PT99457B

PT99457B - Processo para a preparacao de uma levedura de padeiro

Info

Publication number: PT99457B
Application number: PT99457A
Authority: PT
Inventors: Herbert Hottinger; Peter Niederberger; Christof Gysler
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1999-02-26
Also published as: US5827724A; JPH0771474B2; JPH11332554A; CA2055052C; GR3020129T3; CH681307A5; EP0487878B1; PT99457A; IE74955B1; IE913680A1; US5399492A; DK0487878T3; AU8596791A; EP0487878A1; US5480798A; CA2055052A1; ATE135396T1; ES2084750T3; AU650481B2; JPH0576348A

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um processa para a preparação de uma estirpe ds levedura ds padeiro apresentando uma propriedade 1ti, bem somo a uma estirpe de levedura quando preparada pelo processo apresentado»

São conhecidos diversos processos para a preparação de estirpes de levedura de padeiro, baseados designadamente na genética tradicional e tendentes a conferir a essas estirpes propriedades especiais úteis na indústria ds panificação»

Na US 4547374 por exemplo, é descrito um processo para a preparação, através de hibridações selectivas, de uma estirpe de uma espécie de Sacharomyces residentes & congelação s que pode ser utilizada na indústria panificadora para a preparação de uma massa ds pão destinada a • ser congelada antes da fermentação e cozedura»

F.P.

i

Na US 4341871 são descritos híbridos de levedura de padeiro que podem ser desidratados, mesmo sob •forma prensada, sem perca excessiva da sua actividade»

Na US 4663901 são descritas estirpes puras de levedura de padeiro capazes de -fermentar e de fazer subir massas quer açucaradas, quer não açucaradas, e obtidas por hibridação através de -fusão protoplásmica de mut antes petite»

São igual mente conhecidos artigos de padaria comercializados, destinados a serem conservados em •frigorífico antes da -fermentação e cozedura» Estes artigos, tais como pãezinhos s croissants por exemplo, contêm no entanto um agente de -fermentação químico»

A presente invenção tem como objectivo a apresentação de um processo para a preparação de ie padeiro.

bsm como as itirpí levedura de (inactiva a esti r p es de 1evedur a 1evedur a ass i m obt i d as, q uer apr esen t am uma pr op r i ed ad e 11 i, ou seja, uma capacidade de se manterem inactivas mas sobreviverem sob refrigeração (Iti é a sigla da expressão inglesa low tsmperature inactive), e que possam ser utilizadas como leveduras de padeiro na preparação ds artigos de padaria destinados a serem cozidos no forno imediatamente antes de serem consumidos, após conservação em frigorífico, câmara frigorífica ou balcão refrigerado, por exemplo»

Assim, numa primeira forma de execução do processo para a preparação de uma estirpe da padeiro apresentando uma propriedade “Iti baixa temperatura) de acordo com. a presente invenção, submete-se a um tratamento hap1ó i de de Saccharomyces cerevis 1 ae, um mutante apresentando uma propriedade Iti, realiza-se pelo menos um cruzamento retrógado <backcross) com uma estirpe hap 3. ó ide selvagem de Saccharomyces cerevi si ae apresentando um tipo de acasalamento (mating type) oposto, seleccionam—se pelo menos dois sagregant.es de cruzamento retrógado (backcross) apresentando uma propriedade iti e tipos ds acasalamento (mating types) opostos, realiza-se pelo menos um mutagénico uma estirpe se1ecc i ona—ss pelo menos

cruzamento ds tais segregantes, e selecciona-se uma estirpe diplóide assim obtida, apresentando um potencial ds crescimento, uma propriedade Iti a a capacidade de levedar uma massa»

Pela expressão potencial de crescimento compreende-se, na presente exposição, a capacidade ds ser cultivada com um bom rendimento e uma boa produtividade através de um processo de cultura utilizável á escala industrial, designadamente pelo processo de cultura tradicional da levedura de padeiro conhecido pela designação de cruzamento retrôgado (adição lenta e progressiva de uma solução de açúcar a uma suspensão de levedura em condições aerôbicas, por -forma a ev itar a formação de álcool durante a produção de biomassa e a max i m i z ar o rend i mento)»

Da mesma -forma, pela expressão capacidade ds levedar uma massa compreende-se a capacidade de transformar muito lentamente uma massa à temperatura ds refri geração, por exemplo através de uma produção muito lenta de metabolitos tais como o CO_K>que pode ser absorvido pela massa, e álcool que pode actuar como agente de conservação da massa, tendo essa transfarmação muito lenta como consequência o facto da a massa ser susceptível de crescer quando é metida directamente no forno depois de ter sido conservada em frigorifico, em câmara frigorífica ou balcão refrigerado, por ex emp1o»

Numa segunda -forma de execução do processo para preparação de uma estirpe de levedura de padeiro apresentando uma propriedade Iti de acordo com a presente invenção, submete-se, se for o caso, a um tratamento mutagánico uma estirpe poliplãide de Saccharomyces cerevisiae, faz-se esporular essa estirpe, selecciona-se pelo menos um mutante apresentando um propriedade Iti, realiza-se peio menos um cruzamento retrôgado (backcross) com uma outra segrsgante desta estirpe apresentando um tipo de acasalamento (mating type) oposto, seieccionam-se pelo menos dois segregantes de cruzamento retrôgado (backcross) apresentando uma propriedade Iti e tipos de acasalamento (“mating type) opostos, realizase pelo menos um cruzamento ds tais segregantes, e seleccionase uma estirpe poliplóide assim obtida, apresentando um potencial de crescimento, uma propriedade lti“ e a capacidade de levedar· uma', massa.

