KR100903729B1 - 신규한 아데노바이러스를 이용한 암 치료 방법 및 조성물 - Google Patents

신규한 아데노바이러스를 이용한 암 치료 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유류 암세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있는 신규 바이러스를 포함한다. 상기 바이러스는 두 가지 비-독성 전구약물을 강력한 화학치료제로 전환시키는 신규 단백질을 생성한다. 이러한 화학치료제는 국부적으로 생성되며 바이러스가 암세포를 사멸하도록 도울 뿐만 아니라 암세포가 방사선에 민감해지도록 한다. 전임상 시험에서, 상기 바이러스는 단독으로 사용시 또는 전구약물 요법 및/또는 방사선 요법과 병행한 경우 여러가지 포유류 암세포 사멸에 효과적임이 입증되었다. 본 발명은 인간의 암에 대한 안전하고 효과적인 치료를 제공할 수 있다.
암, 아데노바이러스, 방사선, 융합 유전자, 플루오로시토신

Description

신규한 아데노바이러스를 이용한 암 치료 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER THERAPY USING A NOVEL ADENOVIRUS}
본 발명은 암 치료에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아데노바이러스에 기초한 암 치료에 관한 것이다.
암에 대한 진단 및 치료 방법에 있어서 상당한 발전이 이루어져왔음에도 불구하고, 해마다 암 관련 사망자 수는 과거 60 년 동안 감소되지 않고 있다. 기존의 암 치료법들 (수술, 방사선 요법, 화학요법)은 초기 단계의 암 환자에 대해서는 높은 치료율을 보이지만, 다수의 경우 암이 재발하며 이미 진전된 암을 갖는 환자들의 경우 결국 사망하게 된다. 기존의 암 치료의 한계는 종양을 제거하는 능력부족에 기인하는 것이 아니라 환자의 정상세포에 독성을 주지 않고 치료할 수 있는 능력의 부재에 기인한다. 이러한 독성의 이유로, 수술 시 절단 정도, 방사선 투여 용량, 방사선 조사 부위의 범위, 화학 항암제 등의 배합과 용량 등이 제약을 받게 된다. 어떤 치료법에 대한 암 조직과 정상조직 사이의 반응 차 (즉, 치료지수)가 크지 않다면, 그 방법의 효과를 증가시키는 것은 아무런 임상적 가치가 없다.
그럼에도 불구하고, 암을 치료하기 위한 향상된 방법과 새로운 제제로 인하여 여러 다양한 암 환자들의 생존기간과 생존율이 증가하였다. 예를 들어, 수술방 법과 방사선 치료과정의 발달로 해서 국소종양의 경우, 매우 효과적으로 종양을 제거할 수 있게 되었다. 그러나, 수술의 경우, 종양의 위치나 종양세포의 전이와 같은 이유로 적용에 제약이 따를 수 있다. 방사선 방법 또한 투여할 수 있는 용량에 한계가 있기 때문에 제한적일 수 있다. 방사선에 내성을 보이는 종양의 경우 현재 허용된 용량으로는 치료될 수 없는 상황이다.
방사선 요법, 화학 요법, 수술법, 면역치료법과 같은 경우 단독 치료로서도 환자의 상태를 개선 시킬 수 있지만, 각각의 방법을 병행하여 사용할 경우 더 나은 치료 효과를 얻을 수도 있다. 특히, 암이 타 조직으로 전이되었거나 또는 전이 확률이 높을 경우, 방사선요법 (주로 국부 종양 치료에 적용)과 전신요법인 화학요법 또는 면역요법을 병행하여 치료할 수 있다. 그러나 불행하게도, 종양이 방사선 내성을 갖는 경우, 방사선 조사를 받게 되는 암 조직 주변의 정상 조직에 치명적인 독성을 일으키기 때문에 용량을 무제한 증가시킬 수 없으며 치료효과가 제한적 일수밖에 없다. 따라서, 방사선 요법에 대한 암세포의 민감도를 증가시켜 종양의 악성 정도를 감소시킬 필요가 있다. 더욱이, 특정 암세포만 방사선 치료에 선택적으로 적용되게 하는 방법을 개발함으로써,방사선 조사의 독성으로부터 정상세포를 보호할 필요가 있다.
유사하게, 일부 항암제들의 독성을 완화하기 위한 방안으로, 비독성 물질 또는 "전구약물"을, 치료효과를 갖는 물질로 전환시키는 "화학유전자 (chemogenes)"를 종양세포에 도입하기 위하여 아데노 바이러스를 사용하여왔다. 유전자 치료법 같은 여러 새로운 시도들이 암치료의 치료지수를 증가시키는 방안으로 연구중에 있 다.
이들 방법들 중 하나가, 소위 "자살 유전자 요법 (suicide gene therapy)"이라 하는 것인데 이 방법은 비독성의 전구약물을 독성의 항-대사물로 전환시키는 효소를 지시하는 비-포유동물 유전자를 암세포로 전달하고 발현시키는 것을 포함한다. 임상시험에서 현재 평가되고 있는 두개의 "자살 유전자"는 대장균 (E. coli) 유래 시토신 디아미나아제(CD)와 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입-1 티미딘 키나아제(HSV-1 TK) 유전자이며 이는 각각 5-플루오로 시토신(5-FC) 과 갠사이클로버(GCV)에 대한 민감성을 부여한다. 이러한 유전자가 종양으로 표적 운반되면 5-FC 및 GCV 전구약물은 강력한 화학치료제로 국소적으로 전환되어 현저한 종양세포 사멸을 이끈다(하기 문헌: 1). 따라서, 기존의 화학치료법들에 의해 수반되는 사용 용량-제약성의 전신독성이 많이 완화되게 된다.
이전에, 박테리아 CD와 야생형 HSV-1 TK 유전자를 결합하여 새로운 CD/HSV-1 TK 융합 유전자를 생성한 바 있다(하기 문헌: 1). CD/HSV-1 TK 융합 유전자는 CD/5-FC 및 HSV-1 TK/GCV 자살 유전자 치료의 병행 사용을 가능케 한다. CD/5-FC 및 HSV-1 TK/GCV 자살 유전자 치료는 악성 세포에 특정 약리학적 제제에 대한 민감성을 부여하며 또한 중요한 것은, 종양세포에 방사선 민감성을 부여하는 것으로 앞선 연구들에서 제시하여 왔다(하기 문헌: 1-9). 원형 (prototype)의 CD/HSV-1 TK 융합 유전자를 포함하는 신규의, 종양세포 용해성이 있는, 복제가능 아데노바이러스(Ad5-CD/TKrep)(하기 문헌: 10)를 사용하여, 방사선 치료와 병행하거나 병행하지 않고, 증식 가능 아데노 바이러스 매개 이중자살 유전자 요법의 안전성과 효능에 대해, 여러 전임상연구 암 모델(하기 문헌: 10-13)에서, 보다 최근에는 전립선암 환자 대상의 임상 시험 (하기 문헌: 14, 15)에서 그 안전성 및 효능이 입증된 바 있다.
사람의 전립선 암을 대상으로 하는 이들 임상시험에서 최고 3주간 5-FC 및 GCV(vGCV) 전구약물 치료법과 병행한 Ad5-CD/TKrep 바이러스는, 통상적인 용량(70 Gy)의 삼차원 입체 조형 방사선 치료법(3DCRT)을 병행 하지 않거나 (하기 문헌: 14) 혹은 병행 (하기 문헌: 15)하였을 때 최고 1012 바이러스 입자 (Vp) 투여까지 안정성이 입증되었다. 더욱이, 이러한 치료 방식은 임상적 효과에 대한 징후를 나타내었다(하기 문헌: 14, 15).
