KR20230057280A - IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 함유 원료에 대한 다중형 크로마토그래피 정제 단계를 수행하여 엔도톡신 < 0.05 EU/mg 또는 크기 배제 HPLC 순도 98% 이상인 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 얻는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법, 가) IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 단계; 나) 상기 가)에서 배양한 세포로부터 단백질을 회수하는 단계; 다) 상기 나)에서 회수한 단백질을 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계; 라) 상기 다)에서 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 다중형 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하며, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하지 않는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법, 상기 방법으로 정제된 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 함유 원료에 대한 다중형 크로마토그래피 정제 단계를 수행하여 엔도톡신 < 0.05 EU/mg 또는 크기 배제 HPLC 순도 98% 이상인 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 얻는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법, 가) IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 단계; 나) 상기 가)에서 배양한 세포로부터 단백질을 회수하는 단계; 다) 상기 나)에서 회수한 단백질을 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계; 라) 상기 다)에서 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 다중형 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하며, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하지 않는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법, 상기 방법으로 정제된 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
인간 면역글로불린 G (IgG) Fc 도메인은 단백질의 기능을 나타내는 도메인과의 융합을 통하여 단백질 의약품에 지속성을 나타내게 하는 요소가 된다. 이에 따라 많은 상업용 단백질 의약품이 Fc 융합단백질 형태로 개발되고 있다.
혈관 내피세포 성장 인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)는 혈관 신생과 혈관 투과성을 증가시키는 중요한 인자이다. 특히, VEGF는 종양에서 과발현되어 비정상적으로 혈관 신생 및 종양 증식을 촉진한다 (Oncogene (2004) 23, 1745-1753). 또한, 비정상적인 혈관 신생은 종양 발생 외에도 다른 질병에도 중요하게 관련되어 있다고 보고되고 있다. VEGF 관련 기전에서 비정상적인 혈관 신생은 안과 질환인 습성황반변성, 당뇨망막병증 및 망막정맥폐쇄 황반부종 등과 연관되어 있다 (J. Korean Med. Assoc. (2014), 57(7), 614-623).
이러한, 안과 질환에 대한 치료에는 페갑타니브 (Pegaptanib; RNA 압타머), 라니비주맙 (Ranibizumab; 모노클로날 IgG 항체 단편(Fab)), 베바시주맙 (Bevacizumab; 모노클로날 IgG 항체)이 사용되고 있고, 애플리버셉트 (Aflibercept; IgG1 Fc로 융합된 VEGFR1 및 VEGFR2)가 습성황반변성의 치료제로 2011년에 미국에서 승인되었다 (Biol. Ther. (2012) 2(3) 1-22, Drug Design, Development and Therapy (2013) 3(7), 711-722).
본 발명의 하나의 목적은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 함유 원료에 대한 다중형 크로마토그래피 정제 단계를 수행하여 엔도톡신 < 0.05 EU/mg 또는 크기 배제 HPLC 순도 98% 이상인 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 얻는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 가) IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 단계; 나) 상기 가)에서 배양한 세포로부터 단백질을 회수하는 단계; 다) 상기 나)에서 회수한 단백질을 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계; 라) 상기 다)에서 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 다중형 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하며, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하지 않는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법으로 정제된 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 아울러, 본 발명에 기재된 문헌은 본원의 참조로 삽입될 수 있다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 일 양태는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 함유 원료에 대한 다중형 (multimodal) 크로마토그래피 정제 단계를 수행하여 엔도톡신 < 0.05 EU/mg 또는 크기 배제 HPLC 순도 98% 이상인 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 얻는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질"은 IgG Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 함유 원료는 동물세포주를 이용한 세포배양으로부터 생산된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 융합 단백질은 혈관 내피세포 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 길항제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 융합 단백질은 IgG Fc 도메인 및 VEGF 수용체 1 및 2를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 VEGF 수용체 1 및 2는 VEGF 수용체 1 및 2의 세포 외 도메인 (extracellular domain)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 VEGF 수용체는 인간 VEGF 수용체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 융합 단백질은 애플리버셉트 (Aflibercept)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "IgG Fc"는 면역글로불린 IgG의 불변영역인 Fc 영역을 의미한다. 상기 면역글로불린 IgG의 Fc 영역은 상기 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.
상기 면역글로불린 IgG Fc는 IgG의 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 것일 수 있으며, 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 IgG Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 변이체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 변이체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
일 구현 예로, 본 발명의 IgG Fc는 인간 IgG Fc일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 IgG Fc는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 도메인일 수 있고, 구체적으로 IgG1의 Fc 도메인일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 함유 원료"는 세포 배양 등을 통해 얻어진, 정제되지 않은, 세포, 이의 배양물, 파쇄물 등으로서, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법은 다중형 (multimodal) 크로마토그래피 정제 단계를 포함한다.
본 발명에서 용어 "크로마토그래피"는, 혼합물의 성분이 상이한 속도로 매질을 통하여 통과되도록, 매질을 통하여 통과시킨 혼합물의 성분을 분리하는 임의의 프로세스를 지칭한다. 상기 크로마토그래피에는 컬럼 크로마토그래피, 플래너(planar) 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이온 교환 크로마토그래피(양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토 그래피), 크기 배제 크로마토그래피, 다중형 크로마토그래피, 및 소수성 상호반응 크로마토그래피 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 정제공정의 각 단계에서 예시적인 타입의 크로마토그래피 공정 또는 장치에 대해 개시하며, 이는 전술한 모든 타입의 크로마토그래피에 대해 적용할 수 있다.
본 발명의 각 단계의 크로마토그래피는 시료주입 단계, 평형 단계, 세척 단계, 및 용출 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 각 단계는 순서를 바꾸어 수행할 수 있고 각 단계의 전후 또는 사이에 추가로 다른 단계(예를 들어, 평형 단계, 세척 단계)를 더 포함할 수 있으며 하나의 단계에 다른 단계가 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 시료주입 단계에 앞서 평형 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 세척 단계는 평형 단계에 포함되거나 세척 단계에 평형 단계가 포함될 수도 있다. 본 발명의 평형 단계는 평형 완충액을 컬럼에 통과시켜 수지를 평형화하는 단계; 본 발명의 세척 단계는 완충액으로 컬럼을 세척하여 수지에 흡착되어 있는 불순물을 제거하는 단계; 및 용출 단계는 목적 단백질을 용출 및/또는 회수하는 단계일 수 있다.
일 예로, 본 발명의 크로마토그래피에서 완충액은 트로메타민, 인산나트륨, 아세트산나트륨, 시트르산, 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 완충액은 평형 단계, 세척 단계, 및 용출 단계에서 이용되는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 용출 단계는 염 구배, pH 구배, 또는 이들의 조합을 이용하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 용출 단계는 결합-용출 방식(binding and elution mode) 으로 수행하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 용출 단계는 플로우-쓰루 방식(flow through mode) 을 이용하지 않는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "플로우-쓰루"는 크로마토그래피에서 통과액을 수집하는 방식을 의미하며, 본 발명에서 용어 "결합-용출"은 표적 단백질이 혼합 모드 상호반응을 통해 수지에 결합된 리간드에 결합하고 완충액 조성 또는 pH 등을 이용하여 상기 수지에서 분자를 방출하는 방식을 의미한다. 상기 플로우-쓰루 방식은 특정 조건에서 컬럼 레진에 결합하는 물질만을 제거하는 방식이며, 상기 결합-용출은 특정 조건에서 컬럼 레진에 결합하지 않는 물질을 제거하고 컬럼 레진에 결합하지 않는 물질을 회수하는 방식일 수 있다.
