TW202306999A - 抗egfr抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文係關於結合EGFR域II及/或域III之抗體。本文亦係關於結合EGFR之域II及域III的雙特異性抗體。本文亦係關於用於治療癌症之方法及用途。

Description

抗EGFR抗體及其用途
表皮生長因子受體(EGFR)為受體酪胺酸激酶(RTK)之ErbB家族的成員，引導許多不同組織之增殖及分化。參見Wieduwilt MJ及Moasser MM (2008) The epidermal growth factor receptor family: biology driving targeted therapeutics. Cell Mol Life Sci65(10):1566-1584。EGFR之過度表現發生在大量的上皮腫瘤中，且導致臨床結果不佳。參見例如Aratani K等人(2017) Overexpression of EGFR as an Independent Prognostic Factor in Adenocarcinoma of the Esophagogastric Junction. Anticancer Res37(6):3129-3135。Bethune G, Bethune D, Ridgway N及Xu Z (2010) Epidermal growth factor receptor (EGFR) in lung cancer: an overview and update. J Thorac Dis2(1):48-51；Hashmi AA等人(2018) Prognostic significance of epidermal growth factor receptor (EGFR) over expression in urothelial carcinoma of urinary bladder. BMC Urol18(1):59；Li W等人(2018) Overexpression of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and HER-2 in Bladder Carcinoma and Its Association with Patients' Clinical Features. Med Sci Monit24:7178-7185。迄今為止，四種抗EGFR抗體已經批准用於人類療法且其他若干種抗體正在臨床試驗中。然而，即使最流行之治療性抗體西妥昔單抗(Cetuximab；CTX)及帕尼單抗(Panitumumab；PTMB)，其使用亦僅限於一小部分EGFR陽性腫瘤。參見Garcia-Foncillas J等人(2019) Distinguishing Features of Cetuximab and Panitumumab in Colorectal Cancer and Other Solid Tumors. Front Oncol9:849。
本文描述EGFR結合抗體。此等抗體與人類EGFR之域II及/或域III結合。亦描述能夠結合EGFR之域II及域III兩者的雙特異性抗體。此類抗體有利地將靶向EGFR之療法效用擴展至前述EGFR抗體之外，且允許在「開放」構形中抑制EGFR信號傳導，其使得抗體對更廣泛之癌症及腫瘤更有效及有效。因此，本文亦描述抗體在治療癌症及腫瘤中之方法及用途。
在一個態樣中，本文描述一種抗體或其抗原結合片段，其包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 23至38中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列；及/或f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列；其中抗體與EGFR域II結合。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為IgG抗體。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為Fab、F(ab) 2、單域抗體或單鏈可變片段(scFv)。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段以50奈莫耳或更小之KD與EGFR結合。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段以10奈莫耳或更小之KD與EGFR結合。
在另一態樣中，本文描述一種EGFR域III結合抗體，其包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中所示之胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列；及/或f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列；其中抗體與EGFR域III結合。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為IgG抗體。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為Fab、F(ab) 2、單域抗體或單鏈可變片段(scFv)。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段以500奈莫耳或更小之KD與EGFR結合。在某些實施例中，抗體或抗原結合片段以300奈莫耳或更小之KD與EGFR結合。
在一個態樣中，本文亦描述一種與EGFR域II及EGFR域III結合之雙特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，雙特異性抗體包含EGFR域II結合部分，其中EGFR域II結合部分包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中之任一者中所示的胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中之任一者中所示的胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 23至38中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列。在某些實施例中，雙特異性抗體包含EGFR域III結合部分，其中EGFR域III抗原結合部分包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中之任一者中所示的胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中之任一者中所示的胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列。本文亦描述一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含EGFR域II及EGFR域III結合部分，其中EGFR域II結合部分包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中之任一者中所示的胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中之任一者中所示的胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 23至38中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列；且其中EGFR域III抗原結合部分包含：g)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中之任一者中所示的胺基酸序列；h)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中之任一者中所示的胺基酸序列；i)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列；j)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；k)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或l)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列。在某些實施例中，雙特異性抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。在某些實施例中，雙特異性抗體或其抗原結合片段包含IgG恆定區。在某些實施例中，EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含IgG恆定區；共同免疫球蛋白輕鏈與EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈締合；且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈彼此締合。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之IgG恆定區在一或多個胺基酸位置處不同，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之一者包含T366W取代(EU編號)，且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含T366S/L368A/Y407V取代(EU編號)，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之一者包含一或多個選自Q347M、Y348F、T350D、T389W、L368M (EU編號)之取代，且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含一或多個選自S354I、E357L、K359S、T366S、L368A及Y412V (EU編號)之取代，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之一者包含與SEQ ID NO: 61至少約90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含與SEQ ID NO: 62至少約90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，雙特異性抗體或抗原結合片段以100奈莫耳或更小之KD與EGFR結合。在某些實施例中，雙特異性抗體或抗原結合片段以50奈莫耳或更小之KD與EGFR結合。在某些實施例中，雙特異性抗體或抗原結合片段以10奈莫耳或更小之KD與EGFR結合。在某些實施例中，雙特異性抗體或抗原結合片段與EGFR之開放構形結合。
本文亦描述與本文揭示之抗體或雙特異性抗體或其抗原結合片段結合相同抗原決定基或結合重疊的抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段。
本文亦描述與本文揭示之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段競爭結合的抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段。
本文亦描述包含本文所描述之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑的組合物。
本文亦描述一種核酸或複數種核酸，其包含編碼本文所描述之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。
