HU202922B - Process for producing new limphotoxin-polypeptides - Google Patents

Process for producing new limphotoxin-polypeptides Download PDF

Info

Publication number
HU202922B
HU202922B HU872813A HU281387A HU202922B HU 202922 B HU202922 B HU 202922B HU 872813 A HU872813 A HU 872813A HU 281387 A HU281387 A HU 281387A HU 202922 B HU202922 B HU 202922B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
new
shoot
lymphotoxin
leu
thr
Prior art date
Application number
HU872813A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44609A (en
Inventor
Klaus Schollmeier
Achim Moeller
Wolfgang Koerwer
Thomas Doerper
Original Assignee
Basf Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Ag filed Critical Basf Ag
Publication of HUT44609A publication Critical patent/HUT44609A/hu
Publication of HU202922B publication Critical patent/HU202922B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/143—Lymphotoxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/144—Tumor necrosis factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás limfotoxin-aktivitással vagy limfotoxin-szerű aktivitással rendelkező új polipeptidek előállítására.
A limfotoxint (amelyet béta-TNF-nek is neveznek) 1968-ban írták le először [Ruddle and Waksman, J. exp. Med. 128, 1267-1279 (1968); Grainger und Kolb, J. Immun. 101, 111-120 (1968); Rosenau, W. Fed. Proc. 27, 34-38 (1968)]. A limfotoxin, mint mitogén stimulált limfocitákból származó biológiai faktor daganatos (neoplazmás) sejtvonalakra citotoxikus hatású. Hatásspektruma kiterjed például néhány tumor-sejtvonal osztódásának gátlására (Cytostase), és jelentős citolitikus hatása van más transzformált sejtekre [Sawada and Osawa; Jap. J. Exp. Med. 46,263-267 (1976); Granger et al., J. Cell. Immun. 38, 488-402 (1978); Rundell and Evans, Immunpharmacology 3, 9-18 (1981); Granger et al., J. Lymphokine Rés. 1, 45-49 (1982); Ruddle et al., J. Lymphokine Rés. 2, 23-31 (1983)].
Primer sejttenyészetekre és normális sejtvonalakra a limfotoxin citotoxikus hatása gyengébb vagy nincs ilyen hatása. Ezek az észleletek in vivő vizsgálatokhoz vezettek [Khan et al., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 169, 291-294 (1982); Papermaster et al., Cancer 45, 12481253 (1980); Ransom et al., J. Natn. Cancer Inst. 69, 741-744 (1982)], amelyek eredményei azután azt mutatták, hogy a limfotoxin hatásos daganatellenes szer.
A humán limfotoxin aminosavszekvenciáját [Gray et al., Natúré 312, 721-724 (1984)] az 1. ábrán láthatjuk. A limfotoxin szignálszekvenciáját -34-től -1-ig terjedő számozással jelöljük.
A humán limfotoxin (béta-TNF) a limfotoxinok egyik olyan csoportjához tartozik, amelyhez a tumor nekrózis faktor (TNF vagy alfa-TNF) is tartozik. A két proteinnek nemcsak hasonló in vitro és in vivő hatásspektruma van, hanem gammainterferonnal is szinergikusan hatnak [Ruddle et al., Lymphokine Rés. 2, 2331 (1983); Granger et al., Lymphokine Rés. 1, 45-49 (1982); Ruff and Giffort, Lymphokines Vol. 2, Pick. E. ed. 235-275, Acadenic Press New York (1981); Carswell et al., Pross. Natl. Acad. Sci. 72, 3666-3670 (1975); Evans, Canc. Immunoi. Immunothre. 12, 181— 190 (1982); Rundell and Evans, Immunopharmacology 3, 9-18 (1981); Ruff and Giffort, Infect. Immun. 31, 380-385 (1981); Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 5397-5401 (1983); Williams and Bellanti, J. Immunoi. 130, 518-520 (1983); Stone-Wolff et al., J. Exp. Med. 159, 828-843 (1984); Lee et al., J. Immunoi. 133, 1083-1086 (1984); Powell et al., Lymphokine Rés. 4, 13-26 (1985)].
A két protein génjei a 6-os kromoszómán egymás szomszédságában helyezkednek el [Nedwin et al., Nucl. Acid. Rés. 13, 17; 6361-6373 (1985)].
A két protein aminosavainak összehasonlítása azt mutatja, hogy az aminosavegységekre nézve 30% homológia áll fenn (2. ábra). A homológia a két protein középső és C-terminális részére összpontosul, míg az N-terminális rész heterológ és eltérő hosszúságú (2. ábra).
Ismeretes továbbá egy olyan limfotoxin-mutáns, amely N- terminális részén a természetes limfotoxintól abban tér el, hogy az első 23 aminosav hiányzik belőle.
Felfedeztük, hogy azok a polipeptidek, amelyek a limfotoxin 25-171 és 26-171 aminosavszekvenciájából állnak, és az N-terminális végen még egy metionilvagy alanil-csoportot tartalmaznak, előnyösebb tulajdonságokkal rendelkeznek.
Új peptidek úgy állíthatók elő, hogy
a) elkülönítjük az mRNS-t egy limfotoxint termelő sejtvonalból,
b) ezt az mRNS-t átmásoljuk a megfelelő kétszálas cDNS-sé,
c) ezt a cDNS-t inszertáljuk E.coli vektorokba,
d) az így kapott új vektorokkal E.colit transzformálunk,
e) a limfotoxin cDNS kiónokat génszondák és hibridizálás segítségével szelektáljuk és jellemezzük,
f) a limfotoxin gént tartalmazó vektorokat szaporítjuk, és elkülönítjük,
g) a gént vagy a génfragmenseket restrikciós endonukleázok segítségével elkülönítjük,
h) a megfelelő oligonukleotidokat tartalmazó gént vagy génfragmenseket expressziós vektorokba inszertáljuk,
i) adott esetben a gént 5’-végéhez kiegészítő DNSszekvenciákat inszertálunk,
j) az ilyen expressziós vektorokkal E. colit transzformálunk, és
k) a kívánt génterméket kifejezzük, elkülönítjük, és megtisztítjuk.
