)条件下培养28小时，通过加入适当量的NH4 OH而使p H维持于4.5，通过加入增大量的消沫剂如Contraspum(5％重量/体积)而控制产生的泡沫，并且有规律地在26小时内加入适当的增大量的“糖蜜”培养基，直至终体积为约180升。
在发酵的最后2小时内，不再进一步加入糖蜜；从而降低培养基中残留的底物量，以避免在冷藏温度下促进酵母生长的糖类的存在。
最后，由此也有利于酵母中海藻糖的形成。该贮存糖对于在传统干燥过程中提高酵母的存活力是十分重要的。
下面表1描述了在30和300升发酵过程中作为时间的函数所加入的“糖蜜”培养基的量。
表1
 30升分批补料发酵 300升分批补料发酵
    时间(h)     糖蜜培养基(g/h)     糖蜜培养基(g/h)
    1     62.5     600
    2     62.5     600
    3     62.5     700
    4     62.5     800
    5     71     900
    6     79     1000
    7     87     1100
    8     95     1200
    9     102     1300
    10     110     1400
    11     118     1500
    12     133     1600
    13     147     1700
    14     162     1800
    15     177     1900
    16     191     2000
    17     206     2100
    18     220     2200
    19     235     2300
    20     249     2400
    21     264     2500
    22     279     2600
    23     293     2700
    24     308     2800
    25     ///     2800
    26     ///     2800
    27     ///     0
然后将300升发酵罐培养物冷却到12℃，之后离心(Westfalia离心机)直至获得约20％干物质，然后将沉淀酵母重悬于水中。然后再将该悬液离心，在这次离心期间用约300-400升无菌水/100升悬液洗涤该生物质(biomass)。
在此阶段，可加入维生素C，以便降低生物质的氧化。维生素C还具有将pH降至4.4的优点。
最后，将生物质离心(“De Laval”离心机)以除去杂质，直到获得28％干物质。然后挤压(Bücher  压榨机)所说生物质直到获得34-35％干物质。从而获得浓缩的酵母。
然后可测定酵母的生长产率。为此，测定获得的干生物质量，相当于发酵期间加入的糖类的量(主要是存在于糖蜜中的蔗糖)。
4.遗传稳定性：
具有如Lti特性的一种特定特征的酵母菌株的遗传稳定性是该菌株适于工业化使用的决定性因子。
为了评估该稳定性，对Lti特性的回复突变型进行研究。为此，用工业分批补料方法将细胞培养物中的约108个细胞置于含YPD培养基的10个培养皿上平板培养，将培养皿在8℃培养，然后，检查约4星期后此温度下产生的菌落。
5.在一个温度梯度下CO2的产生量
在为此而特别设计的仪器中进行该试验，该仪器包括例如具有不同温度的腔室的温度梯度装置，在其中可放入发酵管的底端。这些管具有封闭和有刻度的上端，以及从侧面分枝出的膨胀瓶。由酵母产生的CO2积累在每个管的有刻度的上端，被积累的气体置换的培养基可能进入到膨胀瓶中。
为了进行该试验，将2ml在YPD培养基上培养过夜的待测菌株培养物接种于含200ml的含有0.67％的无氨基酸氮源(nitrogen base)例如由Difco公司市售的商品名为“无氨基酸酵母氮源”的产品，如0.5％酵母提取物，2％蔗糖、1％琥珀酸钠以及调节pH至4.5的浓盐酸的第一种培养基的500ml瓶中。在30℃搅拌培养24小时。
通过在20℃以6000gn离心5分钟来分离细胞，并将其悬浮于含200ml的含有0.67％无氨基酸氮源，0.3％酵母提取物和0.3％蔗糖，1％琥珀酸钠和为将pH调至4.5的浓盐酸的第二种培养基的500ml瓶中。在30℃搅拌培养24小时。
在4℃，以6000gn离心5分钟而将细胞分离，用50ml蒸馏水将所得的沉淀的酵母细胞洗涤两次。