本文亦描述一種包含該核酸或複數種核酸之細胞，該核酸包含編碼本文所描述之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。在某些實施例中，細胞為真核細胞。在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。在某些實施例中，細胞為原核細胞。
本文亦描述本文所描述之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段之用途，其用於治療個體癌症或腫瘤之方法中。在某些實施例中，癌症或腫瘤為實體組織癌症或腫瘤。在某些實施例中，癌症或腫瘤表現EGFR。在某些實施例中，癌症或腫瘤過度表現EGFR。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含大腸直腸癌。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含頭頸癌。
本文亦描述一種治療罹患癌症或腫瘤之個體的方法，其包含向罹患癌症或腫瘤之個體投與本文所描述之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段，藉此治療癌症或腫瘤。在某些實施例中，癌症或腫瘤為實體組織癌症或腫瘤。在某些實施例中，癌症或腫瘤表現EGFR。在某些實施例中，癌症或腫瘤過度表現EGFR。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含大腸直腸癌。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含頭頸癌。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含非小細胞肺癌(NSCLC)。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張在2021年6月24日申請之美國臨時第63/214,596號之權益，該申請案以全文引用之方式併入本文中。 以引用之方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經特定及個別地指示以引用的方式併入一般。
術語「癌症」及「腫瘤」係指哺乳動物中以細胞生長失調為特徵之生理病況。
術語「EGFR」或「表皮生長因子受體」係指EGFR基因之蛋白質產物。在某些實施例中，EGFR基因為人類 EGFR基因。在某些實施例中，EGFR基因為哺乳動物 EGFR基因。在某些實施例中，EGFR基因為猿猴EGFR基因。在某些實施例中，EGFR基因為小鼠EGFR基因。在某些實施例中，EGFR基因為大鼠EGFR基因。例示性人類EGFR序列在SEQ ID NO 1中。本發明之EGFR蛋白質包括能夠由本文所描述之抗體結合的天然存在之變異體及天然存在之轉譯後修飾。
EGFR胞外域(ECD)包含四個結構化域且以至少兩種不同的構形存在。EGFR之域包含域I (胺基酸1-165)、域II (胺基酸165-310)、域III (胺基酸310-480)及域IV (胺基酸480-620)。在缺乏配位體及低濃度之情況下，域II與域IV相互作用且將ECD束縛在封閉的構形中。在域III與IV之間的界面處結合配位體後，ECD適應完全不同的開放構形，其釋放域II中之二聚化臂，與另一EGFR或其他ErbB家族成員相互作用以形成活性信號傳導二聚體。參見Dawson JP等人(2005). Epidermal growth factor receptor dimerization and activation require ligand-induced conformational changes in the dimer interface. Mol Cell Biol25 (17):7734-7742。
如本文所用，術語「個體(individual)」、「患者」或「個體(subject)」係指經診斷患有、疑似罹患所描述之組合物及方法適用於治療的至少一種疾病或有出現疾病風險之個體。在某些實施例中，個體為哺乳動物。在某些實施例中，哺乳動物為小鼠、大鼠、家兔、犬、貓、馬、牛、綿羊、豬、山羊、駱馬、羊駝或犛牛。在某些實施例中，個體為人類。
如本文所用，用於修飾特定數字之術語「約」係指該數字加或減該數字之10%。修飾範圍之術語「約」係指該範圍減去其最低值之10%及加上其最大值之10%。
如本文所用，術語「治療(treatment/treating)」在提及醫藥方案或用於在接受者中獲得有益或所需結果之其他干預方案時使用。有益或所需結果包括(但不限於)治療益處及/或預防益處。治療益處可指所治療之症狀或基礎病症的根除或改善。另外，可藉由根除或改善與基礎病症相關之生理學症狀中的一或多者以使得在個體中觀測到好轉來達成治療益處，不過個體可能仍罹患基礎病症。預防作用包括延緩、預防或消除疾病或病況之出現；延緩或消除疾病或病況之症狀的發作；減緩、阻止或逆轉疾病或病況之進展；或其任何組合。對於預防益處，有出現特定疾病風險之個體或報導疾病之生理學症狀中之一或多者的個體可進行治療，即使可能尚未診斷出此疾病。熟習此項技術者將認識到，給定一組潛在的接受治療之個體，並非所有個體皆會對治療有反應或對治療有同等反應。若投與包括本文所描述之醫藥組合物的組合物，則認為此類個體已得到治療。
本文中術語「抗體」係在最廣泛的意義上使用且包括多價或雙特異性抗體及單株抗體，包括完整抗體及其功能性(抗原結合)抗體片段，包括抗原結合片段(Fab)片段、F(ab') 2片段、Fab'片段、Fv片段、重組IgG (rIgG)片段、單鏈抗體片段(包括單鏈可變片段(sFv或scFv))及單域抗體(例如sdAb、sdFv、奈米抗體)片段。如本文所描述之抗體亦包含多特異性或雙特異性結合分子，其併入有助於與既定目標抗原特異性結合的一或多個互補決定區。該術語涵蓋免疫球蛋白之經基因工程改造及/或以其他方式修飾之形式，諸如胞內抗體、肽體、嵌合抗體、完全人類抗體、人類化抗體及異結合抗體、多特異性(例如雙特異性)抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體、串聯二-scFv、串聯三-scFv。除非另有說明，否則術語「抗體」應理解為涵蓋其功能性抗體片段。該術語亦涵蓋完整或全長抗體，包括任何種類或子類之抗體，包括IgG及其子類、IgM、IgE、IgA及IgD。抗體可包含人類IgG1恆定區。抗體可包含人類IgG4恆定區。
多特異性或多價抗體(例如，雙特異性抗體及多反應性抗體)及其抗體片段為所提供之抗體之一。抗體包括抗體-結合物及包含抗體之分子(諸如嵌合分子)。因此，抗體包括(但不限於)全長及天然抗體，以及其保留其結合特異性之片段及部分，諸如其任何特異性結合部分，包括具有許多免疫球蛋白類別及/或同型(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE及IgM)之彼等片段及部分；及生物學相關(抗原結合)片段或其特異性結合部分，包括(但不限於) Fab、F(ab') 2、Fv及scFv (單鏈或相關實體)。單株抗體一般為實質上均質抗體之組合物內之一種抗體；因此，除可少量存在之可能天然存在之突變以外，單株抗體組合物內所包含之任何個別抗體均相同。單株抗體可包含人類IgG1恆定區或人類IgG4恆定區。
術語「互補決定區」及「CDR」與「高變區」或「HVR」同義，為此項技術中已知的，且係指抗體可變區內之非相鄰胺基酸序列，其賦予抗原特異性及/或結合親和力。一般而言，各重鏈可變區中存在三個CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且各輕鏈可變區中存在三個CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。「構架區」及「FR」為此項技術中已知的，係指重鏈及輕鏈之可變區的非CDR部分。一般而言，各全長重鏈可變區中存在四個FR (FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4)，且各全長輕鏈可變區中存在四個FR (FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4)。既定CDR或FR之精確胺基酸序列邊界可易於使用多個熟知方案中之任一者測定，該等方案包括由以下所描述之方案：Kabat等人(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人, (1997) JMB273,927-948 (「Chothia」編號方案)；MacCallum等人, J. Mol . Biol .262:732-745 (1996), 「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography」, J . Mol . Biol .262, 732-745. (「Contact」編碼方案)；Lefranc MP等人, 「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」, Dev Comp Immunol, 2003年1月;27(1):55-77 (「IMGT」編碼方案)；Honegger A及Plückthun A, 「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool」, J Mol Biol, 2001年6月8日;309(3):657-70 (「Aho」編碼方案)；及Whitelegg NR及Rees AR, 「WAM: an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB」, Protein Eng. 2000年12月;13(12):819-24 (「AbM」編碼方案)。在某些實施例中，本文所描述之抗體之CDR可由選自Kabat、Chothia、IMGT、Aho、AbM或其組合之方法定義。
既定CDR或FR之邊界可根據用於鑑別之方案而變化。舉例而言，Kabat方案係基於結構比對，而Chothia方案係基於結構資訊。Kabat與Chothia方案兩者之編號均基於最普通抗體區序列長度，其中在一些抗體中出現由插入字母(例如「30a」)表示之插入及缺失。兩種方案將某些插入及缺失(「插入缺失」)置於不同位置，產生不同編號。Contact方案係基於對複雜晶體結構之分析且在多個方面與Chothia編號方案相似。
術語「可變區」或「可變域」係指參與抗體與抗原結合之抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為V H及V L)通常具有類似結構，其中各域包含四個保守性構架區(FR)及三個CDR (參見例如Kindt等人, Kuby Immunology,第6版,W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007))。單個V H或V L域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之V H或V L域分別篩選互補V L或V H域之庫而分離(參見例如Portolano等人, J . Immunol ., 150:880-887 (1993)；Clarkson等人, Nature, 352:624-628 (1991))。
抗體片段為所提供之抗體之一。「抗體片段」可指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之結合完整抗體所結合之抗原的部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv或sFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。在特定實施例中，抗體為包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區之單鏈抗體片段，諸如scFv。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體之蛋白分解消化以及由重組宿主細胞產生。在一些實施例中，抗體為重組產生之片段，諸如包含非天然存在之排列的片段，諸如其中兩個或多於兩個抗體區或鏈由合成連接子(例如多肽連接子)接合的片段，及/或天然存在之完整抗體之酶消化不能產生的片段。
