TW202028247A - Pd-1單一域抗體及其之治療組合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供特異性結合PD-1之結合多肽。更具體而言，本文提供結合PD-1之融合蛋白，其包含多價及/或多特異性構築體及嵌合抗原受體。本文亦提供含有該等多肽之醫藥組合物、編碼該等多肽之核酸分子以及其載體及細胞，及該等所提供PD-1結合多肽之使用方法及該等多肽用於治療疾病及病狀(例如癌症)之用途。

Description

PD-1　單一域抗體及其之治療組合物
本發明概言之提供特異性結合PD-1之結合多肽。更具體而言，本發明係關於至少結合PD-1之包含多價及/或多特異性構築體及嵌合分子之融合蛋白。本發明亦提供編碼該等多肽之核酸分子以及其載體及細胞及該等所提供PD-1結合多肽之使用方法及該等多肽用於治療疾病及病狀(例如癌症)之用途。
PD-1係免疫細胞調節分子之免疫球蛋白超家族之成員。其表現於經活化T細胞之表面上。經活化T細胞上之PD-1表現由腫瘤微環境中腫瘤細胞及基質細胞之PD-L1靶向以抑制免疫反應，由此使得阻斷或靶向PD-1之藥劑成為期望治療靶。需要靶向PD-1之改良之治療分子及藥劑。本文提供滿足該等需要之實施例。
相關申請案
本申請案主張2018年10月11日提出申請之美國臨時申請案第62/744,615號及2019年1月11日提出申請之美國臨時申請案第62/791,152號之權益，該等申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
本文提供特異性結合至PD-1之多肽，其在下文中亦稱為PD-1結合多肽。在一些實施例中，所提供結合多肽包括至少一個結合PD-1之VHH域。在一些實施例中，本文所提供之PD-1結合多肽包括1、2、3、4、5、6、7或8個各自個別地結合PD-1之VHH域。在一些實施例中，本文所提供之PD-1結合多肽包括1、2、3或4個結合PD-1之VHH域。在一些實施例中，PD-1結合多肽係單特異性。在一些實施例中，PD-1結合多肽係多特異性。舉例而言，所提供PD-1結合多肽包含可包括至少一個結合PD-1之VHH域及一或多個結合一或多種除PD-1外之靶蛋白之其他結合域(例如一或多個其他VHH域)之多肽。
在一些實施例中，PD-1結合多肽包括至少一個結合PD-1之VHH域及Fc域。在一些實施例中，本文所提供之PD-1結合多肽包括1、2、3或4個結合PD-1之VHH域及Fc域。在一些實施例中，Fc域調介PD-1結合多肽在生理學條件下之二聚合，從而形成PD-1結合位點數加倍之二聚體。舉例而言，包括三個結合PD-1之VHH域及Fc區之PD-1結合多肽在作為單體時係三價，但在生理學條件下，Fc區可調介二聚合，從而PD-1結合多肽在該等條件下以六價二聚體形式存在。
程式性細胞死亡蛋白-1 (PD-1)係I型膜蛋白且係T細胞調控因子PD-1之擴展CD28/CTLA-4家族之成員(The EMBO Journal (1992), vol. 11，第11期，p. 3887-3895)。據報導，在藉由來自抗原受體之刺激活化之骨髓樣細胞(包含T細胞或B淋巴球)或經活化巨噬球中，觀察到周邊中之PD-1表現(International Immunology (1996), vol. 18，第5期，p. 765-772)。亦展示，PD-1在細胞表面上之表現經由IFN-γ刺激而上調。已鑑別出PD-1之兩種細胞表面醣蛋白配體PD-L1及PDL-2，且該等配體已展示在結合至PD-1時下調T細胞活化及細胞介素分泌(Freeman等人(2000) J. Exp. Med. 192:1027-34；Latchman等人(2001) Nat. Immunol. 2:261-8；Carter等人(2002) Eur. J. Immunol. 32:634-43；Ohigashi等人(2005) Clin. Cancer Res. 11:2947-53)。PD-1 (B7-H1)及PD-L2 (B7-DC)皆係結合至PD-1之B7同系物。PD-L1及PD-L2通常表現於T細胞、B細胞及骨髓樣細胞之表面上。PD-L1及PD-L2係免疫活化之負性調控因子且能夠經由與PD-1受體相互作用來下調免疫反應。在一些態樣中，PD-1表現於NK細胞及T細胞(包含CD4+及CD8+ T細胞)上，藉此嚙合PD-1可抑制細胞之活化、增殖及/或擴增。
人類PD-1之實例性序列陳述如下：MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL  (SEQ ID NO:286，信號序列加下劃線)
在一些情形下，所提供PD-1結合多肽直接阻斷或抑制PD-L1/L2與PD-1之間之相互作用。在一些實施例中，抑制或減小PD-Ll及/或PD-L2與PD-1之間之相互作用之所提供分子調節免疫反應。儘管傳輸抑制信號可下調免疫細胞反應(且最終下調整體免疫反應)，但阻斷免疫細胞中之抑制信號可上調免疫細胞反應(且最終上調免疫反應)。在一些情形下，藉由增強免疫反應來進行調節可用於治療免疫反應得以抑制之某些疾病或病狀(例如癌症)。在一些實施例中，可使用所提供PD-1結合多肽作為治療劑來抑制或減小腫瘤細胞之生長或存活。
提供各種PD-1多肽結合形式。在一些實施例中，本文所提供之PD-1多肽係二價，例如藉由與Fc蛋白融合。在一些實例中，PD-1結合多肽包含PD-1 VHH-Fc多肽。在一些實施例中，Fc係展現免疫效應活性(例如一或多種效應功能，例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC))之Fc。在其他實施例中，PD-1多肽可為含有至少一種其他分子之多特異性多肽。在一些實施例中，其他分子能夠與另一分子嚙合於腫瘤相關微環境中，例如與腫瘤相關抗原或免疫細胞(例如T細胞)嚙合。在特定實施例中，所提供PD-1多肽結合形式阻斷PD-1與PD-L1及/或PD-L1之間之相互作用且/或減小、抑制或阻抑細胞(例如T細胞)中由PD-1調介之抑制信號。
在一些實施例中，可使用所提供PD-1結合多肽來刺激個體中之免疫反應，此在一些態樣中可治療個體之疾病或病症(例如癌症)。在一些態樣中，本文所提供之PD-1結合多肽(例如PD-1-Fc)可結合至PD-1表現細胞且阻斷其與免疫突觸中之毗鄰細胞(例如腫瘤細胞)上之PD-L1及/或PD-L2的相互作用，此在一些態樣中可誘導環境中之主動免疫反應。在一些情形下，主動免疫反應可抑制癌細胞之生長(例如阻斷細胞週期進展)。
在其他態樣中，本文亦提供展現多特異性結合之VHH結合多肽。在一些情形下，該等結合多肽包含對PD-1及腫瘤相關抗原(TAA)展現雙重親和力之多肽。替代地或另外，PD-1結合多肽包含對PD-1及T細胞抗原(例如CD3)展現親和力之多肽。在一些態樣中，該等多特異性分子能夠在結合至腫瘤或T細胞時嚙合或活化腫瘤位點處之T細胞且同時阻斷PD-1及PD-L1/PD-L2之相互作用以減小T細胞中之抑制信號。特定而言，在該等分子中，本文尤其提供展現限制性CD3結合之分子。本文亦提供表現嵌合抗原受體且能夠分泌PD-1結合多肽之經改造細胞，例如經改造T細胞。
出於所有目的，本申請案中所提及之所有出版物(包含專利文件、科學論文及資料庫)之全部內容以引用方式併入本文中，其併入程度如同將每一個別公開案個別地以引用方式併入一般。若本文所陳述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他出版物中所陳述之定義相反或不一致，則本文所闡述定義優先於以引用方式併入本文中之定義。
通常已充分理解本文所闡述或參考之技術及程序且通常由熟習此項技術者使用習用方法來採用，例如以下文獻中所闡述之廣泛利用之方法：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編輯(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames及G. R. Taylor編輯(1995)), Harlow及Lane編輯(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney等人(1987))；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編輯1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編輯，1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney編輯)1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths及D. G. Newell編輯，1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller及M. P. Calos編輯，1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編輯，1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編輯，IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編輯，Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編輯，Harwood Academic Publishers, 1995)；及Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita等人編輯，J.B. Lippincott Company, 1993)；及其更新版本。
本文所用之各部分標題僅出於組織性目的，且不應視為限制所闡述標的物。 I. 定義
除非另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解之含義。另外，除非上下文另外需要或明確指示，否則單數術語應包含複數形式且複數術語應包含單數形式。若各種來源或參考文獻之間之定義出現任何衝突，則以本文所提供之定義為準。
應理解，本文所闡述之本發明實施例包含「由實施例組成」及/或「基本上由實施例組成」。如本文中所使用，除非另外指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包含複數個指示物。本文所用之術語「或」並不意欲暗示替代項相互排斥。
在本申請案中，除非熟習此項技術者明確陳述或理解，否則所用之「或」意指「及/或」。在多重附屬請求項之背景中，所用之「或」重新提及一個以上前述獨立或附屬請求項。
本文所用之術語「約」係指熟習本技術領域者易於瞭解之各別值之一般誤差範圍。提及「約」某一值或參數在本文中包含(且闡述)涉及該值或參數本身之若干實施例。舉例而言，提及「約X」之說明包含對「X」之說明。
術語「核酸分子」、「核酸」及「多核苷酸」可互換使用，且係指核苷酸聚合物。該等核苷酸聚合物可含有天然及/或非天然核苷酸，且包含但不限於DNA、RNA及PNA。「核酸序列」係指核酸分子或多核苷酸中所包括之核苷酸線性序列。
本文所用之術語「經分離多核苷酸」應意指基因體、cDNA或合成來源之多核苷酸或其一定組合，其根據來源具有以下性質：(1)不與發現於自然界中之所有或一部分多核苷酸締合，(2)可操作地連接至本質上不連接之多核苷酸，或(3)並不作為較大序列之一部分出現於自然界中。
術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。胺基酸殘基之該等聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基，且包含(但不限於)肽、寡肽、二聚體、三聚體及胺基酸殘基之多聚體。該定義涵蓋全長蛋白與其片段二者。該等術語亦包含多肽之表現後修飾，例如醣基化、唾液酸化、乙醯基化、磷酸化及諸如此類。此外，出於本發明目的，「多肽」係指在天然序列中包含修飾(例如缺失、添加及取代(通常為保守性))之蛋白質，只要蛋白質維持期望活性即可。該等修飾可能是特意進行的，如經由定點誘變；或可為偶然發生的，例如經由產生蛋白質的宿主突變，或由於PCR擴增而引起的誤差。
本文所提及之術語「經分離蛋白質」意指，標的蛋白(1)不含至少一些通常與其一起發現於自然界中之其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同來源(例如來自相同物種)之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已與至少約50%之與其在自然界中締合之多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他材料分離，(5)不與同「經分離蛋白質」在自然界中締合之蛋白質部分締合(藉由共價或非共價相互作用)，(6)與不與其在自然界中締合之多肽可操作地締合(藉由共價或非共價相互作用)，或(7)不出現於自然界中。此一經分離蛋白質可由基因體DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼，可為合成來源，或係其任一組合。在某些實施例中，經分離蛋白質實質上純或實質上不含在其天然環境中所發現將干擾其應用(治療、診斷、防治、研究或其他用途)之蛋白質或多肽或其他污染物。
如本文中所使用，「實質上純」意指目標物質係所存在之主要物質(亦即，基於莫耳濃度，其比組合物中之任何其他個別物質更豐富)，且實質上經純化之部分係其中目標物質佔所存在所有大分子物質之至少約50% (基於莫耳濃度)之組合物。通常，實質上純之組合物佔組合物中所存在之所有大分子物質之大於約80%，例如在一些實施例中大於約85%、90%、95%及99%。在一些實施例中，將目標物質純化至基本上均質(藉由習用檢測方法在組合物中無法檢測到污染物物質)，其中組合物基本上由單一大分子物質組成。
本文所用之術語「可操作地連接」係指由此所闡述組分之位置處於允許其以其預期方式發揮作用之關係中。「可操作地連接」至編碼序列之控制序列係以使得在與該等控制序列相容之條件下達成該編碼序列之表現的方式來連接。
術語「特異性結合」至抗原或表位係業內充分理解之術語，且測定該特異性結合之方法亦在業內眾所周知。若某一分子與特定細胞或物質較頻繁、較快、以較大持續時間及/或以較大親和力發生反應或締合(較替代細胞或物質)，則該分子可視為展現「特異性結合」或「優先結合」。若單一域抗體(sdAb)或含VHH多肽與其結合至其他物質相比以較大親和力、親合力、較易於及/或以較大持續時間結合，則其「特異性結合」或「優先地結合」至靶。舉例而言，特異性或優先地結合至PD-1表位之sdAb或含VHH多肽係與其結合至其他PD-1表位或非PD-1表位相比以較大親和力、親合力、較易於及/或以較大持續時間結合此表位之sdAb或含VHH多肽。藉由閱讀此定義亦理解；舉例而言，特異性或優先地結合至第一靶之sdAb或含VHH多肽可或可不特異性或優先地結合至第二靶。因此，「特異性結合」或「優先地結合」不一定需要(但其可包含)排他性結合。通常但不一定，在提及結合時意指優先結合。「特異性」係指結合蛋白選擇性結合抗原之能力。
如本文中所使用，術語「表位」係指靶分子(例如抗原，例如蛋白質、核酸、碳水化合物或脂質)上為抗原結合分子(例如之sdAb或含VHH多肽)所結合之位點。表位通常包含分子之化學活性表面基團(例如胺基酸、肽或糖側鏈)且具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。表位可自靶分子之鄰接及/或並置非鄰接殘基(例如胺基酸、核苷酸、糖、脂質部分)形成。在暴露於變性溶劑時，通常保留自鄰接殘基(例如胺基酸、核苷酸、糖、脂質部分)形成之表位，而在使用變性溶劑處理時通常丟失藉由三級摺疊形成之表位。表位可包含(但不限於)至少3個、至少5個或8-10個殘基(例如胺基酸或核苷酸)。在一些實施例中，表位之長度小於20個殘基(例如胺基酸或核苷酸)、小於15個殘基或小於12個殘基。若兩種抗體對抗原展現競爭性結合，則其可結合抗原內之相同表位。在一些實施例中，可藉由至抗原結合分子上之CDR殘基之某一最小距離來鑑別表位。在一些實施例中，可藉由上述距離來鑑別表位，且進一步限於彼等涉及抗原結合分子之殘基與抗原殘基之間之鍵(例如氫鍵)之殘基。亦可藉由各種掃描來鑑別表位，舉例而言，丙胺酸或精胺酸掃描可指示抗原結合分子可相互作用之一或多種殘基。除非明確指示，否則作為表位之殘基組並不排除將其他殘基作為用於特定抗原結合分子之表位之一部分。而是，此一組之存在指示表位之最小系列(或種類組)。因此，在一些實施例中，鑑別為表位之殘基組指示用於抗原之最小相關表位，而並不指示用於抗原上表位之殘基之排他性清單。
「非線性表位」或「構形表位」包括抗原性蛋白內表位特異性抗原結合分子所結合之非鄰接多肽、胺基酸及/或糖。在一些實施例中，至少一個殘基與表位之其他所述殘基為非鄰接；然而，一或多個殘基亦可與其他殘基鄰接。
「線性表位」包括抗原性蛋白內表位特異性抗原結合分子所結合之鄰接多肽、胺基酸及/或糖。應注意，在一些實施例中，並非線性表位內之每一殘基皆需要由抗原結合分子直接結合(或涉及鍵)。在一些實施例中，線性表位可來自使用由線性表位之序列有效組成之肽之免疫化，或來自蛋白質中與蛋白質之其餘部分相對分離(從而抗原結合分子可至少主要僅與該序列部分相互作用)之結構部分。
術語「抗體」及「抗原結合分子」可在最廣泛意義上互換使用且涵蓋各種包括抗體樣抗原結合域之多肽，包含(但不限於)習用抗體(通常包括至少一條重鏈及至少一條輕鏈)、單一域抗體(sdAb，僅包括一條通常類似於重鏈之鏈)、含VHH多肽(包括至少一個唯一重鏈抗體可變域或VHH之多肽)及前述物質中之任一者之片段(只要其展現期望抗原結合活性即可)。在一些實施例中，抗體包括二聚合域。該等二聚合域包含(但不限於)重鏈恆定域(包括CH1、鉸鏈、CH2及CH3，其中CH1通常與輕鏈恆定域CL配對，而鉸鏈調介二聚合)及Fc域(包括鉸鏈、CH2及CH3，其中鉸鏈調介二聚合)。
術語抗體亦包含(但不限於)嵌合抗體、人類化抗體及各種物種(例如駱駝科(包含駱馬)、鯊魚、小鼠、人類、食蟹猴等)之抗體。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合之域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變區(分別為VH 及VL )通常具有類似結構，其中各域包括4個保守框架區(FR)及三個CDR。(參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H. Freeman and Co.，第91頁(2007)。單一VH 或VL 域可足以賦予抗原結合特異性，例如單一域抗體，例如VHH。另外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH 或VL 域分離以分別篩選互補VL 或VH 域之庫。例如參見Portolano等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628 (1991)。
「抗體片段」或「抗原結合片段」係指除習用或完整抗體外之分子，其包括習用或完整抗體中至少含有結合抗原之可變區之部分。抗體片段之實例包含(但不限於) Fv、單鏈Fv (sdFv)、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 ；二價抗體；線性抗體；僅包括VH 區域(VHH)之單一域抗體。
如本文中所使用，提及結合分子之「單價」係指具有對靶抗原具有特異性之單一抗原識別位點之結合分子。單價結合分子之實例包含(例如)單價抗體片段、具有抗體樣結合性質之蛋白質性結合分子或MHC分子。單價抗體片段之實例包含(但不限於) Fab片段、Fv片段及單鏈Fv片段(scFv)。
術語「單一域抗體」、「sdAb」、「VHH」可在本文中互換使用且係指具有單一單體域抗原結合/識別域之抗體。該等抗體包含駱駝科抗體或鯊魚抗體。在一些實施例中，VHH包括三個CDR及四個框架區，其命名為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在一些實施例中，VHH可在N-末端或C-末端處截短，從而其僅包括部分FR1及/或FR4，或缺乏該等框架區中之一者或兩者，只要VHH實質上維持抗原結合及特異性即可。
術語「含VHH多肽」係指包括至少一個VHH域之多肽。在一些實施例中，VHH多肽包括兩個、三個或四個或更多個VHH域，其中每一VHH域可相同或不同。在一些實施例中，含VHH多肽包括Fc域。在一些該等實施例中，VHH多肽可形成二聚體。含VHH多肽之非限制性結構包含VHH1 -Fc、VHH1 -VHH2 -Fc及VHH1 -VHH2 -VHH3 -Fc，其中VHH1 、VHH2 及VHH3 可相同或不同。在該等結構之一些實施例中，一個VHH可藉由連接體連結至另一VHH，或一個VHH可藉由連接體連結至Fc。在一些該等實施例中，連接體包括1-20個胺基酸、較佳地1-20個主要由甘胺酸及視情況絲胺酸構成之胺基酸。在一些實施例中，在含VHH多肽包括Fc時，其形成二聚體。因此，若形成二聚體，則結構VHH1 -VHH2 -Fc可視為四價(亦即，該二聚體具有4個VHH域)。類似地，若形成二聚體結構，則VHH1 -VHH2 -VHH3 -Fc可視為六價(亦即，該二聚體具有6個VHH域)。
如本文中所使用，PD-1結合多肽係特異性結合PD-1之多肽或蛋白質。通常，本文之PD-1結合多肽係含有至少一個結合PD-1之VHH域之含VHH多肽。PD-1結合多肽包含偶聯物(包含融合蛋白)。PD-1結合多肽包含融合蛋白(包含含有Fc域者)。在一些實施例中，PD-1結合多肽含有兩個、三個或四個或更多個各自特異性結合至PD-1之VHH域，其中每一VHH域可相同或不同。在一些實施例中，PD-1結合多肽係多價的。在一些實施例中，PD-1結合多肽係多特異性的。在一些情形下，PD-1結合多肽可含有一或多個結合至一或多個除PD-1外之其他或額外抗原之其他域。
術語「單株抗體」係指實質上均質之抗體群體之抗體(包含sdAb或含VHH多肽)，亦即，除可能存在極少量天然突變外，構成該群體之個別抗體相同。單株抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。另外，與通常包含針對不同決定子(表位)之不同抗體之多株抗體製劑不同，每一單株抗體針對抗原上之單一決定子。因此，單株抗體之試樣可結合至抗原上之相同表位。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上均質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。舉例而言，單株抗體可藉由首次由Kohler及Milstein, 1975, Nature 256:495闡述之雜交瘤方法製得，或可藉由(例如)美國專利第4,816,567號中所闡述之重組DNA方法製得。單株抗體亦自使用(例如) McCafferty等人，1990, Nature 348:552-554中所闡述之技術生成之噬菌體庫分離。
術語「CDR」表示如藉由熟習此項技術者已知之至少一種鑑別方式所定義之互補決定區。可易於使用諸多熟知方案中之任一者來測定既定CDR或FR之精確胺基酸序列邊界，包含由以下參考文獻所闡述者：Kabat等人(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人(1997) JMB 273,927-948 (「Chothia」編號方案)；MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,」 J. Mol. Biol. 262, 732-745. (「接觸」編號方案)；Lefranc MP等人，「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,」 Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (「IMGT」編號方案)；Honegger A及Plückthun A, 「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,」 J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (「Aho」編號方案)；及Martin等人，「Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,」 PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, (「AbM」編號方案)。
既定CDR或FR之邊界可端視用於鑑別之方案而有所變化。舉例而言，Kabat方案係基於結構比對，而Chothia方案係基於結構資訊。Kabat及Chothia方案之編號皆係基於最常見之抗體區域序列長度，其中插入由插入字母(例如「30a」)提供且缺失出現於一些抗體中。兩種方案在不同位置置入某些插入及缺失(「插入缺失」)，從而產生不同編號。接觸方案係基於複雜晶體結構之分析且在許多方面類似於Chothia編號方案。AbM方案係Kabat定義與Chothia定義之間之折衷方案，其係基於Oxford Molecular’s AbM抗體建模軟體所使用者。
在一些實施例中，可根據Chothia編號方案、Kabat編號方案、Kabat及Chothia之組合、AbM定義及/或接觸定義中之任一者來定義CDR。VHH包括三個CDR (命名為CDR1、CDR2及CDR3)。下文之表1列示如分別藉由Kabat、Chothia、AbM及接觸方案所鑑別之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之實例性位置邊界。對於CDR-H1而言，使用Kabat及Chothia編號方案來列示殘基編號。FR位於CDR之間，舉例而言，FR-H1位於CDR-H1之前，FR-H2位於CDR-H1與CDR-H2之間，FR-H3位於CDR-H2與CDR-H3之間，等等。應注意，因所展示Kabat編號方案在H35A及H35B處置入插入，故在使用所展示Kabat編號慣例編號時Chothia CDR-H1環之末端端視環長度在H32與H34之間有所變化。
表 1. 根據各種編號方案之CDR邊界。
CDR Kabat Chothia AbM 接觸
CDR-H1 (Kabat編號1 ) H31--H35B H26--H32..34 H26--H35B H30--H35B
CDR-H1 (Chothia編號2 ) H31--H35 H26--H32 H26--H35 H30--H35
CDR-H2 H50--H65 H52--H56 H50--H58 H47--H58
CDR-H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101
1 - Kabat等人，(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD 2 - Al-Lazikani等人(1997) JMB 273,927-948
因此，除非另外指定，否則既定抗體或其區域(例如其可變區)之「CDR」或「互補決定區」或個別指定CDR (例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)應理解為涵蓋如藉由上文所提及方案中之任一者所定義之一個(或特定)互補決定區。舉例而言，在陳述特定CDR (例如CDR-H3)含有既定VHH胺基酸序列中之相應CDR之胺基酸序列之情形下，應理解，此一CDR具有VHH內之相應CDR (例如CDR-H3)之序列，如藉由上文所提及方案中之任一者所定義。在一些實施例中，指定具體CDR序列。使用各種編號方案來闡述所提供抗體之實例性CDR序列(例如參見表1)，但應理解，所提供抗體可包含如根據其他上文所提及編號方案或熟習此項技術者已知之其他編號方案中之任一者所闡述之CDR。
如本文中所使用，「偶聯物」、「偶聯」或其語法變化形式係指藉由業內已知之任何接合或連接方法使兩種或更多種化合物接合或連接至一起以形成另一化合物。其亦可係指藉由使兩種或更多種化合物接合或連接至一起所生成之化合物。舉例而言，直接或間接連接至一或多個化學部分或多肽之VHH域係一實例性偶聯物。該等偶聯物包含融合蛋白、藉由化學偶聯產生者及藉由任何其他方法產生者。
免疫球蛋白Fc融合體(「Fc融合體」，例如VHH-Fc)係包括一或多個可操作地連接至免疫球蛋白之Fc區之VHH域之分子。免疫球蛋白Fc區可間接或直接連接至一或多個VHH域。業內已知各種連接體且可視情況用於將Fc連接至融合配偶體以生成Fc融合體。在一些該等實施例中，連接體包括1-20個胺基酸、較佳地1-20個主要由甘胺酸及視情況絲胺酸構成之胺基酸。相同物種之Fc融合體可發生二聚合以形成Fc融合體同源二聚體，或使用不同物種來形成Fc融合體異源二聚體。在一些實施例中，Fc係哺乳動物Fc (例如人類Fc)。
本文所用之術語「重鏈恆定區」係指包括至少三個重鏈恆定域CH 1、鉸鏈、CH 2及CH 3之區域。當然，除非另外指示，否則在術語「重鏈恆定區」之範圍內涵蓋域內之非功能改變性缺失及改變。非限制性實例性重鏈恆定區包含γ、δ及α。非限制性實例性重鏈恆定區亦包含ε及μ。每一重恆定區對應於抗體同型。舉例而言，包括γ恆定區之抗體係IgG抗體，包括δ恆定區之抗體係IgD抗體，且包括α恆定區之抗體係IgA抗體。另外，包括μ恆定區之抗體係IgM抗體，且包括ε恆定區之抗體係IgE抗體。某些同型可進一步再分成子類。舉例而言，IgG抗體包含(但不限於) IgG1 (包括γ1 恆定區)、IgG2 (包括γ2 恆定區)、IgG3 (包括γ3 恆定區)及IgG4 (包括γ4 恆定區)抗體；IgA抗體包含(但不限於) IgA1 (包括α1 恆定區)及IgA2 (包括α2 恆定區)抗體；且IgM抗體包含(但不限於) IgM1及IgM2。
本文所用之「Fc區」係指重鏈恆定區中包括CH2及CH3之部分。在一些實施例中，Fc區包括鉸鏈、CH2及CH3。在各個實施例中，在Fc區包括鉸鏈時，鉸鏈調介兩個含Fc多肽之間之二聚合。Fc區可為本文所論述之任一抗體重鏈恆定區同型之Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
「功能Fc區」擁有天然序列Fc區之「效應功能」。實例性「效應功能」包含Fc受體結合；Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下調細胞表面受體(例如B細胞受體)；及B細胞活化等。該等效應功能通常需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)進行組合且可使用各種分析來評價。
「天然序列Fc區」包括與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致之胺基酸序列。天然序列人類Fc區包含天然序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然變體。
「變體Fc區」包括因至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區不同之胺基酸序列。在一些實施例中，「變體Fc區」包括因至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區不同、但仍保留天然序列Fc區之至少一種效應功能之胺基酸序列。在一些實施例中，變體Fc區與天然序列Fc區相比或與親代多肽之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如天然序列Fc區或親代多肽之Fc區中之約1至約10個胺基酸取代，且較佳係約1至約5個胺基酸取代。在一些實施例中，本文之變體Fc區與天然序列Fc區及/或與親代多肽之Fc區擁有至少約80%之序列一致性、與其擁有至少約90%之序列一致性、與其擁有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之序列一致性。
一般而言，免疫球蛋白重鏈或其部分(例如Fc區)中殘基之編號係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, Md. (1991)中之EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「Fc受體」或「FcR」闡述與抗體Fc區結合之受體。在一些實施例中，FcγR係天然人類FcR。在一些實施例中，FcR係結合IgG抗體者(γ受體)且包含FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，包括彼等受體之對偶基因變體及選擇性剪接形式。FcγRII受體包含FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，二者具有類似胺基酸序列，其主要在其胞質結構域上有所不同。活化受體FcγRIIA在其胞質域抑制受體中含有免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)。FcγRIIB在其胞質域中含有免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)。(例如參見 Daeron,Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997))。FcR綜述於(例如) Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med . 126:330-41 (1995)中。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包含擬在將來鑑別者。舉例而言，術語「Fc受體」或「FcR」亦包含新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒體內(Guyer等人，J. Immunol . 117:587 (1976)及Kim等人，J. Immunol . 24:249 (1994))且調控免疫球蛋白之穩態。已知量測至FcRn之結合之方法(例如參見Ghetie及Ward.,Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology , 15(7):637-640 (1997)；Hinton等人，J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；WO 2004/92219 (Hinton等人)。
本文所用之「受體人類框架」係包括源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之重鏈可變結構域(VH )框架之胺基酸序列之框架，如本文所論述。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包括其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，在單一抗原結合域(例如VHH)中之所有人類框架中，胺基酸變化之數量少於10或少於9或少於8或少於7或少於6或少於5或少於4或少於3。
如本文中所使用，「嵌合抗原受體」或「CAR」係指經改造受體，其經由抗原結合域將抗原特異性引入對其進行改造之細胞(例如T細胞，例如天然T細胞、中心記憶性T細胞、效應記憶性T細胞或其組合)上，由此組合抗原結合域之抗原結合性質與T細胞之T細胞活性(例如溶解能力及自我更新)。CAR通常包含細胞外抗原結合域(胞外域)、跨膜域及細胞內信號傳導域。細胞內信號傳導域通常含有至少一個ITAM信號傳導域(例如衍生自CD3ζ)及視情況至少一個共刺激信號傳導域(例如衍生自CD28或4-1BB)。
「親和力」係指分子(例如抗體或含VHH多肽)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間之非共價相互作用之總強度。分子X對於其配偶體Y之親和力或表觀親和力通常可分別由解離常數(KD )或KD -表觀 來表示。可藉由業內已知之常用方法(例如ELISA KD 、KinExA、流式細胞術及/或表面電漿共振裝置，包含本文所闡述者)來量測親和力。該等方法包含(但不限於)涉及BIAcore®、Octet®或流式細胞術之方法。
本文所用之術語「KD 」係指抗原結合分子/抗原相互作用之平衡解離常數。在術語「KD 」用於本文中時，其包含KD 及KD -表觀 。
在一些實施例中，藉由流式細胞術使用抗原表現細胞系來量測抗原結合分子之KD ，且將在每一抗體濃度下量測之平均螢光擬合至非線性單位點結合方程式(Prism Software graphpad)。在一些該等實施例中，KD 係KD- 表觀 。
術語「生物活性」係指分子(不論天然存在(如在活體內所發現)或藉由重組方式提供或可獲得)之任一種或多種生物性質。生物性質包含(但不限於)結合配體、誘導或增加細胞增殖(例如T細胞增殖)及誘導或增加細胞介素表現。
「親和力成熟」含VHH多肽係指與不擁有改變之親代含VHH多肽相比在一或多個CDR中具有一或多個改變之含VHH多肽，該等改變可改良含VHH多肽對抗原之親和力。
本文所用之「人類化VHH」係指其中一或多個框架區已實質上經人類框架區代替之VHH。在一些情況下，人類免疫球蛋白之某些框架區(FR)殘基由相應非人類殘基代替。另外，人類化VHH可包括既不於原始VHH中亦不於人類框架序列中發現但經包含以進一步改良及最佳化VHH或含VHH多肽性能之殘基。在一些實施例中，人類化含VHH多肽包括人類Fc區。如所瞭解，人類化序列可藉由其一級序列來鑑別且未必表示產生抗體之製程。
本文所用之術語「實質上類似」或「實質上相同」表示兩個或更多個數值之間之足夠高相似度使得熟習此項技術者會認為，該兩個或更多個值之間之差異在藉由該值所量測生物特性之背景內具有較小或不具有生物及/或統計學顯著性。在一些實施例中，兩個或更多個實質上類似值相差不超過約5%、10%、15%、20%、25%或50%中之任一者。
多肽「變體」意指在比對序列且引入空位(視需要)以達成最大序列一致性百分比之後與天然序列多肽具有至少約80%胺基酸序列一致性之生物活性多肽，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。該等變體包含(例如)在多肽之N-末端或C-末端添加或缺失一或多個胺基酸殘基之多肽。在一些實施例中，變體具有至少約80%之胺基酸序列一致性。在一些實施例中，變體具有至少約90%之胺基酸序列一致性。在一些實施例中，變體與天然序列多肽具有至少約95%之胺基酸序列一致性。
如本文中所使用，關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」或「同源性」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比之後候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包含在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。
胺基酸取代可包含(但不限於)使用另一胺基酸代替多肽中之一個胺基酸。實例性取代展示於表2中。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。
表2
原始殘基 實例性取代
Ala (A) Val；Leu；Ile
Arg (R) Lys；Gln；Asn
Asn (N) Gln；His；Asp, Lys；Arg
Asp (D) Glu；Asn
Cys (C) Ser；Ala
Gln (Q) Asn；Glu
Glu (E) Asp；Gln
Gly (G) Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys (K) Arg；Gln；Asn
Met (M) Leu；Phe；Ile
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr
Thr (T) Val；Ser
Trp (W) Tyr；Phe
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代使得需要將該等種類之一種之成員與另一種類交換。
術語「載體」用於闡述可經改造以含有可在宿主細胞中繁殖之一或多種經選殖多核苷酸之多核苷酸。載體可包含下列元件中之一或多者：複製來源、一或多個調控所關注多肽之表現之調控序列(例如啟動子及/或增強子)及/或一或多種可選標記物基因(例如抗生素抗性基因及可用於比色分析中之基因(例如β-半乳糖苷酶))。術語「表現載體」係指用於表現宿主細胞中之所關注多肽之載體。
「宿主細胞」係指可為或已成為載體或所分離多核苷酸之接受者之細胞。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。實例性真核細胞包含哺乳動物細胞，例如靈長類動物或非靈長類動物動物細胞；真菌細胞，例如酵母；植物細胞；及昆蟲細胞。非限制性實例性哺乳動物細胞包含(但不限於) NSO細胞、PER.C6® 細胞(Crucell)及293及CHO細胞以及其衍生物(例如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S及CHO-DS細胞)。宿主細胞包含單一宿主細胞之子代，且子代可因天然、偶然或特意突變而未必與初始親代細胞完全相同(在形態上或在基因體DNA互補上)。宿主細胞包含在活體內經本文所提供之多核苷酸轉染之細胞。
本文所用之術語「經分離」係指自至少一些通常發現於自然界中之組分分離或產生之分子。舉例而言，在自至少一些產生其之細胞組分分離時，多肽稱為「經分離」。在多肽係藉由細胞在表現之後分泌之情形下，以物理方式將含有多肽之上清液自產生其之細胞分離可視為「分離」多肽。類似地，在多核苷酸並非通常發現於自然界中之較大多核苷酸(例如在DNA多核苷酸情形下之基因體DNA或線粒體DNA)中之一部分或係自至少一些產生其之細胞組分(例如在RNA多核苷酸情形下)分離時，則其稱為「經分離」。因此，含於宿主細胞內部之載體中之DNA多核苷酸可稱為「經分離」。
術語「個體(individual及subject)」在本文中可互換使用且係指動物(例如哺乳動物)。術語患者包含人類及獸醫學個體。在一些實施例中，提供治療哺乳動物(包含(但不限於)人類、齧齒類動物、猿、貓、犬、馬、牛、豬、綿羊、羊、哺乳類實驗室動物、哺乳類農場動物、哺乳類運動動物及哺乳類寵物)之方法。個體可為雄性或雌性且可為任一適宜年齡(包含嬰兒、幼年、青少年、成人及老年個體)。在一些實例中，「個體(individual或subject)」係指需要治療疾病或病症之個體。在一些實施例中，接受治療之個體可為患者，此指示實際上已將個體鑑別為患有擬治療之病症或處於患有該病症之適當風險下。在特定實施例中，個體係人類，例如人類患者。
本文所用之「疾病」或「病症」係指需要及/或期望治療之病狀。
除非另外指定，否則術語「腫瘤細胞」、「癌細胞」、「癌症」、「腫瘤」及/或「贅瘤」在本文中可互換使用，且係指展現不受控生長及/或細胞存活異常增加及/或細胞凋亡抑制(此會干擾身體器官及系統之正常運轉)之一或多種細胞。此定義包含良性及惡性癌症、息肉、增生以及休眠腫瘤或微轉移。
術語「癌症」及「腫瘤」涵蓋實體及血液學/淋巴癌症且亦涵蓋惡性、惡化前及良性生長(例如發育不良)。同樣，此定義包含具有未由免疫系統阻止(例如免疫逃避及免疫逃逸機制)之異常增殖之細胞(例如病毒感染細胞)。實例性癌症包含(但不限於)：基底細胞癌、膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦癌及中樞神經系統癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；結腸癌及直腸癌；結締組織癌；消化系統癌；子宮內膜癌；食管癌；眼癌；頭頸癌；胃癌(包含胃腸道癌)；神經膠母細胞瘤；肝癌；肝細胞瘤；上皮內贅瘤；腎癌(kidney or renal cancer)；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神經母細胞瘤；口腔癌(唇、舌、口及咽)；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮癌或子宮內膜癌；泌尿系統癌；外陰癌；淋巴瘤，包含何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)以及B細胞淋巴瘤(包含低級/濾泡性非何傑金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中級/濾泡性NHL；中級瀰漫性NHL；高級免疫母細胞性NHL；高級淋巴母細胞性NHL；高級小無核裂細胞NHL；巨塊型疾病NHL；外套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；及瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞性白血病；以及其他癌及肉瘤；及移植後淋巴組織增殖性病症(PTLD)以及與斑痣性錯構瘤病有關之異常血管增殖、水腫(例如與腦腫瘤有關者)及梅格斯氏症候群(Meigs' syndrome)。
本文所用之術語「非腫瘤細胞」係指正常細胞或組織。實例性非腫瘤細胞包含(但不限於)：T細胞、B細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞、樹突狀細胞、單核球、巨噬球、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、間質性腎細胞、纖維母細胞樣滑膜細胞、成骨細胞及位於乳房、骨骼肌、胰臟、胃、卵巢、小腸、胎盤、子宮、睪丸、腎、肺、心臟、腦、肝、前列腺、結腸、淋巴樣器官、骨中之細胞以及骨源間質幹細胞。本文所用之術語「位於周邊之細胞或組織」係指並不位於腫瘤細胞附近及/或腫瘤微環境內之非腫瘤細胞。
本文所用之術語「腫瘤微環境內之細胞或組織」係指環繞及/或供給腫瘤細胞之細胞、分子、細胞外基質及/或血管。腫瘤微環境內之實例性細胞或組織包含(但不限於)：腫瘤血管系統；腫瘤浸潤性淋巴球；纖維母細胞網狀細胞；內皮祖細胞(EPC)；癌症相關性纖維母細胞；外周細胞；其他基質細胞；細胞外基質(ECM)之組分；樹突狀細胞；抗原呈遞細胞；T細胞；調控性T細胞(Treg細胞)；巨噬球；嗜中性球；骨髓樣源抑制細胞(MDSC)及其他位於腫瘤附近之免疫細胞。鑑別腫瘤細胞及/或位於腫瘤微環境內之細胞/組織之方法在業內已眾所周知，如下文所闡述。
在一些實施例中，「增加」或「降低」分別係指統計學顯著之增加或降低。如熟習此項技術者所明瞭，「調節」亦可涉及與不存在測試藥劑之相同條件相比改變(其可為增加或降低)靶或抗原對其配體、結合配偶體、締合成同源多聚體或異源多聚體形式之配偶體或受質中之一或多者之親和力、親合力、特異性及/或選擇性；改變(其可為增加或降低)靶或抗原對存在靶或抗原之介質或環境中之一或多種條件(例如pH、離子強度、存在輔因子等)之敏感性；及/或細胞增殖或細胞介素產生。端視所涉及靶，此可以任一適宜方式及/或使用本身已知或本文所闡述之任一適宜分析來測定。
如本文中所使用，「免疫反應」意欲涵蓋足以抑制或預防(發作)或改善疾病症狀(例如癌症或癌症轉移)之細胞及/或體液免疫反應。「免疫反應」可涵蓋先天性免疫系統及適應性免疫系統二者之態樣。
如本文中所使用，術語疾病、病症或病狀之「治療(treating、treatment)」或「療法」係獲得有益或期望臨床結果之方式。本文所用之「治療」涵蓋任一投與或施加用於哺乳動物(包含人類)疾病之治療劑。出於本發明目的，有益或期望臨床結果包含(但不限於)下列各項中之任一者或多者：緩和一或多種症狀，減弱疾病程度，預防或延遲疾病擴散(例如轉移，例如至肺或至淋巴結之轉移)，預防或延遲疾病復發，延遲或減緩疾病進展，改善疾病狀態，抑制疾病或疾病進展，抑制或減緩疾病或其進展，阻止其發展，及緩解(部分地或完全)。「治療」亦涵蓋減少增殖性疾病之病理學後果。本文所提供之方法涵蓋該等治療態樣中之任一者或多者。與上文一致，術語治療無需百分之百地去除病症之所有態樣。
如本文在癌症背景中所使用，術語「治療」或「抑制(inhibit、inhibiting或inhibition)」癌症係指以下情形中之至少一者：統計學顯著性地降低腫瘤生長速率、中止腫瘤生長或減小腫瘤之大小、質量、代謝活性或體積(如藉由標準準則(例如(但不限於)實體腫瘤反應評估準則(RECIST))所量測)或統計學顯著性地增加無進展存活(PFS)或整體存活(OS)。
「改善」意指與未投與治療劑相比減弱或改良一或多種症狀。「改善」亦包含縮短或減小症狀之持續時間。
「預防(preventing)」、「防治」或「預防(prevention)」疾病或病症係指投與醫藥組合物(單獨或與另一化合物組合)以預防疾病或病症或疾病或病症之一些或所有症狀之發生或發作或減小疾病或病症之發作可能性。
術語「抑制(inhibition或inhibit)」係指降低或中止任一表型特性或降低或中止該特性之發病率、程度或可能性。「減小」或「抑制」係與參考相比降低、減小或阻止活性、功能及/或量。在一些實施例中，「減小」或「抑制」意指使得整體降低10%或更多之能力。在一些實施例中，「減小」或「抑制」意指使得整體降低50%或更多之能力。在一些實施例中，「減小」或「抑制」意指使得整體降低75%、85%、90%、95%或更多之能力。在一些實施例中，經一定時間段相對於對照經相同時間段抑制或降低上述量。
如本文中所使用，「延遲疾病發展」意指推遲、阻礙、減緩、遲緩、穩定、抑制及/或延緩疾病(例如癌症)之發展。此延遲可具有不同時長，此端視所治療疾病及/或個體之病史而定。如熟習此項技術者所顯而易見，充分或顯著延遲實際上可涵蓋預防，此乃因該個體不會發生疾病。舉例而言，可延遲晚期癌症(例如轉移發生)。
本文所用之「預防」包含預防在可易患疾病但尚未診斷為患有疾病之個體中發生或復發疾病。除非另外指定，否則術語「減小」、「抑制」或「預防」並不表示或需要在所有時間內而僅在所量測時間段內完全預防。
術語「抗癌劑」在本文中係以其最廣泛意義使用且係指用於治療一或多種癌症之藥劑。該等藥劑之實例性種類包含(但不限於)化學治療劑、抗癌生物試劑(例如細胞介素、受體細胞外域-Fc融合體及抗體)、輻射療法、CAR-T療法、治療性寡核苷酸(例如反義寡核苷酸及siRNA)及溶瘤病毒。
術語「生物試樣」意指一定量之來自活生物(living thing)或死生物(formerly living thing)之物質。該等物質包含(但不限於)血液(例如全血)、血漿、血清、尿、羊水、滑液、內皮細胞、白血球、單核球、其他細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。
術語「對照」或「參考」係指已知不含分析物(「陰性對照」)或含有分析物(「陽性對照」)之組合物。陽性對照可包括具有已知濃度之分析物。
術語「有效量」或「治療有效量」係指含有活性成分之組合物(例如sdAb或含VHH多肽)在單獨(亦即作為單一療法)或與其他治療劑組合投與患者時會統計學顯著性地降低疾病進展(如例如藉由改善或消除疾病之症狀及/或病因)之量及/或濃度。有效量可為用於以下各項之量：減輕、減弱或緩解至少一種與疾病或病症有關之症狀或生物反應或效應，預防疾病或病症之進展，或改良患者之身體機能。含有活性劑之組合物之治療有效量可根據諸如以下等因素變化：疾病狀態、年齡、性別及個體體重以及活性劑於該個體內引發期望反應之能力。治療有效量亦為活性劑之治療有益效應勝過其任何毒性或有害效應之量。可以一或多次投與來遞送治療有效量。治療有效量係指可在所需時間段內以所需劑量有效地達成期望治療及/或防治結果之量。
如本文中所使用，組合物係指兩種或更多種產物、物質或化合物(包含細胞)之任一混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉劑、膏、水性物、非水性物或其任一組合。
術語「醫藥調配物」及「醫藥組合物」係指一種製劑，其呈允許活性成分之生物活性有效之形式，且其不含對投與該調配物之個體具有不可接受毒性之其他組分。因此，其係適於在醫藥上用於哺乳動物個體、通常人類之組合物。醫藥組合物通常包括有效量之活性劑(例如sdAb或含VHH多肽)及載劑、賦形劑或稀釋劑。載劑、賦形劑或稀釋劑通常分別係醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。該等調配物可無菌。
「醫藥上可接受之載劑」係指業內常與治療劑一起使用且一起構成用於投與個體之醫藥組合物之無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料、調配物助劑或載劑。醫藥上可接受之載劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與調配物之其他成分相容。醫藥上可接受之載劑適用於所採用調配物。
與一或多種其他治療劑「組合」投與包含以任一順序同時(並行)及依序投與。
術語「同時」在本文中用於係指投與兩種或更多種治療劑，其中至少一部分投與在時間上重疊，或其中一種治療劑係相對於投與另一治療劑在較短時間段內投與，或其中兩種藥劑之治療效應至少重疊一定時間段。
術語「依序」在本文中用於係指投與兩種或更多種在時間上不重疊之治療劑，或其中該等藥劑之治療效應並不重疊。
如本文中所使用，「聯合」係指投與一種治療形式以及另一治療形式。因此，「聯合」係指在向個體投與另一治療形式之前、期間或之後投與一種治療形式。
術語「包裝插頁」用於係指通常包含於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於治療產品之使用之警告之資訊。
「製品」係包括至少一種試劑(例如用於治療疾病或病症(例如癌症)之藥劑或用於特異性檢測本文所闡述生物標記物之探針)之任一製造物(例如包裝或容器)或套組。在一些實施例中，製造物或套組係以用於實施本文所闡述方法之單元形式來推銷、分配或出售。
術語「標記」及「可檢測標記」意指附接至(例如)抗體或抗原以致使特定結合對成員之間之反應(例如結合)可檢測之部分。特定結合對之經標記成員稱為「可檢測地標記」。因此，術語「經標記結合蛋白」係指納入用於鑑別結合蛋白之標記之蛋白質。在一些實施例中，標記係可產生可藉由目測或儀器方式檢測之信號之可檢測標記物，例如納入經放射標記之胺基酸或附接至可藉由經標記抗生物素蛋白檢測之生物素基部分之多肽(例如含有螢光標記物或可藉由光學或比色方法檢測之酶活性之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin))。用於多肽之標記之實例包含(但不限於)以下物質：放射性同位素或放射性核種(例如3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho或153 Sm)；色原體、螢光標記(例如FITC、玫瑰紅(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶標記(例如辣根過氧化物酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基；由第二報告基因識別之預定多肽表位(例如白胺酸拉鍊對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合域、表位標籤)；及磁性劑，例如釓螯合物。常用於免疫分析之標記之代表性實例包含產生光之部分(例如吖啶鎓化合物)及產生螢光之部分(例如螢光黃)。就此而言，該部分本身可能並非可檢測地標記，但可在與又一部分反應後變得可檢測。 II.    結合PD-1之VHH域
本文提供PD-1結合多肽，其係含有至少一個特異性結合至PD-1之VHH域之含VHH多肽。在一些實施例中，VHH域結合人類PD-1。在一些實施例中，VHH域結合食蟹猴PD-1。在一些實施例中，VHH域結合鼠類PD-1。在一些實施例中，含VHH多肽納入多個拷貝之本文所提供之VHH域。在該等實施例中，含VHH多肽可納入多個拷貝之相同VHH域。在一些實施例中，含VHH多肽可納入多個拷貝之識別PD-1上之相同表位之不同VHH域。含VHH多肽可格式化為各種形式(包含如下文部分III中所闡述之任一者)。
VHH域係作為能夠選擇性結合至特定抗原之單一單體可變抗體域之抗體片段。VHH域(亦稱為單一域抗體)之分子量僅為12-15 kDa，其遠小於由兩條蛋白質重鏈及兩條輕鏈構成之常見抗體(150-160 kDa)，且甚至小於Fab片段(約50 kDa，一條輕鏈及半條重鏈)及單鏈可變片段(約25 kDa，兩個可變域，一個來自輕鏈且一個來自重鏈)。
單一域抗體係互補決定區為單一域多肽之一部分之抗體。實例包含(但不限於)重鏈抗體、通常不含輕鏈之抗體、源自習用4鏈抗體之單一域抗體、經改造抗體及除源自抗體之彼等外之單一域架構。單一域抗體可衍生自任何物種，包含(但不限於)小鼠、人類、駱駝、美洲駝、羊駝、駱馬、原蛇、鯊魚、山羊、兔及/或牛。在一些實施例中，本文所用之單一域抗體係天然單一域抗體且稱為不含輕鏈之重鏈抗體。為簡潔起見，衍生自通常不含輕鏈之重鏈抗體之此可變域在本文中稱為VHH以區分其與四鏈免疫球蛋白之習用VH。此一VHH分子可衍生自在駱駝科物種中、例如在駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝、駱馬及原駝中產生之抗體。除駱駝科外之其他物種可產生通常不含輕鏈之重鏈抗體；該等VHH在本發明範圍內。
篩選擁有對PD-1之期望特異性之VHH域(包含VHH結合多肽)之方法包含(但不限於)酶聯免疫吸附分析(ELISA)、酶促分析、流式細胞術及業內已知之其他免疫調介技術。
在所提供VHH域中，本文尤其提供PD-1 VHH (美洲駝或羊駝源)及人類化序列，例如下文所闡述之任一者。
在一些實施例中，結合PD-1之VHH域可為人類化的。人類化抗體(例如含VHH多肽)可用作治療分子，此乃因人類化抗體減小或消除了對非人類抗體之人類免疫反應，非人類抗體可對抗體治療劑產生免疫反應且降低治療劑之有效性。通常，人類化抗體包括一或多個可變域，其中CDR (或其部分)係源自非人類抗體，且FR (或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如產生CDR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如) Almagro及Fransson, (2008)Front. Biosci . 13: 1619-1633中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，(1988)Nature 332:323-329；Queen等人，(1989)Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，(2005)Methods 36:25-34；Padlan, (1991)Mol. Immunol. 28:489-498 (闡述「表面重修」)；Dall'Acqua等人，(2005)Methods 36:43-60 (闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，(2005)Methods 36:61-68及Klimka等人，(2000)Br. J. Cancer , 83:252-260 (闡述FR改組之「導向選擇」方式)。
