CN1294269C - 特异杀伤原发肝癌细胞的腺病毒载体及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明“特异杀伤原发肝癌细胞的腺病毒载体及使用方法”，提供了基于病毒疗法的治疗表达甲胎蛋白的原发肝癌的方法和组合物。本发明构建了两种基因工程重组腺病毒，其中含有甲胎蛋白启动子和隔离子基因。研究表明，带有甲胎蛋白的腺病毒可特异性的在肿瘤细胞内复制，隔离子可以提高重组腺病毒在表达甲胎蛋白的原发肝癌细胞的复制的特异性。试验结果表明，此两个重组腺病毒可用于原发肝癌的病毒治疗及基因治疗。

Description

特异杀伤原发肝癌细胞的腺病毒载体及使用方法

发明领域：

本发明涉及基因治疗及病毒治疗领域，具体的涉及到利用肿瘤特异性启动子控制病毒载体特异性的在表达甲胎蛋白的肝癌细胞中特异复制与表达，从而杀死肝癌细胞的技术。

发明背景：

恶性肿瘤的基因治疗，要求病毒载体可以高效的特异性的进入肿瘤细胞，表达治疗性基因，或特异性的在肿瘤细胞内复制，进而杀死肿瘤细胞。

目前作为基因治疗的常见载体有逆转录病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒载体，其中作为肿瘤基因治疗较为常用的是腺病毒载体。

腺病毒是一种双链DNA病毒，其基因组长度约为36kb，分为早期转录区和晚期转录区。目前发现，人腺病毒有47个血清型，分属A-F6个亚属，其中C亚属的5型腺病毒是目前人们研究最为详细的一种。

将腺病毒删除E1区及E3区所得到的腺病毒载体常被称为第一代腺病毒载体，这种载体可插入并表达长度为8kb以内的外源基因，这种腺病毒载体本身不能复制产生子代病毒，腺病毒载体DNA也不整合入宿主细胞的基因组中。

腺病毒载体可感染多种类型细胞，包括静止期细胞。腺病毒载体可以较容易的大规模培养并获得高滴度的病毒纯品。这些特点使得腺病毒作为常用的肿瘤基因治疗载体。

腺病毒作为肿瘤基因治疗的载体，提高其对肿瘤细胞的特异性是十分重要的。

近年来，肿瘤的基因治疗理论与实践发展很快，在采用基因治疗手段治疗肿瘤的各种方案中，让重组病毒特异性的在肿瘤细胞内复制与表达，从而杀死肿瘤细胞的所谓溶瘤病毒(Oncolytic Virus)方案，目前进展最快，其中的代表是美国Onyx公司开发的重组腺病毒Onyx-15，目前正在进行III期临床试验。

为了提高病毒载体杀伤肿瘤细胞的特异性，寻找肿瘤细胞与正常细胞的差异十分重要。

在国内外许多研究者均努力开发可在肝癌细胞中特异性复制表达的病毒载体，有人试图通过改造腺病毒基因组本身达到此目的(Lieber，A.et.al.)，有人试图通过修饰腺病毒的纤毛结构来达到此目的(Curiel，D.at.al.)，其中，以外源的肿瘤特异性启动子控制重组病毒特异性复制，是一种重要的技术手段。(Yu，D.C.et.al.)

原发肝癌细胞与正常肝细胞的一个重要区别是，超过70％的原发肝癌细胞表达甲胎蛋白，而正常肝细胞不表达，只有胎肝细胞才表达这一蛋白。这是癌细胞幼稚化的一种体现，在临床诊断中，甲胎蛋白检测是原发肝癌的重要普查方法。因此，是否表达甲胎蛋白是区别正常肝细胞和肝癌细胞的一个重要标记。如果将腺病毒中其自身启动子删除，置换成甲胎蛋白的启动子，这样，这种重组腺病毒将置于甲胎蛋白启动子控制之下，只有在表达甲胎蛋白的细胞环境中，因为具有该启动子的激活因子，所以启动子被激活，病毒基因组开始复制及表达。而在正常的肝细胞中，不存在这样的激活因子，病毒基因组将不能复制表达。这样就造成了对肝癌细胞的选择性杀伤。