本文中之分子、肽、多肽、抗體或抗體片段可稱為「雙特異性」或「雙重特異性」，包括文法同等物。雙特異性分子具有與至少兩個結構不同之目標特異性結合的能力。特異性結合可由以下引起：分子層面上結構不同之兩個不同結合部分，包括(但不限於)不同的非一致胺基酸序列；或能夠以高親和力(例如，KD小於約1×10 - 6)特異性結合兩個結構不同之目標的單個結合部分。稱為「多特異性」之分子、肽、多肽、抗體或抗體片段係指具有與至少三個結構不同之目標特異性結合之能力的分子。包括文法同等物之「雙特異性抗體」係指保留抗體之至少一個片段的雙特異性分子，該片段能夠特異性結合目標，例如來自抗體分子之可變區、重鏈或輕鏈、或一或多個互補決定區。包括文法同等物之「多特異性抗體」係指保留抗體之至少一個片段的多特異性分子，該片段能夠與目標特異性結合，例如來自抗體分子之可變區、重鏈或輕鏈、或互補決定區。「共同輕鏈雙特異性抗體」係指具有兩種不同重鏈的特定類型之雙特異性抗體，兩種不同重鏈可各自與同一輕鏈形成以結合兩個結構不同之目標。
本發明之「基於片段」之雙特異性抗體或包含「單鏈可變片段」或「scFv」之雙特異性抗體可指單鏈抗體或其片段，其包含兩個結合部分及連接兩個結合部分之連接子。連接子可為多肽連接子或具有適合可撓性以便不抑制任一靶向部分之結合的其他連接子。基於片段之雙特異性抗體形式包括串聯V HH抗體、串聯scFv、scFv-Fab、F(ab) 2、雙親和重靶向抗體(DART)。此類基於片段之抗體可經進一步操縱以包含對既定目標具有特異性之附加結合部分(例如A 2:B 1、A 1:B 2或A 2:B 2)，或具有Fc區之片段以改良藥代動力學或促進ADCC、ADCP或CDC。
「結合部分」係指分子、肽、多肽、抗體或抗體片段之介導與所述目標或抗原或抗原決定基之特異性結合的部分。藉助於實例，抗體之結合部分可包含重鏈/輕鏈可變區對或一或多個互補決定區(CDR)。
本文所描述之抗體分子的特異性結合或結合係指由抗體之一或多個CDR部分介導的結合。並非所有CDR皆為特異性結合所需要的。特異性結合可例如藉由針對特定列舉之目標或抗原的ELISA顯示與同型對照抗體相比結合顯著增加來證明。
如本文所提及之「目標」係指參與分子、肽、多肽、抗體或抗體片段之結合部分的分子部分。目標可包含胺基酸序列及/或碳水化合物、脂質或其他化學實體。「抗原」為包含能夠被適應性免疫分子(諸如抗體或抗體片段、B細胞受體或T細胞受體)結合之部分的目標。
如本文所描述之「抗原決定基」係指抗體之一或多個接觸區。抗體之接觸區由抗體之胺基酸殘基(通常為CDR殘基)所接觸的離散數量胺基酸及與接觸殘基鄰接之相鄰殘基組成。舉例而言，接觸區可由5至20個胺基酸、5至15個胺基酸或5至10個胺基酸之間的目標蛋白之連續片段組成。由於蛋白質摺疊或雙特異性抗體之多特異性，抗體或雙特異性抗體可結合超過一個接觸區，該等接觸區由10、20、30、40、50、75或100個或更多胺基酸隔開。可使用X射線晶體學、氫-氘交換質譜、丙胺酸掃描誘變、藉由免疫墨點、ELISA、表面電漿子輻射、流動式細胞測量術或任何其他適合蛋白質結合分析法測定與過量合成肽之競爭來測定抗原決定基。
如本文中所提及，「競爭」可藉由在過量測試抗體存在下將目標與第一抗體或雙特異性抗體一起培育且觀測第一抗體結合降低來測定。可使用免疫墨點、ELISA、表面電漿子輻射、流動式細胞測量術或任何其他適合蛋白質結合分析來觀測此類結合降低。
雙特異性或多特異性分子之「價數」係指所述分子、肽、多肽、抗體或抗體片段能夠結合的目標之數量。舉例而言，單價分子能夠與特定目標之一個分子結合，二價分子能夠與兩個分子結合，且四價分子能夠結合四個目標。
「人類化」抗體為其中全部或實質上全部CDR胺基酸殘基均源於非人類CDR且全部或實質上全部FR胺基酸殘基均源於人類FR之抗體。人類化抗體視情況可包括源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。非人類抗體之「人類化形式」係指已經歷人類化(通常用以降低對人類之免疫原性)，同時保持親本非人類抗體之特異性及親和力之非人類抗體變異體。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，CDR殘基所源於之抗體)之相應殘基取代，例如用以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類抗體為所提供之抗體之一。「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞所產生之抗體的胺基酸序列或利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列(包括人類抗體庫)之非人類來源的胺基酸序列的抗體。該術語不包括包含非人類抗原結合區之非人類抗體的人類化形式，諸如其中全部或實質上全部CDR為非人類CDR的彼等形式。人類抗體可藉由將免疫原投與已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座的所有或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因動物中，內源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。人類抗體亦可源於人類抗體庫，包括噬菌體呈現庫及無細胞庫，其含有源於人類譜系之抗體編碼序列。
如本文所用之「ADCC」或「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」係指如下細胞介導之反應，其中表現FcγR之非特異性細胞毒性細胞識別目標細胞上結合之抗體且隨後使得目標細胞溶解。ADCC與FcγRIIIa結合相關，其中FcγRIIIa結合增加使得ADCC活性增加。如本文所用，「ADCP」或「抗體依賴性細胞介導之吞噬作用」可指如下細胞介導之反應，其中表現FcγR之非特異性細胞毒性細胞識別目標細胞上結合之抗體且隨後引起目標細胞之吞噬。
術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。多肽(包括所提供之抗體及抗體鏈以及其他肽，例如連接子及結合肽)可包括胺基酸殘基，包括天然及/或非天然胺基酸殘基。該等術語亦包括多肽之表現後修飾，例如醣基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。在一些態樣中，多肽可含有相對於原生或天然序列的修飾，只要蛋白質維持所需活性即可。此等修飾可為有意的，如經由定點誘變，或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或由PCR擴增所致的錯誤。
相對於參考多肽序列之序列一致性百分比(%)係在比對序列且引入間隙(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的候選序列中之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以各種已知方式實現，例如，使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。能夠確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較之序列之全長上獲得最大比對所需之演算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech, Inc.撰寫，且原始程式碼已在美國版權局(U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559申請使用者文檔，其中其註冊在美國版權註冊(U.S.Copyright Registration)第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開購自Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式經編譯可用於UNIX作業系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不會變化。在ALIGN-2用於胺基酸序列比較之情形中，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (其可替代性表述為具有或包含相對於、與或針對既定胺基酸序列B之某一胺基酸序列一致性%之既定胺基酸序列A)計算如下：100乘以分數X/Y，其中X係藉由序列比對程式ALIGN-2在該程式比對A及B時評分為一致匹配之胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。除非另外特定陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值皆如前段中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
可考慮及構想本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。變異體與本文特定揭示之多肽的不同之處通常在於一或多個取代、缺失、添加及/或插入。此類變異體可天然存在，或可例如藉由修飾本發明之以上多肽序列中之一或多個且評估如本文所描述之多肽之一或多種生物活性，及/或使用多種已知技術中之任一者以合成方式產生。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性，抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。可提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。所關注之取代型誘變位點包括CDR及FR。可將胺基酸取代引入所關注之抗體中，且針對所需活性篩選產物，該所需活性例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。
本文所描述之抗體可藉由核酸來編碼。核酸為包含兩個或更多個核苷酸鹼基之多核苷酸類型。在某些實施例中，核酸為可用以將編碼多肽之多核苷酸轉移至細胞中的載體之組分。如本文所用，術語「載體」係指能夠轉運其已連接之另一種核酸的核酸分子。一種載體類型為基因體整合載體或「整合載體」，其可整合至宿主細胞之染色體DNA中。另一類型之載體為「游離型」載體，例如能夠進行染色體外複製之核酸。能夠導引其可操作地連接之基因表現的載體在本文中稱為「表現載體」。適合之載體包含質體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、病毒載體及其類似物。在表現載體中，用於控制轉錄之調控元件(諸如啟動子、強化子、聚腺苷酸化信號)可源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。可另外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及促進轉形體之識別之選擇基因。可採用源於病毒(諸如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒及其類似病毒)之載體。質體載體可經線性化以整合至染色體位置中。載體可包含將位點特異性整合導引至基因體中之限定位置或限制性位點集合中的序列(例如AttP-AttB重組)。另外，載體可包含源於轉位元之序列。
