DE69117886T2

DE69117886T2 - Backhefe

Info

Publication number: DE69117886T2
Application number: DE69117886T
Authority: DE
Inventors: Christof Gysler; Herbert Hottinger; Peter Niederberger
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-10-14
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2011-10-15
Also published as: CA2055052C; US5399492A; GR3020129T3; ES2084750T3; ATE135396T1; JPH11332554A; PT99457B; DE69117886D1; JPH0576348A; CA2055052A1; JPH0771474B2; US5480798A; AU8596791A; ZA918298B; CH681307A5; AU650481B2; PT99457A; US5827724A; IE74955B1; IE913680A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entwicklung eines Backhefe-Stamms, der LTI-Eigenschaft aufweist, sowie eine in diesem Verfahren entwickelte Backhefe.
Man kennt verschiedene Verfahren zur Entwicklung von Backhefe-Stämmen, die insbesondere auf der herkömmlichen Genetik beruhen und zum Ziel haben, diesen Stämmen besondere, für die Herstellung von Backwaren nützliche Eigenschaften zu verleihen.
Die US 4547374 beschreibt beispielsweise die Entwicklung eines Stamms der Art Saccharomyces durch selektive Hybridisierungen, der gegenüber Einfrieren beständig ist und als Backhefe bei der Herstellung eines Brotteigs verwendbar ist, der dazu bestimmt ist, vor dem Gären und Backen eingefroren zu werden.
US 4341871 beschreibt Backhefe-Hybride, die, ohne übermäßig an Aktivität zu verlieren, selbst in gepreßter Form entwässert werden können.
US 4643901 beschreibt reine Backhefe-Stämme, die fermentieren können und eine Teigtreibfähigkeit sowohl bei gezuckerten als auch bei nicht gezuckerten Teigen besitzen und durch Hybridisierung durch Protoplastenfusion von kleinen Mutanten erhalten werden.
Man kennt ferner handelsübliche Backwaren, die dazu bestimmt sind, vor dem Gären und Backen im Kühlschrank konserviert zu werden. Diese Waren, wie beispielsweise Semmeln und Hörnchen, enthalten jedoch ein chemisches Triebmittel.
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Entwicklung von Backhefe-Stämmen sowie auf diese Weise entwickelte Stämme zu schaffen, die LTI-Eigenschaft besitzen, d.h. die Eigenschaft, unter Kühlung inaktiv zu sein, jedoch zu überleben (LTI ist die Abkürzung des englischen Ausdrucks "low temperature inactive") und die als Backhefe bei der Herstellung von Backwaren verwendbar sind, die dazu bestimmt sind, kurz vor dem Verzehr und nach Konservierung beispielsweise im Kühlschrank, in der Kühlkammer oder auf einem gekühlten Regal, gebacken zu werden.
Zu diesem Zweck unterwirft man erfindungsgemäß bei einer ersten Ausführungsform des Verfahrens zur Entwicklung eines Backhefe-Stammes, der LTI-Eigenschaft aufweist, einen haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae einer mutagenen Behandlung, selektioniert wenigstens eine Mutante, die LTI- Eigenschaft aufweist, führt wenigstens eine Rückkreuzung mit einem haploiden Wildstamm von Saccharomyces cerevisiae durch, der einen entgegengesetzten Paarungstyp repräsentiert, selektioniert wenigstens zwei Segreganten der Rückkreuzung, die LTI-Eigenschaft zeigen und vom entgegengesetzten Paarungstyp sind, führt wenigstens eine Kreuzung dieser Segreganten durch und selektioniert einen auf diese Weise erhaltenen diploiden Stamm, der wachstumsfähig ist, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweist.
Unter "Wachstumsfähigkeit" versteht in der vorliegenden Beschreibung die Fähigkeit, mit einer guten Ausbeute und einer guten Produktivität durch ein industriell verwendbares Kulturverfahren kultiviert zu werden, und zwar insbesondere durch das unter dem Namen Fed batch-Verfahren bekannte gebräuchliche Backhefe-Kulturverfahren (langsame und allmähliche Beigabe einer Zuckerlösung zu einer Hefesuspension unter Belüftung, so daß die Bildung von Alkohol während der Biomasseerzeugung vermieden und die Ausbeute maximiert wird).
Unter "Teigtreibfähigkeit" versteht man ferner die Fähigkeit, einen Teig bei Kühltemperatur sehr langsam beispielsweise durch eine sehr langsame Erzeugung von Metaboliten wie CO&sub2;, das durch den Teig absorbiert werden kann, und Alkohol, der als Teigkonservierungsmittel wirken kann, umzuwandeln, wobei diese sehr langsame Umwandlung zur Folge hat, daß der Teig treibfähig ist, wenn er direkt in den Ofen eingebracht wird, nachdem er beispielsweise im Kühlschrank, in der Kühlkammer oder auf einem gekühlten Regal konserviert worden war.
Bei einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Entwicklung eines Backhefe-Stammes, der LTI- Eigenschaft aufweist, unterwirft man ggf. einen polyploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae einer mutagenen Behandlung, läßt diesen Stamm sporulieren, selektioniert wenigstens einen Segreganten, der LTI-Eigenschaft aufweist, führt wenigstens eine Rückkreuzung mit einem anderen Segre ganten dieses Stamms durch, der einen entgegengesetzten Paarungstyp repräsentiert, selektioniert wenigstens zwei Segreganten der Rückkreuzung, die LTI-Eigenschaft zeigen und entgegengesetzte Paarungstypen repräsentieren, führt wenigstens eine Kreuzung dieser Segreganten durch und se lektioniert einen auf diese Weise erhaltenen polyploiden Stamm, der wachstumsfähig ist, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweist.
Man konnte nämlich auf diese Weise Backhefe-Stämme entwikkeln, die die Eigenschaft besitzen, bei den gebräuchlichen Kühltemperaturen, insbesondere bei den Temperaturen von etwa 3 bis 9 oder 10ºC, praktisch inaktiv zu sein, bei diesen Temperaturen jedoch zu überleben und anschließend bei einer höheren Temperatur, insbesondere beispielsweise ab etwa 13-14ºC, ihre Aktivität wieder zu erlangen.