Com e-feito, desta -forma -foi possível preparar estirpes de levedura de padeiro apresentando a propriedade de serem praticamente inactivas às temperaturas usuais de refrigeração, designadamente a temperatura à voltai dos 3-9 ou 10°C, sobrevivendo no entanto a essas temperaturas e de recuperarem em seguida a sua actividade a uma temperatura mais elevada, designadamente a partir dos 13~14°C por exemplo.

Tais estirpes de levedura de padeiro permitem assim substituir um agente de -fermentação químico na preparação de artigos de padaria destinados a, apôs refrigeração, serem cosidos no -forno antes de serem consumidos, Permitem em particular a preparação de artigos con-feccionados, tais como pãezinhos, croissants ou bases para pizzas, ou de massas para serem trabalhadas pela dona de casa, por exemplo, que apresentem após a re-f rigeração e cozedura no -forno, qualidades organolépticas comparáveis às apresentadas pelos mesmos artigos levedados de -fresco sob a acção de uma levedura ds padeiro tradicional existente no mercado, e cozidos no “ϊ* Ο Γ* Π ϋ n

Tais estirpes podem de igual modo ser utilizadas como indicadores da ultrapassagem da temperatura em produtos alimentares destinados a serem conservados sob r e -f r i g e r ação.

Para a realização do presente processo pode, pois, partir-·se quer de uma estirpe haplóide de Saccharomyces cerevi si ae tal como as que constituem as leveduras de padeiro tradicionais de laboratório, quer de uma estirpe poliplóide de Saccharomyces cerevi si ae tal como as que constituem as leveduras de padeiro tradicionais comerc ializadas, por ex emp1o,

Na re-f er ida primeira -forma d® execução do presente processo onde ss parte de uma estirpe haplóide de Saccharomyces cerevisiae, submete-se pois esta estirpe a um tratamento mutagénico. Para esse efeito, podem fazer-se crescer células desta estirpe num meio YPD contendo 2% de glucose, 1% de extracto de levedura e 2% de peptona, por exemplo, e as células podem ser tratadas com um agente mut agé nico tal como o metano-sulfonato de etilo (EMS) ου o 1CR170 por exemplo.

Em seguida, seisccionam-se de preferência diversos mutantss apresentando uma propriedade 1 ti, designadamente uma propriedade de inactividade mas de sobrevivência a uma temperatura de aprox. 9 ou 10°C

Em seguida, realiza-se pelo menos um cruzamento retrógado Cbackcross) do ou dos mutantss seleccionados com uma estirpe haplóide selvagem ds Saccharomyces cerevi si as apresentando um tipo de acasalamento (mating type) oposto, por forma a evitar mutaç-oes indesejadas que a estirpe haplóide de partida pode apresentar à partida ou apôs o referido tratamento mutagénico, e/ou por forma a manter se possível uma propriedade Iti devida apenas a uma única mutação. Se forem realizados vários cruzamentos retrógados, pode ssleccionar—ss entre duas operações sucessivas pelo menos um segregante apresentando uma propriedade Iti, designadamente uma propriedade de inactividade mas de sobrevivência a uma temperatura de aprox. 9 ou 10°C, e pode submeter—se este ou estes segregantes à segunda destas duas operações sucessivas.

Sei ecoionam-se então pelo menos dois segregantes de cruzamentos retrógados, apresentando tipos de acasalamento opostos e uma propriedade Iti, designadamente uma propriedade de inactividade mas ds sobrevivência a uma temperatura de aprox. 9 ou iO*C, s realiza-se pelo menos um cruzamento de tais segregantes.

Por fim selscciona-se uma estirpe diplóide de Saccharomyces cerevi si ae assim obtida, apresentando um potencial de crescimento, uma propriedade Iti s a capacidade de levedar uma massa. Nesta etapa final podem cumprir-se na real idade critérios ds selecção mais severos e mais completos do que os utilizados durante as etapas («ΐ?/*·».

precedentes, Em particular, pode submeter-se a ou as referidas estirpes diplóides a um ensaio de crescimento pelo processo de cultura tradicional de levedura de padeiro conhecido pela designação de -fermentação descontínua (fed-batch).

Em seguida, pode veri-ficar-se a propriedade Iti, submetendoa ou as referidas -estirpes diplóides a um ensaio da produção de CO® em meio nutritivo mal tosado, ou seja, em meio nutritivo contendo mal tose como -fonte ds carbono, em função do tempo, ρ-or exemplo todos os dias entre o 32 e 72. dia, s em -função da temperatura, por exemplo a todos os graus entre 3 e 14° C.

Por -fim, pode verificar-se a capacidade de a estirpe levedar uma massa, incorporando-o como único agente de I©vedação numa massa para pizza, por exemplo, -formando bases ds pizza com essa massa, conservando-as durante alguns dias ou algumas semanas á temperatura de refri geração, e cozendo-as depois no forno. Pode igual mente completar-se esse ensaio, verificando-se a produção de CO^ da estirpe em meio mal tosado a uma temperatura de aprox» 20-30°C, por exemplo.,

Pondo em prática esta primeira forma de execução do processo de acordo com a presente invenção, podem pois produzir-se estirpes que apresentam uma propriedade ].ti considerável, graças à qual podem ser utilizadas na confecção de artigos de padaria destinados a serem cozidos no forno imediatamente antes de consumidos, depois de terem sido conservados sob refri geração. Podem, em especial, produzir-se estirpes de levedura ds padeiro Saccharomycss cerevi si as apresentando um potencial de crescimento em processo de fermentação descontínua Cfed-taatch5, a capacidade de levedarem uma massa, um nível de produção de CO® inferior a 20 ml por g ds levedura prensada após 7 dias em meio maltosado refrigerado a 3-10°C, e um nível de produção de CO® de pelo menos 40 ml por g ds levedura prensada após 6 dias em meio maltosado temperado a pelo menos 14°C.