如本文所用，術語「同源」、「同源性」或「同源性百分比」當在本文中用於相對於參考序列描述胺基酸序列或核酸序列時，可使用Karlin及Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, 如在Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993中所修改)所描述之式確定。將此類式併入Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)之鹼基局部比對檢索工具(basic local alignment search tool；BLAST)程式中。截至本申請案之申請日，序列同源性百分比可以使用BLAST之最近版本確定。
編碼本文所描述之抗體之核酸可用於感染、轉染、轉形或以其他方式使適合細胞對核酸進行轉殖基因，因此使得能夠產生用於商業或治療用途之抗體。用於藉由大規模細胞培養產生抗體之標準細胞株及方法為此項技術中已知的。參見例如Li等人, 「Cell culture processes for monoclonal antibody production.」 Mabs .2010年9月-10月; 2(5): 466-477。在某些實施例中，細胞為真核細胞。在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。在某些實施例中，哺乳動物細胞為適用於產生抗體之細胞株，其為中國倉鼠卵巢細胞(Chines Hamster Ovary cell；CHO)、NS0鼠骨髓瘤細胞或PER.C6®細胞。在某些實施例中，將編碼抗體之核酸整合至適用於產生抗體之細胞之基因體基因座中。在某些實施例中，本文描述一種製造抗體之方法，其包含在足以允許產生及分泌該抗體之活體外條件下培養包含編碼抗體之核酸之細胞。
本文所用之章節標題僅用於組織目的而不應理解為限制所描述之主題。 EGFR 結合抗體
本文描述與EGFR結合且抑制經由EGFR之信號傳導的抗體。此類抗體可用於治療涉及異常EGFR信號傳導之病症。在一些實施例中，抗體與EGFR域II結合。
在某些實施例中，EGFR抗體及雙特異性抗體包含域II結合部分，其包含本文所描述之抗體2a、2b或2c中之任一者或多者的CDR序列。在某些實施例中，EGFR抗體及雙特異性抗體包含域III結合部分，其包含本文所描述之抗體3a、3b或3c中之任一者或多者的CDR序列。
在某些實施例中，本文描述EGFR域II結合抗體，其包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 23至38中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列；及f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約95%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約95%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約97%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約97%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約98%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約98%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約99%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約99%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域II結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，域II結合抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。在某些實施例中，域II結合抗體或其抗原結合片段為IgG抗體。在某些實施例中，域II結合抗體或其抗原結合片段為Fab、F(ab) 2、單域抗體或單鏈可變片段(scFv)。在某些實施例中，域II結合抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。在某些實施例中，域II結合抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體。
本文描述與EGFR結合且抑制經由EGFR之信號傳導的抗體。此類抗體可用於治療涉及異常EGFR信號傳導之病症。在一些實施例中，抗體與EGFR域III結合。
在某些實施例中，本文描述EGFR域III結合抗體，其包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中所示之胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列；及f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約95%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約95%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約97%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約97%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約98%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約98%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約99%一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約99%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之EGFR域III結合抗體包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列一致之胺基酸序列；且其中免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，域III結合抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。在某些實施例中，域III結合抗體或其抗原結合片段為IgG抗體。在某些實施例中，域III結合抗體或其抗原結合片段為Fab、F(ab) 2、單域抗體或單鏈可變片段(scFv)。在某些實施例中，域III結合抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。在某些實施例中，域III結合抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體。 EGFR 結合雙特異性結合分子
本文提供雙特異性或多價抗體分子，其包含經組態以結合第一目標之第一結合組分及經組態以結合第二目標之第二結合組分，其中第一目標包含EGFR抗原決定基，且其中第二目標包含不同的EGFR抗原決定基。在某些實施例中，雙特異性抗體之一個結合部分結合EGFR的域II，且另一結合部分結合EGFR的域III。在某些實施例中，雙特異性抗體之一個結合部分結合人類EGFR之域II，且另一結合部分結合人類EGFR之域III。雙特異性分子可對EGFR (包括人類EGFR)之「開放組態」具有選擇性，此將其與結合封閉形式之抗體(諸如西妥昔單抗或帕尼單抗)區分開來。此類雙特異性抗體為有利的，因為當EGFR由於高表現水準引起之質量作用效應而打開時，該等抗體可在存在配位體或不存在配位體之情況下抑制EGFR活性。
多特異性或雙特異性抗體具有與至少兩個結構不同之目標特異性結合的能力。特異性結合可由以下引起：分子層面上結構不同之兩個不同結合部分，包括(但不限於)不同的非一致胺基酸序列；或能夠特異性結合兩個結構不同之目標的單個結合部分。稱為「多特異性」或「多價」或「雙特異性」之分子、肽、多肽、抗體或抗體片段可指具有與至少兩個結構不同之目標特異性結合之能力的分子。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一或第二結合組分包含多肽。在某些實施例中，第一或第二結合組分由多肽組成。在一些實施例中，雙特異性抗體之第一及第二結合組分包含多肽。在某些實施例中，第一及第二結合組分由多肽組成。在某些實施例中，第一或第二結合組分之多肽包含長度為至少100個胺基酸殘基之胺基酸序列。在某些實施例中，第一及第二結合組分之多肽包含長度為至少100個胺基酸殘基之胺基酸序列。
雙特異性分子可為雙特異性抗體，其保留能夠與目標特異性結合之抗體的至少一個片段，舉例而言，來自抗體分子之可變區、重鏈或輕鏈、或一或多個互補決定區。在一些實施例中，本文所描述之抗體為雙特異性抗體及/或其雙重抗原結合片段。雙特異性抗體具有與兩種結構不同之目標或抗原結合的能力。在一些實施例中，雙特異性抗體包含經組態以結合第一目標之第一結合組分及經組態以結合第二目標之第二結合組分，其中第一目標包含EGFR域II，且其中第二目標包含EGFR域III。
本文所描述之雙特異性抗體減少或消除經由EGFR之信號傳導。在某些實施例中，雙特異性抗體經由EGFR開放構形抑制信號傳導。在某些實施例中，當以K D量測時，雙特異性抗體之結合親和力為約500奈莫耳或更小、約100奈莫耳或更小、約50奈莫耳或更小、約30奈莫耳或更小、約20奈莫耳或更小、約10奈莫耳或更小。
在某些實施例中，本文描述包含EGFR域II及EGFR域III結合部分之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中EGFR域II結合部分包含：a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中之任一者中所示的胺基酸序列；b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中之任一者中所示的胺基酸序列；c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 23至38中之任一者中所示的胺基酸序列；d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列；且其中EGFR域III抗原結合部分包含：g)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中之任一者中所示的胺基酸序列；h)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中之任一者中所示的胺基酸序列；i)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列；j)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；k)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及l)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列。在某些實施例中，雙特異性抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。在某些實施例中，雙特異性抗體或其抗原結合片段包含IgG恆定區。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約97%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約99%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約97%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約99%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約97%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約99%一致的胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列一致的胺基酸序列。 共同輕鏈雙特異性 IgG