Derartige Backhefe-Stämme können also ein chemisches Triebmittel in der Herstellung von Backwaren ersetzen, die dazu bestimmt sind, kurz vor dem Verzehr nach Kühlung im Ofen gebacken zu werden. Sie gestatten insbesondere die Herstellung von vorgeformten Artikeln wie Semmeln, Hörnchen oder Pizzaböden, oder von durch die Köchin zu formendem Teig, die nach dem Kühlen und Backen im Ofen organoleptische Eigenschaften besitzen, die mit denen vergleichbar sind, die dieselben Waren besitzen, die unter der Wirkung einer handelsüblichen herkömmlichen Backhefe aufgegangen sind und im Ofen gebacken wurden.
Derartige Stämme können auch als Indikator des Überschreitens der Temperatur in unter Kühlen zu kondensierenden Lebensmittelprodukten verwendet werden.
Zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens kann man also entweder von einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae wie diejenigen, die die herkömmlichen Laborbackhefen bilden, oder von einem polyploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae wie diejenigen, die beispielsweise die gebräuchlichen handelsüblichen Backhefen bilden, ausgehen.
Bei der ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver fahrens, bei der man von einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae ausgeht, unterwirft man also diesen Stamm einer mutagenen Behandlung. Zu diesem Zweck kann man Zellen dieses Stamms beispielsweise in einem YPD-Medium wachsen lassen, das 2 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 2 % Pepton enthält, wachsen lassen, und die Zellen können mit einem mutagenen Mittel wie beispielsweise Methansulfonsäureethylester (EMS) oder ICR-170 behandelt werden.
Man selektioniert anschließend mehrere Mutanten, die LTI Eigenschaft aufweisen, insbesondere eine Eigenschaft, bei einer Temperatur von etwa 9 oder 10ºC inaktiv zu sein, jedoch zu überleben.
Anschließend nimmt man mindestens eine Rückkreuzung der selektionierten Mutante bzw. Mutanten mit einem haploiden Wildstamm von Saccharomyces cerevisiae vor, der entgegengesetztem Paarungstyp ist, so daß unerwünschte Mutationen vermieden werden, die der haploide Ausgangsstamm zu Beginn oder nach dieser mutagenen Behandlung aufweisen kann, und/oder so daß wenn möglich eine LTI-Eigenschaft behalten wird, die nur auf eine einzige Mutation zurückzuführen ist. Wenn man mehrere Rückkreuzgänge vornimmt, kann man zwischen zwei aufeinanderfolgenden Operationen wenigstens einen Segreganten selektionieren, der LTI-Eigenschaft besitzt, und zwar insbesondere die Eigenschaft, bei einer Temperatur von etwa 9 oder 10ºC inaktiv zu sein, jedoch zu überleben, und kann man diesen oder diese Segreganten der zweiten dieser beiden aufeinanderfolgenden Operationen unterziehen.
Man selektioniert anschließend mindestens zwei Rückkreuzungssegreganten, die entgegengesetzte Paarungstype repräsentieren und LTI-Eigenschaft aufweisen, insbesondere die Fähigkeit, bei einer Temperatur von etwa 9 oder 10ºC inaktiv zu sein, jedoch zu überleben, und nimmt anschließend wenigstens eine Kreuzung solcher Segreganten vor.
Man selektioniert schließlich einen auf diese Weise erhaltenen diploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae, der wachstumsfähig ist, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweist. Bei diesem letzten Schritt kann man nämlich strengere und vollständigere Selektionskriterien anlegen, als sie in den vorhergehenden Schritten verwendet werden. Man kann diesen oder diese diploiden Stämme insbeson dere einem Wachstumstest in dem unter dem Namen Fed batch- Verfahren bekannten herkömmlichen Backhefe-Kulturverfahren unterziehen.
Man kann anschließend die LTI-Eigenschaft testen, indem man diesen oder diese diploiden Stämme einem Test der CO&sub2;-Erzeugung in einem Maltose-Nährmedium, d.h. in einem Maltose als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium, in Abhängigkeit von der Zeit, beispielsweise jeden Tag zwischen 3 und 7 Tagen, und in Abhängigkeit von der Temperatur, beispielsweise bei jedem Grad zwischen 3 und 14ºC, unterzieht.
Man kann schließlich die Teigtreibfähigkeit des Stammes testen, indem man ihn beispielsweise einem Pizzateig als einziges Triebmittel beigibt, indem man mit diesem Teig Pizza böden bildet, indem man sie einige Tage oder einige Wochen bei Kühltemperatur konserviert und sie dann im Ofen bäckt. Man kann diesen Test auch durch einen Test der CO&sub2;-Produktion des Stamms in Maltosemedium bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20-30ºC ergänzen.
Unter Verwendung dieser ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man also Stämme entwickeln, die eine bemerkenswerte LTI-Eigenschaft besitzen, dank der sie zur Erzeugung von Backwaren verwendet werden können, die dazu bestimmt sind, kurz vor dem Verzehr nach Konservierung unter Kühlung im Ofen gebacken zu werden. Man kann insbesondere Backhefe-Stämme von Saccharomyces cerevisiae entwickeln, die beim Zulaufverfahren wachstumsfähig sind und eine Teigtreibfähigkeit, ein Produktionsniveau von CO&sub2; von weniger als 20 ml pro g Preßhefe nach 7 Tagen in einem auf 3-10ºC gekühlten Maltosemilieu und ein Produktionsniveau von CO&sub2; von wenigstens 40 ml pro g Preßhefe nach 6 Tagen in einem Maltosemilieu einer Temperatur von wenigstens 14ºC aufweisen.