본 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 항체 및 융합 단백질 정제에서는 일반적으로 사용되는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 다중형 (Multimodal) 크로마토그래피에서 통과액을 수집하는 플로우-쓰루 방식 (Flow through mode)을 채택하지 않고, 다중형 크로마토그래피에서 결합-용출 방식 (binding and elution mode)으로 융합 단백질을 정제함으로써 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 다중형 크로마토그래피를 이용한 플로우-쓰루 방식과 비교하여 숙주세포 단백질, 엔도톡신, 바이러스, Protein A 용출액 (protein A leachate) 등을 효과적으로 제거하는 것에 의의가 있다. 또한, 본 발명의 정제 방법을 이용할 경우 간단한 3단계의 크로마토그래피 정제만으로 고순도 융합 단백질을 생산할 수 있으며, 등전점 pH 6 ~ 8의 범위를 갖는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트를 효과적으로 정제할 수 있다.
본 발명에서 용어 "다중형 크로마토그래피(multimodal chromatography)"는 목적 단백질의 분리를 위해 고정상과 목적 단백질 사이에 하나 이상의 상호작용을 하는 크로마토그래피를 의미한다. 상기 상호작용은 단백질 크기, 전하, 소수성, 친수성, 및/또는 특이적 상호작용 등이 포함될 수 있다. 상기 다중형 크로마토그래피는 멀티 모달 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatogragphy)와 혼용되는 것일 수 있다. 본 발명의 다중형 크로마토그래피는 물리적 다중형 크로마토그래피 및 화학적 다중형 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명의 다중형 크로마토그래피는 평형 단계, 시료주입 단계, 세척 단계, 및 용출 단계를 포함할 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 각 단계에서 사용되는 완충액은 트로메타민, 인산나트륨, 및 아세트산나트륨으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 평형 단계는 100 내지 200 cm/hr, 110 내지 190 cm/hr, 120 내지 180 cm/hr, 130 내지 170 cm/hr, 140 내지 160 cm/hr, 또는 150 cm/hr의 유속으로, 1 내지 10 CV(column volume), 2 내지 8 CV, 4 내지 6 CV, 또는 5 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 평형 단계는 약 pH 6 내지 8, 구체적으로 pH 7에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 평형 단계에서 사용되는 완충액은 약 pH 6 내지 8, 구체적으로 pH 7의 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 평형 단계에서 사용되는 완충액은 트로메타민, 인산나트륨, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 세척 단계는 1 내지 10 CV(column volume), 2 내지 8 CV, 4 내지 6 CV, 또는 5 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것일 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 용출 단계는 1 내지 10 CV(column volume), 3 내지 9 CV, 5 내지 8 CV, 또는 7 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 용출 단계는 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 6, 구체적으로 약 pH 5에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 용출 단계에서 사용되는 완충액은 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 6, 구체적으로 약 pH 5의 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 용출 단계에서 사용되는 완충액은 인산 나트륨, 아세트산나트륨, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 용출 단계는 염 구배, pH 구배, 또는 이들의 조합, 구체적으로는 pH 구배를 이용하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 용출 단계는 결합-용출 방식(binding and elution mode) 으로 수행하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피의 용출 단계는 플로우-쓰루 방식(flow through mode) 을 이용하지 않는 것일 수 있다.
일 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피에서 사용되는 레진은 Capto adhereTM, Capto MMCTM, Capto MMC ImpResTM, Capto adhere ImpResTM, Nuvia aPrime 4A, Capto Core 400TM, 및 Capto Core 700TM로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 상기 다중형 리간드는 구체적으로 Capto adhere일 수 있으며, 보다 구체적으로는 N-벤질-N-메틸에탄올아민 (N-Benzyl-N-methylethanolamine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 다중형 크로마토그래피에서 사용되는 다중형 리간드로 이온성 결합, 수소 결합 및 소수성 결합의 다중형 기능을 갖는 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에서는, 150 cm/hr의 유속으로 5 CV의 평형 완충액을 칼럼에 통과시켜 수지를 평형화하였다. 평형 완충액으로는 pH 7 내외의 트로메타민 및/또는 인산나트륨 완충액을 이용한다. 이후 수득한 심층여과 회수액을 주입하고, 5 CV의 평형 완충액으로 칼럼을 세척하였다. 7 CV의 용출 완충액을 칼럼에 흘려 목적 단백질을 용출하여 회수하였다. 용출 완충액으로는 pH 5 내외의 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액을 이용하였다(실시예 5).
본 발명의 정제 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계가 추가로 부가된 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 정제 방법은 다중형 크로마토그래피 정제 단계 이전, 이후, 또는 동시에 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 정제 방법은 다중형 크로마토그래피 정제 단계 이후에 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "이온 교환 크로마토그래피"는 매질과 단백질 표면의 순전하의 가역적인 상호 작용 즉, 이온 결합 강도의 차이를 이용한 교환 수지를 말한다. 본 발명에서 사용된 양이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 이용한 이온 크로마토그래피를 의미하며, 상기 단계에서는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물을 추가로 제거할 수 있고 목적하는 등전점을 갖는 동형체를 선택적으로 분리할 수 있다.
본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피는 평형 단계, 시료주입 단계, 제1세척 단계, 제2세척 단계 및 용출 단계를 포함할 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 각 단계에서 사용되는 완충액은 인산나트륨, 아세트산 나트륨, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 평형 단계는 100 내지 200 cm/hr, 110 내지 190 cm/hr, 120 내지 180 cm/hr, 130 내지 170 cm/hr, 140 내지 170 cm/hr, 또는 160 cm/hr의 유속으로, 5 내지 15 CV, 7 내지 13 CV, 8 내지 12 CV, 9 내지 11 CV, 또는 10 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 평형 단계는 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 6, 구체적으로 pH 5에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 평형 단계에서 사용되는 완충액은 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 6, 구체적으로 pH 5의 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 제1세척 단계는 1 내지 10 CV(column volume), 2 내지 8 CV, 4 내지 6 CV, 또는 5 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것일 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 제2세척 단계는 목적 단백질 유연물질 중 산성도가 높은 분획을 제거하기 위한 것일 수 있고, 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 6, 약 pH 5 내지 6, 구체적으로 약 pH 5.9의 1 내지 5 CV, 2 내지 4 CV, 또는 3 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 단계는 5 내지 15 CV, 8 내지 12 CV, 또는 10 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 단계는 약 pH 3 내지 8, pH 6 내지 8, 약 pH 4 내지 7, pH 5 내지 7, pH 6 내지 7, 구체적으로 약 pH 6.5에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 단계에서 사용되는 완충액은 약 pH 3 내지 8, pH 6 내지 8, 약 pH 4 내지 7, pH 5 내지 7, pH 6 내지 7, 구체적으로 약 pH 6.5의 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 단계는 염 구배, pH 구배, 또는 이들의 조합, 구체적으로는 염 구배를 이용하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 단계는 결합-용출 방식으로 수행하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출 단계는 플로우-쓰루 방식(flow through mode)을 이용하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에서는, 10 CV의 평형 완충액을 160 cm/hr의 유속으로 칼럼을 통과시켜 수지를 평형화하였다. 평형 완충액으로는 pH 5 내외의 완충액을 이용하며, 바람직하게는 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액을 이용할 수 있다. 다중형 크로마토그래피 단계에서 얻은 회수액을 주입하고, 5 CV의 평형 완충액으로 칼럼을 세척하였다. 목적 단백질 유연물질 (related substance) 중 산성도가 높은 분획을 제거하기 위하여 pH 5.9 내외의 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액 3 CV 분량을 칼럼에 통과시켜 세척을 수행하였다. 용출 완충액으로 pH 6.5 내외의 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액 10 CV을 이용하여 목적 단백질을 회수하였다(실시예 6). 본 발명자들은 다중형 크로마토그래피 결합-용출 방식 단계 이후 양이온 교환수지를 이용하여 잔량의 숙주세포 단백질, 엔도톡신, 애플리버셉트 유연물질 등을 추가로 제거함으로써 등전점 pH 6 ~ 8의 범위를 갖는 융합 단백질을 효과적으로 정제할 수 있는 방법을 개발한 것이다.