可用於人類化之人類框架區包含(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如參見Sims等人(1993)J. Immunol. 151 :2296)；源自重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列之框架區(例如參見Carter等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285；及Presta等人(1993)J. Immunol , 151:2623)；人類成熟(經體細胞突變)框架區或人類種系框架區(例如參見Almagro及Fransson，(2008)Front. Biosci . 13:1619-1633)；及自篩選FR庫獲得之框架區(例如參見Baca等人(1997)J. Biol. Chem . 272: 10678-10684及Rosok等人，(1996)J. Biol. Chem. 271 :22611-22618)。通常，使用人類FR區代替VHH之FR區以製備人類化VHH。在一些實施例中，代替人類FR之某些FR殘基以改良人類化VHH之一或多種性質。具有該等經代替殘基之VHH域在本文中仍稱為「人類化的」。
本文提供包括CDR1、CDR2及CDR3之結合PD-1之VHH域，該等CDR含於選自SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者之VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中。
在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有含於SEQ ID NO:284中所陳述VHH域或與SEQ ID NO: 284中所陳述之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，PD-1 VHH域具有SEQ ID NO: 284中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 284中所陳述之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，PD-1 VHH域係SEQ ID NO: 284中所陳述胺基酸序列之人類化變體。
在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有含於SEQ ID NO:312中所陳述VHH域或與SEQ ID NO: 312中所陳述之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，PD-1 VHH域具有SEQ ID NO: 312中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 312中所陳述之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，PD-1 VHH域係SEQ ID NO: 312中所陳述胺基酸序列之人類化變體。
在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有SEQ ID NO: 268、272、273或313中之任一者中所陳述之CDR1、SEQ ID NO: 278或314中所陳述之CDR2及SEQ ID NO: 283或315中所陳述之CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有分別陳述於SEQ ID NO: 272、278及283中之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有分別陳述於SEQ ID NO: 268、278及283中之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有分別陳述於SEQ ID NO: 272、278及283中之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有分別陳述於SEQ ID NO: 273、278及283中之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有分別陳述於SEQ ID NO: 313、314及315中之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合PD-1之VHH域包括CDR1、CDR2及CDR3，該等CDR含於選自SEQ ID NO: 251-267中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 251-267中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中。
在一些情形下，所提供PD-1 VHH域係人類化變體，其具有SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 251-267中之任一者之VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，PD-1人類化VHH域具有SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列。
本文提供包括CDR1、CDR2及CDR3之結合PD-1之VHH域，該等CDR含於選自SEQ ID NO: 287、288、289或290中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 296、297、298或299中之任一者之VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中。
在一些實施例中，PD-1 VHH域係SEQ ID NO: 296、297、298或299中所陳述胺基酸序列之人類化變體。
在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有SEQ ID NO: 300、303、306或309中之任一者中所陳述之CDR1、SEQ ID NO: 301、304、307或310中所陳述之CDR2、SEQ ID NO: 302、305、308或311中所陳述之CDR3。在一些實施例中，本文所提供之PD-1 VHH域含有SEQ ID NO: 300中所陳述之CDR1、SEQ ID NO: 301中所陳述之CDR2及SEQ ID NO: 302中所陳述之CDR3；本文所提供之PD-1 VHH域含有SEQ ID NO: 303中所陳述之CDR1、SEQ ID NO: 304中所陳述之CDR2及SEQ ID NO: 305中所陳述之CDR3；本文所提供之PD-1 VHH域含有SEQ ID NO: 306之CDR1、SEQ ID NO: 307中所陳述之CDR2及SEQ ID NO: 308中所陳述之CDR3；或本文所提供之PD-1 VHH域含有SEQ ID NO: 309中所陳述之CDR1、SEQ ID NO: 310中所陳述之CDR2及SEQ ID NO: 311中所陳述之CDR3。 III.   含有PD-1結合多肽之融合蛋白及偶聯物
本文提供含有PD-1結合多肽之融合蛋白及偶聯物，該等多肽含有至少一個之直接或間接連接至一或多個其他域或部分之特異性結合PD-1之VHH域。在一些實施例中，本發明之融合蛋白或偶聯物係由單一多肽構成。在其他實施例中，本發明之融合蛋白或偶聯物係由一個以上多肽構成。在一些實施例中，本發明之PD-1結合多肽納入至少一個特異性結合PD-1之VHH域。在一些態樣中，PD-1結合多肽係多價的。在一些實施例中，PD-1結合多肽包含兩個或更多個拷貝之特異性結合PD-1之VHH域，例如三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個或六個或更多個拷貝之特異性結合PD-1之VHH域。在某些態樣中，PD-1結合多肽係多特異性的。舉例而言，在一些情形下，一或多個其他域可為一或多個結合至一或多種其他抗原或蛋白質之其他結合域。
在一些實施例中，本發明之PD-1結合多肽包含兩個或更多個可經由胺基酸連接體操作地連接之多肽序列。在一些實施例中，該等連接體主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸構成，其在本文中表示為GS-連接體。本發明融合蛋白之GS-連接體可具有不同長度，例如長5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個胺基酸。在一些實施例中，GS-連接體包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接體係包括甘胺酸殘基之撓性連接體，例如(藉由非限制性實例方式) GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，PD-1結合多肽包含GS-連接體及甘胺酸連接體之組合。A. Fc 融合體
本文提供一種PD-1結合多肽，其係含有本文所提供之至少一個結合PD-1之VHH域及Fc域之融合蛋白。在一些實施例中，本文所提供之PD-1結合多肽包括1、2、3或4個結合PD-1之VHH域及Fc域。
在一些實施例中，將免疫球蛋白Fc區併入融合蛋白中在一些態樣中可由多肽構成，該兩個多肽一起形成二聚體。在一些實施例中，Fc域調介PD-1結合多肽在生理學條件下(例如在自細胞表現時)之二聚合，從而形成PD-1結合位點數加倍之二聚體。舉例而言，包括三個結合PD-1之VHH域及Fc區之PD-1結合多肽在作為單體時係三價，但Fc區可調介二聚合，從而PD-1結合多肽在該等條件下以六價二聚體形式存在。在一些實施例中，PD-1 VHH域融合至IgG Fc區且在該等實施例中融合蛋白係每分子具有兩個PD-1 VHH域之二價體。在一些實施例中，兩個PD-1結合域(2×)融合至IgG Fc區且在該等實施例中融合蛋白係每分子具有4個PD-1 VHH域之四價體。在一些實施例中，三個PD-1 VHH域(3×)融合至IgG Fc區且在該等實施例中融合蛋白係每分子具有6個PD-1 VHH域之六價體。
在一些實施例中，多價PD-1結合多肽係二價的。在一些實施例中，本發明之二價PD-1結合多肽包含兩個拷貝之具有下列結構之PD-1結合多肽：(PD-1 VHH)-連接體-Fc。在一些實施例中，多價PD-1結合多肽係四價的。在一些實施例中，本發明之四價PD-1結合多肽包含兩個拷貝之具有下列結構之PD-1-多肽：(PD-1 VHH)-連接體-( PD-1 VHH)-連接體- Fc。在一些實施例中，多價PD-1結合多肽係六價的。在一些實施例中，本發明之六價PD-1結合多肽包含兩個拷貝之具有下列結構之PD-1結合多肽：(PD-1 VHH)-連接體-(PD-1 VHH)-連接體-(PD-1 VHH)-連接體-Fc。
在一些情形下，Fc區之CH3域可用作同源二聚合域，從而所得融合蛋白係形成自兩個相同多肽。在其他情形下，Fc區之CH3二聚體界面區可發生突變以使得能夠進行異源二聚合。舉例而言，可將異源二聚合域納入融合蛋白中，從而構築體係不對稱融合蛋白。
在所提供實施例中之任一者中，PD-1 VHH域可為如上文所闡述之任一者。在一些實施例中，PD-1 VHH域係結合PD-1之人類化VHH域。
在各個實施例中， PD-1-結合多肽中所包含之Fc域係人類Fc域，或係衍生自人類Fc域。在一些實施例中，融合蛋白含有免疫球蛋白Fc區。在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區係選自由以下組成之群之IgG同型：IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型及IgG4子類。
在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區或其免疫學活性片段係IgG同型。舉例而言，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區係人類IgG1同型且具有以下胺基酸序列： PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 8)
在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區或其免疫學活性片段包括與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG1多肽序列。
在本發明融合蛋白包含Fc多肽之一些實施例中，Fc多肽經受突變或修飾。在一些情形下，突變包含一或多個胺基酸取代以減小Fc多肽之效應功能。已知用以改變(例如減小)效應功能之Fc多肽突變之各個實例，包含如下文所闡述之任一者。在一些實施例中，除非參照特定SEQ ID NO進行闡述，否則藉由EU Kabat編號(亦稱為Kabat編號)來提及Fc區中之胺基酸取代。EU編號已為人已知且係根據最新更新之IMGT科學圖表(IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (創建日期：2001年5月17日，最後更新日期；2013年1月10日)及EU索引(如Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版，US Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號(1991)中所報告)。
在一些實施例中，展現減小效應功能之Fc區可為用於期望PD-1或CD3結合但某些效應功能(例如CDC及ADCC)係不必要或有害的之應用中之期望候選者。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來證實CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保多特異性多肽構築體及/或其裂解組分缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如參見Hellstrom, I.等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)，；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med . 166:1351-1361 (1987))中。或者，可使用非放射性分析方法(例如參見用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.)及CytoTox 96™非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, Wis.))。可用於該等分析之效應細胞包含末梢血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可在活體內(例如)在諸如Clynes等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示者等動物模型中評價所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析來證實多特異性多肽構築體或其裂解組分不能與C1q結合且因此缺少CDC活性。例如參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如參見Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如參見Petkova, S.B.等人，Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
在一些實施例中，修飾人類IgG Fc區以改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如以下文獻中所闡述之胺基酸修飾：Natsume等人，2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72；Idusogie等人，2001 J Immunol, 166(4): 2571-5；Moore等人，2010 mAbs, 2(2): 181-189；Lazar等人，2006 PNAS, 103(11): 4005-4010；Shields等人，2001 JBC, 276(9): 6591-6604；Stavenhagen等人，2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890；Stavenhagen等人，2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164；Alegre等人，1992 J Immunol, 148: 3461-3468；Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11之綜述。
增強ADCC之突變之實例包含Ser239及Ile332處之修飾，例如Ser239Asp及Ile332Glu (S239D、I332E)。增強CDC之突變之實例包含Lys326及Glu333處之修飾。在一些實施例中，在該等位置中之一者或兩者處修飾Fc區，例如Lys326Ala及/或Glu333Ala (K326A及E333A，使用Kabat編號系統)。
在一些實施例中，在下列位置中之一或多者處改變融合蛋白之Fc區以減小Fc受體結合：Leu 234 (L234)、Leu235 (L235)、Asp265 (D265)、Asp270 (D270)、Ser298 (S298)、Asn297 (N297)、Asn325 (N325)或Ala327 (A327)或Pro329 (P329)。例如Leu 234Ala (L234A)、Leu235Ala (L235A)、Leu235Glu (L235E)、Asp265Asn (D265N)、Asp265Ala (D265A)、Asp270Asn (D270N)、Ser298Asn (S298N)、Asn297Ala (N297A)、Pro329Ala (P329A)或Pro239Gly (P329G)、Asn325Glu (N325E)或Ala327Ser (A327S)。在較佳實施例中，Fc區內之修飾減小了與Fc受體-γ受體之結合，而對與新生兒Fc受體(FcRn)之結合具有最小影響。
在一些實施例中，在胺基酸Asn297 (Kabat編號)處修飾人類IgG1 Fc區以防止融合蛋白之醣基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，在胺基酸Leu235 (Kabat編號)處修飾融合蛋白之Fc區以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu (L235E)或Leu235Ala (L235A)。在一些實施例中，在Leu234 (Kabat編號)處修飾融合蛋白之Fc區胺基酸以改變Fc受體相互作用，例如Leu234Ala (L234A)。在一些實施例中，在Leu234 (Kabat編號)處修飾融合蛋白之Fc區胺基酸以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu (L235E)。在一些實施例中，在胺基酸234及235處改變融合蛋白之Fc區，例如Leu234Ala及Leu235Ala (L234A/L235A)或Leu234Val及Leu235Ala (L234V/L235A)。在一些實施例中，在胺基酸234、235及297處改變融合蛋白之Fc區，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asn297Ala (L234A/L235A/N297A)。在一些實施例中，在胺基酸234、235及329處改變融合蛋白之Fc區，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Pro239Ala (L234A/L235A/P329A)。在一些實施例中，在胺基酸Asp265 (Kabat編號)處修飾融合蛋白之Fc區以改變Fc受體相互作用，例如Asp265Ala (D265A)。在一些實施例中，在胺基酸Pro329 (Kabat編號)處修飾融合蛋白之Fc區以改變Fc受體相互作用，例如Pro329Ala (P329A)或Pro329Gly (P329G)。在一些實施例中，在胺基酸265及329處改變融合蛋白之Fc區，例如Asp265Ala及Pro329Ala (D265A/P329A)或Asp265Ala及Pro329Gly (D265A/P329G)。在一些實施例中，在胺基酸234、235及265處改變融合蛋白之Fc區，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala (L234A/L235A/D265A)。在一些實施例中，在胺基酸234、235及329處改變融合蛋白之Fc區，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Pro329Gly (L234A/L235A/P329G)。在一些實施例中，在胺基酸234、235、265及329處改變融合蛋白之Fc區，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala、Pro329Gly (L234A/L235A/D265A/P329G)。在一些實施例中，在Gly235處改變融合蛋白之Fc區以減小Fc受體結合。舉例而言，其中自融合蛋白缺失Gly235。在一些實施例中，在胺基酸Gly236處修飾人類IgG1 Fc區以增強與CD32A之相互作用，例如Gly236Ala (G236A)。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白之Fc區缺乏下列位置中之一或多者處之胺基酸以減小Fc受體結合：Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區缺乏下列位置Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)中之一或多者處之胺基酸且Asp265 (D265)、Asn297 (N297)或Pro329 (P329)中之一或多者處進行修飾以減小Fc受體結合。舉例而言，PD-1-結合多肽中所包含之Fc區係衍生自人類Fc域，且在下鉸鏈中包括三個對應於IgG1 E233、L234及L235之胺基酸缺失。在一些態樣中，該等Fc多肽並不嚙合FcγR且由此稱為「效應沉默」或「效應無效」。舉例而言，Fc缺失該三個胺基酸可減小補體蛋白C1q結合。在一些實施例中，Fc區具有該三個胺基酸之Fc缺失之多肽保持結合至FcRn且由此具有延長半衰期及與FcRn調介之再循環有關之穿胞作用。此一經修飾Fc區稱為「Fc xELL」或「Fc缺失」且具有下列胺基酸序列： PAPGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 9)
在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區或其免疫學活性片段包括與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG1多肽序列。
在一些實施例中，修飾人類IgG Fc區以增強FcRn結合。增強FcRn結合之Fc突變之實例係Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu (分別係M252Y、S254T、T256E) (Kabat編號，Dall’Acqua等人，2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514-23524)、Met428Leu及Asn434Ser (M428L、N434S) (Zalevsky等人，2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159)或Met252Ile、Thr256Asp、Met428Leu (分別係M252I、T256D、M428L) (Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，PD-1-結合多肽中所包含之Fc域係衍生自人類Fc域且包括突變M252Y及M428V (在本文中稱為「Fc-YV」)。在一些實施例中，經突變或修飾之Fc多肽包含下列突變：M252Y及M428L (使用Kabat編號系統)。在一些實施例中，該等突變在胞內體酸性pH (接近6.5)下增強FcRn結合，而在中性pH (約7.2)下損失可檢測結合，從而增強FcRn調介之再循環並延長半衰期。
在一些實施例中，PD-1結合多肽中所包含之Fc域係衍生自人類Fc域且包括突變以誘導異源二聚合。在一些實施例中，該等突變包含稱為「隆凸」及「孔洞」突變者。舉例而言，在CH3域內之Thr366處具有胺基酸修飾，在經體積較大性胺基酸(例如Try)代替(T366W)時，該域能夠優先地與在體積較小性胺基酸位置Thr366、Leu368及Tyr407處具有胺基酸修飾(例如分別係Ser、Ala及Val) (T366S/L368A/Y407V)之第二CH3域進行配對。在一些實施例中，「隆凸」 Fc域包括突變T366W。在一些實施例中，「孔洞」 Fc域包括突變T366S、L368A及Y407V。可藉由引入二硫鍵(例如藉由在相對CH3域上將Ser354變為Cys (S354C)且將Y349變為Cys (Y349C))來進一步穩定經由CH3修飾之異源二聚合(綜述於Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15中)。在一些實施例中，用於異源二聚合之Fc域包括其他突變，例如異源二聚體Fc對之第一成員上之突變S354C與異源二聚體Fc對之第二成員上之相應突變Y349C (其形成不對稱二硫化物)。在一些實施例中，異源二聚體Fc對之一個成員包括修飾H435R或H435K以防止蛋白質A結合且同時維持FcRn結合。在一些實施例中，異源二聚體Fc對之一個成員包括修飾H435R或H435K，而異源二聚體Fc對之第二成員在H435處未經修飾。在各個實施例中，孔洞Fc域包括修飾H435R或H435K (在一些情況下在修飾係H435R時，稱為「孔洞-R」)，而隆凸Fc域則並非如此。在一些情況下，與可能存在之同源二聚體孔洞Fc域相比，孔洞-R突變可改良異源二聚體之純化。
在一些實施例中，修飾人類IgG Fc區以防止二聚合。在該等實施例中，本發明融合蛋白係單體。舉例而言，殘基Thr366至帶電殘基之修飾(例如Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp或Thr366Glu (分別係T366K、T366R、T366D或T366E))可防止CH3-CH3二聚合。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫學活性片段係人類IgG2同型且具有以下胺基酸序列： PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 10)
在一些實施例中，融合體或其免疫學活性片段包括與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG2多肽序列。
在一些實施例中，在胺基酸Asn297處修飾人類IgG2 Fc區(例如用以防止抗體醣基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，人類IgG2 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫學活性片段係人類IgG3同型且具有以下胺基酸序列： PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFKWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST FRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNIFSCSVMH EALHNRFTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)
在一些實施例中，抗體或其免疫學活性片段包括與SEQ ID NO: 11之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG3多肽序列。
在一些實施例中，在胺基酸Asn297 (Kabat編號)處修飾人類IgG3 Fc區以防止抗體醣基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，在胺基酸435處修飾人類IgG3 Fc區以延長半衰期，例如Arg435His (R435H)。在一些實施例中，人類IgG3 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫學活性片段係人類IgG4同型且具有以下胺基酸序列： PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK (SEQ ID NO: 12)
在一些實施例中，抗體或其免疫學活性片段包括與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG4多肽序列。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫學活性片段係人類IgG4同型且具有以下胺基酸序列： PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK (SEQ ID NO: 13)
在一些實施例中，抗體或其免疫學活性片段包括與SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG4多肽序列。
在一些實施例中，在胺基酸235處修飾人類IgG4 Fc區以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu (L235E)。在一些實施例中，在胺基酸Asn297 (Kabat編號)處修飾人類IgG4 Fc區以防止抗體醣基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白含有衍生自免疫球蛋白鉸鏈區之多肽。鉸鏈區可選自人類IgG子類中之任一者。舉例而言，融合蛋白可含有具有EPKSSDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 14)之序列之經修飾IgG1鉸鏈，其中與輕鏈之C-末端半胱胺酸形成二硫化物之Cys220突變成絲胺酸(例如Cys220Ser (C220S))。在其他實施例中，融合蛋白含有具有序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 15)之經截短鉸鏈。
在一些實施例中，融合蛋白具有來自IgG4之具有序列ESKYGPPCPPC (SEQ ID NO: 16)之經修飾鉸鏈，該修飾可防止或減小鏈交換(例如Ser228Pro (S228P))。在一些實施例中，融合蛋白含有連接體多肽。在其他實施例中，融合蛋白含有連接體及鉸鏈多肽。
在一些實施例中，Fc區在N297處缺乏或具有較少附接至N-連接聚醣鏈之岩藻糖。存在防止岩藻糖基化之諸多方式，包含(但不限於)在FUT8缺陷型細胞系中生產；向哺乳動物細胞培養基添加抑制劑(例如栗精胺(Castanospermine))；及以代謝方式改造生產細胞系。
在一些實施例中，改造Fc區以消除藉由發現於人類中之預存在抗體之識別。在一些實施例中，藉由對位置Leu11實施突變(例如Leu11Glu (L11E)或Leu11Lys (L11K))來修飾本發明之含VHH多肽。在其他實施例中，藉由改變羧基-末端區域來修飾本發明之單一域抗體，舉例而言，末端序列具有序列GQGTLVTVKPGG (SEQ ID NO: 17)或GQGTLVTVEPGG (SEQ ID NO: 18)或其修飾。在一些實施例中，藉由對位置11實施突變且藉由改變羧基-末端區域來修飾本發明之含VHH多肽。
在一些實施例中，本發明融合蛋白之一或多個多肽經由胺基酸連接體可操作地連接。在一些實施例中，該等連接體主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸構成，其在本文中表示為GS-連接體。本發明融合蛋白之GS-連接體可具有不同長度，例如長5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個胺基酸。
在一些實施例中，GS-連接體包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接體係包括甘胺酸殘基之撓性連接體，例如(藉由非限制性實例方式) GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，融合蛋白可包含GS-連接體及甘胺酸連接體之組合。B. 偶聯物
本文提供含有本文所提供之至少一個特異性結合PD-1之VHH域及一或多個其他部分之偶聯物。其他部分可為治療劑(例如細胞毒性劑)，或可為檢測劑。在一些實施例中，該部分可為靶向部分、小分子藥物(莫耳質量小於500道爾頓之非多肽藥物)、毒素、細胞生長抑制劑、細胞毒性劑、免疫抑制劑、適用於診斷目的之放射性藥劑、用於治療目的之放射性金屬離子、前藥活化酶、延長生物半衰期之藥劑或診斷劑或可檢測劑。
在一些實施例中，偶聯物係含有本文所提供偶聯至治療劑之一或多個PD-1 VHH域之抗體藥物偶聯物(ADC，亦稱為免疫偶聯物)，該治療劑係細胞毒性、細胞生長抑制性或另外提供一些治療益處。在一些實施例中，細胞毒性劑係化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性偶聯物)。在一些實施例中，本發明之所提供抗體藥物偶聯物容許將藥物部分靶向遞送至腫瘤。在一些情形下，此可靶向殺死腫瘤細胞。
在一些實施例中，提供包括本文所提供與治療劑偶聯之至少一個PD-1 VHH域之PD-1結合偶聯物。在一些實施例中，治療劑包含(例如)道諾黴素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、胺甲喋呤(methotrexate)及長春地辛(vindesine) (Rowland等人，Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187, 1986)。在一些實施例中，治療劑具有細胞內活性。在一些實施例中，PD-1結合偶聯物發生內化且治療劑係阻斷細胞之蛋白質合成且由此引起細胞死亡之細胞毒素。在一些實施例中，治療劑係包括具有核糖體不活化活性之多肽之細胞毒素，包含(例如)白樹毒素、三角梅蛋白、肥皂草毒素、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A鏈、異株瀉根毒蛋白、白喉毒素、侷限麴菌素、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素A及其變體。在一些實施例中，在治療劑係包括具有核糖體不活化活性之多肽之細胞毒素之情形下，PD-1結合偶聯物必須在結合至靶細胞時發生內化以使蛋白質對細胞具有細胞毒性。
在一些實施例中，提供包括本文所提供與毒素偶聯之至少一個PD-1 VHH域之PD-1結合偶聯物。在一些實施例中，毒素包含(例如)細菌毒素，例如白喉毒素；植物毒素，例如蓖麻毒蛋白；小分子毒素，例如格爾德黴素(geldanamycin) (Mandler等人，J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000)；Mandler等人，Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028 (2000)；Mandler等人，Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002))、類美登素(maytansinoid) (EP 1391213；Liu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996))及卡奇黴素(calicheamicin) (Lode等人，Cancer Res. 58:2928 (1998)；Hinman等人，Cancer Res. 53:3336-3342 (1993))。毒素可藉由包含微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來施加其細胞毒性及細胞生長抑制效應。
在一些實施例中，提供包括本文所提供與標記偶聯之至少一個PD-1 VHH域之PD-1結合偶聯物，該標記可間接或直接生成可檢測信號。該等IgSF偶聯物可用於研究或診斷應用，例如用於活體內檢測癌症。標記較佳地能夠直接或間接產生可檢測信號。舉例而言，標記可為不透射線物質或放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；螢光(螢光團)或化學發光(發色團)化合物，例如螢光黃異硫氰酸酯、玫瑰紅或螢光素；酶，例如鹼性磷酸酶、β-半乳醣苷酶或辣根過氧化物酶；成像劑；或金屬離子。在一些實施例中，標記係用於閃爍研究之放射性原子，例如99Tc或123I；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，例如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可錯合至各種金屬螯合劑且偶聯至抗體以(例如)用於PET成像(WO 2011/056983)。
可使用業內已知之任何方法來製備PD-1結合偶聯物。例如參見WO 2009/067800、WO 2011/133886及美國專利申請案公開案第2014322129號，該等案件之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，附接可為共價或非共價的(例如經由生物素-鏈黴抗生物素蛋白非共價相互作用)。在一些實施例中，1、2、3、4、5或更多個可相同或不同之部分偶聯、連接或融合至PD-1 VHH域以形成PD-1結合偶聯物。在一些實施例中，可使用業內已知且闡述於下文中之各種分子生物或化學偶聯及鍵聯方法使該等部分附接至VHH域。在一些實施例中，可使用連接體(例如肽連接體、可裂解連接體、不可裂解連接體或有助於偶聯反應之連接體)使效應物部分連接或偶聯至變體多肽或免疫調節蛋白。
在一些實施例中，PD-1 VHH域經由連接體(L)偶聯至一或多個部分，例如約1至約20個藥物部分/VHH。在一些實施例中，PD-1結合偶聯物包括下列組分：(VHH域)、(L)q 及(部分)m ，其中VHH域係所闡述能夠如所闡述特異性結合PD-1之VHH域中之任一者；L係用於連接蛋白質或多肽與該部分之連接體；m至少為1；q為0或更大；且所得PD-1結合偶聯物結合至PD-1。在特定實施例中，m為1至4且q為0至8。
連接體可由一或多種連接體組分構成。為共價附接抗體及藥物部分，連接體通常具有兩個反應性官能基，亦即在反應性意義上係雙價。已知可用於附接兩個或更多個功能或生物活性部分(例如肽、核酸、藥物、毒素、抗體、半抗原及報告基因基團)之雙價連接體試劑，且已闡述其產生偶聯物之方法(Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques；Academic Press: New York, p 234-242)。
實例性連接體組分包含6-馬來醯亞胺基己醯基(「MC」)、馬來醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對-胺基苄基氧基羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(「SPP」)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-I甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(「SMCC」)及(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(「SIAB」)。
在一些實施例中，連接體可包括胺基酸殘基。實例性胺基酸連接體組分包含二肽、三肽、四肽或五肽。實例性二肽包含：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)。實例性三肽包含：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。構成胺基酸連接體組分之胺基酸殘基包含天然存在者以及次要胺基酸及非天然胺基酸類似物(例如瓜胺酸)。胺基酸連接體組分在其選擇性方面可經設計及最佳化以供藉由特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D，於胞漿素蛋白酶)酶促裂解。
VHH域與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得，該等雙功能蛋白質偶合劑係(例如) 3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(例如二琥珀醯亞胺基基質)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
可藉由熟習此項技術者已知之各種方法(例如有機化學反應)、條件及試劑來製備抗體藥物偶聯物。在一實施例中，方法包含：(1)使VHH域之親核性基團與二價連接體試劑經由共價鍵進行反應以形成VHH-L，隨後與藥物部分D進行反應；及(2)使藥物部分之親核性基團與二價連接體試劑經由共價鍵進行反應以形成D-L，隨後與VHH域之親核性基團進行反應。
抗體(包含VHH域)上之親核性基團包含(但不限於)：(i) N-末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中抗體經醣基化。胺基、硫醇基及羥基具有親核性且能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電性基團反應以形成共價鍵，該等親電性基團包含：(i)活性酯基，例如NHS酯基、HOBt酯基、鹵代甲酸酯基及醯基鹵基；(ii)烷基鹵基及苄基鹵基，例如鹵代乙醯胺基；(iii)醛基、酮基、羧基及馬來醯亞胺基。可經由使離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷(特勞特試劑(Traut's reagent))進行反應以將胺轉變成硫醇來將其他親核性基團引入抗體中。可藉由引入1個、2個、3個、4個或更多個半胱胺酸殘基來將反應性硫醇基引入抗體(或其片段)中(例如製備包括一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變抗體)。
亦可藉由修飾抗體(例如VHH域)以引入親電性部分來產生偶聯物(例如抗體藥物偶聯物)，該等親電性部分可與連接體試劑或藥物上之親核性取代基進行反應。可利用(例如)過碘酸鹽氧化試劑來氧化醣基化抗體之糖以形成可與連接體試劑或藥物部分之胺基反應之醛基或酮基。所得亞胺希夫鹼基(Schiff base group)可形成穩定鍵聯，或可藉由(例如)硼氫化物試劑還原以形成穩定胺鍵聯。在一實施例中，醣基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可在蛋白質中產生可與藥物上之適當基團反應之羰基(醛基及酮基) (Hermanson, Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，從而產生代替第一胺基酸之醛。 該醛可與藥物部分或連接體親核劑進行反應。
同樣，藥物部分上之親核性基團包含(但不限於)：胺基、硫醇基、羥基、醯肼基、肟基、肼基、硫代半卡腙基、肼羧酸酯基及芳基醯肼基，該等基團能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電性基團反應以形成共價鍵，該等親電性基團包括：(i)活性酯基，例如NHS酯基、HOBi酯基、鹵代甲酸酯基及醯基鹵基；(ii)烷基鹵基及苄基鹵基，例如鹵代乙醯胺基；(iii)醛基、酮基、羧基及馬來醯亞胺基。
或者，可(例如)藉由重組技術或肽合成來製備含有VHH域及細胞毒性劑之融合蛋白。NA長度可包括編碼偶聯物之兩個部分之各別區域，該等區域彼此毗鄰或由編碼並不破壞偶聯物之期望性質之連接體肽之區域隔開。C. 多特異性形式
本文提供多特異性PD-1結合多肽，其含有至少一個結合PD-1之VHH域及一或多個其他結合域。通常，一或多個其他域結合至除PD-1外之第二抗原或蛋白質。在一些態樣中，其他抗原或蛋白質可為表現於腫瘤上之抗原、表現於免疫細胞(例如T細胞)上之分子或受體(例如CD3)或其他抑制受體(例如CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、TIGIT、SIRPα、NKG2A、B7H3、B7H4)或活化受體(例如OX40、GITR、41BB、CD40、CD27、CD28或ICOS)或賦予靶細胞其他特異性(例如CD8或CD4)。在一些實施例中，一或多個其他域係對第二抗原或蛋白質具有特異性之抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，其他域係VHH域。
在一些實施例中，多特異性PD-1結合多肽包括至少一個結合PD-1之VHH域及至少一個結合第二抗原或蛋白質之其他結合域。在一些實施例中，此第二抗原係腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤微環境相關抗原(TMEAA)。在一些實施例中，此第二抗原係免疫調節抗原，其中該抗原參與增強或減弱免疫細胞中之信號傳導路徑。
在一些情形下，多特異性PD-1結合多肽可進一步含有Fc域(例如上文所闡述之任一者)。在一些實施例中，本文所提供之多特異性PD-1結合多肽含有至少一個結合PD-1之VHH域、至少一個結合第二抗原或蛋白質之其他結合域及Fc域。在一些實施例中，Fc域調介多特異性PD-1結合多肽在生理學條件下之二聚合，從而形成用於PD-1及其他抗原或蛋白質之結合位點數加倍之二聚體。
非限制性實例性多特異性PD-1結合多肽闡述於下文中。 1. 雙特異性 T 細胞嚙合劑
在一些實施例中，PD-1結合多肽係雙特異性構築體，其係或包括本文所提供之至少一個PD-1 VHH域及至少一種能夠結合至表現於T細胞上之表面分子之其他結合分子。在一些實施例中，表面分子係T細胞之活化組分，例如T細胞受體複合物之組分。在特定態樣中，表面分子係活化T細胞抗原，其表現於T細胞上且能夠在與抗原結合分子相互作用時誘導T細胞活化。舉例而言，在一些態樣中，抗原結合分子與活化T細胞抗原之相互作用可藉由觸發T細胞受體複合物之信號傳導級聯來誘導T細胞活化。已知用以量測T細胞活化之適宜分析，且包含任一用以量測或評價增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性活性及/或一或多種活化標記物之表現之分析。在一些實施例中，使此一PD-1結合多肽同時或接近同時結合至其兩個靶(表現於靶細胞上之PD-1及表現於T細胞上之T細胞分子(例如活化T細胞抗原))可在靶細胞與T細胞之間產生暫時性相互作用，由此活化(例如)T細胞之細胞毒性活性且隨後裂解靶細胞。
在一些實施例中，T表面分子(例如活化T細胞抗原)係CD3或係CD2。具體而言，所提供雙特異性PD-1結合多肽能夠特異性結合表現於人類T細胞上之活化T細胞抗原(例如人類CD3或人類CD3)。在特定態樣中，對活化T細胞抗原(例如CD3或CD2)具有特異性之其他結合域係抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，PD-1結合多肽可為雙特異性抗體T細胞嚙合劑，其含有至少一個特異性結合至PD-1之PD-1 VHH域及其他結合分子，該其他結合分子係對T細胞之活化組分(例如T細胞表面分子，例如CD3或CD2)具有特異性之抗體或抗原結合片段。
雙特異性抗體T細胞嚙合劑尤其係含有以下各項之雙特異性T細胞嚙合劑(BiTE)分子：藉由撓性連接體融合之串聯scFv分子(例如參見Nagorsen及Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)；經由(例如)撓性連接體彼此融合且進一步含有能夠穩定締合之第一亞單元及第二亞單元由構成之Fc域之串聯scFv分子(WO2013026837)；二價抗體及其衍生物，包含串聯二價抗體(Holliger等人，Prot Eng 9, 299-305 (1996)；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293, 41-66 (1999))；雙重親和力再靶向DART)分子，其可包含具有C-末端二硫橋之二價抗體形式；或包含完整雜合小鼠/大鼠IgG分子之三功能單抗(Seimetz等人，Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)。可使用本文所提供之任一PD-1 VHH域來生成上述分子中之任一者之類似形式。
在一些實施例中，對活化T細胞抗原具有特異性之其他結合域係選自以下之抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、經二硫化物穩定之Fv片段(dsFv)、scAb、dAb、單一域重鏈抗體(VHH)或單一域輕鏈抗體。在一些實施例中，其他結合域對於結合活化T細胞抗原(例如CD2或CD3)而言係單價的。
在一些實施例中，其他結合域能夠結合至CD3或CD3複合物。CD3複合物係成熟T淋巴球中之至少5個之複合物，該等 膜結合多肽彼此且與T細胞受體以非共價方式締合。CD3複合物包含γ、δ、ε、ζ及η鏈(亦稱為亞單元)。在一些實施例中，其他結合分子係能夠特異性結合至CD3或CD3複合物之抗體或抗原結合片段，亦稱為CD3結合域。在一些實施例中，能夠結合CD3或CD3複合物之CD3結合域包含一或多個拷貝之抗CD3 Fab片段、抗CD3 F(ab')2 片段、抗CD3 Fv片段、抗CD3 scFv、抗CD3 dsFv、抗CD3 scAb、抗CD3 dAb、抗CD3單一域重鏈抗體(VHH)及抗CD3單一域輕鏈抗體。在一些實施例中，抗CD3結合域對於結合CD3而言係單價的。
在一些情形下，CD3結合域識別CD3ε鏈。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包含一或多個拷貝之抗CD3ε Fab片段、抗CD3ε  F(ab')2 片段、抗CD3ε Fv片段、抗CD3ε  scFv、抗CD3ε dsFv、抗CD3ε  scAb、抗CD3ε  dAb、抗CD3ε單一域重鏈抗體(VHH)及抗CD3ε單一域輕鏈抗體。在一些實施例中，抗CD3ε結合域對於結合CD3ε而言係單價的。
針對CD3或CD3複合物之實例性單株抗體包含(但不限於) OKT3、SP34、UCHT1或64.1或其抗原結合片段(例如參見June等人，J. Immunol. 136:3945-3952 (1986)；Yang等人，J. Immunol. 137:1097-1100 (1986)；及Hayward等人，Immunol. 64:87-92 (1988))。在一些態樣中，CD3在T細胞上之群聚(例如藉由經固定或細胞定位或系接之抗CD3抗體)會引起T細胞活化，此類似於T細胞受體之嚙合，但獨立於其純系典型特異性。在一實施例中，CD3結合域單價性且特異性地結合CD3抗原，且係衍生自OKT3 (ORTHOCLONE-OKT3™ (莫羅單抗(muromonab)-CD3)；人類化OKT3 (美國專利第7,635,475號及公開國際申請案第WO2005040220號)；SP34 (Pessano等人，The EMBO Journal. 4: 337-344, 1985)；SP34之人類化變體(WO2015001085)；Teplizumab™ (MGA031, Eli Lilly)；闡述於US2011/0275787中之抗CD3結合分子；UCHT1 (Pollard等人，1987 J Histochem Cytochem. 35(11):1329-38；WO2000041474)；NI0401 (WO2007/033230)；維西珠單抗(visilizumab) (美國專利第5,834,597號)；BC-3 (Anasetti等人，Transplantation 54: 844 (1992)；H2C (闡述於PCT公開案第WO2008/119567號中)；V9 (闡述於Rodrigues等人，Int J Cancer，增刊7，45-50 (1992)及美國專利第6,054,297號中))。其他抗CD3抗體亦可用於本文所提供之構築體中，包含闡述於以下案件中之任一者：國際公開PCT申請案第WO199404679號、第WO2008119567號、第WO2015095392號、第WO2016204966號、第WO2019133761號；公開專利申請案第US20170369563號、第US20180194842號、第US20180355038號；美國專利第7,728,114號、第7,381,803號、第7,994,289號。
在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO:19中所陳述之可變重(VH)鏈及/或SEQ ID NO:20中所陳述之可變輕鏈或與該等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之VH及/或VL序列且特異性結合CD3。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO:19中所陳述之可變重(VH)鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3及SEQ ID NO:20中所陳述之可變輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3。在一些情形下，CD3結合區包括SEQ ID NO:209中所陳述之VH序列之人類化形式及SEQ ID NO:210中所陳述之VL序列之人類化形式。在一些實施例中，CD3結合區可含有SEQ ID NO 21、22、23中之任一者中所陳述之人類化OKT3源VH域序列及/或SEQ ID NO 24、25、26中之任一者中所陳述之VL域序列或與該等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性的VH及/或VL序列且特異性結合CD3。在一些實施例中，CD3結合域係Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有上述VH及VL序列之任一組合，尤其含有SEQ ID NO: 21、22、23中之任一者中所陳述之VH序列及SEQ ID NO: 24、25、26中之任一者中所陳述之VL序列的任一組合。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包含：VH CDR1序列，其至少包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)；VH CD2序列，其至少包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)；VH CDR3序列，其至少包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)；VL CDR1序列，其至少包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)；VL CDR2序列，其至少包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)；及VL CDR3序列，其至少包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)。在一些實施例中，CD3結合域係Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有：VH CDR1序列，其至少包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)；VH CD2序列，其至少包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)；VH CDR3序列，其至少包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)；VL CDR1序列，其至少包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)；VL CDR2序列，其至少包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)；及VL CDR3序列，其至少包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)。
