JP6915792B1 - 広範囲遺伝子欠損を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルス - Google Patents
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Abstract
【課題】癌細胞において特異的に増殖し、癌細胞を障害するワクシニアウイルスの提供及び該ウイルスの癌治療への利用の提供。【解決手段】ワクシニアウイルスのゲノム配列の7000〜9000塩基からなる領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。【選択図】なし
Description
本発明は腫瘍溶解性ワクシニアウイルス及びそれを利用したウイルスベクターに関する。
現在世界中において、生きたウイルスを利用した癌治療の前臨床研究や臨床試験が積極的に行われている。この癌ウイルス療法は、感染した細胞・組織内で増殖伝播しながらそれらを死滅させるというウイルス本来の性質を癌治療に利用する方法である。従来の放射線・化学療法に比べ、第一にウイルス増殖による腫瘍溶解、第二にそれに伴う抗腫瘍免疫の誘導により多様なメカニズムで抗癌作用を発揮する。
かつて日本国内で樹立され痘瘡ワクチンとしてヒトに使われ、高い安全性が証明されているワクシニアウイルスのワクチン株がある（非特許文献１を参照）。しかし、依然正常組織における弱い増殖性を維持しているため、より安全な癌ウイルス療法として確立するには、癌細胞でのみ増殖させる改良が必須であった。そこで、このワクチン株を基に遺伝子組換え技術により改良を加え、広範な癌におけるMAPK/ERK経路の制御異常を指標にして、癌細胞特異的に増殖し破壊する遺伝子組換えワクシニアウイルスの開発に成功した（特許文献１及び２を参照）。
一方、ワクシニアウイルスのゲノム配列の12,000塩基の領域及び／又は13,700塩基の領域を欠損させたコペンハーゲン株の抗癌作用についての報告があった（特許文献３を参照）。
蛋白質 核酸 酵素 Vol.48 No.12(2003), p.1693-1700
本発明は癌細胞において特異的に増殖し、癌細胞を障害するワクシニアウイルスの提供及び該ウイルスの癌治療への利用の提供を目的とする。
本発明者はワクシニアウイルスの抗腫瘍効果についての検討を行う中で、ワクシニアウイルスのK2L遺伝子を含む約8000塩基の広範囲の領域のDNAを欠損させると、正常細胞は障害しないが、感染した癌細胞を傷害し、癌細胞の細胞死を引き起こすことを見出した。すなわち、K2L遺伝子を含む約8000塩基の広範囲の領域のDNAを欠損させたワクシニアウイルスを癌細胞に感染させることにより、抗癌効果を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] ワクシニアウイルスのゲノム配列の7000〜9000塩基からなる領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[２] 前記ワクシニアウイルスのゲノム配列の7000〜9000塩基からなる領域が、030L遺伝子から046L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子又はそれらの遺伝子に相同な遺伝子の少なくとも１個の遺伝子を含む領域である、[１]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[３] 前記030L遺伝子から046L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子である035L遺伝子に相同な遺伝子が、セリンプロテアーゼインヒビター３（SPI-3）をコードする遺伝子である、[２]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[４] 以下に示すワクシニアウイルス株のゲノム配列の以下の領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[１]〜[３]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[５] 配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列の以下の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域が欠損しており、欠損している領域以外の領域は、配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列と８０％以上の配列同一性を有し、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[１]〜[３]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[６] 以下に示すワクシニアウイルス株のゲノム配列の以下の領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[４]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[７] 配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列の以下の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域が欠損しており、欠損している領域以外の領域は、配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列と８０％以上の配列同一性を有し、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[５]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[８] ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、[１]〜[７]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[９] [１]〜[８]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
[１０] [１]〜[８]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルスに外来DNAを導入した、ワクシニアウイルスベクター。
[１１] 外来DNAがマーカーDNA、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするDNAである、[１０]のワクシニアウイルスベクター。
[１２] [１０]又は[１１]のワクシニアウイルスベクターを含む、癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
[１] ワクシニアウイルスのゲノム配列の7000〜9000塩基からなる領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[２] 前記ワクシニアウイルスのゲノム配列の7000〜9000塩基からなる領域が、030L遺伝子から046L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子又はそれらの遺伝子に相同な遺伝子の少なくとも１個の遺伝子を含む領域である、[１]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[３] 前記030L遺伝子から046L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子である035L遺伝子に相同な遺伝子が、セリンプロテアーゼインヒビター３（SPI-3）をコードする遺伝子である、[２]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[４] 以下に示すワクシニアウイルス株のゲノム配列の以下の領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[１]〜[３]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[５] 配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列の以下の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域が欠損しており、欠損している領域以外の領域は、配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列と８０％以上の配列同一性を有し、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[１]〜[３]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[６] 