De entre as diferentes estirpes ds Saccharomyces cerevisiae assim obtidas, foram depositadas, de acordo com o Tratado de Budapeste, em 06.11.90, três a titulo

d e ex emp 1 o, j un t o Mar i ne Bact er i a Lt d „ ABERDEEN AB9 8DG,

da National Collection o-f Industrial and (NCIMB), P.O.Box 31, 135 Abbey Road,

Escócia (Reino unido), onde receberam os números NCIMB 40328, 40329 e 40330.

Na refer i d a seg un d a -forma ds execução do processo de acordo com a presente invenção, partese de uma estirpe poliplóide ds Saccharomy ces cerevisiae, s submete-se depois, se -for o caso, essa estirpe a um tratamento mutagénica. Na realidade, constatou-se que nem sempre é necessário submeter uma tal estirpe a um tratamento mutagénico, algumas estirpes de levedura ds padeiro p o d e m a p r e s e n t a r ;vi denci adas poi s por ex emp1o comercial izadas, susceptíveis ds serem processo.

à partida mutações no decurso do presente

No caso de se submeter uma tal estirpe poliplóide a um tratamento mutagénico, pode, para o efeito, fazer-se crescer as células dessa estirpe num meio YPD contendo 2% de glucose, 1% de extracto ds levedura e 2% ds peptona, por exemplo, s as células obtidas podem ser tratadas com um agente mutagénico tal como o metano-sulfonato de etilo CEMS) ou o ICR--70, por ex emp 3. o.

Nesta segunda forma de execução do presente processo, -faz-se pois esporular uma estirpe poliplóide cie Saccharomyces cerevi si ae depois de, se for o caso, a ter submetido a um tratamento mutagénico. Para fazer esporular esta estirpe, pode fazer-se crescer as células desta estirpe durante um ou dois dias num meio dito de pré-esporulação, tal como um meio PSA contendo O,8% de extracto de levedura, 0,3% de peptona, 10% de glucose e 2% de agar—agar. Em seguida, podem ser transferidas e mantidas durante 3-5 dias num meio de esporulação tal como um meio SA contendo 1% de acetato de potássio, 0,1% de extracto de levedura, 0,05% de glucose e 2% de agar-agar. Em seguida, podem isolar-se os esporos por micromanipulação, por exemplo, e obter-se assim estirpes com ploidia reduzida, ou seja, chamadas segregantes, fazendo-as germinar por exemplo num meio YPD.

Seleccionam-se em seguida de

preferência diversos segregantes da referida estirpe poliplóide ap resent an d o uma pr opri ed ad e “1t i , d esi gnad ament e uma propriedade de inactividade, mas de sobrevivência, a uma temperatura de aprox» 9-10°C»

Em seguida, realiza-se pelo menos um cruzamento retrógado (backcross) do ou dos segregastes seleccionados com um outro segregante da referida estirpe poliplóide gue não apresente qualquer propriedade Iti, mas apresentando um tipo de acasalamento (mating type) oposto, por forma a evitar mutações indesejadas que a estirpe poliplóide pode apresentar è partida ou após o eventual tratamento mutagónico, e/ou por forma a manter se possível uma propriedade Iti devida apenas a uma única, mutação» Se forem realizadas vários cruzamentos retrógados, pode sei ecc :i. on ar —se entre duas operações sucessivas pelo menos um segregante apresentando uma propriedade Iti, designadarnente uma propriedade de inactividade mas de sobrevivência a uma temperatura de aprox» 9 ou 10°C, e pode subfflster-se este ou estes segregantes à segunda destas duas operações sucessivas»

Seleccionam-se então pelo menos dois segregantes de cruzamentos retrógados, apresentando tipos de acasalamento opostos e uma propriedade Iti, designadarnente uma propriedade de inactividade mas de sobrevivência a uma temperatura de aprox» 9 ou 10°C, e realiza-se pelo menos um cruzamento de tais segregantes»

Por f i m, se1ecc i ona-se uma est i rps p o1i p16 i d e d e Sacch ar omyces cer ev i s i ae assi m obt id a, apresentando um potencial de crescimento, uma propriedade Iti e a capacidade de levedar uma massa» Para tal,podem seguir-se os mesmos critérios ds seiecção e submeter a ou as referidas estirpes poliplóides .aos mesmos ensaios descritos acima para esta etapa final da referida primeira forma de execução do processo da presente invenção»

Pondo em prática esta segunda forma de execução do processo de acordo com a presente invenção, podem pois produzir-se estirpes que apresentam uma , propriedade Iti considerável, graças à qual podem ser utilizadas na confecção ds artigos ds padaria destinados a serem cozidos no forno imediatamente antes de consumidos, depois de terem sido conservados sob refrigeração» Podem, em especial, produz ir-se estirpes de levedura de padeiro Saccharomyces cerevi si as apresentando um potencial de crescimento em processo de fermentação descontínua <fed~ batch), a capacidade de levedarem uma massa, um nível de produção de GO35 inferior a 30 ml por g de levedura prensada após 7 dias em meio mal tosado refrigerado a 3-:L0°C, e um nível de produção de C0_a de pelo menos 60 ml por g de levedura prensada após 6 dias em meio maltosado temperado a pelo menos 13⁰C»

De entre as diferentes estirpes de Saccharomyces cerevi sias assim obtidas, foram depositadas, de acordo com o Tratado de Budapeste, em 06»11»90, duas a título de exemplo, junto da National Collection of Industrial and Marine Bactéria Ltd» (NCIMB), P»0»Box 31., 1.35 ftbbey Road, ABERDEEN AB9 SDG, Escócia (Reino Unido), onde receberam os números NCIMB 40331. e 40332»

