ES2713054T3 - Cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, cepas esencialmente derivadas de ella y uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae, depositada con el número de acceso DSM 29004 ante la autoridad de depósito internacional Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

Description

DESCRIPCION

Cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, cepas esencialmente derivadas de ella y uso de las mismas

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a una cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae aislada de una masa fermentada espontaneamente, que puede permanecer viable a temperaturas por debajo de 80C e inactiva para la produccion de dioxido de carbono, y que es capaz de restablecer la capacidad de fermentacion y leudacion normal cuando se desplaza al intervalo de temperatura optimo. Ademas, la invencion se refiere a masas solidas y fluidas, que comprenden al menos agua, harina y levadura segun la invencion, a los usos de tales masas y a su produccion.

Estado de la tecnica

[0002] La especie Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) Meyen ex E. C. Hansen (1883) es la especie del genero Saccharomyces, representada por la cepa tipo Saccharomyces cerevisiae CBS 1171T (Vaughan-Martini & Martini, 2011). Es una especie de levadura definida como domesticada, y su entorno ideal son los procesos industriales que involucran la fermentacion de sustratos ricos en azucar, tales como el mosto de la uva, la cerveza de malta y la masa de harina para panaderia y confiteria. Desde el punto de vista morfoogico, se caracteriza por celulas elipsoidales que en el estado asexual se reproducen por brotes multilaterales y rara vez forman pseudohifas posiblemente no septadas (Vaughan-Martini & Martini, 2011). Las cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae pueden ser haploides, aunque a menudo se encuentran en un estado diploide o ploidia superior. Las cepas aneuploides no son raras, incluso para las cepas de interes tecnologico con aplicaciones en enologia, elaboracion de cerveza y elaboracion de pan (Legras y col., 2007). En su reproduccion sexual, la conjugacion tiene lugar entre celulas de diferentes tipos de apareamiento. Mas comunmente, las celulas con ploidia igual o mayor a dos se convierten directamente en asci. De hecho, los eventos de conjugacion se consideran raros para la especie de Saccharomyces cerevisiae, ya que se sabe que en ambientes naturales ocurre a muy baja concentracion; aunque la concentracion celular aumenta durante los procesos de fermentacion realizados por el hombre, la concentracion elevada de azucar reprime la conjugacion debido al llamado efecto Crabtree. Los asci contienen de una a cuatro ascosporas de forma esferica o elipsoidal corta (Vaughan-Martini & Martini, 2011).

[0003] La fermentacion es normalmente vigorosa para la especie Saccharomyces cerevisiae. Esta especie fermenta glucosa, sacarosa, maltosa y rafinosa. No fermenta lactosa, trehalosa y melibiosa. Fermenta galactosa de forma variable. No se ha observado crecimiento sobre nitrato como unica fuente de nitrogeno. No se producen almidon o compuestos similares. Las temperaturas de crecimiento optimas estan comprendidas entre 25 0C y 30 0C, mientras que solo algunas cepas pueden crecer a 37 0C o 40 0C y algunas de ellas representan un posible riesgo para la salud humana ya que se convierten en patogenos oportunistas en individuos con deficiencia inmunologica (Vaughan-Martini & Martini, 2011; Thygesen y col., 2012).

[0004] En cuanto al genoma, su contenido de G+C (% G+C) esta comprendido entre el 39 % y el 41 %. El genoma consta de 16 cromosomas. Los tamanos disponibles del genoma pueden variar desde 10,26 Mbp para la cepa Saccharomyces cerevisiae CLIB382 (GeneBank Assembly ID: GCA_000209345.1) a 14,27 Mbps para la cepa Saccharomyces cerevisiae Y10 (GeneBank Assembly ID: GCA_000192375.1). El cromosoma mitocondrial es de aproximadamente 0,086 Mb (Foury y col., 1998), aunque se han informado variaciones en el tamano y la secuencia de este importante elemento genetico (Raiser y col., 2012). Pueden estar presentes elementos geneticos extracromosomicos, como los plasmidos, siendo el mas conocido y mejor estudiado el plasmido de 2 pm utilizado como base para desarrollar vectores geneticos para disenar las cepas de interes (Karim y col., 2013).

[0005] Los estudios sobre varias cepas de Saccharomyces cerevisiae se han centrado principalmente en el campo de los productos de panaderia, buscando cepas de levaduras que permitan una conservacion de masa hecha de harina, agua y levadura durante periodos de tiempo superiores a una semana. De hecho, estos productos hechos con levaduras "conocidas" pueden almacenarse a temperaturas de refrigeracion (4-8 0C) solo por unos dias. Esto se debe a que las levaduras "conocidas" son insensibles a tales temperaturas y continuan con su actividad de fermentacion, produciendo dioxido de carbono y etanol como metabolitos finales. Despues de 3 dias de almacenamiento a temperatura refrigerada, la acumulacion continua de dioxido de carbono dentro de los paquetes de masa causa una hinchazon inaceptable desde el punto de vista de la calidad del producto. Ademas, la actividad metabolica de la levadura continua, lo que repercute negativamente en las propiedades organolepticas y reologicas de la masa. En particular, una vez que se abre el paquete, la masa se caracteriza por olores desagradables debido a un alto contenido de etanol.

[0006] Con el fin de superar este problema, los paquetes sellados con una valvula de escape para el excedente de gas se han probado durante anos. Sin embargo, los principales productores de masa cruda han abandonado gradualmente este tipo de paquetes debido a tres problemas: 1) el coste de la valvula es demasiado alto en comparacion con el coste del paquete y el pequeno valor del contenido del producto; 2) en condiciones donde se usa la cantidad apropiada de levadura para una buena fermentacion, de todos modos, la valvula no permite que las presiones internas y externas del paquete sean iguales. Por lo tanto, es necesario dosificar cantidades muy bajas de levadura incluso cuando se usa la valvula, lo que resulta en una masa poco desarrollada y estructurada; 3) incluso en presencia de la valvula y una presion reducida dentro del paquete, la actividad metabolica de la levadura no se mantiene estable, comprometiendo asi en pocos dias las propiedades reologicas y organolepticas de la masa, lo que resulta en una estructura debilitada de la masa (lo que imposibilita que se extienda posteriormente) y con una importante alteracion del olor y el sabor. Por todas estas razones, se han buscado cepas de Saccharomyces cerevisiae que pueden permanecer inactivas pero viables durante mucho tiempo a temperaturas entre 0 0C y 8 0C y reanudar la actividad metabolica normal, y la consiguiente produccion de dioxido de carbono necesario para la fermentacion, una vez que vuelven a las temperaturas optimas de crecimiento. Esta caracteristica tambien se conoce como "inactivacion a baja temperatura", abreviada como LTi por sus siglas en ingles. Los documentos US5480798 y US5776526 describen cepas de levadura de la especie de Saccharomyces cerevisiae caracterizadas por el fenotipo LTi, que se sugiere aplicar en la fermentacion de la masa. Estas cepas, a saber, S. cerevisiae NCIMB 40328; S. cerevisiae NCIMB 40329; S. cerevisiae NCIMB 40330; S. cerevisiae NClMB 40331; S. cerevisiae NCIMB 40332; S. cerevisiae NCIMB 40611; S. cerevisiae NCIMB 40612; S. cerevisiae NCIMB 40613; S. cerevisiae NCIMB 40614 y S. cerevisiae NCIMB 40615 se obtuvieron mediante tecnicas in vitro y seleccion posterior. Por lo tanto, el objetivo de la presente invencion es proporcionar una cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae desprovista de las desventajas mencionadas anteriormente de las cepas conocidas que ya estan en uso para la misma aplicacion.

Sumario de la invencion

[0007] La invencion se refiere, por lo tanto, a una cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae depositada con numero de acceso (o numero de registro) DSM 29004 ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

[0008] De acuerdo con la presente invencion, dicha cepa de levadura, aislada de la masa de levadura espontanea, puede permanecer viable a temperaturas por debajo de 8 °C, en presencia de una actividad de agua menor o igual a 0,98, en un estado inactivo con respecto a la produccion de dioxido de carbono y puede restaurar la capacidad normal de fermentacion y leudacion cuando se devuelve a un intervalo de temperatura optimo.

[0009] En otro aspecto, la invencion se refiere, por lo tanto, a una masa solida o fluida que comprende al menos agua, harina y levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, depositada con el numero de acceso DSM 29004.

[0010] De acuerdo con otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de la cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, depositada con el numero de acceso DSM 29004 ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, para la produccion de masas solidas o fluidas.

[0011] De acuerdo con otro aspecto mas, la invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de una masa refrigerada en forma solida o fluida, preparada mezclando al menos agua, harina y levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae con el numero de acceso DSM 29004 ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, en el que dicha masa se empaqueta en un recipiente.

[0012] Por lo tanto, la cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae segun la presente invencion permanece sorprendentemente inactiva, aunque viable durante un largo tiempo, a temperaturas por debajo de 80C y reanuda la actividad metabolica normal produciendo dioxido de carbono, lo que permite la fermentacion cuando se devuelve a temperaturas optimas para el crecimiento, y en esto su comportamiento es dramaticamente distinto de las levaduras de cerveza "conocidas" caracterizadas por el comportamiento mencionado anteriormente e inconvenientes con respecto al almacenamiento de masas crudas.

[0013] En una realizacion adicional mas, la invencion se refiere a un proceso para la preparacion de un medio que tiene una alta concentracion de nitrogeno alfa-amino, que comprende las etapas de:

a. cultivo de la cepa de levadura DSM 29004 en un medio de extracto de malta de cebada y de malta de trigo durante al menos 36 horas;

b. separacion de la levadura del medio, preferiblemente por filtracion o por centrifugacion;

c. obtencion de un medio que tiene una alta concentracion de nitrogeno alfa-amino superior a 300 mg/l, en el que el nitrogeno alfa-amino no se agrega al medio, sino que resulta del crecimiento de la levadura.

[0014] Definiciones en la presente invencion:

- Se entiende por “cepa DSM 29004” una cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, presentada el 01.07.2014 con el numero de acceso (o numero de registro) DSM 29004 ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; - Se entiende por "manipulacion genetica" cualquier intervencion tecnica destinada a dirigir el proceso de adquisicion de caracterfsticas geneticas especfficas que se expresan como rasgos fenotfpicos correspondientes, comprendiendo las intervenciones tecnicas (Sturley & Young, 1986): (i) cruce de cepas naturales, seguido por la seleccion; (ii) produccion de hfbridos seguido de seleccion; (iii) transformacion, es decir, insercion de ADN exogeno en cromosomas o en el genoma mitocondrial, u otros elementos geneticos tales como plasmidos. (iv) La mutagenesis aleatoria inducida generalmente seguida de la seleccion y/o produccion de hfbridos (Nevoigt 2008) se puede agregar como un modo adicional de manipulacion;

- Se entiende por "variante esencialmente derivada" una variante de la cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, depositada en el DSMZ el 01.07.2014 con el numero de acceso DSM 29004, que puede rastrearse mediante un perfilado de ADN microsatelite o debido a un rasgo genetico distintivo detectable mediante secuenciacion del genoma y analisis comparativo. En el presente caso, los perfiles de ADN microsatelite de las variantes esencialmente derivadas pueden ser identicos al DSM 29004, pero pueden tener secuencias diferentes a este en regiones genomicas distintas a los loci de ADN microsatelite como resultado de mutaciones espontaneas, mutaciones inducidas, hibridaciones u otros metodos de manipulacion genetica. Una posible realizacion de cualquier variante esencialmente derivada de la cepa DSM 29004 es un linaje de la cepa DSM 29004 depositada en el DSMZ el 01.07.2014 con el numero de acceso DSM 29004 que comparte con ella los mismos perfiles de ADN microsatelite para 10 loci, tal como se indica en la Tabla 3, pero se caracteriza por una mayor tolerancia al estres osmotico y una mayor capacidad de supervivencia tras el secado durante la produccion de la cepa DSM 29004 como levadura seca activa. La secuencia del genoma de este nuevo linaje derivado esencialmente de la cepa DSM 29004 podrfa caracterizarse por una secuencia genomica diferente de la cepa DSM 29004 hasta en un 30 %, a excepcion de los loci de ADN microsatelite.