目前，已有数个研究组采用甲胎蛋白启动子控制腺病毒，以期达到特异抗肝癌的作用。由于甲胎蛋白启动子的结构十分复杂，使用不同的部分，不同的结构会得出不同的结构，这就是为什麽很多研究组报道甲胎蛋白启动子的特异性不理想。

我们在这方面进行了大量的研究，使用了一种特殊结构的甲胎蛋白启动子，含有增强子(Enhancer)、静默子(Silencer)及启动子核心区(core promoter)等全部功能部件。

外源肿瘤特异性启动子可能遇到的问题是启动子的忠实性程度，即是否可以在异源基因组中保持同样的特异性。为了增强甲胎蛋白启动子的特异性，我们在重组腺病毒基因组中甲胎蛋白启动子基因序列之前插入了特殊的基因调控组件-隔离子(ioslator)，使其达到了很高的特异性。

对于肿瘤基因治疗载体，一方面要求其可以针对肿瘤细胞产生特异性；另一方面，也希望其具有抗肿瘤基因，置于肿瘤特异性启动子控制之下，特异性的在肿瘤细胞内表达，提高对肿瘤细胞的杀伤效果。同时，要求其在正常细胞中尽可能不复制，减低对正常细胞的杀伤。为达到这两个目的，将A5型腺病毒E1a基因结合入病毒基因组中将会产生一个理想的结果。

5型腺病毒E1a基因位于病毒基因组左端，具有有84％的保守性。E1a编码两个主要的蛋白，一个有243个氨基酸(12S，243R)，一个有289个氨基酸(13S，289R)。E1a-12S和E1a-13S蛋白通过激活病毒基因的表达促使病毒复制。(Shenk，T.1996.Adenoviridea，P.2111-2148。)E1a-12S和E1a-13S蛋白是腺病毒最初表达的两个蛋白，具有激活腺病毒其它基因，特别是E2区和E4区基因的功能，而这两个区的功能是有关腺病毒的复制。

E1a直接活化细胞基因，诱导细胞DNA复制，与细胞周期调控蛋白质pRb，pRb相关蛋白(P107/P130)或P300相互作用。

E1a与pRb家族蛋白分子的结合，释放出E2F家族的转录因子，造成宿主细胞中一些有关DNA合成的基因被正向调控，使静止期细胞进入S期。这些和一些其它在S期激活的细胞因子，产生了一个适合病毒DNA合成的环境。在正常细胞中，E1a诱导细胞周期负调控造成P53蛋白的累积，刺激P53介导G1期细胞停滞(el-Deiry，W.S.et.al.，1993.Cell.75：817-25；Xiong，Y.et.al.1993.Nature，366：701-4)或进入细胞凋亡途径。另外，E1a诱导的调亡也能通过不依据P53途径发生。(Teodoro，J.G.et.al.1995.Oncogene.11：467-74)

E1a基因过去曾被认为是一个癌基因，可使动物胚胎细胞发生永生化，并可与其他病毒或细胞的癌基因相互作用。

在动物实验中，E1a并不能单独诱发癌变，而需与E1b等其它基因共同起作用。5型腺病毒本身没有致癌性，其它型有致癌性的腺病毒与其单独的E1a基因没有必然的联系。近十年来，很多实验证实，5型腺病毒E1a基因不但对人体细胞没有致癌性，而且实际上可以有抑制肿瘤生长的作用。E1a的肿瘤抑制作用可能与E1a对多种基因的调控有关。主要表现在以下几个方面：

①neu基因过度表达与人体恶性肿瘤特别是头颈口腔鳞癌密切相关，也与肿瘤的预后及耐药性相关。而有证据显示，E1a基因在转录水平可以特异性的抑制neu基因的表达，可以抑制如粘附、侵袭等与肿瘤转移相关的特性，E1a基因也能抑制癌基因诱导的包括细胞多形性等在内的癌变特性，也可提高高表达neu基因的乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性(YuDH，et.al.Molecular basis of oncology.1995：131-162；UenoNT，et.al.Proc AACR，1998，39：360(Abstract))

②E1a通过提高细胞P53水平诱导细胞凋亡，产生抗肿瘤作用。

③E1a可以提高细胞对5-氟尿嘧啶、顺铂等化疗药及辐射所诱导的细胞凋亡的敏感性。

④E1a可在宿主细胞表面表达，提高机体对细胞表达E1a基因的细胞的杀伤、清除，达到抗肿瘤效果。

作为肿瘤基因治疗，现有问题是提高其特异性地在肿瘤细胞中的表达，甲胎蛋白启动子控制下的重组腺病毒载体具有这一特征，而E1a基因作为抗肿瘤基因近年来已运用于临床试验中。本发明人经过研究试验，将5型腺病毒E1区启动子删除，代之以甲胎蛋白启动子，为研究甲胎蛋白启动子及隔离子的肿瘤特异性，并在甲胎蛋白启动子基因后面连接报告基因碱性磷酸酶基因，构建出一种新的肿瘤基因治疗腺病毒载体M001，在M001重组腺病毒基因中甲胎蛋白启动子基因之前插入隔离子，构建出另一种重组病毒M002。为进行实际应用，将以上两个重组腺病毒载体中的碱性磷酸酶基因去处，代之以腺病毒E1a基因，形成两个肿瘤特异性病毒载体A001及A002，目的是提供一种腺病毒载体可以特异性的在肝癌细胞中复制，表达E1a基因，从而特异高效的杀死肝癌细胞。

本发明中所构建的重组病毒M002已经送交中国典型培养物保藏中心保藏，地址为中国武汉，武汉大学内。保藏日期是2001年10月28日，保藏编号是V200114，分类命名是腺病毒。

本发明还提供了含有此肿瘤特异性载体病毒及可药用载体的药物组合物。

本发明还提供了此肿瘤特异性载体在制备用于治疗肿瘤药物组合物中的用途。

附图说明：

图1.M001及M002重组腺病毒基因结构，其中AFP是甲胎蛋白启动子，AP是碱性磷酸酶基因，pA是多聚腺苷，HS4是隔离子。

图2.A001及A002重组腺病毒基因结构，其中AFP是甲胎蛋白启动子，AP是碱性磷酸酶基因，pA是多聚腺苷，HS4是隔离子。

图3.M001及M002重组腺病毒细胞特异性试验，其中M1是M001病毒，M2是M002病毒，Hep3B为人肝癌细胞系HepG2为人肝癌细胞系，HuH7为人肝癌细胞系，BT549为人乳腺癌细胞系，Fibroblast为人成纤维细胞，Humhep为人肝细胞系，MCF-7为人乳腺癌细胞系，LS174T为人结肠癌细胞系，HeLa为人官颈癌细胞系。

发明概述

本发明涉及一种重组腺病毒载体，其由删除了E1和/或E3区基因的腺病毒载体构建而来，E1区启动子被置换成重组的人甲胎蛋白启动子，并具有在该甲胎蛋白启动子控制下的插入基因，并且该甲胎蛋白启动子序列包含2次重复的增强子，6至8次重复的静默子，以及启动子核心区；本发明的重组腺病毒载体的特征在于，在所述甲胎蛋白启动子序列的左侧具有隔离子序列。

所述甲胎蛋白启动子序列优选包含2次重复的增强子，6次重复的静默子，以及启动子核心区。

本发明的重组腺病毒载体优选由以下几种组件从左至右依次组成：

a.一段腺病毒左侧倒置末端重复序列；b.一段腺病毒包装序列，位于所述左侧倒置末端重复序列的3′端；c.一段隔离子序列，位于所述腺病毒包装序列的3′端；d.一段重组的人甲胎蛋白启动子序列，位于所述隔离子序列的3′端；e.一段插入基因序列，其被置于所述甲胎蛋白启动子控制之下，位于所述甲胎蛋白启动子的3端′；f.一个或多个腺病毒基因，位于所述插入基因的3′端；g.腺病毒右侧倒置末端重复序列，位于所述腺病毒基因的3′端。

本发明的重组腺病毒载体中的隔离子序列优选是一段由鸡基因中得来的序列，即隔离子HS4。本发明的重组腺病毒载体中的插入基因序列可表达一个或多个基因产物。所述插入基因优选是细胞凋亡基因或细胞裂解基因、碱性磷酸酶基因、腺病毒E1a基因或自杀基因等。

本发明还提供一种使基因在肝癌细胞中特异性表达的方法，该方法包括在活体外在感染条件下，将权利要求1-10中的任意一种腺病毒载体与含有肝癌细胞的细胞群体接触，因此产生一种感染的细胞群体。

发明详述：

本发明中所构建的重组腺病毒载体是经过改造的5型腺病毒。5型腺病毒的基因组含有35935个核苷酸。5型腺病毒是目前研究的最为清楚的一种病毒。流行病学上主要引起人的呼吸道感染，有明显的自愈性。腺病毒作为疫苗应用于人体已有几十年的历史，从未发现有转化人正常细胞及致癌现象发生。

本发明所构建的重组腺病毒载体如图1中所使示的M001和M002。在M001中，腺病毒载体E1a的启动子区被删除，加入甲胎蛋白启动子(AFP Promoter)控制整个腺病毒载体的复制。甲胎蛋白启动子下游是一个报告基因碱性磷酸酶基因(AP)。将M001重组腺病毒基因组中甲胎蛋白启动子序列前插入隔离子HS4，形成重组腺病毒M002，用以研究甲胎蛋白启动子及隔离子的肝癌特异性。为进行实际药效学研究及临床应用，将以上两个重组腺病毒载体中的碱性磷酸酶基因去处，代之以腺病毒E1a基因，形成两个肿瘤特异性病毒载体A001及A002，目的是提供一种腺病毒载体可以特异性的在肝癌细胞中复制，表达E1a基因，从而特异高效的杀死肝癌细胞。

甲胎蛋白启动子结构复杂，序列长达8kb。使用不同部分，其肝癌特异性有很大差别。本项目采用基因工程方法对人甲胎蛋白启动子结构进行优化，具体讲，采用两次重复的增强子(Enhancer)，六次重复的静默子(Silencer)，及甲胎蛋白启动子核心区，共同组成一个全新的，紧凑的，高效的甲胎蛋白启动子，将5型腺病毒基因组置于这个启动子控制之下，并结合隔离子(Isolator)等调控组件，组成一个可以特异性在肝癌细胞中复制表达的重组腺病毒。

本发明的优点：

本发明解决了肝癌基因治疗领域中的两个问题：

(1)如何在肝癌细胞内特异性的表达基因，通过使用甲胎蛋白启动子控制的重组腺病毒载体，可以在肿瘤细胞内特异性表达外源基因，如果特异表达的是一些细胞毒性外源基因或与细胞凋亡有关的外源基因，将对肝癌的治疗提供一种有效的手段。采用不同靶向的肿瘤特异性启动子，就可以针对不同肿瘤进行特异性的治疗。

(2)如何提高肝癌基因治疗载体的肿瘤特异性。目前的肿瘤基因治疗载体普通存在特异性差的问题。本发明中所使用的重组腺病毒载体，利用插入隔离子的设计，提高病毒载体在肿瘤细胞内的复制及表达的特异性。

                       定义

除非另有不同定义，在此使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域中一般技术人员通常所理解的一样。尽管任何与在此描述的相似或相同的任何方法和材料都可用于本发明的实施或试验。在此仅对优选的方法和材料予以描述。为本发明现就以下术语予以定义：

在此使用的“外源基因”这一术语指插入本发明中所用腺病毒载体中的编码任何感兴趣的蛋白的DNA序列。插入外源基因长度的上限取决于腺病毒载体的包装限度。插入的外源基因可编码任何研究所需的蛋白，可以具有药用或其它特征。外源基因可用常规方法制备得来，如合成，及由天然来源提取、克隆等得来。

在此使用的“肝癌特异性基因表达”和“肝癌特异性”这两个术语是指腺病毒载体在肝癌细胞中的表达。虽然此载体在正常细胞中也会有表达，但表达水平很低，使得载体复制和包装无法有效进行，以至于可以将这样低的复制包装水平忽略不计。

在此使用的“第一代腺病毒载体”或“第一代重组腺病毒载体”这一术语是指任何腺病毒载体，删除了E1和/或E3区基因，致使腺病毒载体不能复制。

实施例I重组腺病毒M001和M002的构建

1.M001病毒的构建

以下描述了M001、M002两个重组腺病毒的构建。它们都是带有甲胎蛋白启动子的5型腺病毒载体，其中M002重组腺病毒还含有隔离子HS4基因，而M001不含有HS4基因。

除非另外说明，本发明所采用的技术，均是本领域常规技术，如分子克隆技术、微生物学技术、细胞生物学技术，这些技术在文献中均有充分解释。如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》第二版(1989)等。

质粒载体的构建：

用EcoRI和NsiI内切酶切割质粒pLAPSN，回收含有AP基因的DNA片段。用SalI和AflII内切酶切割质粒pXZAFP，回收大片段。

用AvrII和BlpI切割质粒pAd.BG，回收大片段。分别将AP基因和AFP启动子基因与该片段连接，构成质粒pM001。采用磷酸钙沉淀法将质粒pM001与质粒pBHG10共转染293细胞，将细胞表面铺0.5％琼脂，内含1XMEM，7％胎牛血清，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，约9天后，培养皿琼脂层下细胞出现噬斑，挑取噬斑，进行扩增，提取重组腺病毒DNA，进行DNA酶切分析，确定正确的重组腺病毒毒株。

2.M002病毒的构建

M002重组腺病毒的构建方法是将HS4基因插入pM001质粒中AFP启动子序列5’端，形成质粒pM002，然后与质粒pBHG10共转染293细胞，将细胞表面铺0.5％琼脂，内含1XMEM，7％胎牛血清，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，约9天后，培养皿琼脂层下细胞出现噬斑，挑取噬斑，进行扩增，提取重组腺病毒DNA，进行DNA酶切分析，确定正确的重组腺病毒毒株。

            实施例2

A001重组病毒和A002重组病毒的构建

用点突变的方法在pXC1质粒E1a基因前构建出一个AgeI酶切位点，用AgeI和HpaI限制性内切酶将E1a基因切割下来，回收基因片段。

将pM001及pM002质粒中的碱性磷酸酶基因切除，代之以E1a基因。分别构成质粒pA001和pA002，将质粒pA001和pA002分别与质粒pBHG10共转染293细胞，将细胞表面铺0.5％琼脂，内含1XMEM，7％胎牛血清，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，约9天后，培养皿琼脂层下细胞出现噬斑，挑取噬斑，进行扩增，提取重组腺病毒DNA，进行DNA酶切分析，确定正确的重组腺病毒毒株A001和A002。

                  实施例3

M001和M002重组病毒在肝癌细胞中的特异性复制与表达

M001及M002重组腺病毒培养于293细胞内，培养条件为DMEM培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂。用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒，35000rpm两次离心纯化病毒，最后将病毒稀配于含有1mM MgCl₂，10mM Tris，pH7.5，10％甘油的溶液中。

将M001病毒，M002病毒载体和野生型腺病毒以感染系数(MOI＝100)感染HepG2细胞(人肝癌细胞)，Hep3B细胞(人肝癌细胞)，LOVO细胞(人大肠癌细胞株)，HeLa细胞(人官颈癌细胞株)，293细胞(5型腺病毒转化的入胚胎肾细胞，支持非复制型腺病毒载体复制)，BT549(人乳腺癌细胞)，人成纤维细胞，人正常肝细胞系HumHep，MCF-7(人乳腺癌细胞)和LS174T(人结肠癌细胞)。以上细胞分别培养于96孔板中，培养条件是DMEM培养基，10％胎牛血清，37℃，5％CO₂。48小时后，将细胞裂解，进行碱性磷酸酶活性检测，结果见图3。从图3中可见，对于表达甲胎蛋白的HepG2细胞，Hep3B细胞HuH7细胞，M001病毒和M002病毒显示了极高的特异性，其中M002病毒的特异性更高。在不表达甲胎蛋白的其他肿瘤细胞及正常细胞中，两个病毒基本没有表达报告基因。

尽管本发明为了便于明确理解而通过举例方式在某些方面做了详细描述，但显然在权利要求的范围内进行一定的变化和修饰是可行的。

Claims (11)

1.一种重组腺病毒载体，其由删除了E1和/或E3区基因的腺病毒载体构建而来，E1区启动子被置换成重组的人甲胎蛋白启动子，并具有在所述甲胎蛋白启动子控制下的插入基因，并且所述甲胎蛋白启动子序列包含2次重复的增强子，6至8次重复的静默子，以及启动子核心区；其特征在于，在所述甲胎蛋白启动子序列的左侧具有隔离子序列。

2.权利要求1中所述的腺病毒载体，其中所述甲胎蛋白启动子序列包含2次重复的增强子，6次重复的静默子，以及启动子核心区。

3.权利要求2中所述腺病毒载体，由以下几种组件从左至右依次组成：

a.一段腺病毒左侧倒置末端重复序列；

b.一段腺病毒包装序列，位于所述左侧倒置末端重复序列的3′端；

c.一段隔离子序列，位于所述腺病毒包装序列的3′端；

d.一段重组的人甲胎蛋白启动子序列，位于所述隔离子序列的3′端；

e.一段插入基因序列，其被置于所述甲胎蛋白启动子控制之下，位于所述甲胎蛋白启动子的3端′；

f.一个或多个腺病毒基因，位于所述插入基因的3′端；

g.腺病毒右侧倒置末端重复序列，位于所述腺病毒基因的3′端。

4.权利要求1-3中任意一项所述的腺病毒载体，其中所述的隔离子序列是由鸡基因中得来的隔离子HS4。

5.权利要求4中所述的腺病毒载体，其是中国典型培养物保藏中心保藏编号为V200114的腺病毒载体。

6.权利要求1-3中任意一项所述的腺病毒载体，其中所述的插入基因序列表达一个或多个基因产物。

7.权利要求1-3中任意一项所述的腺病毒载体，其中所述插入基因是细胞凋亡基因或细胞裂解基因。

8.权利要求1-3中任意一项所述的腺病毒载体，其中所述插入基因是碱性磷酸酶基因。

9.权利要求1-3中任意一项所述的腺病毒载体，其中所述的插入基因是腺病毒E1a基因。

10.权利要求1-3中任意一项所述的腺病毒载体，其中所述的插入基因是自杀基因。

11.一种使基因在肝癌细胞中特异性表达的方法，该方法包括在活体外在感染条件下，将权利要求1-10中的任意一种腺病毒载体与含有肝癌细胞的细胞群体接触，因此产生一种感染的细胞群体。

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