以下に示すワクシニアウイルス株のゲノム配列の以下の領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[４]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[７] 配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列の以下の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域が欠損しており、欠損している領域以外の領域は、配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列と８０％以上の配列同一性を有し、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、[５]の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
[８] ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、[１]〜[７]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス。
[９] [１]〜[８]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
[１０] [１]〜[８]のいずれかの腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルスに外来DNAを導入した、ワクシニアウイルスベクター。
[１１] 外来DNAがマーカーDNA、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするDNAである、[１０]のワクシニアウイルスベクター。
[１２] [１０]又は[１１]のワクシニアウイルスベクターを含む、癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
本発明の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、広範囲遺伝子欠損を有しない腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと同等の抗腫瘍効果を有し、かつウイルス毒性が抑えられている。
さらに、本発明の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、広い宿主域と高い発現効率を有しているため、他の外来遺伝子を導入するベクターとしても機能する。細胞毒性効果や免疫賦活効果を有する治療遺伝子を発現させることによって、他の治療法との併用も可能となる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、広範囲遺伝子欠損を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。該ワクシニアウイルスは、広範囲遺伝子欠損を有しない腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと同等の抗腫瘍効果を有し、かつウイルス毒性が抑えられている。
広範囲遺伝子欠損を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにおいて、欠損している遺伝子領域は、約8000塩基からなる領域が欠損している。約8000塩基は、7000〜9000塩基、好ましくは7500塩基〜9000塩基である。約8000塩基からなる領域が欠損しているワクシニアウイルスをd8kワクシニアウイルスと呼ぶ。
d8kワクシニアウイルスの欠損している領域は、配列番号１７に表されるワクシニアウイルスの全ゲノム配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基または7500〜9000塩基の領域であり、好ましくは26500番目の塩基から32000番目の塩基を含む7000〜9000塩基または7500〜9000塩基の領域であり、さらに好ましくは26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域、または23767番目の塩基から32499塩基からなる領域である。
欠損部位を示すために、図１に配列番号１７に表す塩基配列中の配列の欠損部位を示した。配列番号１７に表す塩基配列は、後述するLC16ｍO株のゲノム配列である。他の株を用いる場合、LC16ｍO株の上記の塩基領域に対応する部分の塩基を欠損させればよい。LC16ｍO株のゲノム配列のＸ番目の塩基に対応する他の株のゲノム配列の塩基とは、配列番号１７に表す塩基配列のＸ番目の塩基に対応する他の株のゲノム配列の塩基をいい、他の株のゲノム配列を配列番号１７に表すゲノム配列に対してアラインメントを行ったときに、配列番号１７に表す塩基配列のＸ番目の塩基に対応する塩基をいう。「対応する塩基」を「相当する塩基」ということもある。本発明においては、LC16ｍO株のゲノム配列のＸ番目の塩基からＹ番目の塩基を含む塩基の領域及びLC16ｍO株のゲノム配列のＸ番目の塩基からＹ番目の塩基を含む塩基の領域に対応するLC16ｍO株以外の他の株のゲノム配列の塩基の領域を「配列番号１７に表される塩基配列のＸ番目の塩基からＹ番目の塩基を含む塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の塩基の領域」と呼ぶ。また、「ワクシニアウイルスがLC16ｍO株以外の株であり、該株のゲノム配列とLC16ｍO株のゲノム配列についてアラインメントを行った場合に、該株の配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列のＸ番目の塩基からＹ番目の塩基からなる領域に相当する領域」とも呼ぶことができる。塩基配列のアライメントは、公知のソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、BLAST、COBALT、Clustal W、Clustal Omega、MUSCLE等を用いることができる。また、他のアライメントを行うためのソフトウェアは、NCBI、DDBJ、NIH、EBI等のウェブサイトから取得してもよい。で表される塩基配列に対して比較対象とする塩基配列をアライメントさせることができる。
すなわち、本発明のワクシニアウイルスは、例えば、以下のワクシニアウイルスを含む。
以下に示すワクシニアウイルス株のゲノム配列の以下の領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
以下に示すワクシニアウイルス株のゲノム配列の以下の領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
また、配列番号１７に表す塩基配列のうち欠損させた配列領域以外の塩基配列において、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有している塩基配列を有するワクシニアウイルスは、本発明の広範囲遺伝子欠損を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに包含される。
すなわち、本発明のワクシニアウイルスは、例えば、以下のワクシニアウイルスを含む。
配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列の以下の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域が欠損しており、欠損している領域以外の領域は、配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列と８０％以上の配列同一性を有し、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
配列番号１７に表される塩基配列の27000番目の塩基から31000番目の塩基を含む7000〜9000塩基の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列の以下の領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域が欠損しており、欠損している領域以外の領域は、配列番号１７に表されるワクシニアウイルスのゲノム配列と８０％以上の配列同一性を有し、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域；又は