Von verschiedenen auf diese Weise erhaltenen Stämmen von Saccharomyces cerevisiae wurden drei als Beispiel nach dem Budapester Abkommen am 06.11.1990 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9 8DG, Schottland (Großbritannien), hinterlegt, wo ihnen die Nummern NCIMB 40328, 40329 und 40330 zugeteilt wurden.
Bei der zweiten Ausführungsform des vorliegenden Verfah rens, bei der man von einem polyploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae ausgeht, unterwirft man also diesen Stamm ggf. einer mutagenen Behandlung. Man hat nämlich festgestellt, daß es nicht immer erforderlich ist, einen solchen Stamm einer mutagenen Behandlung zu unterziehen, da manche beispielsweise handelsübliche Backhefen zu Beginn Mutationen aufweisen können, die während der Durchführung des vorliegenden Verfahrens erscheinen können.
Falls man einen polyploiden Stamm einer solchen mutagenen Behandlung unterzieht, kann man zu diesem Zweck Zellen dieses Stamms beispielsweise in einem YPD-Medium wachsen lassen, das 2 % Glucose, 1 % Hefeextrakt und 2 % Pepton enthält, und die erhaltenen Zellen können mit einem mutagenen Mittel wie beispielsweise Ethylmethansulfonsäure (EMS) oder ICR-70 behandelt werden.
Bei dieser zweiten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens läßt man also einen polyploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae sporulieren, nachdem man ihn ggf. einer mutagenen Behandlung unterzogen hat. Zum Sporulieren dieses Stamms kann man Zellen dieses Stamms während einem oder zwei Tagen auf einem sogenannten Sporulationsmedium wie einem PSA-Medium wachsen lassen, das 0,8 % Hefeextrakt, 0,3 % Pepton, 10 % Glucose und 2 % Agar enthält. Man kann sie an schließend übertragen und sie 3-5 Tage auf einem Sporulationsmedium wie einem SA-Medium halten, das 1 % Kaliumacetat, 0,1 % Hefeextrakt, 0,05 % Glucose und 2 % Agar enthält. Man kann anschließend Sporen beispielsweise durch Mikromanipulation isolieren und daraus Stämme mit geringer Ploidie erhalten, mit anderen Worten Segreganten, indem man sie beispielsweise auf einem YPD-Medium keimen läßt.
Man selektioniert anschließend vorzugsweise mehrere Segreganten dieses polyploiden Stamms, die LTI-Eigenschaft aufweisen, insbesondere die Eigenschaft, bei einer Temperatur von etwa 9-10ºC unaktiv zu sein, jedoch zu überleben.
Man nimmt anschließend mindestens eine Rückkreuzung des oder der selektionierten Segreganten mit einem anderen Segreganten dieses polyploiden Stamms vor, der keine LTI-Eigenschaft aufweist, jedoch vom entgegengesetzten Paarungstyp ist, so daß ungewünschte Mutationen vermieden werden, die dieser polyploide Stamm zu Beginn oder nach evtl. mutagener Behandlung aufweisen kann, und/oder so daß möglichst nur eine durch eine einzige Mutation verursachte LTI-Eigenschaft behalten wird. Wenn man mehrere Rückkreuzungsschritte vornimmt, kann man zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schritten mindestens einen Segreganten selektionieren, der LTI-Eigenschaft besitzt, und zwar insbesondere eine Eigenschaft, bei einer Temperatur von etwa 9 -10ºC inaktiv zu sein, jedoch zu überleben, und kann man diesen oder diese Segreganten dem zweiten dieser beiden aufeinanderfolgenden Schritte unterziehen.
Man selektioniert nun mindestens zwei Rückkreuzungssegreganten von entgegengesetzten Paarungstypen und mit LTI-Eigenschaft, und zwar insbesondere einer Eigenschaft, bei einer Temperatur von etwa 9-10ºC inaktiv zu sein, jedoch zu überleben, und nimmt mindestens eine Kreuzung solcher Segreganten vor.
Man selektioniert schließlich einen auf diese Weise erhaltenen polyploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae, der wachstumsfähig ist, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweist.Zu diesem Zweck kann man dieselben Selek tionskriterien anlegen und diesen oder diese polyploiden Stämme denselben Tests unterziehen, wie sie oben im Endschritt der ersten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens beschrieben wurden.
Durch Anwendung dieser zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man also Stämme entwickeln, die eine bemerkenswerte LTI-Eigenschaft aufweisen, dank der sie zur Herstellung von Backwaren verwendet werden können, die dazu bestimmt sind, nach Konservierung unter Kühlung kurz vor dem Verzehr im Ofen gebacken zu werden. Man kann insbesondere Backhefe-Stämme Saccharomyces cerevisiae entwickeln, die beim Zulaufverfahren wachstumsfähig sind und eine Teigtreibf ähigkeit, ein Produktionsniveau von CO&sub2; von weniger als 30 ml pro g Preßhefe nach sieben Tagen in einem auf 3-9ºC gekühlten Maltosemilieu und ein Produktionsniveau von CO&sub2; von wenigstens 60 ml pro g Preßhefe nach 6 Tagen in Maltosemilieu einer Temperatur von wenigstens 13ºC aufweisen.
Von verschiedenen so erhaltenen Stämmen von Saccharomyces cerevisiae wurden als Beispiel zwei nach dem Budapester Abkommen am 06.11.90 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacterial Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AG9 8DG, Schottland (Großbritannien), hinterlegt, wo ihnen die Nummern NCIMB 40331 und 40332 zugeteilt wurden.
Zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der durch dieses Verfahren erhaltenen Stämme werden im nachstehenden Beispiele beschrieben. Die Prozentsätze und Anteile beziehen sich hierin auf das Gewicht, sofern nicht anders angegeben.
Diesen Beispielen geht eine Beschreibung der verschiedenen Tests, der Zusammensetzung der verschiedenen verwendeten Medien, eine kurze Beschreibung der verschiedenen Figuren der beiliegenden Zeichnung und ein Vergleichsbeispiel voraus.