A megfelelő cDNS elkülönítése céljából az RPMI
1788 limfoblasztoid-sejtvonalat (ATCC Nr. CCL 156) a leírtak szerint [Aggarwal et al., J. Bioi. Chem. 259, 686-691 (1984)] tenyésztjük, stimulálás után elkülönítjük az mRNS-t, és ismert eljárások szerint cDNS-re lefordítjuk.
A cDNS-klón a 3. ábrán megadott szekvenciájú. Ennek a szekveciának azokat a részeit használjuk a példákban közelebbről leírt új limfotoxinszertf polipeptidek klónozásához, amelyek restrikciós felismerési helyeken végzett enzimes hasítással könnyen hozzáférhetők. A génffagmensek klónozó vektorokba, például a hozzáférhető pUC18 és pUC19 plazmidokba [Gene, 19, 259 (1982) és 33, 103 (1985)] való beépítése a szakirodalomban leírt módszerekkel (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) történik. A gének vagy génffagmensek alkalmas, kémiailag szintetizálható olyan kontrollszakaszokkal is elláthatók, amelyek lehetővé teszik a proteinek kifejezését. Az így kapott hibridplazmidok alkalmas gazdaszervezetekben, például E. coli-ba való transzformációja szintén ismert és behatóan leírt [Maniatis etal; loc. cit. 250. és 251. old.]. A hibridplazmidok megfelelő szignálszekvenciákkal is elláthatók, amelyek a polipeptideknek E. coli periplazmájában való kiválasztását lehetővé teszik. Ezek az így nyert proteinek azután N-terminális végükön a kiválasztás után metionint nem tartalmaznak, viszont van legtöbbször még egy, a hasítási hely szempontjából fontos amino-21
HU 202 922 Β savuk, például alanin [Nucl. Acid. Rés. 8, 3011-3027 (1980)].
A genetikai kód degenerációja alapján az is lehetséges, hogy az új polipeptidek kifejezésére más DNSszekvenciákat, például eltérő DNS-szekvenciájú kémiailag szintetizált géneket használjunk.
Az új peptidek a daganatos megbetegedéseknél, immunbetegségeknél vagy gyulladásos megbetegedéseknél, például reumánál vagy poliartritisnél használhatók.
Az új pepetidek hatása limfokinek, például alfaTNF és különösen alfa-interferon, béta-interferon és gamma-interferon, valamint kancerosztatikumok hozzáadásával hiperadditív módon fokozhatok. Kancerosztatikumokként különösen a következők jönnek számításba:
a) antibiotikumok, például aktinomicin-D, doxorubicin (adriamicin), daunorubicin, mitramicin és bleomicin, valamint más interchalatorikus - azaz a kétszálú DNS-be vagy RNS-be két szomszédos dózispár közé beépülő - hatású anyagok, például amonafid és mitonafid,
b) alkaloidok, például vinkrisztin, vinblasztin, vindezin, etopozid és tenipozid,
c) alkilező hatású anyagok, például ciklofoszfamid, nitrozó- karbamid és ciszplatin, és
d) antimetabolitok, például metotrexat, 5-fluor-uracil és analógjai, 6-merkapto-purin, 6-tioguanin és citarabin.
A találmány tárgyát képezik ezért az új peptidek limfokinokkal, például alfa-TNF-fel és különösen gammainterferonnal készített kombinációi. A találmány tárgyát képezik olyan gyógyszerkészítmények is, amelyek legalább egy új polipeptidet tartalmaznak, adott esetben valamilyen gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval vagy kötőanyaggal kombinálva. Továbbá szintén a találmány tárgyát képezik az új proteinek már ismert limfokinokkal vagy limfokin-mutánsokkal (például gamma- interferonnal, TNF-fel) készített kombinációit tartalmazó gyógyszerkészítmények.
A találmány további megvalósításait a következő példákban részletesen leírjuk. Az összehasonlítási anyagként használt limfotoxint a limfotoxin-mutánsokhoz hasonló módon E. coli-ban klónozzuk, kifejezzük és a leírtak szerint tisztítjuk.
Példák
1. A cDNS előállítása.
A limfotoxint (béta-TNF) termelő RPMI-1788 sejtvonal tenyésztése.
Az ATCC-től kapott (No. CCL 156) RPMI-1788 haematopoietikus sejtvonalat Spinner palackban 20% borjú magzatszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban (Sigma Chemie. GmbH, Deisenhofen, NSZK, R788O) 37 ’C-on és 5% szándioxidot tartalmazó atmoszférában tenyésztjük. A táptalajt 7-8· 105 sejt/ml sejtsűrűség elérése után 5% borjú magzatszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajra cseréljük, és az előzetesen meghatározott 150 nmól optimális koncentrációnak megfelelő PMA (4p-forbol- 12P-mirisztát-13aacetát) (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, NSZK, P8139sz.) tumorpromotort adunk hozzá. Maximális mennyiségű limfotoxin (700 egység/ml) 70 óra elteltével termelődik. A biológiai aktivitást az irodalomban leírtak [Aggarwal, B.B.; Moffat B. and Harkins, R.N.; J. Bioi. Chem. 259, 686-691,(1984)] szerint határozzuk meg. A fenti idő elteltével a sejteket összegyűjtjük, 2 ml PBS-sel (foszfátpuffer oldat) mossuk, és iizáló pufferban [6 mól guanidinium-fofanid, 5 mmól 7,0 pH-jú nátrium-citrát, 0,1 mól 2-merkapto-etanol, 0,5% szarkozil (N- lauril-szarkozin)] homogenizátor segítségével feltárjuk. Az RNS-t 5,7 mólos cézium-klorid „párnán” percenkénti 35000 fordulatnál éjszakán keresztül ülepítjük. A mRNS poliA+ tartalmú frakcióját oligo(dT)-cellulózon kétszeres affinitáskromatográfiával izoláljuk és tisztítjuk.