在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO:27中所陳述之可變重(VH)鏈及/或SEQ ID NO:28中所陳述之可變輕鏈或與該等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之VH及/或VL序列且特異性結合至CD3。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO:27中所陳述之可變重(VH)鏈之CDRH1、CDRH2及CDRH3及SEQ ID NO:28中所陳述之可變輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO:29、30及31中分別所陳述之CDRH1、CDRH2及CDRH3及SEQ ID NO:32、33及34中分別所陳述之可變輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3。在一些情形下，CD3結合區包括SEQ ID NO:27中所陳述之VH序列之人類化形式及SEQ ID NO:28中所陳述之VL序列之人類化形式。在一些實施例中，CD3結合區可含有SEQ ID NO 35-65中之任一者中所陳述之人類化VH域序列及/或SEQ ID NO: 66-84中之任一者中所陳述之VL域序列或與該等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性的VH及/或VL序列且特異性結合至CD3。在一些實施例中，抗CD3ε結合域其包含含有SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之可變重鏈(Hv)及含有SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之可變輕鏈(Lv)。
在一些實施例中，CD3結合域係Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有上述VH及VL序列之任一組合，尤其含有SEQ ID NO: 35-65中之任一者中所陳述之VH序列及SEQ ID NO: 66-84中之任一者中所陳述之VL序列的任一組合。在一些實施例中，抗CD3結合域係Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包括SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。
在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO:313、314、317或318中之任一者中所陳述之可變重(VH)鏈。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO:315、316、319或320中之任一者中所陳述之可變輕(VL)鏈。
所提供雙特異性構築體可格式化為含有至少一個PD-1 VHH域至少一個對活化T細胞抗原具有特異性之其他域(例如CD3結合域)之諸多形式中之任一者。
在一實施例中，雙特異性構築體係雙特異性單一域抗體連接之Fab (S-Fab)，其含有至少一個如所闡述直接或間接連接至對T細胞活化抗原(例如CD3)具有特異性之Fab抗原結合片段(例如抗CD3 Fab)之PD-1 VHH域。針對T細胞活化抗原之Fab (例如抗CD3 Fab)可含有如所闡述之VH及VL序列中之任一者。在一些實施例中，PD-1 VHH域連接至抗CD3 Fab之VH或VL鏈之C-末端。在一些實施例中，可(例如)藉由與聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺(HPMA)共聚物、蛋白質(例如白蛋白)、聚麩胺酸偶聯或藉由PASylation來進一步修飾S-Fab (Pan等人(2018) International Journal of Nanomedicine, 2018:3189-3201)。
在另一實施例中，雙特異性構築體係scFv-單一域抗體，其中該構築體含有至少一個如所闡述直接或間接連接至含有對T細胞活化抗原(例如CD3)具有特異性之抗原結合域之VH及VL之scFv的PD-1 VHH。針對T細胞活化抗原之scFv (例如抗CD3 scFv)可含有如所闡述之VH及VL序列中之任一者。在一些實施例中，VHH域及scFv藉由連接體(例如肽連接體)連結。在一些實施例中，肽連接體可為如本文所闡述之肽連接體。在一些實施例中，VHH域及scFv各自視情況經由鉸鏈區或連接體(例如肽連接體)連結至Fc區(例如Fc區之N-末端)。Fc區可為本文所闡述之任一者，例如人類Fc區或其變體，例如人類IgG1 Fc區或其變體。在特定實例中，Fc區係藉由變體Fc域(例如變體人類IgG1域)所形成，該等變體Fc域經突變或修飾以促進異源二聚合，其中不同多肽可進行二聚合以產生異源二聚體。
在另一實施例中，CD3結合域係單一域抗體，例如係特異性結合至CD3之VHH域。已知單一域抗體(包含結合至CD3之VHH域)，例如參見公開美國專利申請案第US20160280795號。在一些實施例中，CD3結合域係SEQ ID NO:85中所陳述之抗CD3 VHH或與SEQ ID NO:85展現至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之序列且特異性結合至CD3。在該等態樣中，本文所提供之雙特異性構築體可包含至少一個PD-1 VHH域及至少一個CD3 VHH域。為格式化構築體，在一些情形下，每一VHH域視情況經由鉸鏈區或連接體(例如肽連接體)連結至Fc區(例如Fc區之N-末端)。Fc區可為本文所闡述之任一者，例如人類Fc區或其變體，例如人類IgG1 Fc區或其變體。在特定實例中，Fc區係藉由變體Fc域(例如變體人類IgG1域)所形成，該等變體Fc域經突變或修飾以促進異源二聚合，其中不同多肽可進行二聚合以產生異源二聚體。
在上述實施例中，已知用以促進異源二聚合之實例性Fc區修飾，包含如下文(例如表3)所闡述之任一者。在一些實施例中，異源二聚體Fc之一個Fc多肽包括SEQ ID NO:103、107、115或117中之任一者中所陳述之胺基酸序列，且異源二聚體Fc之另一Fc多肽含有SEQ ID NO:104、108、111、113、119或121中之任一者中所陳述之胺基酸序列。在一些實施例中，異源二聚體Fc之一個Fc多肽包括SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所陳述之胺基酸序列，且異源二聚體Fc之另一Fc多肽包括SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 2. 限制性 CD3 多特異性構築體
在一些實施例中，PD-1結合多肽係作為限制性T細胞嚙合融合蛋白之多特異性多肽構築體。在特定態樣中，本文所提供之限制性多特異性構築體結合活化T細胞抗原(例如CD3)及PD-1。通常，所提供限制性多特異性多肽構築體亦含有至少一個結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。本文所提供之限制性多特異性多肽構築體至少包含：第一組分，其包含免疫球蛋白Fc區；第二組分，其至少包含一或多個拷貝之結合CD3之結合域(在本文中稱為抗CD3結合域或CD3結合域，該等術語可在本文中互換使用)；及連接體(例如多肽連接體)，其接合第一組分及第二組分。在所提供多特異性多肽構築體中，第一組分及第二組分中之一者或兩者含有至少一個結合至PD-1之所提供VHH域，且第一組分及第二組分中之一者或兩者含有至少一個TAA抗原結合域，該TAA抗原結合域在結合至抗原時嚙合使得限制性CD3結合區實質上能夠結合CD3。
在一些實施例中，本文所提供之限制性多特異性多肽構築體就結合CD3且隨後活化T細胞之能力而言以兩種狀態存在：(1) 「惰性」狀態，其出現於任何或所有抗原結合域不結合至PD-1時，從而CD3結合受限且消除或減小T細胞相互作用；及(2) 「活性」狀態，其出現於任何或所有抗原結合域結合抗原時，從而CD3結合區能夠結合CD3且容許T細胞相互作用。
在一些實施例中，Fc區經由一或多個連接體連接至CD3結合域。在一些實施例中， Fc區經由一或多個不可裂解連接體連接至CD3結合區。在一些實施例中，Fc區經由一或多個可裂解連接體或另外不穩定連接體連接至CD3結合區。在一些實施例中，可裂解連接體係可在蛋白酶存在下特異性裂解之連接體。在一些態樣中，在裂解可裂解連接體後，CD3結合得以增強。在一些該等態樣中，「活性」狀態可經由若干機制進一步擴增，包含經由裂解接合CD3結合區及Fc區之連接體。在一些實施例中，可裂解連接體係含有用於蛋白酶之受質識別位點之連接體。在Fc區及CD3結合區藉由可裂解連接體連接之一些實施例中，可在裂解連接體後增強CD3結合。
另外，在Fc區及CD3結合區藉由可裂解連接體可操作地連接之態樣中，裂解Fc區與CD3結合區之間之連接體可將限制性多特異性多肽構築體分離成第一組分及第二組分。端視限制性多特異性多肽構築體之組成，第一組分及第二組分可具有不同功能性。在一些實施例中，Fc區係展現一或多種效應功能(例如ADCC、CDC或ADCP功能)之區域。在該等實例中，可使用本發明之限制性多特異性多肽構築體來產生自擴增系統。舉例而言，在一些態樣中，在Fc與CD3結合域組分之間納入蛋白酶可裂解連接體使得能夠藉由容許完全暴露CD3結合域來擴增T細胞活化能力。端視所包含之具體連接體，可藉由腫瘤相關蛋白酶或藉由在抗原依賴性-T細胞活化後釋放之顆粒酶來調介擴增步驟。若包含腫瘤蛋白酶可裂解連接體，則藉由腫瘤或腫瘤微環境來調介擴增。然而，若包含顆粒酶B可裂解連接體，則可在抗原依賴性活化後藉由T細胞自調介擴增。另外，倘若在構築體中包含啟用效應物之Fc，可藉由經由ADCC機制自NK細胞釋放之顆粒酶來調介擴增。
所提供限制性多特異性多肽構築體包含其中含有Fc區之第一組分N-末端連接至含有CD3結合區之第二組分之構形。在此一實施例中，第一組分及第二組分經由C-末端連接至Fc區末端之連接體進行接合。在一些實施例中，至少一個PD-1 VHH域定位於多特異性多肽構築體之胺基-末端(N-末端)區域中。在一些實施例中，至少一個PD-1 VHH域定位於多特異性多肽構築體之羧基-末端(C-末端)區域中。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體僅含一個定位於多特異性多肽構築體之N-末端或C-末端區域中之PD-1 VHH域。在一些實施例中，至少一個TAA抗原結合域定位於多特異性多肽構築體之胺基-末端(N-末端)區域中。在一些實施例中，至少一個TAA抗原結合域定位於多特異性多肽構築體之羧基-末端(C-末端)區域中。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個定位於多特異性多肽構築體之N-及C-末端區域中之TAA抗原結合域。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體係二聚體，其中二聚合係藉由兩條多肽鏈之間之共價或非共價相互作用所形成。在一些實施例中，兩條多肽鏈藉由(例如)鏈間二硫鍵彼此共價鍵結。在一些實施例中，Fc區調介經由鏈間二硫鍵之二聚合。在特定實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有異源二聚體Fc區，其中在一些情形下，多特異性多肽構築體之多肽鏈係不同的(異源二聚體)。在異源二聚體多特異性多肽構築體之特定實例中，CD3結合區係含有VH及VL鏈之雙鏈多肽，例如係含有VH及VL之Fv抗體片段。在一些實施例中，Fv抗體片段包含經二硫化物穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體係形成自或包含兩個多肽，該兩個多肽包含：第一多肽，其包括異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體(例如可裂解或不可裂解連接體)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VH域；及第二多肽，其包括異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接體(例如可裂解或不可裂解連接體)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域。在一些實施例中，第一多肽含有一或兩個結合至PD-1之VHH域。在一些實施例中，第二多肽含有一或兩個結合至PD-1之VHH域。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體僅含一個PD-1 VHH域。在一些實施例中，第一多肽含有一或兩個TAA抗原結合域。在一些實施例中，第二多肽含有一或兩個TAA抗原結合域。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個TAA抗原結合域。在一些情形下，至少一個TAA抗原結合域位於Fc多肽之N-末端且至少一個TAA抗原結合域位於CD3結合區之鏈之C-末端。在特定實施例中，至少一個結合至PD-1之VHH域位於獨立於異源二聚體分子中含有至少一個(例如兩個) TAA抗原結合域之多肽的多肽上。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個TAA抗原結合域及至少一個結合PD-1之VHH域。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有(1)第一多肽，其按N-末端至C-末端之順序包括：第一TAA抗原結合域、異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體(例如可裂解或不裂解連接體)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv或dsFv)之鏈(例如VH或VL)及第二TAA抗原結合域；及(2)第二多肽，其按N-末端至C-末端之順序包括：異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、相同連接體(例如相同可裂解或不裂解連接體)、抗CD3抗體或抗原結合片段之另一鏈(VH或VL中之另一者)及結合PD-1之VHH域。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有(1)第一多肽，其按N-末端至C-末端之順序包括：第一TAA抗原結合域、異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體(例如可裂解或不裂解連接體)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv或dsFv)之鏈(例如VH或VL)及第二TAA抗原結合域；及(2)第二多肽，其按N-末端至C-末端之順序包括：結合PD-1之VHH域、異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、相同連接體(例如相同可裂解或不裂解連接體)及抗CD3抗體或抗原結合片段之另一鏈(VH或VL中之另一者)。
在一些實施例中，第一多肽或第二多肽或第一多肽及第二多肽二者進一步包含結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)。在一些實施例中，第一多肽及/或第二多肽之CRBR可位於Fc多肽之N-末端及/或CD3結合區之鏈之C-末端。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個結合TAA之抗原結合域、結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)及結合PD-1之VHH域。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有(1)第一多肽，其按N-末端至C-末端之順序包括：第一TAA抗原結合域、異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體(例如可裂解連接體)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv或dsFv)之鏈(例如VH或VL)及第二TAA抗原結合域；及(2)第二多肽，其按N-末端至C-末端之順序包括：一個結合PD-1或CRBR之VHH域、異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、相同連接體(例如相同可裂解連接體)、抗CD3抗體或抗原結合片段之另一鏈(VH或VL中之另一者)及另一結合PD-1或CRBR之VHH域。
本發明之多特異性多肽構築體之每一組分更詳細地闡述於下文中。a. 抗原結合域
本發明之多特異性多肽構築體包含至少一個抗原結合域，例如至少第一抗原結合域及第二抗原結合域。在一些態樣中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域係選自抗體或抗原結合片段、天然(或原始)同族結合配偶體、抗運載蛋白(抗運載蛋白) (經改造脂質運載蛋白)、經設計錨蛋白重複蛋白(Darpin)、非諾爾(Fynomer)、森特因(Centyrin) (經改造纖連蛋白III域)、胱胺酸結域、阿非廷(Affilin)、親和體或經改造CH3域。在一些實施例中，天然同族結合配偶體包括TAA之天然同族結合配偶體或其展現TAA結合活性之變體之細胞外域或其結合片段。
在一些實施例中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)包含一或多個拷貝之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)包含一或多個拷貝之選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單一域重鏈抗體及單一域輕鏈抗體。
在一些實施例中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)係單鏈抗體。在一些實例中，單鏈係scFv、scAb、單一域重鏈抗體或單一域輕鏈抗體。
在一些實施例中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)包含一或多個單一域抗體(sdAb)片段，例如VHH、VNAR、經改造VH或VK域。可自天然駱駝科唯一重鏈抗體、唯一產生重鏈抗體之經基因修飾之齧齒類動物或幼稚/合成駱駝科或人類化駱駝科單一域抗體庫來生成VHH。可自軟骨魚唯一重鏈抗體來生成VNAR。已實施各種方法以自習用異源二聚體VH及VK域來生成單體sdAb，包含界面改造及選擇特定種系家族。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體之抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)含有至少一個結合TAA之sdAb或scFv。在一些實施例中，至少一個結合TAA之scFv或sdAb定位於多特異性多肽構築體之胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含一個結合至TAA之scFv或sdAb，該scFv或sdAb可定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有兩個結合至TAA之scFv或sdAb，該等scFv或sdAb定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有三個scFv或sdAb，其中兩個定位於胺基-末端(相對於Fc區)或羧基-末端(相對於CD3結合區)，且第三個定位於多特異性多肽構築體之另一端。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係形成自或包含兩個多肽，該等多肽包含：第一多肽，其包括異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv) 之VH域及結合至腫瘤相關抗原之scFv或sdAb；及第二多肽，其包括異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接體、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域及視情況結合至腫瘤相關抗原之相同或不同scFv或sdAb。結合至TAA之scFv或sdAb可定位於胺基末端(相對於異源二聚體Fc之Fc多肽)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區之VH或VL鏈)。多特異性多肽構築體之第一多肽及/或第二多肽中之至少一者亦包含結合PD-1之VHH域(例如本發明中所陳述之任一者)。在一些態樣中，多特異性多肽構築體之第一多肽及/或第二多肽中之至少一者亦可包含如所闡述結合共刺激受體或其鏈之CRBR。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體之抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)含有呈單一域抗體(sdAb)形式之結合域。
在一些實施例中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)含有一條以上鏈。在一些實施例中，多特異性多肽構築體之抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)含有組裝為FAB之VH及VL序列。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體之抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)含有結合TAA之Fab抗體之VH-CH1 (Fd)及VL-CL。在一些實施例中，含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL之Fab抗體定位於多特異性多肽構築體之胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含一個Fab抗體，該Fab抗體含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL，結合至TAA，且可定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有兩個Fab抗體片段，該等Fab抗體片段各自含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL且結合至TAA，其中一個片段定位於胺基-末端(相對於Fc區)且另一片段定位於羧基-末端(相對於CD3結合區)。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係形成自或包含三個或更多個多肽，該等多肽包含：第一多肽，其包括異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體及結合至腫瘤相關抗原之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL；第二多肽，其包括異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接體及視情況之結合至腫瘤相關抗原之Fab抗體片段之相同VH-CH1 (Fd)或VL-CL；及第三多肽，其包括結合至TAA之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。
在一些實施例中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域係或包含TAA之天然(或原始)同族結合配偶體或其展現TAA結合活性之變體之細胞外域或其結合片段。
在一些實施例中，抗原結合域或每一獨立抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)結合相同抗原。在一些實施例中，存在一個以上之結合TAA之抗原結合域及每一抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)結合不同抗原。在一些實施例中，每一抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)結合相同腫瘤相關抗原(TAA)。在一些實施例中，每一抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)結合不同TAA。在一些實施例中，每一抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)結合相同TAA上之不同表位。在一些實施例中，每一抗原結合域(例如第一抗原結合域及第二抗原結合域)結合相同TAA上之相同表位。
在一些實施例中，結合TAA之抗原結合域或每一獨立抗原結合域以單價、二價、三價或四價方式結合至TAA。
在一些實施例中，TAA係選自由以下組成之群：1-92-LFA-3、5T4、α-4整聯蛋白、α-V整聯蛋白、α4β1整聯蛋白、α4β7整聯蛋白、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9 (Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸鹽受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明質酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、美索塞林(Mesothelin)、MRP4、MUC1、黏蛋白6 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、納卡斯楚因(Nicastrin)、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸鹽、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域或每一獨立抗原結合域結合腫瘤相關抗原(TAA)葉酸鹽受體α (FRα)。舉例而言，抗原結合域含有呈結合FRα之sdAb形式之結合域。實例性FRα結合 sdAb陳述於SEQ ID NO: 86、87或88中。所提供多特異性多肽構築體中之抗原結合域或每一獨立抗原結合域可與任一前述SEQ ID No具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性且結合FRα。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域或每一獨立抗原結合域結合腫瘤相關抗原(TAA) cMET。舉例而言，抗原結合域含有呈結合cMET之sdAb形式之結合域。實例性cMET結合sdAb陳述於SEQ ID NO: 89中(美國專利第9,346,884號)。所提供多特異性多肽構築體中之抗原結合域或每一獨立抗原結合域可與前述SEQ ID No具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性且結合cMET。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域或每一獨立抗原結合域結合腫瘤相關抗原(TAA) B7H3。舉例而言，抗原結合域含有呈結合B7H3之scFv形式之結合域。在一些實施例中，抗原結合域係或含有包括VH-CH1 (Fd)及LC之Fab抗體片段。實例性B7H3 Fd闡述於PCT公開案第WO2017/030926號中。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域或每一獨立抗原結合域結合腫瘤相關抗原(TAA) CD20。舉例而言，抗原結合域含有呈結合CD20之scFv形式之結合域。實例性CD20結合scFv陳述於SEQ ID NO: 90中或含有SEQ ID NO: 91及92中所陳述之VL及VH (美國公開案第US 2005/0123546號)。所提供多特異性多肽構築體中之抗原結合域或每一獨立抗原結合域可與任一前述SEQ ID No具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性且結合CD20。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域或每一獨立抗原結合域結合腫瘤相關抗原(TAA) DLL3。舉例而言，抗原結合域含有呈結合DLL3之scFv形式之結合域。實例性DLL3結合scFv陳述於SEQ ID NO: 93及94中(美國公開案第US 2017/0037130號)。在一些實施例中，抗原結合域或含有結合DLL3之包括Fd及LC之Fab抗體片段。實例性DLL3 Fd陳述於SEQ ID NO: 95中且實例性DLL3 LC陳述於SEQ ID NO: 96中(美國專利第US 8,044,178號)。所提供多特異性多肽構築體中之抗原結合域或每一獨立抗原結合域可與任一前述SEQ ID No具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性且結合DLL3。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域或每一獨立抗原結合域結合腫瘤相關抗原(TAA) 5T4。實例性5T4 Fd陳述於SEQ ID NO: 97中且實例性5T4 LC陳述於SEQ ID NO: 98中。在一些實施例中，抗體結合域包括如SEQ ID NO: 99及100中所陳述之VH及VL (美國專利第US 8,044,178號)。所提供多特異性多肽構築體中之抗原結合域或每一獨立抗原結合域可與任一前述SEQ ID No具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性且結合5T4。
在一些實施例中，至少一個抗原結合域或每一獨立抗原結合域結合腫瘤相關抗原(TAA) gpNMB。在一些實施例中，抗原結合域係或含有包括Fd及LC鏈之Fab片段。實例性gpNMB Fd陳述於SEQ ID NO: 101中且實例性gpNMB LC陳述於SEQ ID NO: 102中。所提供多特異性多肽構築體中之抗原結合域或每一獨立抗原結合域可與任一前述SEQ ID No具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性且結合gpNMB。
在一些實施例中，抗原結合域經由連接體直接或間接連接至Fc區及/或CD3結合區。在一些實施例中，鍵聯係經由連接體。在一些實施例中，連接體係連接肽(LP)，其可包含如所闡述之任一撓性或剛性連接體。在一些實施例中，連接體係選自由以下組成之群：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接體係包括甘胺酸殘基之撓性連接體，例如(藉由非限制性實例方式) GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，連接體包含GS-連接體及甘胺酸連接體之組合。b. Fc 區
限制性多特異性多肽構築體包含免疫球蛋白Fc區。通常，限制性多特異性多肽構築體係藉由多肽形成之二聚體，每一多肽含有Fc。Fc多肽可為如上文所陳述之任一者。在特定實施例中，Fc區係藉由Fc域所形成，該等Fc域經突變或修飾以促進異源二聚合，其中不同多肽可進行二聚合以產生異源二聚體。因此，在一些實施例中，二聚體係異源二聚體，其中多特異性多肽構築體之兩條多肽鏈係不同的。
已知促進互補Fc多肽之異源二聚合之各種方法，例如參見Ridgway等人，Protein Eng. 9:617-621 (1996)；Merchant等人，Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)；Moore等人(2011) MAbs, 3:546-57；Von Kreudenstein等人，MAbs, (2013) 5:646-54；Gunasekaran等人(2010) J. Biol. Chem., 285:19637-46；Leaver-Fay等人(2016) Structure, 24:641-51；Ha等人(2016) Frontiers in Immunology, 7:1；Davis等人(2010) Protein Eng Des Sel, 23:195-202；公開國際PCT申請案第WO 1998/050431號、第WO 2009/089004號、第WO2011143545號、第WO 2014/067011號、第WO 2012/058768號、第WO2018027025號；公開美國專利申請案第US20140363426號、第US20150307628號、第US20180016354號、第US20150239991號；及美國專利第US5731168號、第US7183076號、第US9701759號、第US9605084號及第US9650446號。促進Fc鏈之異源二聚合之方法包含Fc區誘變，例如藉由包含一組「隆凸與孔洞」突變或包含實現靜電牽引Fc以有益於不同多肽鏈中之有吸引力相互作用之突變。舉例而言，在一些實施例中，異源二聚體之Fc多肽包含用以改變Fc二聚體界面中之電荷極性之突變，從而靜電匹配之Fc鏈之共表現支持有益之有吸引力相互作用，由此促進期望Fc異源二聚體形成，而不利之排斥性電荷相互作用則抑制不期望Fc同源二聚體形成(Guneskaran等人(2010) JBC, 285: 19637-19646)。在共表現於細胞中時，在該等鏈之間可能發生締合，但該等鏈因電荷排除而並不實質上自我締合。用於生成異源二聚體Fc之其他策略包含混合人類IgG及IgA CH3域區段以產生互補CH3異源二聚體(其稱為SEED Fc)。
在一些實施例中，為促進異源二聚合，Fc異源二聚體之兩個多肽含有配對或互補之胺基酸修飾。Fc融合體之多肽之實例性配對胺基酸修飾陳述於表 3 中。
表 3 ： 異源二聚體 Fc 之配對胺基酸
第一 Fc 多肽 第二 Fc 多肽
T366W T366S/L368W/Y407V
T366W/S354C T366S/L368A/Y407V/Y349C
S364H/F405A Y349T/Y349F
T350V/L351Y/F405A/Y407V T350V/T366L/K392L/T394W
K360D/D399M/Y407A E345R/Q347R/T366V/K409V
K409D/K392D D399K/E356K
K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
L360E/K409W/Y349C Q347R/399V/F405T/S354C
K370E/K409W E357N/D399V/F405T
在一些實施例中，修飾包含將凸起(隆凸)引入第一Fc多肽中且將空腔(孔洞)引入第二Fc多肽中，從而凸起可位於空腔中以促進第一及第二含Fc多肽之複合。多肽中用於代替及/或修飾以產生凸起或空腔之靶向胺基酸通常係與第二多肽之界面中之一或多種胺基酸相互作用或接觸之界面胺基酸。
在一些實施例中，經修飾以含有凸起(孔洞)胺基酸之第一Fc多肽包含代替，其中使用具有至少一條自第一Fc多肽界面突出且由此可位於第二多肽之毗鄰界面中之補償性空腔(孔洞)中之側鏈的胺基酸來代替天然或原始胺基酸。最通常而言，代替胺基酸係側鏈體積大於原始胺基酸殘基者。熟習此項技術者知曉如何來測定及/或評價胺基酸殘基之性質以鑑別係用以產生凸起之理想代替胺基酸者。在一些實施例中，用於形成凸起之代替殘基係天然胺基酸殘基且包含(例如)精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)。在一些實例中，經鑑別用於代替之原始殘基係具有小側鏈之胺基酸殘基，例如丙胺酸、天門冬醯胺、天門冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
在一些實施例中，經修飾以含有空腔(孔洞)之第二Fc多肽係包含如下代替者：使用具有至少一條自第二多肽界面凹陷且由此能夠容納來自第一多肽界面之相應凸起之側鏈之胺基酸來代替天然或原始胺基酸。最通常而言，代替胺基酸係側鏈體積小於原始胺基酸殘基者。熟習此項技術者知曉如何測定及/或評價胺基酸殘基之性質以鑑別係用於形成空腔之理想代替殘基者。通常，用於形成空腔之代替殘基係天然胺基酸且包含(例如)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。在一些實例中，經鑑別用於代替之原始胺基酸係具有大側鏈之胺基酸，例如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。
舉例而言，人類IgG1之CH3界面在位於4條逆平行β鏈上之自每一表面埋入1090 Å2之每一域中包含16個殘基(例如參見Deisenhofer等人(1981) Biochemistry, 20:2361-2370；Miller等人(1990) J Mol. Biol., 216, 965-973；Ridgway等人(1996) Prot. Engin., 9: 617-621；美國專利第5,731,168號)。用以產生凸起或空腔之CH3域修飾闡述於(例如)以下文獻中：美國專利第5,731,168號；國際專利申請案WO98/50431及WO 2005/063816；及Ridgway等人(1996) Prot. Engin., 9: 617-621。在一些實例中，用以產生凸起或空腔之CH3域修飾通常靶向位於兩條中心逆平行β鏈上之殘基。此旨在最小化所產生凸起可藉由突出至周圍溶劑中來容納而非由配偶體CH3域中之補償性空腔容納之風險。
舉例而言，在一些實施例中，異源二聚體Fc包含在CH3域內之Thr366處具有胺基酸修飾之多肽，在經體積較大性胺基酸(例如Try)代替(T366W)時，該域能夠優先地與在體積較小性胺基酸位置Thr366、Leu368及Tyr407處具有胺基酸修飾(例如分別係Ser、Ala及Val) (T366S/L368A/Y407V)之第二CH3域進行配對。可藉由引入二硫鍵(例如藉由在相對CH3域上將Ser354變為Cys (S354C)且將Tyr349變為Cys (Y349C))來進一步穩定經由CH3修飾之異源二聚合(綜述於Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15中)。
可藉由任一適宜方法來純化所得限制性多特異性多肽構築體，例如藉由蛋白質A或蛋白質G管柱上之親和力層析。在將編碼不同多肽之兩個核酸分子轉變成細胞時，將形成同源二聚體及異源二聚體。可調節表現條件，從而異源二聚體形成之傾向性大於同源二聚體形成。
用於基於異源二聚體對親和試劑之差異性親和力自同源二聚體回收異源二聚體之技術已眾所周知。在一些態樣中，該等技術包含設計異源二聚體，從而一條Fc多肽鏈並不結合至親和試劑蛋白質A。在一些情形下，一條多肽鏈可含有一或多個胺基酸取代以廢止或減小Fc異源二聚體之一個多肽中對蛋白質A試劑之親和力，例如參見WO2017134440、WO2010151792、Jendeberg等人(Jendeberg等人(1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34。在一些該等實施例中，可在異源二聚體之一個成員上之蛋白質-A結合位點處修飾Fc區以防止蛋白質-A結合且由此使得能夠更有效地純化異源二聚體融合蛋白。此結合位點內之實例性修飾係Ile253，例如Ile253Arg (I253R)。在一些實施例中，修飾可為H435R或H435R/Y436F。在一些實施例中，Fc異源二聚體之Fc多肽可含有修飾，從而其能夠結合蛋白質A，但不結合蛋白質G (pA+/pG-)。實例性pA+/pG-胺基酸修飾包含含有位置428絲胺酸、位置434絲胺酸及視情況位置436組胺酸(參照人類IgGl)或在人類IgG 2、3或4中之相應位置包括該等殘基之Fc。在一些態樣中，一個IgG Fc多肽中之位置428、434及視情況436之該等胺基酸酸修飾可減小或防止蛋白質G結合，從而增強蛋白質純化。
在一些實施例中，可組合用以賦予親和試劑差異性親和力之該等修飾中之任一者與上文所闡述之任一或多個其他胺基酸修飾。舉例而言，可組合I253R修飾與T366S/L368A/Y407V修飾或T366W修飾。T366S/L368A/Y407V修飾性Fc能夠形成同源二聚體，此乃因並無二聚合界面之立體阻塞(如在T336W修飾性Fc之情形下)。因此，在一些實施例中，組合I253R修飾與T366S/L368A/Y407V修飾性Fc以禁止純化可形成之任一同源二聚體Fc。可藉由組合T366S/L368A/Y407V及H453R來採用類似修飾。
在一些實施例中，異源二聚體分子之Fc區另外可含有一或多個其他Fc突變(例如上文所闡述之任一者)。在一些實施例中，異源二聚體分子含有具有減小效應功能之突變之Fc區。
在一些實施例中，異源二聚體Fc之一個Fc多肽包括SEQ ID NO:103、107、115或117中之任一者中所陳述之胺基酸序列，且異源二聚體Fc之另一Fc多肽含有SEQ ID NO: 104、108、111、113、119或121中之任一者中所陳述之胺基酸序列。在一些實施例中，異源二聚體Fc之一個Fc多肽包括SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所陳述之胺基酸序列，且異源二聚體Fc之另一Fc多肽包括SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所陳述之胺基酸序列。
在一些實施例中，所提供多特異性多肽構築體之Fc區展現一或多種效應功能。在一些情形下，Fc區能夠提供Fc介導之效應功能，例如ADCC (例如藉由NK細胞釋放顆粒酶B)、ADCP及/或CDC。一般而言，除抗原結合能力(其係免疫球蛋白之主要功能)外，Fc區亦負責效應功能，例如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。另外，存在於Fc區中之FcRn序列用於藉由偶聯至活體內FcRn受體以增加活體內半衰期來調控血清中之IgG含量。在多特異性多肽構築體含有可裂解連接體之一些實施例中，連接體裂解可產生以下兩種各自具有生物活性之組分：CD3結合區，其能夠結合及嚙合T細胞上之CD3，且在一些態樣中亦可含有用於誘導T細胞上之共刺激信號之CRBR及/或用於阻斷T細胞上之抑制信號之結合PD-1之VHH域；及Fc區，其連接至TAA抗原結合域且可展現靶特異性效應功能。
在一些實施例中，Fc區包含經突變或修飾以改變一或多種效應功能之Fc多肽。因此，在一些情形下，在用於所提供限制性多特異性多肽構築體之Fc中，可改變(例如減小或增強)效應功能(例如ADCC、ADCP及/或CDC中之一或多者)。用以減小效應功能之實例性突變包含如上文所闡述之任一者。c.  CD3 結合域
限制性多特異性多肽構築體包含CD3結合域。本發明之抗CD3結合域經由嚙合T細胞上之CD3或CD3複合物成員來活化T細胞。在較佳實施例中，本發明之抗CD3結合域特異性結合CD3之ε鏈(亦稱為CD3ε)。本發明之抗CD3ε結合域經由嚙合T細胞上之CD3ε來活化T細胞。本發明之抗CD3結合域激發、刺激、活化及/或另外增加CD3調介之T細胞活化。CD3之生物活性包含(例如) T細胞活化及經由CD3與T細胞受體(TCR)之抗原結合亞單元之間之相互作用之其他信號傳導。舉例而言，本發明之抗CD3結合域經由嚙合T細胞上之CD3ε藉由部分地或完全調節(例如激發、刺激、活化或另外增加) CD3調介之T細胞活化來完全或部分地活化T細胞。
CD3結合域可為如上文所闡述之任一者。在特定實施例中，CD3結合域係結合CD3ε之Fv抗體片段(在本文中稱為抗CD3ε Fv片段)。在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段係經二硫化物穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。在一些實施例中，抗CD3結合域對於結合CD3而言係單價的。
在一些實施例中，CD3結合區係含有可變重鏈(Hv，亦稱為VH)及可變輕鏈(Lv，亦稱為VL)之Fv抗體片段，例如如所闡述之任一者。在該等實施例之態樣中，免疫球蛋白Fc區係含有兩個不同Fc多肽(Fc異源二聚體之兩個多肽之間能夠進行異源二聚體締合)之異源二聚體Fc區，例如如所闡述之任一者。在該等實施例中，CD3結合區之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)連接於異源二聚體Fc之相對鏈上。
在一些實施例中，CD3結合區係SP34 (Pessano等人，The EMBO Journal. 4: 337-344, 1985)或SP34人類化變體(WO2015001085)之Fv或dsFv。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域係包含重鏈可變胺基酸序列及輕鏈可變胺基酸序列之組合之Fv或dsFv片段。在一些實施例中，CD3結合域係Fv或dsFv片段，其含有：VH CDR1序列，其至少包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)；VH CD2序列，其至少包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)；VH CDR3序列，其至少包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)；VL CDR1序列，其至少包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)；VL CDR2序列，其至少包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)；及VL CDR3序列，其至少包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域係包含選自SEQ ID NO: 35-65之群之重鏈可變胺基酸序列及選自由SEQ ID NO: 66-84、285組成之群之輕鏈可變胺基酸序列的Fv或dsFv片段。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域係Fv或dsFv片段包含：重鏈可變胺基酸序列，其與選自由SEQ ID NO: 35-65組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大程度一致；及與選自由SEQ ID NO: 66-84、285組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大程度一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗CD3結合域係Fv或dsFv，其含有包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包括SEQ ID NO:  285之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。d. 連接體
限制性多特異性多肽構築體含有連接體，該連接體接合或偶合含有免疫球蛋白Fc區之第一組分及含有CD3結合區之第二組分。在一些實施例中，連接體定位於Fc區之C-末端區域之末端處，從而Fc區N-末端連接至CD3結合區。應理解，因所提供限制性多特異性多肽構築體係多聚體(例如含有一起形成第一組分及第二組分之第一多肽及第二多肽之二聚體)，所提供構築體包含接合Fc部分及第一多肽之CD3結合區之連接體及接合Fc部分及第二多肽之CD3結合區之連接體。在一些實施例中，第一多肽包含異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體及CD3結合區之第一域(例如VH)，且第二多肽包含異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接體及CD3結合區之第二域(例如VL)。通常，存在於限制性多特異性多肽構築體之第一多肽及第二多肽中之連接體係相同的。因此，在一些實施例中，CD3結合域之每一域經由連接體(例如相同連接體)連接至(Fc，例如異源二聚體Fc)之對端多肽。
用於融合蛋白中之各種多肽連接體已眾所周知(例如參見Chen等人(2013) Adv. Drug. Deliv. 65:1357-1369；及國際PCT公開案第WO 2014/099997號、第WO2000/24884號；美國專利第5,258,498號；美國專利第5,525,491號；美國專利第5,525,491號；美國專利第6,132,992號)。
在一些實施例中，選擇連接體，從而在CD3結合區接合至多特異性多肽偶聯物之Fc區時， CD3結合區受限制且在使多特異性多肽構築體與細胞接觸時不能或不能實質上結合或咬細胞(例如T細胞)之表面上之CD3。可採用各種分析來評價藉由多特異性多肽構築體之CD3結合或嚙合，包含用以評價T細胞結合、NFAT活化(使用報告基因系統)、細胞毒性T細胞活性、細胞介素產生及/或T細胞活化標記物表現之分析。實例性分析展示於所提供實例中。通常，連接體亦係確保多肽構築體之正確摺疊者，其不展現與所連接多肽之活性或功能不一致之電荷或與一或多個域中之胺基酸殘基形成將阻止或改變所連接多肽之活性的鍵或其他相互作用。在一些實施例中，連接體係多肽連接體。多肽連接體可為撓性連接體或剛性連接體或二者之組合。在一些態樣中，連接體係短、中等或長連接體。在一些實施例中，連接體之長度最多為40個胺基酸。在一些實施例中，連接體之長度最多為25個胺基酸。在一些實施例中，連接體之長度為至少或至少約2個胺基酸。在一些態樣中，適宜長度係(例如)至少一個且通常少於約40個胺基酸殘基之長度，例如2-25個胺基酸殘基、5-20個胺基酸殘基、5-15個胺基酸殘基、8-12個胺基酸。在一些實施例中，連接體具有或具有約2至24個胺基酸、2至20個胺基酸、2至18個胺基酸、2至14個胺基酸、2至12個胺基酸、2至10個胺基酸、2至8個胺基酸、2至6個胺基酸、6至24個胺基酸、6至20個胺基酸、6至18個胺基酸、6至14個胺基酸、6至12個胺基酸、6至10個胺基酸、6至8個胺基酸、8至24個胺基酸、8至20個胺基酸、8至18個胺基酸、8至14個胺基酸、8至12個胺基酸、8至10個胺基酸、10至24個胺基酸、10至20個胺基酸、10至18個胺基酸、10至14個胺基酸、10至12個胺基酸、12至24個胺基酸、12至20個胺基酸、12至18個胺基酸、12至14個胺基酸、14至24個胺基酸、14至20個胺基酸、14至18個胺基酸、18至24個胺基酸、18至20個胺基酸或20至24個胺基酸。在一些實施例中，連接體之長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。
在某些態樣中，連接體長度愈長，則在多特異性多肽偶聯結合至其抗原(例如TAA)時之CD3結合愈大。因此，在一些態樣中，連接體之長度大於12個胺基酸，例如長度大於13、14、15、16、17或18個胺基酸。在一些實施例中，連接體之長度為12至40個胺基酸、12至30個胺基酸、12至24個胺基酸、12至18個酸、12至15個胺基酸、15至40個胺基酸、15至30個胺基酸、15至24個胺基酸、15至18個胺基酸、18至40個胺基酸、18至30個胺基酸、18至24個胺基酸、24至40個胺基酸、24至30個胺基酸或30至40個胺基酸。
連接體可為天然的、合成的或二者之組合。尤其適宜之連接體多肽主要包含選自甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、丙胺酸(Ala)及蘇胺酸(Thr)之胺基酸殘基。舉例而言，連接體可含有至少75% (基於存在於肽連接體中之殘基總數所計算，例如至少80%、至少85%或至少90%)之選自Gly、Ser、Ala及Thr之胺基酸殘基。連接體亦可僅由Gly、Ser、Ala及/或Thr殘基組成。在一些實施例中，連接體含有1-25個甘胺酸殘基、5-20個甘胺酸殘基、5-15個甘胺酸殘基或8-12個甘胺酸殘基。在一些態樣中，適宜肽連接體通常含有至少50%之甘胺酸殘基，例如至少75%之甘胺酸殘基。在一些實施例中，肽連接體僅包括甘胺酸殘基。在一些實施例中，肽連接體僅包括甘胺酸及絲胺酸殘基。
在一些實施例中，該等連接體主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸構成，其在本文中表示為GS-連接體。在一些實施例中，連接體含有(GGS)n (其中n為1至10，例如1至5，例如1至3)，例如GGS(GGS)n (SEQ ID NO:123) (其中n為0至10)。在特定實施例中，連接體含有序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 123)，其中n為1至10或n為1至5 (例如1至3)。在其他實施例中，連接體含有(GGGGGS)n (SEQ ID NO:124)，其中n為1至4，例如1至3。連接體可包含上述結構中之任一者之組合，舉例而言，可組合2、3、4或5個GS、GGS、GGGGS及/或GGGGGS連接體之重複單元。在一些實施例中，此一連接體之長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個胺基酸。
在一些實施例中，連接體係(以單字母胺基酸代碼形式)：GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 125)或GGGGGS (SEQ ID NO: 126)。在一些實施例中，GS-連接體包括以下胺基酸序列：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS，亦即(G5S)3 (SEQ ID NO: 127)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 129)及GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:128)。在一些實施例中，連接體係GGGG (SEQ ID NO:5)。在上述實例中之任一者之一些中，絲胺酸可經丙胺酸代替(例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
在一些實施例中，連接體包含具有胺基酸序列Glyx Xaa-Glyy -Xaa-Glyz (SEQ ID NO:130)之肽連接體，其中每一Xaa獨立地選自丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、酪胺酸(Tyr)、天門冬醯胺(Asn)、麩醯胺酸(Gln)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天門冬胺酸鹽(Asp)及麩胺酸鹽(Glu)，且其中x、y及z各自係在1-5範圍內之整數。在一些實施例中，每一Xaa獨立地選自由以下組成之群：Ser、Ala及Thr。在特定變化形式中，x、y及z中之每一者等於3 (由此產生具有胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:131)之肽連接體，其中每一Xaa係如上文一般進行選擇。
在一些實施例中，連接體係基於(SSSSG)y (SEQ ID NO:132)基序之重複單元之富絲胺酸連接體，其中y至少為1，但y可為2、3、4、5、6、7、8及9。
在一些情形下，可期望在肽連接體中提供一定剛性。此可藉由在肽連接體之胺基酸序列中包含脯胺酸殘基來達成。因此，在一些實施例中，在肽連接體之胺基酸序列中，連接體包括至少一個脯胺酸殘基。舉例而言，肽連接體可具有其中至少25% (例如至少50%或至少75%)之胺基酸殘基係脯胺酸殘基之胺基酸序列。在一特定實施例中，肽連接體僅包括脯胺酸殘基。
在一些態樣中，肽連接體包括至少一個半胱胺酸殘基，例如一個半胱胺酸殘基。舉例而言，在一些實施例中，連接體包括至少一個半胱胺酸殘基及選自由以下組成之群之胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala及Thr。在一些該等實施例中，連接體包括甘胺酸殘基及半胱胺酸殘基，例如唯一甘胺酸殘基及半胱胺酸殘基。通常，每一肽連接體包含僅一個半胱胺酸殘基。包括半胱胺酸殘基之具體連接體一個實例包含具有胺基酸序列Glym -Cys-Glyn 之肽連接體，其中n及m各自係1-12之整數(例如3-9、4-8或4-7)。在特定變化形式中，此一肽連接體具有胺基酸序列GGGGG-C-GGGGG (SEQ ID NO: 133)。
在一些實施例中，融合蛋白之連接體係結構化或限制性連接體。在特定實施例中，結構化連接體含有序列(AP)n或(EAAAK)n (SEQ ID NO:134) (其中n為2至20、較佳地4至10)，包含(但不限於) AS-(AP)n-GT (SEQ ID NO:135)或AS-(EAAAK)n-GT (SEQ ID NO:136) (其中n為2至20，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)。在其他實施例中，連接體包括序列(GGGGA)n (SEQ ID NO:137)、(PGGGS)n (SEQ ID NO:138)、(AGGGS)n (SEQ ID NO:139)或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS (SEQ ID NO:140，其中 n為2至20。在一些實施例中，連接體係SSSASASSA (SEQ ID NO:141)、GSPGSPG (SEQ ID NO:142)或ATTTGSSPGPT (SEQ ID NO:143)。在一些實施例中，該等連接體因其結構可更為抵抗蛋白水解降解，由此在注射於活體內時提供一定優點。
在一些實施例中，連接體並非可裂解連接體，亦稱為不可裂解連接體。在一些實施例中，連接體不可藉由蛋白酶裂解。在一些實施例中，非可裂解連接體或不可藉由蛋白酶裂解之連接體係通常穩定用於活體內遞送或重組產生者。在一些態樣中，不可藉由蛋白酶裂解之連接體包含不含至少一個較佳地處於蛋白酶之可裂解肽序列或識別位點內之肽鍵者。在特定實施例中，不可裂解連接體並非蛋白酶之靶受質，從而與含有用於相同蛋白酶之受質識別位點之連接體相比，其並不優先地或特異性地藉由蛋白酶裂解。
在一些實施例中，連接體不含用於特定蛋白酶之受質識別位點或裂解位點，該位點係藉由蛋白酶之活性位點識別且藉由蛋白酶裂解之序列。通常，舉例而言，對於絲胺酸蛋白酶而言，裂解序列係由受質中之P1-P4及P1′-P4′胺基酸構成，其中裂解發生於P1位置之後。通常，絲胺酸蛋白酶之裂解序列長6個殘基以匹配許多蛋白酶之擴展受質特異性，但可端視蛋白酶而更長或更短。通常，連接體不包含藉由蛋白酶識別之P1-P1′異裂鍵序列。在一些態樣中，不可裂解連接體或不含藉由蛋白酶特異性識別而裂解之受質識別位點之連接體係其中蛋白酶裂解實質上小於蛋白酶之靶受質裂解者。
在一些實施例中，連接體係可裂解連接體。在一些態樣中，可裂解連接體係進一步包含因存在至少一個可在生理學條件下斷裂之鍵而作為蛋白酶受質之序列之連接體，例如上文所闡述之任一者。在一些情形下，可裂解連接體在存在於活體內之特定條件下對裂解易感或敏感，該等條件係(例如)在暴露於細胞外蛋白酶後，包含存在於活體內細胞環境中者。在一些情形下，蛋白酶可存在於特定生理學微環境(例如腫瘤微環境)中，由此限制可發生裂解之位點。