일 예로, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피에 사용할 수 있는 레진은 CM Sepharose Fast Flow, Capto ImpRes SP, SOURCE 30 S, SOURCE 15 S, Eshmuno S, Eshmuno CPX, Eshmuno CP-FT, Eshmuno CPS, Fractogel EMD SO3-, Fractogel EMD SE, Capto MMC, Macro-Prep 25 S, Macro-Prep CM, UNOsphere S, Macro-Prep High S, POROSTM XS, POROSTM 50 HS, Nuvia S Resin, Nuvia HR-S, Nuvia cPrim, Exhmuno CMXTM, Capto MMC ImpResTM, Nuvia cPrime, TOYOPEARL SP-650,TOYOPEARL GigaCap S-650 , TOYOPEARL CM-650, TOYOPEARL GigaCap CM-650, TOYOPEARL Salfate-650, TOYOPEARL MegaCap II SP-550, TOYOPEARL SP-550을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.바람직하게는, 본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피에서 사용되는 레진은 Capto STM, Capto ImpRes SP 및 Eshmuno CPS 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 술폰산 (-SO3), 술포프로필 (Sulfopropyl) 및 카복시메틸 (Carboxymethyl) 중 한 가지 이상, 구체적으로 술폰산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 양이온 교환 크로마토그래피의 양이온 교환 수지는 다른 수용액에 첨가되어 수용액 속의 특정 양이온과 자신의 양이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지를 의미하며, 양이온 교환 컬럼은 등전점 이상에서 양이온을 띠는 단백질을 흡착시킬 수 있다.
일 구현예로, 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기는 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호반응 (hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호반응 (hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하지 않음으로써, 시료 농축과정과 정제 규모에 따른 스케일-업의 용이성을 갖고, 단백질 구조의 소수성 부분이 염에 노출되는 것을 방지하며, 정제 수준을 높일 수 있다.
이 때에도 상기 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호반응 (hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피가 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 정제가 아닌 용도(예를 들어, 융합 단백질 순도 확인 또는 검증)를 위해서는 사용될 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 정제 방법은 일반적으로 IgG Fc 도메인을 가지는 항체 및 융합 단백질의 정제에서 일반적으로 수행되는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 음이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 이용한 이온 크로마토그래피를 의미한다.
본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 정제 방법은 각 단계의 전 또는 후에 여과 단계를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 여과 단계는 심층여과, 한외여과, 및 투석여과로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 여과는 1회 이상 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "심층여과(depth filtration)"는 입자 지름이 크며 균등 계수가 작은 여과제를 사용하여 여층 표면에서는 걸러지지 않고 통과한 플록을 내부에서 잡아주는 여과를 의미한다.
본 발명에서 용어 "한외여과(ultrafiltration)"는 압력 및 막을 이용하여 액체주에 용해되거나 분산된 물질을 입자크기나 분자량 크기별로 분획할 수 있는 공정을 의미한다.
본 발명에서 용어 "투석여과(diafiltration)"는 투석을 이용하여 용매와 분자 크기가 다른 둘 이상의 용질이 함유된 유체로부터 일부 용질만 제거하는 방법을 의미한다. 상기 투석여과는 정용여과와 혼용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 가) IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 단계; 나) 상기 가)에서 배양한 세포로부터 단백질을 회수하는 단계; 다) 상기 나)에서 회수한 단백질을 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계; 라) 상기 다)에서 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 다중형 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하며, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하지 않는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법을 제공한다. 상기 라) 단계에서 다중형 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 이전, 이후, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다.
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법의 최종 정제된 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질은 크기 배제 HPLC 순도 98% 이상, 엔도톡신 < 0.05 EU/mg 또는 pI 6.0 ~ 8.0인 것일 수 있다.
본 발명의 정제 방법을 통해 본 발명자들은 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호반응 (hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 등을 사용하지 않고도 간단한 3단계의 크로마토그래피 정제만으로 고순도 융합 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 등전점 pH 6 ~ 8의 범위를 갖는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트를 효과적으로 정제할 수 있다.
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 다중형 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피는 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 가) IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 단계에서, 상기 세포는 동물세포, 구체적으로 중국 햄스터 난소세포(CHO 세포)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "배양"은 상기 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 세포 종류에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
본 발명의 나) 상기 가)에서 배양한 세포로부터 단백질을 회수하는 단계에서, 상기 회수 방법은 본 발명의 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에서 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 심층여과, 추출, 한외여과, 투석 등을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 세포로부터 목적하는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 회수할 수 있다.
본 발명의 다) 상기 나)에서 회수한 단백질을 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계에서, 1차 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피일 수 있으며, 구체적으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "친화성 크로마토그래피"는 표적 분자와 리간드 간의 높은 특이성의 상호작용을 이용한 크로마토그래피를 의미한다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피는 평형 단계, 시료주입 단계, 제1세척 단계, 제2세척 단계 및 용출 단계를 포함할 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 각 단계에서 사용되는 완충액은 트로메타민, 인산나트륨, 아세트산, 및 시트르산으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 평형 단계는 2 내지 8 CV, 4 내지 6 CV, 또는 5 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 평형 단계는 약 pH 6 내지 8, 구체적으로 pH 7에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 평형 단계에서 사용되는 완충액은 약 pH 6 내지 8, 구체적으로 pH 7의 완충액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 평형 단계에서 사용되는 완충액은 트로메타민, 인산나트륨, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 제1세척 단계에서 사용되는 완충액은 시트르산, 아세트산, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있고, L-아르기닌 (L-Arginine) 및/또는 요소 (urea)를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 제1세척 단계는 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 7, pH 5 내지 6.5, 구체적으로 약 pH 5.9에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 제1세척 단계는 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 7, pH 5 내지 6.5, 구체적으로 약 pH 5.9의 5 내지 15 CV, 7 내지 13 CV, 8 내지 12 CV, 9 내지 11 CV, 또는 10 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것일 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 제2세척 단계에서 사용되는 완충액은 시트르산, 아세트산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 제2세척 단계는 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 6, pH 5 내지 6, 구체적으로 약 pH 5.6 에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 제2세척 단계는 약 pH 3 내지 7, 약 pH 4 내지 6, pH 5 내지 6, 구체적으로 pH 5.6의 1 내지 7 CV, 또는 3 내지 5 CV 의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 용출 단계는 약 pH 1 내지 5, 약 pH 2 내지 4, 약 pH 3 내지 4, 구체적으로 약 pH 3.5 에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 용출 단계는 약 pH 1 내지 5, 약 pH 2 내지 4, 약 pH 3 내지 4, 구체적으로 약 pH 3.5의 1 내지 7 CV, 또는 3 내지 5 CV의 완충액을 컬럼에 통과시키는 것을 포함할 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 용출 단계에서 사용되는 완충액은 시트르산, 아세트산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 용출 단계는 염 구배, pH 구배, 또는 이들의 조합, 구체적으로는 pH 구배를 이용하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 용출 단계는 결합-용출 방식(binding and elution mode)으로 수행하는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피의 용출 단계는 플로우-쓰루 방식(flow through mode)을 이용하지 않는 것일 수 있다.
일 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피에 사용할 수 있는 컬럼은 MabSelect PrismA, MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX, MabSelect SuRe pcc, 또는 MabCaptureCTM 일 수 있다.
일 예로, 본 발명의 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 레진은, alkali-stabilized Protein A-derived 리간드를 가지는 MabSelect SuRe 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시 예에서는, 약 5 컬럼 부피(CV) 분량의 pH 6~8, 바람직하게는 약 pH 7의 트로메타민 및/또는 인산나트륨 완충액을 체류시간 7.5분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 수지를 평형화하였다. 이후, 실시예 1에서 얻은 세포 배양 수확액을 평형화된 칼럼에 주입하고, 3CV의 평형 완충액으로 칼럼을 세척하여 수지에 흡착되어 있는 불순물을 제거하였다. 이후 10 CV의 세척 완충액 1과 3~5 CV의 세척 완충액 2를 칼럼에 순차적으로 통과시켜 추가로 불순물을 제거하였다. 세척 완충액 1로는 pH 5~6.5, 바람직하게는 약 pH 5.9의 시트르산 및/또는 아세트산 완충액을 이용하였으며, 세척 완충액 1은 L-아르기닌 (L-Arginine) 및/또는 요소 (urea)를 더 포함할 수 있다. 세척 완충액 2로 pH 5.6 내외의 시트르산 및/또는 아세트산 완충액을 이용하였다. 이후 용출 용액으로 5CV 분량의 pH 3.5 내외의 시트르산 및/또는 아세트산 완충액을 칼럼에 통과시켜 목적 단백질을 회수하였다 (실시예 2).