A poliA+ mRNS-t az AMV reverz transzkriptáz enzimmel egyszálas cDNS-be írjuk át. A másik szál szintézise szintén reverz transzkriptázzal történik. A kétszálas cDNS-t Sau 3A restrikciós endonukleázzal a gyártó (Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen, NSZK) adatai szerint hasítjuk és 1%-os agarózgélen frakcionáljuk. Az 1 kbp *0,5 kbp nagyságú DNS-fragmenseket kioldjuk a gélből és defoszforilált BamHI-linearizált E. coli pUC18 vektornál (Boehringer Mannheim, NSZK) ligáljuk. A DNS-t kompetens E. coli HB101 törzs sejtjeibe transzformáljuk (Maniatis et al., loc. cit. 250. és 251. old.) és 100'5 g/ml ampicillint tartalmazó LB-lemezeken szélesztjük. A baktériumokat nitro-cellulóz szűrőre visszük át, replikáljuk, lizáljuk, a DNS-t denaturáljuk, és szilárdan a szűrőre kötjük.
DNS-szintetizátor (Applied Biosystem, Typ 380A) segítségével a humán-limfotoxin közzétett DNS-szekvenciájához homológiával rendelkező három heptadekamer oligonukleotid szondát állítunk elő. Ezen szondák szekvenciája a következő:
5’ CCTCCTGCACCTGCTGC 3’
5’ TTGCTGGGGTCTCCAAT 3’
5’ GAGTGCAGCCAGGGTTC 3
Az oligonukleotid szondákat 5’-végen γ-32Ρ-ΑΤΡvel jelezzük, és a nitro-cellulóz szűrőt 1 mólos nátrium-klorid, 1 mmólos EDTA, 1%-os SDS (nátrium-dodecil-szulfát), 10%-os dextrán-szulfát oldatban 42 ’Con éjszakán keresztül rázatjuk a szondákkal. A szűrőt intenzíven mossuk 1 mólos nátrium-klorid, 1 mmólos EDTA, 1%-os SDS oldattal, utána a szűrőt filmre exponáljuk, és megállapítjuk a szekvencia homológiával rendelkező kiónokat. A homológ kiónokat elkülönítjük, és szétválasztjuk. A plazmid DNS-t elkülönítjük, és szekvenáljuk. Egy ilyen elkülönített klón a pLyt 15, amelynek szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be.
2. Olyan hibridplazmid előállítása, amely tartalmazza a 24-171 aminosavszekvenciával rendelkező öszszehasonlító anyag (delta 23 limfotoxin) részére a génfragmenst.
Kiindulási pont a pLyt 15 plazmid. Ez az Sau 3-val hasított limfotoxin cDNS-nek (lásd 3. ábra) a pUC18
HU 202 922 Β
BamHI felismerési helyére való inszerciójával keletkezik. A pLyt 15 plazmidot ismert módon a Bbvl/Accl valamint az Accl/Sall restrikciós endonukleázokkal az előállító (Boehringer Mannheim, NSZK) adatai szerint nyitjuk fel (3. és 4. ábra). Az emésztési elegyet .5%-os poliakrilamidgélen elektroforézissel ismert módon (Maniatis et al., loc. cit. 173-178 old.) szétválasztjuk, és a töredéket etidium-bromiddal végzett festéssel tesszük láthatóvá. A két szükséges Bbvl/Accl és Accl/Sall limfotoxin-génffagmenst ezután kivágjuk az akrilamid-gélből, és a mátrixtól elektroforetikusan elválasztjuk. A két fragmens 0,1 pmól mennyiségeit utána 0,1 pmól pUC18 EcoRl/Sall vektorral és a KS 23/24 szintetikus oligonukleotiddal éjszakán keresztül 15 ’C-on ligáljuk.
KS23: 5’ AATTCATGCATAGC 3’
KS24: 3’ GTACGTATCGTGGG 5’ így a 4. ábra szerinti pKS301 hibridplazmidot kapjuk.
3. Olyan hibridplazmid előállítása, amely tartalmazza a 25-171 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid (delta 24 limfotoxín) részére a génfragmenst.
Kiindulási pont a pLvt 15 plazmid. Ez a Sau 3A-val hasított limfotoxín cDNS-nek (lásd 3. ábra) a pUC18 BamHI felismerési helyére való inszertálásával keletkezik. A pLyt 15 plazmidot ismert módon a Bbvl/Accl valamint Accl/Sall restrikciós endonukleázokkal nyitjuk fel a gyártó adatai szerint (3. és 5. ábra). Az emésztési elegyet 5%-os poliakrilamidgélen ismert módon elektroforézissel választjuk szét. A töredékeket etidium- bromiddal végzett festéssel láthatóvá tesszük. A két szükséges Bbvl/Accl és Accl/Sall limfotoxin-génfragmenst utána kivágjuk az akrilamidgélből, és elektroforetikusan elválasztjuk a mátrixtól. Mindkét fragmens 0,1 pmólnyi mennyiségét azután 0,1 pmól pUC18 EcoRl/Sall vektorral és a KS 27/28 szintetikus oligonukleotiddal éjszakán keresztül 15 ’Con ligáljuk.
KS27: 5’ AATTCATGAGC 3’
KS28: 3’ GTACTCGTGGG 5’ így az 5. ábra szerinti pKS302 hibridplazmidot kapjuk.
4. Olyan hibridplazmidok előállítása, amelyek tartalmazzák a 26-171 aminosavszekvenciával rendelkező polipeptid (delta 25 limfotoxín) részére a génfragmenseket.
A hibridplazmid felépítése a 2, és 3. példában leírtak szerint történik az új KS29/30 oligonukleotidokkal.
KS29: 5’ AATTCATG 3’
KS30: 3’ GTACTGGG 5’ így a 2. és 3. példához hasonlóan az új KS303 hibridplazmidot (lásd 6. ábra) kapjuk.
5. A hibridplazmidok transzformációja.
Megfelelő E. coli, például W3110 (ATCC 27325) sejteket 0,1-0,1 pg pKS301, pKS302 és pKS303 hibridplazmiddal transzformálunk, és ampicillint tartalmazó agarlemezeket szélesztünk. Utána a kiónokat, amelyek helyesen integrált limfotoxin-részszekvenciákat tartalmaznak, plazmid- gyorsanalízissel azonosítjuk (Maniatis et al., loc. cit. 366. és 367. old.).