- Se entiende por “cepa de levadura inactiva pero viable” una cepa de levadura que no produce dioxido de carbono o produce cantidades casi imperceptibles del mismo, pero que puede reanudar la actividad metabolica y mantener el proceso de fermentacion de una masa a base de harina y agua, triplicando el volumen de la masa original al pasar a la temperatura optima de crecimiento;

- "Vigor fermentativo" se refiere a la actividad de una cepa de levadura para consumir los azucares disponibles y producir dioxido de carbono, permitiendo asf la fermentacion con la textura deseada de la masa fermentada; - Se entiende por “productos de panadena" pan, pizza, pan plano (focaccia), bollos salados pequenos (tigelle), pero tambien productos con levadura adecuados para frefr en forma de rectangulos de masa inflada frita (gnocco frito) y empanadillas fritas (panzerotti);

- "Atmosfera modificada" o "atmosfera protectora" se refiere a una atmosfera con mezcla de gases que incluye dioxido de carbono en porcentajes de 0 % a 60 % y nitrogeno de 0 % a 80 %, preferiblemente 50 % de dioxido de carbono y 50 % de nitrogeno;

- La "ausencia sustancial de produccion de dioxido de carbono" puede ocurrir cuando se agrega levadura a una masa hecha de harina y agua. Dicha mezcla mantenida entre 00C y 80C da como resultado un posible aumento de la concentracion de dioxido de carbono en el paquete que comprende del 0 % al 5 % de la concentracion inicial justo despues de sellar el paquete. La hinchazon del paquete sellado podrfa ser una senal indirecta de que la produccion de gas por parte de la levadura esta por encima del rango establecido.

- "medio de crecimiento" (sinonimos: medio de crecimiento/caldo de cultivo/caldo de crecimiento) se refiere a un sustrato que contiene todos los compuestos (factores) requeridos por un microorganismo para la replicacion celular que resulta en el aumento del numero de celulas individuales y el crecimiento de la poblacion. En este contexto, los microorganismos estan pensados principalmente como levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae y bacterias del acido lactico que pertenecen a los generos Lactobacillus, Pediococcus y Leuconostoc. Los factores requeridos por los microorganismos para su crecimiento en el medio pertenecen principalmente a las categorfas: fuente de carbono, fuente de nitrogeno asimilable (constituida por amonfaco y aminoacidos libres, el ultimo tambien conocido como FAN), vitaminas y sales (oligoelementos). Las fuentes tfpicas de carbono son la melaza de cana de azucar, la melaza de remolacha, el extracto de malta de cebada y el extracto de malta de trigo;

- "medio desechado" se refiere a uno de los componentes obtenidos despues de la separacion y recoleccion de las celulas de levadura viables del medio de crecimiento, que se caracteriza por una menor concentracion en la fuente de carbono y nitrogeno asimilable, ya que se convierten en masa celular durante el crecimiento de las levaduras, pero que todavfa contiene FAN y otros factores esenciales, tambien derivados del metabolismo de las levaduras cultivadas;

- “celula no vital/celulas no viables, extractos celulares, lisado celular” se refiere a subproductos derivados del crecimiento de la cepa DSM 29004 en un medio de cultivo. Por lo tanto, los residuos celulares derivados de celulas no viables, extractos celulares y lisado celular pueden separarse a partir de celulas viables mediante centrifugacion y/o filtracion, y luego recuperarse en el medio desechado. La composicion de celulas no vitales/celulas no viables, extractos celulares y lisado celular esta estrictamente relacionada con las propiedades metabolicas y fisiologicas unicas de la cepa DSM 29004.

Descripcion de las figuras

[0015] A continuacion, la invencion se describira en detalle y con referencia a las Figuras adjuntas, en las que: La Figura 1 muestra la imagen de un gel de agarosa que muestra los resultados de la PCR especifica de especie para Saccharomyces cerevisiae, lo que confirma que la cepa DSM 29004 pertenece a esta especie, como se describe en el Ejemplo 1. El orden de carga es el siguiente: M) marcador de tamano O'GeneRuler DNA Ladder Mix, Ready-to-Use 100 to 10.000 bp (Thermo Scientific); 1) Saccharomyces cerevisiae DSM 29004; 2) Saccharomyces cerevisiae CBS 1171T; 3) Sin control de plantilla;

La Figura 2a muestra, en una reproduccion de la imagen de un gel de agarosa, resultados de la PCR que muestran el perfil de ADN microsatelite para los loci SC8132X, YOR267C SCPTSY7 y para el locus C5 despues de la electroforesis en gel de agarosa al 3 % p/v, como en el Ejemplo 1. El orden de carga es el siguiente: M) marcador de tamano O'GeneRuler DNA Ladder Mix, Ready-to- Use 100 to 10.000 bp (Thermo Scientific); 1) Saccharomyces cerevisiae DSM 29004; 2) Saccharomyces cerevisiae CBS 1171T; 3) Sin control de plantilla; La Figura 2b muestra la foto de un gel de agarosa con los resultados de la PCR mostrando el perfil de ADN microsatelite los loci SC8132X, YOR267C SCPTSY7 y para el locus C5 despues de la electroforesis en gel de agarosa al 3 % p/v, como se indica en el Ejemplo 8. El orden de carga es el siguiente M) marcador de tamano O'GeneRuler DNA Ladder Mix, Ready-to- Use 100 to 10.000 bp (Thermo Scientific); 1) Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40611; 2) S. cerevisiae NCIMB 40612; 3) S. cerevisiae NCIMB 40613; ⁴ ) S. cerevisiae NCIMB 40614; 5) S. cerevisiae ⁿCⁱMB 40615; 6) S.cerevisiae NCIMB 40328; 7) S. cerevisiae NCIMB 40329; 8) S. cerevisiae NCIMB 40330; 9) S. cerevisiae NCIMB 40331; 10) S.cerevisiae NCIMB 40332; 11) S. cerevisiae DSM 29004; 12) S. cerevisiae CBS 1171t ; 13) Sin control de plantilla.

La Figura 3 muestra los perfiles de ADN microsatelites para los loci YGL139W, YFR028C, YGL014W, YOL109W, YML091C, YLL049W, YBR240C, YDR160W, YPL009C, YOR267C por separacion de fragmentos en un capilar como se detalla en el Ejemplo 1. Los tamanos (*) se expresan en pares de bases (bp) y con un error de /- 1 bp. Se muestran los picos principales observados para cada locus, hasta un maximo de dos;

La Figura 4 muestra los datos del panel de prueba mostrados en un diagrama de Kiviat o “grafico radar” que informa de los datos de multiples variables: apariencia de la masa, olor de la masa, apariencia del producto cocido, alveolacion de la masa, suavidad, olor del producto cocido, sabor general y agrado, como se describe en el Ejemplo 7.

La Figura 5 muestra la representacion grafica del analisis de componentes principales, como se describe en el Ejemplo 8.

La Figura 6 muestra, en una reproduccion, uno de los dos perfiles cromatograficos replicados que representan los compuestos volatiles obtenidos por fermentacion del medio M4 a base de extractos de malta de cebada y trigo con la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM29004 durante 72 horas a 27 0C en un matraz agitado, como se indica en el Ejemplo 10.

La Figura 7a. muestra un cultivo liquido de la cepa Lactobacillus sanfranciscensis LMG 17498T en el medio DSM 225 (conocido tambien como "Dough Like Medium") producido segun el protocolo publicado por DSMZ y basado en un extracto de levadura fresca de la cepa DSM 29004 como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 7b. muestra la cinetica de crecimiento de Pediococcus acidilactici LMG 11384^t en medio MRS suplementado, en la proporcion 1:10 v/v, con el medio desechado obtenido despues del crecimiento de las cepas de levadura DSM 29004 y CBS 1171T en medio M4. MRS sin suplementos es el medio de control, como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 7c. muestra la cinetica de crecimiento de Pediococcus pentosaceus LMG 11488T en medio MRS suplementado, en la proporcion 1:10 v/v, con el medio desehado obtenido despues del crecimiento de las cepas de levadura DSM 29004 y CBS 1171T en medio M4. MRS sin suplementos es el medio de control, como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 7d. muestra la cinetica de crecimiento de Leuconostoc mesenteroides LMG 6893T en medio MRS suplementado, en la proporcion 1:10 v/v, con el medio desechado obtenido despues del crecimiento de las cepas de levadura DSM 29004 y CBS 1171T en medio M4. MRS sin suplementos es el medio de control, como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 7e. muestra la cinetica de crecimiento de Lactobacillus plantarum DSM 20174T en medio MRS suplementado, en la proporcion 1:10 v/v, con el medio desechado obtenido despues del crecimiento de las cepas de levadura DSM 29004 y CBS 1171T en medio M4. MRS sin suplementos es el medio de control, como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 7f. muestra la cinetica de crecimiento de Lactobacillus brevis DSM 20054T en medio MRS suplementado, en la proporcion 1:10 v/v, con el medio desechado obtenido despues del crecimiento de las cepas de levadura DSM 29004 y CBS 1171T en medio M4. MRS sin suplementos es el medio de control, como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 7g. muestra la cinetica de crecimiento de Lactobacillus fermentum LMG 6902T en medio MRS suplementado, en la proporcion 1:10 v/v, con el medio desechado obtenido despues del crecimiento de las cepas de levadura DSM 29004 y CBS 1171T en medio M4. MRS sin suplementos es el medio de control, como se describe en el Ejemplo 14.

Descripcion detallada de la invencion

[0016] Por lo tanto, la invencion se refiere a una cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, presentada el 01.07.2014 con el numero de acceso DSM 29004 ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

[0017] Como ejemplo no limitativo, un rasgo distintivo de la cepa de Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 y de las cepas esencialmente derivadas se proporciona mediante el perfil de ADN microsatelite, definido por el analisis de polimorfismos de longitud en loci caracterizados por la presencia de Secuencias Simples Repetidas o SSR.

[0018] La cepa de acuerdo con la presente invencion se caracteriza genotipicamente y es identificable de manera clara y definida por rasgos especificos identificados dentro del genoma. Esta cepa ha evolucionado espontaneamente, sin ninguna intervencion directa o manipulacion genetica, y tiene las caracteristicas relevantes para su aplicacion industrial tipicas de una cepa de "inactivacion a baja temperatura" o LTi, representada por la capacidad de ser almacenada en una forma inactiva pero viable a bajas temperaturas (en un rango entre 0 °C y 8 0C) y reactivada simplemente aumentando la temperatura ambiente a un rango entre 12 0C y 38 0C, preferiblemente entre 25 0C y 28 0C. La reactivacion se manifiesta como el consumo de los azucares disponibles y la produccion de dioxido de carbono que, en condiciones adecuadas, hace posible la fermentacion con la alveolacion deseada de la masa fermentada.

[0019] La cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 de una masa fermentada espontaneamente (masa madre) de origen italiano, aislada por diluciones seriadas en solucion salina seguidas de cultivo en medio selectivo de Saccharomyces y refrescada periodicamente mediante la adicion de una mezcla de agua y harina sin levadura, se presento ante Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 1 de julio de 2014 y se le asigno el numero de deposito DSM 29004.

[0020] La cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae de acuerdo con la presente invencion, permanece, por tanto, sorprendentemente inactiva, pero vital durante mucho tiempo, a temperaturas inferiores a 80C y luego retoma la actividad metabolica normal, con produccion de dioxido de carbono que permite el proceso de fermentacion, cuando se devuelve a las temperaturas optimas para el crecimiento, y en esto su comportamiento es drasticamente distinto de las levaduras de cerveza "conocidas" caracterizadas por el comportamiento y los inconvenientes mencionados anteriormente con respecto al almacenamiento de masas crudas.

[0021] Para verificar y determinar las caracteristicas de la cepa DSM 29004, y para descartar la superposicion de esta cepa con las cepas descritas en el estado de la tecnica, se realizo una comparacion de genotipos entre DSM 29004 y las cepas de S. cerevisiae NCIMB 40611, NCIMB 40612, NCIMB 40613, NCIMB 40614, NCIMB 40615, NCIMB 40328, NCIMB 40329, NCIMB 40330, NCIMB 40331, NCIMB 40332 y CBS1171T. En el Ejemplo 8 se describen las etapas experimentales y los resultados mostrados en la Figura 2b.

[0022] En la Figura 2b se muestra claramente que la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM29004 en el carril 11 es diferente de las otras cepas que se describen en el estado de la tecnica debido a tres bandas especificas (banda A, banda B y banda C) en el patron de ADN de microsatelite, comprendidas en el rango entre 350 pb y 500 pb.