蛋白酶通常特異性或優先裂解特定靶受質(與另一非靶受質相比)。可基於序列(例如連接體)之裂解速率常數來測定此一特異性程度，該裂解速率常數係蛋白酶對其受質之偏好及酶效率之量度。可使用測定在各種濃度之受質存在下隨時間之裂解增加速率之任一方法來計算特異性常數。舉例而言，受質連接至在藉由蛋白酶裂解時釋放之螢光部分。藉由測定不同蛋白酶濃度下之裂解速率，可測定特定蛋白酶針對特定連接體之裂解特異性常數(kcat /Km )。在一些實施例中，可裂解連接體係能夠藉由蛋白酶以約至少1×104 M−1 S−1 、或至少5×104 M−1 S、至少10×104 M−1 S、至少10×105 M−1 S或更大之速率特異性裂解之連接體。
在一些實施例中，本發明之限制性多特異性多肽構築體包含接合第一組分及第二組分之可裂解連接體。在一些實施例中，可裂解連接體包含可用作蛋白酶(通常細胞外蛋白酶)之受質之胺基酸序列。舉例而言，可裂解連接體可包含含有至少一個較佳地位於蛋白酶之可裂解肽序列內之肽鍵之裂解序列。適宜蛋白酶包含(例如)基質金屬蛋白酶(MMP)、半胱胺酸蛋白酶、絲胺酸蛋白酶及胞漿素活化劑，該等物質以強化方式形成或活化於疾病(例如類風濕性關節炎或癌症)中，從而引起過度組織降解、發炎及轉移。在特定實施例中，蛋白酶係由腫瘤、經活化免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)或腫瘤微環境中之細胞產生之蛋白酶。在一些實施例中，蛋白酶係顆粒酶B、間質蛋白酶或MMP (例如MMP-2)。
可基於藉由鄰近表現靶之細胞之腫瘤產生及/或藉由與多特異性多肽構築體之期望靶共局部化於組織中之腫瘤產生的蛋白酶來選擇可裂解連接體。在文獻中報導，具有諸多癌症(例如實體腫瘤)中之已知受質之蛋白酶之含量有所增加。例如參見La Rocca等人(2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421。
在一些實施例中，接合限制性多特異性多肽構築體之第一組分及第二組分之可裂解連接體係由藉由經一種組分活化之免疫效應細胞產生的蛋白酶所裂解。舉例而言，涵蓋效應物激活或增強之IgG Fc區之多特異性多肽構築體在與靶抗原嚙合時能夠誘發ADCC。ADCC之核心在於自效應細胞(亦即NK細胞及細胞毒性T細胞)釋放顆粒酶B及穿孔素。在釋放後，顆粒酶B以穿孔素依賴性方式進入靶細胞中，其中其介導細胞凋亡。重要的是，顆粒酶B在效應細胞與靶細胞之間之細胞外突觸內具有活性。在一些實施例中，接合多特異性多肽構築體之第一組分及第二組分之可裂解連接體係藉由顆粒酶B所裂解。顆粒酶B釋放於藉由多特異性多肽構築體之一種組分調介之效應細胞活化期間。在一些實施例中，可藉由免疫效應細胞(包含經活化T細胞或NK細胞)來產生顆粒酶B及其他蛋白酶。在一些實施例中，在藉由多特異性多肽構築體結合TAA時藉由CD3嚙合來活化T細胞可釋放該等蛋白酶，該等蛋白酶然後可裂解特定可裂解連接體，由此強化或增加CD3結合分子嚙合CD3之活性。在一些實施例中，裂解可擴增或增加由多特異性構築體在以未裂解狀態結合至TAA時所達成之活性。
實例性受質包含(但不限於)可藉由下列酶或蛋白酶中之一或多者裂解之受質：ADAMS、ADAMTS，例如ADAM8；ADAM9；ADAM10；ADAM12；ADAM15；ADAM17/TACE；ADAMDEC1；ADAMTS1；ADAMTS4；ADAMTS5；天門冬胺酸蛋白酶，例如BACE或腎素；天門冬胺酸細胞自溶酶，例如細胞自溶酶D或細胞自溶酶E；半胱天冬酶(Caspase)，例如半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10或半胱天冬酶14；半胱胺酸細胞自溶酶，例如細胞自溶酶B、細胞自溶酶C、細胞自溶酶K、細胞自溶酶L、細胞自溶酶S、細胞自溶酶V/L2、細胞自溶酶X/Z/P；半胱胺酸蛋白酶，例如克魯茲蛋白酶(Cruzipain)；豆莢蛋白(Legumain)；卵巢腫瘤泛素異肽酶(Otubain)-2；KLK，例如KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13或KLK14；金屬蛋白酶，例如甲基多巴(Meprin)；腎胰島素殘基溶酶(Neprilysin)；PSMA；BMP-1；MMP，例如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26或MMP27；絲胺酸蛋白酶，例如經活化蛋白質C、細胞自溶酶A、細胞自溶酶G、凝乳酶(Chymase)、凝血因子蛋白酶(例如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa)、彈性蛋白酶(Elastase)、顆粒酶B、胍基苯甲酸酶、HtrA1、人類嗜中性球彈性蛋白酶、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、馬拉譜因(Marapsin)、NS3/4A、PACE4、胞漿素、PSA、tPA、凝血酶、纖維蛋白溶酶(Tryptase)、uPA；II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP)，例如DESC1、DPP-4、FAP、海普森(Hepsin)、間質蛋白酶-2、間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3或TMPRSS4；及其任一組合。
在一些實施例中，可裂解連接體係藉由多種蛋白酶(例如2種或更多種蛋白酶、3種或更多種蛋白酶、4種或更多種蛋白酶，等等)裂解。
在一些實施例中，可裂解連接體經選擇以與特定蛋白酶一起使用，該特定蛋白酶係(例如)已知藉由鄰近表現靶之細胞之腫瘤產生及/或藉由與多特異性多肽構築體之靶共局部化之腫瘤產生的蛋白酶。
在一些實施例中，可裂解連接體含有用於特定蛋白酶之受質識別位點或裂解位點，該位點係藉由蛋白酶之活性位點識別且藉由蛋白酶裂解之序列。通常，舉例而言，對於絲胺酸蛋白酶而言，裂解序列係由受質中之P1-P4及P1′-P4′胺基酸構成，其中裂解發生於P1位置之後。通常，絲胺酸蛋白酶之裂解序列長6個殘基以匹配許多蛋白酶之擴展受質特異性，但可端視蛋白酶而更長或更短。通常，可裂解連接體包含藉由蛋白酶識別之P1-P1′異裂鍵序列。在一些態樣中，可裂解連接體經改造以引入能夠藉由特定蛋白酶裂解之肽鍵，例如藉由引入蛋白酶之受質識別位點序列或裂解序列。
在一些實施例中，可裂解連接體包含兩個或更多個受質序列之組合。在一些實施例中，每一受質序列係藉由相同蛋白酶裂解。在一些實施例中，至少兩個受質序列係藉由不同蛋白酶裂解。在一些實施例中，可裂解連接體包括作為顆粒酶B之受質之胺基酸。在一些實施例中，顆粒酶B可裂解連接體含有具有通式P4 P3 P2 P1 ↓ P1’ 之胺基酸序列(SEQ ID NO: 144)，其中P4係胺基酸I、L、Y、M、F、V或A；P3係胺基酸A、G、S、V、E、D、Q、N或Y；P2係胺基酸H、P、A、V、G、S或T；P1係胺基酸D或E；且P1’係胺基酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A。在一些實施例中，顆粒酶B可裂解連接體含有具有通式P4 P3 P2 P1 ↓ P1’ 之胺基酸序列(SEQ ID NO: 145)，其中P4係胺基酸I或L；P3係胺基酸E；P2係胺基酸P或A；P1係胺基酸D；且P1’係胺基酸I、V、T、S或G。
在一些實施例中，顆粒酶B受質包括胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)、LEPG (SEQ ID NO: 147)或LEAE (SEQ ID NO:148)。在一些實施例中，可裂解連接體含有胺基酸序列，可裂解連接體包括胺基酸序列IEPDI (SEQ ID NO:149)、LEPDG (SEQ ID NO:150)、LEADT (SEQ ID NO:151)、IEPDG (SEQ ID NO:152)、IEPDV (SEQ ID NO:153)、IEPDS (SEQ ID NO:154)、IEPDT (SEQ ID NO:155)、IEPDP (SEQ ID NO:144)、LEPDG (SEQ ID NO:152)或LEADG (SEQ ID NO:153)。
在一些實施例中，可裂解連接體包括作為間質蛋白酶受質之胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接體包括序列P4QAR↓(A/V) (SEQ ID NO: 156)，其中P4係任一胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接體包括序列RQAR(A/V) (SEQ ID NO: 157)。在一些實施例中，間質蛋白酶受質包括胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)。在一些實施例中，可裂解連接體包括胺基酸序列RQARV (SEQ ID NO: 159)。
在一些實施例中，可裂解連接體包括作為一或多種基質金屬蛋白酶(MMP)之受質之胺基酸。在一些實施例中，MMP係MMP-2。在一些實施例中，可裂解連接體含有通式P3 P2 P1 ↓ P1’ (SEQ ID NO: 160)，其中P3係P、V或A；P2係Q或D；P1係A或N；且P1’係L、I或M。在一些實施例中，可裂解連接體含有通式P3 P2 P1 ↓ P1’ (SEQ ID NO: 161)，其中P3係P；P2係Q或D；P1係A或N；且P1’係L或I。在一些實施例中，MMP受質包括胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)。
在一些實施例中，可裂解連接體包括作為顆粒酶B受質之胺基酸序列及作為間質蛋白酶受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接體包括胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)及胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)之組合。
在一些實施例中，可裂解連接體包括作為顆粒酶B受質之胺基酸序列及作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接體包括胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)及胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)之組合。
在一些實施例中，可裂解連接體包括作為間質蛋白酶受質之胺基酸序列及作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接體包括胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)及胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)之組合。
在一些實施例中，可裂解連接體包括作為顆粒酶B受質之胺基酸序列、作為間質蛋白酶受質之胺基酸序列及作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接體包括作為顆粒酶B受質之胺基酸序列及作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接體包括胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)、胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)及胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)之組合。
可裂解連接體可包含任何已知連接體。可裂解連接體之實例闡述於以下文獻中：Be’liveau等人(2009) FEBS Journal, 276；美國公開申請案第US20160194399號、第US20150079088號、第US20170204139號、第US20160289324號、第US20160122425號、第US20150087810號、第US20170081397號；美國專利第US9644016號。
在一些實施例中，可裂解連接體包括選自由以下組成之群之胺基酸序列：TGLEADGSPAGLGRQARVG (SEQ ID NO: 163)；TGLEADGSRQARVGPAGLG (SEQ ID NO: 164)；TGSPAGLEADGSRQARVGS (SEQ ID NO: 162)；TGPAGLGLEADGSRQARVG (SEQ ID NO: 166)；TGRQARVGLEADGSPAGLG (SEQ ID NO: 167)；TGSRQARVGPAGLEADGS (SEQ ID NO: 168)；及TGPAGLGSRQARVGLEADGS (SEQ ID NO:169)；GPAGLGLEPDGSRQARVG (SEQ ID NO: 170)；GGSGGGGIEPDIGGSGGS (SEQ ID NO: 171)；GGSGGGGLEADTGGSGGS (SEQ ID NO: 172)；GSIEPDIGS (SEQ ID NO: 173)；GSLEADTGS (SEQ ID NO: 174)；GGSGGGGIEPDGGGSGGS (SEQ ID NO: 175)；GGSGGGGIEPDVGGSGGS (SEQ ID NO: 176)；GGSGGGGIEPDSGGSGGS (SEQ ID NO: 177)；GGSGGGGIEPDTGGSGGS (SEQ ID NO: 178)；GGGSLEPDGSGS (SEQ ID NO: 179)；及GPAGLGLEADGSRQARVG (SEQ ID NO: 180)；GGEGGGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 181)；GSSAGSEAGGSGQAGVGS (SEQ ID NO: 182)；GGSGGGGLEAEGSGGGGS (SEQ ID NO: 183)；GGSGGGGIEPDPGGSGGS(SEQ ID NO: 184)；TGGSGGGGIEPDIGGSGGS (SEQ ID NO: 185)。e. 抗 PD-1 VHH 域
本發明之限制性多特異性多肽構築體包含至少一個來自本文所提供之任一者之PD-1 VHH域。在一些實施例中，PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 245-287、294-299及312-315中之任一者中所陳述之胺基酸序列。
在特定實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個PD-1 VHH域(例如如所闡述之任一者)。在一些情形下，至少一個PD-1 VHH域定位於胺基末端(相對於異源二聚體Fc之Fc多肽)且至少一個PD-1 VHH域定位於羧基-末端(相對於CD3結合區之VH或VL鏈)。在一些態樣中，兩個PD-1 VHH域中之每一者係相同的。
在特定實施例中，限制性多特異性多肽構築體僅含PD-1域。在一些情形下，PD-1 VHH域定位於胺基末端(相對於異源二聚體Fc之Fc多肽)。在一些實施例中，PD-1 VHH域定位於羧基-末端(相對於CD3結合區之VH或VL鏈)。
在一些實施例中，抗PD-1 VHH域經由連接體直接或間接連接至Fc區及/或CD3結合區。在一些實施例中，鍵聯係經由連接體。在一些實施例中，連接體係連接肽(LP)，其可包含如所闡述之任一撓性或剛性連接體。在一些實施例中，連接體係選自由以下組成之群：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 244)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 245)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 246)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 247)。在一些實施例中，連接體係包括甘胺酸殘基之撓性連接體，例如(藉由非限制性實例方式) GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 248)、GGGGG (SEQ ID NO: 249)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，連接體包含GS-連接體及甘胺酸連接體之組合。f. 共刺激結合域
本發明之多特異性多肽構築體包含一或多個結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)。在一些實施例中，所提供多特異性多肽構築體之一或多個CRBR結合表現於T細胞上之共刺激受體。在一些實施例中，共刺激受體上調、誘導或表現於經活化T細胞之表面上。在一些態樣中，CRBR結合共刺激受體且刺激共刺激受體。在一些實施例中，共刺激受體與多特異性多肽之CRBR之激動性結合可誘導T細胞中之下游信號傳導以在嚙合CD3後強化或增強T細胞活化或功能性。在一些實施例中，CRBR或每一獨立CRBR係抗體或抗原結合片段、共刺激受體之天然同族結合配偶體、抗運載蛋白(經改造脂質運載蛋白)、經設計錨蛋白重複蛋白、非諾爾、森特因(經改造纖連蛋白III域)、胱胺酸結域、阿非廷、親和體或經改造CH3域。
在一些實施例中，CRBR或每一獨立CRBR (例如第一CRBR及第二CRBR)包含一或多個拷貝之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，CRBR或每一獨立CRBR (例如第一抗原結合域及第二CRBR)包含一或多個拷貝之選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單一域重鏈抗體及單一域輕鏈抗體。
在一些實施例中，CRBR或每一獨立CRBR (例如第一CRBR及第二CRBR)係單鏈抗體。在一些實例中，單鏈係scFv、scAb、單一域重鏈抗體或單一域輕鏈抗體。
在一些實施例中，CRBR或每一獨立CRBR (例如第一CRBR及第二CRBR)包含一或多個單一域抗體(sdAb)片段(例如VH H、VNAR 、經改造VH 或VK 域)。可自天然駱駝科唯一重鏈抗體、唯一產生重鏈抗體之經基因修飾之齧齒類動物或幼稚/合成駱駝科或人類化駱駝科單一域抗體庫來生成VH H。可自軟骨魚唯一重鏈抗體來生成VNAR 。已實施各種方法以自習用異源二聚體VH 及VK 域來生成單體sdAb，包含界面改造及選擇特定種系家族。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體之CRBR或每一獨立CRBR (例如第一CRBR及/或第二CRBR)含有至少一個結合共刺激受體之sdAb或scFv。在一些實施例中，至少一個結合共刺激受體之scFv或sdAb定位於多特異性多肽構築體之胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含一個結合至共刺激受體之scFv或sdAb，該scFv或sdAb可定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有兩個結合至共刺激受體之scFv或sdAb，該等scFv或sdAb定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係形成自或包含兩個多肽，該等多肽包含：第一多肽，其包括異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv) 之VH域及結合至共刺激受體之scFv或sdAb；及第二多肽，其包括異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接體、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域及視情況另一結合至共刺激受體之相同或不同scFv或sdAb。結合至共刺激受體之scFv或sdAb可定位於胺基末端(相對於異源二聚體Fc之Fc多肽)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區之VH或VL鏈)。多特異性多肽構築體之第一多肽及/或第二多肽中之至少一者亦包含結合TAA或其鏈之抗原結合域，如部分II.4中所闡述。在一些實施例中，結合TAA之抗原結合域係scFv或sdAb且包含為多特異性多肽構築體之第一多肽及/或第二多肽之一部分。在一些實施例中，結合TAA之抗原結合域係Fab，且多特異性多肽構築體另外形成自第三多肽，其中至少第一多肽及第二多肽包含結合TAA之Fab之鏈(例如Fab之VH-CH1或VL-CL)且第三多肽含有結合TAA之Fab之另一鏈(例如Fab之VH-CH1或VL-CL中之另一者)。
在一些實施例中，CRBR或每一獨立CRBR (例如第一CRBR及/或第二CRBR)含有一條以上鏈。在一些實施例中，多特異性多肽構築體之CRBR或每一獨立CRBR (例如第一CRBR及/或第二CRBR)含有組裝為FAB之VH及VL序列。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體之CRBR抗原結合域或每一獨立CRBR抗原結合域(例如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)含有結合共刺激受體之Fab抗體之VH-CH1 (Fd)及VL-CL。在一些實施例中，含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL之Fab抗體定位於多特異性多肽構築體之胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含一個Fab抗體，該Fab抗體含有VH-CH1 (Fd)或VL-CL，結合至共刺激受體，且可定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有兩個Fab抗體片段，該等Fab抗體片段各自含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL且結合至共刺激受體，其中一個片段定位於胺基-末端(相對於Fc區)且另一片段定位於羧基-末端(相對於CD3結合區)。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係形成自或包含三個或更多個多肽，該等多肽包含：第一多肽，其包括異源二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接體及結合至共刺激受體之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL；第二多肽，其包括異源二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接體及視情況之結合至共刺激受體之Fab抗體片段之相同VH-CH1 (Fd)或VL-CL；及第三多肽，其包括結合至共刺激受體之Fab抗體片段之VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。多特異性多肽構築體之第一、第二及/或第三多肽亦可包含PD-1 VHH域(例如如所闡述之任一者)。
在一些實施例中，CRBR或每一獨立CRBR係或包含共刺激受體(例如天然配體)之天然(原始)同族結合配偶體或其對共刺激受體展現結合活性之變體。
在一些實施例中，所提供多特異性多肽構築體之一或多個CRBR結合表現於T細胞上之共刺激受體。在一些實施例中，存在一個以上結合至共刺激受體之CRBR且每一CRBR (例如第一CRBR及第二CRBR)結合相同共刺激受體。在一些實施例中，每一CRBR (例如第一CRBR及CRBR)結合不同共刺激受體。在一些實施例中，每一CRBR (例如第一CRBR及第二CRBR)結合相同共刺激受體上之不同表位。在一些實施例中，每一CRBR (例如第一抗原-CRBR及CRBR)結合相同共刺激受體上之相同表位。
在一些實施例中，結合共刺激受體之CRBR或每一獨立CRBR以單價、二價、三價或四價方式結合至共刺激受體。
在一些實施例中，共刺激受體表現於T細胞(例如自個體獲得之原代T細胞)上。在一些實施例中，共刺激受體表現於人類T細胞(例如自人類個體獲得之原代人類T細胞)上。
在一些實施例中，共刺激受體係腫瘤壞死因子(TNF)受體家族之成員。在一些實施例中，共刺激受體係免疫球蛋白超家族(IgSF)之成員。在一些實施例中，共刺激受體係B7受體家族之成員。
在一些實施例中，共刺激受體係選自由以下組成之群：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)及NKG2D。在一些實施例中，共刺激受體係選自41BB、OX40、GITR、ICOS或CD28。在一些實施例中，共刺激受體係選自41BB、OX40或GITR。
在一些實施例中，共刺激受體係41BB。在一些實施例中，共刺激受體係OX40。在一些實施例中，共刺激受體係GITR。在一些實施例中，共刺激受體係ICOS。在一些實施例中，共刺激受體係CD28。
在一些實施例中，多特異性多肽之CRBR係或包括共刺激受體之激動性結合分子。CRBR可結合至共刺激受體且引發、誘導或刺激與藉由受體之天然配體所引發、誘導或刺激者類似或相同之反應或活性。在一些態樣中，CRBR與共刺激受體之結合所誘導或刺激之下游信號係藉由受體之天然配體所引發、誘導或刺激之信號的大於5%、大於10%、大於20%、大於30%、大於40%、大於50%、大於60%、大於70%、大於80%、大於90%或大於100%。
在一些實施例中，一或多個CRBR係結合至以下各項之抗體或其片段：共刺激受體41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)。在一些實施例中，一或多個CRBR係結合至共刺激受體41BB、OX40、GITR、ICOS或CD28之抗體或其片段。在一些實施例中，一或多個CRBR係結合至共刺激受體41BB、OX40或GITR之抗體或其片段。結合41BB、OX40及GITR之實例性多肽分別闡述於PCT公開案第WO2017123650號、第WO2017123673號及第WO2017015623號中。在一些實施例中，一或多個CRBR係結合共刺激受體之單一域抗體(sdAb)，例如闡述於PCT公開案第WO2017123650號、第WO2017123673號及第WO2017015623號中者。
在一些實例中，共刺激受體結合區(CRBR)結合或包括以下各項之天然同族結合配偶體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)、NKG2D。在一些實施例中，天然同族結合配偶體係選自41BB配體(41BBL)、OX40L (CD252)、CD70、GITR配體/TNFSF18、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、ICOS配體(ICOSL)、CD154 (CD40L)、B細胞活化因子(BAFF)、增殖誘導性配體(APRIL)、NKG2D配體或其功能片段。
CRBR之實例性序列陳述於表 4 中。
在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR結合共刺激受體41BB。在一些實例中，CRBR係或含有對41BB具有特異性或結合其之抗體或抗原結合片段，例如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR係41BB之天然配體或係其功能結合片段。在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR係抗運載蛋白。該等結合41BB之CRBR之實例陳述於SEQ ID NO: 186-210中之任一者中。在一些實施例中，結合41BB之CRBR含有SEQ ID NO: 187、189及191中之任一者中所陳述之VH及SEQ ID NO: 188、190或192中之任一者中所陳述之VL。所提供多特異性多肽構築體中之CRBR或每一獨立CRBR可與任一前述SEQ ID NO具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合41BB。
在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR結合共刺激受體OX40。在一些實例中，CRBR係或含有對OX40具有特異性或結合其之抗體或抗原結合片段，例如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR係OX40之天然配體或係其功能結合片段。該等結合OX40之CRBR之實例陳述於SEQ ID NO: 211-220中之任一者中。在一些實施例中，結合OX40之CRBR含有SEQ ID NO: 216及218中之任一者中所陳述之VH及SEQ ID NO: 217及219中之任一者中所陳述之VL。所提供多特異性多肽構築體中之CRBR或每一獨立CRBR可與任一前述SEQ ID NO具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合OX40。
在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR結合共刺激受體GITR。在一些實例中，CRBR係或含有對GITR具有特異性或結合其之抗體或抗原結合片段，例如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR係GITR之天然配體或係其功能結合片段。該等結合GITR之CRBR之實例陳述於SEQ ID NO: 221-230中之任一者中。在一些實施例中，結合GITR之CRBR含有VH SEQ ID NO: 222、224、226及228中之任一者中所陳述之及SEQ ID NO: 223、225、227及229中之任一者中所陳述之VL。所提供多特異性多肽構築體中之CRBR或每一獨立CRBR可與任一前述SEQ ID NO具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合GITR。
在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR結合共刺激受體CD27。在一些實例中，CRBR係或含有對CD27具有特異性或結合其之抗體或抗原結合片段，例如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR係CD27之天然配體或係其功能結合片段。該等結合CD27之CRBR之實例陳述於中任一SEQ ID NO: 231中。在一些實施例中，結合CD27之CRBR含有SEQ ID NO: 232中所陳述之VH及SEQ ID NO: 233中所陳述之VL。所提供多特異性多肽構築體中之CRBR或每一獨立CRBR可與任一前述SEQ ID NO具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合CD27。
在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR結合共刺激受體ICOS。在一些實例中，CRBR係或含有對ICOS具有特異性或結合其之抗體或抗原結合片段，例如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR係ICOS之天然配體或係其功能結合片段。實例性之結合ICOS之CRBR序列陳述於SEQ ID NO: 234中。
在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR結合共刺激受體CD28。在一些實例中，CRBR係或含有對CD28具有特異性或結合其之抗體或抗原結合片段，例如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或每一獨立CRBR係CD28之天然配體或係其功能結合片段。實例性之結合CD28之CRBR序列陳述於SEQ ID NO: 235中。
表 4 ： 實例性 CRBR 序列
CRBR 形式 參考文獻 SEQ ID NO
結合 41BB 之 CRBR 序列
41BBL 天然配體 UniProt登錄號：P41273 186
PF-05082566    VH US 2012/0237498  (SEQ ID NO:  43) 187
VL US 2012/0237498  (SEQ ID NO:  45) 188
BMS663513 VH WO 2005/035584  (SEQ ID NO: 9) 189
VL WO 2005/035584  (SEQ ID NO: 6) 190
MSB7 VH US 2017/0226215 (SEQ ID NO: 138) 191
VL US 2017/0226215 (SEQ ID NO:  28) 192
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 12) 193
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 13) 194
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 14) 195
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 15) 196
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 16) 197
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 17) 198
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 18) 199
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 SEQ ID NO: 19) 200
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 20) 200
人類41BBL之71-254 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 3) 201
人類41BBL之85-254 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 4) 202
人類41BBL之80-254 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 5) 203
人類4lBBL之52-254 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 6) 204
人類41BBL之71-248 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 7) 206
人類41BBL之85-248 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 8 207
人類41BBL之80-248 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 9) 208
人類41BBL之52-248 41BB配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 10) 209
41BB sdAb sdAb US 2017/0198050 210
結合 OX40 之 CRBR 序列
OX40配體 天然配體 UniProt登錄號：P23510 211
OX40配體 天然配體 US 7,959,925 (SEQ ID NO: 2) 212
人類OX40L: 51-183 天然配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 11) 213
人類Ox40L: 51-183 N90D 天然配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 12) 214
人類OX40L: 52-183 天然配體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 13) 215
1A07 VH US 2015/0307617 (SEQ ID NO: 56) 216
VL US 2015/0307617 (SEQ ID NO: 59) 217
1949 VH WO 2016/179517 (SEQ ID NO: 16) 218
VL WO 2016/179517 219
1D10v1 sdAb US 9,006,399 220
結合 GITR 之 CRBR 序列
GITR配體 天然配體 UniProt第Q9UNG2號 221
36E5 VH US 2014/0348841 (SEQ ID NO: 104) 222
VL US 2014/0348841 (SEQ ID NO: 105) 223
TRX-518 VH US 2013/0183321 (SEQ ID NO: 54) 224
VL US 2013/0183321 (SEQ ID NO: 44) 225
5H7v2 VH US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 282) 226
VL US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 134) 227
41G5v2 VH US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 312) 228
VL US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 124) 229
C06v3 sdAb US 2017/0022284   (SEQ ID NO: 59) 230
結合 CD27 之 CRBR 序列
CD70-ECD 天然配體 UniProt第P32970號 231
1F5 VH US 2011/0274685 232
VL US 2011/0274685 233
結合 ICOS 之 CRBR 序列
ICOS sdAb sdAb    234
結合 CD28 之 CRBR 序列
CD28 sdAb sdAb    235
在一些實施例中，一或多個CRBR經由連接體直接或間接連接至Fc區及/或CD3結合區。在一些實施例中，鍵聯係經由連接體。在一些實施例中，連接體係連接肽(LP)，其可包含如本文所闡述之任一撓性或剛性連接體，但連接CRBR或區域之肽通常並非可裂解連接體。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體在CRBR與Fc區之間包括連接肽(LP)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體在CD3結合區與CRBR之間包括連接肽(LP)。 3. NK 募集
在一些實施例中，PD-1結合多肽係雙特異性構築體，其係或包括本文所提供之至少一個PD-1 VHH域及至少一個能夠結合至表現於天然殺手(NK)細胞上之表面分子及/或募集NK細胞之其他結合分子。在特定態樣中，多特異性構築體針對PD-1及NK細胞表面分子係雙特異性。在一些實施例中，表面分子係CD16 (FcγRIII)。具體而言，所提供雙特異性PD-1結合多肽能夠特異性結合表現於人類NK細胞上之NK活化受體(例如人類CD16a)。
CD16 (一些IgG之Fc部分之已知涉及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之低親和力受體)係負責觸發藉由NK細胞之靶細胞裂解之最佳表徵之膜受體(Mandelboim等人，1999, PNAS 96:5640-5644)。通常，大部分(大約90%)之人類NK細胞以低密度表現CD56 (CD56dim)且以高含量表現FcγRIII (CD16) (Cooper等人，2001, Trends Immunol. 22:633-640)。人類FcγRIII以兩種同種型CD16a (FcγRIIIA)及CD16b (FcγRIIIB)存在，該等同種型在其細胞外免疫球蛋白結合區中共有96%序列一致性(van de Winkel及Capel, 1993, Immunol. Today 14(5):215-221)。在特定實施例中，其他結合分子能夠特異性結合CD16a。
CD16a作為跨膜受體表現於巨噬球、肥大細胞及NK細胞上。在NK細胞上，CD16a之α鏈與含有FcεRI γ鏈及/或T細胞受體(TCR)/CD3 ζ鏈之免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)締合以調介信號傳導(Wirthmueller等人，1992, J. Exp. Med. 175:1381-1390)。已在NK細胞中觀察到CD16a與γ鏈及ζ鏈之同源二聚體及異源二聚體之不同組合之相互作用，從而指示能夠在NK細胞中經由利用CD16a複合物之各自變化形式之不同信號傳導路徑來調介信號傳導(Anderson等人，1990, PNAS 87(6):2274-2278；Ackerly等人，1992, Int. J. Cancer，增刊7:11-14)。表現FcγR之效應細胞已展示經由ADCC參與破壞腫瘤細胞。舉例而言，嚙合CD16a與(例如)能夠特異性結合CD16a之激動劑結合分子可活化表現CD16a之NK細胞，由此誘發生物反應、尤其信號傳導反應。在一些情形下，結合分子能夠以類似於抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之方式藉助結合至該等細胞來觸發細胞殺死。
在特定實例中，PD-1結合多肽包含可特異性結合至PD-1及CD16a之雙特異性分子，該等雙特異性分子可使NK細胞靶向具有該抗原之細胞，從而可經由NK細胞介導之細胞殺死來根除具有抗原之細胞。舉例而言，特異性結合表現於腫瘤細胞上之PD-1之結合分子可使NK細胞靶向腫瘤細胞。在一些情形下，藉由結合至CD16a之結合分子引起之NK細胞活化可殺死腫瘤細胞。
在一些實施例中，對活化NK細胞受體(例如CD16a)具有特異性之其他結合域係選自以下之抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、經二硫化物穩定之Fv片段(dsFv)、scAb、dAb、單一域重鏈抗體(VHH)或單一域輕鏈抗體。在一些實施例中，其他結合域對於結合活化T NK細胞受體(例如CD16a)而言係單價的。
在一些情形下，其他結合域識別CD16a。在一些實施例中，抗CD16a結合域包含一或多個拷貝之抗CD16a Fab片段、抗CD16a F(ab')2 片段、抗CD16a Fv片段、抗CD16a  scFv、抗CD16a dsFv、抗CD16a  scAb、抗CD16a  dAb、抗CD16a單一域重鏈抗體(VHH)及抗CD16a單一域輕鏈抗體。在一些實施例中，抗CD16a結合域對於結合CD16a而言係單價的。在一些實施例中，BH73結合多肽係結合BH73且激發CD16a活性之雙特異性構築體。
對CD16a具有特異性之抗體及其抗原結合片段已眾所周知且包含(例如) NM3E2 (McCall等人(1999) Mol. Immunol., 36:433-045。其他抗CD16a抗體亦可用於本文所提供之構築體中，包含以下文獻中所闡述之任一者：公開美國專利申請案第US10160280795號；美國專利第9,701,750號；Behar等人(2008) Protein Eng Des Sel. 21:1-10；Arndt等人(1999) Blood 94:2562-2568。在特定實例中，抗CD16a係抗CD16a scFv。在一些實施例中， 抗CD16a係包含於TandAb分子中之抗CD16a抗體(例如參見Reush等人(2014) Mabs, 6:727-738)。在一些態樣中，抗CD16a係美國專利第9,035,026號中所闡述之抗CD16a或抗原結合片段(例如scFv)。
所提供雙特異性構築體可格式化為含有至少一個PD-1 VHH域至少一個對活化NK細胞受體具有特異性之其他域(例如CD16a結合域)之諸多形式中之任一者。
在一實施例中，雙特異性構築體係雙特異性單一域抗體連接之Fab (S-Fab)，其含有至少一個如所闡述直接或間接連接至對NK細胞活化受體(例如CD16a)具有特異性之Fab抗原結合片段(例如抗CD16a Fab)之PD-1 VHH域。在一些實施例中，PD-1 VHH域連接至抗C16a Fab之VH或VL鏈之C-末端。在一些實施例中，可(例如)藉由與聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺(HPMA)共聚物、蛋白質(例如白蛋白)、聚麩胺酸偶聯或藉由PASylation來進一步修飾S-Fab (Pan等人(2018) International Journal of Nanomedicine, 2018:3189-3201)。
在另一實施例中，雙特異性構築體係scFv-單一域抗體，其中該構築體含有至少一個如所闡述直接或間接連接至含有對NK細胞活化受體(例如CD16a)具有特異性之抗原結合域之VH及VL之scFv的PD-1 VHH。針對NK細胞活化受體之scFv(例如抗CD16a scFv)可含有如所闡述之VH及VL序列中之任一者。在一些實施例中，VHH域及scFv藉由連接體(例如肽連接體)連結。在一些實施例中，肽連接體可為如本文所闡述之肽連接體。在一些實施例中，VHH域及scFv各自視情況經由鉸鏈區或連接體(例如肽連接體)連結至Fc區(例如Fc區之N-末端)。Fc區可為本文所闡述之任一者，例如人類Fc區或其變體，例如人類IgG1 Fc區或其變體。在特定實例中，Fc區係藉由變體Fc域(例如變體人類IgG1域)所形成，該等變體Fc域經突變或修飾以促進異源二聚合，其中不同多肽可進行二聚合以產生異源二聚體。
在另一實施例中，對NK細胞活化受體(例如CD16a)具有特異性之抗原結合域係單一域抗體，例如係特異性結合至CD16a之VHH域。已知單一域抗體(包含結合至CD16a之VHH域)，例如參見公開美國專利申請案第US20160280795號。在該等態樣中，本文所提供之雙特異性構築體可包含至少一個PD-1 VHH域及至少一個CD16a VHH域。為格式化構築體，在一些情形下，每一VHH域視情況經由鉸鏈區或連接體(例如肽連接體)連結至Fc區(例如Fc區之N-末端)。Fc區可為本文所闡述之任一者，例如人類Fc區或其變體，例如人類IgG1 Fc區或其變體。在特定實例中，Fc區係藉由變體Fc域(例如變體人類IgG1域)所形成，該等變體Fc域經突變或修飾以促進異源二聚合，其中不同多肽可進行二聚合以產生異源二聚體。
在上述實施例中，已知用以促進異源二聚合之實例性Fc區修飾，包含如下文(例如表1)所闡述之任一者。在一些實施例中，異源二聚體Fc之一個Fc多肽包括SEQ ID NO:103、107、115或117中之任一者中所陳述之胺基酸序列，且異源二聚體Fc之另一Fc多肽含有SEQ ID NO:104、108、111、113、119或121中之任一者中所陳述之胺基酸序列。在一些實施例中，異源二聚體Fc之一個Fc多肽包括SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所陳述之胺基酸序列，且異源二聚體Fc之另一Fc多肽包括SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 4. 細胞介素融合體及 / 或細胞介素受體靶向
在一些實施例中，PD-1結合多肽係作為細胞介素-抗體融合蛋白之多特異性多肽構築體(亦稱為PD-1 VHH-細胞介素融合體)。在一些態樣中，本文所提供之至少一個PD-1 VHH域直接或間接連接至至少一種細胞介素(例如干擾素)。在特定實施例中，細胞介素係能夠展現抗增殖活性、細胞凋亡活性及/或抗病毒活性之干擾素。在一些實施例中，本文所提供PD-1 VHH-細胞介素融合體之干擾素能夠結合至由IFNAR1及/或2構成之受體。可使用各種分析中之任一者來評價該等融合蛋白對結合IFNAR1及/或2、減小或降低癌細胞之生長速率及/或增殖速率、減小腫瘤大小、消除腫瘤或誘導癌細胞死亡(例如經由細胞凋亡)之效應。該等分析包含使用已知表現PD-1之各種癌細胞系之活體外分析或採用動物腫瘤模型之活體內分析。
在一些實施例中，干擾素係I型干擾素，例如人類I型干擾素或其變體。在一些態樣中，人類I型干擾素係作為經截短人類I型干擾素或人類突變I型干擾素之變體。在一些實施例中，I型干擾素或其變體係野生型人類IFNα (IFNα；α2及天然較高親和力變體，例如α 14)、干擾素β (IFN-β)以及其突變及/或截短形式。在一些實施例中，干擾素係II型干擾素，例如人類II型干擾素或其變體。在一些態樣中，人類II型干擾素係作為經截短人類II型干擾素或人類突變II型干擾素之變體。在一些實施例中，II型干擾素或其變體係野生型人類干擾素γ (IFN-γ)以及其突變體及/或截短形式。在一些實施例中，可使用所提供細胞介素-抗體融合蛋白來抑制表現或過度表現PD-1之靶細胞(例如癌細胞)之生長及/或增殖。
在一些實施例中，PD-1 VHH-細胞介素融合蛋白在形式上類似於如以下文獻中所闡述之任一者：國際PCT公開申請案第WO2014194100號；美國專利第9,803,021號；Valedkarimi等人(2017) Biomed Pharmacother., 95:731-742；或Young等人(2014) Semin Oncol., 41:623-636。
在特定實施例中，干擾素(例如I型干擾素，例如人類I型干擾素，例如IFNα、IFNβ或IFNγ)係擁有天然或野生型干擾素之內源性結合親和力及/或活性者，較佳地，內源性結合親和力及/或活性程度為天然野生型干擾素(以其經分離形式)之至少60%或至少或至少約80% (例如至少90%、95%、98%、99%、100%)或更大程度。
干擾素及干擾素突變體已眾所周知且係充分表徵之細胞介素群組(例如參見WO 2002/095067；WO 2002/079249；WO 2002/101048；WO 2002/095067；WO 2002/083733；WO 2002/086156；WO 2002/083733；WO 2003/000896；WO 2002/101048；WO 2002/079249；WO 2003/000896；WO 2004/022593；WO2004/022747；WO 2003/023032；WO 2004/022593亦及Kim等人(2003) Cancer Lett. 189(2): 183-188；Hussain等人(2000) J. Interferon Cytokine Res. 20(9): 763-768；Hussain等人(1998) J. Interferon Cytokine Res. 18(7): 469-477；Nyman等人(1988) Biochem. J. 329 (Pt 2): 295-302；Golovleva等人(1997) J. Interferon Cytokine Res. 17(10): 637-645；Hussain等人(1997) J. Interferon Cytokine Res. 17(9): 559-566；Golovleva等人(1997) Hum. Hered. 47(4): 185-188；Kita等人(1991) J. Interferon Cytokine Res. 17(3): 135-140；Golovleva等人(1996) Am. J. Hum. Genet. 59(3): 570-578；Hussain等人(1996) J. Interferon Cytokine Res. 16(7): 523-529；Linge等人(1995) Biochim Biophys Acta。該等細胞介素中之任一者可用於所提供細胞介素-抗體融合蛋白中。
在一些實施例中，干擾素係人類I型干擾素。人類干擾素家族之基因/蛋白質之等位基因已眾所周知，例如參見Pestka (10983) Arch Biochem Biophys., 221:1-37；Diaz等人(1994) Genomics, 22:540-52；Pestka (1986) Meth. Enzymol, 199: 3-4；及Krause等人(2000) J. Biol. Chem., 275:22995-3004。
在一些實施例中，干擾素係全長IFNα (例如人類IFNα)、全長IFNβ (例如人類IFNβ)或全長IFNγ (例如人類IFNγ)。在一些實施例中，干擾素係生物活性截短IFNα (例如人類IFNα)、生物活性截短IFNβ (例如人類IFNβ)或生物活性截短IFNγ (例如人類IFNγ)。在一些實施例中，生物活性截短干擾素含有在N-末端及/或C-末端截短之野生型或天然干擾素之鄰接胺基酸序列且其長度為天然或野生型干擾素之長度的至少或至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更大。可使用用於評價干擾素之生物活性之多種標準分析中之任一者。舉例而言，可藉由量測針對特定測試病毒之抗病毒活性來分析IFNα活性。用於分析IFNα活性之套組市面有售(例如參見ILITE™αβ套組，Neutekbio，愛爾蘭)。在一些態樣中，IFNα係IFN-a2a (例如登錄號：CAA23805)、IFN-a-c (登錄號：P01566)、IFN-a-d (登錄號：AAB59403)；IFNa-5 (登錄號：CAA26702)；IFNa-6 (登錄號：AA26704)；IFNa-4 (登錄號：NP_066546)；IFNa-4b (登錄號：CAA26701)；IFNa-I (登錄號：AAA52725)；IFNa-J (登錄號：CAA23792)；IFNa-H (登錄號：CAA23794)；IFNa-F (登錄號：AAA52718)；IFNa-7 (登錄號：CAA26903)，或係其生物活性片段。在一些態樣中，IFNβ係陳述於登錄號AAC41702之IFNβ或係其生物活性片段。在一些態樣中，IFNγ係陳述於登錄號P01579中之IFNγ或係其生物活性片段。
在一些實施例中，涵蓋含有變體或突變干擾素α 2 (IFNa2)之所提供PD-1 VHH-細胞介素融合體。某些突變體包含位置57之His突變及/或位置58之E突變及/或位置61之Q突變。在某些實施例中，突變體包含突變H57Y及/或E58N及/或Q61S。在某些實施例中，突變體包含具有突變H57Y、E58N及Q61S (YNS)之突變IFNa2 (例如參見Kalie等人(2007) J. Biol. Chem., 282: 11602-11611)。在其他實施例中，突變體包含位置57之His突變及/或位置58之E突變及/或位置61之Q突變(皆突變至A (丙胺酸))。在某些實施例中，突變體包含具有突變H57A、E58A及Q61A (HEQ)之突變IFNa2 (例如參見Jaitin等人(2006) Mo/. Cellular Biol, 26(5): 1888-1897)。在某些實施例中，突變干擾素包括位置57之His至A、Y或M突變及/或位置58之E至A或N或D或L突變及/或位置61之Q至A或S或L或D突變。在某些實施例中，突變體包含干擾素α 8 (IFN-a8)之突變體，例如具有對應於R145至V、I或L及/或A146至N或S及/或M149至Y之胺基酸代替(例如R145V/A146N/M149Y、R145I/A146S/M149Y或R145L/A146S/M149Y)之變體(例如參見Yamamoto等人(2009) J. Interferon & cytokine Res, 29: 161-170。
在一些實施例中，所提供PD-1 VHH-細胞介素融合體含有在胺基酸17處使用絲胺酸代替天然半胱胺酸之突變或變體IFNβ(例如參見Hawkins等人(1985) Cancer Res., 45, 5914-5920)。
在一些實施例中，所提供PD-1 VHH-細胞介素融合體含有截短干擾素。在一實施例中，截短干擾素包含缺失最多前15個胺基-末端胺基酸殘基及/或最多後10-13個羧基-末端胺基酸殘基之人類IFNα，該人類IFNα已展示可保留天然或野生型人類IFNα之活性(例如參見Ackerman (1984) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81: 1045-1047)。在一些實施例中，截短人類IFNα缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個羧基末端胺基酸殘基及/或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基末端胺基酸殘基。
在一些實施例中，所提供PD-1 VHH-細胞介素融合體含有截短干擾素，如公開美國專利申請案第US2009/0025106號中所闡述。在一些實施例中，所提供PD-1 VHH-細胞介素融合體含有包含N-及/或C-末端缺失之截短IFNγ，如Lundell等人(1991) Protein Neg, 4:335-341；Pan等人(1987) Eur. J. Biochem., 166:145-149中所闡述。
在一些實施例中，干擾素(例如人類干擾素)係與未修飾、典型野生型蛋白質相比抵抗蛋白水解之突變干擾素，例如參見美國專利第7,998,469號；美國專利第8,052,964號；美國專利第4,832,959號；美國專利第6,120,762號；WO1992/008737；及EP219781。
在所提供PD-1 VHH-細胞介素融合蛋白之態樣中，抗體及細胞介素(例如干擾素)經由連接體(例如肽連接體)直接附接或間接附接。可附接至VHH域之N-末端或C-末端，只要附接不干擾抗體與PD-1之結合。可使用本文所闡述之任一連接體(例如肽連接體)。在一些實施例中，連接體係包括選自由以下組成之群之胺基酸序列之GS-連接體：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接體係包括甘胺酸殘基之撓性連接體，例如(藉由非限制性實例方式) GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，融合蛋白可包含GS-連接體及甘胺酸連接體之組合。D. 經改造細胞