6. A limfotoxin-aktivitással rendelkező polipeptidek kifejezése.
A 2., 3. és 4. példákban kapott hibridplazmidokat önmagában ismert módon [Gene 27, 151 és 161 (1984); 15, 81 (1981)] egyetlen EcoRl hasítási helyükön szintetikusan előállított szignálszekvenciákkal (Pharmacia-LKB, Freiburg, NSZK) látjuk el a kifejezéshez. Ezeket az új expressziós plazmidokat E. coliba transzformáljuk. A termelősejtek tenyésztése normál teljes táptalajon [10 g/lit. pepton, 5 g/lit. élesztőkivonat, 10 g/lit. nátrium-klorid és 100 mg/lit. ampicillin] történik. A limfotoxín és a limfotoxmutánsok termelésére a következő táptalajt használjuk:
Élesztőkivonat, Difco 20 g/lit.
NZ Amin A, Sheffield 20 g/lit.
Dikálium-hidrogén-foszfát 4 g/lit.
Kálium-dihidrogén-foszfát 1 g/lit.
Ammónium-klorid 1 g/lit.
Kalcium-klorid-dihidrát 0,01 g/lit.
Mangán(II)-klorid-tetrahidrát 0,2 g/lit.
Kálium-szulfát 2,6 g/lit.
Magnézium-szulfát-heptahidrát 0,5 g/lit.
Etilén-diamin-tetraecetsav 0,05 g/lit.
Vas(III)-klorid-hexahidrát 0,005 g/lit.
Cink(II)-oxid 0,0005 g/lit.
Réz(II)-klorid-dihidrát 0,0001 g/lit.
Kobalt(II)-nitrát-hexahidrát 0,0001 g/lit.
Ammónium-molibdát-tetrahidrát 0,0001 g/lit.
+100 mg/lit. ampicillin pH-beállítás 7,0-re.
7. A limfotoxín összehasonlító anyag tisztítása és jellemzése.
136 g limfotoxin-termelő E.coli törzs (lásd 164 965 sz. európai szabadalmi leírást) nedves masszát, amelyet megfelelő limfotoxín- kifejező rázatott tenyészet centrifugálásával nyerünk, 800 ml 8,5 pH-jú 20 mmólos nátrium-foszfátpuffer, 400 mmólos arginin-HCl oldatban szuszpendálunk. A sejtszuszpenziót ultrahangos kezeléssel 4 ’C-on feltárjuk. A nukleinsavak lecsapása 20 ml 2 mólos mangán(II)-klorid oldattal történik a pH 12,5%-os ammónium- hidroxid oldattal 7,2-re való beállítása közben. Centrifugálás és a csapadék elválasztása után a felülúszóhoz keverés közben 4 ’C- on 390 g ammónium-szulfátot adunk. A proteincsapadékot centrifugálás és a felülúszó eldobása után 200 ml 20 mmólos 8,5 pH-jú nátrium-foszfát pufferral oldjuk, amely 0,1 mmól arginin.HCl- t tartalmaz, A pufferoldatot dializáljuk, utána egymás után ioncserés kromatografáljuk Q-Sepharose-on, S-Sepharose-on és Mono
HU 202 922 Β
Q-n (Fa. Pharmacia). Az így kapott limfotoxin-oldat ELISA- meghatározás szerint 0,01-0,05% közötti maradék E. coli proteint tartalmaz. Az N-terminális szekvenálás azt mutatja, hogy a következő limfotoxin-származékok keverékéről van szó:
1. Met-limfotoxin Met-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-LeuThr-Pro-Ser
2. delta 3-limfotoxin Val-Gly-Leu-Thr-Pro-Ser-AlaAla-Gln-Thr
3. delta 23-limfotoxin His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-AlaAla-His-Leu
8. A delta 23-limfotoxin összehasonlító anyag tisztítása és jellemzése.
Megfelelő rázatott tenyészetből (lásd 2. és 6. példa) származó 20 g centrifugált E. coli sejttömeget 200 ml 8,5 pH-jú 20 mmólos nátrium-foszfát pufferban szuszpendálunk, és 15 perces ultrahangkezelés után 4 ml 2 mólos mangán(H)-klorid oldattal elegyítve lecsapjuk a nukleinsavakat. Centrifulálás után a felülúszót híg ammónium-hidroxid oldattal 8,9 pH-ra lúgosítjuk, és 78 g ammónium-szulfáttal lecsapjuk a nyersproteint. A csapadékot centrifugálás után elkülönítjük, 100 ml 9,0 pH-jú 10 mmólos nátrium-foszfát pufferban oldjuk, és a pufferral szemben dializáljuk. Q-Sepharose-on és SSepharose-on (Fa. Pharmacia) végzett kromatográfiával homogén proteinoldatot kapunk, amely (SDS-gélelektroforézissel végzett analízis szerint) 99% feletti tisztaságú N-terminálisan metionint tartalmazó delta 23- limfotoxint tartalmaz. A protein N-terminális szekvenciája: Met- His-Ser-Thr-Leu-Lys-Pro-Ala-Ala-HisLeu-Ile.
9. A delta 24-limfotoxin tisztítása és jellemzése.
110 g megfelelő delta 24-limfotoxint termelő E. coli rázatott tenyészetből (lásd 3. és 6. példa) centrifugálás után nyert nedves biomasszát 1 liter pufferban (20 mmól nátrium-foszfát, 400 mmól arginin.HCl, pH 8,5) szuszpendálunk, és 4 ’C-on végzett ultrahangkezeléssel feltárjuk. A kapott szuszpenzióhoz a nukleinsavak lecsapására 20 ml 2 mólos mangán(II)-oldatot adunk. Az oldható proteinfrakciót 1,5 óra múlva centrifugálással nyerjük. Az oldat pH-ját híg ammónium-hidroxid oldattal 8,9-re állítjuk. A delta 24-limfotoxint 4 ’C-on keverés közben hozzáadott 390 g ammóniumszulfáttal (60%-os telítés) csapjuk ki. Az ammóniumszulfátos csapadékot 300 ml pufferban (20 mmól nátrium-foszfát, 0,1 mmól arginin.HCl, pH 10,5) oldjuk, és éjszakán keresztül dializáljuk 20 liter ugyanezen pufferral szemben. A dializált proteinoldatot anioncserélő-oszlopon (Q- Sepharose-ff, Fa. Pharmacia) kromatografáljuk. A proteint fínomtisztítás céljából egymás után CM-Sepharose-on (Fa. Pharmacia) és S-Sepharose-on kromatografáljuk. A protein tisztasága SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis szerint 99%-nál nagyobb. A protein N-terminális metionintől mentes. Az N- terminális szekvencia: Ser-Thr-Leu-Lys-ProAla-Ala-His-Leu-Ile.