[0023] Los resultados indican claramente que DSM 29004 es una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae con caracteristicas mejoradas.

[0024] En una realizacion preferida, la cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, depositada con el numero de acceso DSM 29004 en el DSMZ el 01.07.2014 y las cepas esencialmente derivadas, se caracteriza por el hecho de que dicha cepa permanece viable durante al menos 20 dias. a una temperatura comprendida entre 0 0C y 8 0C, y dicha cepa, posteriormente desplazada a una temperatura entre 12 0C y 38 0C, muestra el vigor fermentativo y la actividad de crecimiento. La ausencia sustancial de produccion de dioxido de carbono es evidente en el caso de que la levadura se agregue a una masa hecha de harina y agua. Dicha mezcla mantenida entre 00C y 8 0C no provoca el hinchamiento de un paquete sellado, una clara senal de que la produccion de gas por parte de la levadura tiende a cero. Por otra parte, el vigor fermentativo se hace evidente cuando la misma masa, despues de 20 dias de almacenamiento en un paquete sellado a temperaturas variables en un rango comprendido entre 0 0C y 8 0C, se deja a temperatura ambiente (20-25 0C) durante aproximadamente 20 minutos, alcanzando un volumen que triplica su volumen original, mostrando asi una excelente accion fermentativa de la levadura. La recuperacion de la actividad fermentativa de la levadura a temperaturas de 20-25 0C (temperatura ambiente), despues de una etapa de almacenamiento refrigerado, permite tener productos terminados que se caracterizan por una buena alveolacion y suavidad y textura crujiente de la masa, al mismo tiempo. La cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 ha demostrado ser extremadamente ventajosa para su aplicacion industrial en actividades de fermentacion, cuando se utiliza como ingrediente alimentario.

[0025] En otra realizacion, la cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, depositada con el numero de acceso DSM 29004 en el DSMZ el 01.07.2014, se caracteriza porque dicha cepa permanece viable durante al menos 30 dias a una temperatura entre 0 0C y 6 0C, y posteriormente muestra vigor fermentativo y actividad de crecimiento a temperaturas comprendidas entre 12 0C y 380C, preferiblemente entre 25 0C y 28 0C.

[0026] La ausencia sustancial de produccion de dioxido de carbono es evidente en el caso de que la levadura se anada a una masa hecha de harina y agua. Dicha mezcla mantenida entre 0 ° y 60C no produce un hinchamiento de un paquete sellado, lo que es una clara senal de que la produccion de gas por parte de la levadura tiende a cero. Por otro lado, el vigor fermentativo se hace evidente cuando la misma masa, despues de 30 dias de almacenamiento en un paquete sellado a temperaturas variables en el rango comprendido entre 00C y 80C, se deja a temperatura ambiente (20-25 0C) durante aproximadamente 20 minutos, alcanzando un volumen que es 2,5 veces superior al volumen original, demostrando asi una importante accion fermentativa de la levadura.

[0027] Esta caracteristica tambien se denomina "inactivacion a baja temperatura", abreviada como LTi. El caracter LTi es multifactorial y depende de multiples loci definidos como “loci de caracteres cuantitativos" (QTL); el genotipo asociado con el fenotipo de interes aun no se ha descrito. Los metodos de manipulacion genetica dirigida no pueden producir el resultado deseado en estos casos, por lo que a menudo se obtienen mejores resultados mediante una estrategia de manipulacion "ciega", como la conjugacion de cepas seleccionadas por reproduccion sexual. De acuerdo con los conocimientos actuales, todas las cepas de la especie de Saccharomyces cerevisiae que se describen como poseedoras de esta caracteristica se han obtenido mediante manipulacion genetica, en particular mutagenesis aleatoria inducida, seguida de conjugacion o produccion de hibridos con otras cepas seleccionadas. En un caso particular, el proceso consistio en la fusion de cepas obtenidas por mutagenesis con dos cepas de levadura seleccionadas por su alto vigor fermentativo y normalmente utilizadas en el campo de los productos de panaderia. Las cepas naturales con caracteristicas de LTi aisladas de la masa con levadura natural de origen italiano no se conocian previamente.

[0028] En un aspecto preferido, la cepa de levadura de acuerdo con la presente invencion se caracteriza por que dicha cepa muestra un mayor vigor fermentativo en la fermentacion de la masa, cuando se cultiva previamente en un medio de extracto de malta de cebada y de malta de trigo que cuando se cultiva en un medio basado en melazas, a una temperatura comprendida entre l2 0C y 38 0C, preferiblemente entre 25 0C y 28 0C.

[0029] Preferiblemente, dicho medio de extracto de malta de cebada y malta de trigo se encuentra en una concentracion que oscila entre 0,1 g/l y 100 g/l, preferiblemente comprendido entre 40 g/l y 80 g/l, y dicho medio basado en melazas tiene una concentracion de glucosa que oscila entre 0,1 g/l y 200 g/l, preferiblemente entre 20 g/l y 100 g/l.

[0030] En una realizacion adicional, la invencion se refiere a una masa solida o fluida que comprende al menos agua, harina y levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae depositada con el numero de acceso DSM 29004.

[0031] Se han descrito otras caracteristicas ventajosas de la cepa de acuerdo con la invencion.

[0032] Sorprendentemente, la cepa DSM29004 producida con el medio tradicional a base de melaza libera aromas frutales. El medio a base de melaza generalmente tiene un olor desagradable, al igual que la levadura que crece en ese medio. Esto suele causar problemas con el sabor de la masa que contiene levadura cultivada en medios a base de melaza. Sorprendentemente, el olor de la cepa de acuerdo con la invencion, cultivada en medio a base de melaza durante al menos 72 horas, es sustancialmente mas agradable que las cepas normales de Saccharomyces cerevisiae, lo que anade sabores agradables a la masa, en lugar de empeorar el sabor de la misma masa (segun se indica en el Ejemplo 9).

[0033] Despues del crecimiento de la cepa DSM 29004 en un extracto de malta de cebada y un extracto de malta de trigo suplementado con fuentes de nitrogeno, otras sales y vitaminas (como se muestra en la Tabla 8), el medio desechado resultante se analizo para determinar el contenido de nitrogeno alfa-aminico (la fuente de nitrogeno tambien conocida cuando se hace referencia a la levadura como FAN o nitrogeno amino libre, y como nitrogeno alfaaminico para bacterias) y se descubrio que el medio desechado del crecimiento de DSM 29004 se caracterizaba por un mayor contenido de nitrogeno alfa-aminico en comparacion con las otras cepas analizadas como se describe en el Ejemplo 13. El nitrogeno alfa-aminico es una fuente de factores esenciales para el crecimiento de microorganismos, como las bacterias del acido lactico, especialmente las bacterias del acido lactico que estan bien adaptadas a la masa y a la masa fermentada.

[0034] La presencia de bacterias del acido lactico es esencial para mejorar la textura y los sabores de la masa, dandole una fragancia mas natural (como se describe en el Ejemplo 14).

[0035] Se observo que el medio mostrado en la Tabla 8, una vez descartado despues del crecimiento de DSM29004, tiene sorprendentemente la capacidad de aumentar el crecimiento de bacterias del acido lactico que pertenecen al genero Pediococcus, al mismo tiempo sin tener efectos negativos en el crecimiento normal de las otras bacterias del acido lactico. Tambien se observo que dicho medio desechado se caracteriza por la ausencia de dioxido de azufre, que, sin embargo, suele ser producido por la levadura durante la fermentacion. La presencia de dioxido de azufre inhibe el crecimiento de las bacterias del acido lactico, por lo que no es ventajosa en la fermentacion de la masa (Ejemplo 12) y representaria un obstaculo insuperable en el caso de que el medio desechado se anadiera a la masa junto con la cepa de levadura como suplemento. Por el contrario, el medio desechado despues del crecimiento de DSM29004, al estar sustancialmente exento de dioxido de azufre, es adecuado para ser anadido a una masa como suplemento, aprovechando asi su mencionada capacidad para potenciar el crecimiento de bacterias del acido lactico.

[0036] Al mismo tiempo, la presencia de extractos de malta de cebada y de trigo en el medio (como se muestra en la Tabla 8) induce la expresion de los genes relacionados con la fermentacion de la maltosa. La maltosa es el azucar presente principalmente en la masa de productos horneados. Por lo tanto, la cepa DSM 29004 cultivada en un medio como el que se muestra en la Tabla 8, una vez en una masa de producto horneado, utilizara la maltosa de manera mas eficaz y mostrara mayor celeridad, mayor rapidez y mas vigor que la cultivada en un medio a base de melazas, favoreciendo asi la fermentacion de la masa (vease el Ejemplo 11). Esta caracteristica de una mejor fermentacion de la cepa DSM 29004 cultivada en un medio como el de la Tabla 8 representa una ventaja consistente en el uso de las cepas de Lti, ya que se sabe que estas cepas se muestran, incluso a temperaturas que generalmente son optimas para la fermentacion de Saccharomyces cerevisiae una actividad metabolica mas baja y esto generalmente conlleva una fermentacion insuficiente o un largo tiempo necesario para una fermentacion decente. Los productos horneados como el pan, la pizza, el pan plano (focaccia), los bollos salados (tigelle), pero tambien los productos con levadura adecuados para freir productos como los rectangulos de masa inflada frita y las empanadillas fritas se obtienen a partir de masas a base de harina. Las realizaciones implican la produccion de una masa que puede estar en forma solida o fluida. La principal diferencia entre estas masas es la mayor cantidad de agua que se agrega como ingrediente de la mezcla liquida.

[0037] En particular, la masa fluida se refiere a una mezcla con viscosidad, medida por un viscosimetro rotacional Brookfield, comprendida entre 47.000 cP (mPa-s) y 800 cP (mPa-s) a 50 rpm, con impulsor R7 y R3, respectivamente, o entre 36.000 cP (mPa-s) y 600 cP (mPa-s) a 100 rpm, con impulsor R7 y R3 respectivamente, en cada caso a una temperatura de 20 0C. Esta condicion permite obtener una masa fluida deslizante, que en particular se distribuye por gravedad en el espacio disponible una vez que se vierte en los respectivos medios de soporte (bandeja de hornear).

[0038] En particular, se dispone que tales masas contienen harina, principalmente harina de trigo, especialmente una harina de trigo duro o blando o una mezcla de las mismas. Ademas, la harina de trigo es preferiblemente del tipo "0". Sin embargo, debe entenderse que tambien puede emplearse harina de otras fuentes, preferiblemente harina de espelta y posiblemente otras harinas tales como arroz, trigo sarraceno, centeno u otras harinas sin gluten. Tambien se pueden utilizar harinas procedentes de la agricultura ecologica.

[0039] Se dispone que la masa solida contiene harina en una proporcion comprendida entre el 50 % y el 70 % en peso de la masa, aunque es preferible una proporcion comprendida entre el 54 % y el 67 % en peso de la masa. Se establece que la masa solida contiene dicha harina en una proporcion comprendida entre el 43,5 % y el 60,6 % en peso de la masa y preferiblemente entre el 44,5 % y el 50,5 % en peso de dicha masa. En particular, con el fin de obtener una masa fluida con las caracteristicas mencionadas anteriormente, dicha harina debe mostrar una fuerza igual o superior a 220 W medida por el alveografo Chopin.

[0040] Se pretende que estas masas contengan agua. En el caso de la masa solida, el agua se agrega a la harina en una proporcion comprendida entre el 30 % y el 40 % en peso de la masa y preferiblemente en una proporcion comprendida entre el 33 % y el 36 % en peso de la masa. En el caso de la masa fluida, el agua se agrega en una proporcion comprendida entre el 35,5 % y el 56,5 % en peso de la masa, pero preferiblemente en una proporcion entre el 44,5 % y el 50,9 % en peso de la masa.

[0041] Para obtener una masa solida, se agrega la levadura DSM 29004 o una cepa esencialmente derivada en una proporcion comprendida entre 0,4 % y 2,4 % en peso de masa, preferiblemente en una proporcion comprendida entre 0,8 % y 1,3 % en peso de masa. Para obtener una masa fluida, la cepa de levadura DSM 29004 o una cepa esencialmente derivada se agrega en una proporcion de hasta un maximo de 1,8 % en peso de masa, preferiblemente en una proporcion comprendida entre 0,6 % y 0,8 % en peso de masa.

[0042] Se inocula entre 1-105 CFU/g de masa y 1-107 CFU/g de masa, preferiblemente 5-106 CFU/g de masa, de la levadura DSM 29004 o una cepa esencialmente derivada. Ademas, se anade sal o cloruro de sodio para obtener dicha masa. En particular, dicha sal esta en una cantidad de hasta un maximo de 2 % en peso de masa, preferiblemente en una cantidad comprendida entre 0,7 % y 1,8 % en peso de masa. Ademas, para obtener dicha masa, se anaden preferiblemente una masa de aceite y/o grasa dietetica, o una mezcla de aceites y/o grasas dieteticas. Preferiblemente se usa aceite de oliva y mas preferiblemente aceite de oliva virgen extra. Dicho aceite y/o grasa dietetica se anade en una proporcion de hasta un maximo de 6 % en peso de masa, preferiblemente en una proporcion comprendida entre 1,9 % y 5,5 % en peso de masa. Tambien se pueden utilizar aceites procedentes de la agricultura ecologica. Ademas, se agrega preferiblemente extracto de malta o harina de grano malteado para obtener dicha masa. Dicho extracto de malta o harina de grano malteado es una proporcion de hasta un maximo de 0,8 % en peso de masa. Tambien se podria utilizar extracto de malta o harina de grano malteado de la agricultura ecologica.

[0043] Preferiblemente, dicha masa tambien contiene un coadyuvante de fermentacion. En particular, dicho coadyuvante de fermentacion comprende una base seca de masa fermentada acida de harina, en particular hecha de trigo blando, gluten, acido L-ascorbico y alfa-amilasa. En particular, dicho coadyuvante de fermentacion esta en una cantidad inferior o igual al 0,6 % en peso de masa. Tambien se podria utilizar un coadyuvante de procesamiento "BIO".

[0044] Ademas, dicha mezcla contiene preferiblemente levadura desactivada. En particular, dicha levadura desactivada esta en una cantidad inferior al 2 % en peso de la masa.

[0045] Un primer procedimiento para hacer un producto de panaderia, en particular pizza, implica mezclar la harina junto con dicho coadyuvante y dicha malta, y la adicion de dicha levadura y dicha levadura desactivada.

[0046] Se anaden agua y aceite o grasa en una etapa posterior y se lleva a cabo una primera mezcla de la masa. Luego se agrega sal y se realiza una segunda mezcla, logrando asi la etapa de una masa para hornear que esta lista para su posterior procesamiento y que se encuentra en forma solida, fluida o sustancialmente fluida de acuerdo con la receta seguida para su elaboracion.

[0047] En el caso de la masa fluida, esta se vierte en una bandeja para hornear y se extiende libremente en el espacio de contencion definido por la bandeja. En el caso de una masa solida, esta se extiende mecanicamente siempre dentro de la bandeja respectiva. Dicha masa estirada se puede definir como la base el producto de panaderia.

[0048] La base asi obtenida se entrega a una celda de fermentacion, donde se somete a una fermentacion conveniente. En particular, dicha fermentacion se realiza en un entorno adecuadamente controlado en cuanto a temperatura y humedad, y en particular se extiende durante un intervalo de tiempo de aproximadamente dos horas.

[0049] Posteriormente, el tomate fluido o sustancialmente fluido, particularmente en forma de salsa, pulpa o pasta de tomate, se extiende sobre la superficie superior de dicha base.

[0050] En una siguiente etapa, la base cubierta con tomate se cocina en un horno especial.

[0051] A continuacion, se anade una capa a la superficie superior de la base, que preferiblemente consistira simplemente en trozos de queso mozzarella.

[0052] Obviamente, esta etapa no estaria presente en la preparacion de productos tales como pan plano, bases para pizza o similares.

[0053] Posteriormente, el producto podra ser envasado en el paquete respectivo.

[0054] Otro procedimiento muy similar puede proporcionar una etapa de coccion preliminar de la base blanca y la posterior cobertura de la superficie superior con tomate, queso mozzarella y otros ingredientes deseados.

[0055] Sin embargo, debe entenderse que tambien se podria obtener un pan plano correspondiente (focaccia) usando un proceso que proporciona dichas etapas hasta completar la base del producto, obtenida despues de la fermentacion del producto, seguida, por ejemplo, de la cobertura de la superficie superior con aceite y otros posibles ingredientes, y la coccion correspondiente.

[0056] Un segundo procedimiento para obtener un producto de panaderia conlleva el envasado directo de la masa, tanto en forma solida como fluida, en un envase adecuado.

[0057] En este caso, inmediatamente despues de mezclar los ingredientes, la masa se divide en partes alicuotas y se fermenta previamente a una temperatura aproximada de 20-25 0C durante un periodo de tiempo de 30 a 60 minutos, preferiblemente 30 minutos. Las diferentes partes alicuotas de la masa se enfrian luego en una celda de enfriamiento adecuada, hasta que la temperatura central del producto alcanza los 40C.

[0058] En un aspecto adicional, la presente invencion comprende una masa dividida en partes alicuotas. Dichas partes alicuotas pueden fermentarse previamente a una temperatura de aproximadamente 20-25 0C durante un periodo de tiempo de 30 a 60 minutos, preferiblemente 30 minutos.

[0059] Posteriormente, las partes alicuotas individuales se envasan en paquetes especiales termosellados o sin sellar. El envasado puede tener lugar en condiciones de atmosfera modificada o atmosfera normal. En cuanto al envasado en atmosfera modificada o protectora, la mezcla de gases incluye el dioxido de carbono utilizado en proporciones de 0 % a 60 % y el nitrogeno utilizado en proporciones de 0 % a 80 %, preferiblemente 50 % de dioxido de carbono y 50 % de nitrogeno.

[0060] En este segundo procedimiento, el consumidor final almacena la masa envasada directamente en el frigorifico o, en cualquier caso, a temperaturas comprendidas en un intervalo de 0 0C a 8 0C, preferiblemente a temperaturas en un intervalo de 00C a 6 0C.

[0061] El producto se almacena en las condiciones anteriores durante un periodo de 20 dias a temperaturas en un intervalo de 00C a 8 0C, preferiblemente durante un periodo de 30 dias a temperaturas en un intervalo de 00C a 6 0C.

[0062] Durante este periodo de almacenamiento, la masa envasada se utiliza para la produccion de un producto de panaderia, tal como pan, pizza y pan plano (focaccia), pero tambien para la produccion de productos fermentados adecuados para freir.

[0063] La masa solida se retira del paquete y se deja reposar a temperatura ambiente (20-25 0C), preferiblemente durante aproximadamente 20-30 minutos. Despues de este tiempo, la masa se enrolla sobre un soporte adecuado espolvoreado con harina y se lleva al tamano deseado manteniendo un grosor de lamina de aproximadamente 4-5 mm. Sin embargo, el grosor y el tamano son variables en funcion del producto final que se desee obtener.

[0064] Para la elaboracion de productos de panaderia, la masa se adorna en la superficie superior con diferentes ingredientes dependiendo del producto que se desea obtener. En el caso de la elaboracion de una pizza, la masa enrollada se cubrira con tomate en forma liquida o sustancialmente liquida, en particular en forma de salsa, pulpa o pasta de tomate, y con trozos de queso mozzarella y otros ingredientes deseados. Tambien es posible planear una etapa de horneado en el horno de la masa enrollada sola, seguido por el relleno de la superficie superior.

[0065] En el caso de la produccion de una focaccia o pan plano, la superficie superior de la base se aceitara con aceite de oliva y se espolvoreara con sal segun se desee.

[0066] La masa enrollada recubierta, en ambos casos, se somete a coccion. De este modo se completa el producto de panaderia.

[0067] Para la elaboracion de productos fermentados adecuados para freir, la fase para la preparacion de la masa corresponde a la descrita para productos horneados. La diferencia esta en la coccion del producto, que no se hace en el horno sino en aceite y/o grasa para freir.

[0068] El uso de una masa fluida implica la apertura del paquete y la masa se debe verter en una bandeja para hornear engrasada. La viscosidad de la masa permite su distribucion por gravedad en el espacio disponible dentro del soporte. En este caso, es posible facilitar la propagacion mediante una ligera accion mecanica para cubrir toda la superficie de la bandeja.

[0069] Se deja reposar la masa a temperatura ambiente (20-25 °C) en la bandeja para hornear cubierta con una pelicula de plastico para evitar el endurecimiento de la superficie.

[0070] En este punto es posible proceder a la elaboracion de productos horneados con las mismas modalidades de preparacion descritas anteriormente.

[0071] Un aspecto adicional de la masa segun la presente invencion es una masa en la que dicha cepa de levadura DSM 29004 de la especie Saccharomyces cerevisiae esta en forma de celulas viables.

[0072] Dicha cepa y las cepas esencialmente derivadas estan en forma de celulas viables. La cepa en cuestion se puede usar para obtener dicha masa como mezcla con otras levaduras y microorganismos viables, no viables y extractos o lisados de levaduras u otros microorganismos.

[0073] Segun un aspecto adicional de la presente invencion, la masa es una mezcla en la que dicha levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae se mezcla con otras levaduras y/o microorganismos viables, no viables, extractos o lisados de otras levaduras y otros microorganismos.

[0074] Segun otro aspecto adicional, la masa de la presente invencion se caracteriza por que no muestra hinchamiento del paquete, desarrollo de olor y sabor anormales o formacion de liquido dentro del paquete cuando se almacena a una temperatura entre 0 0C y 8 0C durante 20 dias, o preferiblemente a una temperatura entre 0 0C y 6 0C durante 30 dias.

[0075] Segun otro aspecto, la invencion se refiere al uso de la cepa de levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, depositada con el numero de registro DSM 29004 ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, para la produccion de masas solidas o fluidas.

[0076] Los usos comprenden la aplicacion para la masa solida o fluida de la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 y las cepas esencialmente derivadas. Como ejemplo no exclusivo, un uso industrial de Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 o las cepas esencialmente derivadas se representa mediante la mezcla con masa a base de harina y el almacenamiento en un estado viable pero inactivo a temperaturas comprendidas entre 00C y 80C, con la propiedad de reactivarse para producir dioxido de carbono cuando se vuelva a un intervalo de temperatura optimo para su crecimiento. La cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 y las cepas esencialmente derivadas se caracterizan por la presencia en su genoma de secuencias de nucleotidos que son unicas en terminos de secuencia de bases, tamano, numero de copias o ubicacion con respecto a las regiones colindantes, que son detectables y reproducibles mediante tecnicas de biologia molecular.

[0077] Segun otro aspecto mas, la invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de una masa refrigerada en forma solida o fluida, en el que la preparacion consiste en mezclar al menos agua, harina y levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae depositada con el numero de acceso DSM 29004 en la ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, en el que dicha masa se envasa en un recipiente. De manera ventajosa, en una realizacion preferida del procedimiento de acuerdo con la presente invencion, dicha masa se envasa en un recipiente con una atmosfera modificada de nitrogeno (N²) de 0 a 80 % y de dioxido de carbono (CO²) de 0 a 60 %, o en un recipiente sellado que contenga atmosfera normal.

[0078] Las masas obtenidas de acuerdo con la presente invencion pueden envasarse en bandejas termoselladas o no termoselladas, e incluso en la fecha de caducidad (es decir, despues de 30 dias) no se observa hinchamiento del envase, desarrollo de olores y sabor anormales ni formacion de liquido dentro del envase. Una vez abierto el envase, el producto se deja reposar y fermentar a temperatura ambiente durante unos 20 minutos antes de estirar la masa. Este tiempo permite que la levadura presente en la masa recupere su vigor fermentativo y permite obtener un producto final caracterizado por una buena alveolacion, agradabilidad y suavidad de la masa.

[0079] En una realizacion adicional mas, la invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de un medio que tiene una alta concentracion de nitrogeno alfa-amino (tambien denominado en el presente documento "medio desechado"), que comprende las etapas de:

a. cultivo de la cepa de levadura DSM 29004 en un medio de extracto de malta de cebada y de malta de trigo durante al menos 36 horas;

b. separacion de la levadura del medio, preferiblemente por filtracion o por centrifugacion;

c. obtencion de un medio que tiene una alta concentracion de nitrogeno alfa-amino superior a 300 mg/l, en donde el nitrogeno alfa-amino no se agrega al medio, sino que resulta del crecimiento de la levadura.

[0080] Una caracteristica del medio es que el DSM 29004, cultivado en el medio descrito en el parrafo anterior, libera durante la fermentacion, preferiblemente: ester etilico del acido octanoico, alcohol feniletilico, ester feniletilico del acido acetico, bencenoacetaldehido, 4-metil-2-heptanona, octanal, ester etilico del acido nonanoico.

[0081] En los ejemplos se describe el uso del medio como suplemento para la masa y como suplemento para mejorar la fermentacion de la masa de especies de bacterias del acido lactico, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sanfranciscensis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici y Pediococcus pentosaceus. Preferiblemente, las bacterias del acido lactico pertenecen al genero Pediococcus spp.

[0082] A continuacion, para ilustrar la presente invencion, se describen ejemplos de realizaciones y procedimientos preferidos de la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1: procedimientos de analisis de la biodiversidad: ADN microsatelite

[0083] La cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae segun se evidencia por el resultado positivo (Figura 1) de la PCR especifica de la especie (Torriani y col., 2004). Ademas, para el mejor conocimiento del estado de la tecnica, se caracteriza por un genotipo unico descrito, en las formas preferidas, por:

- analisis del perfil de ADN microsatelite mediante electroforesis en gel de agarosa al 3 % en peso/volumen (Figura 2) de los productos de amplificacion de la multiplexion por PCR loci SC8132X, YOR267C, SCPTSY7 (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008) y C5 (Legras y col., 2005). Los cebadores utilizados fueron: SC8132X FW y SC8132X RV cada uno a una concentracion de 0,75 pM (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008); YOR267C FW y YOR267C RV cada uno a una concentracion de 0,5 pM (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008); SCPTSY7 FW y SCPTSY7 RV a una concentracion de 2,0 pM (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008) y finalmente los cebadores C5 FW y C5 RV a una concentracion de 0,5 pM (Legras y col., 2005). La reaccion se realizo en un volumen de 20 pl usando 1,5U de ADN polimerasa GoTaq (Promega) en un tampon 1x con adicion de cloruro de magnesio (MgCh) a una concentracion de 3,1 mM y nucleotidos trifosfato (dNTP), cada uno a una concentracion de 0,4 mM. La amplificacion se realizo en el instrumento Nexus Mastercycler Gradient (Eppendorf) con un programa termico que consiste en una etapa de desnaturalizacion inicial a 94 0C durante 4 minutos, seguido de un ciclo a 94 0C durante 30 segundos, 56 °C durante 45 segundos y 72 0C durante 30 segundos, repetido 34 veces, seguido de una ultima etapa de extension a 72 0C durante 10 minutos.

- analisis de perfil de ADN microsatelite para loci YGL139W, YFR028C, YGL014W, YOL109W, YML091C, YLL049W, YBR240C, YDR160W, YPL009C, YOR267C, obtenido por amplificacion en reacciones de PCR separadas, utilizando cebadores descritos en la literatura (Richards y col., 2009), seguido de separacion de los fragmentos en un capilar (Figura 3). El analisis del perfil en el capilar se realizo con el software Peak Scanner 2.0 con los siguientes parametros: "tamano estandar: GS500 (-250)" y "metodo de analisis: tamano predeterminado -NPP".

[0084] Los loci de ADN microsatelite son unos pocos cientos de bases de secuencias dispersas en el genoma, que consisten en repeticiones en tandem de motivos cortos de 1-6 bases. Tambien se conocen como secuencias simples repetidas o SSR. Estos loci se usan ampliamente como marcadores geneticos debido a su difusion, alto grado de polimorfismo y alta reproducibilidad y confiabilidad de sus ensayos de deteccion (Dutech y col., 2007). Estos son loci comunes entre eucariotas (levaduras, mohos, plantas y animales superiores) y rara vez estan presentes en especies bacterianas. El polimorfismo ocurre esencialmente en dos niveles: presencia/ausencia de loci unicos y variaciones de longitud en cada locus debido al numero de repeticiones de un solo motivo de repeticion en tandem.

[0085] El analisis de ADN microsatelite consiste en la amplificacion por PCR de los loci de interes. Los cebadores utilizados para la PCR estan disenados en regiones conservadas que flanquean el locus que se va a analizar. Si el locus esta presente, una parte del ADN que contiene los motivos de repeticion en tandem se obtiene como producto de PCR. La longitud del producto de PCR varia segun la forma alelica presente en el genoma analizado. La presencia de varios loci y su tamano se muestra mediante electroforesis en gel de agarosa. Si los cebadores utilizados estan marcados con una molecula fluorescente, la ejecucion se puede realizar en los capilares utilizados para la secuenciacion de Sanger. Tanto en el gel de agarosa como en el analisis capilar, la migracion de los productos de PCR muestra el tamano de las bandas segun su movilidad relativa. Se conocen docenas de loci diferentes en Saccharomyces cerevisiae (Legras y col., 2005). Algunos tienen un numero limitado de formas alelicas (variantes del mismo locus observadas en cepas de la misma especie) y son poco discriminatorias, mientras que otros se caracterizan por un mayor numero de formas alelicas y, por lo tanto, son mas discriminatorias (Legras y col., 2005 Vaudano & Garcia-Moruno, 2008).

[0086] Segun el mejor conocimiento del estado de la tecnica, la base de datos mas completa de perfiles de ADN microsatelite de cepas pertenecientes a la especie Saccharomyces cerevisiae esta disponible para consulta y consta de 246 perfiles generados por analisis capilar de 11 loci identificados en funcion de su mayor frecuencia alelica, con la excepcion del locus mat a/mat a que solo tiene dos formas. La base de datos generada por Richards y colegas (2009) contiene perfiles de ADN de microsatelite de cepas aisladas en el campo y cepas comerciales de la industria del vino y otros sectores (Richards y col., 2009). En proyectos paralelos, se han desarrollado otros protocolos similares que confirmaron la alta capacidad de los loci de ADN microsatelite para diferenciar diferentes cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae, sin embargo, no hay una base de datos disponible para consulta (Legras y col., 2007). La cepa DSM 29004 tiene un perfil unico de ADN microsatelite, en comparacion con todas las demas cepas descritas en la base de datos producida por Richards y col., 2009.

Ejemplo 2: Comparacion del comportamiento de la cepa DSM 29004 con la cepa tipo de Saccharomyces cerevisiae

[0087] Para diferenciar las propiedades de la cepa DSM 29004 de las cepas estandar de Saccharomyces cerevisiae, se utilizaron la cepa DSM 29004 de Saccharomyces cerevisiae y la cepa del tipo Saccharomyces cerevisiae CBS 1171T para la preparacion de dos masas de pizza identicas que eran diferentes solamente para la cepa de levadura inoculada, y consistio en harina, agua (52 % en peso de la harina), aceite de oliva virgen extra (8,42 % en peso de la harina), sal (1 % en peso de la harina). Las dos cepas de levadura se agregaron al agua de amasado a una concentracion de aproximadamente 1-106 CFU/g. Las dos masas asi obtenidas se envasaron en paquetes sellados en una atmosfera protectora (50 % de nitrogeno y 50 % de CO²), se almacenaron a 6 ° C y se controlaron a lo largo del tiempo.

Comportamiento de la cepa DSM 29004

[0088] Con respecto a la masa con la cepa DSM 29004, durante los primeros 15 dias de almacenamiento refrigerado, se observo una disminucion de aproximadamente 1 ciclo logaritmico en terminos de CFU /g, de 1-106 CFU /g a 1-105 CFU/g, mientras que, durante el periodo restante, hasta 30 dias de almacenamiento, se observo una ralentizacion de la disminucion con un cambio de 1-105 CFU/g a 5-104 CFU/g. Durante estos 30 dias, el paquete sellado nunca mostro signos de hinchazon o aumento de la presion interna.

[0089] La viabilidad y la capacidad de la levadura para dar lugar a masas bien estructuradas y alveoladas tambien se verificaron 15 dias y 30 dias despues de la preparacion.

[0090] En ambas pruebas, la masa se extrajo del paquete, se estiro en la bandeja para hornear y se dejo a temperatura ambiente (23 0C) durante 30 minutos.

[0091] En la prueba realizada el dia 15, la altura de la masa cruda se triplico con respecto a la altura original, demostrando una excelente actividad de la levadura. La masa fermentada durante 30 minutos aumento aun mas, aunque ligeramente, durante la coccion. El producto horneado mostro una alveolacion grande y estructurada que era bastante similar a la obtenida con una masa preparada el mismo dia.

[0092] En una prueba realizada a los 30 dias, la altura de la masa cruda aumento a 2,5 veces su altura original, mostrando una actividad significativa de la levadura. La masa fermentada durante 30 minutos aumento aun mas, aunque ligeramente, durante la coccion. El producto cocido todavia mostraba una alveolacion grande y estructurada que era comparable a la obtenida en la prueba realizada el dia 15.

[0093] En ningun caso, el producto tenia olores extranos de sus ingredientes o colores inusuales.

Comportamiento del tipo de cepa de Saccharomyces cerevisiae

[0094] Por el contrario, la cepa de Saccharomyces cerevisiae CBS 1171T causo una hinchazon inaceptable del paquete sellado (y la rotura en muchos casos) incluso despues de 3 dias de almacenamiento a 6 0C, mostrando asi una fuerte actividad de la levadura a la temperatura de 6 0C. Despues de abrir el paquete, la masa tenia un olor y sabor anormales, caracterizados por un olor acido y alcoholico. La estructura de la masa se debilito hasta el punto de imposibilitar su estiramiento.

[0095] Despues de estos tres dias, hubo un aumento de 2 ciclos logaritmicos, de 1.106 CFU/g a 1.108 CFU/g de masa.

[0096] Por lo tanto, existe una clara diferencia en el comportamiento exhibido por la cepa DSM 29004 y la cepa tipo, con respecto tanto a la actividad de fermentacion a 60C como a la calidad de la fermentacion una vez que se extrajo la masa del paquete.

Ejemplo 3: preparacion de una masa solida para pizza

[0097] La cepa de Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 se usa para la preparacion de una masa solida para pizza de acuerdo con la siguiente receta que se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1

[0098] La levadura se inocula a una concentracion de 5x106 CFU /g de masa.

[0099] Esta masa se reparte en bolas que pesan aproximadamente 250 g.

[0100] Cada masa de bola se enfria a una temperatura de aproximadamente 00C/4 0C y se envasa en una bandeja termoformada en atmosfera modificada (50 % de N² y 50 % de CO²). Luego, el paquete se almacena en un frigorifico a una temperatura de aproximadamente 6 0C durante 20 dias. Despues de veinte dias a partir de la fecha de produccion, la bola de masa se retira del paquete y se deja a temperatura ambiente (20-25 0C) durante unos 20 minutos. Despues de dicho intervalo, la masa se extiende sobre una tabla de cortar enharinada hasta que alcanza el tamano de una base redonda de unos 28 cm. Este ultimo luego se transfiere a un papel a prueba de grasa y se adorna con pasta de tomate o tomates picados, queso mozzarella picado y otros ingredientes al gusto. Luego, la pizza se cocina en la parrilla central del horno precalentado a 230 0C y se pone en modo de ventilacion durante 6-8 minutos hasta que el queso mozzarella se derrita por completo.

[0101] Esto da como resultado una pizza que tiene una miga suave y aveolada y un borde y corteza crujientes.

Ejemplo 4: preparacion de una masa solida para focaccia (pan plano)

[0102] La cepa de Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 se usa para la preparacion de una masa solida de acuerdo con la siguiente receta que se muestra en la Tabla 2:

Tabla 2

[0103] La levadura se inocula a una concentracion de 5x106 CFU /kg de masa.

[0104] Esta masa se divide en bolas que pesan alrededor de 400 g.

[0105] Cada bola de masa se enfria a una temperatura de aproximadamente 0 0C y se empaqueta en una bandeja termoformada en atmosfera modificada (50 % de N² y 50 % de CO²). Luego, el paquete se almacena en un frigorifico a una temperatura de aproximadamente 60C durante 20 dias.