将细胞悬浮于10ml蒸馏水中，并将其转移至有刻度的并预先称重的15ml聚丙烯管中。在4℃，以3000gn将其离心10分钟。将试管中水排干，称酵母沉淀物的重量，并将其以每毫升中加入相当于具有干物质量约27％的0.5克浓缩酵母的0.61克酵母沉淀物的量悬浮到第三种培养基中，该培养基含有0.67％无氨基酸氮源，2％麦芽糖，1％琥珀酸钠和浓盐酸，以将pH调到4.5。将0.5-3ml悬液(温度＞10℃检测)或1-3ml(温度＜10℃检测)悬液加到上面描述的发酵管中。每个发酵管中预先装有50ml所述第三种培养基，换句话说，是含有糖蜜的培养基，并将其冷却到4℃。
在所需温度以及在上面描述的温度梯度装置中培养发酵管。在将试管放入声波振荡浴中几秒钟后，在选定的时间间隔内观察生成的CO2，以便使释放出的CO2气泡进入液体培养基中。
培养基
除非另有说明，给出的化合物的百分数为重量/体积百分数。
YPM-琼脂：1％“Difco  Bacto酵母提取物”。
          2％“Difco  Bacto胨”。
          2％麦芽糖。
          2％“Difco  Bacto琼脂”。
          0.9％体积/体积(V/V)的溶解于纯乙醇中的
          0.4％(V/V)Bromcresol  Red溶液。
YPD：     2％“Difco Bacto胨”。
          1％“Difco  Bacto酵母提取物”。
          2％葡萄糖。
YPD-琼脂：含有2％“Difco  Bacto胨”的YPD。
YNE：     0.67％“Difco  无氨基酸酵母氮源”。
          0.5％“Difco  Bacto酵母提取物”。
          1％琥珀酸二钠。
          1.12％(V/V)5M  HCl 。
          0.7％(V/V)乙醇。
YNEA      加0.3％(V/V)冰醋酸的YNE。
前糖蜜：  含有前糖蜜培养基的起始分批补料发酵培养基，它
          具有下列组分：
          100kg   的软化水
          263g    (NH4)2HPO4
          62g     MgSO4
          8.6g    NaCl
          7.82g CaCl2
          17g  肌醇
          0.84g泛酸钙
          0.006g生物素
糖蜜：    84.85％无菌糖蜜(Aarberg，瑞士)。
          13.85％水。
          1％  H2SO4。
按下列方式将糖蜜灭菌。在80℃热处理30分钟而诱导污染的孢子繁殖，在室温使其繁殖20小时，在125℃灭菌2分钟。然后冷却之后离心(Westfalia离心机)分离沉淀。
附图
图1：表示对于菌株NCIMB 40611，40612和Hindelbank面包酵母，100克含有1％浓缩酵母的生面团在8℃，12℃和30℃时产生的CO2含量与时间的函数关系。
图2和3：表示菌株NCIMB 40612(图2)和“Levure deboulangerie bleue”(蓝面包酵母)(LBB，用于比较，图3)在含糖蜜培养基上产生的CO2含量与温度及持续时间之间的三维函数关系图。
实施例1
具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株，例如具有MATα、mal3，lts 500基因型的NCIMB 40613菌株用作为起始材料。该菌株按布达佩斯条约规定于94年1月28日保藏于National Collection ofIndustrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box31，135 Abbey Road，ABERDEEN  AB9 8DG，苏格兰(英国)。
将该菌株与包含活化的但受分解代谢抑制的并且是诱导型的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株，尤其是具有MATa，trp5，ade7，adel，MAL6基因型的NCIMB 40614菌株进行杂交，该菌株已按布达佩斯条约规定于94年1月28日保藏于上面描述的保藏机构。
使二倍体酵母形成孢子，分离单倍体的孢子，然后用传统方法鉴定其性别类型，通过在8℃YPD-Agar培养基上培养鉴别其Lti表现型，在YPM-Agar培养基上培养鉴别其Mal表现型。然后将相反性别的分离子代相互杂交。
然后筛选二倍体原养型酵母菌株。并也在YPM-Agar培养基上培养而检查Mal表现型。最后，通过检测上面描述的烤制用生面团中菌株的CO2产生量而筛选Lti特性，并根据前面的“生长潜力”试验培养酵母而检测其在分批补料发酵法中的生长能力。然后选出起始生长速率大于对照LBB菌株65％的菌株。