10. A delta 25-limfotoxin tisztítása és jellemzése. Delta 25-limfotoxint termelő E.coli rázatott tenyészetből (lásd 4. és 6. példa) származó 176 g nedves biomasszát centrifugálás után 600 ml pufferral (20 mmól nátrium-foszfát, 400 mmól arginin, pH 8,5) szuszpendálunk. A sejtfeltárás 4 ’C-on ultrahangos kezeléssel történik. A nukleinsavak lecsapására a szuszpenziót 2 mólos mangán(II)-klorid oldattal 40 mmólos végkoncentrációra állítjuk be. Egyidejűleg az oldat pH-ját 12,5%-os ammónium- hidroxid oldattal 74-re állítjuk. Centrifugálás után a felülúszóhoz literenként 390 g ammónium-szulfátot adva 4 ’C-on kicsapjuk a delta 25-limfotoxint. A csapadékot 300 ml 104 pH-jú 20 mmólos nátrium-foszfát-pufferban oldjuk. A nem oldódó protein aggregátumok eltávolítása céljából a zavaros oldatot centrifugáljuk. A felülúszót 5 mmólos 8,5 pH-jú nátrium-foszfát pufferral szemben dializáljuk, és végül egy Q-Sepharose oszlopon (Fa.Pharmacia) kromatografáljuk. A delta 25-limfotoxint tartalmazó frakciót finomtisztítás céljából egymás után CMSepharose-on (Fa.Pharmacia) és Q-Sepharose-on (Fa.Pharmacia) kromatografáljuk. Az így kapott protein tisztasága SDS- poliakrilamidgél-elektroforézis szerint 99%-nál nagyobb. A protein a fermentációs körülményektől függően egyáltalán nem vagy csak kevés N-terminális metionint tartalmaz. Az N-terminális szekvencia a meghatározás szerint a következő:
Thr-Leu-Lys-Pro-Ala-Ala-His-Leu-Ile-Gly11. Humán rekombináns limfotoxin (LT) és a delta 23-, delta 24-, delta 25-limfotoxin (LT)-mutánsok in vitro citotoxikus aktivitása a TNF- és limfotoxin-szenzitív L929 sejtvonalak és WEHI-164 ellen.
5·103 frissen tripszinizált, exponenciális növekedési stádiumban lévő sejtet 96-lyukas lemezeken 125 μΐ komplett növesztő táptalajon (MÉM Earle sókkal + 10% brojú magzatszérum, Flow Laboratories, Meckenheim, FRC) szélesztünk, és éjszakán keresztül 37 ’C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó, vízgőzzel telített atmoszférában inkubáljuk. A tápanyaghozzáadás a következő napon történik tenyészetlyukanként 25 μΐ komplett tenyésztáptalajban. A startkoncentráció 10 ng protein milliliterenként; kettős sorozattitrálás egy kettősmeghatározással. Midenegyes tenyészetlappon a következő kontrollokat mellékeljük: a) csak táptalaj; b) sejtek táptalajjal, de limfotoxin nélkül; c) ismert biológiai aktivitású titrált TNF-standard. Az előbb megadott körülmények között végzett további 48 órás inkubálás után a túlélő sejteket kristályibolya-oldattal (15 g kristályibolya, 7 g nátrium-klorid, 646 ml etanol, 172,8 ml 37 %-os formaldehid oldat, vízzel 2 literre feltöltve) megfestjük. Ehhez a táptalaj lecsapása után a sejteket 20 percig 50 μΐ festékoldattal festjük szobahőmérsékleten. Utána a tenyészetlapokat addig mossuk vízzel, amíg a sejthez nem kötődő összes színezéket el nem távolítjuk. A sejt által megkötött színezéket 100 μΐ mérőoldat (50%-os etanol, 0,1% ecetsav) hozzáadása után 540 nm-nél egy Titertek Multiscan MCC/340 (Flow Laboratories, Meckenheim) segítségével fotometriásan határozzuk meg. Megadjuk azokat a limfotoxin- illetve
HU 202 922 Β
LT-mutáns-koncentrációkat, amelyek (az abszorpció csökkenésével mérve) a sejteknek a kezeletlen sejtkontrolihoz képest 50%-os lizisét eredményezik.
Egy egységként (U) olyan limfotoxin vagy LT-mutáns mennyiséget definiálunk, amely az adott sejtszám 5 50%-os lizisét indukálja.
Ebből az L929 indikárotsejtomalra a következő (a 8,2· 106 U/mg protein aktivitású jelenlévő TNF-standarddal szemben korrigált biológiai aktivitások adódnak: 10
Anyag
Limfotoxin (LT) delta 23LT delta 24LT delta 25LT
Aktivitás (U/mg protein)
6,1· 107 1,2·108
2,0· 108 15
8,5· 107
A WEHI-164 tumorsejtvonallal szemben a limfotoxinra, illetve a LT-mutánsokra a következő biológiai aktivitások adódnak (azokat a proteinkoncentrációkat 20 adjuk meg, amelyek adott sejtszám 50%-os lizisét okozzák):
Anyag Proteinkoncentráció EC50 (ng protein/ml)
LT 0,55
delta 23LT 0,29
delta 24LT 0,15
delta 25LT 0,38
12.Humán rekombináns limfotoxin és mutánsainak
szinergikus citotoxikus aktivitása humán rekombináns gamma-interferonnal tumorsejtekre.
Limfotoxin vagy a LT-mutánsok gamma-interferonnal együtt mutatott szinergikus aktivitásának kimutatására az emberi MG-63 csontszarkómát használjuk, amely egyedül limfotoxinra nem érzékeny, gamma-interferon azonban dózistól függően gátolja növekedését.