본 발명의 라) 상기 다)에서 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 다중형 크로마토그래피로 정제하는 단계는 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
일 구현 예로, 상기 라) 다중형 크로마토그래피로 정제하는 단계는 (a) pH 6 ~ 8의 완충용액으로 평형화된 다중형 크로마토그래피 칼럼에 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 로딩하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계보다 낮은 pH의 완충용액을 크로마토그래피 칼럼에 주입하여 pH 6 ~ 4의 조건에서 정제 단백질을 용출하고 수획하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 라)에서 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계는 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
일 구현 예로, 상기 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계는 (a) pH 4 ~ 6의 완충용액으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 선행 크로마토그래피 정제 단백질을 로딩하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 완충용액보다 높은 pH의 완충용액으로 용출하여 pI 6.0 ~ 8.0의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 수획하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 (b) 단계에서 (a) 단계의 완충용액보다 높은 pH의 완충용액은 약 pH 5~9, 약 pH 6~9, 약 pH 5~8, 구체적으로는 pH 6~8일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 다) 및 라) 중 어느 하나 이상의 크로마토그래피로 정제하는 단계 이전, 이후, 또는 이들의 조합에 심층여과 단계, 한외여과 단계, 투석여과 단계 및 바이러스 불활화 단계 중 하나 이상이 부가 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 다) 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계; 라) 다중형 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단계는 용출 단계를 포함하며, 상기 용출 단계는 염 구배, pH 구배, 또는 이들의 조합을 pH 구배, 구체적으로는 pH 구배를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법으로 정제된 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 이의 정제방법 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 피크 1 분획물을 포함하는 것일 수 있다, 이 때, 상기 피크 1 분획물은 본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법으로 정제된 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 소수성 상호반응 크로마토그래피 분석 시 50 mM 인산 나트륨, 2 M 염화 나트륨, pH 7.0인 이동상 A 및 50 mM 인산 나트륨, 30% 아세토나이트릴 pH 7.0인 이동상 B에서 이동상 B의 비율이 40 내지 45% 구간에서 용출되는 것일 수 있다.
일 구현 예로, 상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 조성물은 상기 피크 1 분획물을 5% 이하로 포함하는 것일 수 있고, 0.001% 내지 5%로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현 예로, 상기 피크 1 분획물은 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 어느 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 정제방법으로 정제된 융합 단백질을 제공한다.
일 구현 예로, 상기 융합단백질은 애플리버셉트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제방법을 이용하여 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 효율적으로 대량 생산 및 공급할 수 있다.
도 1은 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 MabSelect SuRe 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 Protein A 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 2는 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 상기 도 1의 정제 단계(단백질 A 크로마토그래피) 후 Capto Adhere 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 다중형 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 3은 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 상기 도 1 및 도 2의 정제 단계(단백질 A 크로마토그래피 및 다중형 크로마토그래피) 후 Capto S 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 4는 상기 도 3의 정제 단계(Capto S 양이온 교환 크로마토그래피)에서 정제 및 용출된 분획들의 등전점 전기영동 (Isoelectricfocusing) 분석 결과이다. Lane 1은 내부 표준품 1이며, Lane 2는 내부 표준품 2이다. Lane 3은 CEX(양이온 교환 크로마토그래피)의 용출 부피를 3CV 만큼 수집한 시료의 분석 결과이며, 이후 Lane 4, 5, 6, 7, 및 8은 CEX의 용출 부피를 0.5 CV씩 증가시켜 수집한 시료의 분석 결과이다.
도 5는 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 상기 도 1 및 도 2의 정제 단계(단백질 A 크로마토그래피 및 다중형 크로마토그래피) 후 SP-550C 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 6은 상기 도 5의 정제 단계(SP-550C 양이온 교환 크로마토그래피)에서 정제 및 용출된 분획들의 등전점 전기영동 (Isoelectricfocusing) 분석 결과이다. Lane 1은 CEX의 용출 부피를 4CV만큼 수집한 시료의 분석 결과이며, 이후 Lane 2 및 3은 CEX의 용출 부피를 8CV 및 10CV로 증가시켜 수집한 시료의 분석 결과이다.
도 7은 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 염 구배 용출 크로마토그램이다.
도 8은 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 염 구배 용출의 분획별 등전점 전기영동 분석 결과이다. 염 구배 용출 시에는 아이소폼 제거로 인하여 목표 단백질의 수율이 감소된다.
도 9는 Capto Adhere 레진 다중형 크로마토그래피와 비교 평가하기 위하여 Capto Q 레진을 이용하여 플로우-쓰루 방식으로 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 음이온 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 10은 Capto Q 레진 음이온 교환 크로마토그래피와 비교 평가하기 위하여 Capto Adhere 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 다중형 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 11은 음이온 크로마토그래피와 다중형 크로마토그래피를 비교 평가하기 위하여 동일 시료를 가하여 정제한 후 HCP (Host cell protein)를 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 메티오닌 잔기의 산화(Oxidation) 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 히스티딘 잔기의 산화 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 각 아미노산 잔기의 탈아미드화(Deamidation) 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 각 아미노산 잔기의 탈수(Dehydration) 분석 결과이다.
도 2는 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 상기 도 1의 정제 단계(단백질 A 크로마토그래피) 후 Capto Adhere 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 다중형 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 3은 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 상기 도 1 및 도 2의 정제 단계(단백질 A 크로마토그래피 및 다중형 크로마토그래피) 후 Capto S 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 4는 상기 도 3의 정제 단계(Capto S 양이온 교환 크로마토그래피)에서 정제 및 용출된 분획들의 등전점 전기영동 (Isoelectricfocusing) 분석 결과이다. Lane 1은 내부 표준품 1이며, Lane 2는 내부 표준품 2이다. Lane 3은 CEX(양이온 교환 크로마토그래피)의 용출 부피를 3CV 만큼 수집한 시료의 분석 결과이며, 이후 Lane 4, 5, 6, 7, 및 8은 CEX의 용출 부피를 0.5 CV씩 증가시켜 수집한 시료의 분석 결과이다.
도 5는 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 상기 도 1 및 도 2의 정제 단계(단백질 A 크로마토그래피 및 다중형 크로마토그래피) 후 SP-550C 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 6은 상기 도 5의 정제 단계(SP-550C 양이온 교환 크로마토그래피)에서 정제 및 용출된 분획들의 등전점 전기영동 (Isoelectricfocusing) 분석 결과이다. Lane 1은 CEX의 용출 부피를 4CV만큼 수집한 시료의 분석 결과이며, 이후 Lane 2 및 3은 CEX의 용출 부피를 8CV 및 10CV로 증가시켜 수집한 시료의 분석 결과이다.
도 7은 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 염 구배 용출 크로마토그램이다.
도 8은 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 염 구배 용출의 분획별 등전점 전기영동 분석 결과이다. 염 구배 용출 시에는 아이소폼 제거로 인하여 목표 단백질의 수율이 감소된다.
도 9는 Capto Adhere 레진 다중형 크로마토그래피와 비교 평가하기 위하여 Capto Q 레진을 이용하여 플로우-쓰루 방식으로 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 음이온 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 10은 Capto Q 레진 음이온 교환 크로마토그래피와 비교 평가하기 위하여 Capto Adhere 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 다중형 크로마토그래피를 수행하여 얻은 크로마토그램이다.