TESTS

1. Wachstumstest
Zur Simulierung eines realen Wachstumstest in dem unter dem Namen Fed batch-Verfahren bekannten herkömmlichen Verfahren zur Kultur von Backhefe wurde ein Wachstumstest auf verschiedenen Kulturmedien geschaffen, die nicht fermentierbare Kohlenstoffquellen enthalten, wie Milchsäure (S-lac- Medium), Ethanol (die Medien S-EtOH 2 % und S-EtOH 1 %) und Glycerol (YPG-Medium).
Der Grundgedanke dieses Tests ist, daß die Backhefe als Reaktion auf eine kritische Beigabegeschwindigkeit einer Lösung eines fermentierbaren Zuckers wie Saccharose im Fed batch-Verfahren-Verfahren nicht fermentierbare Kohlenstoffmetaboliten akkumuliert. Diese Metaboliten haben eine hemmende und toxische Wirkung auf den Stoffwechsel und auf die Atmung der Hefe. Stämme mit hoher Wachstumsfähigkeit können diese toxischen Kohlenstoffmetaboliten bei höheren Beigabegeschwindigkeiten akkumulieren und sind weniger empfindlich gegenüber einer Akkumulierung dieser Metaboliten als Stämme mit einer weniger hohen Wachstumsfähigkeit.
Die Ergebnisse dieses Wachstumstests sind in Fig. 1 dargestellt, in der die Größen angegeben sind, die die Kolonien nach Inkubation von Zellen eines Stamms auf Platten dieser Medien während 3 Tagen bei 30ºC besitzen. Die jedem Medium entsprechenden horizontalen Bänder enden an Teilstrichen 0; 0,5 mm; 0,5-1 mm; 1,5-2,5 mm; 2,5 mm, die die festgestellte durchschnittliche Größe der Kolonien angeben.

2. Test der CO&sub2;-Produktion

Man führt diesen Test in einem speziell hierfür geschaffenen Gerät durch, der aus einem Block mit Temperaturgefälle besteht, der beispielsweise Zellen mit veränderlichen Temperaturen besitzt, in die man das untere Ende von Fermentationsgläsern einführen kann. Diese Gläser haben ein geschlossenes oberes Ende mit einer Gradteilung sowie einen an der Seite angeschlossenen Expansionskolben. Das durch die Hefe erzeugte CO&sub2; sammelt sich im oberen, mit Gradteilung versehenen Ende jedes Glases an, wobei das durch die Akkumulation des Gases verdrängte Kulturmedium in den Expansionskolben eintreten kann.
Zur Durchführung dieses Tests beimpft man 2 ml einer Kultur des zu testenden Stamms von einer Nacht auf YPD-Medium in 200 ml eines ersten Mediums ein, das 0,67 % einer Stickstoffbase ohne Aminosäuren, wie beispielsweise das von der Firma Difco unter dem Namen "yeast nitrogen base w/o amino acids" vertriebene Produkt, 0,5 % Hefeextrakt, 2 % Saccharose, 1 % Natriumsuccinat und konzentrierte Salzsäure zur Einstellung des pHs auf 4,5 in einer 500 ml-Flasche enthält. Man inkubiert unter Rühren während 24 h bei 30ºC.
Man trennt die Zellen ab, indem man 5 min bei 20ºC unter 6000 g zentrifugiert, und bringt sie in 200 ml eines zweiten Mediums in Suspension, das 0,67 % einer Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 0,3 % Hefeextrakt und 0,3 % Saccharose, 1 % Natriumsuccinat und konzentrierte Salzsäure zur Einstellung des pH auf 4,5 in einer 500 ml Flasche enthält. Man inkubiert unter Rühren während 24 h bei 30ºC.
Man trennt die Zellen ab, indem man 5 min bei 4ºC unter 6000 g zentrifugiert, und wäscht den erhaltenen Hefezellenrückstand mit 50 ml destilliertem Wasser.
Man suspendiert die Zellen in 10 ml destilliertem Wasser und überträgt sie in vorgewogene 15 ml-Polypropylenröhrchen mit Gradteilung. Man zentrifugiert sie 10 Minuten bei 4ºC unter 3000 g. Man tropft die Röhrchen ab, wiegt die Heferückstände und bringt sie in einer Menge von 0,61 g Heferückstand, was 0,5 g Preßhefe mit einem Trockenmassegehalt von etwa 27 % entspricht, pro ml in einem dritten Medium in Suspension, das 0,67 % Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 2 % Maltose, 1 % Natriumsuccinat und konzentrierte Salzsäure zur Einstellung des pHs auf 4,5 enthält. Man führt 0,5 ml (bei Temperaturen ≥ 10ºC) oder 1 ml (bei Temperaturen < 10ºC) in Fermentationsgläsern der oben beschriebenen Art in Suspension, die man zuvor jeweils mit 50 ml des dritten Mediums, d.h. des Maltosemediums, gefüllt hat und auf 4ºC gekühlt hat.
Man inkubiert die Fermentationsgläser bei den gewünschten Temperaturen in dem oben beschriebenen Temperaturgefälleblock. Man notiert die CO&sub2;-Produktion in gewählten Abständen, nachdem man die Gläser einige Sekunden in ein Bad mit Ultraschallrührung getaucht hat, um die im flüssigen Medium festgehaltenen CO&sub2;-Blasen freizusetzen.

3. Teigtreibfähigkeitstest

Man stellt einen Teig her, in dem man 30 Teile Wasser, 60 Teile weißes Weichweizenmehl, 1,4 Teile Natriumchlorid und 7,6 Teile Arachidöl mischt. In diese Mischung bringt man den zu testenden Stamm in einer Menge von 1 Teil Preßhefe ein. Daraus formt man Pizzaböden mit einem Durchmesser von 20 cm und einer Dicke von 0,5 cm. Man konserviert sie 21 Tage bei 8ºC in versiegelter Kunststoffverpackung.
Anschließend nimmt man die Pizzaböden aus ihrer Verpackung und bäckt sie 15 min im Ofen bei 180ºC.
Der Test gilt als bestanden, wenn die Pizzaböden dann eine Dicke von etwa 2 cm und organoleptische Eigenschaften, insbesondere einen Geschmack und eine Textur besitzen, die mit denen von entsprechenden Pizzaböden vergleichbar sind, die mit einem Teig hergestellt wurden, der unter der Wirkung einer handelsüblichen herkömmlichen Backhefe frisch aufgegangen ist.