A vizsgálatot a következőképpen végezzük:
2·1Ο3 exponenciális növekedési szakaszban lévő sejtet szélesztünk mélyedésenként egy 96-lyukas lemezen komplett táptalajban (RPMI 1640 + 10% borjú magzatszérum, mindkettő a Flow Laboratories, Meckenheim-től), és éjszakán keresztül inkubáljuk 37 ’Con 5% szén-dioxidot tartalmazó, vízgőzzel telített atmoszférában. Utána állandó (rekombináns, humán) gamma- interferon koncentrációnál a limfotoxint vagy a limfotoxin- mutánst sorozatban 5-szörösen hígítjuk; a startkoncentráció 10 ng protein/ml. A végtérfogat mindenegyes tenyészetlyukban 150 μΐ. Kontrollként tiszta táptalajt vagy gamma- interferon és/vagy LT, illetve LT-mutánsok nélküli sejttenyészeteket használunk. A tenyészlemezeket további 72 óra hosszat inkubáljuk az előbb megadott körülmények között, és utána a 11, példában leírtak szerint kristályibolyával festjük, és fotometriásan kiértékeljük.
A gamma-interferon és limfotoxin MG-63 tumorsejtek elleni szinergikus hatásának meghatározásánál kapott kísérleti adatokat a 7. ábrában tüntetjük fel.
A limfotoxinok gamma-interferonnal együtt mutatott szinergikus hatását a következőképp határozzuk meg:
a) gamma-interferon sejtosztódásgátló aktivitását a minták optikai sűrűségéből a következő képlettel számítjuk ki:
gamma-INF aktivitás = 100%OD 540 nm (kezelt sejt)
OD 540 nm (kontroll sejt)
100%(A)
Példa: 2 ng/ml gamma-IFN; lásd 7. ábra.
20 gamma-IFN aktivitás = 100%- -f— ·100%-35% 1
b) gamma-interferon limfotoxinnal való kombinációja citotoxikus aktivitásának számítása az A képlet szerint.
Példa: 2 ng/ml gamma-interferon és 2 ng/ml LT; lásd 7. ábra.
gamma-interferon+LT aktivitás - 100%0,83
1,85
100%-55%.
c) limfotoxinok gamma-interferonnal együtt gyakorolt szinergikus hatásainak meghatározása:
szinergikus hatásgamma-IFN + LT aktivitás gamma-IFN aktivitás
Példa: 2 ng/ml gamma-IFN és 2 ng/ml limfotoxin; lásd 7. ábrát és 12.a) és b) példákat. ' szinergikus hatás55%
35%
-1,57.
ng/ml gamma-interferon 2 ng/ml limfotoxinnal való kombinációja a 2 ng/ml gamma-interferon által egyedül kiváltott citotoxikus hatást 1,57-es faktorral 60 erősíti. Másik mérésnél 1,41 értéket kaptunk. A két sejtnél kapott átlagértéket tartalmazza az alább következő táblázat.
A gamma-interferon és a delta 24-limfotoxin-mutáns MG-63 tumorsejtvonallal szembeni szinergikus hatása meghatározásának kísérleti adatait a 8. ábrán ábrázoljuk. A delta 24-LT gamma- interferonnal kifejtett szinergikus hatását az előbb bemutatottak szerint határozzuk meg.
A gamma-interferon által kiváltott citotoxicitás limfotoxinnal vagy az itt leírt limfotoxin-mutánsok valamelyikével való kombináció útján fellépő erősítésének (szinergikus hatás) eredményeit a következő táblázatban foglaljuk össze.
HU 202 922 Β
LT- fajta gamma-IFN (ng/ml) 10 2 0,4 0,08 0,016
LT 2,0 1,61 1,49 1,40 1,27 1,15
0,4 2,16 1,89 1,75 1,87 1,42
delta 23 2,0 1,48 1,38 1,32 1,16 1,05
0,4 2,0 1,90 1,62 1,27 1,24
delta 24 2,0 2,45 2,04 1,69 1,49 1,55
0,4 6,59 3,75 2,69 1,96 2,37
delta 25 2,0 2,61 1,89 1,63 1,38 1.41
0,4 8,30 3,45 3,04 1,45 1,65
A táblázatban megadott értékeket az előbb a 12.a)12. c) példáknál közöltek szerint határoztuk meg, számítottuk ki, és az átlagértékek két független kísérlet eredményei tükrözik.
13. A toxicitás meghatározása.
A vizsgálandó anyagok akut toxicitásának meghatározásához 4-6 hetes korú hím Balb/c egereket használunk. Az állatokat véletlenszerűen 5 állatból álló csoportokba osztjuk, és egy hetes akklimatizálódási idő elteltével a vizsgálati anyag különböző dózisait (0,25 mg/testsúlykilogramm-4,0 mg/testsúlykilogramm) adjuk be nekik intravénás injekcióként az egyik oldalsó farokvénába. A beadási térfogat 10 ml/testsúlykilogramm; az injektálás időtartama 10 másodperc. Az anyagokat közvetlenül az intravénás injektálás előtt oldjuk olyan fiziológiás sóoldatban, amely 0,2% BSAt tartalmazó fiziológiás sóoldatot kapnak intravénásán. A vizsgálati anyagok injekciós beadása után az összes állatot 7 napi időtartamig megfigyelés alatt tartjuk. A következő tüneteket jegyezzük fel: hasmenés, mérsékelt helyváltoztatás, szőrmerevedés, cianózis és elhullás; ezenkívül rendszeresen mérjük az állatok testhőmérsékletét és testtömegét.
Több vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy mind a limfotoxin (LT) mind a mutánsok (delta 23LT, delta
24LT és delta 25LT) a testhőmérséklet, a testsúly és a helyváltoztató mozgások dózis- és időfüggő csökkenését okozzák, valamint szőrmerevedést és hasmenést váltanak ki. Ezek a tünetek már az injekciós beadás után 2 órával kimutathatók, mindenekelőtt magasabb dózisok esetén, és a túlélő állatok esetében a 7-napos megfigyelési időn belül teljesen reverzibilisek. A megfigyelt tünetek azokban az állatokban a legkifejezettebbek, amelyeket LT-vel kezelünk. Azok az állatok, amelyeket az LT-mutánsokkal kezelünk, az LT-hez viszonyítva összességében gyengébben kifejeződő tünetegyüttest mutatnak, viszont a delta 23LT lényegesen erősebb tüneteket okoz, mint a delta 24LT; a delta 25LT közbülső helyzetet foglal el a delta 23LT és a delta 24LT között.