Os exemplos que ss seguem, são apresentados para ilustrar o processa e as estirpes obtidas pelo processo a que se refere a presente invenção» Os vai ores para percentagens e partes são indicados em peso, salvo indicação em contrário»

Estes exemplos são precedidos de uma descrição de diversos ensaios, da composição dos diferentes meios utilizados, de uma breve descrição das diferentes figuras em anexo e de um exemplo comparativo»

ENSAIOS

- Ensai os de cresci mento

Para simular um ensaio real de crescimento no processo de cultura tradicional da levedura de padeiro, conhecido sob a designação de fermentação descontínua

Q íf ed-batch)

concebeu-se um ensaio de crescimento sobre

diversos meios de cultura contendo -fontes de carbono nâo fermentáveis, tais como o ácido láctico (meio S-lac> , o etanol (meio S-EtQH 2% e S-EtQH 1% e o glicerol (meio YP6) „

As considerações que serviram ds base a este ensaio são o -facto de a levedura de padeiro acumular metabolitos carbónicos não -fermentáveis em resposta a uma velocidade de adição crítica de uma solução ds açúcar fermentável tal como a sacarose, durante o processo ds fermentação descontínua. Estes metabolitos t'ê'm um efeito inibidor e tóxico sobre o metabolismo e a respiração da levedura. As estirpes que apresentam um potencial de c resc i mento elevada p od em acumu1 ar esses met ab oli tos car b ó ni c os tóxicos a velocidades de adição superiores, e são menos sensíveis a uma acumulação ds tais metabolitos do que as estirpes que apresentam um potencial de crescimento menos elevado.

Qs resultados deste ensaio ds crescimento são apresentados na Figura 1, em termos das dimensões que as colónias apresentam após incubação ds células de uma estirpe sobre placas dos referidos meios ds cultura, durante 3 dias a 30°C» As bandas horizontais correspondentes a cada meio de cultura param nas marcas 0,5 mm§ 0,5-1,5 mmy '1,5-2,5 mm§ e 2,5 mm, indicando uma dimensão média das colónias observadas.

Ensaio de pr-ouução de JÇQ₂

Este ensaio é realizado num aparelho especialmente concebido para o efeito, que compreende um bloco com gradiente de temperatura apresentando câmaras com temperaturas variáveis, por exempla, nas quais se poda introduzir a extremidade inferior dos tubos de fermentação» Estes tubos apresentam uma extremidade superior fachada e graduada, bem como um balão de expansão montado lateralmente» 0 • C0_s produzido pela levedura acumula-se na extremidade superior

graduada de cada tuba, podendo a meia de cultura deslocado pela

I acumulação do gás passar para o balão de expansão.

Para realizar este ensaio, inoculamse num balão de 500 ml, 2 ml ds uma cultura ds uma noite sobre o meio YPD da estirpe a testar, em 200 ml dum primeira meia de ct.ilfura contendo 0,67% de uma base azotada sem aminoácidos, tal como por exemplo, o produto comercializado pela -firma Difco sob a designação yeast nitrogen base w/o amino acids, 0,5% de extracto de levedura, 2% de sacarose, 1% de succinato de sódio e ácido clorídrico concentrado para acertar o pH a 4,5. Incubass durante 24 h a 30°C, sob agitação.

Separ am-se as c é1u1 as por centrifugação a 600 g e a 20°C durante 5 minutos, e num balão de 500 ml, suspendem-se em 200 ml de um segundo meio de cultura contendo 0,67% de uma base azotada sem aminoácidos, 0,3% ds extracto de levedura, 0,3% de sacarose, 1% de succinato de sódio e ácido clorídrico concentrado para acertar o pH a 4,5. Incuba-se durante 24 h a 30°C, sob agitação.

Separam-se as células por centrifugação a 600 g e a 4°C durante 5 minutos, e lava-se duas vezes o depósito compactada de células ds levedura obtido com 50 ml de água destilada.

Suspendem-se as células em 10 ml ds água destilada e transferem-se para tubos de polipropileno de 15 ml, graduados s previamente pesados. Centrifugam-se a 3000 g e a 4°C durante 10 minutos» Escoam-se os tubos, pesam—se os depósitos compactados de levedura e suspendem-se, à razão de 0,61 g de resíduo de levedura, correspondentes a 0,5 g ds levedura prensada apresentando um teor de matéria seca de aprox. 27%, por ml, num terceiro meio de cultura contendo 0,67% de uma base azotada sem aminoácidos, 2% de mal tose, 1% de succinato de sódio e ácido clorídrico concentrado para acertar o pH a 4,5» Introduzem-se 0,5 ml (para temperaturas > 10°C) ou 1 ml (para temperaturas £ 10°C) em tubos de fermentação como os acima descritos, sendo cada um delas previamente cheio com 5 ml do referido terceiro meio de cultura, ou seja, do meio da cultura maltosado, e arrefecidos a 4°C.

Incubar· qs tubos de fermentação às temperaturas desejadas, no bloco com gradiente de temperatura acima descrito. Verifica-se a produção de C0_ia a intervalos seleccionados, depois de mergulhar os tubos durante alguns segundos num banho de agitação ultrassónica para libertar· as bolhas de C0_a retidas no meio líquido.

3. Ensaio para» determinar a capacidade de levedar uma massa

Prepara-se uma massa misturando 30 partes de água, 60 partes de farinha branca de trigo mole, '1,4 partes de cloreto de sódio e 7,6 partes de óleo de amendoim» Incorpora-se nessa massa a levedura a testar, á razão de í parte de levedura prensada» Tendem-se bases para pizza com 20 cm de diâmetro e 0,5 cm de espessura» Conservam-se durante ΞΊ d:i.as a S°C, em embalagem plástica hermeticamente fechada» as bases para pizza apresentarem uma espessura de aprox»

Retiram-se então as bases para pizza das suas embalagens e cozem-se no forno durante 15 minutos a 1SO°C»

Considera-se que o ensaio teve 'êxito

.. ....... L.................................. _í ....................

cm e qualidades organolépticas, designadamente um sabor e textura, comparáveis ás de bases para pizzas analogas, preparadas com uma massa levedada de fresco por acção de uma levedura de padeiro tradicional comercializada«

MEIOS DE CULTURA

YPD

Glucose 2%

Extracto de levedura 1% Peptona 2%

Glucose 10%

Extraíto de levedura 0,8% Peptona 0,3%

Ag ar—ag ar 2% »i-·

Glucose 0,05%

Extraeto de levedura 0,1% Acetato de potássio 1%

Agar—agar 2% •lac

0,67% de base azotada sem aminoácidos 0,5% de ácido láctico 2% de agar-agar

S-EtOH a 1% ou 2%

0,67% de base azotada sem aminoácidos 1% ou 2% de etanol 2% de agar—agar

YPG

Glicerol 2%

Extraeto de levedura 1%

Peptona 2%

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1

Rep r esent a ç ão linear da dimensão da colónias obtidas por- crescimento de células das estirpes NCIMB 40328, 40329, 40330, 40331, 40332 e levedura de padeiro azul

CLBB, para comparação), sobre os meios de cultura S-lac, S-EtOH

1% e 2%, e YPG.

Figuras 2 a 7

Repr esent a ç ão t r i d i men sion a1 d o nível de produção de COs em meio maltosado, em função da temperatura e da duração, pelas estirpes NCIMB 40328 Cfig„2) , NCIMB 40329 CFig.3), NCIMB 40330 <Fig.4>, NCIMB 40331 (Fig.5), NCIMB 40332 (Fig,6) s levedura de padeiro azul CLBB, para comparação, Fig„7).

Figura 8

Representação bidimensional do nível de produção C0_a em meio maltosado a 30°C, em -função do tempo, pelas estirpes NCIMB 40328, 40329, 40330, 40332 e levedura de padeiro azul CLBB, para comparação).

Exemplo de comparação ft Titulo de comparação, submeteu-ss uma estirpe de levedura de padeiro comercializada, neste caso uma estirpe que constitui a levedura de padeiro comercializada pela -firma Fould Springer sob a denominação levedura de padeiro azul CLBB), aos mesmos ensaios utilizados acima para seleccionar as referidas estirpes diplôides s poliplóides apresentando um potencial de crescimento, uma propriedade Iti e a capacidade de levedar uma massa, ou seja, os ensaios 1 a 3 anteri ormente descritos.

0s resultados do ensaio comparativo de crescimento apresentados na Figura 1 revelam de -forma clara que a estirpe LBB possui um muito bom potencial de crescimento no processo de cultura tradicional para a levedura de padeiro, designado por fermentação descontínua Cfed-batch).

Os resultados do ensaio comparativo de produção de C0_a são apresentados na Figura 7, verificando-se que a produção de C0_s em meio mal tosado ultrapassa os 40 ml por g de levedura prensada, após 6-7 dias a 3-5-C, 5-6 dias a 5-9° C e 3-4 dias a Í0°C»

Para além di sso, ver i f i ca-se na Figura 8 que em meio mal tosado, a produção de C0_s pela estirpe LBB ultrapassa rapidamente os 20 ml por g de levedura prensada passadas cerca de 4 h a 30-C»

Os resultados do ensaio comparativo da capacidade de levedar· uma massa revelam que a estirpe LBB não á adequada a uma conservação por refrigeração antes da cozedura no forno» A embalagem plástica hermeticamente fechada, na qual é embalada a base de pizza obtida com a utilização da estirpe LBB, incha como um balão passado 1 dica a 8°C»

Pelo contrário, constata-se que praticamante não é perceptível qualquer diferença de qualidade entre as bases de pizza obtidas com a utilização das estirpes produzidas pelo processo da presente invenção e submetidas aos ensaios anter iormente ref er idos, reiat ivos à capac i dade ds levedar uma massa, por um lado, e as bases de pizza obtidas com a utilização da estirpe LBB e submetida ao mesmo ensaio, suprimindo-se a etapa de conservação sob refrigeração.

Exemplo 1

Parte-se de uma estirpe haplóide de

Saccharomyces_____cerevisiae tal como as que constituem as leveduras de padeiro tradicionais ds laboratório, designadamente de uma estirpe apresentando o genotipo riftTa arg4-17 his4—38 lysl-í met.8-1 trpl-l mal, que foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste, em 06=11.90, junto da National Collection of Industrial and Marine Bacterie Ltd» (NCIMB), P.O.Box 31, 135 Abbey Road, ABERDEEN AB9 8D8, Escócia (Reino Unido), onde recebeu o Nfi NCIMB 40333»

Submete—se esta estirpe a um tratamento mutagénico com EMS» Para tal, deixam—se crescer células desta estirpe em 5 ml de meio de cultura YPD até à fase estacionária, lavam-se uma vez com uma solução tampão de fosfato de potássio 100 mM de pH 7,0 e suspendem-se na mesma solução tampão à razão ds 10® células/ml»

Adicionam-se à suspensão 3% em volume de EMS e deixa-se reagir durante 1 h a 30°C, sob agitação vigorosa» Trava-se o tratamento por meio de diluição da suspensão sm 10 vezes o seu volume de uma solução de tiossulfato de sódio a 5%» Semeiam-se então as células sobre meio de cultura YPD sólido e cultivam-se durante 2 dias a 30°C» Em seguida, procede-se à repicagem sobre meio de cultura YPD sá li do e cultivam-se durante 3 semanas a 10-C ensaiar a sua pro p r i e d a d e 3. t i »

Seleccionam-se então alguns mutantes estáveis apresentando uma propriedade de inactividade mas de sobrevivência a essa temperatura»

Realiza-se um cruzamento retrógado (backcross) ds um desses mutantes apresentando um tipo de acasalamento HATa com uma estirpe haplóide selvagem de Saccharomyces cerevisiae tal como, por exemplo, a estirpe GRFÍS apresentando o genotipo MAT% can i hi s3-11,15 1 eu5-3, ί 12, que é

S»R»Fink, Whitehead Massachusetts 02 Í42, um seg r eg ante d este bem conhecida dos especialistas (ver Xnstitute, Nine Cambridge , Cambridge,

EUA) »

Seiecciona-se cruzamento retrógado (backcross) apresentando uma propriedade 1 ti fortemente acentuada a ÍO°C, bem como o genotipo MATa lysl h i s3/4 tr p1 ma1»

Rea3. i za-ss um cruzamento retr óçjado deste segregante com a mesma estirpe selvagem utilizada para o cruzamento retrógado de um mutante da estirpe de partida»

Seiecc i onam-se então dois segregantes deste cruzamento retrógado (backcross) apresentando uma propriedade 3.ti fortemente acentuada a 10°C, bem como o genotipo Hat of 1 eu2 Si i s5 / 4 mal»

Rea1i z a-se um c r uz amen to r etr ò g ad o de cada um destes dois segregantes com uma estirpe haplóide selvagem de Saccharomyces cerevisi ae apresentando pelo menos um gene MAL., tal como, por exemplo, a estirpe 1043-7A, que é bem conhecida dos especialistas (ver- Yeast Genetics Stock Center, 6ã edição do catálogo, de Rafaert Mortimer, Department of Biophysics and Medicai Physics, IJnçiversity of Califórnia, Berkeley, CA 94720, EUA),

Seisccionam-se então um segregante de cada um destes cruzamentos retrógados, apresentando uma propriedade lti fortemente acentuada a 10°C, bem como um deles o genotipo lifiTa MAL e o outro o genotipo HAT OÇ1 eu2 MAL.»

Realiza-se um cruzamento destes dois segregantes e seieccionam-se diversas estirpes diplóides de Saccharomyces cerevi si as resultantes deste cruzamento, que apresenta um potencial de crescimento, uma propriedade lti e a capacidade de levedar uma massa»

Entre as d:i. versas estirpes assim obtidas, depositou-se, a título de exemplo, a estirpe NCIMB 40328 acima referida» Esta estirpe apresenta um potencial de crescimento relativamente modesto no processo de cultura tradicional da levedura de padeiro, conhecido como fermentação d esc on t ín ua, c orno se p ode ver ific ar pela F ig»1, q ue i1ustra os resultados obtidos de acordo com o ensaio de crescimento acima descrito»

No entanto, apresenta uma boa capacidade de levedar uma massa., pois correspondeu bem no respectivo ensaio acima descrito»

Por f i m, apresenta uma pr oprisdade lti acentuada, como se pode verificar pela Fig»2, que representa sob a forma de diagrama tridimensional o seu nível de produção de CCf_a em função da temperatura e da duração da fermentação em meio mal tosado, conforme determinado através do ensaio de produção de pormenorizadamente descrito acima» Na real idade,verifica-se que aquela estirpe é praticamente inactiva entre 3-ÍO°C durante pelo menos cerca de 1 semana, mas que sobrevive e que é capaz de retomar uma actividade notável a partir dos 13-14°C passados cerca de 6-7 dias» Verifica-se em particular que o nível de produção de C0_s é ainda próximo de

zero após 7 dias entre 3-~8°C, e que apenas sobre aprox. 8 ml por g de levedura prensada após 7 dias a 10°C» Pelo contrário, o seu nível de produção de C0₂ em meio mal tosado sobe a mais de 40 ml/g de levedura prensada a partir dos 10°C_ç ao fim de 6 d i as»

Verifica-se igual mente, como se pode verificar pela Fig„8, que o seu nível de produção de CO^ em meio maltosado sobe rapidamente a mais de 20 ml/g a partir das 2 horas a 30°C.

Esta estirpe NC1MB 40328 apresenta, p ar a a 3. ê m d i sso, as c ar ac t er i st i c as ssg u i n tes s

Morfologia

Células elípticas» Certas células aumentam e formam uma pseudomicela»

Fermentação de açúcares

A estirpe á capaz de fermentar a sacarose, a maltose e a glucose»

Exemp l_o 2

Parte-se da mesma estirpe de partida e procede-se como no exemplo 1 atê à referida selecção de dois segregant.es de cruzamento retrógado apresentando uma propriedade Iti acentuada a 10°C, bem como o genotipo MATOt 1 eu2 his5/4 mal»

Rea1i z a-se um cruz ament o retr ógado de um destes segregantes com uma estirpe haplóids selvagem de Sac c h ar omy c es cerevi si as tal como, por exemplo, a estirpe X2180-1A apresentando o genotipo MATa CUFi SUC2 ga!2mal mel, que ê bem conhecida dos especialistas (ver Yeast Senetics Stock Center, 6â edição do catálogo)»

Selecciona-se um segregante deste cruzamento retrógado (backcross) apresentando uma propriedade Iti for te mente acentuada a iO°C, bem como o genotipo MATiX hi s3/4 1eu2 mal»

Realiza-se um cruzamento retrógado deste segregante com a mesma estirpe X21S0-1A utilizada acima, para eliminar as mutações auxotróficas his3/4 s leu2.