도 11은 음이온 크로마토그래피와 다중형 크로마토그래피를 비교 평가하기 위하여 동일 시료를 가하여 정제한 후 HCP (Host cell protein)를 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 메티오닌 잔기의 산화(Oxidation) 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 히스티딘 잔기의 산화 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 각 아미노산 잔기의 탈아미드화(Deamidation) 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 본 발명 및 상업적으로 판매되는 정제 애플리버셉트의 각 아미노산 잔기의 탈수(Dehydration) 분석 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
[실시예 1] 배양액 수확 및 전처리
목적 단백질인 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입한 중국 햄스터 난소세포(CHO)를 배양함으로써 배양액을 준비하였다. 융합 단백질의 대표 예로서, CHO 세포에는 애플리버셉트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입한 후 배양하였다.
통상적으로 배양액에는 동물 세포를 비롯한 불순물이 포함되어 있다. 이에, 크로마토그래피를 수행하기 전에 심층여과를 수행하여 동물 세포를 비롯한 불순물을 제거하였다. 이 과정을 거쳐 세포 배양 수확액 (Harvested cell culture fluid; HCCF)을 준비하였다. 필터 재료 표면에서 불순물과 입자들을 제거하는 표면 여과 방식과 달리 심층여과를 이용하여 느슨한 섬유 구조와 높은 다공성의 3차원 필터로 불순물과 입자들을 제거하는 방식으로서 공정 속도와 효율성을 높일 수 있었다.
[실시예 2] 단백질 A(Protein A) 친화 크로마토그래피 정제
실시예 1의 전처리 과정을 통해 얻은 세포 배양 수확액으로부터 융합 단백질(CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트)을 포획 (direct product capture)하기 위해 단백질 A 친화 크로마토그래피를 수행하였다. 이는 항체 또는 Fc를 갖는 융합단백질의 Fc 도메인에 결합하는 친화성 리간드를 이용하여 정제하는 단계이며, pH 3~5, 바람직하게는 pH 3~4, 더욱 바람직하게는 pH 약 3.5의 완충용액, 예컨대 시트르산 및/또는 아세트산 완충용액을 이용하여 단백질을 용출하여 회수하였다.
이를 위하여, 약 5 컬럼 부피(CV, column volume) 분량의 pH 6~8, 바람직하게는 약 pH 7의 트로메타민 및/또는 인산나트륨 완충액을 체류시간 7.5분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 수지를 평형화하였다. 이후 실시예 1에서 얻은 세포 배양 수확액을 평형화된 칼럼에 주입하고, 3CV의 평형 완충액으로 칼럼을 세척하여 수지에 흡착되어 있는 불순물을 제거하였다. 이후 10 CV의 세척 완충액 1과 3~5 CV의 세척 완충액 2를 칼럼에 순차적으로 통과시켜 추가로 불순물을 제거하였다. 세척 완충액 1로는 pH 5~6.5, 바람직하게는 약 pH 5.9의 시트르산 및/또는 아세트산 완충액을 이용하였으며, 세척 완충액 1은 L-아르기닌 (L-Arginine) 및/또는 요소 (urea)를 더 포함할 수 있다. 세척 완충액 2로 pH 5.6 내외의 시트르산 및/또는 아세트산 완충액을 이용하였다. 이후 용출 용액으로 5CV 분량의 pH 3.5 내외의 시트르산 및/또는 아세트산 완충액을 칼럼에 통과시켜 목적 단백질을 회수하였다. 수지 재사용을 위하여 목적 단백질 회수 이후 스트립 완충액, 0.1M 수산화나트륨, 평형 완충액, 보관 완충액 순으로 세척을 진행한 후 보관하였다.
한편, 본 실시예의 단백질 A 크로마토그래피는 MabSelect SuRe 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 수행하였다.
그 결과, 도 1에 단백질 A 친화 크로마토그래피를 이용하여 세포 배양 수확액을 정제한 결과를 제시하였다.
[실시예 3] 바이러스 불활화 및 중화
단백질 A 친화 크로마토그래피 정제에서 수득한 용출액은 pH 3.5±0.1로 적정하여 1~2시간 방치하여 잠재적 바이러스의 불활 처리를 수행하였다. 불활화 반응 이후 단백질 용액을 pH 5.5±0.1 조건으로 중화하고, 미세여과를 통해 응집체 등의 불순물을 제거하였다.
[실시예 4] 심층여과
심층여과는 심층 필터를 사용하여 주로 공정 유래 불순물을 제거하는 단계이다.
이를 위하여, 필터 지체 부피(Hold-up volume) 5배 분량의 평형 완충액을 156 LMH (Liter/m2/h)의 유속으로 필터를 통과시켜 평형화를 수행하였다. 평형 완충액으로는 pH 5.5 내외의 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액을 이용하였다. 평형 후 단백질 용액을 심층 필터에 주입하고 여과액을 회수하였다.
[실시예 5] 다중형 크로마토그래피
다중형 크로마토그래피는 공정 유래 불순물, 내독소, 잠재적 바이러스를 제거하는 단계이다. 이에, CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 Capto Adhere 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 다중형 크로마토그래피를 수행하였다.
이를 위하여, 150 cm/hr의 유속으로 5 CV의 평형 완충액을 칼럼에 통과시켜 수지를 평형화하였다. 평형 완충액으로는 pH 7 내외의 트로메타민 및/또는 인산나트륨 완충액을 이용한다. 이후 실시예 4에서 수득한 심층여과 회수액을 주입하고, 5 CV의 평형 완충액으로 칼럼을 세척하였다. 7 CV의 용출 완충액을 칼럼에 흘려 목적 단백질을 용출하여 회수하였다. 용출 완충액으로는 pH 5 내외의 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액을 이용한다. 수지 재사용을 위하여 단백질 회수 이후 스트립 완충액, 1M 수산화나트륨, 평형 완충액, 보관 완충액 순으로 칼럼을 세척한 후 보관하였다. 도 2에 정제 크로마토그램 결과를 나타내었다.
다중형 크로마토그래피를 수행하여 바이러스 로그 감소 (Virus log reduction) 결과를 얻었다. 이의 결과는 실시예 7의 표 5에 나타내었다. 이 때, 잠재적 바이러스의 경우 최대 로그 감소가 6 이상의 결과를 얻어 효율적인 바이러스 제거 효과가 있음을 확인하였다.
[실시예 6] 양이온 교환 크로마토그래피
양이온 교환 크로마토그래피는 특정한 등전점 범위의 IgG Fc 도메인을 갖는 융합단백질만을 포획하기 위한 최종 정제 단계이다.
이를 위하여, 10 CV의 평형 완충액을 160 cm/hr의 유속으로 칼럼을 통과시켜 수지를 평형화하였다. 평형 완충액으로는 pH 5 내외의 완충액을 이용하며, 바람직하게는 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액을 이용할 수 있다. 다중형 크로마토그래피 단계에서 얻은 회수액을 주입하고, 5 CV의 평형 완충액으로 칼럼을 세척하였다. 목적 단백질 유연물질 (related substance) 중 산성도가 높은 분획을 제거하기 위하여 pH 5.9 내외의 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액 3 CV 분량을 칼럼에 통과시켜 세척을 수행하였다. 용출 완충액으로 pH 6.5 내외의 인산나트륨 및/또는 아세트산나트륨 완충액 10 CV을 이용하여 목적 단백질을 회수하였다. 최대 피크의 8%까지 단백질을 회수하였다. 수지 재사용을 위하여 단백질 회수 이후 스트립 완충액, 1M 수산화나트륨, 평형 완충액, 보관 완충액 순으로 세척을 진행한 후 보관하였다.
한편, 양이온 교환수지 크로마토그래피 종류와 이에 따른 정제 조건 실험은하기 표 1에 나타낸 바와 같이 수행할 수 있다.
CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 실시예 5의 정제 단계 후(즉, 단백질 A 친화 크로마토그래피 및 다중형 크로마토그래피 후) Capto S 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 4는 상기 도 3의 Capto S 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계에서 정제 및 용출된 분획들의 등전점 전기영동 분석 결과이다. 도 4의 1, 2 lane은 내부 표준(internal reference)이며, 3,4,5,6,7, 및 8 lane은 Capto S 용출액 수집 수간에 따른 분석 결과이다. 수집 구간이 증가하여도 유사한 IEF pattern이 나타남을 확인할 수 있다.
또한, CHO 세포배양으로 얻은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질, 특히 애플리버셉트에 대하여 실시예 5의 정제 단계 후(즉, 단백질 A 친화 크로마토그래피 및 다중형 크로마토그래피 후) SP-550C 레진을 이용하여 결합-용출 방식으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 6은 상기 도 5의 SP-550C 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계에서 정제 및 용출된 분획들의 등전점 전기영동 (Isoelectricfocusing) 분석 결과이다.
한편, 도 7에는 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 염 구배 용출 크로마토그램을 나타내었다. 도 8에는 양이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 염 구배 용출의 분획별 등전점 전기영동 분석 결과를 나타내었다. 염 구배 용출 시에는 아이소폼 제거로 인하여 목표 단백질의 수율이 감소된다.
[실시예 7] 다중형 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피 간의 정제 효능 평가
다중형 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피 간의 정제 효능을 평가하기 위해, Capto adhere 다중형 크로마토그래피 및 Capto Q 음이온 크로마토그래피 결과를 비교하였다. Capto adhere 다중형 크로마토그래피 및 Capto Q 음이온 크로마토그래피의 수행을 위하여 AC, 심층여과01, 심층여과02, HIC, UF/DF, 심층여과03을 수행 후 시료를 분주하여 Capto adhere 다중형 크로마토그래피 및 Capto Q 음이온 크로마토그래피를 각각 수행하였다.
Capto Q와 Capto adhere 크로마토그래피로 IgG 도메인을 함유하는 동일 융합 단백질 시료(특히, 애플리버셉트; 실시예 1 내지 4로부터 수득한 시료)에 대하여 각각 정제를 진행하였고 이를 통해 얻은 용출 시료의 잔류 HCP(Host cell protein; 불순물의 일종)를 분석하여 각 시료의 HCP 잔존 양을 비교하였다. Capto Q 음이온 교환 크로마토그래피 및 Capto adhere 다중형 크로마토그래피는 다음과 같은 방식으로 수행하였다.
AC 크로마토 그래피
심층여과01
심층여과02
소수성 상호 작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC
UF/DF
Capto Q 음이온 교환 크로마토그래피
Capto Q 음이온 교환 크로마토그래피의 경우 완충액은 Buffer A(Q)(50 mM Sodium phosphate, pH 7.0)와 Buffer B(Q)(50 mM Sodium phosphate, 1 M Sodium chloride, pH 7.0)를 사용하였으며 플로우-쓰루 방식으로 진행하였다. 이의 결과는 도 9에 나타내었다.
Capto adhere 다중형 크로마토그래피
Capto adhere 다중형 크로마토그래피의 경우 완충액은 Buffer A(Ad)(50 mM Sodium phosphate, pH 7.0)와 Buffer B(Ad)(50 mM Sodium phosphate, pH 5.0), 및 Buffer C(Ad)(20 mM Sodium phosphate, 150 mM Sodium chloride, pH 2.0)를 사용하였으며, 같은 시료를 로딩하는 조건에서 결합-용출 방식 (binding and elution mode)으로 진행하였다. 이의 결과는 도 10에 나타내었다.
Capto Q 크로마토그래피 및 Capto adhere 크로마토그래피에서 용출된 각 시료의 잔류 HCP (Host cell protein)는 Immunoenzymetric Assay for the Measurement of CHO Host Cell Protein kit(GYGNUS, F550)를 이용하여 분석하였다. 이의분석 결과는 도 11에 나타내었다. 또한, 아래 표 2는 HIC (Hydrophobic interaction chromatography)와 AEX (Anion Exchange chromatography) 공정이 포함된 각 정제단계에서 얻은 잔류 HCP 결과 값을 나타낸다. 또한, 아래 표 3은 다중형 크로마토그래피 공정이 포함된 각 정제단계에서 얻은 잔류 HCP 결과 값을 나타낸다. HCP 결과 값은 CHO 세포의 HCP를 ELISA방식으로 검출하는 미국 Cygnus사의 제품을 사용하여 측정하였다.
* AC: 단백질 A 크로마토그래피(Protein A Chromatography), HIC: 소수성 상호반응 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography), AEX: 음이온 교환 크로마토그래피(Anion Exchange chromatography)
* AC: 단백질 A 크로마토그래피, Depth filtration: 심층여과, UF: 한외여과(Ultrafiltration), MMC: 다중형 크로마토그래피(Multimodal chromatography), AEX:음이온 교환 크로마토그래피, DS: 약물(Drug Substance; 정제 원액), LOQ: 정량한계(limit of Quantitation)
상기 표 2 및 표 3에서 나타나는 바와 같이, 표 2의 공정(음이온 교환 크로마토그래피 이용)에서는 심층여과를 2회 수행하여야 HCP 를 낮출 수 있었던 반면, 표 3의 공정(다중형 크로마토그래피 이용)에서는 심층여과를 1회만 수행하여도 HCP 를 낮출 수 있었다.
아래 표 4는 각 정제단계에 따른 HCP, HCD, Protein A 용출액 및 엔도톡신 함량을 나타낸다. 또한, 아래 표 5는 정제방법에 따른 바이러스 잔류량을 나타낸다.
HCP는 CHO 세포의 Protein를 ELISA방식으로 검출하는 미국 Cygnus사의 제품을 사용하여 측정하였고, HCD는 CHO 세포의 DNA를 RT-PCR(Real Time - Polymerase Chain Reaction, 실시간 중합효소 연쇄반응) 방식으로 검출하는 Applied Biosystems사의 제품을 사용하여 측정하였다. Protein A 누수액 (leachate)은 Protein A 레진의 리간드가 누수되어 있는 함량을 ELISA 방식으로 검출하는 Repligen사의 제품을 사용하여 측정하였다. 엔도톡신 함량은 제품에 포함되어 있는 엔도톡신의 함량은 미국약전에 제시된 방법으로 검출하는 Chales River사의 제품을 사용하여 측정하였다.
LRV는 각 공정이 바이러스를 제거할 수 있는 공정인지 확인하기 위하여 일정량의 바이러스를 주입하여 각 공정을 수행한 후에 바이러스의 잔량을 측정하는 것으로서, 공지된 방법을 사용하였다.
표 5의 Low pH treatment는 실시예 3이고 Capto Adhere는 실시예 5 공정이며, 및 바이러스 필터링(Virus filtration)은 실시예 6 이후에 수행되는 공정을 나타낸다.
* HCCF: 배양액(Harvested cell culture fluid), PA: 단백질 A 크로마토그래피, Depth filtration: 심층여과, UF: 한외여과(Ultrafiltration), MMC: 다중형 크로마토그래피(Multimodal chromatography), CEX: 양이온 교환 크로마토그래피(Cation exchange chromatography), UF/DF: 한외여과/투석여과(ultrafiltration/diafiltration). HCP: 숙주세포 단백질(Host cell protein), HCD: 숙주세포 DNA(Host cell DNA), Protein A leachate: 단백질 A 침출수, Endotoxin: 엔도톡신
* LRV: 로그 환원 값(log-reduction value), Minimum LRV: 최소 LRV(minimum light reflectance value), MVM: 마우스 미세 바이러스(Minute Virus of Mice), MuLV: 뮤린 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus), Reo-3: 레오바이러스 3형(Reovirus Type 3), PrV: 슈도라비스 바이러스(Pseudorabies virus).