이러한 진전에도 불구하고, 암 치료에 사용되기 위한 효과적인 방법 및 조성물이 현저히 요구되는 실정이다. 본 발명은 이러한 결점 및 다른 결점의 견지에서 개발되었다.
발명의 요약
본 발명은 포유류 암 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 신규 바이러스를 포함하는 새롭고 향상된 암 치료용 방법 및 조성물을 포함한다. 상기 바이러스는 비-독성 전구약물을 강력한 화학치료제로 전환시키는 새로운 단백질을 생성한다. 이러한 화학치료제는 국소적으로 생성되며 바이러스가 암 세포를 사멸시키는 것을 도울 뿐만 아니라 종양세포에게 방사선에 대한 민감성을 부여한다. 전임상 연구에서, 상기 바이러스는 단독으로 사용되는 경우보다 전구약물 요법 및/또는 방사선 요법과 결합하여 사용되는 경우 다양한 사람 암세포를 효과적으로 사멸시키는 것으로 나타났다.
본 발명은 종래에 개시된 원형 Ad5-CD/TKrep 바이러스에 비해 상대적으로 적어도 두 가지의 현저한 향상성을 갖는 새로운 "제 2 세대" 아데노바이러스 ("Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP"라 명명됨)를 포함한다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 그 생성물이 5-FC 및 GCV 전구약물을 이들의 활성 화학치료제로 전환시키는데 보다 효과적인 향상된 yCD/mutTKSR39 융합 유전자를 갖는다. 더욱이, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 Ad5 ADP 단백질을 발현하며, 이는 복제능이 있는 아데노바이러스의 종양세포 용해 활성을 현저히 증가시킨다. 원형 Ad5-CD/TKrep 바이러스에 비해 상대적으로, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 전임상 암 모델에서 보다 우수한 바이러스성 종양세포 용해 활성 및 화학치료 활성을 나타내었다. 상기 데이타는 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스를 포함하는 본 발명이 5-FC와 GCV 전구약물 요법 및 방사선 요법과 결합된 경우 임상적으로 낮은 독성 및 현저한 항-종양 활성을 나타냄을 제시한다.
본 발명의 다른 견지는 하기 도면 및 상세한 설명을 통해 당해 기술분야의 숙련자에게 쉽게 이해될 것이다.
도면의 간단한 설명
본 발명을 하기 도면과 관련하여 예시함으로써 설명한다.
도 1은 본 발명의 바이러스 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP의 개요도이다.
도 2는 본 발명의 ADP 유전자의 유용성을 나타내는 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 향상된 yCD/mutTKSR39 유전자의 유용성을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 ADP 유전자의 유용성을 나타내는 도면이다.
도 5는 전립선내 LNCaP C4-2 마우스 모델에서 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP를 이용한 Kaplan-Meier 플롯을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
일반적으로, 본 발명은 암 치료용 방법 및 조성물을 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 전구약물과 함께 투여 시 암세포를 사멸하고 잔존하는 암세포가 방사선에 보다 민감해지도록 할 수 있는 치료 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 구현으로 비-독성 전구약물을 화학치료제로 전환시킬 수 있는 단백질을 생성하는 새로운 바이러스가 제공된다. 상기 전구약물은 국부적으로 생성되거나 혹은 치료와 관련하여 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 바이러스는 예를 들어, 이에 한정하는 것은 아니나 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP와 같이 종양세포 용해성의 복제능이 있는 아데노바이러스이다. 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여시 상기 아데노바이러스는 적어도 두 가지 전구약물을 화학치료제로 전환한다. 이러한 전구약물은 이에 한정하는 것은 아니나 5-플루오로시토신(5-FC) 및 간시클로비어(GCV 및 이들의 유도체)를 포함할 수 있다.
전구약물을 화학치료제로 전환시키는 능력에 부가적으로 본 발명의 구현은 세포를 방사선에 민감하게 한다. 세포를 민감하게 함으로써 보다 낮은 방사선 투여량이 방사선의 유익성을 제한함이 없이 사용될 수 있다. 또한, 암세포가 방사선에 보다 민감해지는 한편 정상세포는 보다 덜 민감해지고 이에 따라 암 치료의 부작용을 제한하기 때문에, 방사선 치료가 보다 효과적이게 된다. 본 발명의 치료 방법 및 조성물은 수술, 화학치료, 호르몬 치료 및 면역치료와 같은 다른 치료와 함께 사용될 수 있다.
바람직한 구체예로, 본 발명은 이스트 시토신 디아미나아제(yCD)/돌연변이 SR39 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입-1 티미딘 키나아제(mutTKSR39) 융합 유전자 및 아데노바이러스 타입 5(Ad5) 아데노바이러스 사멸 단백질(ADP) 유전자를 함유하는 신규의, 종양세포 용해성의 복제능이 있는 아데노바이러스 (Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP)를 포함한다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 사람 암세포내에서 복제되며 사람의 암세포를 효과적으로 사멸시킨다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 두 가지 전구약물, 5-플루오로시토신(5-FC) 및 간시클로비어(GCV; 및 GCV 유도체)를 강력한 화학치료제로 전환시킬 수 있는 새로운 yCD/mutTKSR39 융합 단백질을 생성한다(이중 자살 유전자 치료로서 언급됨). yCD/5-FC 및 HSV-1 TKSR39 자살 유전자 치료는 모두 강력한 화학치료 활성을 나타내며 종양세포를 이온화 방사선에 민감하게 만든다.
예를들면, 전임상 연구는 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스가 그대로 사용되거나 혹은 다른 이중 자살 유전자 치료 및/또는 방사선 요법과 함께 사용되는 경우 다양한 사람 암세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 보여준다. 임상 설정 시, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스는 바이러스-매개 종양세포 용해성 효과를 위하여 단일요법으로 사용될 수 있으며, 복합된 바이러스성 종양세포 용해/화학치료 효과를 위하여 yCD/5-FC 및 HSV-1 Ad5-TKSR39/GCV 자살 유전자 치료와 결합될 수 있으며, 혹은 복합된 바이러스성 종양세포 용해/화학치료/방사선민감화 효과(삼중 치료로 언급됨)를 위하여 yCD/5-FC 및 HSV-1 TKSR39/GCV 자살 유전자 치료 및 방사선 요법과 결합될 수 있다. 삼중 치료는 사람 암의 관리시 수술, 화학치료, 호르몬 치료 및 면역치료와 같은 다른 통상적인 암 치료와 결합될 수 있다.
암 치료와 같은 이러한 유전자 치료에 기초한 방법을 더욱 발달 시키기위해, 원형 Ad5-CD/TKrep 바이러스에 비해 상대적으로 두 가지 현저한 향상성을 갖는 새로운 제 2 세대 아데노바이러스(Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP)를 개발하였다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 그 생성물이 5-FC 및 GCV 전구약물을 이들의 활성 화학치료제로 전환시키는데 보다 효과적인 향상된 yCD/mutTKSR39 융합 유전자를 갖는다. 더욱이, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 Ad5 ADP 단백질을 발현하며, 이는 복제능이 있는 아데노바이러스의 종양세포 용해 활성을 현저히 증가시킨다. 원형 Ad5-CDITKrep 바이러스에 비해 상대적으로, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 전임상 암 모델에서 보다 우수한 바이러스성 종양세포 용해 활성 및 화학치료 활성을 나타내었다.
바이러스 감염에 의한 본 발명의 핵산 도입은 다른 열거된 방법에 비해 여러가지 장점을 제공한다. 바이러스 감염성에 기인하여 보다 높은 효율이 획득될 수 있다. 더욱이, 바이러스는 매우 특수화되어 있어 전형적으로 특정 세포타입에 감염 및 증식하게 되어있다. 따라서, 이들 바이러스의 특이성 성향은 생체내에서 또는 조직이나 혼합된 세포 배양물에서 벡터를 특정 세포에 대하여 표적화하는데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 특정 수용체 또는 리간드로 변형되어 수용체 매개 이벤트를 통하여 표적 특이성이 달라질 수 있다.
또한, 안전성을 확보하고/하거나 치료 효율을 증가시키기 위해 부가적인 특성이 벡터에 더해질 수 있다. 이러한 특성은 예를 들어, 재조합 바이러스로 감염된 세포에 대하여 음성적으로 선별하는데 사용될 수 있는 마커를 포함한다. 이러한 음성적 선별 마커의 예는 항생물질 간시클로비어에 대한 민감성을 부여하는 상기 언급한 TK 유전자이다. 따라서 음성적 선별은 유도가능한 자살을 제공하기때문에 그 감염이 항생물질의 첨가를 통해 조절될 수 있는 수단이다. 이러한 보호는 예를들어, 변환된 형태의 바이러스 벡터 또는 재조합 서열을 생성하는 돌연변이가 발생하는 경우 세포의 형질전환이 일어나지 않을 것을 확실하게 한다.
특정 세포 타입에 대한 발현을 제한하는 특성이 또한 일부 구현에 포함될 수 있다. 이러한 특성은 예를 들어, 원하는 세포 타입에 대하여 특이적인 프로모터 및 조절 엘리먼트를 포함한다.
또한, 재조합 바이러스 벡터는 측면 감염 및 특이성을 타겟팅하는 장점을 제공하기때문에 본 발명의 핵산을 생체 내에서 발현시키는데 유용하다. 측면 감염은, 레트로바이러스의 경우에서 처럼, 라이프 사이클에 본래 존재하는 것으로서 단일 감염된 세포에서 생성된 여러 자손 비리온 (virion)이 떨어져 나와 (bud off) 이웃하는 주변 세포를 감염시키는 것이다. 그 결과, 처음 원래의 바이러스 입자에 의해 감염되지 않았던 대부분의 많은 지역이 신속히 감염되게 된다. 이는 감염원이 딸 자손을 통해서만 퍼지는 수직형 감염과는 대조적이라고 볼 수 있다. 측면으로 퍼질 수 없는 바이러스 벡터가 또한 생성될 수 있다. 이 특성은 특정 유전자를 국한된 수의 표적 세포에만 도입하는 것을 목적으로 하는 경우에 유용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 바이러스는 숙주 방어 기작을 피하기 위해 많은 경우에 진화된 매우 특수화된 감염원이다. 일반적으로, 바이러스는 특정 세포 타입에 감염하고 그 세포에서 증식한다. 바이러스 벡터를 특정장소로 선택적으로 타겟팅하는 것은 주로 바이러스 자체가 원래 갖고 있는 선택적 특이성을 이용하여 이미 정해진 세포 유형에 타겟팅하는 것이며 그리하여 재조합 유전자를 그 감염세포로 도입되도록 한다. 본 발명의 방법에 사용되는 벡터는 타겟으로 삼는 세포 유형에 따라 달라질 것이며 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 것일 것이다. 예를 들어, 만일 치료하고자 하는 것이 유방암인 경우 그 상피 세포에 대해 특이적인 벡터가 사용될 수 있다. 마찬가지로, 치료하고자 하는 것이 조혈 시스템의 질병 혹은 병리적 조건인 경우 혈액세포 및 이들의 전구체에 대해 특이적인, 바람직하게는 특정 타입의 조혈세포에 대해 특이적인 바이러스 벡터가 사용될 수 있다.
재조합 벡터는 여러가지 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 그 방법은 바이러스 벡터의 타겟 특이성을 이용할 수 있으며 이 경우 질환부에 국소적으로 투여할 필요가 없다. 그러나, 국소 투여는 보다 신속하고 보다 효과적인 치료를 제공할 수 있다. 또한 투여는 대상자에게 정맥 내 혹은 피하 주사 같은 방식으로 수행할 수 있다. 주입후, 이들 바이러스 벡터는 선택적으로 타겟하여 감염시킬 수 있는 숙주세포를 만날 때까지 순환할 것이다.
또 다른 투여 방식으로는, 질병 또는 병리적 조건 자리에 국소적으로 직접 접종하거나 혹은 영양분을 공급하는 혈관계로 접종하는 방식이 있다. 국소 투여는 희석 효과가 없기때문에 유리하며 따라서 다수의 표적세포에서 발현시키는데 보다 적은 투여량이 요구된다. 또한, 국소 투여는 벡터가 접종된 지역내 모든 세포를 감염시키는데 사용될 수 있기 때문에 다른 투여형태를 필요로하는 표적 요건을 완화시킬 수 있다. 만일 접종된 지역내의 특정 세포 부분집단에서만 발현이 되길 원하는 경우, 원하는 부분집단에 특이적인 프로모터 및 조절 엘리먼트가 이러한 목적을 완수하는데 사용될 수 있다. 이러한 비-표적 벡터는 예를 들어, 바이러스 벡터, 바이러스 게놈, 플라스미드, 파지미드 등일 수 있다. 리포좀과 같은 트랜스펙션 운반체가 또한 상기 비-바이러스 벡터를 접종지역내의 수용세포내로 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 트랜스펙션 운반체는 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
본 발명의 화합물은 각 환자의 임상적 상태, 투여 부위 및 투여 방법, 투여 일정, 환자 나이, 성별, 체중 및 의사들에게 공지된 기타 요인을 고려하여 우수 의학 실행에 따라 투여 및 투약된다. 본 명세서에서 목적상 약학적으로 "유효량"은 당해 기술분야에 알려진 바와 같이 이러한 고려사항에 의해 결정된다. 그 양은 이에 한정하는 것은 아니나 향상된 생존율 또는 보다 신속한 회복, 또는 증상 및 당해 기술분야의 숙련자에 의한 적절한 측정치로서 선택되는 것과 같은 다른 지표의 향상 혹은 제거를 포함하는 향상을 달성하기에 효과적이어야 한다.
본 발명의 방법에서, 본 발명의 화합물은 여러가지 방식으로 투여될 수 있다. 이는 화합물로 투여될 수 있으며 단독으로 혹은 약학적으로 허용된 캐리어, 희석제, 보조제 및 운반체와 함께 활성 성분으로 투여될 수 있다. 상기 화합물은 경구, 피하주사 또는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 및 비강내 투여 뿐만 아니라 수막강내 및 인퓨전 기술를 포함하는 비경구적으로 투여 될 수 있다. 상기 화합물의 이식 또한 유용하다. 치료받는 환자는 온혈 동물 특히 사람을 포함하는 포유류이다. 약학적으로 허용된 캐리어, 희석제, 보조제 및 운반체 뿐만 아니라 이식물 캐리어는 일반적으로 본 발명의 활성 성분과 반응하지 않는 비활성, 비-독성 고체 필러, 액체 필러, 희석제 또는 캡슐화 물질을 칭한다.
일반적으로 본 명세서에 예시된 마우스나 다른 실험동물보다 사람은 보다 오랜 치료기간을 갖는 사실에 주의해야 하며, 그 치료 기간은 질병 진행기간과 약물 효과의 기간에 비례한다. 투여는 단일 투여 또는 수일의 기간에 걸친 다중 투여일 수 있다. 치료기간은 일반적으로 질병 진행 기간 및 약물 효과 및 치료하고자 하는 대상종에 따라 비례한다.
본 발명의 화합물을 비경구적으로 투여하는 경우, 일반적으로 단위 투여가능한 형태(용액, 현탁액, 에멀전)로 배합될 것이다. 주입하기에 적절한 약학 배합물은 무균 수용액 또는 분산물 및 무균 주입가능한 용액이나 분산물로 재구성하기위한 무균 분말을 포함한다. 캐리어는 예를들어, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및 야채오일을 함유하는 용매 또는 분산매체일 수 있다.
예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산물의 경우에 요구되는 입자크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유체성이 유지될 수 있다. 면실유, 참기름, 올리브오일, 콩기름, 옥수수기름, 해바라기기름 또는 땅콩기름와 같은 비수성 운반체 및 이소프로필 미리스테이트와 같은 에스테르가 화합 조성물용 용매 시스템에 사용될 수 있다. 또한, 항균 보존제, 항산화제, 킬레이트제 및 버퍼를 포함하는 조성물의 안정성, 무균성 및 등장성을 증진시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물의 활성 억제는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 여러 항균 및 항곰팡이제에 의해 확보될 수 있다. 많은 경우에, 예를들어, 당, 염화 나트륨 등과 같은 등장성 제제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주입가능한 약제 형태의 연장된 흡수는 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연하는 제제를 사용하여 이루어질 수 있다. 그러나, 본 발명에 따라 사용되는 어떠한 운반체, 희석제 또는 첨가제라도 상기 화합물과 혼화되어야한다.
무균 주입가능한 용액은 필요에 따라 여러가지 다른 성분을 갖는 필요량의 적절한 용매에 본 발명을 실시하는데 사용되는 화합물을 혼입시킴으로써 준비될 수 있다.
본 발명의 약리학적 배합물은 여러가지 운반체, 보조제, 첨가제 및 희석제와 같은 어느 혼화가능한 캐리어를 함유하는 주입가능한 배합물로 환자에게 투여될 수 있으며, 본 발명에 사용되는 화합물은 서서히 방출되는 피하 이식물 또는 모노클로날 항체, 벡터화된 운반체, 이온투과담체, 중합체 매트릭스, 리포좀, 마이크로스피어와 같은 표적 운반 시스템의 형태로 환자에게 비경구적으로 투여될 수 있다. 이식물, 운반 시스템 및 모듈과 같은 다른 많은 것들이 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 화합물은 처음에는 적절한 수준의 혈중 농도 (blood level)를 이루기 위해 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 그 다음 환자의 수준은 경구 투여 형태로 유지되나, 환자의 상태에 따라 그리고 상기 언급한 바와 같은 다른 투여 형태가 사용될 수 있다. 투여되는 양은 처리되는 환자에 따라 달라질 것이다.
정의
달리 언급하지 않는한 하기 용어 및 구는 다음과 같은 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전자 치료"는 관심있는 유전 물질(예, DNA 또는 RNA)을 숙주내로 전달하여 유전학적 혹은 후천적 질병이나 조건 표현형을 치료 혹은 예방하는 것을 칭한다. 관심있는 유전 물질은 생체내에서 생성시키고자 하는 생성물(예, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 기능성 RNA, 안티센스)을 암호한다. 예를 들어, 관심있는 유전 물질은 치료적 가치가 있는 호르몬, 수용체, 효소, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화할 수 있다. 관심있는 유전 물질은 또한 자살 유전자를 암호화할 수 있다. 검토를 위해 일반적으로 "Gene Therapy"(Advances in Pharmacology 40, Academic Press, 1997)를 참조 바람.
용어 "생체내 유전자 치료"는 전달되는 유전 물질이 그 수용체내에 존재하는 원위치에서 (in situ) 수용체 기관의 표적세포내로 도입되는 경우를 칭한다. 치료후, 유전적으로 변환된 표적세포는 원위치에서 트랜스펙션된 유전물질을 발현한다. 이러한 치료는 또한 숙주 유전자가 결함이 있는 경우 원위치에서 그 유전자를 수복하는 것을 포함한다.
용어 "유전자 발현 운반체"는 이종성 핵산을 숙주세포내로 운반/전달할 수 있는 어떠한 운반체를 칭한다. 발현 운반체는 당해 기술분야에 알려진 바와 같이 세포 선별 방식에서 핵산의 표적, 발현 및 전사를 조절하는 엘리먼트를 포함할 수 있다. 종종 유전자의 5'UTR 및/또는 3'UTR이 발현 운반체의 5'UTR 및/또는 3'UTR로 대체될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 발현 운반체는 운반되어지는 실제 유전자의 5'UTR 및/또는 3'UTR를 포함할 뿐만 아니라 특정 아미노산 암호 부위를 포함할 수 있다. 발현 운반체는 이종성 물질의 전사를 조절하는 프로모터를 포함할 수 있으며 선택적인 전사를 가능케하는 구성적 혹은 유도성 프로모터일 수 있다. 필요한 전사 조절을 확보하기에 요구될 수 있는 인핸서가 임의로 포함될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 프로모터에 의해 지시되는 기본 전사 수준을 변화시키기위해 암호 서열과 인접하게 작동하는(in cis) 어떠한 비-번역 DNA 서열이다. 발현 운반체는 또한 선별 유전자를 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
실시예 1. Ad5-yCD/ mut TK SR39 rep -ADP 아데노바이러스의 특징
Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 아데노바이러스의 전장 DNA 및 일부분 DNA 및 번역된 단백질 서열, yCD/mutTKSR39 융합 유전자 및 ADP 유전자(서열번호: 1 내지 4 및 6)를 서열목록에 나타내었다. 하기 실시예는 이러한 서열의 견지에서 나타낸 것이다.
실시예의 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스 (서열번호: 1)는 E1 영역에 향상된 yCD/mutTKSR39 융합 유전자 및 E3 영역에 Ad5 ADP 유전자를 포함하는 복제능이 있는, 타입 5 아데노바이러스(그 서열은 당해 기술분야 숙련자에게 쉽게 알려져 있으며 입수가능하다)이다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP의 개요도는 도 1로 제공된다(도 1에서, "CMV" = 휴먼 사이토메갈로바이러스 프로모터; "SV40" = 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 서열; 및 "mu" = 맵 유닛). 도 1에 나타낸 바와 같이, CMV-yCD/mutTKSR39-SV40 발현 카세트는 결실된 55kDa E1B 유전자의 자리내 E1 영역에 위치한다. CMV-ADP-SV40 발현 카세트는 결실된 E3 유전자의 자리내 E3 영역에 위치한다.
Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 55kDa E1B 유전자(서열번호: 2)에서 1,255염기쌍(bp) 결실(염기 2,271-3,524)을 포함한다. 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 방법을 사용하여 두 개의 조숙 (premature) 번역 정지 코돈을 절단된 비-기능성의 78 아미노산 E1B 단백질을 생성하는 55kDa E1B 유전자내로 조작하였다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 야생형 Ad5 E1A 및 19kDa E1B 단백질을 발현한다. yCD/mutTKSR39 융합 유전자 (서열번호: 4)는 결실된 55kDa E1B 유전자의 위치에 삽입하였다. yCD/mutTKSR39 융합 유전자의 발현은 휴먼 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 유도되며 시미안 바이러스 40(SV40) 폴리아데닐화 엘리먼트를 사용하였다. yCD/mutTKSR39 융합 유전자는 59kDa yCD/mutTKSR39 융합 단백질을 코딩하며, 이는 효소적으로 5-플루오로시토신(5-FC)을 플루오로우라실(5-FU)로 전환할 수 있으며, 간시클로비어(GCV) 및 그 유도체를 이들의 상응하는 모노포스페이트로 전환할 수 있다(예, GCV-MP). 5-FU 및 GCV-MP의 하류 (downstream) 대사 산물은 DNA 복제의 강력한 억제제이며 분열하는 세포의 사멸을 일으킨다. 이러한 하류 대사 산물은 또한 강력한 방사증감제이며 방사선 치료의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있다(하기 문헌 1-14). yCD/mutTKSR39 융합 단백질을 발현하는 세포 뿐만 아니라, 방관자효과에 의해 주위 세포는 yCD/5-FC 및 HSV-1 TKSR39/GCV 자살 유전자 치료에 의해 사멸되며 이온화 방사선의 사멸 효과에 민감해진다.
Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 또한 숙주 면역 반응을 억제하지만 바이러스 복제에 필요한 유전자에 영향을 주는 E3 영역에 2.68kb 결실을 (염기 28,133~30,181) 포함한다(서열번호: 3). Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 천연 Ad5 E3 유전자의 위치에 Ad5 ADP 발현 카세트를 갖는다. ADP 유전자(서열번호: 6)의 발현은 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 유도되며 시미안 바이러스 40(SV40) 폴리아데닐화 엘리먼트를 사용한다. 변형되지 않은 원래의 111.6kDa Ad5 ADP 단백질이 생성되며, 이는 복제능이 있는 아데노바이러스의 종양용해 활성을 현저히 증가시킨다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 다른 알려진 모든 Ad5 E3 유전자들(gp19, 10.4kDa, 14.5kDa 및 14.7kDa 유전자)가 결핍되어 있다.
실시예 2. Ad5-yCD/ mut TK SR39 rep -ADP 아데노바이러스의 제작
Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP의 제작에 사용된 아데노바이러스 서열을 함유하는 플라스미드는 Microbix(Toronto, Canada)로 부터 입수하였다. pCMV-yCD/mutTKSR39 발현 플라스미드(좌-말단 벡터)를 생성하기위해, 돌연변이 SR39 HSV-1 TK 유전자(하기 문헌: 16)를 선형화된 pET23d:HSVTKSR39 를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 생성하였다. 하기 프라이머쌍을 mutTKSR39 PCR 산물을 생성하는데 사용하였다:
5'-GATCGGATCCCTCGAGATCCTAGCATGGCTTCGTACCCCGGC-3 (서열번호: 8)
5'-GATCGAATTCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTC-3 (서열번호: 9)
그 결과물인 1,128bp 단편을 BamHI(GGATCC) + EcoRI(GAATTC)으로 절단하였고, 원형 CD/HSV-1 TK 융합 유전자를 제거한후 pCA14-CDglyTK-E1aE1b(하기 문헌: 10)의 BamHI + EcoRI 부위 사이에 클로닝하여 pCA14-CMV-mutTKSR39-E1aE1b를 생성하 였다. yCD 유전자(하기 문헌: 17)를 주형으로서 선형화된 pBAD-ByCD를 사용하여 생성하였다. 하기 프라이머쌍을 yCD PCR 산물을 생성하는데 사용하였다:
5'-GATCCTCGAGCCACCATGGTGACAGGGGGAATG-3' (서열번호: 10)
5'-GATCGCTAGCACCTCCCCCACCGCCTCtCCCTCCACCCTCACCAATATCTTC-3' (서열번호: 11)
그 결과물인 526bp 단편을 XhoI(CTCGAG) + NheI(GCTAGC)으로 절단하고 pCA14-CMV-mutTKSR39-E1aE1b의 XhoI + NheI 부위 사이에 클로닝하여 pCA14-CMV-yCD/mutTKSR39-E1aE1b를 생성하였다.
pBHG10-Paclmod-CMV-ADP(우-말단 벡터)를 생성하기 위해, ADP 유전자를 PCR에 의해 생성하고 pBHG10-PacImod의 PacI과 SwaI 부위 사이에 클로닝하였다. pBHG10-PacImod는 pBHG10(Microbix; Toronto, Canada)의 유도체이며 지향성 클로닝이 용이하도록 하기위해 E3 영역에 PacI 및 SwaI 부위를 포함한다.
pBHG10은 E1 영역에 염기 188~1,339 및 E3 영역에 염기 28,133~30,818이 제외된 전체 아데노바이러스 타입 5 게놈을 포함한다. 주형으로서 야생형 Ad5 DNA를 사용하여, ADP 유전자를 함유하는 333bp PCR 산물을 생성하였다. 하기 프라이머쌍을 ADP PCR 산물을 생성하는데 사용하였다:
5'-GATCGGATCCCCTGCTCCAGAGATGACCGGC-3' (서열번호: 12)
5'-GATCAAGCTTGGAATCATGTCTCAMAATC-3' (서열번호: 13)
그 결과물인 333bp PCR 산물을 BamHI(GGATCC) + HindIII(AAGCTT)로 절단하고 BamHI-HindIII 절단된 pCA14(Microbix; Toronto, Canada)내로 클로닝하여 pCA14- ADP를 생성하였다. 전체 CMV-ADP-SV40 폴리A 발현 카세트를 하기 프라이머쌍을 이용하여 PCR에 의해 생성하였다:
5'-GATCATTTAAATAATTCCCTGGCATTATGCCCAGTA-3' (서열번호: 14)
5'-GATCTTAATTAATCGATGCTAGACGATCCAGACATG-3' (서열번호: 15)
SwaI 제한부위(ATTTAAAT)를 5'프라이머내 CMV 프로모터의 상류 (upstream)에 도입하였고 PacI 제한부위(TTAATTAA)는 3'프라이머를 갖는 SV40 폴리 A 영역의 하류에 도입하였다. PCR 산물을 SwaI 및 PacI으로 절단하고 SwaI-PacI 절단된 pBGH10-PacImod내로 클로닝하여 pBGH10-PacImod-CMV-ADP를 생성하였다.
Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스를 생성하기위해, pCA14-CMV-yCD/mutTKSR39-E1aE1b(10㎍)를 PvuI 절단에 의해 선형화하고 ClaI-선형화된 pBHG10-PacImod-CMV-ADP(30㎍)과 함께 CaPO4-DNA 침전법을 이용하여 HEK293 세포(Microbix)에 동시-트랜스펙션하였다. 분리된 플라크를 7~14일 후에 수거하여 HEK 293 세포에서 2회 플라크-정제하였다. 2회 정제된 플라크로부터 얻어진 바이러스를 사용하여 HEK293 세포를 감염시켜 미정제 바이러스 상층액 및 CsCl 구배-정제된 아데노바이러스를 생성시켰다.
실시예 3. 시험관내에서 Ad5-yCD/ mut TK SR39 rep -ADP에 함유된 ADP 유전자의 장점
사람 DU145 전립선 선암 (adenocarcinoma) 세포를 24-웰 플래이트에 5×104 세포/웰의 농도로 플래이팅하고 등급량의 Ad5-CD/TKrep(레인 1) 및 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스(레인 2)로 감염시켰다. 5일후, 세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 그 결과(도 2에 나타낸 바와 같음, "Vp" = 바이러스 입자), Ad5 ADP 유전자를 함유하며 ADP 단백질을 발현하는 복제능이 있는 아데노바이러스(즉, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP)는 ADP가 결실된 아데노바이러스보다 현저히 우수한 종양용해 활성을 갖는다는 것이 확실히 입증되었다. 즉, Ad5 ADP 유전자의 존재는 복제능이 있는 아데노바이러스의 종양용해 활성을 현저히 증가시켰다. 이러한 결과는 시험관내에서 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP에 함유된 ADP 유전자의 유용성을 입증한다.
실시예 4. 시험관내에서 Ad5-yCD/ mut TK SR39 rep -ADP에 함유된 yCD/ mut TK SR39 유전자의 장점
A. CD 어세이
LNCaP C4-2 세포를 목 (mock)-감염시키거나(레인 1 및 5), 또는 10 MOI로 Ad5-CD/TKrep(레인 2 및 6), Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP(레인 3 및 7), Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-hNIS(레인 4 및 8)를 사용하여 감염시켰다. 72시간후, 기질로서 [14C]-시토신(레인 1~4) 및 [3H]-5-FC(레인 4~8)를 이용하여 세포를 CD 활성에 대하여 검사하였다. 그 결과를 도 3a[(시토신(좌하 화살표), 우라실(좌상 화살표), 5-FC(우하 화살표), 5-FU(우상 화살표)]에 나타내었다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 재조합 아데노바이러스는 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP와 같이 향상된 yCD/mutTKSR39 rep 유전자를 발현하며, 이는 원형 Ad5-CD/TKrep 바이러스에 함유된 CD/HSV-1 TK 융합 유전자를 발현하는 바이러스에 비해 시토신에서 우라실로의 전환이 아닌 5-FC에서 5-FU로의 보다 우수한 전환을 나타낸다.
B. 세포 변성 효과 어세이
세포(106 세포, 60mm 디쉬)를 목 (mock)-감염시키거나, 또는 3 MOI로 Ad5-CD/TKrep 또는 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP를 사용하여 감염시켰다. 다음날, 세포를 여러가지 농도(㎍/ml)의 5-FC(웰 3~7 및 15~19, 좌에서 우로, 위에서 아래로) 또는 GCV(웰 8~12 및 20~24, 좌에서 우로, 위에서 아래로)를 함유하는 배지에 재플레이팅하였다. 9일후 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 그 결과(도 3b에 나타냄), Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP와 같은 향상된 yCD/mutTKrep 유전자를 발현하는 재조합 아데노바이러스는 원형 Ad5-yCD/TKrep 바이러스에 함유된 CD/HSV-1 TK 융합 유전자를 발현하는 바이러스보다 5-FC 전구약물 요법과 결합된 경우에 보다 우수한 세포 사멸을 달성하는 것으로 나타났다. 또한, 도 3a 및 3b의 결과는 시험관내에서 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP에 함유된 yCD/mutTKSR39 유전자의 유용성을 보여준다.
본 실시예의 결과는 또한 yCD/5-FC 및 HSV-1 TKSR39/GCV 자살 유전자 치료가 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스 자체의 치료 효과를 증가시키는데 사용될 수 있음을 입증한다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 그 생성물이 원형 Ad5-CD/TKrep 바이러스에 의해 생성되는 CD/HSV-1 TK 융합 단백질에 비하여 상대적으로 향상된 촉매 활성을 갖는 새로운 yCD/mutTKSR39 융합 유전자를 갖는다. 향상된 yCD/mutTKSR39 융합 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 원형 CD/HSV-1-TK 융합 단백질을 발현하는 바이러스에 비해 5-FC에서 5-FU로의 보다 우수한 전환을 나타내며 그리고 가능하게는 GCV에서 GCV-MP로의 보다 우수한 전환을 나타낸다. 따라서, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 바이러스의 종양 파괴 효과를 증대시키기 위해 yCD/5-FC 및 HSV-1 TKSR39/GCV 자살 유전자는 독립적으로 사용될 수도 있고 함께 사용될 수도 있다.
실시예 5. 생체내에서 Ad5-yCD/ mut TK SR39 rep -ADP에 함유된 ADP 유전자의 장점
근육내(다리)주사로 C33A 종양(150~200mm3)에 1010vp의 Ad5-CD/TKrep 또는 Ad5-CD/TKrep-ADP를 제 0, 2 및 4일에 주입하였다(도 4의 화살표 머리). 5-FC(500mg/kg/day) 및 GCV(30mg/kg/day)를 제 5~11일에 투여하였다(도 4의 평행선 음영 막대). 종양 체적을 격일로 모니터링하였다. 미리정해진 종결시점은 500mm3이었다. 생존은 제 90일에 종양을 갖지 않거나(치료) 혹은 <500mm3의 종양을 갖는 동물로 정의하였다. 그 결과(도 4 및 하기 표 1에 나타냄)는 생체내에서 보다 우수한 종양 세포 파괴를 나타내었으며 따라서 이는 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP에 함유된 ADP 유전자의 유용성을 입증한다. 즉, Ad5 ADP 유전자의 존재는 시험관내에서 뿐만 아니라 생체내에서 복제능이 있는 아데노바이러스의 종양용해 활성을 증가시켰다.
표 1. C33A 종양 모델에서 Ad5-CD/TKrep-ADP를 이용한 결과의 요약
그룹 평균 생존a 종양 치료율(%) P 값
로그 등급 (생존) 피셔 이그잭트 (종양 치료)
PBS 17 0(0/13)
Ad5-CD/TKrep 26 0(0/12)
Ad5-CD/TKrep + 5-FC + GCV 33 9(1/11)
Ad5-CD/TKrep-ADP >90 8(1/12) 0.022b 1.000b
Ad5-CD/TKrep-ADP + 5-FC + GCV >90 70(7/10) 0.026c .008c
a평균 생존은 일(days)로 나타낸다.
bAd5-CD/TKrep-ADP 대 Ad5-CD/TKrep
cAd5-CD/TKrep-ADP + 5-FC + GCV 대 Ad5-CD/TKrep + 5-FC + GCV
실시예 6. 마우스 모델에서 생체내 Ad5-yCD/ mut TK SR39 rep -ADP의 효과
전립선내 형성된 LNCaP C4-2 종양(크기 약 25 ~ 50mm3)을 갖는 수컷 SCID 마우스에 약 109vp의 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP를 제 0일에 주입하였다(도 5의 화살표 머리). 5-FC(500mg/kg/day) 및 GCV(30mg/kg/day)를 제 3~9일에 투여하였다(도 5의 평행선 음영 막대). 혈청 PSA를 매주 측정하였다. 미리 정해진 종결시점은 PSA=500ng/ml이었다. 그 결과(도 5 및 표 2에 나타냄), 본 발명의 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP를 이용한 마우스 모델에서 평균 생존 시간 및/또는 종양 치료율의 증가가 나타났다.
표 2. LNCaP C4-2 종양 모델에서 Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP를 이용한 결과
그룹 평균 생존(일) 종양 치료율(%) P 값
로그 등급 (생존) 피셔 이그잭트 (종양 치료)
PBS 5 0(0/8)
Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 17 0(0/11) .038a NAa
Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP + 5-FC + GCV >90 80(8/10) <0.001b <0.001b
aAd5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP 대 PBS;
bAd5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP + 5-FC + GCV 대 PBS.
실시예 7. yCD/5-FC 및 HSV-1 TK SR39 /GCV를 이용하여 방사선 민감도가 증가된 (Radiosensitized) 사람 암세포
본 발명자에 의한 이전 실험에 나타낸 바와 같이(하기 문헌: 1~14), yCD/5-FC 및 HSV-1 TKSR39/GCV 자살 유전자 치료는 또한 사람 암세포의 방사선에 대한 민감도를 증가시키는데 사용될 수 있다. Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 그 생성물이 원형 Ad5-CD/TKrep 바이러스에 의해 생성되는 CD/HSV-1 TK 융합 단백질에 비하여 상대적으로 향상된 촉매 활성을 갖는 새로운 yCD/mutTKSR39 융합 유전자를 갖는다. 선행 연구는 CD/5-FC 및 HSV-1 TK/GCV 자살 유전자 치료가 사람 종양 세포를 이온화 방사선에 민감해지도록 할 수 있음을 입증하였다. 따라서, Ad5-yCD/mutTKSR39 rep-ADP는 향상된 yCD/mutTKSR39 융합 단백질을 발현하기때문에, 생체내에서 보다 우수한 종양세포 방사선 민감도를 이끌 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 여러가지 참고문헌은 참고문헌 번호로 표기된다. 번호로 표기된 참고문헌들의 목록을 하기에 제공한다. 이러한 참고문헌의 전체 설명은 본 발명과 관련된 기술분야의 상태를 보다 완전히 설명하기위해 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 특정적으로 나타내어지고 상기 바람직한 그리고 택일적인 구체예, 및 실시예를 참고로 설명되었지만, 하기 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 발명을 실시하는데 있어서 본 명세서에 기술된 본 발명의 구현예에 대하여 여러가지 선택적 방안이 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하며 이에 따라 이들 청구범위의 범위내의 방법 및 조성물 및 이들의 등가물을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 본 발명의 설명은 본 명세서에 기술된 요소의 모든 신규하고 자명하지 않은 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 청구범위는 이러한 요소의 어떠한 신규하고 자명하지 않은 조합에 대해 본 출원 혹은 후속 출원으로서 제출될 수 있다. 상술한 구체예는 예시적인 것이며 어떠한 단일 특징 또는 요소도 본 출원 혹은 후속 출원에 청구될 수 있는 모든 가능한 조합에 필수적인 것은 아니다. 청구범위가 이들 등가물의 "하나" 또는 "제 1" 요소를 인용하는 경우, 이러한 청구범위는 그러한 요소를 둘 또는 그 이상으로 필요로 하거나 배제하는 것이 아니라 그러한 요소를 하나 또는 그 이상 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
참고문헌 목록
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120 aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 180 aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 240 gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 300 cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 360 agacaccggg accgatccag cctggggatc agtcttcgag tcgaggatcc cctgctccag 420 agatgaccgg ctcaaccatc gcgcccacaa cggactatcg caacaccact gctaccggac 480 taacatctgc cctaaattta ccccaagttc atgcctttgt caatgactgg gcgagcttgg 540 acatgtggtg gttttccata gcgcttatgt ttgtttgcct tattattatg tggcttattt 600 gttgcctaaa gcgcagacgc gccagacccc ccatctatag gcctatcatt gtgctcaacc 660 cacacaatga aaaaattcat agattggacg gtctgaaacc atgttctctt cttttacagt 720 atgattaaat gagacatgat tccaagcttg tcgacttcga gcaacttgtt tattgcagct 780 tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 840 ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcgtc 900 tagcatcgat taattaa 917 <210> 4 <211> 1635 <212> DNA <213> Adenovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(1635) <400> 4 atg ggg aca ggg gga atg gca agc aag tgg gat cag aag ggt atg gac 48 Met Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 att gcc tat gag gag gcg gcc tta ggt tac aaa gag ggt ggt gtt cct 96 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 att ggc gga tgt ctt atc aat aac aaa gac gga agt gtt ctc ggt cgt 144 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 ggt cac aac atg aga ttt caa aag gga tcc gcc aca cta cat ggt gag 192 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 atc tcc act ttg gaa aac tgt ggg aga tta gag ggc aaa gtg tac aaa 240 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 gat acc act ttg tat acg acg ctg tct cca tgc gac atg tgt aca ggt 288 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 gcc atc atc atg tat ggt att cca cgc tgt gtt gtc ggt gag aac gtt 336 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 aat ttc aaa agt aag ggc gag aaa tat tta caa act aga ggt cac gag 384 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 gtt gtt gtt gtt gac gat gag agg tgt aaa aag atc atg aaa caa ttt 432 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 atc gat gaa aga cct cag gat tgg ttt gaa gat att ggt gag ggt gga 480 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Gly Gly 145 150 155 160 ggg gga ggc ggt ggg gga ggt gct agc atg gct tcg tac ccc tgc cat 528 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser Met Ala Ser Tyr Pro Cys His 165 170 175 caa cac gcg tct gcg ttc gac cag gct gcg cgt tct cgc ggc cat agc 576 Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser 180 185 190 aac cga cgt acg gcg ttg cgc cct cgc cgg cag caa gaa gcc acg gaa 624 Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu 195 200 205 gtc cgc ctg gag cag aaa atg ccc acg cta ctg cgg gtt tat ata gac 672 Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp 210 215 220 ggt cct cac ggg atg ggg aaa acc acc acc acg caa ctg ctg gtg gcc 720 Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala 225 230 235 240 ctg ggt tcg cgc gac gat atc gtc tac gta ccc gag ccg atg act tac 768 Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr 245 250 255 tgg cag gtg ctg ggg gct tcc gag aca atc gcg aac atc tac acc aca 816 Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr 260 265 270 caa cac cgc ctc gac cag ggt gag ata tcg gcc ggg gac gcg gcg gtg 864 Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val 275 280 285 gta atg aca agc gcc cag ata aca atg ggc atg cct tat gcc gtg acc 912 Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr 290 295 300 gac gcc gtt ctg gct cct cat gtc ggg ggg gag gct ggg agt tca cat 960 Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His 305 310 315 320 gcc ccg ccc ccg gcc ctc acc atc ttc ctc gac cgc cat ccc atc gcc 1008 Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Ile Phe Leu Asp Arg His Pro Ile Ala 325 330 335 ttc atg ctg tgc tac ccg gcc gcg cgg tac ctt atg ggc agc atg acc 1056 Phe Met Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr 340 345 350 ccc cag gcc gtg ctg gcg ttc gtg gcc ctc atc ccg ccg acc ttg ccc 1104 Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro 355 360 365 ggc aca aac atc gtg ttg ggg gcc ctt ccg gag gac aga cac atc gac 1152 Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg His Ile Asp 370 375 380 cgc ctg gcc aaa cgc cag cgc ccc ggc gag cgg ctt gac ctg gct atg 1200 Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met 385 390 395 400 ctg gcc gcg att cgc cgc gtt tac ggg ctg ctt gcc aat acg gtg cgg 1248 Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg 405 410 415 tat ctg cag ggc ggc ggg tcg tgg tgg gag gat tgg gga cag ctt tcg 1296 Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser 420 425 430 ggg acg gcc gtg ccg ccc cag ggt gcc gag ccc cag agc aac gcg ggc 1344 Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly 435 440 445 cca cga ccc cat atc ggg gac acg tta ttt acc ctg ttt cgg gcc ccc 1392 Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro 450 455 460 gag ttg ctg gcc ccc aac ggc gac ctg tat aac gtg ttt gcc tgg gcc 1440 Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala 465 470 475 480 ttg gac gtc ttg gcc aaa cgc ctc cgt ccc atg cac gtc ttt atc ctg 1488 Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg Pro Met His Val Phe Ile Leu 485 490 495 gat tac gac caa tcg ccc gcc ggc tgc cgg gac gcc ctg ctg caa ctt 1536 Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu 500 505 510 acc tcc ggg atg gtc cag acc cac gtc acc acc cca ggc tcc ata ccg 1584 Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro 515 520 525 acg atc tgc gac ctg gcg cgc acg ttt gcc cgg gag atg ggg gag gct 1632 Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala 530 535 540 aac 1635 Asn 545 <210> 5 <211> 545 <212> PRT <213> Adenovirus <400> 5 Met Gly Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser Met Ala Ser Tyr Pro Cys His 165 170 175 Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser 180 185 190 Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu 195 200 205 Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp 210 215 220 Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala 225 230 235 240 Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr 245 250 255 Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr 260 265 270 Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val 275 280 285 Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr 290 295 300 Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His 305 310 315 320 Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Ile Phe Leu Asp Arg His Pro Ile Ala 325 330 335 Phe Met Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr 340 345 350 Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro 355 360 365 Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg His Ile Asp 370 375 380 Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met 385 390 395 400 Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg 405 410 415 Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser 420 425 430 Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly 435 440 445 Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro 450 455 460 Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala 465 470 475 480 Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg Pro Met His Val Phe Ile Leu 485 490 495 Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu 500 505 510 Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro 515 520 525 Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala 530 535 540 Asn 545 <210> 6 <211> 303 <212> DNA <213> Adenovirus <220> <221> CDS <222> (1)..(303) <400> 6 atg acc ggc tca acc atc gcg ccc aca acg gac tat cgc aac acc act 48 Met Thr Gly Ser Thr Ile Ala Pro Thr Thr Asp Tyr Arg Asn Thr Thr 1 5 10 15 gct acc gga cta aca tct gcc cta aat tta ccc caa gtt cat gcc ttt 96 Ala Thr Gly Leu Thr Ser Ala Leu Asn Leu Pro Gln Val His Ala Phe 20 25 30 gtc aat gac tgg gcg agc ttg gac atg tgg tgg ttt tcc ata gcg ctt 144 Val Asn Asp Trp Ala Ser Leu Asp Met Trp Trp Phe Ser Ile Ala Leu 35 40 45 atg ttt gtt tgc ctt att att atg tgg ctt att tgt tgc cta aag cgc 192 Met Phe Val Cys Leu Ile Ile Met Trp Leu Ile Cys Cys Leu Lys Arg 50 55 60 aga cgc gcc aga ccc ccc atc tat agg cct atc att gtg ctc aac cca 240 Arg Arg Ala Arg Pro Pro Ile Tyr Arg Pro Ile Ile Val Leu Asn Pro 65 70 75 80 cac aat gaa aaa att cat aga ttg gac ggt ctg aaa cca tgt tct ctt 288 His Asn Glu Lys Ile His Arg Leu Asp Gly Leu Lys Pro Cys Ser Leu 85 90 95 ctt tta cag tat gat 303 Leu Leu Gln Tyr Asp 100 <210> 7 <211> 101 <212> PRT <213> Adenovirus <400> 7 Met Thr Gly Ser Thr Ile Ala Pro Thr Thr Asp Tyr Arg Asn Thr Thr 1 5 10 15 Ala Thr Gly Leu Thr Ser Ala Leu Asn Leu Pro Gln Val His Ala Phe 20 25 30 Val Asn Asp Trp Ala Ser Leu Asp Met Trp Trp Phe Ser Ile Ala Leu 35 40 45 Met Phe Val Cys Leu Ile Ile Met Trp Leu Ile Cys Cys Leu Lys Arg 50 55 60 Arg Arg Ala Arg Pro Pro Ile Tyr Arg Pro Ile Ile Val Leu Asn Pro 65 70 75 80 His Asn Glu Lys Ile His Arg Leu Asp Gly Leu Lys Pro Cys Ser Leu 85 90 95 Leu Leu Gln Tyr Asp 100 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 8 gatcggatcc ctcgagatcc tagcatggct tcgtaccccg gc 42 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 9 gatcgaattc ttccgtgttt cagttagcct c 31 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 10 gatcctcgag ccaccatggt gacaggggga atg 33 <210> 11 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 11 gatcgctagc acctccccca ccgcctctcc ctccaccctc accaatatct tc 52 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 12 gatcggatcc cctgctccag agatgaccgg c 31 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 13 gatcaagctt ggaatcatgt ctcamaatc 29 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 14 gatcatttaa ataattccct ggcattatgc ccagta 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Primer <400> 15 gatcttaatt aatcgatgct agacgatcca gacatg 36

Claims (26)

  1. 효모 시토신 디아미나아제 및 돌연변이체 SR39 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 타입 1 티미딘 키나아제 융합 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열번호: 4의 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제 1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하며, 전구약물, 5 플루오로시토신 및 간시클로비어를 활성 화학치료제로 전환하는 단리된 폴리펩타이드.
  3. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  4. 제 1항의 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호: 6의 아데노바이러스 타입 5 아데노바이러스 사멸 단백질 유전자를 포함함을 특징으로 하는, 서열번호: 1의 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제 4항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 3항 또는 제 5항에 따른 재조합 아데노바이러스, 및 약학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 악성종양 치료용 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 11항에 있어서, 약학 조성물이 종양 부위에 국부적으로 투여됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 제 11항에 있어서, 약학 조성물이 종양에 직접 주입하여 투여됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  17. 제 11항에 있어서, 약학 조성물이 정맥내 주입에 의해 투여됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  18. 제 11항에 있어서, 약학 조성물이 2회 이상 별도로 투여됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 11항에 있어서, 약학 조성물이 (a) 5-플루오로시토신, (b) 간시클로비어, (c) 5-플루오로시토신 및 간시클로비어, 및 (iv) 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제 2 약학 조성물을 추가로 포함하되, 약학 조성물이 투여된 후에 제 2 약학 조성물이 투여됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 약학 조성물 및 제 2 약학 조성물이 투여된 후에 방사선 요법 치료가 후속됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  25. 삭제
  26. 제 2항에 따른 폴리펩타이드를 5 플루오로시토신 또는 간시클로비어와 접촉시키는 것을 포함하는 5 플루오로시토신 또는 간시클로비어를 활성 화학치료제로 전환시키는 방법.
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