MEDIEN

YPD

Glucose 2 %
Hefeextrakt 1 %
Pepton 2 %

PSA

Glucose 10 %
Hefeextrakt 0,8 %
Pepton 0,3 %
Agar 2 %

SA

Glucose 0,05 %
Hefeextrakt 0,1 %
Kaliumacetat 1 %
Agar 2 %

S-lac

0,67 % Stickstoffbase ohne Aminosäuren
0,5 % Milchsäure
2 % Agar

S-EtOH 1 % oder 2 %

0,67 % Stickstoffbase ohne Aminosäuren
1 % oder 2 % Ethanol
2 % Agar

YPG

Glycerol 2 %
Hefeextrakt 1 %
Pepton 2 %

ZEICHNUNGEN

Fig. 1:

Lineare Darstellung der Größe von Kolonien, die durch Wachsen von Zellen der Stämme NCIMB 40328, 40329, 40330, 40331, 40332 und Hefe "levure boulangère bleue" (LBB, zum Vergleich) auf Medien S-lac, S-EtOH 1 % und 2 % und YPG erhalten wurden.

Fig. 2 bis Fig. 7:

Dreidimensionale Darstellungen des CO&sub2;-Produktionsniveaus in Maltosemedium in Abhängigkeit von der Temperatur und der Zeit bei den Stämmen NCIMB 40328 (Fig. 2), NCIMB 40329 (Fig. 3), NCIMB 40330 (Fig. 4), NCIMB 40331 (Fig. 5), NCIMB 40332 (Fig. 6) und Hefe "levure boulangère bleu" (LBB, zum Vergleich, Fig. 7).

Fig. 8:

Zweidimensionale Darstellung der CO&sub2;-Erzeugung in Maltosemedium bei 30ºC in Abhängigkeit von der Zeit bei den Stämmen NCIMB 40328, 40329, 40330, 40332 und Hefe "levure boulangère bleue" (LBB, zum Vergleich).

Vergleichsbeispiel

Zum Vergleich unterzieht man einen handelsüblichen Backhefe-Stamm im vorliegenden Fall einen Stamm, der die von der Firma Fould Springer unter der Bezeichnung "levure boulangère bleue" (LBB) vertriebene Backhefe bildet, denselben Tests, wie sie oben zur Selektion der diploiden und polyploiden Stämme verwendet wurden, die wachstumsfähig sind, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweisen, d.h. den oben beschriebenen Tests 1 bis 3.
Die in Fig. 1 dargestellten Ergebnisse des vergleichenden Wachstumstests zeigen erwartungsgemäß, daß der Stamm LBB eine sehr gute Wachstumsfähigkeit in dem Fed batch-Verfahren genannten herkömmlichen Backhefe-Kulturverfahren hat.
Die Ergebnisse des vergleichenden CO&sub2;-Produktionstests sind in Fig. 7 dargestellt, in der man sieht, daß die CO&sub2;-Produktion in Maltosemedium 40 ml pro g Preßhefe ab 6-7 Tagen bei 3-5ºC, ab 5-6 Tagen bei 5-9ºC und ab 3-4 Tagen bei 10ºC überschreitet.
Auf Fig. 8 sieht man außerdem, daß die CO&sub2;-Produktion in Maltosemedium bei dem Stamm LBB ab etwa 4 hbei 30ºC schnell 20 ml pro g Preßhefe überschreitet.
Die Ergebnisse des vergleichenden Teigtreibfähigkeitstests zeigen, daß der Stamm LBB sich nicht für eine Konservierung unter Kühlung vor dem Backen im Ofen eignet. Die versiegelte Kunststoffverpackung, in der ein unter Verwendung des Stamms LBB erhaltener Pizzaboden verpackt ist, bläht sich ab einem Tag bei 8ºC wie ein Ballon auf.
Dagegen stellt man fest, daß zwischen den Pizzaböden, die unter Verwendung von in dem vorliegenden Verfahren entwikkelten Stämmen erhalten wurden und dem vorstehenden Teigtreibfähigkeitstest unterzogen wurden, einerseits und den Pizzaböden, die unter Verwendung des Stamms LBB erhalten wurden und demselben Test unterzogen wurden, bei dem der Schritt der Konservierung unter Kühlung weggelassen wurde, andererseits praktisch kein Qualitätsunterschied wahrnehmbar ist.