本文提供表現本文所闡述之所提供PD-1結合分子中之任一者之經改造細胞。在特定實例中，所提供PD-1結合分子係分泌自細胞。在一些實施例中，含有(例如)如本文所提供之抗PD-1 VHH域之PD-1結合分子包括信號肽(例如抗體信號肽或其他有效信號序列)以使域位於細胞外部。在PD-1結合分子包括信號肽且由經改造細胞表現時，信號肽使得免疫調節蛋白由經改造細胞分泌。通常，信號肽或信號肽之一部分經由分泌自結合分子裂解。PD-1結合分子可由核酸(其可為表現載體之一部分)編碼。在一些實施例中，PD-1結合分子由細胞(例如免疫細胞，例如原代免疫細胞)表現及分泌。
在一些實施例中，所提供經改造細胞進一步含有嵌合抗原受體(CAR)。CAR係通常含有細胞外靶向/結合部分之合成受體，該細胞外靶向/結合部分與單一融合分子中之一或多個信號傳導域締合且表現於細胞(例如T細胞)之表面上。因此，CAR在單一融合分子中組合抗原特異性及T細胞活化性質。第一代CAR通常包含CD3ζ或Fc l受體 γ鏈之細胞質區域作為其信號傳導域。已在卵巢癌、腎癌、淋巴瘤及神經母細胞瘤患者之I期臨床研究中測試第一代CAR，其中該等CAR誘導中等反應(綜述於Sadelain等人，Curr Opin Immunol, 21 (2): 215-223, 2009中)。第二代CAR (其含有共刺激分子(例如CD28及CD3ζ)之信號傳導域)提供雙重信號傳導以引導組合之活化及共刺激信號。第三代CAR係具有三個或更多個信號傳導域之另一複合物(綜述於Sadelain等人，Cancer Discovery (3), 388-398, 2013及Dotti等人，Immuno. Rev, 257 (1), 1-36, 2014中)。
在一些實施例中，CAR含有包括一或多個對腫瘤抗原具有特異性之抗原結合域之細胞外域。在一些態樣中，腫瘤抗原及/或對TAA具有特異性之抗原結合域可為如本文所闡述之任一者。CAR構築體包含含有一或多個細胞外抗原結合域之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導區。在一些情形下，細胞外抗原結合域係scFv或單一域抗體(VHH)。一般而言，形成CAR之抗原結合單元之細胞外抗原結合域以足夠親和力「結合」或「能夠結合」 (亦即靶向)靶抗原，從而CAR可用於靶向表現靶抗原之細胞或組織之療法中。
CAR之跨膜域係通常跨越或能夠跨越或橫跨漿膜之域且直接或間接(例如經由間隔體(例如免疫球蛋白鉸鏈序列))連結至細胞外抗原結合域及含有細胞內信號傳導域之內質部分。在一實施例中，CAR之跨膜域係跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)之跨膜區、人工疏水性序列或其組合。在一實施例中，跨膜域包括CD3ζ域或CD28跨膜域。其他跨膜域為熟習此項技術者所明瞭且可與本文所提供CAR之實施例聯合使用。
本文所提供CAR之細胞內信號傳導區含有一或多個細胞內信號傳導域，該一或多個細胞內信號傳導域在嚙合CAR之抗原結合域時(例如在結合抗原時)將信號傳輸至T細胞。在一些實施例中，細胞內區域含有係或含有ITAM信號傳導域之細胞內信號傳導域。實例性細胞內信號傳導域包含(例如)衍生自以下各項之信號傳導域：T細胞受體複合物之ζ鏈或其任一同系物(例如η鏈、FcsRIy及β鏈、MB 1 (Iga)鏈、B29 (Ig )鏈等)、人類CD3ζ鏈、CD3多肽(Δ、δ及ε)、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)及其他涉及T細胞轉導之分子(例如CD2、CD5、OX40及CD28)。在特定實施例中，細胞內信號傳導區含有衍生自人類CD3ζ鏈之細胞內信號傳導域。
在一些實施例中，胞內域包括CD3-ζ信號傳導域。在一些實施例中，CD3-ζ信號傳導域包括SEQ ID NO: 236中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 236展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之胺基酸序列且保留T細胞信號傳導之活性。
在一些實施例中，CAR之細胞內信號傳導區可進一步含有衍生自共刺激分子之細胞內信號傳導域。在該等實例中，在抗原特異性嚙合之後，與(例如)僅含含有信號傳導域(例如CD3ζ)之ITAM之CAR相比，此一信號傳導域可(例如)經由增強記憶細胞之增殖、存活及/或發育來增強CAR-T細胞活性。在一些實施例中，共刺激域係自選自以下之蛋白質獲得之功能信號傳導域：CD28、CD137 (4-IBB)、CD134 (OX40)、DapIO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1 、LFA- 1 (CD1 la/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其組合。在特定實施例中，共刺激信號傳導域係衍生或獲得自人類蛋白質。在一些態樣中，共刺激信號傳導域係衍生或獲得自人類CD28或人類CD137 (4-IBB)。
在一些實施例中，共刺激信號傳導域係衍生自CD28或4-1BB且包括SEQ ID NO: 237-240中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 237-240展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性之胺基酸序列且保留T細胞共刺激信號傳導的活性。
在特定實施例中，CAR進一步包括連結細胞外抗原結合域及跨膜域之鉸鏈或間隔體區。此鉸鏈或間隔體區可用於達成所得CAR之不同長度及撓性。可使用之鉸鏈或間隔體區之實例包含(但不限於)抗體之Fc片段或其片段或衍生物、抗體之鉸鏈區或其片段或衍生物、抗體之CH 2區、抗體之CH 3區、人工間隔體序列(例如肽序列)或其組合。其他鉸鏈或間隔體區為熟習此項技術者所明瞭且可加以使用。在一實施例中，鉸鏈係lgG4鉸鏈或CD8A鉸鏈。
在一些實施例中，間隔體及跨膜域係衍生自CD8之鉸鏈及跨膜域，其(例如)具有SEQ ID NO: 241-243中所陳述之實例性序列或與SEQ ID NO: 241-243展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列一致性之胺基酸序列。
本文亦提供包括編碼如本文所提供之PD-1結合分子之多核苷酸之經分離核酸構築體。本文亦提供包括編碼CAR且編碼如本文所提供之PD-1結合分子之多核苷酸之經分離核酸構築體。在一些態樣中，編碼CAR之第一核酸與編碼PD-1結合分子之第二核酸由雙順反子元件(例如IRES或核糖體跳躍序列(例如T2A或P2A))隔開。在一些態樣中，構築體係用於在細胞中表現PD-1結合分子及/或CAR之表現載體。表現載體可為病毒載體。病毒載體技術在業內已眾所周知且闡述於(例如) Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013)中。已研發多種基於病毒之系統用於至哺乳動物細胞中之基因轉移。舉例而言，使用逆轉錄病毒(例如腺病毒)載體。在一實施例中，使用慢病毒載體。
在另一態樣中，亦提供包括如上文所闡述之一或多種核酸構築體之經分離細胞或細胞群體。亦提供經基因修飾以表現本文所提供之PD-1結合分子及/或CAR之經分離細胞或細胞群體。因此，本文提供包括(例如穩定表現)本文所提供之CAR之經基因改造之細胞。在一實施例中，細胞係選自由以下組成之群：T細胞、天然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調控性T細胞、造血幹細胞及/或多潛能胚胎/誘導性幹細胞。在一些情形下，細胞係T細胞，例如CD4及/或CD8 T細胞。在一些實施例中，細胞係個體之自體細胞。舉例而言，在一些實施例中，可自患者分離T細胞(亦稱為原代T細胞)以用於使用CAR核酸構築體進行改造(例如轉染或轉導)。
在一實例性實例中，可離體純化原代T細胞(CD4細胞或CD8細胞或二者)且使用TCR/CD28激動劑(例如抗CD3/抗CD28塗覆珠粒)進行刺激。在2或3天活化製程之後，可經由標準慢病毒或逆轉錄病毒轉導方案或質體電穿孔策略將編碼CAR之重組表現載體穩定引入原代T細胞中。可藉由(例如)流式細胞術使用抗表位標籤或與天然親代分子交叉反應之抗體來監測細胞之PD-1結合分子分泌及/或CAR表現。可經由使用抗表位標籤抗體進行分選來富集表現CAR之T細胞，或針對端視應用之高或低表現進行富集。
可藉由各種方式來分析經PD-1結合分子及/或CAR改造之T細胞之適當功能。在一些情形下，可使用活體外細胞毒性、增殖或細胞介素分析(例如IFNγ表現)來評價經改造T細胞之功能。實例性標準終點係腫瘤系裂解百分比、經改造T細胞之增殖或培養上清液中之IFNγ蛋白表現。在一些情形下，可(例如)藉由監測活化標記物(例如CD69、CD44或CD62L)之表現、增殖及/或細胞介素產生來評價在(例如)經由抗原刺激CAR時刺激T細胞活化之能力。
本文亦提供預防及/或治療個體之疾病或病狀(例如癌症)之方法，其包含向個體投與本文所提供之經改造細胞。通常，個體需要使用醫藥活性量之本發明之細胞及/或醫藥組合物來治療該疾病或病狀。 Ⅳ.    多肽表現及產生
提供包括編碼所提供sdAb及PD-1結合多肽中之任一者之多核苷酸之核酸分子。在一些實施例中，所提供核酸序列及尤其DNA序列編碼如本文所提供之融合蛋白。在前述實施例中之任一者中，核酸分子亦可編碼引導PD-1結合多肽之分泌之前導序列，該前導序列通常發生裂解，從而其不存在於經分泌多肽中。前導序列可為天然重鏈(或VHH)前導序列，或可為另一異源性前導序列。
可使用業內之習用重組DNA技術來構築核酸分子。在一些實施例中，核酸分子係適於表現於所選宿主細胞中之表現載體。
提供包括編碼本文所闡述之PD-1結合多肽之核酸之載體。該等載體包含(但不限於) DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體等。在一些實施例中，選擇經最佳化以在期望細胞類型(例如CHO或CHO源細胞或NSO細胞)中表現多肽之載體。實例性該等載體闡述於(例如) Running Deer等人，Biotechnol. Prog . 20:880-889 (2004)中。
特定而言，可使用編碼期望PD-1結合多肽(例如融合蛋白)之DNA載體來促進製備本文所闡述之PD-1結合多肽之方法且獲得顯著量。可將DNA序列插入適當表現載體(亦即含有用於轉錄及轉譯所插入蛋白質編碼序列之所需元件之載體)中。可利用各種宿主-載體系統來表現蛋白質編碼序列。該等系統包含經病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染之哺乳動物細胞系統；經病毒(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；微生物，例如含有酵母載體之酵母或經噬菌體DNA、質體DNA或黏粒DNA轉變之細菌。端視所用宿主-載體系統，可使用諸多適宜轉錄及轉譯元件中之任一者。
本發明亦提供藉由在表現多肽之條件下培養細胞來產生PD-1結合多肽之方法，其中該細胞包括編碼本文所闡述之PD-1結合多肽之經分離核酸分子及/或包含該等經分離核酸序列之載體。
在一些實施例中，PD-1結合多肽可表現於原核細胞(例如細菌細胞)或真核細胞(例如真菌細胞(例如酵母)、植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞)中。可(例如)根據業內已知之程序來實施該表現。可用於表現多肽之實例性真核細胞包含(但不限於) COS細胞，包含COS 7細胞；293細胞，包含293-6E細胞；CHO細胞，包含CHO-S、DG44. Lec13 CHO細胞及FUT8 CHO細胞；PER.C6® 細胞(Crucell)；及NSO細胞。在一些實施例中，PD-1結合多肽可表現於酵母中。例如參見 美國公開案第US 2006/0270045 A1號。在一些實施例中，基於對多肽進行期望轉譯後修飾之能力來選擇特定真核宿主細胞。舉例而言，在一些實施例中，CHO細胞產生唾液酸化程度高於293細胞中所產生之相同多肽之多肽。
可藉由任一方法將一或多種核酸(例如載體)引入期望宿主細胞中，包含(但不限於)磷酸鈣轉染、DEAE-聚葡萄糖調介之轉染、陽離子脂質調介之轉染、電穿孔、轉導、感染等。非限制性實例性方法闡述於(例如) Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中。可根據任一適宜方法在期望宿主細胞中暫時或穩定地轉染核酸。
亦提供包括本文所闡述之任一核酸或載體之宿主細胞。在一些實施例中，提供表現本文所闡述之PD-1結合多肽之宿主細胞。可藉由任一適宜方法來純化表現於宿主細胞中之PD-1結合多肽。該等方法包含(但不限於)使用親和力基質或疏水相互作用層析。適宜親和力配體包含ROR1 ECD及結合Fc區之藥劑。舉例而言，可使用蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或抗體親和力管柱來結合Fc區且純化包括Fc區之PD-1結合多肽。疏水相互作用層析(例如丁基或苯基管柱)亦可適於純化一些多肽(抗體)。離子交換層析(例如陰離子交換層析及/或陽離子交換層析)亦可適於純化一些多肽(例如抗體)。混合模式層析(例如反相/陰離子交換、反相/陽離子交換、親水性相互作用/陰離子交換、親水性相互作用/陽離子交換等)亦可適於純化一些多肽(例如抗體)。業內已知許多純化多肽之方法。
在一些實施例中，在無細胞系統中產生PD-1結合多肽。非限制性實例性無細胞系統闡述於(例如)以下文獻中：Sitaraman等人，Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)；Spirin,Trends Biotechnol . 22: 538-45 (2004)；Endo等人，Biotechnol. Adv . 21: 695-713 (2003)。
在一些實施例中，提供藉由上述方法製得之PD-1結合多肽。在一些實施例中，在宿主細胞中製備PD-1結合多肽。在一些實施例中，在無細胞系統中製備PD-1結合多肽。在一些實施例中，純化PD-1結合多肽。在一些實施例中，提供包括PD-1結合多肽之細胞培養基。
在一些實施例中，提供包括藉由上述方法製得之抗體之組合物。在一些實施例中，組合物包括在宿主細胞中製備之PD-1結合多肽。在一些實施例中，組合物包括在無細胞系統中製備之PD-1結合多肽。在一些實施例中，組合物包括經純化PD-1結合多肽。 V.     醫藥組合物及調配物
本文提供含有本文所提供之任一PD-1結合多肽或表現其之經改造細胞之醫藥組合物。在一些實施例中，可將PD-1結合多肽(例如本發明融合蛋白，亦在本文中稱為「活性化合物」)及其衍生物、片段、類似物及同系物納入適於投與之醫藥組合物中。在一些實施例中，可將表現含有本文所提供之PD-1結合多肽之嵌合受體(例如嵌合抗原受體)之經改造細胞納入適於投與之醫藥組合物中。
該等組合物通常含有醫藥上可接受之載劑。如本文中所使用，術語「醫藥上可接受之載劑」意欲包含任何及所有與醫藥投與相容之溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑以及諸如此類。適宜載劑闡述於最新版之Remington’s Pharmaceutical Sciences (該領域中之標準參考文獻，其以引用方式併入本文中)中。該等載劑或稀釋劑之適宜實例包含(但不限於)水、鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。亦可使用脂質體及非水性媒劑(例如不揮發油)。用於醫藥活性物質之該等介質及試劑之使用為業內所熟知。除任何與活性化合物不相容之習用介質或試劑外，本發明涵蓋其於組合物中之用途。亦可將補充活性化合物納入組合物中。
本發明醫藥組合物可經調配以與其既定投與途徑相容。投與途徑之實例包含非經腸(例如靜脈內)、真皮內、皮下、腫瘤內、經口(例如吸入)、經皮(亦即局部)、經黏膜及直腸投與。用於非經腸、皮內或皮下施加之溶液或懸浮液可包含下列組分：無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，例如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調節滲透性之試劑，例如氯化鈉或右旋糖。可使用酸或鹼(例如鹽酸或氫氧化鈉)來調節pH。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
適用於可注射應用之醫藥組合物包含無菌水溶液(其中具有水溶性)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。對於靜脈內投與而言，適宜載劑包含生理學鹽水、抑菌水、你好CREMOPHOR ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情形下，組合物必須無菌且其流動性程度應使其具有易注射性。其在製造及儲存條件下必須穩定且必須針對諸如細菌及真菌等微生物之污染作用進行防腐。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂等包衣、藉由維持所需粒徑(在分散液之情形下)及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。可藉由各種抗細菌及抗真菌試劑來達成微生物作用之預防，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)及諸如此類。在許多情形下，較佳將等滲劑(例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉)納入組合物中。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包含延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。
無菌可注射溶液可藉由以下步驟來製備：將所需量活性化合物納入具有上文所列舉成分中之一者或其組合(若需要)之適宜溶劑中，隨後進行過濾滅菌。通常，藉由將活性化合物納入含有基本分散介質及來自上文所列舉者之所需其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在使用無菌粉劑來製備無菌可注射溶液之情形下，製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥，此自預先經無菌過濾之溶液產生具有活性成分加上任一其他期望成分之粉劑。
口服組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用載劑。其可包封成明膠膠囊或壓縮成錠劑。出於經口治療性投與之目的，可一起納入活性化合物與賦形劑且以錠劑、口含錠或膠囊之形式來使用。亦可使用流體載劑來製備口服組合物以用作漱口劑，其中經口施加於流體載劑中之化合物且擦淨，並吐出或吞嚥。可包含醫藥上相容之黏合劑及/或佐劑材料作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、口含錠及諸如此類可含有下列成分中之任一者或具有類似性質之化合物：黏合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖；崩解劑，例如海藻酸、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或斯特羅特斯(Sterotes)；助滑劑，例如膠質二氧化矽；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙類矯味劑。
對於藉由吸入投與而言，以氣溶膠噴霧形式自加含有適宜推進劑(例如氣體，例如二氧化碳)之壓容器或分配器或噴霧器來遞送化合物。
亦可藉由經黏膜或經皮方式進行全身性投與。對於經黏膜或經皮投與而言，在調配物中使用適於透過障壁之滲透劑。該等滲透劑通常為業內已知，且包含(例如用於經黏膜投與)洗滌劑、膽鹽及梭鏈孢酸衍生物。可經由使用鼻噴霧或栓劑來達成經黏膜投與。對於經皮投與而言，將活性化合物調配成如業內通常已知之軟膏、油膏、凝膠或乳霜。
亦可將化合物製成栓劑(例如使用習用栓劑基質，例如可可脂及其他甘油酯)或保留灌腸劑形式以用於直腸遞送。
在一實施例中，可利用防止化合物自身體快速消除之載劑來製備活性化合物，例如受控釋放調配物，包含植入物及微囊封遞送系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之方法為熟習此項技術者所明瞭。亦可在商業上自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals, Inc.獲得材料。亦可使用脂質體懸浮液作為醫藥上可接受之載劑。可根據熟習此項技術者已知之方法來製備該等調配物，例如如美國專利第4,522,811號中所闡述。
尤其有利地將口服或非經腸組合物調配成劑量單位形式以便於投與及劑量均勻性。如本文所使用之劑量單位形式係指適於作為單位劑量供擬治療個體使用之物理離散單位；各單位含有預定量之活性化合物，該預定量經計算與所需醫藥載劑一起產生期望治療效應。本發明劑量單位形式之規格取決於且直接依賴於活性化合物之獨特特性及擬達成之特定治療效應以及複合此一活性化合物以治療個體之技術中固有的限制條件。
醫藥組合物可與投與說明書一起包含於套組、容器、包裝或分配器中。該等醫藥組合物可與使用說明書一起包含於診斷套組中。
以有效治療或防治特定適應症之量來投與醫藥組合物。治療有效量通常取決於所治療個體之體重、其身體或健康狀況、擬治療病狀之延伸性或所治療個體之年齡。在一些實施例中，可以在約50 μg/kg體重/劑量至約50 mg/kg體重/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。在一些實施例中，可以在約100 μg/kg體重/劑量至約50 mg/kg體重/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。在一些實施例中，可以在約100 μg/kg體重/劑量至約20 mg/kg體重/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。在一些實施例中，可以在約0.5 mg/kg體重/劑量至約20 mg/kg體重/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。
在一些實施例中，可以在約10 mg/劑量至約1,000 mg/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。在一些實施例中，可以在約20 mg/劑量至約500 mg/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。在一些實施例中，可以在約20 mg/劑量至約300 mg/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。在一些實施例中，可以在約20 mg/劑量至約200 mg/劑量範圍內之量來投與醫藥組合物。
可視需要向個體投與醫藥組合物。在一些實施例中，向個體投與一或多次有效劑量之醫藥組合物。在各個實施例中，每月一次、每月一次以下(例如每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次)向個體投與有效劑量之醫藥組合物。在其他實施例中，每月一次以上(例如每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次、每天一次或每天多次)來投與有效劑量之醫藥組合物。向個體投與有效劑量之醫藥組合物至少一次。在一些實施例中，可多次投與有效劑量之醫藥組合物，包含在至少一個月、至少六個月或至少一年之時段內投與多次。在一些實施例中，視需要向個體投與醫藥組合物以緩解病狀之一或多種症狀。 Ⅵ.    治療方法及用途
本文所闡述之PD-1結合多肽或表現其之經改造細胞可用於治療、診斷及防治各種適應症。舉例而言，PD-1結合多肽或經改造細胞可用於治療個體之各種疾病及病症。該等方法及用途包含(例如)涉及向患有疾病、病狀或病症(例如腫瘤或癌症)之個體投與分子或經改造細胞或含有其之組合物之治療方法及用途。在一些實施例中，投與有效量之分子或經改造細胞以治療疾病或病症。用途包含含PD-1結合多肽之分子或經改造細胞在該等方法及治療中及用以製備用於實施該等治療方法之藥劑之用途。在一些實施例中，藉由向患有或懷疑患有疾病或病狀之個體投與PD-1結合多肽或經改造細胞或包括其之組合物來實施該等方法。在一些實施例中，該等方法由此治療個體之疾病或病狀或病症。
在一實施例中，可使用本發明之PD-1結合多肽或經改造細胞作為治療劑。通常採用該等藥劑來診斷、預後、監測、治療、緩解及/或預防個體之疾病或病況。藉由使用標準方法鑑別患有病症(或處於發生風險下)之個體(例如人類患者或其他哺乳動物)來實施治療方案。在一些情形下，選擇已知、懷疑或已鑑別為具有表現PD-1之腫瘤之個體。向個體投與PD-1結合多肽或經改造細胞。向個體投與PD-1結合多肽或經改造細胞且該藥劑通常因與靶結合而具有效應。
在一些實施例中，在投與個體時，所提供PD-1多肽多特異性多肽構築體或經改造細胞能夠(例如)藉由嚙合細胞中之CD3及/或CD3信號及/或藉由阻斷PD-1及PD-L1/PD-L2之相互作用來調節(例如增加)免疫反應。在一些實施例中，本文提供調節個體中之免疫反應之方法，其係藉由投與治療有效量之所提供多特異性構築體或經改造細胞或其醫藥組合物來達成。在一些實施例中，調節免疫反應之方法增加或增強個體中之免疫反應。舉例而言，增加或增強之反應可為細胞調介之免疫性之增加。在一些實例中，該方法增加了T細胞活性，例如細胞毒性T細胞(CTL)活性。在一些實施例中，經調節(例如增加)免疫反應係針對腫瘤或癌症。
在一些實施例中，投與PD-1結合多肽(例如PD-1-Fc融合蛋白或含有Fc區之多特異性構築體)可經由嚙合FcγR (經由多特異性多肽構築體之Fc區)來活化先天性免疫細胞。投與該等多特異性多肽構築體可激發、刺激、活化及/或增加先天性免疫細胞效應功能(包含ADCC、細胞介素釋放、去顆粒及/或ADCP)。在限制性多特異性多肽構築體之情形下，在接合第一組分及第二組分之連接體由蛋白酶裂解時及/或在結合靶細胞(例如腫瘤細胞)上之腫瘤抗原時，所投與該等多特異性多肽構築體可活化T細胞，由此使抗CD3結合部分結合T細胞上之CD3ε。在一些情形下，投與多特異性多肽構築體可激發、刺激、活化及/或增加CD3調介之T細胞活化、細胞毒性、細胞介素釋放及/或增殖。
在一些實施例中，所提供方法係用於藉由投與治療有效量之所提供PD-1結合多肽或經改造細胞或其醫藥組合物中之任一者來治療個體之疾病或病狀。在一些實施例中，疾病或病狀係腫瘤或癌症。通常，疾病或病症之緩解或治療涉及減弱一或多種與該疾病或病症有關之症狀或醫學問題。舉例而言，在癌症之情形下，治療有效量之藥物可達成下列各項中之一者或其組合：減小癌細胞數量；減小腫瘤大小；抑制(亦即降低至一定程度及/或停止)之癌細胞至周邊器官浸潤；抑制腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕一或多種與癌症有關之症狀。在一些實施例中，可使用本發明組合物來預防個體中之疾病或病症之發作或復發，該個體係(例如)人類或其他哺乳動物(例如非人類靈長類動物、伴侶動物(例如貓、狗、馬)、農場動物、工作動物或動物園動物)。術語個體及患者在本文中可互換使用。
在一些實施例中，可使用PD-1結合多肽或經改造細胞或其醫藥組合物來抑制哺乳動物癌細胞(例如人類癌細胞)之生長。治療癌症之方法可包含向患有癌症之個體投與有效量之本文所闡述醫藥組合物中之任一者。可投與有效量之醫藥組合物以抑制、終止或逆轉癌症進展。可在活體內或離體處理人類癌細胞。在離體治療人類患者時，在身體外部處理含有癌細胞之組織或流體且然後將組織或流體再引入患者中。在一些實施例中，藉由向患者投與治療組合物來活體內治療人類患者之癌症。
疾病之非限制性實例包含：所有類型之癌症(乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、頭頸癌、胰臟癌等)、類風濕性關節炎、克羅恩氏病(Crohn’s disuse)、SLE、心血管損害、缺血等。舉例而言，適應症包含白血病(包含T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL))、淋巴母細胞性疾病(包含多發性骨髓瘤)及實體腫瘤(包含肺、結腸直腸、前列腺、胰臟及乳房之腫瘤，包含三陰性乳癌)。舉例而言，適應症包含骨疾或癌症轉移(不論原發性腫瘤來源如何)；乳癌，包含(藉由非限制性實例方式) ER/PR+乳癌、Her2+乳癌、三陰性乳癌；結腸直腸癌；子宮內膜癌；胃癌；神經膠母細胞瘤；頭頸癌，例如食管癌；肺癌，例如(藉由非限制性實例方式)非小細胞肺癌；多發性骨髓瘤；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；肉瘤，例如骨肉瘤；腎癌，例如(藉由非限制性實例方式)腎細胞癌；及/或皮膚癌，例如(藉由非限制性實例方式)鱗狀細胞癌症、基底細胞癌或黑色素瘤。在一些實施例中，癌症係鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症係皮膚鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症係食管鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症係頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症係肺鱗狀細胞癌。
在一些實施例中，PD-1結合多肽或經改造細胞或其醫藥組合物可用於治療、緩解(症狀)、改善癌症或其他贅瘤性病狀及/或延遲其進展。在一些實施例中，癌症係膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食管癌、胃腸癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。在某些實施例中，癌症係轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
在一些實施例中，本發明之PD-1結合多肽(例如融合蛋白或多特異性多肽構築體)之治療有效量通常係關於達成治療目標所需之量。通常，醫師可考慮年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及患者(個體)病狀之個體差異來確定擬投與本發明組合物之精確量。
在一些實施例中，治療有效劑量可為(藉由非限制性實例方式)約0.01 µg/kg體重至約10 mg/kg體重。在一些實施例中，治療有效劑量可為(藉由非限制性實例方式)約0.01 mg/kg體重至約5-10 mg/kg體重。常用投藥頻率可(例如)介於每天兩次至每週一次之間。
在一些實施例中，投與治療量之本發明之經改造細胞組合物。通常可陳述，包括如本文所闡述之經改造細胞(例如T細胞)之醫藥組合物可以104 個細胞/kg體重至109 個細胞/kg體重、例如105 個細胞/kg體重至106 個細胞/kg體重(包含彼等範圍內之所有整數值)之劑量來投與。亦可在該等劑量下多次投與經改造細胞組合物(例如T細胞組合物)。可藉由利用免疫療法中通常已知之輸注技術來投與該等細胞(例如參見Rosenberg等人，New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。用於特定患者之最佳劑量及治療方案可易於由熟習醫學技術者藉由監測患者疾病之體徵且相應地調節治療來確定。
結合診斷或治療特定病症之任一已知方法來測定治療有效性。篩選擁有期望特異性之PD-1結合多肽或含有其之經改造細胞之方法包含(但不限於)酶聯免疫吸附分析(ELISA)及業內已知之其他免疫調介技術。已知各種用於測定投與所提供PD-1結合多肽或經改造細胞是否足以調節免疫學活性之方式，該調節係藉由以下效應來達成：消除、隔離或不活化介導或能夠介導不期望免疫反應之免疫細胞；誘導、生成或開啟介導或能夠介導保護性免疫反應之免疫細胞；改變免疫細胞之物理或功能性質；或該等效應之組合。免疫學活性調節之量測實例包含(但不限於)檢驗免疫細胞群體之存在或不存在(使用流式細胞術、免疫組織化學、組織學、電子顯微術、聚合酶鏈反應(PCR))；量測免疫細胞之功能能力，包含因應於信號而增殖或分裂之能力或抗性(例如使用T細胞增殖分析及基於在使用抗CD3抗體、抗T細胞受體抗體、抗CD28抗體、鈣離子載體、加載有肽或蛋白質抗原之PMA (佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈遞細胞刺激後之3H-胸苷納入之肽掃描分析；B細胞增殖分析)；量測殺死或裂解其他細胞之能力(例如細胞毒性T細胞分析)；量測細胞介素、趨化介素、細胞表面分子、抗體及其他細胞產物(例如藉由流式細胞術、酶聯免疫吸附分析、西方印漬分析(Western blot analysis)、蛋白質微陣列分析、免疫沈澱分析)；量測免疫細胞活化之生物化學標記物或免疫細胞內之信號傳導路徑(例如酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸磷酸化、多肽裂解及蛋白質複合物之形成或解離之西方印漬及免疫沈澱分析；蛋白質陣列分析；使用DNA陣列之DNA轉錄剖析或消減雜交)；量測藉由細胞凋亡、壞死或其他機制之細胞死亡(例如膜聯蛋白V染色、TUNEL分析、用以量測DNA梯狀條帶之凝膠電泳、組織學、螢光半胱天冬酶分析、半胱天冬酶受質之西方印漬分析)；量測基因、蛋白質及由免疫細胞產生之其他分子(例如北方印漬分析(Northern blot analysis)、聚合酶鏈反應、DNA微陣列、蛋白質微陣列、2維凝膠電泳、西方印漬分析、酶聯免疫吸附分析、流式細胞術)；及量測臨床症狀或結果(例如自體免疫疾病、神經退化性疾病及其他涉及自蛋白或自多肽之疾病之改良) (臨床評分、使用其他療法之需求、功能狀態、成像研究，例如藉由量測復發率或疾病嚴重程度)。
所提供PD-1結合多肽亦可用於各種診斷性及防治性調配物中。在一實施例中，將PD-1結合多肽投與處於發生上文所提及病症中之一或多者之風險下之患者。可使用基因型、血清學或生物化學標記物來測定患者或器官發生一或多種病症之傾向。
在本發明之另一實施例中，將PD-1結合多肽或經改造細胞投與經診斷患有與上文所提及病症中之一或多者有關之臨床適應症之人類個體。一經診斷後，投與此一治療劑以減輕或逆轉臨床適應症之效應。組合療法
本發明之PD-1結合多肽或經改造細胞可單獨投與或與其他治療模式(例如其他抗癌劑)組合投與。其可在其他治療模式之前、實質上同時或之後提供(亦即同時或依序)。在一些實施例中，本文所闡述之治療方法可進一步包含投與：輻射療法、化學療法、接種疫苗、靶向腫瘤療法、CAR-T療法、溶瘤病毒療法、癌症免疫療法、細胞介素療法、手術切除術、染色質修飾、燒蝕、冷凍療法、針對腫瘤靶之反義藥劑、針對腫瘤靶之siRNA藥劑、針對腫瘤靶之微RNA藥劑或抗癌/腫瘤劑或生物試劑(例如抗體、細胞介素或受體細胞外域-Fc融合體)。
在一些實施例中，同時給予本文所提供之PD-1結合多肽與一或多種化學治療劑、CAR-T (嵌合抗原受體T細胞)療法、溶瘤病毒療法、細胞介素療法及/或靶向其他檢查點分子(例如VISTA、gpNMB、B7H4、HHLA2、CD73、CTLA4、TIGIT等)之藥劑。
在一些實施例中，組合使用本發明之PD-1結合多肽或經改造細胞與其他抗腫瘤藥劑(例如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib) (TARCEVA® )、血小板源生長因子抑制劑(例如GLEEVEC® (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib))、干擾素、CTLA4抑制劑(例如抗CTLA抗體伊匹單抗(ipilimumab) (YERVOY®))、PD-1抑制劑(例如抗PD1抗體BMS-936558)、PDL1抑制劑(例如抗PDL1抗體MPDL3280A)、PDL2抑制劑(例如抗PDL2抗體)、細胞介素、結合至下列靶ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFRβ、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4或VEGF受體中之一或多者之拮抗劑(例如中和抗體)、TRAIL/Apo2及其他生物活性及有機化學藥劑等)。
在一些實施例中，同時給予本文所提供之PD-1結合多肽或經改造細胞與PD-1/PD-L1治療劑。PD-1 / PD-L1治療劑之實例包含尼沃魯單抗(nivolumab) (BMS)；匹利珠單抗(pidilizumab) (CureTech, CT-011)、派姆單抗(pembrolizumab) (Merck)；德瓦魯單抗(durvalumab) (Medimmune/AstraZeneca)；阿替珠單抗(atezolizumab) (Genentech/Roche)；阿維魯單抗(avelumab) (Pfizer)；AMP-224 (Amplimmune)；BMS-936559；AMP-514 (Amplimmune)；MDX-1105 (Merck)；TSR-042 (Tesaro/AnaptysBio, ANB-011)；STI-A1010 (Sorrento Therapeutics)；STI-A1110 (Sorrento Therapeutics)；及其他針對程式性死亡-1 (PD-1)或程式性死亡配體1 (PD-L1)之藥劑。
在一些實施例中，本發明之PD-1結合多肽或經改造細胞可與化學治療劑組合使用。化學治療劑之實例包含(但不限於)烷基化劑，例如噻替派(thiotepa)及CYTOXAN® 環磷醯胺(cyclosphosphamide)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)及尿多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基蜜胺，包含六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內酯(acetogenin) (尤其係布拉它辛(bullatacin)及布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(camptothecin) (包含合成類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065 (包含其合成類似物阿多來新(adozelesin)、卡澤來新(carzelesin)及比澤來新(bizelesin))；念珠藻素(cryptophycin) (尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡黴素(duocarmycin) (包含合成類似物KW-2189及CB1-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺 (mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)；曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1 (例如參見 Agnew,Chem Intl. Ed. Engl. , 33:183-186(1994))；達內黴素(dynemicin)，包含達內黴素A；雙膦酸鹽，例如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素髮色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(anthramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN® 多柔比星(包含嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin) (例如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如胺甲喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、胺甲喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；乙醯葡醛酸內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百垂布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatrexate)；地磷醯胺(defosfamide)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(eflornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素，例如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK® 多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；新月毒素(尤其T-2毒素、黏液黴素A (verrucarin A)、漆斑菌素(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urehan)；長春地辛；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶薩托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside) (「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如TAXOL® 太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE® 太平洋紫杉醇之無克列莫佛(Cremophor)、白蛋白工程化奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及TAXOTERE® 多西紫杉醇(docetaxel) (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR® 吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(vincristine)；NAVELBINE® 長春瑞濱(vinorelbine)；鹽酸米托恩醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar, CPT-11) (包含伊立替康與5-FU及甲醯四氫葉酸(leucovorin)之治療方案)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；康布瑞塔卡汀(combretastatin)；甲醯四氫葉酸(LV)；奧沙利鉑，包含奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR之抑制劑(例如埃羅替尼(TARCEVA® ))及減小細胞增殖之VEGF-A；及上述物質中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
其他非限制性實例性化學治療劑包含用於調控或抑制對癌症之激素作用之抗激素藥劑，例如抗雌激素製劑及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包含(例如)它莫西芬(tamoxifen) (包含NOLVADEX® 它莫西芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON® 托瑞米芬(toremifene)；抑制芳香酶之芳香酶抑制劑，其調控腎上腺中雌激素產生，例如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE® 乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN® 依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR® 伏羅唑(vorozole)、FEMARA® 來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX® 阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素製劑(例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine) (1,3-二噁烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制黏附細胞增殖中涉及之信號傳導途徑中之基因表現者，例如PKC-α、Ralf及H-Ras；核糖酶，例如VEGF表現抑制劑(例如ANGIOZYME® 核糖酶)及HER2表現抑制劑；疫苗，例如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECTIN® 疫苗及VAXID® 疫苗；PROLEUKIN® (阿地介白素(aldesleukin)) rIL-2；LURTOTECAN® 拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® GnRH激動劑；及任一上述物質之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
在一些實施例中，將PD-1結合多肽及其他藥劑調配成單一治療組合物，且同時投與PD-1結合多肽及其他藥劑。或者，PD-1結合多肽或經改造細胞及其他藥劑彼此分開(例如各自調配成分開之治療組合物)，且同時投與PD-1結合多肽或經改造細胞及其他藥劑，或在治療方案期間於不同時間投與PD-1結合多肽或經改造細胞及其他藥劑。舉例而言，在投與其他藥劑之前投與PD-1結合多肽或經改造細胞，在投與其他藥劑後投與PD-1結合多肽或經改造細胞，或以交替方式投與PD-1結合多肽或經改造細胞及其他藥劑。可以單一劑量或多個劑量來投與PD-1結合多肽及其他藥劑。
在一些實施例中，同時投與PD-1結合多肽或經改造細胞及其他藥劑。舉例而言，可將PD-1結合多肽及其他藥劑調配成單一組合物或作為兩種或更多種分開組合物來投與。在一些實施例中，依序投與PD-1結合多肽或經改造細胞及其他藥劑，或在治療方案期間於不同時間投與PD-1結合多肽或經改造細胞及其他藥劑。 VII.  實例性實施例 所提供實施例尤其係： 1.     一種PD-1結合多肽構築體，其包括至少一個特異性結合PD-1之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)及一或多個結合至除PD-1外之靶之其他結合域。 2.     如實施例1之PD-1結合構築體，其中該至少一個VHH域包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272、273及313組成之群之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 278或314中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 283或315中所陳述之胺基酸序列。 3.     一種PD-1結合構築體，其包括至少一個包括以下之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)：互補決定區1 (CDR1)，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272、273及313組成之群之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 278或314中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 283中所陳述之所選胺基酸序列。 4.     如實施例1至3中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該PD-1係人類PD-1。 5.     如實施例1至4中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域係人類化的。 6.     如實施例1、2、4及5中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至免疫細胞上之活化受體。 7.     如實施例6之PD-1結合多肽構築體，其中該免疫細胞係T細胞。 8.     如實施例6或7之PD-1結合多肽構築體，其中該活化受體係CD3 (CD3ε)。 9.     如實施例8之PD-1結合多肽構築體，其針對PD-1及CD3係雙特異性。 10.   如實施例9之PD-1結合多肽構築體，其中該免疫細胞係天然殺手(NK)細胞。 11.    如實施例6或10之PD-1結合多肽構築體，其中該活化受體係CD16 (CD16a)。 12.   如實施例11之PD-1結合多肽構築體，其針對PD-1及CD16a係雙特異性。 13.   如實施例1、2、4及5中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他域結合至腫瘤相關抗原(TAA)。 14.   如實施例1、2、4及5中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至細胞介素受體。 15.   如實施例1、2及4至14中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域包括抗體或其抗原結合片段。 16.   如實施例1、2及4至15中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域係單價的。 17.   如實施例16之PD-1結合多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段係Fv、經二硫化物穩定之Fv (dsFv)、scFv、Fab、單一域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。 18.   如實施例14之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域係細胞介素或係能夠結合至該細胞介素受體之其截短片段或變體。 19.   如實施例18之PD-1結合多肽構築體，其中該細胞介素係為I型干擾素或II型干擾素之干擾素，係I型干擾素之截短片段或變體或係II型干擾素之截短片段或變體。 20.   如實施例19之PD-1結合多肽構築體，其中： 該I型干擾素係IFNα或IFNβ或係其截短片段或變體；或 該II型干擾素係IFNγ或係其截短片段或變體。 21.   如實施例1至20中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該多肽包括免疫球蛋白Fc區。 22.   如實施例1、2及4至21中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該多肽包括連接至少一個單一域抗體及該一或多個其他結合域之免疫球蛋白Fc區。 23.   如實施例1至22中任一項之PD-1結合多肽構築體，其係二聚體。 24.   如實施例21至23中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區係同源二聚體Fc區。 25.   如實施例21至24中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。 26.   如實施例21至24中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區係人類IgG1。 27.   如實施例26之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括SEQ ID NO:8中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。 28.   如實施例21至23中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區係異源二聚體Fc區。 29.   如實施例21至28中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區展現效應功能。 30.   如實施例21至29中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括含有一或多個胺基酸修飾之多肽，該一或多個胺基酸修飾減小效應功能及/或減小與選自Fcγ受體或C1q之效應分子之結合。 31.   如實施例30之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個胺基酸修飾係缺失Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者。 32.   如實施例30或31之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括SEQ ID NO:9中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。 33.   如實施例1至32中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者中所陳述之序列或與SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 34.   如實施例1至33中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:284、(ii) SEQ ID NO:284之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:284展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 35.   如實施例1至34中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:284中所陳述之序列。 36.   如實施例1至34中任一項之PD-1結合多肽，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272及273組成之群之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 278中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 283中所陳述之胺基酸序列。 37.   如實施例1至34及36中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括分別SEQ ID NO: 268、278及283、分別SEQ ID NO: 272、278及283或分別SEQ ID NO: 273、278及283中所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 38.   如實施例1至34、36及37中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251-267展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1之胺基酸序列。 39.   如實施例１至34及36至38之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 40.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 257中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 257展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 41.   如實施例1至34及36至40中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 257中所陳述之胺基酸序列。 42.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 43.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 252中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 252展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 44.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 253中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 253展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 45.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 254中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 254展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 46.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 255中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 255展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 47.