本文揭示具有共同輕鏈雙特異性IgG結構之雙特異性抗體，如 圖 1所示。具有單個一致之共同輕鏈之雙特異性抗體允許輕鏈可變區有效地與任一重鏈可變區域締合，減少使用多個不同輕鏈時出現的無效抗原結合部分形成。此類雙特異性結構藉由減少不需要之產物，對生產期間雙特異性抗體之形成及組裝具有顯著益處。一般而言，共同輕鏈之結構包含第一及第二IgG重鏈。各重鏈包含VH、CH1、CH2及CH3域。共同輕鏈雙特異性IgG結構亦包含輕鏈，其包含VL域及CL域。一般而言，第一重鏈將包含源於具有第一特異性之抗體之重鏈的序列；且第二重鏈將包含來自具有第二特異性之抗體的重鏈。與第一及第二重鏈配對之輕鏈將為一致的，且可源於具有任一特異性或單獨特異性之抗體的輕鏈。共同輕鏈雙特異性IgG結構可包含第一及第二重鏈分子，其進一步包含在CH3域內的促進第一重鏈與第二重鏈偶合及/或防止第一重鏈與另一第一重鏈偶合或第二重鏈與另一第二重鏈偶合之突變。突變可在物理上(例如空間位阻、「杵」「臼」)或生物化學上(例如靜電相互作用)防止兩個第一重鏈分子或兩個第二重鏈分子發生偶合。例示性杵臼突變可包含一條重鏈中之T366W (EU編號)及第二重鏈中之T366S/L368A/Y407V (EU編號)。促進第一重鏈分子與第二重鏈分子偶合之例示性突變揭示於例如WO2009089004、US 8,642,745、US PG-PUB: US20140322756及「The making of bispecific antibodies」 MAbs. 2017年2-3月；9(2): 182-212中。共同輕鏈雙特異性IgG結構亦可包含與其偶合之碳水化合物分子或其額外修飾。
在某些實施例中，雙特異性抗體或其抗原結合片段包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其包含IgG恆定區；共同免疫球蛋白輕鏈與EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈締合；且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈彼此締合。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之IgG恆定區在一或多個胺基酸位置處不同，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含T366W取代(EU編號)且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含T366S/L368A/Y407V取代(EU編號)，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含一或多個選自Q347M、Y348F、T350D、T389W、L368M (EU編號)之取代且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含一或多個選自S354I、E357L、K359S、T366S、L368A及Y412V (EU編號)之取代，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 61至少約90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含與SEQ ID NO: 62至少約90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，使得有利於EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。在某些實施例中，保持此序列一致性，同時保留為促進充分均二聚化而引入之變異胺基酸。 醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及稀釋劑
包含本發明之抗體的組合物包括在包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及稀釋劑的醫藥組合物中。在某些實施例中，將本發明之抗體懸浮於無菌及/或等滲溶液中來投與。在某些實施例中，溶液包含約0.9% NaCl。在某些實施例中，溶液包含約5.0%右旋糖。在某些實施例中，溶液進一步包含以下中之一或多者：緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、丁二酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽及羥基甲胺基甲烷(Tris)；界面活性劑，例如聚山梨醇酯80 (Tween 80)、聚山梨醇酯20 (Tween 20)及泊洛沙姆(poloxamer) 188；多元醇/雙醣/多醣，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖及聚葡萄糖40；胺基酸，例如甘胺酸或精胺酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸、甲硫胺酸；或螯合劑，例如EDTA或EGTA。
用於投與抗體之皮下調配物可包含以下中之一或多者：緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、丁二酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽及羥基甲胺基甲烷(Tris)；界面活性劑，例如聚山梨醇酯80 (Tween 80)、聚山梨醇酯20 (Tween 20)及泊洛沙姆188；多元醇/雙醣/多醣，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖及聚葡萄糖40；胺基酸，例如甘胺酸或精胺酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸、甲硫胺酸；或螯合劑，例如EDTA或EGTA。此外，可包括減輕注射部位疼痛之化合物或分子，諸如玻尿酸酶，例如濃度為約2,000 U/ml至約12,000 U/ml。
在某些實施例中，本發明之抗體或雙特異性抗體凍乾運送/儲存且在投與之前復原。在某些實施例中，凍乾抗體調配物包含增積劑，諸如甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、聚葡萄糖40或其組合。凍乾調配物可含於包含玻璃或其他適合的非反應性材料之小瓶中。抗體在調配時，不論復原與否，均可緩衝在某一pH下，一般在小於約7.5下。在某些實施例中，pH值可在4.5與7.5、4.5與7.0、4.5與6.5、4.5與6.0、或5.5與5.0之間。
本文亦描述套組，其包含在適合容器中之本文所描述之抗體分子中之一或多者及一或多種選自以下之額外組分：使用說明書、稀釋劑、賦形劑、載劑及投與裝置。
在某些實施例中，本文描述一種製備癌症治療之方法，其包含將一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑及本發明之抗體分子混合。在某些實施例中，本文描述一種製備用於儲存或運送之癌症治療之方法，其包含凍乾本發明之一或多種抗體。 生產及製造
編碼本文所描述之抗體或雙特異性抗體之核酸可用於感染、轉染、轉形或以其他方式使適合細胞對該核酸進行轉殖基因，由此能夠生產用於商業或治療用途之抗體或雙特異性抗體。用於藉由大規模細胞培養產生抗體之標準細胞株及方法為此項技術中已知的。參見例如Li等人, 「Cell culture processes for monoclonal antibody production.」 Mabs. 2010年9月-10月; 2(5): 466-477。
在某些實施例中，核酸序列編碼本文揭示之抗體或雙特異性抗體。在某些實施例中，編碼抗體或雙特異性抗體之多核苷酸序列與真核調控序列可操作地偶合。在一些實施例中，細胞包含核酸序列。
在一些實施例中，細胞包含編碼本文揭示之抗體或雙特異性抗體的核酸。在某些實施例中，細胞包含原核細胞。在某些實施例中，原核細胞為大腸桿菌細胞。在某些實施例中，細胞包含真核細胞。在某些實施例中，真核細胞為中國倉鼠卵巢(Chines Hamster Ovary；CHO)細胞、NS0鼠骨髓瘤細胞或人類PER.C6細胞。
在某些實施例中，本文描述一種製造抗體或雙特異性抗體之方法，其包含在足以允許產生及分泌抗體或雙特異性抗體之活體外條件下培養包含編碼抗體或雙特異性抗體之核酸的細胞。
在某些實施例中，本文描述主細胞庫，其包含：(a)哺乳動物細胞株，其包含整合在基因體位置之編碼本文所描述之抗體的核酸；及(b)冷凍保護劑。在某些實施例中，冷凍保護劑包含甘油。在某些實施例中，主細胞庫包含：(a) CHO細胞株，其包含整合在基因體位置之編碼抗體或雙特異性抗體的核酸；及(b)冷凍保護劑。在某些實施例中，冷凍保護劑包含甘油或DMSO或兩者。在某些實施例中，主細胞庫含於能夠耐受液氮冷凍之適合小瓶或容器中。
本文亦描述製造本文所描述之抗體或雙特異性抗體的方法。此類方法包含在細胞培養基中在足以允許抗體或雙特異性抗體表現及分泌之條件下培育包含編碼抗體或雙特異性抗體之核酸的細胞或細胞株，且進一步自細胞培養基中收穫抗體或雙特異性抗體。收穫可進一步包含一或多個純化步驟以移除活細胞、細胞碎片、非抗體蛋白質或多肽、非所需鹽、緩衝劑及培養基組分。在某些實施例中，額外純化步驟包括離心、超速離心、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L純化及/或離子交換層析。 使用方法
在某些實施例中，本文揭示適用於治療癌症或腫瘤之雙特異性抗體。治療係指力圖使所治療之病況好轉或改善所治療之病況之方法。相對於癌症，治療包括(但不限於)減小腫瘤體積、減少腫瘤體積生長、增加無進展存活期或總體預期壽命。在某些實施例中，治療將影響所治療之癌症之緩解。在某些實施例中，治療涵蓋作為意欲預防先前所治療之癌症或腫瘤復發或進展之防治性或維持性劑量的用途。熟習此項技術者應理解，並非所有個體皆會對所投與之治療有同等反應或完全反應，但此等個體仍被視為經治療的。
在某些實施例中，癌症或腫瘤為實體組織癌症或腫瘤。在某些實施例中，癌症或腫瘤為血癌。在某些實施例中，癌症為轉移性的。在某些實施例中，癌症為與異常EGFR表現(諸如過度表現)相關之癌症。在某些實施例中，癌症或腫瘤為大腸直腸癌。在某些實施例中，癌症或腫瘤為轉移性大腸直腸癌。在某些實施例中，癌症或腫瘤為頭頸癌。在某些實施例中，癌症或腫瘤為轉移性頭頸癌。在某些實施例中，癌症或腫瘤包含非小細胞肺癌(NSCLC)。