Az egyes LDso-értékek becsült értékeit a következőképp számítjuk:
LD50 LT-re: 0,79 mg/testsúlykilogramm,
LD50 delta 23LT-re: 1,84 mg/testsúlykilogramm, LD50 delta 25LT-re: 3,1 mg/testsúlykilogramm, LD50 delta 24LT-re: nem számolható, mivel bármilyen adagolásnál sem volt az állatok elhullása >50%.
X- Leu Lys Pro Alá Alá His
Asn Ser Leu Leu Trp Arg Alá
Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn
Gly Ile TVr Phe Val iyr Ser
Tyr Ser Pro Lys Alá Thr Ser
Val Gin Leu Phe Ser Ser Gin
Ser Ser Gin Lys Met Val Tyr
His Ser met Tyr His Gly Alá
Gin Leu Ser Thr His Thr Asp
Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly
Leu
Asn
Asn
Gin
Ser
Tyr
Pro
Alá
Gly
Alá
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a
    De Gly Asp Pro Ser Lys Gin Thr Asp Arg Alá Phe Leu Gin Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Val Val Phe Ser Gly Lys Alá Pro Leu iyr Leu Alá His Glu Pro Phe His Val Pro Leu Leu Gly Leu Gin Glu Pro Trp Leu Phe Gin Leu Thr Gin Gly Asp De Pro His Leu Val Leu Ser Phe Alá Leu
    általános képletű polipeptidek amelyek képletében
    X jelentése treonil- (Thr-), szeril-treonil- (Ser-Thr-), metionil-treonil- (Met-Thr-), metionil-szeril-treonil- (Met-Ser- Thr-) csoport vagy ettől legfeljebb 5%-ban eltérő aminosavszekvenciájú, limfotoxin- vagy limfotoxinszerű-hatású po55 lipeptidek célzott mutagenezissel való előállítására, azzal jellemezve, hogy
    i) egy limfotoxint termelő sejtvonalból elkülönítjük az mRNS-t, ii) ezt az mRNS-t a megfelelő kétszálas cDNS-sé átmásoljuk, iii) ezt a cDNS-t E. coli vektorokba inszertáljuk,
    HU 202 922 Β iv) az így kapott új vektorokkal E. colit transzfomálunk,
    v) a limfotoxin cDNS kiónokat génszondák segítségével és hibridizálással szelektáljuk és jellemezzük, vi) a limfotoxin-gént tartalmazó vektorokat szaporítjuk és elkülönítjük, vii) a gént vagy génfragmenseket restrikciós endonukleázok segítségével izoláljuk, viii) a megfelelő oligonukleotidokat tartalmazó gént vagy génfragmenseket expressziős vektorokba inszertáljuk, ix) adott esetben a gén 5’-végéhez további DNS-szekvenciákat inszertálunk,
    x) ilyen expressziós vektorokkal E. coli transzformálunk, és
    5 xi)a kívánt génterméket kifejezzük, elkülönítjük, és megtisztítjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan polipeptidek előállítására, amelyek képletében X jelentése szeril-treonil- (Ser-Thr-) vagy treonil- (Thr-) csoport, azzal jellemezve, hogy a fenti peptideket kódoló génfragmenseket inszertáljuk az expressziós vektorokba.
    -8HU 202922 B Cl.5: C 12 N 15/28
    1. ÁBRA szignálszekvenciával rendelkező limfotoxin aminosavszekvenciáj
    o H- at a UJ QC UJ o z -J M at Uí UJ LÓ X UJ X at < s a X Ló < Q. LÓ a a 0 > 3 3 LÓ O z at at © 3 a a UJ UJ > at -1 > X et -i LÓ X -J ♦ -J Q. 0 >- ►- a 0 < k- α > o Q. 3 UJ < ot Z > a X — -Λ a LÓ LU _j > —f —í UJ < 0 CL < _J ** < t— 0 0 LÓ et Z t/l > UJ > LÓ z 3 Z o X _J *r· X >- UJ —1 a w 0 X 0 & 0 _J 0 0 a > < z UJ < OS © et > QC a -j -1 -J _J UJ QC UJ X UJ 0 < 0 RM < LÓ a LÓ 0 ►— LÓ LÓ > 0 3 0 ot QC Ot O 3 3 > J a UJ OS X UJ UJ α UJ UJ V 0 < _J < k- Ló LÓ a -J .J o < Ló a O Ot UJ a Z. .J < a' —j PM LÓ et > X > < > Q. < X < a k- a K 0 > 3 at < at -j < 3 -t UJ 3 ot UI X -i ’x < -J UJ < X UJ < -j h- < b- > < _l > a o 3 Z < z 3 LÓ Z ►- < Ló et UJ -i _J LÓ UJ > _J UJ -j RM a _J 0 < < -J -t 0 X < X 3 -J < © < 3 > —I LÓ < o uj < -J at -J UJ -J < > at > < a < -J 0 > -J < a UJ 3 < Ló 0 QC QC 3 z > UJ z UJ -j > QC UJ UJ —1 _j _j & _J < -i < LÓ Ló 0 0 0 PM 3 3 oc 3 a z UJ LÓ et Ló > UJ UJ UJ UJ QC LÓ X mm UJ w -Í u —1 Ló -J k- < a X LÓ X 0 0 3 o 0 at 3 z < et OC a et UJ QC CM X UJ Ló < UJ >» LÓ < -J a ♦ >- -J < > < Ló ♦— < 3 > a tn QC 3 QC -j 3 3 ►- at u _J X CM UJ UJ UJ < UJ UJ UJ X 0 0 k- ♦ Ló -i LÓ > -J X h- O 3 3 LÓ QC 3 Z QC 3 QC LÓ a UJ UJ CM PM UJ UJ -j >- UJ UJ PM CL «J -J ♦ Z Ló -J 0 k- -1 Ló X o 3 > < z QC QC 3 O Ló a et UJ -J -1 LÓ UJ UJ UJ α MM X a 0 < < LÓ LÓ -i a X t— et 3 -J 3 z UJ (X o _j 3 at X UJ < UJ _J X >- et < UJ UJ μ- -Λ > -J 0 a 1— a > _J LÓ H 3 > LÓ LÓ > -i et Ló a 3 UJ UJ _í PM > u < UJ PM at UJ X -J 0 X _J 0 > Ló X k-
HU872813A 1986-06-20 1987-06-19 Process for producing new limphotoxin-polypeptides HU202922B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863620656 DE3620656A1 (de) 1986-06-20 1986-06-20 Polypeptide mit lymphotoxin-aktivitaet oder lymphotoxin-aehnlicher aktivitaet, ihre herstellung und verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44609A HUT44609A (en) 1988-03-28
HU202922B true HU202922B (en) 1991-04-29

Family

ID=6303309

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU872813A HU202922B (en) 1986-06-20 1987-06-19 Process for producing new limphotoxin-polypeptides

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5157106A (hu)
EP (1) EP0250000B1 (hu)
JP (1) JPS635099A (hu)
AT (1) ATE82329T1 (hu)
AU (1) AU590861B2 (hu)
DE (2) DE3620656A1 (hu)
DK (1) DK312787A (hu)
ES (1) ES2052513T3 (hu)
FI (1) FI872635A (hu)
HU (1) HU202922B (hu)
ZA (1) ZA874430B (hu)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6330426A (ja) * 1986-07-25 1988-02-09 Mitsubishi Chem Ind Ltd 自己免疫性疾患治療薬
FI884798A (fi) * 1987-10-28 1989-04-29 Eisai Co Ltd Rekombinantlymfotoxin.