Seiecciona-se um segregante deste cruzamento rstrôgsdo apresentando o genotipo MAT mal, e uma propriedade 1 ti fortemente acentuada a 10° C, resultante de uma mutação única, ou seja, apresentando um segregação 2s2 perfeita no que diz respeito a esta propriedade Iti»

Realiza-se um cruzamento retrógado deste segregante com uma estirpe haplóide selvagem de Sac charomyces cerevisias apresentando pelo menos um gene MAL,., tal como, por exemplo, a estirpe 1043-7A, que ê bem conhecida dos especialistas (ver Yeast. Benetics Stock Center, óã edição do catálogo)»

Seleccionam-se então por um lado, um segregante deste cruzamento retrógado, apresentando ' uma propriedade Iti acentuada a ÍO°C, bem como o genotipo MATQiMAL, e por outro lado dois segregantes deste cruzamento retrógado, ap r esen tan d o r espec ti vamen te uma p r opr iedad ε 11i acentuada e fortemente acentuada a 10°C, bem como cada um deles o genotipo MATa ura3 mal=

Realiza-se um cruzamento ds cada um destes dois últimos segregantes com o primeiro, e seleccionamse diversas estirpes diplóides de Saccharomyces cerevisiae resultantes destes dois cruzamentos, que apresentam um potencial de crescimento, uma propriedade Iti e a capacidade de levedar uma massa»

Entre as diversas estirpes assim obtidas, depositaram-se, a título de exemplo, as estirpes NCIMB 40329 e ÍMCIMB 40330 acima referidas, e resultantes de cada um destes cruzamentos» Estas duas estirpes apresentam um potencial de crescimento relativamente bom no processo de cultura tradicional da levedura de padeiro» conhecido como fermentação descontínua, como se pode verificar pela Fig»l»

Apresentam igual mente uma boa capacidade de levedar uma massa, pois corresponderam bem no respectivo ensaio acima descrito.

Por fim, apresentam uma propriedade lti acentuada» Com efeito» verifica-se pelas Figuras 3 s 4, que são prat icamen te i nact i vas em meio mal tosado entre 3-10°C durante pelo senos cerca de 1 semana, mas que sobrevivem e que são capazes de retomar uma actividade notável a partir dos 1114°C passados cerca de 5-7 dias» Verifica-se em particular que o nivel de produção de C0_s é ainda próximo de zero apôs 7 dias entre 3-9^sC, e que apenas sobe a aprox. 12 ml por g de levedura prensada apôs 7 dias a 10°C» pt*Ouução ge sooe a mais

P e 1 o c o n t r a r i ο, ο η í v e 1 d e de 40 ml/g de levedura prensada a partir dos 12™14°C, ao fim de 6 dias»

Ver i fi ca-sa i gua1mente, corno se ρode verificar pela Fig»8, que o seu nivel de produção de C0_s em meio mal tosado sobe rapidamente a mais de 20 ml/g a partir de aprox» 1,5 horas a 30°C»

Estas estirpes apresentam, para além disso, as características seguintess

MCI MB 40329

Morfologi a

Células elípticas» Dimensão das cé1ulas reiat1vamente homogênea»

Fermentação de aoácares

A estirpe é capaz de fermentar a sacarose, a maltose e a glucose»

NCI.MB 40330

Morfologia

Células elípticas. Dimensão das cé1ulas reiativamente homogénea»

Fermentação de açúcares

A estirpe é capaz de fermentar a sacarose, a mal tose e a glucose»

Exemplo 3

Parte-se de uma estirpe poliplóide de Saccharomyces__cerevi si ae comercializada, como a que constitui a levedura de padeiro comercializada pela firma Fould Springer sob a designação levedura de padeiro azul, cujas células contêm 3 a 4 vezes mais DNA do que as células de uma estirpe haplóide de Saccharomy ces cerevisiae»

Para fazer esporular esta estirpe, fazem-se crescer as suas células sobre um meio de préesporulação PSA durante dois dias -a 30°C» Transferem-se em seguida para um meio de esporulação SA, onde são mantidas durante 4 dias a 30°C»

Isolam-se então os esporos e fazemse germinar sobre um meio de cultura YPD para obter estirpes, também designadas segregantes, com uma ploidia reduzida»

Seleccionam-se um destes segregantes apresentando uma propriedade 1 ti fortemente acentuada a 10°C, e apresentando por exemplo o tipo de acasalamento HAT 0( »

Realiza-se um cruzamento retrôgado deste segreganfe com um outro daqueles segregantes com ploidia reduzida, que não apresente uma propriedade Iti, mas o tipo de acasalamento HftTa.

Seleccionam-se vários segregantes deste cruzamento retrôgado que apresentam uma propriedade Iti fortemente acentuada a 10°C, bem como um tipo de acasalamento»

Realiza-se vâr ios c r uz amentos retrógados entre os segregantes apresentando tipos de acasalamento opostos, e seleocionam-se diversas estirpes poliplóides de Saccharoiayces_cerevisiae resultantes destes cruzamentos, que apresentem um potencial de crescimento, uma propriedade lti e a capacidade de levedar uma massa»

Entre as diversas estirpes assim obtidas, depôsitaram-se, a título de exemplo, as estirpes NCIMB 40331 e NCIMB 40332 acima referidas» Estas duas estirpes apresentam em especial um potencial de crescimento muito bom no processo de cultura tradicional da levedura de padeiro, conhecido como fermentação descontínua, como se pode verificar pela Fig»l