(ii) 配列番号１７に表される塩基配列の23767番目の塩基から32499番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。
d8kワクシニアウイルスの欠損している領域は培養中のウイルスの増殖に必要のない遺伝子をコードする領域である。
遺伝子の欠損は、例えば公知のゲノム編集、相同組換え、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、人為的突然変異法、ウイルスベクターを利用したPTGS法等により行うことができる。本発明において、遺伝子の欠損とは、その遺伝子が欠失により存在しないことをいう。欠損している広範囲遺伝子領域は、他の配列で置換されていてもよい。
欠損している上記領域には、LC16m0株及びLC16m8株の030L遺伝子から046L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子又はそれらの遺伝子に相同な遺伝子の少なくとも１つが含まれる。030L遺伝子から046L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子としては、030L、031L、032L、033R、034R、035L、036R、037L、038L、039L、040L、041L、042R、043L、044L、045L、046L遺伝子の17の遺伝子が挙げられる。すなわち、欠損している上記領域には、これらの遺伝子又はそれらの遺伝子に相同な遺伝子の少なくとも１個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個又は17個が欠損している。ここで、相同な遺伝子とは、LC16m0株以外のワクシニアウイルス株における、上記のLC16m0株の遺伝子に存在する同じ構造及び機能を有する対応する遺伝子（corresponding gene）をいう。また、種々の株のデータベースの配列を用いたBLASTP分析では、LC16m0株及びLC16m8株の030L遺伝子から046L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子に相同な遺伝子として、M1L遺伝子からF3L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子が挙げられ、この領域の遺伝子として、M1L、M2L、VACWR032、K ORF A、K ORF B、K2L、MVA024L、K4L、ACAM3000_MVA_026、VACWR037、K6L、K7R、K8、F1L、MVA030L及びF3L遺伝子の16遺伝子が挙げられる。すなわち、これらの遺伝子又はそれらの遺伝子に相同な遺伝子の少なくとも１個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、11個、12個、13個、14個、15個又は16個が欠損している。例えば、コペンハーゲン（CPN)株においては、M1L遺伝子からF3L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子が該当する。コペンハーゲン株のM1L遺伝子からF3L遺伝子までの連続した領域に存在する遺伝子としては、M1L、M2L、K1L、K ORF A、K ORF B、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L及びF3L遺伝子の14遺伝子が挙げられる。すなわち、コペンハーゲン株の場合、これらの遺伝子の少なくとも１個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、11個、12個、13個又は14個が欠損している。各株の遺伝子の相同遺伝子については、S.Morikawa et al., Journal of Virology, Sept, 2005, p.1183-11891のTable１に示されている。一方、好ましくは、本発明のワクシニアウイルスにおいて、LC16m0株及びLC16m8株の026L、027L、028L及び029L、並びにこれらの遺伝子に相同な遺伝子からなる群から選ばれる１個以上の遺伝子は欠損しておらず、特に好ましくは026L、027L、028L及び029L遺伝子、並びにこれらの遺伝子に相同な遺伝子が欠損していない。種々の株のデータベースの配列を用いたBLASTP分析では、LC16m0株及びLC16m8株の026L、027L、028L及び029L遺伝子に相同な遺伝子として、C2L、C1L、N1L及びN2L遺伝子が挙げられる。すなわち、本発明のワクシニアウイルスにおいて、C2L、C1L、N1L及びN2L遺伝子、並びにこれらの遺伝子に相同な遺伝子からなる群から選ばれる１個以上の遺伝子は欠損しておらず、特に好ましくはC2L、C1L、N1L及びN2L遺伝子、並びにこれらの遺伝子に相同な遺伝子が欠損していない。コペンハーゲン（CPN)株においては、C2L、C1L、N1L及びN2L遺伝子、並びにこれらの遺伝子に相同な遺伝子からなる群から選ばれる１個以上の遺伝子は欠損しておらず、特に好ましくはC2L、C1L、N1L及びN2L遺伝子、並びにこれらの遺伝子に相同な遺伝子が欠損していない。例えば、LC16m0株及びLC16m8株の030L遺伝子から046L 遺伝子までの連続して存在する遺伝子又はそれらの遺伝子に相同な遺伝子に加え、026L、027L、028L及び029L遺伝子、並びにこれらの遺伝子に相同な遺伝子が欠損している場合、約12kdの領域が欠損していることになり、d12kワクシニアウイルスと呼ぶことができる。コペンハーゲン株の場合、M1L、M2L、K1L、K ORF A、K ORF B、K2L、K3L、K4L、K5L、K6L、K7R、F1L、F2L及びF3L遺伝子に加えC2L、C1L、N1L及びN2L遺伝子が欠損している場合、約12kdの領域が欠損していることになり、d12kワクシニアウイルスと呼ぶことができる。d8kワクシニアウイルスは、d12kワクシニアウイルスよりも取得しやすく、外来遺伝子の挿入も容易であるという効果がある。
また、実施例４に示すように、同種同系移植モデルを用いた抗がん効果実験において、d8kは、投与側及び非投与側の両方において、がんが寛解し得るが、d12kでは、非投与側での寛解は認められない。このことは、d8kが全身作用を有することを示す。この効果は、腫瘍免疫活性が高まるアブスコパル効果によるものであると推測される。
本発明のワクシニアウイルスは、約8,000塩基の領域の欠損に加えて、HA（A56R)遺伝子の機能が欠損していてもよい。HA遺伝子の機能の欠損とはHA遺伝子が発現しないか、あるいは発現してもその発現タンパク質がHAタンパク質の正常な機能を保持していないことをいう。ワクシニアウイルスのHA遺伝子の機能を欠損させるためには、HA遺伝子の総て又は一部を欠失させればよい。また、塩基を置換、欠失又は付加することにより遺伝子を変異させ、正常なHAタンパク質が発現できないようにしてもよい。また、HA遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよい。HA遺伝子の欠損により、ワクシニアウイルスは、細胞融合能を有するようになる。ここで、細胞融合能とは、ワクシニアウイルスが細胞に感染したときに、感染した細胞同士の細胞融合を引き起こし得ることをいう。ワクシニアウイルスのHA遺伝子が欠損し、HAの機能が働かなくなることでウイルスの増殖、伝播能が上がることで腫瘍溶解能が向上し、加えて感染した癌細胞の細胞死が誘導される。
相同組換えとは、細胞内で２つのDNA分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、ワクシニアウイルスのような巨大なゲノムDNAを持つウイルスの組換えにしばしば用いられる方法である。まず、標的とするワクシニアウイルスの上記の約8000塩基からなる領域又は約12000塩基からなる領域の配列を分断する形で、他のDNAを連結したプラスミド（トランスファーベクターという）を構築し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入してやると、ウイルス複製の過程で裸になったウイルスDNAとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたDNAがウイルスゲノムの標的遺伝子中に組み込まれ、該遺伝子は機能を欠損する。このとき用いる細胞としては、BSC-1細胞、HTK-143細胞、Hep2細胞、MDCK細胞、Vero細胞、HeLa細胞、CV1細胞、COS細胞、RK13細胞、BHK-21細胞、初代ウサギ腎臓細胞等ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。
ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して標的遺伝子を改変する方法である。ゲノム編集の方法として、用いるヌクレアーゼにより、ZFN(zinc finger nuclease)法（Urnov, Fyodor D. et al., Natur, Vol 435, 2 June 2005, pp.642-651)、TALEN(Tale nuclease)法(Mahfouz, Magdy M et al., PNAS February 8, 2011, 108(6), pp.2623-2628)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9(Crispr Associated protein 9)(Jinek, Martin, et al., Science, Vol 337, 17 August 2012, pp.816-821)、CRISPR/Cas3等のCRISPR/Casシステムによる方法等が挙げられる。これらの方法には、ニッカーゼ改変型Casを用いた方法等のヌクレアーゼを改変した方法も含む。このうち、CRISPR/Cas9システムによる方法が好ましい。CRISPR/Cas9システムにおいては、切断することにより機能を欠損させたい遺伝子の標的配列に相補的な配列を含むguide RNA(crRNA、tracrRNA)及びヌクレアーゼであるCas9により任意の配列を切断する。ゲノムの切断後にNHEJ（非相同性末端結合）により修復が起こり、塩基の欠損等が誘導され、遺伝子をノックアウトすることができる。あるいは、ゲノム切断後にHDR（相同組換え型修復）により、標的遺伝子に相同組換えにより変異を誘導することができる。ゲノム編集により特定の遺伝子領域を破壊する場合は、遺伝子中の標的配列を選択し、該配列に相補的な配列を含むguide RNAの配列を設計すればよい。guide RNAの塩基長は、20以上が好ましい。CRISPR/Cas9システムによりゲノム編集を行う場合、Cas9タンパク質とguide RNAを共発現させればよく、例えば、両方を共発現させるベクターを導入すればよい。CRISPR/Cas9によるゲノム編集は、市販のCRISPR/Cas9ツールを用いて行うことができる。
本発明の広範囲遺伝子欠損を有する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを製造するためのワクシニアウイルスの株は限定されないが、リスター（Lister)株、リスター株から確立されたLC16株、LC16mO株、LC16m8株（橋爪 壮、臨床とウイルス vol.3, No.3, 269, 1975等）、New York City Board of Health（NYBH）株、Wyeth株、コペンハーゲン株、Western Reserve（WR）株、Modified Vaccinia Ankara（MVA）株、EM63株、池田株、大連株、Tian Tan株等が挙げられる。LC16mO株は、Lister株からLC16株を経て作出された株であり、LC16m8株は、さらにLC16mO株から作出された、ウイルス膜タンパク質をコードする遺伝子であるB5R遺伝子にフレームシフト変異が認められ、このタンパク質が発現、機能しなくなったことで弱毒化された株である（蛋白質 核酸 酵素 Vol.48 No.12(2003), p.1693-1700）。リスター株、LC16m8株及びLC16mO株の全ゲノム配列として、例えば、それぞれAccession No.AY678276.1、Accession No.AY678275.1及びAccession No.AY678277.1が知られている。したがって、リスター株から公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により、LC16m8株、及びLC16mO株を作製することができる。
本発明においては、好ましくは癌細胞の中のみで増殖するワクシニアウイルスである腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（oncolytic virus）を用いる。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは正常の細胞には作用しないが、癌細胞の中でのみ増殖し癌細胞を溶解させ、癌細胞を効果的に殺すことができる。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを制限増殖型ワクシニアウイルスとも呼ぶ。
ヒトに投与する場合の安全性が確立されているという点で、本発明において用いるワクシニアウイルスは弱毒化され、病原性を有していないものが好ましい。このような弱毒化された株として、B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株が挙げられる。B5R遺伝子は、ワクシニアウイルスのエンベロープに存在するタンパク質をコードしており、B5R遺伝子産物は、ウイルスの感染・増殖に関与している。B5R遺伝子産物は感染細胞表面及びウイルスのエンベロープに存在し、隣接の細胞、あるいは宿主体内の他の部位にウイルスが感染・伝播するときに、感染効率を高める働きをし、ウイルスのプラークサイズ及び宿主域にも関与している。B5R遺伝子を欠失させると、動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、ポックサイズも小さくなる。また、皮膚増殖能が低下し、皮膚病原性が低下する。B5R遺伝子が部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスは、B5R遺伝子の遺伝子産物がその正常機能を有さず、皮膚増殖性も小さく、ヒトに投与した場合でも副作用を起こさない。B5R遺伝子を欠失している弱毒化株として、例えば上記のLC16m8株からB5R遺伝子を完全に欠失させて確立されたm8Δ株（LC16m8Δ株とも呼ぶ）が挙げられる。また、LC16mO株からB5R遺伝子を完全に欠失して確立されたmOΔ株（LCmOΔ株とも呼ぶ）を用いることもできる。これらのB5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒されたワクシニアウイルス株は国際公開第WO2005/054451号に記載されており、その記載に基づいて入手することができる。ワクシニアウイルスがB5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失し、B5Rタンパク質の機能が欠失しているかどうかは、例えば、RK13細胞に感染させたときに形成されるプラークサイズ、ポックサイズ、Vero細胞でのウイルス増殖性、ウサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。また、ワクシニアウイルスの遺伝子配列を調べてもよい。
B5R遺伝子を有するワクシニアウイルスは、B5R遺伝子を癌細胞中で発現させ、B5Rタンパク質の作用により、癌細胞の傷害をもたらす。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは完全なB5R遺伝子を発現することが望ましい。上記のようにB5R遺伝子を有しておらず、弱毒化され安全性が確立されているワクシニアウイルスを用いる場合、該B5R遺伝子を欠失したワクシニアウイルスにあらためて完全なB5R遺伝子を導入する。B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスを用いる場合、該ワクシニアウイルスゲノムに、B5R遺伝子を挿入して用いればよい。B5R遺伝子のワクシニアウイルスへの挿入は如何なる方法で行ってもよいが、例えば公知の相同組換え法により行うことができる。また、この場合のB5R遺伝子を挿入する位置は、もともとB5R遺伝子が存在していたB4R遺伝子とB6R遺伝子の間でもよいし、ワクシニアウイルスのゲノムの任意の部位であってもよい。さらに、あらかじめ、B5R遺伝子をDNAコンストラクトとして構築し、それをワクシニアウイルスに導入してもよい。
ワクシニアウイルスによる癌ウイルス治療の対象とする癌は限定されず、卵巣癌、肺癌、膵癌、皮膚癌、胃癌、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、頭頚部癌、脳・神経腫瘍、胸腺癌、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、黒色腫等あらゆる癌種を挙げることができる。