[실시예 8] 정제 애플리버셉트의 Oxidation/ Deamidation/ Dehydration 분석
본 발명의 방법으로 정제한 애플리버셉트 시료 (Aflibercept 1)와 상업적으로 판매되고 있는 애플리버셉트 시료 (Aflibercept 2)를 사용하여 이들의 산화, 탈아미드화, 및 탈수를 분석하였다.
실시예 1 내지 6으로부터 수득한 정제 애플리버셉트 시료 1 mg과 1 M 디티오트레이톨(dithiothreitol) 10 ul을 혼합하여 변성 완충제(7 M Guanidine hydrochloride, 0.25 M Tris-HCl, pH 8.4)를 1 ml으로 조제하여 37 ℃에서 1시간 반응하여 단백질 시료를 환원시켰다. 이 후 1 M 요오드아세트아미드 (iodoacetamide) 10 ul을 상기 환원된 용액에 첨가하여 1 시간 동안 반응하여 알킬화(Alkylation) 시켰다. 여과 원심분리 용기(Centrifugal filter tube)를 이용하여 완충용액을 50mM Tris-HCl (pH 7.8)로 치환하고, 이렇게 제조된 시료 50ul과 1mg/mL 트립신(Trysin) 2ul을 혼합하여 37 ℃에서 18시간 반응하여 단백질을 펩타이드로 분해하였다. 이렇게 얻은 각 시료의 펩타이드 시료는 RP-UPLC(Reverse-phase ultraperformance chromatography, 미국 ThermoFisher사)와 Q-TOF(Online electrospray ionization mass spectrometry absorption, 미국 ThermoFisher사)로 LC-MS 분석과 LC-MS/MS 분석을 각각 수행하였고, 이 결과를 Byonic software (미국 Protein Metrics사)를 이용하여 분석하였다.
산화(Oxidation) 분석 결과는 산화되는 아미노산 종류에 따라 메티오닌 잔기의 산화 분석 결과(10, 163, 192, 및 237 번째 아미노산)를 도 12에 나타내었고, 히스티딘 잔기의 산화 분석 결과는 도 13(19, 209, 및 253번째 아미노산)에 나타내었다. 탈아미드화(Deamidation) 및 탈수(Dehydration) 분석 결과는 각각 도 14 및 도 15에 나타내었다(84, 91, 99, 152, 180, 261, 271, 300, 346, 369, 374, 및 375 번째 아미노산; 및 2, 47, 52, 102, 173, 179, 234, 250, 255, 279, 341, 384, 386, 398 번째 아미노산).
도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 산화(Oxidation)의 경우에는 대부분 메티오닌(Methionine) 잔기에서 발생하며, 일부 히스티딘(Histidine) 잔기에서 관찰되나 트립토판(Tryptophan) 잔기에서는 관찰되지 않았다.
메티오닌 산화 부위는 Methionine #10 (M10), Methionine #163 (M163), Methionine #192 (M192) 및 Methionine #237 (M237) 4개의 아미노산 잔기에서 관찰되었다. 산화 정도는 모두 10%이하이고, 본 발명의 방법으로 정제한 시료(Aflibercept 1)와 상업적으로 판매하고 있는 시료 (Aflibercept 2)에서 유사한 결과를 얻었다.
히스티딘 산화 부위는 Histidine #19 (H19), Histidine #209 (H209), 및 Histidine #253 (H253), 3개의 아미노산 잔기에서 관찰되었으며, 산화된 정도는 모두 0.5%이하이고, 본 특허의 방법으로 정제한 시료 (Aflibercept 1)와 상업적으로 판매하고 있는 시료 (Aflibercept 2)에서 유사한 결과를 얻었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 탈아미드화(Deamidation)는 일부 아스파라진(Asparagine) 및 글루타민(Glutamine) 잔기에서 관찰되었다. 탈아미드화 부위는 Asparagine #84 (N84), Asparagine #91 (N91), Asparagine #99 (N99), Asparagine #152 (N152), Glutamine #180 (Q180), Asparagine #261/#271 (N261/N271), Asparagine #300 (N300), Asparagine #346 (N346), 및 Asparagine #369/#374/#753 (N369/N374/N753), 9곳의 아미노산 잔기에서 관찰되었다. N261/N271, N369/N374/N753의 경우에는 병기되어 있는 위치의 아스파라진 잔기 중의 한 곳에서 탈아미드화가 일어난 것은 확인되었지만, 정확히 어느 잔기인지까지 분석은 하지 않은 것이다. 이 중 N84의 탈아미드화된 정도가 12.8% 및 11.4%인 것을 제외하고는 모두 10% 이하이고, 본 발명의 방법으로 정제한 시료 (Aflibercept 1)와 상업적으로 판매하고 있는 시료 (Aflibercept 2)에서 유사한 결과를 얻었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 탈수(Dehydration)는 일부 아스파르트산(Aspartate) 잔기에서 관찰되었다. 탈수 부위는 Aspartate #2 (D2), Aspartate #39 (D39), Aspartate #47/#52 (D47/D52), Aspartate #102 (D102), Aspartate #173 (D173), Aspartate #179 (D179), Aspartate #234 (D234), Aspartate #250/#255 (D250/D255), Aspartate #297 (D297), Aspartate #341 (D341), 및 Aspartate #384/#386 (D384/386)을 포함하는 11곳의 아미노산 잔기에서 관찰되었다. 탈수된 정도는 모두 10%이하이고, 본 특허의 방법으로 정제한 시료 (Aflibercept 1)와 상업적으로 판매하고 있는 시료 (Aflibercept 2)가 유사한 결과를 얻었다.
상기 결과들은 본 발명의 방법으로 정제한 애플리버셉트 시료 (Aflibercept 1)와 상업적으로 판매되고 있는 애플리버셉트 시료 (Aflibercept 2) 모두 유사한 경향을 나타내므로, 본 발명의 정제방법도 효과적으로 애플리버셉트를 정제할 수 있음을 시사한다.
[실시예 9] 정제 애플리버셉트의 소수성 상호반응 크로마토그래피 및 각 분획 분석
본 발명의 방법으로 정제한 애플리버셉트(Aflibercept 1)와 상업적으로 판매되고 있는 정제 애플리버셉트(Aflibercept 2)의 소수성 상호반응 크로마토그래피 분석을 진행하였다. 이동상 A의 조성은 50 mM 인산 나트륨, 2 M 염화 나트륨, pH 7.0이며, 이동상 B의 조성은 50 mM 인산 나트륨, 30% 아세토나이트릴 pH 7.0으로 하였다. 분석 컬럼은 TSKGel® Phenyl-5PW (TOSOH, Cat No. 0007573)이고, 분석 조건은 컬럼 오븐 온도 30 ℃, 1 mL/min 유속으로 15분간 이동상 B 비율을 0%에서 90% 높이면서 용출한다. 이 분석에는 본 발명의 방법으로 정제한 애플리버셉트 시료 (Aflibercept 1)와 상업적으로 판매되고 있는 애플리버셉트 시료 (Aflibercept 2)를 사용하였고, 아래 표 6에 나타난 정제 애플리버셉트 소수성 상호반응 크로마토그래피 분획별 비율과 같이 두 애플리버셉트 시료에서 유사한 결과를 얻었다. Peak 1은 이동상 B의 비율이 40-45% 구간에서 용출되며, Peak 2는 이동상 B의 비율이 50-55% 구간에서 용출되며, Peak 3는 이동상 B의 비율이 70-80% 구간에서 용출되었다.