在某些實施例中，所描述之抗體及雙特異性抗體可藉由任何適合投與含抗體之醫藥組合物的途徑來投與有需要之個體，該途徑諸如皮下、腹膜內、靜脈內、肌內、腫瘤內或腦內等。在某些實施例中，抗體經靜脈內投與的。在某些實施例中，皮下投與抗體。在某些實施例中，瘤內投與抗體。在某些實施例中，以適合之給藥時程投與抗體，例如每週一次、每週兩次、每月一次、每月兩次、每兩週一次、每三週一次或每月一次等。可以任何治療有效量投與抗體。在某些實施例中，治療上可接受之量在約0.1 mg/kg與約50 mg/kg之間。在某些實施例中，治療上可接受之量在約1 mg/kg與約40 mg/kg之間。在某些實施例中，治療上可接受之量在約5 mg/kg與約30 mg/kg之間。治療有效量包括足以改善與待治療之疾病或病痛相關之一或多種症狀之量。 具體實施例1. 在一個實施例中本文描述一種抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列；(b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列；(c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 23至38中之任一者中所示的胺基酸序列；(d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；(e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列；及/或(f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列；其中抗體與EGFR域II結合。 2. 實施例1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。 3. 實施例1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為IgG抗體。 4. 實施例1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為Fab、F(ab) 2、單域抗體或單鏈可變片段(scFv)。 5. 實施例1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。 6. 實施例1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體。 7. 實施例1至6中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中該免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列；且其中該免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。 8. 實施例1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以50奈莫耳或更小之K D與EGFR結合。 9. 實施例1至7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以10奈莫耳或更小之K D與EGFR結合。 10. 一種抗體或抗原結合片段，其包含：(a)重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中所示之胺基酸序列；(b)重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中所示之胺基酸序列；(c)重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列；(d)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列；(e)輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中所示之胺基酸序列；及/或(f)輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列；其中該抗體與EGFR域III結合。 11. 實施例10之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合或人類化的。 12. 實施例10或11之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為IgG抗體。 13. 實施例10或11之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為Fab、F(ab) 2、單域抗體或單鏈可變片段(scFv)。 14. 實施例10至13中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體。 15. 實施例10至14中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為雙特異性抗體。 16. 實施例10至15中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈，其中該免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列；且其中該免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。 17. 實施例10至16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以500奈莫耳或更小之K D與EGFR結合。 18. 實施例10至16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段以300奈莫耳或更小之K D與EGFR結合。 19. 一種抗體或其抗原結合片段，其與實施例1至18中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段結合相同抗原決定基或結合重疊。 20. 一種抗體或其抗原結合片段，其與實施例1至18中任一項之抗體或其抗原結合片段競爭結合。 21. 一種組合物，其包含實施例1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。 22. 一種核酸或複數種核酸，其包含編碼實施例1至20中任一項之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。 23. 一種細胞，其包含實施例22之核酸或複數種核酸。 24. 實施例23之細胞，其中該細胞為真核細胞。 25. 實施例24之細胞，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。 26. 實施例23之細胞，其中該細胞為原核細胞。 27. 一種實施例1至20中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其用於治療個體癌症或腫瘤之方法中。 28. 實施例27之用途，其中該癌症或腫瘤為實體組織癌症或腫瘤。 29. 實施例27之用途，其中該癌症或腫瘤表現EGFR。 30. 實施例27之用途，其中該癌症或腫瘤過度表現EGFR。 31. 實施例27至30中任一項之用途，其中該癌症或腫瘤包含大腸直腸癌。 32. 實施例27至30中任一項之用途，其中該癌症或腫瘤包含頭頸癌。 33. 一種治療罹患癌症或腫瘤之個體的方法，其包含向該罹患癌症或腫瘤之個體投與實施例1至20中任一項之抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段，藉此治療該癌症或腫瘤。 34. 實施例33之方法，其中該癌症或該腫瘤表現EGFR。 35. 實施例33之方法，其中該癌症過度表現EGFR。 36. 實施例33之方法，其中該癌症或該腫瘤為實體組織癌症。 37. 實施例33至36中任一項之方法，其中該癌症或腫瘤包含大腸直腸癌。 38. 實施例33至36中任一項之方法，其中該癌症或腫瘤包含頭頸癌。 實例
以下實例僅出於說明性目的而包括且不意欲限制本發明之範疇。
為促進可作為潛在治療劑有效開發之Ab的產生，使用抗ErbB2治療性Ab曲妥珠單抗(Trastuzumab)構架構築抗原結合片段(Fab)之噬菌體展示庫。該庫之輕鏈序列固定為曲妥珠單抗變異體之輕鏈序列，且三個重鏈互補決定區(CDR)多樣化( 圖 2)。
在針對與EGFR胞外域(ECD)之結合進行多輪選擇之後，分離出許多能夠與EGFR結合之抗體作為含有LC變異體之噬菌體Fab，且用野生型曲妥珠單抗κ輕鏈產生IgG。
為進行表徵，重點針對兩種不同的抗EGFR抗體-命名為ER-2及ER-3，其在EGF存在下分別與EGFR結合或不結合。用純化之IgG蛋白進行表面電漿子共振(SPR)分析顯示ER-2及ER-3以中等親和力( K D 分別等於20或14 nM)與EGFR結合( 圖 2)。為提高Fab ER-2及ER-3之親和力，以受控及有限之方式使各重鏈之序列多樣化，將聚焦之噬菌體展示庫多樣化。在針對與EGFR之結合進行選擇及ELISA篩選後，將一系列變異體多樣化，包括分別命名為ER-2a及ER3a之ER-2及ER-3之先導最佳化變異體。SPR分析顯示IgG ER-2a及ER3a與EGFR結合，親和力在次奈莫耳範圍內( K D 分別等於0.28或0.33 nM) ( 圖 2)。藉由ELISA來評估Fab ER-2a及ER-3a之特異性( 圖 3A)。兩種Fab在人類ErbB家族中皆展現出高選擇性，因為偵測到對EGFR之強結合，但未偵測到對ErbB2、ErbB3或ErbB4之結合。此外，兩種Fab皆展現出與小鼠及恆河猴及食蟹獼猴EGFR之強結合，且Fab ER-2a及ER-3a分別與犬類EGFR強結合或弱結合。相比之下，西妥昔單抗(CTX)及帕尼單抗(PTMB)與人類及非人類靈長類動物EGFR結合，但不與小鼠或犬類EGFR結合。
ELISA亦用於確定飽和濃度之EGF或多種抗EGFR IgG是否可阻斷各Fab與固定化EGFR之結合( 圖 3B)。此等分析確認Fab ER-3a被其自身的IgG、EGF、CTX及PTMB阻斷，而相比之下，Fab ER-2a被其自身的IgG阻斷，但不被任何其他配位體阻斷。類似地，生物層干涉術(BLI)分析顯示，經Fc標記之EGF (EGF-Fc)與固定化EGFR的結合因EGF-Fc自身而減少，且被CTX、PTMB及IgG ER-3a消除，但未被IgG ER-2a消除( 圖 3B)。
為繪製抗原決定基，使用流動式細胞測量術來評估IgG與經轉染以表現全長EGFR或包含雙域(D1-D2、D2-D3、D3-D4)或三域(D1-D2-D3、D2-D3-D4)之EGFR片段的HEK293T細胞之結合，且繪製飽和IgG濃度處之結合信號( 圖 3C)。與以域III為中心之互補位一致，CTX及PTMB與展示含有域III (D3-D4及D2-D3-D4)之EGFR片段的細胞結合，且IgG ER-3a展現出相同的結合模式。相比之下，IgG ER-2a與展示D1-D2片段之細胞結合最強，亦與展示其他含有域II (D2-D3、D1-D2-D3、D2-D3-D4)之片段之細胞結合，但未與展示缺乏域II (D3-D4)之片段的細胞結合。此外，CTX、PTMB及IgG ER-3a與展示EGFRvIII (缺乏所有域I及大部分域II)之細胞及展示EGFR-D28 (跨越二聚化臂，缺乏28個殘基(Cys240-Cys267))之細胞強結合，但IgG ER-2a未如此。綜合而言，此等結果表明，Ab ER-3a識別EFGR域III中之抗原決定基，類似於CTX及PTMB之抗原決定基，而Ab ER-2a識別域II內以二聚化臂為中心之不同抗原決定基。
最後，探究Ab對MDA-MB-468乳癌細胞中EGF活化EGFR之影響，該等細胞展示出高水準之內源性EGFR。參見Filmus J, Pollak MN, Cailleau R及Buick RN (1985) MDA-468, a human breast cancer cell line with a high number of epidermal growth factor (EGF) receptors, has an amplified EGF receptor gene and is growth inhibited by EGF. Biochem Biophys Res Commun128(2):898-905。西方墨點法(Western blotting)揭示兩種Fab皆以劑量依賴性方式降低磷酸化EGFR之水準，且Fab ER-2a在此分析中特別有效( 圖 3D)。
為改良IgG ER-2a及ER-3a之生物物理特性，以受控及有限之方式使各重鏈之序列多樣化來構築聚焦之噬菌體展示庫，且在針對與EGFR之結合進行選擇及ELISA篩選之後，鑑別一系列變異體，包括ER-2a及ER-3a之最佳化變異體，分別命名為ER-2b及ER-3b ( 圖 2)。最後，篩選具有Asp突變之CDR H3位置，以測定何種胺基酸將容納帶負電荷之側鏈，同時仍保持與EGFR之結合。此類Asp插入可能藉由減少聚集來提高所得純系之可開發性。
製備併入ER-3a及ER2a純系之結合域之雙特異性抗體。如 圖 4A所示，雙特異性抗體ER-3a/ER-2a及EGFR活性狀態結合抗體ER-2a抑制HNSCC細胞株FaDu及CRC細胞株HCT-8及NSCLC細胞株H1975中之細胞生長。FaDu及HCT-8表現野生型EGFR，且H1975表現具有兩個激酶域突變L858R及T790M之EGFR。將EGFR之配位體EGF添加至此等細胞中以進一步刺激EGFR活性且模擬使EGF表現之環境。如所預期，如匯合百分比降低所示，僅識別EGFR活性狀態之兩種抗體ER-3a/ER-2a抑制所有三種細胞株之增殖。
如 圖 4B所示，併入3a及2a兩者結合域之雙特異性抗體能夠在配位體存在及不存在的情況下抑制細胞生長。
儘管本文已展示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將明白，此類實施例僅藉助於實例提供。在不脫離本發明之情況下，熟習此項技術者現將想到大量變化形式、變化及取代。應理解，本文所述之本發明實施例的各種替代方案可用於實施本發明。預期以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此覆蓋在此等申請專利範圍及其等效方案之範疇內之方法及結構。 序列
Seq ID NO 序列 註解
1 MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA 人類EGFR
2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDV N TAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 共同輕鏈[N]
3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDV S TAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 共同輕鏈[S]
4 DVSTA CDR-L1
5 DVNTA CDR-L1
6 SASFLYS CDR-L2
7 HYTTPP CDR-L3
8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLYYSSMHWVRQAPGKGLEWVASISPYYGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYHFSWHWSSFGGSYYPGMDYWGQGTLVTVSS ER2-VH [N28]
9 LYYSM ER2-H1
10 SISPYYGYTS ER2-H2
11 YYHFSWHWSSFGGSYYPGM ER2-H3
12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDVYYAAMHWVRQAPGKGLEWVASISPYYGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYHFSWHWSSFGGSYYPGMDYWGQGTLVTVSS ER2a-VH [D28]
13 VYYAAM ER2a-H1
14 SISPYYGYTS ER2a-H2
15 YYHFSWHWSSFGGSYYPGM ER2a-H3
16 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFN IYYAAMHWVRQAPGKGLEWVA FISPYYSYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR YFHSSWYESSSPRAYYPGMDYWGQGTLVTVSS ER2b-VH [N28]
17 IYYAAM ER2b-H1
18 FISPYYSYTS ER2b-H2
19 YFHSSWYESSSPRAYYPGM ER2b-H3
20 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFN IYYAAMHWVRQAPGKGLEWVA FISPYYSYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR YYHISWPWSSYGGTYYPGMDYWGQGTLVTVSS ER2c-VH [N28]
21 IYYAAM ER2c-H1
22 FISPYYSYTS ER2c-H2
23 YYHISWPWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
24 DYHISWPWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
25 YDHISWPWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
26 YYDISWPWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
27 YYHDSWPWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
28 YYHIDWPWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
29 YYHISDPWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
30 YYHISWDWSSYGGTYYPGM ER2c-H3
31 YYHISWPDSSYGGTYYPGM ER2c-H3
32 YYHISWPWDSYGGTYYPGM ER2c-H3
33 YYHISWPWSDYGGTYYPGM ER2c-H3
34 YYHISWPWSSDGGTYYPGM ER2c-H3
35 YYHISWPWSSYDGTYYPGM ER2c-H3
36 YYHISWPWSSYGDTYYPGM ER2c-H3
37 YFHSSWYESSSPRDYYPGM ER2c-H3
38 YFHSSWYESSSPRAYDPGM ER2c-H3
39 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFN LYSYSMHWVRQAPGKGLEWVA YISPSSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARHWYYYPSYYWGGFDYWGQGTLVTVSS ER3-VH
40 LYSYSM ER3-H1
41 YISPSSGSTY ER3-H2
42 HWYYYPSYYWGGF ER3-H3
43 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFD LYSYSMHWVRQAPGKGLEWVA SVSPSSGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARHW HVYPSYYWGGFDYWGQGTLVTVSS ER3a-VH
44 LYSYSM ER3a-H1
45 SVSPSSGSTY ER3a-H2
46 HVYPSYYWGGF ER3a-H3
47 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFD IYSFSIHWVRQAPGKGLEWVASISPSAGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR HWHVYPSYYWGGMDYWGQGTLVTVSS ER3b-VH
48 IYSFSI ER3b-H1
49 SISPSAGSTY ER3b-H2
50 HWHVYPSYYWGGM ER3b-H3
51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFD IYSFSIHWVRQAPGKGLEWVASISPSAGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR HWHVYPSYYWGGMDYWGQGTLVTVSS ER3c-VH
52 IYSFSI ER3c-H1
53 SISPSAGSTY ER3c-H2
54 HDHVYPSYYWGGM ER3c-H3
55 HWHDYPSYYWGGM ER3c-H3
56 HWHVDPSYYWGGM ER3c-H3
57 HWHVYPSDYWGGM ER3c-H3
58 HWHVYPSYYWDGM ER3c-H3
59 HWHVYPSYYWGDM ER3c-H3
60 HWHVYPSYYWGGD ER3c-H3
61 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPMVFDLPPSREEMTKNQVSLWCMVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK HC (杵)
62 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPIRELMTSNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK HC (臼)
本發明之新穎特徵在隨附申請專利範圍中具體闡述。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其附圖的以下詳細描述來獲得對本發明之特性及優勢的更佳理解：
圖 1顯示共同輕鏈雙特異性抗體之某個非限制性實施例(未按比例)。
圖 2說明靶向EGFR之抗體的重鏈CDR序列及動力學親和力。
圖 3A說明純系2a、3a、西妥昔單抗(CTX)及帕尼單抗(PTMB)對不同EGFR家族及來自不同物種之EGFR的特異性。
圖 3B說明使用純系2a、3a、西妥昔單抗(CTX)及帕尼單抗(PTMB)之競爭分析。
圖 3C說明純系2a、3a、西妥昔單抗(CTX)及帕尼單抗(PTMB)之EGFR域結合。
圖 3D說明對純系2a及3a之EGFR信號傳導的抑制。
圖 4A說明與對照或西妥昔單抗(CTX)或帕尼單抗(PTMB)相比，使用單獨或組合成雙特異性形式之2a及3a抗體對細胞株回應於EGF之生長的抑制。
圖 4B說明使用具有2a及3a之結合特異性的雙特異性抗體抑制生長。不存在(黑色條)或存在EGF (白色條)。

Claims (40)

  1. 一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，其結合EGFR域II及EGFR域III。