本発明のワクシニアウイルスを含む癌治療用医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のワクシニアウイルスを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路によればよい。また、癌部に局所投与してもよい。有効投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約102〜1010プラーク形成単位(PFU)である。
本発明は、上記のワクシニアウイルスを癌患者に投与することを含む癌の治療方法も包含する。
さらに、本発明のワクシニアウイルスは、外来遺伝子（外来DNA又は外来ポリヌクレオチド）を含んでいてもよい。外来遺伝子（外来DNA又は外来ポリヌクレオチド）としては、マーカー遺伝子、細胞毒性や免疫賦活効果を有する産物をコードする治療用遺伝子が挙げられ、さらに、癌、ウイルス、細菌、原虫等のタンパク質抗原をコードするDNAが挙げられる。マーカー遺伝子はレポーター遺伝子ともいい、ルシフェラーゼ(LUC)遺伝子、緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent protein；GFP)等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（DsRed)等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（GUS)遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT)遺伝子、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子等が挙げられる。これらの外来遺伝子を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをワクシニアウイルスベクターと呼ぶことができる。
治療用遺伝子は、癌や感染症等の特定の疾患の治療に用い得る遺伝子であり、p53、Rb等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-17、IL-18、IL-24、ケモカイン2（CCL2）、CCL5、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CD40L、CD70、CD80、CD137L、OX-40L、GITRL、LIGHT、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、MIP1a、FLT3L、HPGD、TRIF、DAI、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子、CTLA4、PD1、PD-L1の阻害作用を有する抗体等をコードする遺伝子が挙げられる。ルシフェラーゼやGFPを発現するワクシニアウイルスは、その感染細胞である癌細胞を簡便、迅速に検出することが可能となる。本発明のワクシニアウイルスを癌治療に用いる場合、ワクシニアウイルスの有する腫瘍溶解性と共に癌に対する治療用遺伝子が癌治療効果を発揮することができる。
外来遺伝子(外来DNA)としてウイルス、細菌、原虫及び癌等の抗原をコードするDNAを導入することにより、外来遺伝子を導入したワクシニアウイルスベクターを種々のウイルス、細菌、原虫及び癌に対するワクチンとして用いることができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、マラリア原虫、重症急性呼吸器症候群(SARS＝サーズ)ウイルス等の感染防御抗原（中和抗原）、あるいはWT1、MART-1、NY-ESO-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、Glypican-3、KIF20A、Survivin、AFP-1、gp100、MUC1、PAP-10、PAP-5、TRP2-1、SART-1、VEGFR1、VEGFR2、NEIL3、MPHOSPH1、DEPDC1、FOXM1、CDH3、TTK、TOMM34、URLC10、KOC1、UBE2T、TOPK、ECT2、MESOTHELIN、NKG2D、P1A、5T4、B7-H6、BCMA、CD123、CD133、CD138、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD44、CEA、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EphA2、ErbB2、FAP、FR-α、HER2、IL13Ra2、MUC1、MUC16、NKG2D、PSCA、PSMA、ROR1、TARP、DLL3、PRSS21、Claudin18.2、Claudin18、CAIX、L1-CAM、FAP-α、CTAG1B、FR-α等のタンパク質や、GD2、GM2等の糖脂質などの癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。
これらの外来遺伝子は、例えば、相同組換えの手法を用いることにより導入することができる。相同組換えは上述の方法で行えばよい。例えば、導入したい部位のDNA配列中に導入すべき外来遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入すればよい。外来遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子中が好ましい。
また、外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターは、限定はないが、上述のPSFJ1-10や、PSFJ2-16、p7.5Kプロモーター、p11Kプロモーター、T7.10プロモーター、CPXプロモーター、HFプロモーター、H6プロモーター、T7ハイブリッドプロモーター等を用いることができる。本発明のワクシニアウイルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 遺伝子導入＆発現解析実験法 斎藤泉他編集、羊土社（1997年９月１日発行）、あるいは、D. M. Glover他編、加藤郁之進 監訳DNAクローニング4−哺乳類のシステム−（第2版）TaKaRa、EMBO Journal（1987年） ６巻 p.3379-3384等の記載に従えばよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１ 広範囲遺伝子欠損を有するワクシニアウイルスの取得
広範囲遺伝子欠損ウイルスの欠損領域に外来遺伝子を挿入した遺伝子組換えワクシニアウイルスを作製するために、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）（配列を配列番号１７に示す）を鋳型に使用し、d8k欠損のために、２組のプライマー：配列番号１と配列番号２あるいは配列番号３と配列番号４で増幅し、得られたPCR産物をそれぞれ制限酵素KpnIとAgeI、あるいはSacIとAgeIにより切断した。それらをpBluescript SKII(+) ベクターのKpnIとSacI切断部位にクローニングし、8kbp欠損領域の周辺配列を有するpSKII(+)-8kを構築した。一方、比較例としてのd12k欠損のために、２組のプライマー：配列番号５と配列番号６あるいは配列番号７と配列番号８を用いて増幅し、得られたPCR産物をKpnIとAgeI、あるいはSacIとAgeIにより切断した。それらをpBluescript SKII(+)ベクターのKpnIとSacI切断部位にクローニングし、12kbp欠損領域の周辺配列を有するpSKII(+)-12kを構築した。続いて広範囲遺伝子欠損領域に外来遺伝子の発現ユニットを挿入するため、pIRES-LucGFP（国際公開第WO2015/076422号）のDNAを鋳型として、２つのプライマー（配列番号９と配列番号１０）によってLuciferase EGFP遺伝子領域を増幅した。そのPCR産物を制限酵素NheIとBspEIで切断し、それをpTNshuttle/TK-SP-BFPベクターのAgeI及びNheI切断部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66(1):135-138）下にLuciferase EGFPを連結したpTK-ST7.5-LucGFPを構築した。なお、pTagBFP-N(FP172、Evrogen社)のDNAを鋳型として、２つのプライマー（配列番号１と配列番号２）によって、BFP遺伝子領域を増幅した。その各PCR産物を制限酵素SfiIとEcoRIで切断し、それをpTK-SP-LGベクター(国際公開第WO2015/076422号)の同じ制限酵素部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66(1):135-138）下にBFPを連結し、pTNshuttle/TK-SP-BFPを構築した。次にpTK-ST7.5-LucGFPを制限酵素SphIとEcoRIで切断し、そのST7.5-LucGFP断片をpSKII(+)-8kベクター、あるいはpSKII(+)-12kベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、各遺伝子欠損領域にLuciferase EGFP発現ユニットを挿入したpSKII(+)-8k-LucGFP及びpSKII(+)-12k-LucGFPを構築した。