| Aflibercept 1 | Aflibercept 2 | |
| Peak 1 | 0.88% | 1.76% |
| Peak 2 | 91.86% | 90.58% |
| Peak 3 | 7.26% | 7.66% |
HI-HPLC 분석에서 관찰되는 Peak 1과 Peak 2 분획의 단백질을 LC-MS를 이용하여 환원형(Reduced form) 및 탈글리코실형(deglycosylated form)의 Intact mass 분석을 진행하였다. Peak 1 분획의 Intact mass 분석 결과, 아래 표 7과 같은 정제 애플리버셉트 소수성 상호반응 크로마토그래피 분획 Peak 1의 단백질 단편(Peptide fragment) 분석 결과에 나타난 아미노산 서열을 갖는 단백질 단편들이 분석되었다. 그 중 202-431 peptide가 Major form으로 분석되었으며(peak 1-d), 이는 VEGFR1 domain 2 부분과 VEGFR2 domain 3 부분이 대부분 결실된 폼으로 예상된다. Peak 2 분획은 세부적으로 Peak 2-1, Peak 2-2, Peak 2-3으로 구분되는데 해당 분획들간의 Intact mass 분석결과에서는 차이가 보이지 않았다.
| M.W | Seq. | Theoretical (Da) | ||||
| Peak1-a | 24934.0 | 210 | 431 | - | 24938.3 | -4.3 |
| Peak1-b | 25172.0 | 208 | 431 | +TH | 25176.5 | -4.5 |
| Peak1-c | 25810.0 | 203 | 431 | +HEKDKTH | 25814.3 | -4.3 |
| Peak1-d | 25909.5 | 202 | 431 | +VHEKDKTH | 25913.4 | -3.9 |
HI-HPLC 분석에서 관찰되는 Peak1과 Peak2 분획의 단백질을 LC-MS를 이용하여 번역후 변형(Post-translational modification) 분석을 진행하였다. 아래 표 8에 나타난 정제 애플리버셉트 소수성 상호반응 크로마토그래피 분획의 Deamidation 분석 결과와 같이 아스파라진 잔기의 탈아미드화의 경우 Peak 1 분획과 Peak2 분획들간의 차이가 없이 유사하게 분석되었다.
| Peak 1 | Peak 2-1 | Peak 2-2 | Peak 2-3 | |
| N68 | 1% | 1% | 1% | 1% |
| N84 | 28% | 27% | 27% | 28% |
| N99 | 4% | 5% | 2% | 2% |
| N271 | 1% | 1% | 1% | 1% |
| N300 | 10% | 9% | 9% | 10% |
| N369/N374/N375 | 4% | 4% | 4% | 4% |
아래 표 9에 나타난 정제 애플리버셉트 소수성 상호반응 크로마토그래피 분획의 Methionine oxidation 분석 결과와 같이, 메티오닌 잔기의 산화의 경우 Peak1 분획의 단백질이 Peak 2 분획의 단백질들에 비해 2~3 배 정도 산화된 것을 확인하였다. T1 peptide의 M10/M20과, T28 펩타이드의 M237 모두 산화가 증가하였다.
| Peak 1 | Peak 2-1 | Peak 2-2 | Peak 2-3 | |
| M10/M20 | 7% | 4% | 2% | 2% |
| M237 | 10% | 6% | 3% | 3% |
[실시예 10] 정제 애플리버셉트의 소수성 상호반응 크로마토그래피 및 각 분획의 Anti-VEGF bioassay 분석
HI-HPLC 분석에서 관찰되는 Peak1과 Peak2 분획의 단백질의 활성을 평가하기 위하여 PathHunter Anti-VEGF bioassay (미국 Eurofins Discoverx사)를 진행하였다. VEGF에 반응하는 PathHunter 세포를 배양액에 정제 애플리버셉트의 소수성 상호반응 크로마토그래피 각 분획을 혼합하여 VEGF의 결합에 어떠한 영향을 미치는가를 표준품과 함께 비교하여 각 분획의 활성을 측정하였다.
Peak 1 분획의 경우 상대 역가가 6.6%로 분석되었으며, VEGFR domain이 결실되어 활성이 감소한 것으로 확인되었다. Peak 2 분획은 상대 역가가 유지되는 것으로 분석되어 활성의 감소가 없는 것으로 확인되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (25)
- IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 함유 원료에 대한 다중형 (multimodal) 크로마토그래피 정제 단계를 수행하여 엔도톡신 < 0.05 EU/mg 또는 크기 배제 HPLC 순도 98% 이상인 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 얻는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 정제 단계가 부가된, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호반응 (hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 및 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하지 않는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 다중형 크로마토그래피의 리간드로 이온성 결합, 수소 결합 및 소수성 결합의 다중형 기능을 갖는 물질을 포함하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 2에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 술폰산 (-SO3), 술포프로필 (Sulfopropyl) 및 카복시메틸 (Carboxymethyl) 중 한 가지 이상을 포함하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 크로마토그래피 정제 단계에서 용출은 pH 구배를 이용하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 크로마토그래피는 용출 단계를 포함하며, 상기 용출 단계는 결합-용출 방식 (binding and elution mode)으로 수행하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질은 혈관 내피세포 성장 인자 길항제인, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질은 애플리버셉트(Aflibercept)인, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 가) IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 단계;
나) 상기 가)에서 배양한 세포로부터 단백질을 회수하는 단계;
다) 상기 나)에서 회수한 단백질을 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계;
라) 상기 다)에서 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 다중형 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하며,
음이온 교환 크로마토그래피를 사용하지 않는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법의 최종 정제된 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질은 크기 배제 HPLC 순도 98% 이상, 엔도톡신 < 0.05 EU/mg 또는 pI 6.0 ~ 8.0인, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질은 혈관 내피세포 성장 인자 길항제인, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질은 애플리버셉트인, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 라) 다중형 크로마토그래피로 정제하는 단계는
(a) pH 6 ~ 8의 완충용액으로 평형화된 다중형 크로마토그래피 칼럼에 1차 크로마토그래피로 정제한 단백질을 로딩하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계보다 낮은 pH의 완충용액을 크로마토그래피 칼럼에 주입하여 pH 6~4의 조건에서 정제 단백질을 용출하고 수획하는 단계;를 포함하는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 다중형 크로마토그래피의 리간드로 이온성 결합, 수소 결합 및 소수성 결합의 다중형 기능을 갖는 물질을 포함하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 라) 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계는
(a) pH 4 ~ 6의 완충용액으로 평형화된 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 선행 크로마토그래피 정제 단백질을 로딩하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 완충용액보다 높은 pH의 완충용액으로 용출하여 pI 6.0 ~ 8.0의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 수획하는 단계;를 포함하는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 16에 있어서,
상기 (b) 단계에서는 (a) 단계의 완충용액보다 높은 pH의 완충용액은 pH 5-8인, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 술폰산 (-SO3), 술포프로필 (Sulfopropyl) 및 카복시메틸 (Carboxymethyl) 중 한 가지 이상을 포함하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 다중형 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 중 하나 이상은 용출 단계를 포함하며, 상기 용출 단계는 결합-용출 방식 (binding and elution mode)으로 수행하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법은 크기 배제 크로마토그래피 및 소수성 상호반응 (hydrophobic interaction) 크로마토그래피를 수행하지 않는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 다) 및 라) 중 어느 하나 이상의 단계 이전, 이후, 또는 이들의 조합에 심층여과 단계, 한외여과 단계, 투석여과 단계 및 바이러스 불활화 단계 중 하나 이상이 부가 수행되는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 10에 있어서,
상기 다) 1차 크로마토그래피로 정제하는 단계; 라) 다중형 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단계는 용출 단계를 포함하며, 상기 용출 단계는 pH 구배를 이용하는, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질 정제 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 10의 정제 방법으로 정제된, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 조성물.
- 청구항 23에 있어서,
상기 조성물은 소수성 상호반응 크로마토그래피 분석 시 50 mM 인산 나트륨, 2 M 염화 나트륨, pH 7.0인 이동상 A 및 50 mM 인산 나트륨, 30% 아세토나이트릴 pH 7.0인 이동상 B에서 이동상 B의 비율이 40 내지 45% 구간에서 용출되는 피크 1 분획물을 포함하는 것인, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 조성물.
- 청구항 24에 있어서, 상기 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 조성물은 피크 1 분획물을 5% 이하로 포함하는 것인, 조성물.
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