  2. 如請求項1之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含EGFR域II結合部分，其中該EGFR域II結合部分包含： a) 重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中之任一者中所示的胺基酸序列； b) 重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中之任一者中所示的胺基酸序列； c) 重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 19或23至38中之任一者中所示的胺基酸序列； d) 輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列； e) 輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或 f) 輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含EGFR域III結合部分，其中該EGFR域III抗原結合部分包含： a) 重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中之任一者中所示的胺基酸序列； b) 重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中之任一者中所示的胺基酸序列； c) 重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列； d) 輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列； e) 輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或 f) 輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含EGFR域II結合部分及EGFR域III結合部分，其中該EGFR域II結合部分包含： a) 重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 17中之任一者中所示的胺基酸序列； b) 重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 18中之任一者中所示的胺基酸序列； c) 重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 19或23至38中之任一者中所示的胺基酸序列； d) 輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列； e) 輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或 f) 輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列； 且其中該EGFR域III抗原結合部分包含： g) 重鏈互補決定區1 (HCDR1)，其包含SEQ ID NO: 52中之任一者中所示的胺基酸序列； h) 重鏈互補決定區2 (HCDR2)，其包含SEQ ID NO: 53中之任一者中所示的胺基酸序列； i) 重鏈互補決定區3 (HCDR3)，其包含SEQ ID NO: 54至60中之任一者中所示的胺基酸序列； j) 輕鏈互補決定區1 (LCDR1)，其包含SEQ ID NO: 4或5中之任一者中所示的胺基酸序列； k) 輕鏈互補決定區2 (LCDR2)，其包含SEQ ID NO: 6中之任一者中所示的胺基酸序列；及/或 l) 輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，其包含SEQ ID NO: 7中之任一者中所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段係嵌合的或人類化的。
  6. 如請求項1至5中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段包含IgG恆定區。
  7. 如請求項1至6中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域II結合部分及該EGFR域III結合部分包含共同免疫球蛋白輕鏈，其中該共同免疫球蛋白輕鏈包含與SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域II結合部分包含EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈，其中該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 16或20中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域III結合部分包含EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈，其中該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含與SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列至少約90%、95%、97%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈包含IgG恆定區；該共同免疫球蛋白輕鏈與該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈締合；且該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈彼此締合。
  11. 如請求項10之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之該IgG恆定區在一或多個胺基酸位置上不同，使得有利於該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化，抑制該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈之均二聚化，或抑制該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之均二聚化。
  12. 如請求項11之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之一者包含T366W取代(EU編號)且該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含T366S/L368A/Y407V取代(EU編號)，使得有利於該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化，抑制該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈之均二聚化，或抑制該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之均二聚化。
  13. 如請求項11之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之一者包含一或多個選自Q347M、Y348F、T350D、T389W、L368M (EU編號)之取代且該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含一或多個選自S354I、E357L、K359S、T366S、L368A及Y412V (EU編號)之取代，使得有利於該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化，抑制該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈之均二聚化，或抑制該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之均二聚化。
  14. 如請求項11之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈及該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之一者包含與SEQ ID NO: 61至少約90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，且該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈或該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈中之另一者包含與SEQ ID NO: 62至少約90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列，使得有利於該EGFR域II結合免疫球蛋白重鏈與該EGFR域III結合免疫球蛋白重鏈之異二聚化。
  15. 如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性抗體或抗原結合片段以100奈莫耳或更小之K D與EGFR結合。
  16. 如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性抗體或抗原結合片段以50奈莫耳或更小之K D與EGFR結合。
  17. 如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性抗體或抗原結合片段以10奈莫耳或更小之K D與EGFR結合。
  18. 如請求項1至14中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該雙特異性抗體或抗原結合片段與EGFR之開放構形結合。
  19. 一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至18中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段結合相同抗原決定基或結合重疊。
  20. 一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至18中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段競爭結合。
  21. 一種組合物，其包含如請求項1至20中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。
  22. 一種核酸或複數種核酸，其包含編碼如請求項1至20中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。
  23. 一種細胞，其包含如請求項22之核酸或複數種核酸。
  24. 如請求項23之細胞，其中該細胞為真核細胞。
  25. 如請求項24之細胞，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
  26. 如請求項23之細胞，其中該細胞為原核細胞。
  27. 一種如請求項1至20中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段的用途，其用於治療個體癌症或腫瘤之方法中。
  28. 如請求項27之用途，其中該癌症或腫瘤為實體組織癌症或腫瘤。
  29. 如請求項27之用途，其中該癌症或腫瘤表現EGFR。
  30. 如請求項27之用途，其中該癌症或腫瘤過度表現EGFR。
  31. 如請求項27至30中任一項之用途，其中該癌症或腫瘤包含大腸直腸癌。
  32. 如請求項27至30中任一項之用途，其中該癌症或腫瘤包含頭頸癌。
  33. 如請求項27至30中任一項之用途，其中該癌症或腫瘤包含非小細胞肺癌。
  34. 一種治療罹患癌症或腫瘤之個體的方法，其包含向罹患該癌症或該腫瘤之該個體投與如請求項1至20中任一項之雙特異性抗體或其抗原結合片段，藉此治療該癌症或該腫瘤。
  35. 如請求項34之方法，其中該癌症或該腫瘤表現EGFR。
  36. 如請求項34之方法，其中該癌症過度表現EGFR。
  37. 如請求項34之方法，其中該癌症或該腫瘤為實體組織癌症。
  38. 如請求項34至37中任一項之方法，其中該癌症或腫瘤包含大腸直腸癌。
  39. 如請求項34至37中任一項之方法，其中該癌症或腫瘤包含頭頸癌。
  40. 如請求項34至37中任一項之方法，其中該癌症或腫瘤包含非小細胞肺癌。
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