広範囲遺伝子欠損ウイルスの欠損領域に外来遺伝子を挿入した遺伝子組換えワクシニアウイルスを作製するために、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）（配列を配列番号１７に示す）を鋳型に使用し、d8k欠損のために、２組のプライマー：配列番号１と配列番号２あるいは配列番号３と配列番号４で増幅し、得られたPCR産物をそれぞれ制限酵素KpnIとAgeI、あるいはSacIとAgeIにより切断した。それらをpBluescript SKII(+) ベクターのKpnIとSacI切断部位にクローニングし、8kbp欠損領域の周辺配列を有するpSKII(+)-8kを構築した。一方、比較例としてのd12k欠損のために、２組のプライマー：配列番号５と配列番号６あるいは配列番号７と配列番号８を用いて増幅し、得られたPCR産物をKpnIとAgeI、あるいはSacIとAgeIにより切断した。それらをpBluescript SKII(+)ベクターのKpnIとSacI切断部位にクローニングし、12kbp欠損領域の周辺配列を有するpSKII(+)-12kを構築した。続いて広範囲遺伝子欠損領域に外来遺伝子の発現ユニットを挿入するため、pIRES-LucGFP（国際公開第WO2015/076422号）のDNAを鋳型として、２つのプライマー（配列番号９と配列番号１０）によってLuciferase EGFP遺伝子領域を増幅した。そのPCR産物を制限酵素NheIとBspEIで切断し、それをpTNshuttle/TK-SP-BFPベクターのAgeI及びNheI切断部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66(1):135-138）下にLuciferase EGFPを連結したpTK-ST7.5-LucGFPを構築した。なお、pTagBFP-N(FP172、Evrogen社)のDNAを鋳型として、２つのプライマー（配列番号１と配列番号２）によって、BFP遺伝子領域を増幅した。その各PCR産物を制限酵素SfiIとEcoRIで切断し、それをpTK-SP-LGベクター(国際公開第WO2015/076422号)の同じ制限酵素部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66(1):135-138）下にBFPを連結し、pTNshuttle/TK-SP-BFPを構築した。次にpTK-ST7.5-LucGFPを制限酵素SphIとEcoRIで切断し、そのST7.5-LucGFP断片をpSKII(+)-8kベクター、あるいはpSKII(+)-12kベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、各遺伝子欠損領域にLuciferase EGFP発現ユニットを挿入したpSKII(+)-8k-LucGFP及びpSKII(+)-12k-LucGFPを構築した。
図１に示す遺伝子欠損領域に外来遺伝子Luciferase EGFPを導入した組換えワクシニアウイルスを作製した。24wellプレートに80%コンフルエントに培養されたCV1細胞にワクシニアウイルスLC16mO（Molecular Therapy Oncolytics. 2019; 14: 159-171）をMOI=0.1〜0.5で感染させ、室温で１時間吸着させた。その後、FuGENE HD(Roche)と混合したトランスファーベクタープラスミドpSKII(+)-8k-LucGFP、またはpSKII(+)-12k-LucGFPをマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、37℃にて２〜３日間培養した。細胞を回収し凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったBSC1細胞に適当に希釈して接種し、0.8%メチルセルロースを含むEagle MEM、5%FBS培地を加え、37℃で２〜４日間培養した。培地を除き、GFP蛍光蛋白の発現が見られたプラークをチップの先で掻き取り、opti-MEM培地(Invitrogen)に浮遊させた。BSC1細胞にてさらに３回以上この作業を繰り返し、プラーク純化をした。純化後のウイルスは各遺伝子欠損領域の周囲配列を標的とするプライマー（d8k：配列番号１１と配列番号１２、d12k：配列番号１３と配列番号１４）を用いてPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンをそれぞれd8k-LucGFP、又はd12k-LucGFPとした（図１）。比較対象となるHA-LucGFPは国際公開W02015/076422号に記載される方法で作製された、ワクシニアウイルスLC16mOの増殖に関与しないHA領域内にLuciferase EGFPを導入した遺伝子組換えウイルスである。各組換えウイルスはA549細胞にて大量培養し精製した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し実験に供した。
なお、本実施例において、d8k-LucGFPは24クローン取得でき、d12k-LucGFPは５クローン取得できた。この結果は、広範囲遺伝子欠損を有するワクシニアウイルスのうち8k欠損ワクシニアウイルスが取得しやすいことを示している。
実施例２ 広範囲遺伝子欠損を有するワクシニアウイルスの抗がん効果解析
広範囲遺伝子欠損を有するd8k-LucGFP、d12k-LucGFP、及び広範囲遺伝子欠損を持たないHA-LucGFPの抗腫瘍効果を比較するべく、広範な癌細胞株への感染及びその後の生存率測定を行った。ヒト卵巣癌細胞（SKOV3、RMG-1、OVCAR-3：2.0×104/well、A2780:1.0×104/well）、ヒト膵臓癌細胞（Panc1：2.0×104/well、AsPC1 CD44v9 high、Panc10.05：3.5×104/well、MiaPaca-2：1.0×104/well）、ヒト結腸癌細胞（CaCO2、SW480：2.0×104/well）、ヒト乳癌細胞（MDA-MB-231、MCF-7：2.0×104/well）、ヒト肺癌細胞（A549：1.0×104/well）、ヒト前立腺癌細胞（PC3：2.5×104/well）、ヒト類上皮癌細胞（A431：2.0×104/well）、ヒト喉頭癌細胞（Hep-2：2.0×104/well）、マウス大腸癌細胞（CT26：1.0×104/well）、マウスメラノーマ細胞（B16-F10：1.5×104/well）、及びマウス肺癌細胞（TC1：4.0×103/well）らを96wellプレートに播種し、37℃ ２４時間培養後HA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFPの各ウイルス液をRMG-1はMOI＝0.001、0.01、0.1、SW480はMOI＝0.001、0.01、0.1、1、マウス癌細胞株（CT26、B16-F10、TC1）はMOI=0.1、1、5、それ以外のヒト癌細胞株はMOI=0.01、0.1、1のいずれかにより感染させた（n=3）。そしてTC1は感染から４８時間後、それ以外は７２時間後にCellTiter 96（登録商標） Aqueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay（Promega）により細胞生存率の測定を行った。
広範囲遺伝子欠損を有するd8k-LucGFP、d12k-LucGFP、及び広範囲遺伝子欠損を持たないHA-LucGFPの抗腫瘍効果を比較するべく、広範な癌細胞株への感染及びその後の生存率測定を行った。ヒト卵巣癌細胞（SKOV3、RMG-1、OVCAR-3：2.0×104/well、A2780:1.0×104/well）、ヒト膵臓癌細胞（Panc1：2.0×104/well、AsPC1 CD44v9 high、Panc10.05：3.5×104/well、MiaPaca-2：1.0×104/well）、ヒト結腸癌細胞（CaCO2、SW480：2.0×104/well）、ヒト乳癌細胞（MDA-MB-231、MCF-7：2.0×104/well）、ヒト肺癌細胞（A549：1.0×104/well）、ヒト前立腺癌細胞（PC3：2.5×104/well）、ヒト類上皮癌細胞（A431：2.0×104/well）、ヒト喉頭癌細胞（Hep-2：2.0×104/well）、マウス大腸癌細胞（CT26：1.0×104/well）、マウスメラノーマ細胞（B16-F10：1.5×104/well）、及びマウス肺癌細胞（TC1：4.0×103/well）らを96wellプレートに播種し、37℃ ２４時間培養後HA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFPの各ウイルス液をRMG-1はMOI＝0.001、0.01、0.1、SW480はMOI＝0.001、0.01、0.1、1、マウス癌細胞株（CT26、B16-F10、TC1）はMOI=0.1、1、5、それ以外のヒト癌細胞株はMOI=0.01、0.1、1のいずれかにより感染させた（n=3）。そしてTC1は感染から４８時間後、それ以外は７２時間後にCellTiter 96（登録商標） Aqueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay（Promega）により細胞生存率の測定を行った。