在由此获得的各种菌株中，以上面介绍的NCIMB 40611菌株作为举例进行了保藏。
该菌株具有显著的Lti特性。正如在描述根据“生面团中CO2产生量”试验获得的结果的图1中所看到的那样。在3和12℃之间时该菌株实际上是失活的。的确，在3-12℃温度时它的CO2产生量低于3ml/h/kg生面团。还观察到在30℃时产生的CO2量快速上升。
此外，在“在温度梯度下产生的CO2量”试验中获得的结果表明在最高至18℃时在含有麦芽糖的培养基中培养12天之后，该菌株不释放任何气体。
另外，该菌株的起始生长速率相当于LBB酵母的66％，并且在根据前面描述的检测法，该菌株在分批补料方法中的生长产率相当于以同样方式测出的LBB菌株的生长产率，就是说0.5g干生物量/每克糖。
最后，根据上面描述的对遗传稳定性的检测未发现回复突变型。因而该菌株实际上是稳定的。
实施例2
以具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株，例如具有MATa、mal3，lts 500基因型的NCIMB 40613菌株作为起始材料。该菌株巳根据布达佩斯条约于94年1月28日保藏于National  Collection  ofIndustria l and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box31，135  Abbey Road，ABERDEEN  AB9 8DG，苏格兰(英国)。
将该菌株与包含活化的但受分解代谢抑制并且是组成型的Mal等位基因的单倍体酿酒酵母菌株，尤其是具有MATa，leu2，trp1，ura3，MAL2-8c，MAL3基因型的NCIMB 40615菌株进行杂交，NCIMB 40615菌株已按布达佩斯条约于94年1月28日进行保藏。
使双倍体形成孢子，然后将分离子代杂交，按与实施例1同样的方式筛选菌株。
在由此获得的各个菌株中，作为举例寄存了上面介绍的NCIMB40612菌株。
NCIMB40612于1995年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M95006。
正如在描述根据“生面团中产生的CO2量”试验中获得的结果的图1中所看出的那样，实际上在3至12℃之间时该菌株是失活的。的确，在3-8℃温度时其CO2产生量低于7ml/h/kg生面团。
在至少12℃时CO2产生量低于12ml/h/kg生面团，并且还观察到在30℃时产生的CO2含量快速上升。
此外，正如在描述由“在温度梯度下CO2生成量”试验获得的结果的图2中所看到的那样，该菌株还在含有麦芽糖的培养基中培养4天之后，在最高至18℃时其CO2的生成量为每克浓缩酵母低于10ml。作为比较，还将对照LBB菌株也进行了该试验(图3)。
另外，该菌株的起始生长速率相当于LBB酵母的90％，并且根据前面描述的试验其在分批补料方法中的生长产率相当于按同样方法测出的LBB菌株的生长产率，即每克培养基中产生0.5g干生物量
最后，根据上面描述的遗传稳定性检测试验没有发现回复突变型。因而该菌株实际上是稳定的。
实施例3
按下面方式将Lti面包酵母干燥以便能够以粉末形式将其保存较长时间。使用包含约20％干物质并且经离心和洗涤过的NCIMB40612菌株的培养物。然后例如按美国专利4,358,250中描述的传统方法将酵母干燥。从而获得了包含96％干物质的干酵母粉。
然后按下面方式将这些酵母再水合。在30℃将10％干酵母加到90％水中。然后温和地混合20分钟，最后，在4℃加入一定量的水从而获得了具有所需干物质量的酵母悬液。
可以看到经脱水，然后再水合的酵母完全保存其发酵活性。
实施例4
制备包含浓缩酵母菌株NCIMB 40612的冷藏的并经包装好的烤制用生面团。为此，按前面描述方法将NCIMB 40612酵母的浓缩的新鲜培养物用于“分批补料培养产率”检测试验。然后将一定量的所述浓缩酵母(包含约35％干物质)与面粉、水、脂肪和盐混合，从而得到包含0.2％浓缩酵母干物质，60％面粉，30％水，8％人造奶油和1.8％NaCl的生面团。
然后以与在欧洲专利EP 0,158,590中描述的相同方式将该生面团包装，不同之处在于不能透过空气的塑料包装物包含有一个排气阀门，即是说，一个阀门允许气体从包装物的内部溢出到外部，并且阻止空气从包装物外界流进其内部。此外，该包装物的内部大气还包含50％氮气和50％二氧化碳。
实施例5
制备包含再水合的酵母菌株NCIMB 40612的冷藏的并经包装好的烤制用生面团。
使用包含10％干物质的实施例3所述的再水合NCIMB 40612酵母悬液。由此制备包含0.3％再水合酵母干物质，60％面粉，30％水，8％人造奶油和1.7％NaCl的生面团。于是按与实施例4所述的相同方式包装该生面团。
实施例6
使用在冷藏温度下保存了一天的实施例4的生面团，然后将该生面团在220℃直接烘烤约15分钟。
另外，以与上述同样方式分别将冷藏保存7天、28天和60天的实施例4的生面团烘烤。
最后，为了比较，制备具有与实施例4所述的相同组分的生面团，唯一不同之处是加入传统面包酵母以替代Lti酵母。将该生面团在室温下发酵45天，然后在与上述同样条件下烘烤该生面团。
三种分别保存了7天、28天和60天的经烘烤的生面团具有与按上述传统方式用酵母发酵的生面团非常相似的口味及质地。
另一方面，保存了1天的经烘烤的生面团具有的口味及质地与按传统方法用酵母发酵的生面团有一些差异。这可以用下列事实解释，在保存的第一天过程中，Lti酵母还没有产生使生面团十分相似于传统生面团的足量的气味和气体。

Claims (17)

1.制备具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其特征在于，首先将具有Lti特性的单倍体酿酒酵母菌株与至少具有一个活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因的单倍体酿酒酵母菌株进行杂交，然后在第二阶段，将分离子代进行杂交，并且最后，选出具有Lti表现型、活化的但受分解代谢抑制的Mal表现型，和在分批补料方法中具生长能力的原养型二倍体菌株。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在第二阶段，将各自来自于不同的第一杂交组合的分离子代进行杂交。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，在酵母中，活化的但受分解代谢抑制的MAL等位基因是组成型的或诱导型的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，为检测所要选择的所述二倍体菌株的Lti特性，将其在3至30℃之间的温度下检测几天内烤制用生面团中产生的CO2量。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测所要选择的所述二倍体菌株在分批补料方法中的生长能力，是在需要碳源呼吸代谢的一种培养基中进行的。
6.根据权利要求1的方法制备的工业用面包酵母菌株酿酒酵母，它在分批补料方法中的生长产率大于0.5克干生物量/每克糖，在最高达8℃时CO2产生量低于7ml/h/kg生面团，在最高达12℃时CO2产生量低于12ml/h/kg生面团，并且在含有麦芽糖的培养基中培养4天后，在最高达18℃温度时CO2产生量还低于10ml/每克浓缩酵母。
7.根据权利要求6所述的工业用面包酵母菌株酿酒酵母，其特征在于，在最高达12℃时它具有低于3ml/h/kg生面团的CO2生产量。
8.根据权利要求6所述的工业用面包酵母菌株酿酒酵母，其保藏号为CCTCC M95006。
9.权利要求6-8中任何一项所述的工业用面包酵母菌株用于制备在冷藏保存后在炉子中烘烤的面包房产品的应用。
10.制备经冷藏的并经包装好的烤制用生面团的方法，其中所述生面团制备如下，即通过将权利要求6-8中任何一项所述的酵母至少与水和面粉混合，然后将该生面团包装于有排气阀门的容器中。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将所述生面团在冷藏温度下混合并然后进行包装。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将生面团在包含氮气或二氧化碳或其两者的混合物的大气中包装。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将酵母以0.1-1％浓缩或再水合酵母的干物质量的量与生面团混合。
14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述酵母含有贮存海藻糖。
15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，向所述生面团中加入1.2至2％的NaCl。
16.根据权利要求10-15中任何一项所述的方法制备的冷藏的并经包装好的烤制用生面团。
17.根据权利要求16的烤制用生面团，其特征在于，将其于冷藏温度下保存至少1天至多60天。
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