Apresentam igualmente uma boa capacidade de levedar uma massa, pois corresponderam bem no respectiva ensaio acima descrito»

Por fim, apresentam uma propriedade lti acentuada» Com efeito, verifica-se peias Figuras 5 e 6, que são praticamente inactivas em meio mal tosado entre 3-9° C durante pelo menos 4 a 5 dias, mas que sobrevivem e que são capazes de retomar uma actividade notável a partir dos '10-13° C passados cerca de 5--7 dias» Verifica-se em particular que o seu nível de produção de CO® é ainda próximo de zero após 5 dias entre 3-9°C, e que apenas sobe a aprox» 20-25 ml por g de levedura prensada após 7 dias a 3-9°C» Pelo contrário, o seu nível de produção de COs» sobe a mais de 60 ml/g de levedura prensada a partir dos Í2-14°C, ao fim de 5 dias»

Ver i f i c a-se i gua1men te, c orno se p od e verificar pela Fig» 8, que o nivel de produção des CDs» da estirpe NCIMB 40332 em meio maltosado sobe rapidamente a mais ds 20 ml /g a partir de aprox» 4 horas a 30° C„

Estas estirpes apresentam, para além d i sso, as c ar ac t er í st i c as seg u i n t es a

NCIMB 40331

Células redondas. Dimensão homogénea d ss céiulas

Fermentação de açúcares

A estirpe é capaz de fermentar a sacarose, a maltose e a glucose.

MCIMB 40550

Morfologia

Células redondas» Dimensão homogénea das células»

Fermentação de açúcares

A estirpe é capaz de fermentar a sacarose, a maltose e a glucose»

Claims

Processo para preparação de uma estirpe de levedura de padeiro apresentando uma propriedade Iti, (inactiva a baixa temperatura) caracterizado por se submeter a um tratamento mutagénico uma estirpe haplóids ds Sacchar omyces csrev i s i ae, se se 1 ecc i on ar ρ e3. o men os um mu t an t e apresentando uma propriedade “Iti, se realizar pelo menos um • cruzamento retrôgado (backcross) com uma estirpe haplóids
2-5 selvagem de Sac c h aromyces cerevi si ae apresentando um tipo de acasalamento (mating type) oposto, se seleccionar pelo menos dois segregantes de cruzamento retrógado (backcross) apresentando uma propriedade Iti e tipos de acasalamento (mating types) opostos, se realizar pelo menos um cruzamento ds tais segregantes, e se seleccionar uma estirpe diplóide assim obtida, apresentando um potencial de crescimento, uma propriedade 3.ti e a capacidade de levedar uma massa, — —

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, ss verificar a propriedade Iti da referida estirpe diplóide a seleccionar, submetendo a um ensaio de produção de C0_;a durante alguns dias em meio nutritivo contendo maltose como fonte de carbono, à temperatura entre 3 e 14° C.

Processo para preparação de uma estirpe de levedura de padeiro apresentando uma propriedade Iti, caracterizado por, se for o caso, se submeter a um tratamento mutagénico uma estirpe poliplóide de Saccharomyces cerevisiae, se fazer esporular essa estirpe, se seleccionar pelo menos um mutante apresentando uma propriedade Iti, se realizar pelo menos um cruzamento retrógado (backcross) com uma outra segregante desta estirpe apresentando um tipo de acasalamento (mating type) oposto, se seleccionar pelo menos dois segregantes ds cruzamento retrógado (backcross) apresentando uma propriedade ”3.ti e tipos de acasalamento (mating types”) apostos, se realizar pelo menos um cruzamento de tais segregantes, e ss seleccionar uma estirpe poliplóide assim obtida, apresentando um potencial de crescimento, propriedade Iti e a capacidade de levedar uma massa.

uma

Processo de acordo com a

reivindicação 3, caracterizado por·, para se verificar a propriedade iti” da referida estirpe poliplóide a seleccionar, a submeter a um teste de produção de CO® durante alguns dias em meio nutritivo contendo maltose como fonte de carbono, à temperatura entre 3 e 14° C =

Processo de acordo com a reivindicações i e 2, caracterizado por se obter uma estirpe de levedura de padeiro Saccharomyces cerevisi ae que apresenta um potencial de crescimento em processo de fermentação descontínua ífed-batch> uma capacidade ds levedar uma massa, um nível de produção de CO® inferior a 20 ml por g de levedura prensada após 7 dias em meio maltosado refrigerado a 3~10°C, e um nível ds produção de C0-_a de pelo menos 40 ml por g de levedura prensada após 6 dias em meio maltosado temperado a pelo menos 14°C»

- 6â Processo de acordo com a reivindicações 3 e 4, caracterizado por se obter uma estirpe ds levedura de padeiro Saccharomyces cerevi si ae que apresenta um potencial de crescimento em processo de fermentação descontinua (fed-batch), uma capacidade de levedar uma massa, um nível ds produção ds C0_s inferior a 30 ml por g ds levedura prensada após 7 dias em meio maltosado refrigerada a 3-9°C, e um nível de produção de CO-a de pelo menos 60 ml por g de levedura prensada após 6 dias em meio maltosado temperado a pelo menos

Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se obter uma estirpe ds levedura de padeiro Saccharomyces cerevi si ae seleccionada de entre o grupo -formado pelas estirpes de Sac c h ar omy c es cerevisi as NC1MB 40328, 40329 e 40330.

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ss obter uma estirpe de levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae seleccionada de entre o grupo -formado pelas estirpes de Sac c h ar omy c ss cerevisiae NCJMB 40331 e 40332.

7a

A requerente reivindica a prioridade do pedida suíço apresentado em 09 de Novembro de 1990, sob o NS„3565/90-4.