図２及び図３に各細胞の生存率を示す。広範囲遺伝子欠損のないHA-LucGFPと比較し、d8k-LG及びd12k-LGはヒト癌細胞株SKOV3、PC3、Hep-2及びマウス癌細胞株CT26、B16-F10、TC1らにおいては細胞障害性が高まり、A2780、MiaPaca-2、CaCO2らにおいては細胞障害性が弱まる傾向を示した。一方残る１０種の癌細胞株では三者ウイルス間で生存率の減少に差は見られず、ほぼ同等の細胞障害性を示した。以上より、広範囲遺伝子欠損を有するd8k、d12kウイルスはほとんどの癌細胞においてその細胞障害性を損なうことなくHAウイルスとほぼ同等の抗腫瘍効果を発揮できることが示唆された。
実施例３ 異種移植マウスモデルにおける広範囲遺伝子欠損を有するワクシニアウイルスの毒性・抗がん効果解析
次に腫瘍異種移植モデルを用い、広範囲遺伝子欠損を有するワクシニアウイルスの治療効果と毒性の評価を行った。Renila luciferaseを定常発現するヒト膵臓癌細胞株Panc1を5.0×106 cellsでICR-SCIDマウスの腹腔内に移植し、腫瘍の生着を確認した14日後に各ウイルス：HA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFPを1.0×106 PFUでマウス腹腔内へ投与した（Day 0）。腫瘍の生着及び増殖はViviRen In Vivo Renilla Luciferase Substrate（Promega）を用いたRluc発光検出により、またウイルスの増殖及び伝搬はVivo Glo Luciferin, In vivo Grade（Promega）の投与によるFluc発光検出によりそれぞれ確認した。発光の検出は各基質投与後にin vivoイメージングシステム（Berthold、NightSHADE LB985）を用いて非侵襲的に行われた。図４にウイルス投与前（Day -1）時点と投与後11日（Day 11）時点での腫瘍Rlucの検出結果を示す。腫瘍Rlucはウイルス投与前には全ての群で一律に検出されるが、ウイルス投与後11日時点では各ウイルス（HA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFP）投与群でそのシグナルが消失していた。一方、ウイルスを投与していないMock群においてはRlucシグナルが残存していた。その前後（投与後3日及び10日時点）におけるウイルスFlucの検出結果を図５に示す。投与後3日時点では全てのウイルス投与群でマウス腹腔部におけるウイルスFlucの発現が確認された。その7日後の投与後10日時点では腹腔部でのウイルスFlucのシグナルはほぼ消失していたが、HA-LucGFP投与マウスでのみ口、四肢、尾部などの非腫瘍部でのウイルスシグナルが観察された。図６にウイルスFluc、腫瘍Rlucの数値化の結果を示す。ウイルス投与後3日目時点でのFluc蛍光はMock群と比較し各ウイルス投与群において有意な上昇が認められたが（Two-Way ANOVA統計解析：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）、各ウイルス間の差は見られなかった。その７日後のウイルス投与後10日目時点のウイルスFlucはどのウイルスもMock群と同等まで減少していた。またウイルス投与1日前時点での腫瘍Rlucは各群とも同等であったが、投与後11日時点では各ウイルス投与マウスの腫瘍Rluc発光はMock群と比較して有意に減少していた（Two-Way ANOVA統計解析：*P<0.05、**P<0.01）。ウイルス投与後のマウス体重の推移を図７に示す。HA-LucGFP投与マウスはDay 20までにPox痕と体重の急激な減少が見られ、ウイルス毒性の徴候が観察された。Mock群はDay 50前後から腫瘍負荷による体重の減少傾向が見られた。d8k-LucGFP投与群は5匹中2匹のマウスでDay 50付近からPox痕の出現と体重減少が見られたが、残り3匹には見られなかった。一方でd12k-LucGFP群は全てのマウスでPox痕は見られず、急激な体重減少も見られなかった。図８にウイルス投与後のマウスの生存率を示す。Log-rank統計解析により、HA-LucGFP投与群はMock群と比較して有意に生存期間が短くなっていた（**P=0.0018）。一方d8k-LucGFP及びd12k-LucGFP投与群はDay 100を過ぎるまで死亡は見られず、Mock群と比較しての有意な生存延長が認められた（**P=0.0015）。以上より、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPは腫瘍異種移植モデルにおいても親ウイルスと同等の抗腫瘍効果を持ち、さらにHA-LucGFPよりもウイルス毒性が抑えられることで腫瘍特異的に治療効果を発揮できることが示唆された。
次に腫瘍異種移植モデルを用い、広範囲遺伝子欠損を有するワクシニアウイルスの治療効果と毒性の評価を行った。Renila luciferaseを定常発現するヒト膵臓癌細胞株Panc1を5.0×106 cellsでICR-SCIDマウスの腹腔内に移植し、腫瘍の生着を確認した14日後に各ウイルス：HA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFPを1.0×106 PFUでマウス腹腔内へ投与した（Day 0）。腫瘍の生着及び増殖はViviRen In Vivo Renilla Luciferase Substrate（Promega）を用いたRluc発光検出により、またウイルスの増殖及び伝搬はVivo Glo Luciferin, In vivo Grade（Promega）の投与によるFluc発光検出によりそれぞれ確認した。発光の検出は各基質投与後にin vivoイメージングシステム（Berthold、NightSHADE LB985）を用いて非侵襲的に行われた。図４にウイルス投与前（Day -1）時点と投与後11日（Day 11）時点での腫瘍Rlucの検出結果を示す。腫瘍Rlucはウイルス投与前には全ての群で一律に検出されるが、ウイルス投与後11日時点では各ウイルス（HA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFP）投与群でそのシグナルが消失していた。一方、ウイルスを投与していないMock群においてはRlucシグナルが残存していた。その前後（投与後3日及び10日時点）におけるウイルスFlucの検出結果を図５に示す。投与後3日時点では全てのウイルス投与群でマウス腹腔部におけるウイルスFlucの発現が確認された。その7日後の投与後10日時点では腹腔部でのウイルスFlucのシグナルはほぼ消失していたが、HA-LucGFP投与マウスでのみ口、四肢、尾部などの非腫瘍部でのウイルスシグナルが観察された。図６にウイルスFluc、腫瘍Rlucの数値化の結果を示す。ウイルス投与後3日目時点でのFluc蛍光はMock群と比較し各ウイルス投与群において有意な上昇が認められたが（Two-Way ANOVA統計解析：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）、各ウイルス間の差は見られなかった。その７日後のウイルス投与後10日目時点のウイルスFlucはどのウイルスもMock群と同等まで減少していた。またウイルス投与1日前時点での腫瘍Rlucは各群とも同等であったが、投与後11日時点では各ウイルス投与マウスの腫瘍Rluc発光はMock群と比較して有意に減少していた（Two-Way ANOVA統計解析：*P<0.05、**P<0.01）。ウイルス投与後のマウス体重の推移を図７に示す。HA-LucGFP投与マウスはDay 20までにPox痕と体重の急激な減少が見られ、ウイルス毒性の徴候が観察された。Mock群はDay 50前後から腫瘍負荷による体重の減少傾向が見られた。d8k-LucGFP投与群は5匹中2匹のマウスでDay 50付近からPox痕の出現と体重減少が見られたが、残り3匹には見られなかった。一方でd12k-LucGFP群は全てのマウスでPox痕は見られず、急激な体重減少も見られなかった。図８にウイルス投与後のマウスの生存率を示す。Log-rank統計解析により、HA-LucGFP投与群はMock群と比較して有意に生存期間が短くなっていた（**P=0.0018）。一方d8k-LucGFP及びd12k-LucGFP投与群はDay 100を過ぎるまで死亡は見られず、Mock群と比較しての有意な生存延長が認められた（**P=0.0015）。以上より、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPは腫瘍異種移植モデルにおいても親ウイルスと同等の抗腫瘍効果を持ち、さらにHA-LucGFPよりもウイルス毒性が抑えられることで腫瘍特異的に治療効果を発揮できることが示唆された。
実施例４ 同種同系移植モデルにおける広範囲遺伝子欠損を有するワクシニアウイルスの抗がん効果
次に正常な免疫系を持つマウス体内での各ウイルスの抗がん効果を比較するため、左右両腹部に皮下腫瘍を持つ同種同系マウスモデルでの治療効果を検討した。マウスへの腫瘍移植及びウイルス投与のスケジュールを図９に示す。マウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsでBALB/cマウスの腹部両側皮下に移植し、腫瘍が53〜121mm3（平均89mm3）になるまで５日間成長させた。腫瘍成長後にHA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFPを隔日３回 2.5×107PFUで片側の腫瘍内へ直接投与し（Day0, 2, 4）、その合間（Day 1, 3, 5, 7）にVivo Glo Luciferin, In vivo Gradeの投与によるFluc発光検出を行った。図１０にウイルス投与後１日目時点でのウイルスFlucの検出画像を示す。各ウイルス投与マウスは投与側腫瘍でのみウイルスシグナルが検出され、非投与側腫瘍では確認できなかった。またd8k-LucGFP及びd12k-LucGFPのFlucシグナルはHA-LucGFPのシグナルより減少する傾向が見られた。図１１にDay 1〜Day 7までのウイルスFlucシグナルの数値化結果を示す。d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPウイルスのFlucシグナルはDay 1時点でHA-LucGFPより有意に減少していたが（Two-Way ANOVA統計解析：**P<0.01）、どのウイルスもDay 7には一様に消失していた。図１２にウイルス投与側及び非投与側腫瘍の腫瘍径の推移を示す。各ウイルスは投与した腫瘍に対し強力な治療効果を発揮し、HA-LucGFPでは７匹中２匹、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPではそれぞれ８匹中５匹のマウスで投与側腫瘍を寛解させた（表１）。Two-Way ANOVA統計解析により、HA-LucGFP、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPはMock群と比較して投与側腫瘍径を有意に抑えることが確認された（***P<0.001）。一方HA-LucGFP、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPはウイルスシグナルの見られなかった非投与側腫瘍に対してもMock群と比較して有意な腫瘍抑制効果を示しており（Two-Way ANOVA統計解析：**P<0.01、***P<0.001）、投与側腫瘍の崩壊による抗腫瘍免疫の誘導が示唆された。加えてd8k-LucGFP投与マウスでのみ、投与側・非投与側両方が寛解する個体が８匹中３匹現れた。
次に正常な免疫系を持つマウス体内での各ウイルスの抗がん効果を比較するため、左右両腹部に皮下腫瘍を持つ同種同系マウスモデルでの治療効果を検討した。マウスへの腫瘍移植及びウイルス投与のスケジュールを図９に示す。マウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsでBALB/cマウスの腹部両側皮下に移植し、腫瘍が53〜121mm3（平均89mm3）になるまで５日間成長させた。腫瘍成長後にHA-LucGFP、d8k-LucGFPあるいはd12k-LucGFPを隔日３回 2.5×107PFUで片側の腫瘍内へ直接投与し（Day0, 2, 4）、その合間（Day 1, 3, 5, 7）にVivo Glo Luciferin, In vivo Gradeの投与によるFluc発光検出を行った。図１０にウイルス投与後１日目時点でのウイルスFlucの検出画像を示す。各ウイルス投与マウスは投与側腫瘍でのみウイルスシグナルが検出され、非投与側腫瘍では確認できなかった。またd8k-LucGFP及びd12k-LucGFPのFlucシグナルはHA-LucGFPのシグナルより減少する傾向が見られた。図１１にDay 1〜Day 7までのウイルスFlucシグナルの数値化結果を示す。d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPウイルスのFlucシグナルはDay 1時点でHA-LucGFPより有意に減少していたが（Two-Way ANOVA統計解析：**P<0.01）、どのウイルスもDay 7には一様に消失していた。図１２にウイルス投与側及び非投与側腫瘍の腫瘍径の推移を示す。各ウイルスは投与した腫瘍に対し強力な治療効果を発揮し、HA-LucGFPでは７匹中２匹、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPではそれぞれ８匹中５匹のマウスで投与側腫瘍を寛解させた（表１）。Two-Way ANOVA統計解析により、HA-LucGFP、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPはMock群と比較して投与側腫瘍径を有意に抑えることが確認された（***P<0.001）。一方HA-LucGFP、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPはウイルスシグナルの見られなかった非投与側腫瘍に対してもMock群と比較して有意な腫瘍抑制効果を示しており（Two-Way ANOVA統計解析：**P<0.01、***P<0.001）、投与側腫瘍の崩壊による抗腫瘍免疫の誘導が示唆された。加えてd8k-LucGFP投与マウスでのみ、投与側・非投与側両方が寛解する個体が８匹中３匹現れた。
また免疫不全マウスモデルの時と異なり、HA-LucGFP、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFPのいずれを投与した場合でもウイルスによる毒性の徴候は見られなかった。HA-LucGFP、d8k-LucGFP及びd12k-LucGFP投与群はMock群と比較しての有意な生存延長が認められた（Log-rank統計解析：*P<0.018、**P<0.0056）。以上より、d8k-LucGFPウイルスは正常な免疫系を持つマウス体内において、投与した腫瘍のみでなく非投与側腫瘍に対してもHA-LucGFP及びd12k-LucGFP以上の抗腫瘍効果を発揮することが示唆された。
本発明のワクシニアウイルスを癌治療に用いることができる。
配列番号１〜１６ プライマー
Claims (5)
- 以下に示すワクシニアウイルスLC16mO株のゲノム配列の以下の領域が欠損しており、正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する、腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルス：
(i) 配列番号１７に表される塩基配列の26240番目の塩基から34314番目の塩基からなる領域に対応するワクシニアウイルスのゲノム配列の領域。 - 請求項１記載の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
- 請求項１記載の腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルスに外来DNAを導入した、ワクシニアウイルスベクター。
- 外来DNAがマーカーDNA、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするDNAである、請求項３記載のワクシニアウイルスベクター。
- 請求項３又は４に記載のワクシニアウイルスベクターを含む、癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
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