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 256中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 256展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 48.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 258中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 49.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 259中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 50.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 260中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 260展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 51.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 261中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 261展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 52.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 262中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 262展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 53.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 263中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 263展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 54.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 264中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 55.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 265中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 265展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 56.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 266中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 266展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 57.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 267中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 267展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 58.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域與SEQ ID NO: 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284包括至少95%之序列一致性且結合PD-1。 59.   如實施例1至34及36至39中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域陳述於SEQ ID NO: 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284中。 60.   一種多特異性多肽構築體，其包括：(a)第一組分，其包括含有第一Fc多肽及第二Fc多肽之異源二聚體Fc區；及(b)第二組分，其包括含有可變重鏈區(VH)及可變輕鏈區(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段，其中： 構成該抗CD3抗體或抗原結合片段之該等VH及VL連接至該異源二聚體Fc之對端多肽； 該等第一組分及第二組分藉由連接體偶合，其中該異源二聚體Fc區定位於該抗CD3抗體之N-末端； 該等第一組分及第二組分中之一者或兩者包括至少一個結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域；且 該等第一組分及第二組分中之一者或兩者包括至少一個唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)。 61.   如實施例60之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體至少包括(i)包括該異源二聚體Fc區之該第一Fc多肽之第一多肽、連接體及該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域；及(ii)包括該異源二聚體Fc區之該第二Fc多肽之第二多肽、連接體(視情況與存在於該第一多肽中之連接體相同)及該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域中之另一者， 其中該等第一多肽及第二多肽中之一者或兩者獨立地包括至少一個結合TAA之抗原結合域及至少一個PD-1 VHH域。 62.   如實施例60或61之多特異性多肽構築體，其中與同源二聚體Fc區之多肽相比，視情況與SEQ ID NO: 245中所陳述之Fc多肽或其免疫學活性片段相比，該異源二聚體Fc區之該等第一及第二Fc多肽中之一者或兩者包括至少一個修飾以誘導異源二聚合。 63.   如實施例62之多特異性多肽構築體，其中該異源二聚體Fc之該等第一及第二Fc多肽中之每一者獨立地包括至少一個胺基酸修飾。 64.   如實施例63之多特異性多肽構築體，其中該異源二聚體Fc之該等第一及第二Fc多肽中之每一者包括隆凸與孔洞修飾或包括電荷突變以增加該等多肽之靜電互補性。 65.   如實施例64之多特異性多肽構築體，其中該胺基酸修飾係隆凸與孔洞修飾。 66.   如實施例60至65中任一項之多特異性多肽構築體，其中該異源二聚體Fc之該第一Fc多肽包括選自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其組合之修飾且該異源二聚體Fc之該第二Fc多肽包括修飾Thr366Trp。 67.   如實施例66之多特異性多肽，其中該等第一及第二Fc多肽進一步包括非半胱氨酸殘基至半胱胺酸殘基之修飾，其中該第一多肽之修飾位於位置Ser354及Tyr349中之一者處且該第二Fc多肽之修飾位於位置Ser354及Tyr349中之另一者處。 68.   如實施例60至64中任一項之多特異性多肽構築體，其中該胺基酸修飾係電荷突變以增加該等多肽之靜電互補性。 69.   如實施例60至64及68中任一項之多特異性多肽構築體，其中該等第一及/或第二Fc多肽該等第一及第二Fc多肽或中之每一者在互補位置中包括修飾，其中該修飾使用具有相反電荷之胺基酸代替另一多肽之互補胺基酸。 70.   如實施例60至69中任一項之多特異性多肽構築體，其中該異源二聚體Fc之該第一或第二Fc多肽中之一者進一步在殘基Ile253處包括修飾。 71.   如實施例70之多特異性多肽構築體，其中該修飾係Ile253Arg。 72.   如實施例60至71中任一項之多特異性多肽構築體，其中該異源二聚體Fc之該第一或第二Fc多肽中之一者進一步在殘基His435處包括修飾。 73.   如實施例72之多特異性多肽構築體，其中該修飾係His435Arg。 74.   如實施例60至73中任一項之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包括缺乏Lys447之多肽。 75.   如實施例60至74中任一項之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包括含有至少一個修飾以增強FcRn結合之多肽。 76.   如實施例75之多特異性多肽構築體，其中該修飾位於選自由以下組成之群之位置：Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其組合。 77.   如實施例76之多特異性多肽構築體，其中該修飾位於選自由以下組成之群之位置：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其組合。 78.   如實施例76之多特異性多肽構築體，其中該修飾位於位置Met252及位置Met428。 79.   如實施例78之多特異性多肽構築體，其中該修飾係Met252Y及Met428L。 80.   如實施例76之多特異性多肽構築體，其中該修飾係Met252Y及Met428V。 81.   如實施例60至80中任一項之多特異性多肽構築體，其中該異源二聚體Fc之該第一多肽包括SEQ ID NO:103、107、115或117中之任一者中所陳述之胺基酸序列，且該異源二聚體Fc之該第二多肽包括SEQ ID NO:104、108、111、113、119或121中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 82.   如實施例1至81中任一項之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包括含有至少一個胺基酸修飾之多肽，該至少一個胺基酸修飾減小效應功能及/或減小與選自Fcγ受體或C1q之效應分子之結合。 83.   如實施例82之多特異性多肽構築體，其中該一或多個胺基酸修飾係缺失Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者。 84.   如實施例60至83中任一項之多特異性多肽構築體，其中該異源二聚體Fc之該第一多肽包括SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所陳述之胺基酸序列且該異源二聚體Fc之該第二多肽包括SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 85.   如實施例60至84中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段係單價的。 86.   如實施例60至85中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段並非單鏈抗體，視情況並非單鏈可變片段(scFv)。 87.   如實施例60至86中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段係Fv抗體片段。 88.   如實施例87之多特異性多肽構築體，其中該Fv抗體片段包括經二硫化物穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。 89.   如60-88之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包括：VH CDR1，其包括胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)；VH CD2，其包括胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)；VH CDR3，其包括胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)；VL CDR1，其包括胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)；VL CDR2，其包括胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)；及VL CDR3，其包括胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)。 90.   如實施例60至89中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包括： VH，其具有SEQ ID NO: 35-65中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35-65中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列；及 VL，其具有SEQ ID NO: 66-85及293中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 66-85及293中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。 91.   如實施例60至90中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。 92.   如實施例60至90中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 285之胺基酸序列。 93.   如實施例60至92中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域定位於胺基-末端(相對於該多特異性多肽構築體之該Fc區)及/或羧基-末端(相對於該CD3結合區)。 94.   如實施例60至93中任一項之多特異性多肽構築體，其中 該第一多肽按N-末端至C-末端之順序包括結合TAA之第一抗原結合域、包括該異源二聚體Fc區之該第一Fc多肽之第一多肽、連接體、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域及結合TAA之第二抗原結合域；及 該第二多肽包括該至少一個PD-1 VHH域且按N-末端至C-末端之順序包括該異源二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接體(視情況與存在於該第一多肽中之連接體相同)及該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域中之另一者，其中該至少一個PD-1 VHH域定位於胺基-末端(相對於該Fc區)及/或羧基-末端(相對於該CD3結合區)。 95.   如實施例60至94中任一項之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包括唯一一個特異性結合PD-1之PD-1 VHH域。 96.   如實施例60至95中任一項之多特異性多肽構築體，其中相對於該多特異性構築體之該Fc區，該PD-1 VHH域定位於胺基-末端。 97.   如實施例60至96中任一項之多特異性多肽構築體，其中 該第一多肽按N-末端至C-末端之順序包括結合TAA之第一抗原結合域、包括該異源二聚體Fc區之該第一Fc多肽之第一多肽、連接體、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域及結合TAA之第二抗原結合域；及 該第二多肽按N-末端至C-末端之順序包括該異源二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接體(視情況與存在於該第一多肽中之連接體相同)、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域中之另一者及該PD-1 VHH域。 98.   如實施例60至95中任一項之多特異性多肽構築體，其中相對於該多特異性構築體之該Fc區，該PD-1 VHH域定位於胺基-末端。 99.   如實施例60至95及98中任一項之多特異性多肽構築體，其中 該第一多肽按N-末端至C-末端之順序包括結合TAA之第一抗原結合域、包括該異源二聚體Fc區之該第一Fc多肽之第一多肽、連接體、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域及結合TAA之第二抗原結合域；及 該第二多肽按N-末端至C-末端之順序包括該PD-1 VHH域、該異源二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接體(視情況與存在於該第一多肽中之連接體相同)及該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域中之另一者。 100.  如實施例60至99中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者中所陳述之序列或與SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 101.  如實施例60至100中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:284、(ii) SEQ ID NO:284之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:284展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 102.  如實施例60至101中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:284中所陳述之序列。 103.  如實施例60至101中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272及273組成之群之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 278中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 283中所陳述之胺基酸序列。 104.  如實施例60至100及103中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括分別SEQ ID NO: 268、278及283、分別SEQ ID NO: 272、278及283或分別SEQ ID NO: 273、278及283中所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 105.  如實施例60至100、103及104中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251-267展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 106.  如實施例60至100及103至105之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 107.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 257中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 257展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 108.  如實施例60至100及103至107中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 257中所陳述之胺基酸序列。 109.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 110.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 252中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 252展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 111.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 253中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 253展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 112.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 254中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 254展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 113.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 255中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 255展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 114.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 256中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 256展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 115.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 258中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 116.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 259中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 117.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 260中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 260展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 118.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 261中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 261展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 119.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 262中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 262展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 120.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 263中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 263展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 121.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 264中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 122.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 265中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 265展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 123.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 266中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 266展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 124.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 267中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 267展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 125.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括與SEQ ID NO: 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284展現至少95%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 126.  如實施例60至100及103至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域陳述於SEQ ID NO: 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284中。 127.  如實施例60至126中任一項之多特異性多肽構築體，其中該等第一組分及第二組分中之一者或兩者包括至少一個結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)。 128.  如實施例127之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)定位於胺基-末端(相對於該多特異性多肽構築體之該Fc區)及/或羧基-末端(相對於該CD3結合區)。 129.  如實施例127或128之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包括唯一一個共刺激受體結合區(CRBR)。 130.  如實施例127至129中任一項之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包括兩個視情況相同或不同之共刺激受體結合區(CRBR)。 131.  如實施例127至129中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)係或包括該共刺激受體之天然同族結合配偶體之細胞外域或其結合片段或其對該共刺激受體展現結合活性之變體。 132. 如實施例127至130中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)係選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單一域重鏈抗體及單一域輕鏈抗體。 133.  如實施例132之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段係Fv、scFv、Fab、單一域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。 134.  如實施例1132或133之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段係sdAb。 135.  如實施例134之多特異性多肽構築體，其中該sdAb係人類或人類化sdAb。 136.  如實施例127至135中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)及NKG2D。 137.  如實施例127至136中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自41BB (CD137)、OX40 (CD134)及糖皮質激素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)之共刺激受體。 138.  如實施例127至137中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)包括SEQ ID NO:210中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO:210中所陳述之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列且結合4-1BB。 139.  如實施例60至138中任一項之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包括結合至TAA之第一及第二抗原結合域。 140.  如實施例139之多特異性多肽構築體，其中該等抗原結合域結合至相同腫瘤相關抗原(TAA)。 141.  如實施例139或149之多特異性多肽構築體，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合該相同TAA之不同或非重疊表位及/或競爭結合至該相同TAA。 142.  如實施例139之多特異性多肽構築體，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合不同TAA。 143.  如實施例139至142中任一項之多特異性多肽構築體，其中一個抗原結合域定位於胺基-末端(相對於該Fc區)且一個抗原結合域定位於羧基-末端(相對於該CD3結合區)。 144.  如實施例60至143中任一項之多特異性多肽構築體，其中該結合TAA之抗原結合域或結合TAA之該等抗原結合域中之每一者獨立地包括該TAA之該天然同族結合配偶體之細胞外域或其結合片段或其對該TAA展現結合活性的變體。 145.  如實施例60至143中任一項之多特異性多肽構築體，其中該結合TAA之抗原結合域或結合TAA之該等抗原結合域中之每一者獨立地係抗體或其抗原結合片段。 146.  如實施例145之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段係Fv、scFv、Fab、單一域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。 147.  如實施例145或146之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段係sdAb。 148.  如實施例147之多特異性多肽構築體，其中該sdAb係人類或人類化sdAb。 149.  如實施例60至148中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗原結合域或該等抗原結合域中之每一者獨立地結合至選自以下之腫瘤抗原：1-92-LFA-3、5T4、α-4整聯蛋白、α-V整聯蛋白、α4β1整聯蛋白、α4β7整聯蛋白、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9 (Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸鹽受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明質酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、美索塞林(Mesothelin)、MRP4、MUC1、黏蛋白6 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、納卡斯楚因(Nicastrin)、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸鹽、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。 150.  如實施例139至149中任一項之多特異性多肽構築體，其中： 該第一多肽按N-末端至C-末端之順序包括結合TAA之第一抗原結合域、包括該異源二聚體Fc區之該第一Fc多肽之第一多肽、連接體、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域及結合TAA之第二抗原結合域；及 該第二多肽按N-末端至C-末端之順序包括該PD-1 VHH域或該CRBR中之一者、該異源二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接體(視情況與存在於第一多肽中之連接體相同)、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域中之另一者及該PD-1 VHH域或該CRBR中之另一者。 151.  如實施例60至150中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係肽或多肽連接體，視情況其中該連接體之長度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。 152.  如實施例60至151中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係不可裂解連接體。 153.  如實施例152之多特異性多肽構築體，其中該不可裂解連接體包括GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:125)、GGGGGS (SEQ ID NO:126)及其組合。 154.  如實施例60至153中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係或包括序列GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO:127)。 155.  如實施例60至151中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係可裂解連接體。 156.  如實施例155之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接體係用作蛋白酶受質之多肽。 157.  如實施例156之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係藉由免疫效應細胞、藉由腫瘤或藉由存在於腫瘤微環境中之細胞產生。 158.  如實施例156或157之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係藉由免疫效應細胞產生且該免疫效應細胞係經活化T細胞、天然殺手(NK)細胞或NK T細胞。 159.  如實施例156至158中任一項之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係選自間質蛋白酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、顆粒酶B及其組合。 160.  如實施例159之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係顆粒酶B。 161.  如實施例156至160中任一項之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接體包括胺基酸序列GGSGGGGIEPD IGGSGGS (SEQ ID NO:171)。 162.  一種結合PD-1之經分離單一域抗體，其包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272及273組成之群之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 278中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 283中所陳述之胺基酸序列。 163.  如實施例162之經分離單一域抗體，其包括SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251-267或284中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 164.  如實施例162或163之經分離單一域抗體，其中該單一域抗體包括 (i) SEQ ID NO:284、(ii) SEQ ID NO:284之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:284展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 165.  如實施例162至164中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO:284中所陳述之序列。 166.  如實施例162至164中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括：CDR1，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272及273組成之群之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 278中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 283中所陳述之胺基酸序列。 167.  如實施例162至164及166中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括分別SEQ ID NO: 268、278及283、分別SEQ ID NO: 272、278及283或分別SEQ ID NO: 273、278及283中所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 168.  如實施例162至164、166及167中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251-267展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 169.  如實施例162至164及166-168中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 251-267中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 170.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 257中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 257展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 171.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 257中所陳述之胺基酸序列。 172.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 251中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 173.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 252中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 252展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 174.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 253中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 253展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 175.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 254中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 254展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 176.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 255中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 255展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 177.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 256中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 256展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 178.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 258中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 179.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 259中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 180.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 260中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 260展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 181.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 261中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 261展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 182.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 262中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 262展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 183.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 263中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 263展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 184.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 264中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 185.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 265中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 265展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 186.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 266中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 266展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 187.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該至少一個PD-1 sdAb包括SEQ ID NO: 267中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 267展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 188.  如實施例162至164及166至169中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267或284中所陳述之胺基酸序列。 189.  一種多核苷酸，其編碼如實施例1至59中任一項之PD-1結合多肽。 190.  一種多核苷酸，其編碼如實施例60至161中任一項之多特異性多肽構築體。 191.  一種多核苷酸，其包括編碼如實施例60至161中任一項之多特異性構築體之第一多肽之第一核酸序列及編碼該多特異性構築體之第二多肽之第二核酸序列，其中該等第一及第二核酸序列由內核糖體進入位點(IRES)或編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽之核酸隔開。 192.  如實施例191之多核苷酸，其中該等第一核酸序列及第二核酸序列可操作地連接至相同啟動子。 193.  如實施例192之多核苷酸，其中該編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽之核酸係選自T2A、P2A、E2A或F2A。 194.  一種多核苷酸，其編碼如實施例162至188中任一項之單一域抗體。 195.  一種載體，其包括如實施例189至194中任一項之多核苷酸。 196.  如實施例195之載體，其係表現載體。 197.  如實施例195或196之載體，其係病毒載體或真核載體，視情況其中該真核載體係哺乳動物載體。 198.  一種細胞，其包括一或多個如實施例189至194中任一項之多核苷酸或一或多個如實施例195至197中任一項之載體。 199.  如實施例198之細胞，其中該細胞係重組或經分離細胞。 200.  如實施例199之細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。 201.  一種產生多肽之方法，該方法包括向細胞中引入一或多個如實施例189至194中任一項之多核苷酸或一或多個如實施例195至197中任一項之載體且在產生多特異性多肽構築體之條件下培養該細胞。 202.  如實施例201之方法，其進一步包括自該細胞分離或純化多肽。 203.  一種多肽，其係藉由如實施例201或202之方法所產生。 204.  一種經改造免疫細胞，其包括如實施例1至59中任一項之結合分子或如實施例162至188中任一項之單一域抗體，視情況其中該結合分子可自該細胞分泌。 205.  如實施例204之經改造細胞，其進一步包括嵌合抗原受體(CAR)。 206.  如實施例204或205之經改造免疫細胞，其中該細胞係淋巴球。 207.  如實施例205至206中任一項之經改造免疫細胞，其中該細胞係T細胞或天然殺手(NK)細胞。 208.  如實施例205至207中任一項之經改造免疫細胞，其中該CAR包括含有結合TAA之抗原結合域之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域。 209.  如實施例208之經改造免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域包括免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)信號傳導域，視情況其中該細胞內信號傳導域係或包括CD3ζ信號傳導域、視情況人類CD3ζ信號傳導域。 210.  如實施例209之經改造免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域進一步包括共刺激分子之信號傳導域。 211.  一種醫藥組合物，其包括如實施例1至59中任一項之PD-1結合多肽、如實施例60至161中任一項之多特異性多肽構築體、如實施例162至188中任一項之單一域抗體或如實施例204至210中任一項之經改造免疫細胞。 212.  如實施例211之醫藥組合物，其包括醫藥上可接受之載劑。 213.  如實施例211或212之醫藥組合物，其係無菌的。 214.  一種刺激或誘導個體中之免疫反應之方法，該方法包括向有需要之個體投與如實施例1至59中任一項之PD-1結合多肽、如實施例60至161中任一項之多特異性多肽構築體、如實施例162至188中任一項之單一域抗體或如實施例204至210中任一項之經改造免疫細胞或如實施例211至213之醫藥組合物。 215.  如實施例214之方法，其中該免疫反應針對腫瘤或癌症、視情況表現PD-1之腫瘤或癌症有所增加。 216.  如實施例214或215之方法，其中該方法治療該個體之疾病或病狀。 217.  一種治療個體之疾病或病狀之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之如實施例1至59中任一項之PD-1結合多肽、如實施例60至161中任一項之多特異性多肽構築體、如實施例162至188中任一項之單一域抗體或如實施例204至210中任一項之經改造免疫細胞或如實施例211至213之醫藥組合物。 218.  如實施例216或217之方法，其中該疾病或病狀係腫瘤或癌症。 219.  如實施例214至218中任一項之方法，其中該個體係人類。 220.  如實施例1之PD-1結合構築體，其中該至少一個VHH域包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO:300中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 301中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 302中所陳述之胺基酸序列。 221.  如實施例1之PD-1結合構築體，其中該至少一個VHH域包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO:303中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 304中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 305中所陳述之胺基酸序列。 222.  如實施例1之PD-1結合構築體，其中該至少一個VHH域包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO:306中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 307中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 308中所陳述之胺基酸序列。 223.  如實施例1之PD-1結合構築體，其中該至少一個VHH域包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO:309中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 310中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 311中所陳述之胺基酸序列。 224.  一種PD-1結合構築體，其包括至少一個包括以下之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 300中所陳述之所選胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 301中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 302中所陳述之所選胺基酸序列。 225.  一種PD-1結合構築體，其包括至少一個包括以下之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 303中所陳述之所選胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 304中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 305中所陳述之所選胺基酸序列。 226.  一種PD-1結合構築體，其包括至少一個包括以下之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 306中所陳述之所選胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 307中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 308中所陳述之所選胺基酸序列。 227.  一種PD-1結合構築體，其包括至少一個包括以下之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 309中所陳述之所選胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 310中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 311中所陳述之所選胺基酸序列。 228.  如實施例220至227中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該PD-1係人類PD-1。 229.  如實施例220至228中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域係人類化的。 230.  如實施例220至224及228至229中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至免疫細胞上之活化受體。 231.  如實施例230之PD-1結合多肽構築體，其中該免疫細胞係T細胞。 232.  如實施例230或231之PD-1結合多肽構築體，其中該活化受體係CD3 (CD3ε)。 233.  如實施例232之PD-1結合多肽構築體，其針對PD-1及CD3係雙特異性。 234.  如實施例233之PD-1結合多肽構築體，其中該免疫細胞係天然殺手(NK)細胞。 235.  如實施例230或234之PD-1結合多肽構築體，其中該活化受體係CD16 (CD16a)。 236.  如實施例235之PD-1結合多肽構築體，其針對PD-1及CD16a係雙特異性。 237.  如實施例220至224及228至229中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他域結合至腫瘤相關抗原(TAA)。 238.  如實施例220至224及228至229中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至細胞介素受體。 239.  如實施例220至224及228至238中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域包括抗體或其抗原結合片段。 240.  如實施例220至224及228至239中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域係單價的。 241.  如實施例240之PD-1結合多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段係Fv、經二硫化物穩定之Fv (dsFv)、scFv、Fab、單一域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。 242.  如實施例238之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域係細胞介素或係能夠結合至該細胞介素受體之其截短片段或變體。 243.  如實施例242之PD-1結合多肽構築體，其中該細胞介素係為I型干擾素或II型干擾素之干擾素，係I型干擾素之截短片段或變體或係II型干擾素之截短片段或變體。 244.  