[0106] Despues de veinte dias a partir de la fecha de produccion, la bola de masa se retira del paquete y se deja a temperatura ambiente (20-25 0C) durante aproximadamente 20 minutos. Despues de dicho intervalo, la masa se extiende sobre una tabla de cortar enharinada hasta que alcanza el tamano de una bandeja para hornear (30x40 cm). Esta ultimo se transfiere a un papel a prueba de grasa, y se perfora con un tenedor para evitar la fermentacion excesiva durante la coccion. La superficie de la base luego se engrasa con aproximadamente 3 cucharadas de aceite de oliva virgen extra y sal al gusto. Luego, el pan plano se cocina en la parrilla mediana del horno, se precalienta a 200 0C y se pone en modo de ventilacion, durante aproximadamente 14 minutos.

[0107] Esto da como resultado un pan plano que luce bien elevado y se caracteriza por una miga suave y alveolada con borde y corteza crujientes.

Ejemplo 5: preparacion de una masa solida para rectangulos de masa inflada frita

[0108] La cepa de Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 se usa para la preparacion de una masa solida para rectangulos de masa inflada frita de acuerdo con la siguiente receta que se muestra en la Tabla 3:

Tabla 3

[0109] La levadura se inocula a una concentracion de 5x106 CFU /g de masa.

[0110] Esta masa se divide en bolas que pesan alrededor de 400 g.

[0111] Cada bola de masa se enfria a una temperatura de aproximadamente 0 0C y se empaqueta en una bandeja termoformada en atmosfera modificada (50 % de N² y 50 % de CO²). Luego, el paquete se almacena en un refrigerador a una temperatura de aproximadamente 60C durante 20 dias.

[0112] Despues de veinte dias a partir de la fecha de produccion, la bola de masa se retira del paquete y se deja a temperatura ambiente (20-25 0C) durante aproximadamente 20 minutos. Despues de ese tiempo, la masa se extiende sobre una tabla de cortar enharinada para obtener una masa enrollada con un grosor de 2-3 mm. La masa enrollada se corta en rectangulos de aproximadamente 10 cm x 10 cm. Por separado, se precalientan 500 ml/1 L de aceite adecuado para freir (aceite de oliva o aceite de cacahuete) en una sarten. Una vez que el aceite esta caliente, los rectangulos de la masa se sumergen poco a poco durante unos 30 segundos. Los rectangulos hinchados se drenan individualmente en toallas de papel.

[0113] Se obtiene un producto frito que se caracteriza por una fuerte fermentacion de la masa.

Ejemplo 6: preparacion de una masa fluida para la produccion de una pizza

[0114] La cepa de Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 se usa para la preparacion de una masa fluida para la produccion de una pizza de acuerdo con la siguiente receta que se muestra en la Tabla 4:

Tabla 4

[0115] La levadura se inocula a una concentracion de aproximadamente 5x106 CFU /g de masa.

[0116] Dicha masa fluida se divide en paquetes de 600 g y cada paquete se sella en atmosfera modificada (50 % de N² y 50 % de CO²). El paquete se almacena en un frigorifico a una temperatura entre 0 °C y 80C, preferiblemente 6 0C durante 20 dias.

[0117] Despues de veinte dias a partir de la fecha de produccion, el paquete se abre y se vierten 600 g de masa liquida en una bandeja para hornear bien aceitada con una cucharada de aceite de oliva. La masa se distribuye bien por todo el espacio disponible de la bandeja y se deja reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. La bandeja se puede cubrir con una pelicula de teflon para evitar la formacion de peliculas de superficie. Despues de dos horas, la base blanca se cocina durante aproximadamente 16 minutos a 200 0C en un horno en modo ventilado. Despues de cocinar, el producto se cubre con 100 g de salsa de tomate y 100 g de queso mozzarella cortado en trozos. En este punto, el producto se cocina durante 8-10 minutos a 200 0C en un horno en modo ventilado.

[0118] Se obtiene una pizza con una miga suave y alveolada y un borde y una corteza crujientes.

Ejemplo 7: prueba de panel para la verificacion del nivel de aceptacion general del producto

[0119] Los productos horneados obtenidos siguiendo las recetas y metodos de preparacion anteriores se someten a una "prueba de panel" para confirmar el hecho de que dichos productos se caracterizan por una buena alveolacion y, al mismo tiempo, por la suavidad y la textura crujiente de la masa.

[0120] La prueba de panel o analisis sensorial es una herramienta que permite, debido al uso de tecnicas y procedimientos estandarizados, la medicion y evaluacion objetiva de todas las caracteristicas de un producto alimenticio percibido por los cinco sentidos humanos. Su aplicacion sistematica, combinada con analisis quimicos, fisicos y microbiologicos, puede identificar un producto de calidad satisfactorio para las preferencias gustativas de los consumidores.

[0121] Tambien se realizo una prueba de panel de confirmacion (Figura 4) para confirmar la satisfaccion general del producto desde el punto de vista organoleptico. Los productos que se probaron son bases blancas obtenidas de masa solida, fermentadas previamente durante 30 minutos durante la fase de produccion, envasadas en una atmosfera protectora (50 % N² y 50 % CO²) y almacenadas durante 21 dias a 8 0C La preparacion del producto terminado se realizo siguiendo los procedimientos indicados anteriormente.

[0122] Las ventajas conseguidas por el producto de la presente invencion son evidentes a partir de la descripcion detallada y de los ejemplos anteriores. En particular, este producto ha demostrado ser, de manera sorprendente y ventajosa, adecuado para la preparacion de una masa solida o fluida que puede almacenarse a temperaturas inferiores a 8 0C, incluso durante mas de 20 dias, sin cambios cualitativos de la masa y del paquete y que permite, una vez que se cambia a temperatura ambiente, obtener productos de panaderia caracterizados por un desarrollo optimo.

Ejemplo 8: Comparacion aenotipica de diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae

[0123] La comparacion de ADN microsatelite de las siguientes cepas de levadura se realizo con el fin de verificar si existe una superposicion entre la cepa DSM 29004 de acuerdo con la presente invencion y las cepas del estado de la tecnica.

[0124] Cepas analizadas: Saccharomyces cerevisiae DSM 29004, S. cerevisiae NCIMB 40611; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40612; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40613; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40614; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40615; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40328; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40329; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40330; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40331; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40332 y Saccharomyces cerevisiae CBS1171T.

[0125] La cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004, aislada de una masa fermentada espontaneamente proveniente de Italia, se caracteriza por un genotipo unico descrito, en las formas preferidas, por:

analisis de perfil de ADN microsatelite mediante electroforesis en gel de agarosa al 3 % en peso (Figura 2) de productos de amplificacion de PCR multiplex que amplifican loci SC8132X, YOR267C, SCPTSY7 (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008) y C5 (Legras y col., 2005). Los cebadores utilizados fueron: SC8132X FW y SC8132X RV cada uno a una concentracion de 0,75 pM (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008); YOR267C FW y YOR267C RV cada uno a una concentracion de 0,5 pM (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008);

SCPTSY7 FW y SCPTSY7 RV a una concentracion de 2,0 pM (Vaudano & Garcia-Moruno, 2008) y finalmente los cebadores C5 FW y C5 RV a una concentracion de 0,5 pM (Legras y col., 2005). La reaccion se realizo en un volumen de 20 pl usando 1,5U de ADN polimerasa GoTaq (Promega) en un tampon 1x con adicion de cloruro de magnesio (MgCL) a una concentracion de 3,1 mM y nucleotidos trifosfato (dNTP), cada uno a una concentracion de 0,4 mM. La amplificacion se realizo en el instrumento Nexus Mastercycler Gradient (Eppendorf) con un programa termico que consiste en una etapa de desnaturalizacion inicial a 94 0C durante 4 minutos, seguido de un ciclo a 94 0C durante 30 segundos, 56 0C durante 45 segundos y 72 0C durante 30 segundos, repetido 34 veces, seguido de una ultima etapa de extension a 72 0C durante 10 minutos.

[0126] Los resultados indican claramente que DSM 29004 es una nueva cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae con caracteristicas mejoradas, que se caracteriza por un genotipo unico como se puede ver en el analisis de perfil del ADN de microsatelite como se muestra (Figura 2b).

[0127] Mas en detalle, la cepa DSM 29004 es diferente de las otras cepas indicadas en el estado de la tecnica debido a tres bandas especificas (banda A, banda B y banda C) en el patron de ADN microsatelite, comprendidas en el intervalo entre 350 pb y 500 pb.

Ejemplo 9: comparacion de los compuestos volatiles liberados por la cepa DSM 29004 de Saccharomyces cerevisiae, y las otras cepas, durante la produccion en medio a base de melaza mediante analisis SPME GC-MS

[0128] Cepas analizadas: Saccharomyces cerevisiae DSM 29004, NCIMB 40611; NCIMB 40612; NCIMB 40613; NCIMB 40614; NCIMB 40615, NCIMB 40328; NCIMB 40329; NCIMB 40330; NCIMB 40331; NCIMB 40332 and CBS1171T.

[0129] Todas las cepas de S. cerevisiae que tienen el fenotipo LTi descrito en el estado de la tecnica se compararon asi con la cepa de S. cerevisiae DSM 29004 segun la presente invencion, analizando la produccion de aroma, para verificar las diferencias de actividad fenotipica entre las cepas.

[0130] Las cepas se cultivaron en medio YPD (Tabla 5). Un cultivo de cada cepa en la fase exponencial media se diluyo para alcanzar una concentracion de 0,1 OD en la longitud de onda de 600 nm. El medio "a base de melaza" (Tabla 6) se inoculo independientemente con 100 pl de dicha suspension de celulas de levadura a la concentracion de 0,1 OD y se incubo 72 h a 27 0C.

[0131] Las siguientes tablas muestran la lista de los componentes y su concentracion en los medios utilizados para cultivar las cepas de levaduras en cultivo discontinuo.

T l . M i n xr xr l v r YPD):

T l . M i ml z r^ liv i nin MM

[0132] Al final de dicho perfodo, se transfirieron 3 ml de caldo de cultivo a viales esteriles (10 ml de capacidad) para el analisis de compuestos volatiles. Se agregaron 10 gl de un stock de 1000 ppb de patron de referencia interno (4-metilpentanol) a cada vial antes de sellarlo. El analisis SPME GC-MS se realizo en cada muestra. Las condiciones experimentales son las descritas por Montanari y col. (2014).

[0133] Los perfiles aromaticos obtenidos para cada cepa se indican en la Tabla 7, en la que cada resultado es el promedio de tres mediciones. Cada resultado se expresa como la relacion entre el area del pico y el area del estandar de referencia.

[0134] Se realizo un analisis de componentes principales para verificar una discriminacion adicional de las cepas. Se observo que los dos primeros componentes explican mas del 50 % de la varianza total y en base a la proyeccion de las dos primeras variables, las cepas se colocaron en el grafico de proyeccion como se muestra en la Figura 5. Resultados:

[0135] La Figura 5 muestra que las cepas NCIMB del estado de la tecnica estan todas agrupadas entre si (con la excepcion de NCIMB40330, que esta en la parte inferior (negativa) del grafico. Ambas cepas CBS1171T y DSM29004 estan distantes en esta proyeccion y estan en el lado positivo del eje y.

[0136] Segun la Figura 5, las posiciones de las cepas en el grafico se deben principalmente a las siguientes variables: 3-hidroxi-2butanona, ester etilico del acido hexadecanoico, 9-hexadecanoato de etilo y ester metilico del acido octadecanoico (Tabla 7).

[0137] Las variables ester etilico del acido hexadecanoico y ester metilico del acido octadecanoico parecen producirse unicamente por la cepa de acuerdo con la presente invencion. De hecho, solo la cepa S.cerevisiae DSM29004 produce los compuestos volatiles: ester etilico del acido hexadecanoico y ester metilico del acido octadecanoico.

[0138] Estos compuestos se caracterizan por un aroma afrutado y suave.

[0139] La presencia de estos compuestos hace que el DSM 29004, cultivado en un medio a base de melaza, libere un aroma mas agradable que las cepas de levadura habituales que crecen en el mismo medio.

Ejemplo 10: analisis de compuestos volatiles liberado por la cepa DSM 29004 de Saccharomyces cerevisiae, en Medio 4 (M4) por SPME GC-MS.

[0140] El analisis se realizo como se explica en el Ejemplo 9, inoculando la cepa DSM 29004 en Medio 4 (M4) en lugar de MM. La composicion de M4, que se basa en el extracto de malta de cebada y el extracto de malta de trigo, se describe en la Tabla 8.

Tabla 8 M i 4 M4 h h m l m l r n r liv i continuo

[0141] La cepa DSM 29004 se incubo durante 72 horas en el medio M4 y produjo un perfil tipico de compuestos volatiles constituidos por las treinta moleculas indicadas en la Tabla 9. El experimento se repitio dos veces y los datos se expresan como el valor medio de la relacion de cada area de pico y area de pico estandar. El cromatograma de una de las repeticiones se muestra en la Figura 6.

Tabla 9. Cuantificacion de los treinta compuestos volatiles producidos por DSM 29004 despues del crecimiento en M4 r n 72 h r .

[0142] Al comparar la Tabla 9 y la Tabla 7, se pueden resaltar las diferencias entre los perfiles de aroma de DSM 29004 cultivados en medios M4 y MM. Las diferencias mas relevantes se evidencian en la concentracion de etanol, mayor en M4, debido a la mayor concentracion de azucar, lo que favorece la via de fermentacion. Sin embargo, la concentracion de algunas moleculas con un impacto relevante en el sabor general es mayor despues del crecimiento de DSM 29004 en M4. De hecho, los siguientes compuestos resultaron en una mayor proporcion en M4: ester etilico del acido octanoico (2,41 vs. 1,61), alcohol feniletilico (4,08 vs. 0,93), acido feniletilico del acido acetico (0,19 vs. 0), bencenoacetaldehido (0,88 vs. 0), 4-metil-2-heptanona (0,10 vs. 0,01), octanal (0,15 vs. 0), ester etilico del acido nonanoico (0,52 vs. 0,19). Todos estos compuestos tienen un fuerte impacto en el sabor, mejorando los componentes afrutados y florales (como rosas) del sabor y reduciendo los componentes picantes del sabor, que son molestos para el gusto humano. Los componentes picantes del sabor, en cambio, son tipicos de la fermentacion de levadura cultivada en un medio a base de melaza.

Ejemplo 11: procedimiento para inducir la expresion de enzimas en DSM 29004 para metabolizar la maltosa y los compuestos relacionados con el extracto de malta.

[0143] Tres muestras de ARN total se purifican mediante tres cultivos de S. cerevisiae DSM 29004 cultivados durante 18 horas a 27 0C en YPD (Tabla 5), MM (Tabla 6) y M4 (Tabla 8) a traves de ZR ARN Fungal/Bacterial MiniPrep (ZymoResearch). Se procesa ARN total de alta calidad (valor RIN >8,0). El ARNm se purifica primero por captura de poliA, mientras que, para la muestra bacteriana, el ARN total se somete primero a agotamiento de ARNr. El ARNm purificado se fragmenta y se convierte en ADNc bicatenario. Los adaptadores de ADN con codigos de barras especificos de la muestra se ligan y se realiza una amplificacion por PCR. El "metodo dUTP" se utiliza para generar bibliotecas de secuencias de ARNm especificas de cadena, incluyendo los codigos de barras, y que son compatibles con la secuenciacion de una sola lectura o de extremos emparejados. Se utiliza el kit de preparacion de la biblioteca RNA-seq de Illumina TruSeq. La biblioteca se selecciona en funcion del tamano utilizando perlas magneticas, lo que da como resultado un promedio en bibliotecas con un tamano de inserto en el intervalo aproximado de 100-400 pb.

[0144] Las lecturas de secuencia se filtran y se recortan adicionalmente en funcion de las puntuaciones de calidad de Phred. Las lecturas filtradas/recortadas se alinean contra la secuencia de referencia de la cepa S. cerevisiae S288c utilizando el software CLCbio "RNA-Seq". Tambien los valores de expresion (normalizados) se calculan y se comparan entre las muestras. El control de calidad se realiza mediante el analisis de diagrama de caja, el analisis de componentes principales (PCA) y el agrupamiento jerarquico de los valores de expresion normalizados.

[0145] Los datos reflejan en la muestra de S.cerevisiae DSM 29004 cultivada en M4 cuando se comparan con los medios YPD y MM una expresion modulada de los genes de la familia de las glucosidasas y los genes relacionados con el metabolismo de la maltosa, en particular los genes mal11 ,mal11.3,mal11.5,mal12,mal13,mal13.3,mal13.5,ma/31 ,mal31.3,mal31.5,mal32,mal33,mal33.3,mal33.5.

[0146] Estos datos muestran que el medio M4 mejora la expresion de los genes relacionados con la fermentacion de la masa en S. cerevisiae DSM 29004, ya que la maltosa es el azucar presente principalmente en la masa de productos horneados. Asi, la cepa DSM 29004, cultivada en un medio M4, y una vez en una masa de producto horneada, utilizara la maltosa de manera mas eficaz y mostrara mas celeridad, mas rapidez y mas vigor que la cultivada en medio a base de melaza, favoreciendo asi la fermentacion de la masa. Esta caracteristica de una mejor fermentacion de la cepa DSM 29004 cultivada en medio M4 representa una ventaja constante en el uso de cepas Lti, ya que se sabe que estas cepas se muestran, incluso a temperaturas que generalmente son optimas para la fermentacion de S. cerevisiae, una actividad metabolica mas baja, y esto generalmente resulta en una fermentacion insuficiente o un tiempo demasiado largo para una fermentacion decente.

Ejemplo 12: baja produccion de dioxido de azufre en el medio segun la invencion por la cepa DSM 29004 y su relevancia para la interaccion con bacterias del acido lactico

[0147] El medio M4 a base de extracto de malta de cebada y extracto de malta de trigo se prepara esterilizando en autoclave a 121 0C durante 15 minutos, una solucion de 55 g/l de extracto de malta de cebada y 35 g/l de extracto de malta de trigo y luego anadiendo los otros componentes esterilizados de la siguiente manera: en autoclave, en el caso de sales y por filtracion en el caso de vitaminas.

[0148] Un cultivo exponencial medio en YPD de la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004, se normaliza a una concentracion de 0,1 OD (longitud de onda de 600 nm) y se inoculan 2 ml en 100 ml del medio y se cultivan a 27 °C en un agitador durante 36 horas. La cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 29004 muestra una produccion de dioxido de azufre inferior a 10 mg/l, que es compatible con el uso del medio desechado como suplemento para mejorar el crecimiento de bacterias del acido lactico en una masa fermentada. De hecho, el dioxido de azufre, generalmente es producido por la levadura durante la fermentacion. La presencia de dioxido de azufre inhibe el crecimiento de las bacterias del acido lactico, por lo tanto, no es ventajosa en la fermentacion de la masa (Ejemplo 11) y representaria un obstaculo insuperable en el caso de que el medio desechado se agregara a la masa junto con la cepa de levadura como suplemento. En su lugar, el medio desechado despues del crecimiento de DSM29004, que no muestra presencia de dioxido de azufre, es adecuado para ser anadido a una masa como suplemento, aprovechando asi su capacidad mencionada anteriormente para mejorar el crecimiento de las bacterias del acido lactico.

Ejemplo 13: altas concentraciones de nitrogeno alfa-aminico disponibles en el medio de acuerdo con la invencion por la cepa DSM 29004 y su relevancia para la interaccion con bacterias del acido lactico

[0149] El medio M4 a base de extracto de malta de cebada y extracto de malta de trigo se prepara esterilizando en autoclave a 121 0C durante 15 minutos, una solucion de 55 g/l de extracto de malta de cebada y 35 g/l de extracto de malta de trigo y luego anadiendo los otros componentes esterilizados de la siguiente manera: en autoclave, en el caso de sales y por filtracion en el caso de vitaminas.

[0150] Un cultivo exponencial medio en YPD de las cepas Saccharomvces cerevisiae DSM 29004, S. cerevisiae NCIMB 40611; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40612; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40613; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40614; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40615; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40328; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40329; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40330; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40331; Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40332 Saccharomyces cerevisiae CBS1171T, se normalizaron como se describe en el Ejemplo 12 e inocularon en 100 ml del medio, luego se cultivaron a 27 0C en un agitador durante 36 horas.

[0151] El medio desechado al final de la fermentacion en el caso de la cepa DSM 29004 muestra una concentracion notable de nitrogeno alfa-aminico de 465 mg/l (Tabla 10), mientras que el promedio de todas las demas cepas analizadas es de 133 mg/l. Esta concentracion 3 veces mayor de nitrogeno alfa-aminico confiere al medio desechado un valor anadido como suplemento para el crecimiento de bacterias del acido lactico. De hecho, el nitrogeno alfa-aminico es una fuente de factores esenciales para el crecimiento de microorganismos, tales como las bacterias del acido lactico, especialmente las bacterias del acido lactico que estan bien adaptadas a la masa y la masa fermentada. La presencia de bacterias del acido lactico es esencial para mejorar la textura de la masa y los sabores, dandole una fragancia mas natural (vease el Ejemplo 14).

Tabla 10. Concentracion del nitrogeno alfa-aminico en el medio desechado obtenido despues del crecimiento de DSM 29004 las ce as de levadura indicadas en el estado de la tecnica

Ejemplo 14: efecto del extracto de levadura fresca de DSM 29004 sobre Lactobacillus sanfranciscensis y comparacion del efecto del Medio 4 desechado al final de la cepa DSM 29004 y produccion de CBS 1171T sobre bacterias del acido lactico

[0152] Se sabe que Lactobacillus sanfranciscensis requiere extracto de levadura fresca como suplemento en el medio DSM 225 (conocido tambien como "Dough Like Medium") producido de acuerdo con el protocolo publicado por DSMZ (Tabla 11). Lactobacillus sanfranciscensis es una de las bacterias mas utilizadas para la preparacion de masas fermentadas, debido a su capacidad para dar a la masa sabores agrios tipicos de las masas hechas a mano a la antigua. Se preparo un extracto de levadura fresca de la cepa DSM 29004 y se uso para cultivar Lactobacillus sanfranciscensis LMG17498. El crecimiento fue bien promovido por el extracto fresco de DSM 29004 (Figura 7a).

Tabla 11. Com osicion del medio DSM 225 tambien conocido como "Dou h Like Medium".

[0153] La potencialidad del medio M4 desechado recuperado despues de la recoleccion de las celulas de levadura de la cepa DSM 29004 como posible suplemento para mejorar el crecimiento de las bacterias del acido lactico en una masa fermentada se evaluo mediante el analisis de la cinetica del crecimiento en medio liquido MRS (Oxoid). El medio MRS se preparo de acuerdo con las instrucciones del productor, excepto por el uso de 9/10 de agua para disolver el polvo. La solucion se esterilizo en autoclave, luego en cada botella/vial se anadio 1/10 de volumen del medio M4 desechado en el que se cultivaron la cepa DSM 29004 y CBS 1171T. Los medios desechados se agregaron por filtracion con membranas caracterizadas por un tamano de mineral de 0,45 pm. La cinetica de crecimiento se monitorizo midiendo la densidad optica del tubo a 600 nm.

[0154] En el ensayo, se usaron las cepas Lactobacillus brevis DSM 20054T, Lactobacillus fermentum LMG 6902T, Lactobacillus plantarum DSM 20174T, Leuconostoc mesenteroides LMG 6893T, Pediococcus pentosaceus LMG 11488T y Pediococcus acidilactici. Los datos para todas las especies mencionadas se indican en la Figura 7.

[0155] Mas en detalle, un cultivo exponencial medio en MRS de cada cepa se normalizo a una concentracion de 0,1 OD a 600 nm de longitud de onda y 10 pl se inocularon en MRS como control negativo, en MRS suplementado con el medio M4 desechado del cultivo de DSM 29004 (MRS M4 DSM29004) y con medio M4 desechado de CBS1171T (MRS M4 CBS1171). La cinetica de crecimiento de estos cultivos bacterianos se monitorizo durante 48 horas midiendo la concentracion celular con el espectrofotometro a una longitud de onda de 600 nm (Figuras 7b, 7c, 7d, 7e, 7f, 7g).

[0156] La calidad de los productos a base de cereales esta influenciada por las funciones de varios ingredientes, tales como la masa fermentada.

[0157] La masa fermentada es una mezcla de harina y agua que se fermenta mediante una microflora compuesta por asociaciones estables de levaduras y bacterias del acido lactico (LAB).

[0158] Estas LAB son principalmente cepas heterofermentativas, que elaboran acido lactico y acido acetico en la mezcla, y por lo tanto dan como resultado un sabor amargo del producto final. La masa fermentada desempena un papel importante en la preparacion de la masa de pan para favorecer las propiedades tecnologicas (por ejemplo, mejor maquinabilidad de la masa), propiedades nutricionales (por ejemplo, mediante hidrolisis de fitato), propiedades organolepticas (por ejemplo, volumen de pan, textura de miga y un sabor unico), y mantenimiento de las propiedades (vida util).

[0159] Las LAB y las levaduras a menudo se asocian en la masa fermentada. La relacion LAB: levadura en masa fermentada es generalmente de 100:1. Mientras que, en la mayoria de los alimentos fermentados, las LAB homofermentativas desempenan un papel importante, las LAB heterofermentativas predominan en la masa fermentada, especialmente cuando se prepara de forma tradicional. De hecho, el acido acetico, un importante producto final de la heterofermentacion, desempena un papel importante en el sabor de la masa fermentada.

[0160] Las LAB son un grupo importante de cultivos iniciadores industriales, aplicados en la produccion de alimentos fermentados.

[0161] Las LAB contribuyen a la mejora de las propiedades de sabor de los alimentos fermentados, asi como a sus bioconservantes y a su seguridad microbiana.

[0162] La actividad metabolica de las LAB durante la fermentacion mejora la propiedad de la masa, la textura y el sabor; retrasa el proceso de estancamiento y evitar que los productos con levadura tengan moho y se echen a perder por las bacterias. Las LAB contribuyen al valor nutricional y a la salubridad de los productos.

[0163] La importancia de las interacciones sinergicas entre lactobacilos y levaduras se basa en el metabolismo de los carbohidratos y los aminoacidos y la produccion de dioxido de carbono.

[0164] Producen principalmente acido L-lactico y acido acetico con una menor cantidad de otros acidos tales como el acido citrico y los acidos malicos.

[0165] Muchas propiedades reologicas de la masa dependen de las actividades metabolicas de sus LAB residentes: fermentacion lactica, fermentacion acetica, proteolisis, sintesis de compuestos volatiles, actividad anti-moho y antiviscosidad.

[0166] Las actividades metabolicas de la fermentacion de las LAB mejoran las propiedades de la masa, la textura y el sabor del pan y retrasan el proceso de estancamiento del pan.

[0167] Durante mucho tiempo, la disminucion del pH, que ha sido causada por la produccion de acido organico, se ha considerado el efecto mas importante de la fermentacion de las LAB en la masa. Este descenso del pH influye en el comportamiento viscoelastico de la masa y es necesario para mantener la capacidad de manipulacion y la maquinabilidad en la produccion industrial.

[0168] La relacion entre acido lactico y acido acetico es un factor importante que podria afectar al perfil del aroma y la estructura del producto final. El acido acetico es responsable de un gluten mas corto y mas duro, mientras que el acido lactico puede explicar gradualmente una estructura de gluten mas elastica.

[0169] Ademas, la actividad de las enzimas proteoliticas y amiloliticas presentes puede verse influida en mayor grado por el perfil de pH del periodo de fermentacion de la acidificacion biologica en contraste con la naturaleza mas bien instantanea del regimen de acidificacion quimica. La actividad optima de estas enzimas, que desempenan un papel importante en los cambios de los constituyentes de la masa, logra una actividad optima a pH 4-5 para las enzimas proteoliticas y a pH 3,6-6,2 para las enzimas amiloliticas. Otras enzimas que podrian afectar a los componentes estructurales de la masa, cuya actividad depende del pH, incluyen las peroxidasas, las catalasas, las lipoxigenasas y las polifenoloxidasas.

[0170] Se informo de que ciertas bacterias del acido lactico tambien pueden producir exopolisacaridos (EPS), que podrian tener un efecto positivo en el volumen y la vida util del pan. Los EPS mas frecuentes producidos durante la fermentacion de la masa fermentada son: fructanos (levan, inulina) y glucanos (reuteran, dextrano, xantano). El EPS influye significativamente en la mejora de la textura de la masa. La produccion de EPS en cantidades suficientes durante la fermentacion de la masa crearia la posibilidad de reemplazar los hidrocoloides en el horneado. Se ha informado que los hidrocoloides mejoran la calidad del pan a traves de la estabilizacion de la asociacion agua-harina en la matriz de las masas.

[0171] Durante la fermentacion de la masa, las LAB liberan tambien peptidos pequenos y aminoacidos libres importantes para el crecimiento microbiano y la acidificacion de la masa. Ademas, los peptidos pequenos y los aminoacidos libres son importantes como precursores para el desarrollo del sabor de los productos horneados con levadura.

[0172] La LAB de la masa fermentada generalmente pertenece al genero Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus o Weisella.

[0173] La cinetica de crecimiento de Lactobacillus spp. en M4 muestra un mayor crecimiento de bacterias que pertenecen a Piociocus spp., especialmente P. pentosaceus y P. acidilactici cuando MRS se suministra con M4 desechado de un cultivo DSm 29004 Pediococcus pentosaceus son grampositiva, facultativamente anaerobicas, no moviles y no formadoras de esporas, miembros de las bacterias de acido lactico de importancia industrial. Al igual que otras bacterias del acido lactico, las P. pentosaceus son tolerantes al acido, no pueden sintetizar porfirinas y poseen un metabolismo estrictamente fermentativo con acido lactico como principal producto metabolico.

[0174] El acido lactico se produce a partir de azucares de hexosa a traves de la via de Embden-Meyerhof y a partir de pentosas por la via de 6-fosfogluconato/fosfocetolasa. P. pentosaceus crecen entre pH 4,5 y 8,0, en NaCl al 9-10 %, hidrolizan la arginina y pueden utilizar maltosa.

[0175] Se ha informado de que cepas de P. pentosaceus contienen entre tres y cinco plasmidos residentes. Los rasgos ligados a los plasmidos incluyen la capacidad de fermentar la rafinosa, la melibiosa y la sacarosa, asi como la produccion de bacteriocinas como agentes antimicrobianos.

[0176] P. pentosaceus tambien tiene un efecto fungistatico debido a la produccion de acido acetico.

[0177] P. pentosaceus es una LAB homofermentativa y su fermentacion produce una alta concentracion de acido lactico, en relacion con el acido acetico, lo que da como resultado un sabor amargo suave y plano muy apreciado en la masa.

[0178] Hay dos tipos de compuestos aromaticos que se producen durante la fermentacion de la masa. Los compuestos no volatiles incluyen acidos organicos producidos por bacterias homo y heterofermentativas que acidifican, disminuyen el pH y producen aroma en la masa. Los compuestos volatiles estan compuestos de alcoholes, aldehidos, cetonas, esteres y compuestos que contienen azufre producidos por acciones biologicas y bioquimicas durante la fermentacion y aportan sabor.

[0179] En particular, P. pentosaceus produce diacetil y acetato de etilo que proporcionan un agradable sabor a mantequilla, lo que le da una particular suavidad a la masa.

BIBLIOGRAFIA:

[0180]

Dutech C., Enjalbert J., Fournier E., Delmotte F., Barres B., Carlier J., Tharreau D., Giraud T. (2007). Challenges of microsatellite isolation in fungi. Fungal Genet Biol. 44: 933-949.

Foury F., Roganti T., Lecrenier N., Purnelle B. (1998). The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 440: 325-331.

Karim A.S., Curran K.A., Alper H.S. (2013). Characterization of plasmid burden and copy number in Saccharomyces cerevisiae for optimization of metabolic engineering applications. FEMS Yeast Res. 13: 107-116. Legras J.L., Ruh O., Merdinoglu D., Karst F. (2005). Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization of Saccharomyces cerevisiae strains. Int J Food Microbiol. 102: 73-83.

Legras J.L., Merdinoglu D., Cornuet J.M., Karst F. (2007). Bread, beer and wine: Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history. Mol Ecol. 16: 2091 -2102.

Montanari, C., Bargossi, E., Lanciotti, R., Chinnici, F., Gardini, F., Tabanelli, G. (2014). Effects of two different sourdoughs on the characteristics of Pandoro, a typical Italian sweet leavened baked good. LWT - Food Science and Technology 59: 289-299 Ralser M., Kuhl H., Ralser M., Werber M., Lehrach H., Breitenbach M., Timmermann B. (2012). The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biol. 2:120093.

Richards K.D., Goddard M.R., Gardner R.C. (2009). A database of microsatellite genotypes for Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 96: 355-359.

Sturley S.L. & Young T. (1986). Genetic Manipulation of Commercial Yeast Strains. Biotechnol Genet Eng. 4: 1­ 38.

Thygesen J.B., Glerup H., Tarp B. (2012). Saccharomyces boulardii fungemia caused by treatment with a probioticum. b Mj Case Rep. 2012. pii: bcr0620114412.

Torriani S., Zapparoli G., Malacrino P., Suzzi G., Dellaglio F. (2004). Rapid identification and differentiation of Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and their hybrids by multiplex PCR. Lett Appl Microbiol.

38:239-244.

Vaudano E. & Garcia-Moruno E. (2008). Discrimination of Saccharomyces cerevisiae wine strains using microsatellite multiplex PCR and band pattern analysis. Food Microbiol. 25: 56-64.

Vaughan-Martini A. & Martini A. (2011). Capitulo 61: Saccharomyces Meyen ex Rees’. In Kurtzman C.P., Fell J.W., Boekhout T., The Yeasts, a Taxonomic Study, 5a ed.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae, depositada con el numero de acceso DSM 29004 ante la autoridad de deposito internacional Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.

2. Cepa de levadura de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que dicha cepa permanece viable durante al menos 20 dias a una temperatura comprendida entre 0 0C y 8 0C y por que dicha cepa muestra sucesivamente un vigor fermentativo y una actividad de crecimiento a una temperatura comprendida entre 12 0C y 38 0C, preferiblemente entre 25 0C y 28 0C.

3. Cepa de levadura de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizada por que dicha cepa permanece viable durante al menos 30 dias a una temperatura comprendida entre 0 0C y 6 0C y por que dicha cepa muestra sucesivamente un vigor fermentativo y una actividad de crecimiento a una temperatura comprendida entre 12 0C y 38 0C, preferiblemente entre 25 0C y 28 0C.

4. Cepa de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que dicha cepa muestra un mayor vigor fermentativo en la fermentacion de la masa, cuando se cultiva previamente en un medio de extracto de malta de cebada y de malta de trigo que cuando se cultiva en un medio a base de melaza a una temperatura comprendida entre 12 0C y 38 0C, preferiblemente entre 25 0C y 28 0C.

5. Cepa de levadura de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizada por que dicho medio de extracto de malta de cebada y de malta de trigo esta en una concentracion que varia de 0,1 g/l a 100 g/l preferiblemente comprendido entre 40 g/l y 80 g/l y dicho medio a base de melaza tiene una concentracion de glucosa que varia de 0,1 g/l a 200 g/l, preferiblemente de 20 g/l a 100 g/l.

6. Masa solida o fluida, que comprende al menos agua, harina y levadura de la cepa Saccharomyces cerevisiae de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Masa de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que dicha levadura de la cepa Saccharomyces cerevisiae esta en forma de celulas vitales.

8. Masa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la que dicha levadura de la cepa Saccharomyces cerevisiae esta en una mezcla con otra levadura y/o microorganismos.

9. Masa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada por que cuando se envasa en un recipiente sellado a una temperatura comprendida entre 0 0C y 8 0C durante 20 dias, o preferiblemente a una temperatura comprendida entre 00C y 6 0C durante 30 dias, no presenta inflamaciones en el envase, desarrollo de olores o sabores anormales ni formacion de liquido dentro del envase.

10. Uso de la cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la produccion de masa solida o fluida.

11. Procedimiento de preparacion de masa refrigerada en forma solida o fluida, preparada mezclando al menos agua, harina, levadura de la especie de Saccharomyces cerevisiae, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha masa se envasa en un recipiente.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicha masa se envasa en un recipiente sellado que tiene una atmosfera interna modificada de 0 a 80 % de N² y de 0 a 60 % de CO², o en un recipiente sellado que tiene un envasado de atmosfera normal.

13. Procedimiento de preparacion de un medio que tiene una concentracion de nitrogeno alfa-amino superior a 300 mg/l, que comprende las etapas de:

a. cultivo de la cepa de levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio de extracto de malta de cebada y de malta de trigo durante al menos 36 horas;

b. separacion de la levadura del medio, preferiblemente por filtracion o por centrifugacion;

c. obtencion de un medio que tiene una concentracion de nitrogeno alfa-amino superior a 300 mg/l.