Beispiel 1

Man geht von einem haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae aus, wie sie die gebräuchlichen Laborbackhefen bilden, insbesondere von einem Stamm mit dem Genotyp MATa arg4-17 his4-38 lys1-1 met8-1 trp1-1 mal, der gemäß dem Budapester Abkommen am 06.11.90 bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), P.O. Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9 8DG, Schottland (Großbritannien), hinterlegt wurde, wo ihm die Nummer NCIMB 40333 zugeteilt wurde.
Man unterzieht diesem Stamm einer mutagenen Behandlung mit EMS. Zu diesem Zweck läßt man Zellen dieses Stamms in 5 ml Kulturmedium YPD bis zur stationären Phase wachsen, wäscht sie einmal mit einem Kaliumphosphatpuffer von 100 mM mit pH 7,0 und bringt sie im selben Puffer in einer Menge von 10&sup8; Zellen pro ml in Suspension.
Man gibt der Suspension 3 Vol.-% EMS bei und läßt sie 1 h bei 30ºC unter kräftigem Rühren reagieren. Man stoppt die Behandlung durch Verdünnung der Suspension im 10fachen ihres Volumens von einer 5 %igen Natriumthiosulfatlösung. Man breitet nun die Zellen auf festem Medium YPD aus und kultiviert sie 2 Tage bei 30ºC. Man setzt sie anschließend auf festes YPD-Medium um und kultiviert sie 3 Wochen bei 10ºC, um ihre LTI-Eigenschaft zu testen.
Dann selektioniert man einige stabile Mutanten mit der Eigenschaft, bei dieser Temperatur inaktiv zu sein, jedoch zu überleben.
Man nimmt eine Rückkreuzung einer dieser Mutanten vom Paarungstyp MATa mit einem haploiden Wildstamm von Saccharomyces cerevisiae vor, beispielsweise dem dem Fachmann wohlbekannten Stamm GRF18 vom Genotyp MATα can1 his3-11,15 leu2- 3,112 (vgl. G.R. Fink, Whitehead Institute, Nine Cambridge Center, Cambridge, Massachusetts 02 142, USA).
Man selektioniert einen Segreganten dieser Rückkreuzung, der eine stark ausgeprägte LTI-Eigenschaft bei 10ºC, sowie den Genotyp MATA lys1 his3/4 trp1 mal aufweist.
Man nimmt eine Rückkreuzung dieses Segreganten mit demselben Wildstamm vor, wie er für die Rückkreuzung einer Mutan ten des Ausgangsstamms verwendet wurde.
Man selektioniert anschließend zwei Segreganten dieser Rückkreuzung, die eine ausgeprägte LTI-Eigenschaft bei 10ºC sowie jeweils den Genotyp MATα leu2 his3/4 mal aufweisen.
Man nimmt eine Rückkreuzung jedes dieser beiden Segreganten mit einem haploiden Wildstamm von Saccharomyces cerevisiae mit mindestens einem MAL-Gen vor, wie beispielsweise dem dem Fachmann bekannten Stamm 1403-7A (vgl. Yeast Genetics Stock Center, 6. Ausgabe des Katalogs, von Robert Mortimer, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California, Berkeley, CA 94720, USA).
Man selektioniert anschließend einen Segreganten jeder dieser Rückkreuzungen, der jeweils eine stark ausgeprägte LTI- Eigenschaft bei 10ºC sowie im einen Fall einen Genotyp MATa MAL und im anderen Fall einen Genotyp MATα leu2 MAL aufweist.
Man nimmt anschließend eine Kreuzung dieser beiden Segreganten vor und selektioniert verschiedene von dieser Kreuzung stammende diploide Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die wachstumsfähig sind, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweisen.
Von verschiedenen auf diese Weise erhaltenen Stämmen hat man als Beispiel den oben erwähnten Stamm NCIMB 40328 eingereicht. Dieser Stamm hat eine relativ mäßige Wachstumsfähigkeit in dem herkömmlichen, Fed batch-Verfahren genannten Backhefe-Kulturverfahren, wie man in Fig. 1 sehen kann, die die im oben beschriebenen Wachstumstest erhaltenen Ergebnisses angibt.
Er besitzt jedoch eine gute Teigtreibfähigkeit, da er den entsprechenden oben beschriebenen Test gut bestanden hat.
Er besitzt schließlich eine ausgeprägte LTI-Eigenschaft, wie man in Fig. 2 sehen kann, die sein CO&sub2;-Produktionsniveau in Form eines dreidimensionalen Diagramms in Abhängigkeit von der Temperatur und der Fermentationsdauer in Maltosemedium zeigt, wie es durch den oben ausführlich beschriebenen CO&sub2;-Produktionstest bestimmt wird. Man sieht nämlich, daß er zwischen 3 und 10ºC während mindestens etwa einer Woche inaktiv ist, jedoch überlebt und in der Lage ist, nach etwa 6 bis 7 Tagen ab etwa 13-14ºC eine beträchtliche Aktivität wiederzuerlangen. Man sieht insbesondere, daß sein CO&sub2;-Produktionsniveau nach 7 Tagen zwischen 3 und 8ºC noch nahe bei null ist und daß es nach 7 Tagen bei 10ºC nur auf etwa 8 ml pro g Preßhefe ansteigt. Dagegen steigt sein CO&sub2;-Produktionsniveau in Maltosemedium nach 6 Tagen ab 13-14ºC auf mehr als 40 ml/g an.
Man stellt ferner fest, wie in Fig. 8 zu sehen ist, daß sein CO&sub2;-Produktionsniveau in Maltosemedium bei 30ºC ab etwa 2 h auf mehr als 20 ml/g ansteigt.
Dieser Stamm CIMB 40328 besitzt ferner die folgenden Merkmale:

Morphologie:

Elliptische Zellen. Manche Zellen werden größer und bilden ein Pseudomycelium.

Fermentation der Zucker:

Der Stamm kann Saccharose, Maltose und Glucose fermentieren.

Beispiel 2:

Man geht vom selben Ausgangsstamm aus und geht auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 bis zur Selektion von zwei Rückkreuzungssegreganten mit ausgeprägter LTI-Eigenschaft bei 10ºC sowie dem Genotyp MATαleu2 his3/4 mal vor.
Man nimmt eine Rückkreuzung eines dieser beiden Segreganten mit einem haploiden Wildstamm von Saccharomyces cerevisiae vor, beispielsweise mit dem dem Fachmann wohlbekannten Stamm X2180-1A mit dem Genotyp MATa CUP1 SUC2 gal2 mal mel (vgl. Yeast Genetics Stock Center, 6. Ausgabe des Katalogs).
Man selektioniert einen Segreganten dieser Rückkreuzung mit ausgeprägter LTI-Eigenschaft bei 10ºC sowie dem Genotyp MATαhis3/4 leu2 mal.
Man nimmt eine Rückkreuzung dieses Segreganten mit demselben Stamm X2180-1A wie oben vor, um die auxotrophen Mutationen his3/4 und leu2 zu entfernen.
Man selektioniert einen Segreganten dieser Rückkreuzung, der den Genotyp MATα mal und eine auf eine einzige Mutation zurückzuführende beträchtliche LTI-Eigenschaft bei 10ºC aufweist, d.h. eine vollkommene 2:2-Segregation hinsichtlich dieser LTI-Eigenschaft besitzt.
Man nimmt eine Rückkreuzung dieses Segreganten mit einem haploiden Wildstamm von Saccharomyces cerevisiae mit wenigstens einem MAL-Gen vor, wie beispielsweise dem dem Fachmann wohlbekannten Stamm 1403-7A (vgl. Yeast Genetics Stock Center, 6. Ausgabe des Katalogs).
Man selektioniert einerseits einen Segreganten dieser Rückkreuzung mit ausgeprägter LTI-Eigenschaft bei 10ºC sowie dem Genotyp MATαMAL und andererseits zwei Segreganten dieser Rückkreuzung mit ausgeprägter bzw. stark ausgeprägter LTI-Eigenschaft bei 10ºC sowie mit jeweils dem Phenotyp MATa ura2 mal.
Man nimmt eine Kreuzung jedes dieser beiden letztgenannten Segreganten mit dem ersten vor und selektioniert verschiedene von diesen beiden Kreuzungen stammende diploide Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die wachstumsfähig sind und LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweisen.
Von den verschiedenen so erhaltenen Stämmen wurden als Beispiel die oben erwähnten, jeweils aus einer dieser beiden Kreuzungen hervorgehenden Stämme NCIMB 40329 und NCIMB 40330 eingereicht. Diese beiden Stämme besitzen eine relativ gute Wachstumsfähigkeit in den herkömmlichen, Fed batch-Verfahren genannten Backhefe-Kulturverfahren, wie man in Fig. 1 sehen kann.
Sie besitzen ferner eine gute Teigtreibfähigkeit, da sie den entsprechenden vorstehenden Test gut bestanden haben.
Sie besitzen schließlich eine ausgeprägte LTI-Eigenschaft. In den Fig. 3 und 4 sieht man nämlich, daß sie in Maltosemedium zwischen 3 und 10º während mindestens einer Woche praktisch inaktiv sind, jedoch überleben und in der Lage sind nach etwa 5 bis 7 Tagen ab etwa 11-14ºC eine beträchtliche Aktivität wiederzuerlangen. Man sieht insbesondere, daß ihr CO&sub2;-Produktionsniveau nach 7 Tagen zwischen 3 und 9ºC noch nahe bei null ist und daß es nach 7 Tagen bei 10ºC nur auf etwa 12 ml/g Preßhefe ansteigt. Dagegen steigt ihr CO&sub2;-Produktionsniveau nach 6 Tagen ab 12-14ºC auf mehr als 40 ml/g an.
Ferner stellt man fest, wie in Fig. 8 zu sehen ist, daß ihr CO&sub2;-Produktionsniveau in Maltosemedium ab 1,5 h bei 30ºC schnell auf mehr als 20 ml/g ansteigt.
Diese Stämme besitzen außerdem die folgenden Eigenschaften:

NCIMB 40329

Morphologie:

Elliptische Zellen. Größe der Zellen relativ homogen.

Fermentation der Zucker:

Kann Saccharose, Maltose und Glucose fermentieren.

NCIMB 40330

Morphologie:

Elliptische Zellen. Größe der Zellen relativ homogen.

Fermentation der Zucker:

Kann Saccharose, Maltose und Glucose fermentieren.

Beispiel 3

Man geht von einem handelsüblichen polyploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae aus, wie er von der Firma Fould Springer unter der Bezeichnung "levure boulangère bleue" vertrieben wird, dessen Zellen drei bis viermal mehr DNA als die Zellen eines haploiden Stamms von Saccharomyces cerevisiae enthalten.
Um diesen Stamm sporulieren zu lassen, läßt man Zellen von ihm zwei Tage bei 30ºC auf einem Vorsporulationsmedium PSA wachsen. Man überträgt sie anschließend auf ein Sporulationsmedium SA, auf dem man sie 4 Tage bei 30ºC hält.
Man isoliert dann Sporen und läßt sie auf einem YPD-Kulturmedium keimen, um Stämme, d.h Segreganten, mit geringer Ploidie zu erhalten.
Man selektioniert einen dieser Segreganten, der stark aus geprägte LTI-Eigenschaft bei 10ºC besitzt und außerdem den Paarungstyp MATα hat.
Man nimmt eine Rückkreuzung dieses Segreganten mit einem anderen dieser Segreganten mit geringer Ploidie vor, der keine LTI-Eigenschaft, jedoch den Paarungstyp MATa aufweist.
Man selektioniert mehrere Segreganten dieser Rückkreuzung, die eine stark ausgeprägte LTI-Eigenschaft bei 10ºC und einen Paarungstyp aufweisen.
Man nimmt mehrere Kreuzungen zwischen Segreganten mit entgegengesetzten Paarungstypen vor und selektioniert verschiedene aus diesen Kreuzungen hervorgehende polyploide Stämme von Saccharomyces cerevisiae, die wachstumsfähig sind und LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweisen.
Von verschiedenen auf diese Weise erhaltenen Stämmen wurden als Beispiel die oben erwähnten Stämme NCIMB 40331 und NCIMB 40332 hinterlegt. Diese beiden Stämme besitzen insbesondere eine sehr gute Wachstumsfähigkeit in dem Fed batch- Verfahren genannten gebräuchlichen Backhefe-Kulturverfahren, wie in Fig. 1 zu sehen ist.
Sie besitzen ferner eine gute Teigtreibfähigkeit, da sie den entsprechenden oben beschriebenen Test bestehen.
Sie besitzen schließlich eine ausgeprägte LTI-Eigenschaft. Man sieht nämlich in den Fig. 5 und 6, daß sie in Maltosemedium zwischen 3 und 9ºC während mindestens 4 bis 5 Tagen praktisch inaktiv sind, jedoch überleben und in der Lage sind, nach etwa 5 bis 7 Tagen ab etwa 10-13ºC eine beträchtliche Aktivität wieder zu erlangen. Man sieht insbesondere, daß ihr CO&sub2;-Produktionsniveau nach 5 Tagen zwischen 3 und 9ºC noch nahe bei null ist und daß es nach 7 Tagen bei 3-9ºC nur auf etwa 20-25 ml pro g Preßhefe ansteigt. Dagegen steigt ihr CO&sub2;-Produktionsniveau nach 5 Tagen ab 12-14ºC auf mehr als 60 ml/g an.
Man stellt ferner fest, wie in Fig. 8 zu sehen ist, daß das CO&sub2;-Produktionsniveau des Stammes NCIMB 40332 in Maltosemedium ab etwa 4 h bei 30ºC schnell auf mehr als 20 ml/g ansteigt.
Diese Stämme besitzen außerdem die folgenden Eigenschaften:

NCIMB 40331

Morphologie:

Runde Zellen. Größe der Zellen homogen.

Fermentation der Zucker:

Kann Saccharose, Maltose und Glucose fermentieren.

NCIMB 40332

Morphologie:

Runde Zellen. Größe der Zellen homogen.

Fermentation der Zucker:

Kann Saccharose, Maltose und Glucose fermentieren.

Claims

1. Verfahren zur Entwicklung eines diploiden Backhefe- Stamms, der LTI-Eigenschaft aufweist, d.h. die Eigenschaft, weniger als 20 ml CO&sub2; pro g Preßhefe nach 7 Tagen in einem auf 3 bis 10ºC gekühlten Maltosemilieu zu entwickeln und seine Aktivität bei 13-14ºC wiederzuerlangen, bei dem man einen haploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae einer mutagenen Behandlung unterwirft, wenigstens eine Mutante selektioniert, die LTI-Eigenschaft aufweist, wenigstens eine Rückkreuzung mit einem haploiden Wildstamm von Saccharomyces cerevisiae durchführt, der einen entgegengesetzten Paarungstyp reprasentiert, wenigstens zwei Segreganten der Rückkreuzung selektioniert, die LTI-Eigenschaft zeigen und vom entgegengesetzten Paarungstyp sind, wenigstens eine Kreuzung dieser Segreganten durchführt, und einen auf diese Weise erhaltenen Stamm selektioniert, der wachstumsfähig ist, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweist.

2. Verfahren anch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Feststellung der LTI-Eigenschaft des zu selektionierenden diploiden Stamms diesen während einiger Tage bei Temperaturen zwischen 3 und 14ºC einem Test der CO&sub2;-Erzeugung in einem Nährmedium unterwirft, das als Kohlenstoffquelle Maltose enthält.

3. Verfahren zur Entwicklung eines polyploiden Backhefe- Stamms, der LTI-Eigenschaft aufweist, d.h. die Eigenschaft, weniger als 30 ml CO&sub2; pro g Preßhefe nach 7 Tagen in einem auf 3 bis 9ºC gekühlen Maltosemilieu zu entwickeln und seine Aktivität bei 13-14ºC wiederzuerlangen, bei dem man, gegebenenfalls, einen polyploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae einer mutagenen Behandlung unterwirft, diesen Stamm sporulieren läßt, wenigstens einen Segreganten selektioniert, der LTI- Eigenschaft aufweist, wenigstens eine Rückkreuzung mit einem anderen Segreganten dieses Stamms durchführt, der einen entgegengesetzten Paarungstyp repräsentiert, wenigstens zwei Segreganten der Rückkreuzung selektioniert, die LTI-Eigenschaft zeigen und vom entgegengesetzten Paarungstyp sind, wenigstens eine Kreuzung dieser Segreganten durchführt, und einen auf diese Weise erhaltenen polyploiden Stamm selektioniert, der wachstumsfähig ist, LTI-Eigenschaft und eine Teigtreibfähigkeit aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Feststellung der LTI-Eigenschaft des zu selektionierenden polyploiden Stamms diesen während einiger Tage bei Temperaturen zwischen 3 und 14ºC einem Test der CO&sub2;-Erzeugung in einem Nährmedium unterwirft, das als Kohlenstoffquelle Maltose enthält.

5. Diploider Stamm der Backhefe Saccharomyces cerevisiae, der beim Zulaufverfahren wachstumsfähig ist und eine Teigtreibfähigkeit, ein Produktionsniveau von CO&sub2; von weniger als ml pro g Preßhefe nach 7 Tagen in einem auf 3-10ºC gekühlten Maltosemilieu und ein Produktionsniveau von CO&sub2; von wenigstens 40 ml pro g Preßhefe nach 6 Tagen in einem Maltosemilieu einer Temperatur von wenigstens 14ºC aufweist.

6. Polyploider Stamm der Backhefe Saccharomyces cerevisiae, der beim Zulaufverfahren wachstumsfähig ist und eine Teigtreibfähigkeit, ein Produktionsniveau von CO&sub2; von weniger als ml pro g Preßhefe nach 7 Tagen in einem auf 3-9ºC gekühlten Maltosemilieu und ein Produktionsniveau von CO&sub2; von wenigstens 60 ml pro g Preßhefe nach 6 Tagen in einem Maltosemilieu einer Temperatur von wenigstens 13ºC aufweist.

7. Backhefe-Stamm nach Anspruch 5, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus den Stämmen Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40328, 40329 und 40330 besteht.

8. Backhefe-Stamm nach Anspruch 6, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus den Stämmen Saccharomyces cerevisiae NCIMB 40331 und 40332 besteht.

9. Verwendung eines Backhefe-Stamms nach einem der Ansprüche 5 bis 8 bei der Herstellung von Backwaren zum Backen im Ofen nach einer Konservierung unter Kühlung.

10. Verwendung eines Backhefe-Stamms nach einem der Ansprüche 5 bis 8 als Indikator des Überschritens der Temperatur in Lebensmittelprodukten für eine Konservierung unter Kühlung.