如實施例243之PD-1結合多肽構築體，其中： 該I型干擾素係IFNα或IFNβ或係其截短片段或變體；或 該II型干擾素係IFNγ或係其截短片段或變體。 245.  如實施例220至244中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該多肽包括免疫球蛋白Fc區。 246.  如實施例220至224及228至245中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該多肽包括連接至少一個單一域抗體及該一或多個其他結合域之免疫球蛋白Fc區。 247.  如實施例220至246中任一項之PD-1結合多肽構築體，其係二聚體。 248.  如實施例245至247中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區係同源二聚體Fc區。 249.  如實施例245至248中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。 250.  如實施例245至248中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區係人類IgG1。 251.  如實施例250之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括SEQ ID NO:8中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。 252.  如實施例245至247中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區係異源二聚體Fc區。 253.  如實施例245至252中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區展現效應功能。 254.  如實施例245至253中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括含有一或多個胺基酸修飾之多肽，該一或多個胺基酸修飾減小效應功能及/或減小與選自Fcγ受體或C1q之效應分子之結合。 255.  如實施例254之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個胺基酸修飾係缺失Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者。 256.  如實施例254或255之PD-1結合多肽構築體，其中該Fc區包括SEQ ID NO:9中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。 257.  如實施例220至256中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 296-299中之任一者中所陳述之序列或與SEQ ID NO: 296-299中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 258.  如實施例220至257中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:296、(ii) SEQ ID NO:296之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:296展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 259.  如實施例220至258中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:296中所陳述之序列。 260.  如實施例220至258中任一項之PD-1結合多肽，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 300中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 301中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 302中所陳述之胺基酸序列。 261.  如實施例220至258及260 36中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 300、301及302中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 262.  如實施例220至257中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:297、(ii) SEQ ID NO:297之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:297展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 263.  如實施例220至257及262中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:297中所陳述之序列。 264.  如實施例220至257及262中任一項之PD-1結合多肽，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 303中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 304中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 305中所陳述之胺基酸序列。 265.  如實施例220至257、262及264中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 303、304及305中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 266.  如實施例220至257中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:298、(ii) SEQ ID NO:298之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:298展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 267.  如實施例220至257及266中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:297中所陳述之序列。 268.  如實施例220至257及266中任一項之PD-1結合多肽，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 306中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 307中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 308中所陳述之胺基酸序列。 269.  如實施例220至257、266及268中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 306、307及308中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 270.  如實施例220至257中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:299、(ii) SEQ ID NO:299之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 271.  如實施例220至257及270中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:299中所陳述之序列。 272.  如實施例220至257及270中任一項之PD-1結合多肽，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 309中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 310中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 311中所陳述之胺基酸序列。 273.  如實施例220至257、270及272中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 309、310及311中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 274.  如實施例220至258、260至262、264至266、268至270及272-273中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域與SEQ ID NO: 296-299包括至少95%之序列一致性且結合PD-1。 275.  如實施例220至258、260至262、264至266、268至270及272-274中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域陳述於SEQ ID NO: 296-299中。 276.  如實施例60至99中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 296-299中之任一者中所陳述之序列或與SEQ ID NO: 296-299中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 277.  如實施例60至99或276中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:296、(ii) SEQ ID NO:296之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:296展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 278.  如實施例60至99、276或277中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:296中所陳述之序列。 279.  如實施例60至99、276或277中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 300中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 301中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 302中所陳述之胺基酸序列。 280.  如實施例60至99、276、277或279中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 300、301及302中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 281.  如實施例60至99或276中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:297、(ii) SEQ ID NO:297之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:297展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 282.  如實施例60至99、276或281中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:297中所陳述之序列。 283.  如實施例60至99、276或281中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 303中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 304中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 305中所陳述之胺基酸序列。 284.  如實施例60至99、276、281或283中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 303、304及305中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 285.  如實施例60至99或276中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:298、(ii) SEQ ID NO:298之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:298展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 286.  如實施例60至99、276或285中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:297中所陳述之序列。 287.  如實施例60至99、276或285中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 306中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 307中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 308中所陳述之胺基酸序列。 288.  如實施例60至99、276、285或287中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 306、307及308中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 289.  如實施例60至99或276中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括(i) SEQ ID NO:299、(ii) SEQ ID NO:299之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 290.  如實施例60至99、276或289中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO:299中所陳述之序列。 291.  如實施例60至99、276或289中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 309中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 310中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 311中所陳述之胺基酸序列。 292.  如實施例60至99、276、289或291中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 300、301及302中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 293.  如實施例60至99或276至292中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括與SEQ ID NO: 296、297、298或299展現至少95%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 294.  如實施例60至99或276至292中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域陳述於SEQ ID NO: 296、297、298或299中。 295.  如實施例276至294中任一項之多特異性多肽構築體，其中該等第一組分及第二組分中之一者或兩者包括至少一個結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)。 296.  如實施例295之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)定位於胺基-末端(相對於該多特異性多肽構築體之該Fc區)及/或羧基-末端(相對於該CD3結合區)。 297.  如實施例295或296之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包括唯一一個共刺激受體結合區(CRBR)。 298.  如實施例295至297中任一項之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包括兩個視情況相同或不同之共刺激受體結合區(CRBR)。 299.  如實施例295至297中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)係或包括該共刺激受體之天然同族結合配偶體之細胞外域或其結合片段或其對該共刺激受體展現結合活性之變體。 300. 如實施例295至298中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)係選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單一域重鏈抗體及單一域輕鏈抗體。 301.  如實施例300之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段係Fv、scFv、Fab、單一域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。 302.  如實施例300或301之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段係sdAb。 303.  如實施例302之多特異性多肽構築體，其中該sdAb係人類或人類化sdAb。 304.  如實施例295至303中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)及NKG2D。 305.  如實施例295至304中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自41BB (CD137)、OX40 (CD134)及糖皮質激素誘導性TNFR相關蛋白(GITR)之共刺激受體。 306.  如實施例295至305中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)包括SEQ ID NO:210中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO:210中所陳述之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列且結合4-1BB。 307.  如實施例276至306中任一項之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包括結合至TAA之第一及第二抗原結合域。 308.  如實施例307之多特異性多肽構築體，其中該等抗原結合域結合至相同腫瘤相關抗原(TAA)。 309.  如實施例307或308之多特異性多肽構築體，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合該相同TAA之不同或非重疊表位及/或競爭結合至該相同TAA。 310.  如實施例307之多特異性多肽構築體，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域結合不同TAA。 311.  如實施例307至310中任一項之多特異性多肽構築體，其中一個抗原結合域定位於胺基-末端(相對於該Fc區)且一個抗原結合域定位於羧基-末端(相對於該CD3結合區)。 312.  如實施例276至311中任一項之多特異性多肽構築體，其中該結合TAA之抗原結合域或結合TAA之該等抗原結合域中之每一者獨立地包括該TAA之該天然同族結合配偶體之細胞外域或其結合片段或其對該TAA展現結合活性的變體。 313.  如實施例276至311中任一項之多特異性多肽構築體，其中該結合TAA之抗原結合域或結合TAA之該等抗原結合域中之每一者獨立地係抗體或其抗原結合片段。 314.  如實施例313之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段係Fv、scFv、Fab、單一域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。 315.  如實施例313或314之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段係sdAb。 316.  如實施例315之多特異性多肽構築體，其中該sdAb係人類或人類化sdAb。 317.  如實施例276至316中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗原結合域或該等抗原結合域中之每一者獨立地結合至選自以下之腫瘤抗原：1-92-LFA-3、5T4、α-4整聯蛋白、α-V整聯蛋白、α4β1整聯蛋白、α4β7整聯蛋白、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9 (Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸鹽受體α (FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明質酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、Jagged配體、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、美索塞林、MRP4、MUC1、黏蛋白6 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、納卡斯楚因、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸鹽、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。 318.  如實施例310至317中任一項之多特異性多肽構築體，其中： 該第一多肽按N-末端至C-末端之順序包括結合TAA之第一抗原結合域、包括該異源二聚體Fc區之該第一Fc多肽之第一多肽、連接體、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域及結合TAA之第二抗原結合域；及 該第二多肽按N-末端至C-末端之順序包括該PD-1 VHH域或該CRBR中之一者、該異源二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接體(視情況與存在於第一多肽中之連接體相同)、該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH或VL域中之另一者及該PD-1 VHH域或該CRBR中之另一者。 319.  如實施例276至318中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係肽或多肽連接體，視情況其中該連接體之長度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。 320.  如實施例276至319中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係不可裂解連接體。 321.  如實施例320之多特異性多肽構築體，其中該不可裂解連接體包括GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:125)、GGGGGS (SEQ ID NO:126)及其組合。 322.  如實施例276至321中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係或包括序列GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO:127)。 323.  如實施例276至319中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接體係可裂解連接體。 324.  如實施例323之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接體係用作蛋白酶受質之多肽。 325.  如實施例324之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係藉由免疫效應細胞、藉由腫瘤或藉由存在於腫瘤微環境中之細胞產生。 326.  如實施例324或325之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係藉由免疫效應細胞產生且該免疫效應細胞係經活化T細胞、天然殺手(NK)細胞或NK T細胞。 327.  如實施例324至326中任一項之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係選自間質蛋白酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、顆粒酶B及其組合。 328.  如實施例327之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係顆粒酶B。 329.  如實施例324至328中任一項之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接體包括胺基酸序列GGSGGGGIEPD IGGSGGS (SEQ ID NO:171)。 330.  一種結合PD-1之經分離單一域抗體，其包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 300中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 301中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 302中所陳述之胺基酸序列。 331.  如實施例330之經分離單一域抗體，其包括SEQ ID NO:296中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 296中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 332.  如實施例330或331之經分離單一域抗體，其中該單一域抗體包括 (i) SEQ ID NO:296、(ii) SEQ ID NO:296之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:296展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 333.  如實施例330至332中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO:296中所陳述之序列。 334.  如實施例330至332中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 300中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 301中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 302中所陳述之胺基酸序列。 335.  如實施例330至332及334中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 300、301及302中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 336.  一種結合PD-1之經分離單一域抗體，其包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 303中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 304中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 305中所陳述之胺基酸序列。 337.  如實施例336之經分離單一域抗體，其包括SEQ ID NO:297中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 297中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 338.  如實施例336或337之經分離單一域抗體，其中該單一域抗體包括 (i) SEQ ID NO:297、(ii) SEQ ID NO:297之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:297展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 339.  如實施例336至338中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO:297中所陳述之序列。 340.  如實施例336至338中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 303中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 304中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 305中所陳述之胺基酸序列。 341.  如實施例336至338及340中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 303、304及305中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 342.  一種結合PD-1之經分離單一域抗體，其包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 306中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 307中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 308中所陳述之胺基酸序列。 343.  如實施例342之經分離單一域抗體，其包括SEQ ID NO:298中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 298中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 344.  如實施例342或343之經分離單一域抗體，其中該單一域抗體包括 (i) SEQ ID NO:298、(ii) SEQ ID NO:298之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:298展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 345.  如實施例342至344中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO:298中所陳述之序列。 346.  如實施例342至344中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 306中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 307中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 308中所陳述之胺基酸序列。 347.  如實施例342至344及346中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 306、307及308中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 348.  一種結合PD-1之經分離單一域抗體，其包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括SEQ ID NO: 309中所陳述之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 310中所陳述之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 311中所陳述之胺基酸序列。 349.  如實施例348之經分離單一域抗體，其包括SEQ ID NO:299中所陳述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 299中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 350.  如實施例348或349之經分離單一域抗體，其中該單一域抗體包括 (i) SEQ ID NO:299、(ii) SEQ ID NO:299之人類化變體中所陳述之序列或(iii)與SEQ ID NO:299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。 351.  如實施例348至350中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO:299中所陳述之序列。 352.  如實施例348至350中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括：CDR1，其包括SEQ ID NO: 309中所陳述之胺基酸序列；CDR2，其包括SEQ ID NO: 310中所陳述之胺基酸序列；及CDR3，其包括SEQ ID NO: 311中所陳述之胺基酸序列。 353.  如實施例348至350及352中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 309、310及311中分別所陳述之CDR1、CDR2及CDR3。 354.  如實施例330至332、334至338、340至344、346至350及352至353中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 296-299中之任一者中所陳述之胺基酸序列。 355.  如實施例330至332、334至338、340至344、346至350及352至354中任一項之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 296、297、298或299中所陳述之胺基酸序列。 356.  一種多核苷酸，其編碼如實施例220至275中任一項之PD-1結合多肽。 357.  一種多核苷酸，其編碼如實施例276至329中任一項之多特異性多肽構築體。 358.  一種多核苷酸，其包括編碼如實施例276至329中任一項之多特異性構築體之第一多肽之第一核酸序列及編碼該多特異性構築體之第二多肽之第二核酸序列，其中該等第一及第二核酸序列由內核糖體進入位點(IRES)或編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽之核酸隔開。 359.  如實施例358之多核苷酸，其中該等第一核酸序列及第二核酸序列可操作地連接至相同啟動子。 360.  如實施例359之多核苷酸，其中該編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽之核酸係選自T2A、P2A、E2A或F2A。 361.  一種多核苷酸，其編碼如實施例330至355中任一項之單一域抗體。 362.  一種載體，其包括如實施例356至361中任一項之多核苷酸。 363.  如實施例362之載體，其係表現載體。 364.  如實施例362或363之載體，其係病毒載體或真核載體，視情況其中該真核載體係哺乳動物載體。 365.  一種細胞，其包括一或多個如實施例356至361中任一項之多核苷酸或一或多個如實施例362至364中任一項之載體。 366.  如實施例365之細胞，其中該細胞係重組或經分離細胞。 367.  如實施例366之細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。 368.  一種產生多肽之方法，該方法包括向細胞中引入一或多個如實施例356至361中任一項之多核苷酸或一或多個如實施例362至364中任一項之載體且在用以產生多特異性多肽構築體之條件下培養該細胞。 369.  如實施例368之方法，其進一步包括自該細胞分離或純化多肽。 370.  一種多肽，其係藉由如實施例368或369之方法所產生。 371.  一種經改造免疫細胞，其包括如實施例220至275中任一項之結合分子或如實施例330至355中任一項之單一域抗體，視情況其中該結合分子可自該細胞分泌。 372.  如實施例371之經改造細胞，其進一步包括嵌合抗原受體(CAR)。 373.  如實施例371或372之經改造免疫細胞，其中該細胞係淋巴球。 374.  如實施例372至373中任一項之經改造免疫細胞，其中該細胞係T細胞或天然殺手(NK)細胞。 375.  如實施例372至374中任一項之經改造免疫細胞，其中該CAR包括含有結合TAA之抗原結合域之細胞外域、跨膜域及細胞內信號傳導域。 376.  如實施例375之經改造免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域包括免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)信號傳導域，視情況其中該細胞內信號傳導域係或包括CD3ζ信號傳導域、視情況人類CD3ζ信號傳導域。 377.  如實施例376之經改造免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域進一步包括共刺激分子之信號傳導域。 378.  一種醫藥組合物，其包括如實施例220至275中任一項之PD-1結合多肽、如實施例276至329中任一項之多特異性多肽構築體、如實施例330至355中任一項之單一域抗體或如實施例371至377中任一項之經改造免疫細胞。 379.  如實施例378之醫藥組合物，其包括醫藥上可接受之載劑。 380.  如實施例378或379之醫藥組合物，其係無菌的。 381.  一種刺激或誘導個體中之免疫反應之方法，該方法包括向有需要之個體投與如實施例220至275中任一項之PD-1結合多肽、如實施例276至329中任一項之多特異性多肽構築體、如實施例330至355中任一項之單一域抗體或如實施例371至377中任一項之經改造免疫細胞或如實施例378至380之醫藥組合物。 382.  如實施例381之方法，其中該免疫反應針對腫瘤或癌症、視情況表現PD-1之腫瘤或癌症有所增加。 383.  如實施例381或382之方法，其中該方法治療該個體之疾病或病狀。 384.  一種治療個體之疾病或病狀之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之如實施例220至275中任一項之PD-1結合多肽、如實施例276至329中任一項之多特異性多肽構築體、如實施例330至355中任一項之單一域抗體或如實施例371至377中任一項之經改造免疫細胞或如實施例378至380之醫藥組合物。 385.  如實施例384或385之方法，其中該疾病或病狀係腫瘤或癌症。 386.  如實施例381至385中任一項之方法，其中該個體係人類。 VIII. 實例
包含下列實例僅用於闡釋性目的且並不意欲限制本發明範圍。 實例1:   PD-1 sdAb之生成
經由美洲駝及羊駝之免疫化來生成靶向人類PD-1之單一域抗體。使用如下所陳述之重組形式之人類PD-1細胞外域(ECD；SEQ ID NO:286中所陳述之人類PD-1之胺基酸25-167，例如UniProt編號：Q15116)對美洲駝及羊駝實施免疫： LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRSAGQFQ
在產生特異性抗PD1抗體效價後，自500mL來自免疫化動物之血液分離美洲駝/羊駝末梢血單核細胞(PBMC)並使用Qiagen RNeasy Maxi套組分離總mRNA，且隨後使用Thermo Superscript IV逆轉錄酶及寡-dT引發來轉化成第一鏈cDNA。經由PCR使用cDNA作為模板來特異性擴增單一域抗體(sdAb；亦稱為VHH)序列且以sdAb-Fc-AGA2融合蛋白形式選殖至酵母表面顯示載體中。Fc係人類IgG1 Fc (陳述於SEQ ID NO:8中)。
使用重組形式之PD-1 ECD經由磁珠分離及隨後之螢光活化細胞分選(FACS)來富集顯示該等sdAb之酵母庫。將經分選酵母平鋪並將經分離群落撿入至96孔板(96-well block)中，且在培養基中生長以使表面展示sdAb-Fc自表現切換至分泌至培養基中。實例性所鑑別sdAb陳述於表E1中。
表 E1 ： PD-1 sdAb
純系名稱 CDR1 SEQ ID NO CDR2 SEQ ID NO CDR3 SEQ ID NO VHH SEQ ID NO
18H10 GSVTGANTMG 272 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 284
1-14 GRTVSIYAMG 313 GIGWNGGTTY 314 ESAAGTLGDY 315 312
實例2:   駱駝科源PD-1 sdAb之人類化
使用人類VH3-23種系作為架構對實例性駱駝科源PD-1 sdAb (18H10)實施人類化。有助於溶解性、特異性、穩定性及/或親和性之駱駝科殘基保持未修飾。另外，所有人類化變體皆含有修飾Leu11Glu (L11E)及羧基-末端修飾Ser112Lys (S112K)及Ser113Pro (S113P)，此乃因該等修飾已知可防止或減小針對sdAb之預存在ADA之識別(如US20160207981中所闡述)。 表E2陳述實例性PD-1 sdAb人類化變體。
表 E2 ： PD-1 sdAb 人類化變體
純系名稱 CDR1 SEQ ID NO CDR2 SEQ ID NO CDR3 SEQ ID NO VHH SEQ ID NO
18H10 人類化變體
hz18H10v1 GSMTGANTMG 268 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 251
hz18H10v2 GSMTGANTMG 268 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 252
hz18H10v3 GSMTGANTMG 268 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 253
hz18H10v4 GSMTGANTMG 268 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 254
hz18H10v5 GSMTGANTMG 268 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 255
hz18H10v6 GSVTGANTMG 272 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 256
hz18H10v7 GSITGANTMG 273 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 257
hz18H10v8 GSVTGANTMG 272 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 258
hz18H10v9 GSVTGANTMG 272 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 259
hz18H10v10 GSMTGANTMG 268 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 260
hz18H10v11 GSVTGANTMG 272 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 261
hz18H10v12 GSVTGANTMG 272 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 262
hz18H10v13 GSMTGANTMG 268 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 263
hz18H10v14 GSVTGANTMG 272 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 264
hz18H10v15 GSITGANTMG 273 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 265
hz18H10v16 GSITGANTMG 273 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 266
hz18H10v17 GSITGANTMG 273 LIGNYVTH 278 YTDNLGTS 283 267
實例3:   藉由流式細胞術測得之sdAb與PD-1表現細胞之結合
在PD-1表現細胞中評價經純化sdAb-Fc之特異性及相對親和力 。為瞬時轉染293細胞，將FreeStyle 293細胞以1×106 個細胞/mL再懸浮於新鮮FreeStyle 293表現培養基中。在每次轉染中將細胞接種於50 mL培養基中並在37℃下於振盪器上培育，同時製備轉染試劑。將50µg每一轉染質體稀釋至500µL OptiMEM中。在每一轉染之單獨管中，將150µg聚乙烯亞胺(PEI；75µL 2 mg/mL溶液)添加至500µL OptiMEM中且然後以1:1與DNA:OptiMEM溶液混合。使DNA及PEI在室溫下複合15分鐘。然後將DNA:PEI複合物逐滴添加至準備好之FreeStyle 293細胞燒瓶中並藉由渦旋進行混合。將經轉讓細胞在37℃振盪器中培育過夜以充分表現蛋白質。所用轉染質體編碼人類、食蟹猴及鼠類來源之加檸檬素標籤之全長PD1蛋白。
藉由流式細胞術使用經瞬時轉染之PD-1表現細胞來評價實例1及2中所闡述之實例性PD-1-sdAb-Fc融合蛋白之結合。將未轉染FreeStyle 293細胞或經瞬時轉染之FreeStyle 293細胞在FACS緩衝液(1× TBS、0.01% FBS、0.002%疊氮化鈉)稀釋至0.5×10×106 個細胞/mL並以100µL/孔平鋪於96孔圓底分析板中。將分析板在約750 rpm下離心5分鐘，然後去除上清液且如下所述添加一級抗體稀釋液。將滴定稀釋抗體添加至含有293細胞之分析板中。將細胞在4℃下於抗體稀釋液中培育30分鐘。在30分鐘培育之後，將分析板在約750 rpm下離心5分鐘，使用150µL FACS緩衝液洗滌，並在約750 rpm下再次離心5分鐘。去除洗滌劑且添加50µL/孔之Alexa Fluor 647偶聯驢-抗人類IgG (以1:1000稀釋於FACS緩衝液中)並在4℃下培育20分鐘。然後將分析板在750 rpm下離心5分鐘，使用150µL FACS緩衝液洗滌，並在750 rpm下再次離心5分鐘。去除洗滌劑且將細胞再懸浮於30µL/孔之FACS緩衝液中以用於藉由流式細胞術(iQue Intellicyte)進行分析。
18H10 (衍生自美洲駝之親代抗體；SEQ ID NO:284)、18H10之人類化變體(SEQ ID NO: 251-257、259-260及262-266)或1-14 (SEQ ID NO: 312)結合人類PD-1表現細胞(huPD1-FL 293)、食蟹猴PD-1表現細胞(cynoPD1-FL 293)、小鼠PD-1表現細胞(muPD1-FL 293)或非表現(UT 293)細胞之實例性結果陳述於圖：1A-1G中。 實例4:   藉由流式細胞術評價PD-1 sdAb與經活化人類T細胞之結合
藉由流式細胞術來評價PD-1-sdAb-Fc融合蛋白與經活化人類T細胞之結合。
對於人類T細胞之富集及活化而言，使用密度梯度離心自人類供體血液分離末梢血單核細胞(PBMC)。使用PBS/2%FBS (1:2)稀釋血樣且將30 mL經稀釋血液層鋪於15 mL Lymphoprep密度梯度培養基中。在離心之後，去除血漿相間之PBMC層及Lymphoprep且使用紅血球裂解緩衝液將剩餘紅血球在室溫下裂解5分鐘。使用針對CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD123、TCR γ/δ之生物素化抗譜系標記物抗體標記非T細胞群體(20分鐘，室溫)且使用磁鏈黴抗生物素蛋白顆粒消耗。保留含有T細胞部分之未結合細胞上清液。藉由以約2×106 個細胞/mL培養基之密度平鋪於經1µg/mL小鼠抗人類CD3 (OKT3)塗覆之組織培養板中來將經富集人類T細胞活化3天。將經活化T細胞在PBS中洗滌一次，然後進一步用於結合分析中。
實質上如實例3中所闡述藉由流式細胞術來評價結合並量化，只是對於與經活化人類T細胞之結合而言，使用介於167nM至0.00847nM之間之18H10 (SEQ ID NO: 284)、人類化18H10 (hzv7；SEQ ID NO: 257)或1-14 (SEQ ID NO: 312)之4倍、10點連續稀釋液進行培育。如圖 2 中所展示，發現所測試實例性PD-1靶向構築體及人類化變體結合經富集及活化之人類T細胞。 實例5:   使用報告基因分析來評價PD-1/PD-L1阻斷
使用表現PD-1之Jurkat效應報告基因細胞系(其中TCR嚙合使得轉錄螢光素酶報告基因)來評價實例性靶向PD-1之sdAb阻斷PD-1及PD-L1之相互作用的能力。在該分析中，將表現PD-L1之aAPC/CHOK1細胞與Jurkat報告基因細胞一起共培養以提供TCR特異性活化信號，且同時經由嚙合效應細胞上之PD-1來抑制此信號。監測PD-1 sdAb阻斷抑制信號且增強TCR嚙合之能力。
在分析前一天，將表現PD-L1之aAPC/CHOK1細胞平鋪於100µl補充有10% FBS之Ham’s F12中。在分析當天，棄除所有培養基且更換為40µL分析培養基(RPMI 1640，補充有1% FBS)，該分析培養基含有包含18H10 (SEQ ID NO: 41)或人類化18H10 (hzv7；SEQ ID NO: 14)之測試蛋白滴定液(起始濃度：50nM，以1:4滴定)。然後將Jurkat PD-1報告基因細胞添加至板中(40µL)且將板培育6h (37℃，5% CO2，於加濕氣氛中)。在培育之後，將等體積之BioGlo螢光素酶分析受質添加至孔中並在室溫下培育10分鐘，且評價發光並分析。
如圖 3A 及B 中所展示，觀察到PD-1/PD-L1由實例性測試蛋白18H10 (SEQ ID NO: 284)、人類化18H10 (hzv7；SEQ ID NO: 257)或1-14 (SEQ ID NO: 312)阻斷，如藉由存在TCR嚙合及螢光素酶轉錄所指示。 實例6:   使用抗PD1 sdAb產生靶向TAA之限制性CD3結合蛋白之方法
生成含有經二硫化物穩定之抗CD3 Fv結合區(其展現限制性CD3結合)、異源二聚體Fc域、一或多個TAA抗原結合域(定位於胺基-末(端相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區))及抑制受體結合區(IRBR) (含有針對PD-1之單一域抗體(sdAb)，其定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區))之多特異性多肽構築體。在一些情形下，生成含有至少一個(例如)針對41BB之共刺激受體結合區(CRBR)之多特異性多肽構築體，該共刺激受體結合區定位於胺基-末端(相對於Fc區)及/或羧基-末端(相對於CD3結合區)。
在實例性構築體中，生成至少編碼異源二聚體多特異性多肽構築體之第一多肽鏈及第二多肽鏈之多核苷酸且選殖至表現質體中。第一多肽鏈通常按自N-末端至C-末端之順序包含Fc孔洞多肽(例如陳述於SEQ ID NO:112或在一些情形下SEQ ID NO:114中)；可裂解或不可裂解連接體，例如含有一或多個用於蛋白酶之受質識別位點者；及dsFv抗CD3抗體之可變輕鏈(VL)域(例如陳述於SEQ ID NO:285中)。第二多肽鏈通常按自N-末端至C-末端之順序包含Fc隆凸多肽(例如陳述於SEQ ID NO: 105或在一些情形下SEQ ID NO:109中)；第一多肽鏈之相同可裂解連接體或相同不可裂解連接體；及dsFv抗CD3抗體之可變重鏈域(例如陳述於SEQ ID NO:47中)。使用實例性不可裂解連接體GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO:127)或含有用於顆粒酶B之受質識別位點之實例性可裂解連接體GGSGGGGIEPD IGGSGGS (SEQ ID NO:171)來生成構築體。一或兩個多肽鏈另外以各種構形編碼位於Fc域胺基末端及/或CD3結合區羧基末端之PD-1 sdAb (例如SEQ ID NO:284或SEQ ID NO: 257)及/或位於Fc域胺基末端及/或CD3結合區羧基末端之4-1BB sdAb (例如SEQ ID NO:210)共刺激受體結合域。
使用聚乙烯亞胺將編碼異源二聚體限制性CD3結合蛋白之每一鏈之單獨質體以等莫耳比率瞬時轉染至哺乳動物細胞(HEK293或CHO)中。在3-7天之後收集分泌至上清液中之重組蛋白，且藉由蛋白質A層析、隨後藉由製備型粒徑篩析層析(SEC)或流通式疏水性相互作用層析(HIC)來純化經分泌重組蛋白。選擇性純化在異源二聚體Fc之一條鏈中之位置I253R或H435R (通常係孔洞-Fc)設計有突變從而並不結合蛋白質A之異源二聚體蛋白。使用SEC (使用Superdex-200樹脂之AKTA)或FT-HIC (使用丁基/苯基瓊脂糖之AKTA)上之第二層析步驟去除含有兩個異源二聚體Fc、更具疏水性且具有兩倍預計分子量之不期望交叉配對物質。
該方法有利於產生含有異源二聚體Fc及如所闡述經二硫化物穩定之抗CD3 Fv (例如如SEQ ID NO: 47中所陳述之具有突變G44C之抗CD3 VH及如SEQ ID NO: 285中所陳述之具有突變G100C之VL)之適當配對物質之異源二聚體多特異性多肽構築體。經純化異源二聚體限制性CD3結合蛋白較為穩定且在延長4℃下培育或增加蛋白質濃度時並不累積交叉配對物質。
本發明並不意欲將範圍限制於所揭示特定實施例，該等實施例提供用於(例如)闡釋本發明之各個態樣。自本文之說明及教示內容將明瞭所闡述之組合物及方法之各種修改。可實踐該等變化，此並不背離本發明之真實範圍及精神且意欲歸屬於本發明範圍內。序列
編號 序列 注釋
1 GGSGGS (GGS)2連接體
2 GGSGGSGGS (GGS)3 連接體
3 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接體
4 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接體
5 GGGG 甘胺酸連接體
6 GGGGG 甘胺酸連接體
7 GGGGGG 甘胺酸連接體
8 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 人類IgG1 Fc
9 PAPGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK Fc xELL
10 PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 人類IgG2 Fc
11 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFKWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST FRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNIFSCSVMH EALHNRFTQK SLSLSPGK 人類IgG3 Fc
12 PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK 人類IgG4 Fc
13 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK 人類IgG4 Fc
14 EPKSSDKTHTCPPC 經修飾IgG1鉸鏈
15 DKTHTCPPC 經截短IgG1鉸鏈
16 ESKYGPPCPPC 經修飾IgG4鉸鏈
17 GQGTLVTVKPGG 羧基-末端序列
18 GQGTLVTVEPGG 羧基-末端序列
19 QVQLVQSGGG VVQPGRSLRL SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGKGLEWIGY INPSRGYTNY NQKVKDRFTI SRDNSKNTAF LQMDSLRPED TGVYFCARYY DDHYCLDYWG QGTPVTVSS OKT3 VH
20 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVS YMNWYQQTPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTDY TFTISSLQPE DIATYYCQQW SSNPFTFGQG TKLQIT OKT3 VL
21 QVQLVQSGGG VVQPGRSLRL SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGKGLEWIGY INPSRGYTNY NQKVKDRFTI SRDNSKNTAF LQMDSLRPED TGVYFCARYY DDHYSLDYWG QGTPVTVSS OKT3人類化VH
22 DVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGQGLEWIGY INPSRGYTNY ADSVKGRFTI TTDKSTSTAY MELSSLRSED TATYYCARYY DDHYCLDYWG QGTTVTVSS OKT3人類化VH
23 QVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGQCLEWMGY INPSRGYTNY NQKFKDKATL TADKSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARYY DDHYSLDYWG QGTLVTVSS OKT3人類化VH
24 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG TKLEIN OKT3人類化VL
25 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSVS YMNWYQQKPG KAPKRWIYDT SKVASGVPAR FSGSGSGTDY SLTINSLEAE DAATYYCQQW SSNPLTFGGG TKVEIK OKT3人類化VL
26 DIQLTQSPSI LSASVGDRVT ITCRASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRWIYDT SKVASGVPYR FSGSGSGTEY TLTISSMQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGCG TKVEIKRT OKT3人類化VL
27 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA 抗CD3 Hv
28 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 Lv
29 TYAMN 抗CD3 VH CDR1
30 RIRSKYNNYATYYADSVKD 抗CD3 VH CDR2
31 HGNFGNSYVSWFAY 抗CD3 VH CDR3
32 RSSTGAVTTSNYAN 抗CD3 VL CDR1
33 GTNKRAP 抗CD3 VL CDR2
34 ALWYSNLWV 抗CD3 VL CDR3
35 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH1
36 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH2
37 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH3
38 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH4
39 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH5
40 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH6
41 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH7
42 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVS 抗CD3 VH8
43 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH9
44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSYFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH10
45 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH11
46 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVKP 抗CD3 VH12
47 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVKP 抗CD3 VH13
48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGCGTLVTVKP 抗CD3 VH14
49 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH15
50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH16
51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH17
52 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH18
53 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH19
54 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH20
55 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH21
56 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH22
57 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH23
58 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH24
59 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH25
60 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH26
61 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH27
62 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVS 抗CD3 VH28
63 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH29
64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSYFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH30
65 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH31
66 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL1
67 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLEIK 抗CD3 VL2
68 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL3
69 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL4
70 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL5
71 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL6
72 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL7
73 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL8
74 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLEIK 抗CD3 VL9
75 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLEIK 抗CD3 VL10
76 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQCFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGEGTKLEIK 抗CD3 VL11
77 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL12
78 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLEIK 抗CD3 VL13
79 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL14
80 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL15
81 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL16
82 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL17
83 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL18
84 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL19
85 QVQLQESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRTFS NYHMGWFRQA PGKERELVAA ISGSGGSTYY TDSVKGRFTI SRNNAKNTMS LQMSNLKPED TGVYYCTTPT EKGSSIDYWG QGTQVTVSSG RYPYDVPDY 抗CD3 VHH
86 QLQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDNYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRNNAKGTVYLLMNSLKPEDTAVYYCATELVPACTYSNGRGPLDGMDYWGKGTQVTVKP FRα sdAb
87 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSIDATAWYRQAPGKQRELVAIITSSGSTNYPESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCNAITRYGGSTYDFWGQGTLVTVKP FRα sdAb
88 EVQPGGSLRLSCAASETFGVVFTLGWYRQAPGKGREFVARVTGTDTVDYAESVKGRFTISSDFARNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNTGAYWGQGTLVTVKP FRα sdAb
89 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFILDYYAIGWFRQAPGKEREGVLCIDASDDITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCATPIGLSSSCLLEYDYDYWGQGTLVTVKP cMET sdAb
90 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSGSGGGGSGGGGTGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIK CD20 scFv
91 QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYAFS YSWINWVRQA PGQGLEWMGR IFPGDGDTDY NGKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARNV FDGYWLVYWG QGTLVTVSS CD20 VH
92 DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSNGITYLYW YLQKPGQSPQLLIYQMSNLV SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQNLELPYTFGGGTKVE IKRTV CD20 VL
93 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYVYYSGTTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASIAVTGFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQRVNNNYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDRSPLTFGGGTKLEIK DLL3 scFv
94 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYYWSWIRQP PGKGLEWIGYVYYSGTTNYN PSLKSRVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCASIAV TGFYFDYWGQ GTLVTVSSGG GGSGGGGSGG GGSEIVLTQS PGTLSLSPGERVTLSCRASQ RVNNNYLAWY QQRPGQAPRL LIYGASSRAT GIPDRFSGSG SGTDFTLTIS RLEPEDFAVY YCQQYDRSPL TFGGGTKLEI K DLL3 scFv
95 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMAWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTASLQIINLKNEDTATYFCARIGDSSPSDYWGQGTTLTVSSSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DLL3 Fd
96 SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFAGSGYGTDFSFTISTVQAEDLAVYFCQQDYTSPWTFGGGTKLEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DLL3 LC
97 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRQWDYDVRAMNYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 5T4 Fd
98 DIVMTQSHIFMSTSVGDRVSITCKASQDVDTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRLTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 5T4 LC
99 EVQLVESGGGL VQPKGSLKLS CAASGFTFNT YAMNWVRQAP GKGLEWVARI RSKSNNYATY YADSVKDRFT ISRDDSQSML YLQMNNLKTE DTAMYXCVRQ WDYDVRAMNY WGQGTSVTVS S 抗5T4 VH
100 DIVMTQSHIF MSTSVGDRVS ITCKASQDVDTAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRLTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQSEDLADYFCQQ YSSYPYTFGG GTKLEIK 抗5T4  VL
101 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSFNYYWSWIRHHPGKGLEWIGYIYYSGSTYSNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLTLSSVTAADTAVYYCARGYNWNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC gpNMB Fd
102 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVDNNLVWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC gpNMB LC
103 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 隆凸Fc
104 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 孔洞Fc
105 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 隆凸Fc
106 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 孔洞Fc
107 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 隆凸Fc
108 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 孔洞Fc
109 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 隆凸Fc
110 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 孔洞Fc
111 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPT 孔洞Fc
112 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPT 孔洞Fc
113 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG 孔洞Fc
114 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG 孔洞Fc
115 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPT 隆凸Fc
116 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPT 隆凸Fc
117 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG 隆凸Fc
118 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG 隆凸Fc
119 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPT 孔洞Fc
120 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPT 孔洞Fc
121 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG 孔洞Fc
122 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG 孔洞Fc
123 (GGGGS)n，其中n為1至5 連接體
124 (GGGGGS)n，其中n為1至4 連接體
125 GGGGS 連接體
126 GGGGGS 連接體
127 GGGGGSGGGGGSGGGGGS 連接體
128 GGGGSGGGGSGGGGS 連接體
129 GGSGGGGSGGGGSGGGGS 連接體
130 GlyxXaa-Glyy-Xaa-Glyz Xaa獨立地選自A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E x、y及z各種係1-5範圍內之整數 連接體
131 Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly Xaa獨立地選自A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E 連接體
132 (SSSSG)n n=1-9 連接體
133 GGGGG-C-GGGGG 連接體
134 (EAAAK)n 連接體
135 AS-(AP)n-GT n=2-20 連接體
136 AS-(EAAAK)n-GT n=2-20 連接體
137 (GGGGA)n n=2-20 連接體
138 (PGGGS)n n=2-20 連接體
139 (AGGGS)n n=2-20 連接體
140 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS n=2-20 連接體
141 SSSASASSA 連接體
142 GSPGSPG 連接體
143 ATTTGSSPGPT 連接體
144 X1 X2 X3 X4 X5 (P4 P3 P2 P1 ↓ P1’) X1= I、L、Y、M、F、V或A；(P4 = I、L、Y、M、F、V或A) X2 = A、G、S、V、E、D、Q、N或Y；(P3 = A、G、S、V、E、D、Q、N或Y) X3 = H、P、A、V、G、S或T；(P2 = H、P、A、V、G、S或T) X4 = D或E；(P1 = D或E) X5 = I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A (P1’ = I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A) 共有連接體
145 X1 E X3 D X5 (P4 P3 P2 P1 ↓ P1’) X1 = I或L；(P4 = I或L) (P3 = E) X3 = P或A；(P2 = P或A) X5 = I、V、T、S或G (P1’ = I、V、T、S或G) 共有連接體
146 LEAD 顆粒酶B受質
147 LEPD 連接體
148 LEAE 連接體
149 IEPDI 連接體
150 LEPDG 連接體
151 LEADT 連接體
152 IEPDG 連接體
153 IEPDV 連接體
154 IEPDS 連接體
155 IEPDT 連接體
156 X1QARX5 (P1QAR↓(A/V)) X1 =任一胺基酸；(P1係任一胺基酸) X5 = A或V 共有連接體
157 RQARX5 (RQAR(A/V)) X5 = A或V 連接體
158 RQAR 間質蛋白酶受質
159 RQARV 連接體
160 X1X2 X3 X4 (P3 P2 P1 ↓ P1’) X1 = P、V或A；(P3 = P、V或A) X2 = Q或D；(P2 = Q或D) X3 = A或N；(P1 = A或N) X4 = L、I或M  (P1’ = L、I或M) 共有連接體
161 PX2X3X4  (P3 P2 P1 ↓ P1’) (P3 = P) X2 = Q或D；(P2 = Q或D) X3 = A或N；(P1係A或N) X4 = L或I (P1’係L或I) 共有連接體
162 PAGL MMP受質
163 TGLEADGSPAGLGRQARVG 連接體
164 TGLEADGSRQARVGPAGLG 連接體
165 TGSPAGLEADGSRQARVGS 連接體
166 TGPAGLGLEADGSRQARVG 連接體
167 TGRQARVGLEADGSPAGLG 連接體
168 TGSRQARVGPAGLEADGS 連接體
169 TGPAGLGSRQARVGLEADGS 連接體
170 GPAGLGLEPDGSRQARVG 連接體
171 GGSGGGGIEPDIGGSGGS 連接體
172 GGSGGGGLEADTGGSGGS 連接體
173 GSIEPDIGS 連接體
174 GSLEADTGS 連接體
175 GGSGGGGIEPDGGGSGGS 連接體
176 GGSGGGGIEPDVGGSGGS 連接體
177 GGSGGGGIEPDSGGSGGS 連接體
178 GGSGGGGIEPDTGGSGGS 連接體
179 GGGSLEPDGSGS 連接體
180 GPAGLGLEADGSRQARVG 連接體
181 GGEGGGGSGGSGGGS 連接體
182 GSSAGSEAGGSGQAGVGS 連接體
183 GGSGGGGLEAEGSGGGGS 連接體
184 GGSGGGGIEPDPGGSGGS 連接體
185 TGGSGGGGIEPDIGGSGGS 連接體
186 ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEANSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 41BBL
187 EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSS 41BB VH
188 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL 41BB VL
189 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSS 41BB VH
190 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIK 41BB VL
191 QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWVNPMSGGTNYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGMAMRLELDKWGQGTLVTVSS 41BB VH
192 SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSVVFGGGTQLTVL 41BB VL
193 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIKLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYNVTGVTFDDKKCTYAISTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
194 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPIKMMATIYELKEDKSYDVTMVKFDDKKCMYDIWTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
195 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYDVTAVAFDDKKCTYDIWTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
196 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIKLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYDVTAVAFDDKKCTYDIWTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
197 QDSTSDLIPA PPLSKVPLQQ NFQDNQFHGK WYVVGQAGNI KLREDSKMMA TIYELKEDKS YDVTGVSFDD KKCTYAIMTF VPGSQPGEFT LGKIKSFPGH TSSLVRVVST NYNQHAMVFF KFVFQNREEF YITLYGRTKE LTSELKENFI RFSKSLGLPE NHIVFPVPID QCIDG 41BB抗運載蛋白
198 QDSTSDLIPA PPLSKVPLQQ NFQDNQFHGK WYVVGQAGNI KLREDKDPVK MMATIYELKE DKSYDVTGVT FDDKKCRYDI STFVPGSQPG EFTFGKIKSF PGHTSSLVRV VSTNYNQHAM VFFKFVFQNR EEFYITLYGR TKELTSELKE NFIRFSKSLG LPENHIVFPV PIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
199 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPHKMMATIYELKEDKSYDVTGVTFDDKKCTYAISTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
200 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIKLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYDVTGVTFDDKKCTYAISTLVPGSQPGEFTFGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
201 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPSKMMATIYELKEDKSYDVTAVTFDDKKCNYAISTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
202 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類41BBL之71-254
203 LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類41BBL之85-254
204 DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類41BBL之80-254
205 PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類4-lBBL之52-254
206 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之71-248
207 LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之85-248
208 DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之80-248
209 PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之52-248
210 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFSFSINAMGWYRQAPGKRREFVAAIESGRNTVYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGLLKGNRVVSPSVAYWGQGTLVTVKP 41BB sdAb
211 QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL OX40配體
212 QVSHRYPRFQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEFCVL OX40配體
213 QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL OX40配體
214 QVSHRYPRIQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEF CVL OX40配體
215 VSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL OX40配體
216 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQGTLVTVSS OX40 VH
217 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRT OX40 VL
218 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSGIYDSSGYDYWGQGTLVTVSS OX40 VH
219 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK OX40 VL
220 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTFSDAFMYWVRQAPGKGLEWVSSISNRGLKTAYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCSRDVDGDFRGQGTLVTVKP OX40 sdAb
221 QLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS GITR配體
222 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGGYYDSMDYWGQGTLVTVSS GITR VH
223 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSFMNWYQQKPGQAPRLLIYAASNQGSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTKEVTWTFGQGTKVEIK GITR VL
224 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYQPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSS GITR VH
225 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIK GITR VL
226 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYFWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGTTYYNPSLKSRVTISIDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDLFYYDTSGPRGFDPWGQGTLVTVSS GITR VH
227 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGSSTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSPWTFGQGTKVEIK GITR VL
228 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYPGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGELGRYYYYGMDVWGQGTTVTVSS GITR VH
229 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNNYPWTFGQGTKVDIK GITR VL
230 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVFSIDAMGWYRQAPGKQRELVAVLSGISSAKYAASAPGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYADVSTGWGRDAHGYWGQGTLVTV GITR sdAb
231 UniProt第P32970號 CD70-ECD
232 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGNWGFFDYWGQGTLVTVSS CD70 VH
233 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPRTFGQGTKVEIK CD70 VL
234 QVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINGMGWYRQAPGKERELVAGLTSGGSVTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCRAEIFTRTGENYYGMDYWGKGTQVTVKP ICOS sdAb
235 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRMFSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYRRDAADYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCGFTYAGWASSRRDDYNYWGQGTLVTVKP CD28 sdAb
236 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3ζ信號傳導域
237 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB源共刺激域
238 SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28源共刺激域
239 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28源共刺激域2
240 FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28源共刺激域3
241 KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC CD8源鉸鏈及跨膜域
242 AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG VLLLSLVIT CD8源鉸鏈及跨膜域
243 KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT CD8鉸鏈及跨膜域
244 GGSGGS (GGS)2連接體
245 GGSGGSGGS (GGS)3 連接體
246 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接體
247 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接體
248 GGGG 甘胺酸連接體
249 GGGGG 甘胺酸連接體
250 GGSGGS (GGS)2連接體
251 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKGRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v1
252 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v2
253 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v3
254 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v4
255 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v5
256 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v6
257 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v7
258 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v8
259 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v9
260 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v10
261 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v11
262 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v12
263 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRELVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v13
264 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v14
265 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v15
266 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v16
267 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v17
268 GSMTGANTMG CDR1
269 GGSGGSGGS (GGS)3 連接體
270 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接體
271 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接體
272 GSVTGANTMG CDR1
273 GSITGANTMG CDR1
274 GGSGGS (GGS)2連接體
275 GGSGGSGGS (GGS)3 連接體
276 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接體
277 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接體
278 LIGNYVTH CDR2
279 GGSGGS (GGS)2連接體
280 GGSGGSGGS (GGS)3 連接體
281 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接體
282 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接體
283 YTDNLGTS CDR3
284 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCVASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYHYADSVKGRFTISRENAKNTVILQMNSLNPEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP 18H10
285 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL (CON)
286 MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL PD-1
296 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRVSCAASGRTFSSYGMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGTQYYADSAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCADYTDYVVYRPQEIGYWGQGTQVTVKP    cPD1-8
297 QLQLQQSGGGLAQAGGSLRLSCAASGRTVSIYAMGWFRQAPGKEREFVAGIGWNGGTTYYADSVEGRFTISRDHAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQESAAGTLGDYWGRGTQVTVKP    cPD1-14
298 QVTLKESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTEIIYAMGWFRQAPGKEREFVAGIGWSGGTTYYADSVEGRFTISRDSAKNTVYLQMRSLKPEDTAVYYCAAQDSVAGTLGDYWGQGTQVTVKP    cPD1-13
299 QVTLRESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFGLYAMTWFRQAPGKDREGISCISSSDGSTIYADSVKGRFTASRDNAKDTMYLQMNNLNPEDTAVYYCATDYETRCDYGLRLRDRTAYWGPGTQVTVKP    cPD1-5
300 GRTFSSY    cPD1-8 CDR1
301 GRTVSIY    cPD1-14 CDR1
302 GRTEIIY    cPD1-13 CDR2
303 GLTFGLY    cPD1-5 CDR1
304 SWSGGT    cPD1-8 CDR2
305 GWNGGT    cPD1-14 CDR2
306 GWSGGT    cPD1-13 CDR2
307 SDGST    cPD1-5 CDR2
308 YTDYVVYRPQEIGY    cPD1-8 CDR3
309 QESAAGTLGDY    cPD1-14 CDR3
310 QDSVAGTLGDY    cPD1-13 CDR3
311 DYETRCDYGLRLRDRTAY    cPD1-5 CDR3
312 QVQLQQSGGGLAQAGGSLRLSCAASGRTVSIYAMGWFRQAPGKEREFVAGIGWNGGTTYYADSVEGRFTISRDHAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCAAQESAAGTLGDYWGRGTQVTVKPGG 1-14
316 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH 312557
317 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKCLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH 312557 G44C
318 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQGTKVEIK 抗CD3 VL 312557
319 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGCGTKVEIK 抗CD3 VL 312557 Q100C
320 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFTFDDYSMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSKDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKYGSGYGKFYHYGLDVWGQGTTVTVSS CD3-VH-G   
321 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFTFDDYSMHWVRQAPGKCLEWVSGISWNSGSKDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKYGSGYGKFYHYGLDVWGQGTTVTVSS CD3-VH-G G44C
322 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK VK1 -39Jκ5
323 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGCGTRLEIK VK1 -39Jκ5 Q100C
圖1A-1G 繪示18H10及其人類化變體hz18H10或1-14與表現人類PD-1 (圖1A、1D、1E、1F、1G)、食蟹猴PD-1 (圖1B)或小鼠PD-1 (圖1C)之FreeStyle 293細胞之結合。亦評價且展示與未轉染(293)細胞之結合。
圖2 係繪示18H10及其人類化變體hz18H10v7與經活化人類T細胞之結合之圖形。藉由流式細胞術量化測試物品與經活化T細胞之結合。
圖3 係繪示在Jurkat報告基因螢光素酶分析系統中18H10、其人類化變體hz18H10v7或1-14阻斷T細胞受體(TCR)信號傳導之PD1/PDL1介導性抑制之能力之圖形。圖3A繪示藉由18H10及hz18H10v7之PD1阻斷，而圖3B繪示藉由1-14之PD1阻斷。

Claims (28)

  1. 一種PD-1結合多肽構築體，其包括至少一個特異性結合PD-1之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)。
  2. 一種PD-1結合多肽構築體，其包括至少一個特異性結合PD-1之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)及一或多個結合至除PD-1外之靶的其他結合域。
  3. 如請求項1之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個VHH域包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272、273及313組成之群之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 278或314中所示之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 283或315中所示之胺基酸序列。
  4. 一種PD-1結合構築體，其包括至少一個包括以下之唯一重鏈可變域(PD-1 VHH域)：互補決定區1 (CDR1)，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272、273及313組成之群之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 278或314中所示之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 283或315中所示之所選胺基酸序列。
  5. 2、3或4中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該特異性結合PD-1之PD-1 VHH域阻斷PD-1及PD-L1之相互作用。
  6. 如請求項2之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合共刺激分子。
  7. 如請求項2之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合T細胞表面標記物。
  8. 如請求項7之PD-1結合多肽構築體，其中該T細胞表面標記物係CD8。
  9. 如請求項7之PD-1結合多肽構築體，其中該T細胞表面標記物係CD4。
  10. 如請求項2之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合除PD1外之免疫檢查點。
  11. 如請求項2之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至免疫細胞上之活化受體。
  12. 如請求項2之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他域結合至腫瘤相關抗原(TAA)。
  13. 如請求項2之PD-1結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至細胞介素受體。
  14. 2、3或4中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該多肽包括免疫球蛋白Fc區。
  15. 2、3或4中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括SEQ ID NO: 251至267、284或312中之任一者中所示之序列或與SEQ ID NO: 251至267、284或312中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。
  16. 如請求項1或2中任一項之PD-1結合多肽構築體，其中該至少一個PD-1 VHH域包括CDR1、CDR2及CDR3係分別所示於SEQ ID NO: 268、278及283中；分別是於SEQ ID NO: 272、278及283中；或分別示於SEQ ID NO: 273、278及283中。
  17. 一種結合PD-1之經分離單一域抗體，其包括：互補決定區1 (CDR1)，其包括選自由SEQ ID NO: 268、272、273及313組成之群之胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包括SEQ ID NO: 278或314中所示之胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包括SEQ ID NO: 283或315中所示之胺基酸序列。
  18. 如請求項17之經分離單一域抗體，其包括SEQ ID NO: 251至267或284中之任一者中所致之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 251至267、284或312中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列且結合PD-1。
  19. 如請求項18之經分離單一域抗體，其中該sdAb包括SEQ ID NO: 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、284或312中所示之胺基酸序列。
  20. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至4中任一項之PD-1結合多肽。
  21. 一種多核苷酸，其編碼如請求項17至19中任一項之單一域抗體。
  22. 一種載體，其包括如請求項20至21中任一項之多核苷酸。
  23. 一種細胞，其包括一或多種如請求項20至21中任一項之多核苷酸或如請求項22之載體。
  24. 一種產生多肽之方法，該方法包括向細胞中引入一或多種如請求項20至21中任一項之多核苷酸或如請求項22之載體，並在用以產生多肽構築體之條件下培養該細胞。
  25. 一種經改造免疫細胞，其包括如請求項1至4中任一項之結合分子或如請求項17至19中任一項之單一域抗體，視情況其中該結合分子可自該細胞分泌。
  26. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至4中任一項之PD-1結合多肽、如請求項17至19中任一項之單一域抗體或如請求項25之經改造免疫細胞。
  27. 一種刺激或誘導個體中免疫反應之方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項1至4中任一項之PD-1結合多肽、如請求項17至19中任一項之單一域抗體或如請求項25之經改造免疫細胞或如請求項26之醫藥組合物。
  28. 一種治療個體中疾病或病狀之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之如請求項1至4中任一項之PD-1結合多肽、如請求項17至19中任一項之單一域抗體或如請求項25之經改造免疫細胞或如請求項26之醫藥組合物。
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