CA1329119C (en) * 1988-03-29 1994-05-03 Milton David Goldenberg Cytotoxic therapy
US5120525A (en) * 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
EP0336383A3 (en) * 1988-04-07 1990-08-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel recombinant human lymphotoxin
JPH023698A (ja) * 1988-06-20 1990-01-09 Denki Kagaku Kogyo Kk ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬
CA2001756A1 (en) * 1988-10-31 1991-04-30 Seiichi Uesugi New human lymphotoxin n-end deletion mutant
DE3841754A1 (de) * 1988-12-12 1990-06-13 Basf Ag Neue tnf-peptide
DE3841759A1 (de) * 1988-12-12 1990-06-13 Basf Ag Neue tnf-peptide

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4568640A (en) * 1981-05-11 1986-02-04 Harvey Rubin Method of inserting amino acid analogs into proteins
DE3376224D1 (en) * 1982-05-25 1988-05-11 Univ Brandeis Cloning vector with indicator genes which have been inactivated by frameshift
IL75318A (en) * 1984-05-31 1994-08-26 Genentech Inc Recombinant human memotoxin and methods for its recombinant production
US4677064A (en) * 1984-11-09 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4677063A (en) * 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4752575A (en) * 1984-11-26 1988-06-21 The Regents Of The University Of California Lymphotoxins with antitumor activity and method for producing same
AU603768B2 (en) * 1985-07-04 1990-11-29 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin
US4782139A (en) * 1985-10-28 1988-11-01 Eli Lilly And Company Selective chemical removal of a protein amino-terminal residue
JPS62181298A (ja) * 1986-02-05 1987-08-08 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトリンホトキシンポリペプチド誘導体
FI884798A (fi) * 1987-10-28 1989-04-29 Eisai Co Ltd Rekombinantlymfotoxin.

Also Published As

Publication number Publication date
US5157106A (en) 1992-10-20
DK312787D0 (da) 1987-06-19
JPS635099A (ja) 1988-01-11
EP0250000A3 (en) 1988-05-04
ATE82329T1 (de) 1992-11-15
FI872635A0 (fi) 1987-06-12
EP0250000A2 (de) 1987-12-23
DK312787A (da) 1987-12-21
AU7452187A (en) 1988-01-07
EP0250000B1 (de) 1992-11-11
FI872635A (fi) 1987-12-21
ZA874430B (en) 1989-02-22
ES2052513T3 (es) 1994-07-16
DE3782549D1 (de) 1992-12-17
AU590861B2 (en) 1989-11-16
HUT44609A (en) 1988-03-28
DE3620656A1 (de) 1987-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU594045B2 (en) Recombinant colony stimulating factor-1
US4847201A (en) DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
US4677063A (en) Human tumor necrosis factor
KR920007399B1 (ko) 인체 생리적 활성 폴리펩티드
AU601675B2 (en) Purification, production and use of tumor necrosis factors
CA1339032C (en) Forms of colony stimulating factor-1
DE3750056T2 (de) Polypeptid-Mutanten des menschlichen TNF und für diese Mutanten codierende DNS.
KR950000712B1 (ko) 인터로이킨1활성을가지는폴리펩티드의제조방법
EP0256843A1 (en) Expression of g-csf and muteins thereof and their use
HU202287B (en) Process for producing human immune interferon
EP0200748B1 (en) Human tumor necrosis factor
DE3586972T2 (de) Gereinigtes interleukin-1.
JPS63152398A (ja) インターロイキン−１β誘導体及び医薬
HU202922B (en) Process for producing new limphotoxin-polypeptides
IL92938A (en) A polypeptide that has a mutagenic activity on monocytes and AND that encodes it
AU617999B2 (en) A genetic engineering process for the preparation of angiogenins
EP0098863A1 (en) Interferon-alpha 61
CA1282353C (en) INTERFERON .alpha. 74
AT393690B (de) Homogene, rekombinante immun-interferonfragmente
KR100197110B1 (ko) 활성 사람 호중구 화학주성 인자 폴리펩티드의 제조방법
HU200939B (en) Process for stabilizing htnf obtained by recombinant dna technique
JP2675294B2 (ja) ヒト腫瘍壊死因子
EP0174999B1 (en) Method for improving expression and method thereto
EP0327360B1 (en) Novel polypeptides and DNA encoding said polypeptides
DE69006311T2 (de) Antimetastatische peptide.

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee