RS59340B1 - Varijante fc regiona sa modifikovanim vezivanjem za fcrn i metode upotrebe - Google Patents

Varijante fc regiona sa modifikovanim vezivanjem za fcrn i metode upotrebe

Info

Publication number
RS59340B1
RS59340B1 RSP20191266A RS59340B1 RS 59340 B1 RS59340 B1 RS 59340B1 RS P20191266 A RSP20191266 A RS P20191266A RS 59340 B1 RS59340 B1 RS 59340B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
region
polypeptide
mutations
human
antibody
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Ekkehard Moessner
Tilman Schlothauer
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS59340B1 publication Critical patent/RS59340B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/528—CH4 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Or Coding Systems Of Tv Signals (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na antitela i fuzione polipeptide Fc regiona koji su asimetrično modifikovani u odnosu na svoj Fc receptor, posebno na svoj FcRn, interakciju i metode za njihovu upotrebu.
OSNOVA
Neonatalni Fc receptor (FcRn) je važan za metaboličku sudbinu antitela klase IgG in vivo. FcRn funkcioniše tako što spašava IgG iz lizozomskog puta degradacije, što dovodi do smanjenog klirensa i povećanog poluživota. To je heterodimerni protein koji se sastoji od dva polipeptida: proteina od 50 kDa klase I nalik na glavni kompleks histokompatibilnosti (α-FcRn) i β2 mikroglobulina od 15 kDa (β2m). FcRn se vezuje sa visokim afinitetom za CH2-CH3 deo Fc regiona antitela klase IgG. Interakcija između antitela klase IgG i FcRn je zavisna od pH, i dešava se u stehiometrijskom odnosu 1:2, tj. jedan molekul IgG antitela može da stupi u interakciju sa dva molekula FcRn preko svoja dva polipeptida teškog lanca Fc regiona (vidi npr. Huber, A.H. i sar. J. Mol. Biol.230 (1993) 1077-1083).
Dakle, svojstva/karakteristike in vitro vezivanja IgG za FcRn ukazuju na njegove in vivo farmakokinetičke osobine u krvotoku.
U interakciji između FcRn i Fc regiona antitela IgG klase učestvuju različiti aminokiselinski ostaci CH2 i CH3 domena teškog lanca.
Poznate su različite mutacije koje utiču na vezivanje za FcRn i time na poluživot u krvotoku. Ostaci Fc regiona kritični za interakciju Fc regiona miša i FcRn regiona miša identifikovani su mutagenezom usmerenom na mesto (vidi npr. Dall’Acqua, W.F. i sar. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Ostaci I253, H310, H433, N434 i H435 (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa) uključeni su u interakciju (Medesan, C. i sar. Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M. i sar. Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K. i sar. Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). Otkriveno je da su ostaci I253, H310 i H435 kritični za interakciju humanog Fc regiona sa mišjim FcRn (Kim, J.K. i sar. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2885).
Postupci za povećanje vezivanja Fc regiona (a tako i IgG) za FcRn izvedeni su mutiranjem različitih aminokiselinskih ostataka u Fc-regionu: Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433 i Asn 434 (vidi Kuo, T.T. i sar. J. Clin. Immunol.
30 (2010) 777-789; Ropeenian, D.C. i sar. Nat. Rev. Immunol.7 (2007) 715-725).
Kombinaciju mutacija M252Y, S254T, T256E opisali su Dall'Acqua i sar. za poboljšanje vezivanja za FcRn pomoću studija interakcije između proteina (Dall’Acqua, W.F. i sar. J. Biol. Chem.281 (2006) 23514-23524). Studije kompleksa humani Fc region-humani FcRn pokazale su da su ostaci I253, S254, H435 i Y436 presudni za interakciju (Firan, M. i sar. Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L. i sar. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y.A. i sar. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) su objavili i ispitali različite mutante ostataka 248 do 259 i 301 do 317 i 376 do 382 i 424 do 437.
Yeung, Y.A. i sar. (Cancer Res. 70 (2010) 3269-3277) opisali su terapeutsko anti-VEGF antitelo sa povećanom potencijom nezavisnom od farmakokinetičkog poluživota sa mutacijama odabranim iz grupe N434A, T307Q/N434A, T307Q/N434S, V308P/N434A i T307Q/E380A/N434A (humani IgG1). Farmakokinetiku posredovanu FcRn receptorom terapeutskog IgG u oku opisali su Kim, H. i sar. (Mol. Vis. 15 (2009) 2803-2812). WO 2014/006217 opisuje dimerne proteine koji sadrže aminokiseline na tri različita položaja koji su različiti od onih prisutnih u humanom IgG1, od kojih je šest sposobno da formira heksamernu strukturu u rastvoru. Proteini koji sadrže Fc koji imaju region za vezivanje i varijantu Fc regiona koja može da izazove jednu ili više imunoloških efektorskih funkcija i/ili da se veže za Fc receptor efikasnije od sličnog proteina koji sadrži Fc koji ima Fc region divljeg tipa opisani su u WO 2012/125850. WO 210/151792 opisuje oblik bispecifičnog antitela koji obezbeđuje lakoću izolacije, sadrži varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina koji su različito modifikovani u CH3 domenu, pri čemu su diferencijalne modifikacije neimunogene ili su u suštini neimunogene u odnosu na CH3 modifikacije, i barem jedna od modifikacija dovodi do različitog afiniteta prema bispecifičnom antitelu za afinitetni reagens kao što je protein A, a bispecifično antitelo se može izolovati iz oštećene ćelije, iz medijuma, ili iz mešavine antitela zasnovane na afinitetu prema proteinu A. Imunoglobulinske kompozicije koje istovremeno učestvuju u vezivanju antigena, pri čemu je jedan od antigena vezan dvovalentno, a drugi antigen je vezan jednovalentno, opisane su u WO 2011/028952.
REZIME
Pronalazak je definisan u zahtevima.
Otkriveno je da se vezivanje za FcRn antitela ili fuzionog polipeptida Fc regiona može modifikovati promenom aminokiselinskih ostataka na neodgovarajućim položajima u pojedinačnim polipeptidima Fc regiona, jer ove izmene deluju zajedno u modifikaciji vezivanja za FcRn. Antitela i fuzioni polipeptidi Fc regiona, kako su ovde navedeni, korisni su, npr. za lečenje bolesti kod kojih je potrebno prilagođeno sistemsko retenciono vreme.
Ovde su prikazane varijante Fc regiona koje imaju modifikovana svojstva vezivanja za FcRn u poređenju sa odgovarajućim Fc regionom divljeg tipa. Ove varijante Fc regiona sadrže specifične aminokiselinske mutacije u CH2 i/ili CH3 domenu. Utvrđeno je da ove mutacije, kada se koriste bilo same ili u kombinaciji u istom, ili raspoređene u oba teška lanca Fc regiona, omogućavaju da se kreira prilagođeni in vivo poluživot varijante Fc regiona.
Ovde je objavljena varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG koja sadrži prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona,
pri čemu
a) prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona su izvedeni iz istog matičnog (humanog) polipeptida Fc regiona klase IgG, i
b) prvi polipeptid Fc regiona ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence drugog polipeptida Fc regiona najmanje na jednom odgovarajućem položaju prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa,
pri čemu varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG ima različit afinitet prema humanom Fc receptoru u odnosu na (humani) Fc region klase IgG koji ima iste aminokiselinske ostatke (kao (matični) humani polipeptid Fc regiona a)) na odgovarajućim položajima prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa u prvom polipeptidu Fc regiona i drugom polipeptidu Fc regiona.
Ovde je objavljena varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG koja sadrži prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona,
pri čemu
a) prvi polipeptid Fc regiona ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence drugog polipeptida Fc regiona najmanje na jednom odgovarajućem položaju prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa,
pri čemu varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG ima različit afinitet prema humanom Fc receptoru u odnosu na Fc region klase IgG koji ima isti aminokiselinski ostatak (kao u odgovarajućem humanom Fc regionu) u prvom i drugom polipeptidu Fc regiona na odgovarajućem položaju.
Ovde je objavljena varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG koja sadrži prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona,
pri čemu
a) aminokiselinska sekvenca prvog polipeptida Fc regiona se razlikuje od aminokiselinske sekvence polipeptida prvog matičnog Fc regiona klase IgG u jednom ili više aminokiselinskih ostataka,
aminokiselinska sekvenca drugog polipeptida Fc regiona razlikuje se od aminokiselinske sekvence drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG u jednom ili više aminokiselinskih ostataka, i
b) prvi polipeptid Fc regiona ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence drugog polipeptida Fc regiona najmanje na jednom odgovarajućem položaju prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa,
pri čemu varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG ima različit afinitet prema humanom Fc receptoru u odnosu na matični Fc region klase IgG koji sadrži prvi i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a).
Ovde je objavljena varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG koja sadrži prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona,
pri čemu
a) aminokiselinska sekvenca prvog polipeptida Fc regiona je izvedena iz prvog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, a aminokiselinska sekvenca drugog polipeptida Fc regiona je izvedena iz drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, i
b) u prvi polipeptid Fc regiona i/ili u drugi polipeptid Fc regiona uvodi se jedna ili više mutacija, tako da prvi polipeptid Fc regiona ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od aminokiselinske sekvence drugog polipeptida Fc regiona najmanje na jednom odgovarajućem položaju prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa,
pri čemu varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG ima različit afinitet prema humanom Fc receptoru u poređenju sa Fc regionom klase IgG koji sadrži prvi i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a).
Jedan aspekt pronalaska je Fc region klase IgG koji sadrži polipeptid prve varijante Fc regiona i polipeptid druge varijante Fc regiona,
pri čemu
a) polipeptid prve varijante Fc regiona je izveden iz prvog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG i polipeptid druge varijante Fc regiona je izveden iz drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, pri čemu je prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG identičan ili različit od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, i
b) polipeptid prve varijante Fc regiona se razlikuje od polipeptida druge varijante Fc regiona u jednom ili više aminokiselinskih ostataka, osim onih aminokiselinskih ostataka u kojima se prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG razlikuje od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, i
c) Fc region klase IgG koji sadrži polipeptid prve varijante Fc regiona i polipeptid druge varijante Fc regiona ima afinitet prema humanom Fc receptoru koji se razlikuje od Fc regiona klase IgG koji sadrži prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a) i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a),
pri čemu ili prvi polipeptid Fc regiona ili drugi polipeptid Fc regiona ili oba polipeptida Fc regiona sadrže nezavisno jedan od drugog sledeću kombinaciju mutacija: - T307H i N434H.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, Fc region klase IgG je varijanta heterodimernog (humanog) Fc regiona klase IgG.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG su polipeptidi nehumanog Fc regiona klase IgG.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG su isti polipeptid Fc regiona klase IgG.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, sparivanje prvog polipeptida Fc regiona i drugog polipeptida Fc regiona da bi se formirao dimerni (funkcionalni) Fc region dovelo je do formiranja heterodimera.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, prvi i drugi polipeptid Fc regiona se razlikuju nezavisno jedan od drugog u najmanje jednom aminokiselinskom ostatku od odgovarajućeg polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, IgG klasa je izabrana od potklasa IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, humani Fc receptor se bira između humanog neonatalnog Fc receptora i humanog Fcγ receptora.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, prvi polipeptid Fc regiona se razlikuje u 1 ili 2 ili 3 ili 4 ili 5 ili 6 ili 7 ili 8 ili 9 ili 10 ili 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka na odgovarajućem položaju prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa od drugog polipeptida Fc regiona.
U jednom otelotvorenju svih aspekata koji su ovde navedeni, prvi polipeptid Fc regiona ili drugi polipeptid Fc regiona ili oba polipeptida Fc regiona sadrže jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom otelotvorenju svih aspekata koji su ovde navedeni
prvi polipeptid Fc regiona obuhvata nezavisno od drugog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H i M252Y i S254T i T256E,
i
drugi polipeptid Fc regiona obuhvata nezavisno od prvog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih mutacija ili kombinaciju mutacija
- T307H, ili
- T307Q, ili
- Q311H, ili
- E430 H, ili
- N434H, ili
- T307H i Q311H, ili
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H, ili
- T307H i M252Y i S254T i T256E, ili
- Q311H i M252Y i S254T i T256E, ili
- E430 H i M252Y i S254T i T256E, ili
- N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom otelotvorenju svih aspekata koji su ovde navedeni
prvi polipeptid Fc regiona obuhvata nezavisno od drugog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H i M252Y i S254T i T256E,
i
drugi polipeptid Fc regiona obuhvata nezavisno od prvog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih mutacija ili kombinaciju mutacija
- T307H, ili
- T307Q, ili
- E430 H, ili
- T307H i Q311H, ili
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H, ili
- T307H i M252Y i S254T i T256E, ili
- Q311H i M252Y i S254T i T256E, ili
- E430 H i M252Y i S254T i T256E, ili
- N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom otelotvorenju svih aspekata koji su ovde navedeni, prvi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- nijednu, ili
- M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A,
i
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H,
i drugi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih mutacija ili kombinacija mutacija:
- nijednu, ako prvi polipeptid Fc regiona sadrži najmanje jednu mutaciju, ili
- T307H, ili
- T307Q, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo mutaciju T307Q, ili - Q311H, ili
- E430 H, ili
- N434H, ili
- T307H i Q311H, ili
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307Q i N434A, ili
- M252Y i S254T i T256E, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija H310A i H433A i Y436A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H.
U jednom otelotvorenju svih aspekata koji su ovde navedeni, prvi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- nijednu, ili
- M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A,
i
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H,
i drugi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih mutacija ili kombinacija mutacija:
- nijednu, ako prvi polipeptid Fc regiona sadrži najmanje jednu mutaciju, ili
- T307H, ili
- T307Q, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo mutaciju T307Q, ili - E430 H, ili
- T307H i Q311H, ili
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307Q i N434A, ili
- M252Y i S254T i T256E, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo
1
kombinaciju mutacija H310A i H433A i Y436A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije I253A i H310A i H435A, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutacije Y349C, T366S, L368A i Y407V ("polipeptid rupice Fc-regiona"), i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutacije S354C i T366W ("polipeptid dugmeta Fc-regiona").
U jednom otelotvorenju svih aspekata, varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG sadrži prvi i drugi polipeptid humanog Fc regiona potklase IgG1, pri čemu
a) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije L234A i L235A (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa), ili
b) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutaciju P329G (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa), ili
c) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije L234A i L235A i P329G (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa), ili
d) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije L234A i L235A (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa) i prvi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutaciju T366W, i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutacije T366S, L368A i Y407V, ili
e) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije L234A i L235A i P329G (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa) i prvi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutaciju T366W, i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutacije T366S, L368A i Y407V.
U jednom otelotvorenju, varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG sadrži prvi i drugi polipeptid humanog Fc regiona potklase IgG4, pri čemu
a) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije S228P i L235E (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa), ili
b) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutaciju P329G (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa), ili
c) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije S228P i L235E i P329G (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa), ili
d) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije S228P i L235E (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa) i prvi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutaciju T366W, i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutacije T366S, F368A i Y407V,
e) i prvi i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije S228P i L235E i P329G (numeracija prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa) i prvi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutaciju T366W, i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutacije T366S, L368A i Y407V.
Jedan aspekt koji je ovde opisan je antitelo ili fuzioni polipeptid Fc regiona koji sadrži varijantu (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde objavljeno.
U jednom otelotvorenju, antitelo je monoklonsko antitelo.
U jednom otelotvorenju, antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo.
Ovde je objavljena nukleinska kiselina koja kodira varijantu (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde objavljeno.
Ovde je objavljena nukleinska kiselina koja kodira antitelo kao što je ovde objavljeno. Ovde je objavljena nukleinska kiselina koja kodira fuzioni polipeptid Fc regiona kao što je ovde objavljeno.
Ovde je objavljena ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu kao što je ovde objavljeno.
Ovde je objavljeni postupak za proizvodnju varijante (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde objavljeno, uključujući uzgajanje ćelije domaćina kao što je ovde objavljeno, tako da se proizvede varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG.
Ovde je objavljeni postupak za proizvodnju antitela kao što je ovde objavljeno, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina kao što je ovde objavljeno, tako da se proizvodi antitelo.
Ovde je objavljeni postupak za proizvodnju fuzionog polipeptida Fc regiona kao što je ovde objavljeno, koji uključuje uzgajanje ćelije domaćina kao što je ovde objavljeno, tako da se proizvodi fuzioni polipeptid Fc regiona.
Jedan aspekt kao što je ovde objavljen je farmaceutska formulacija koja sadrži varijantu (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde objavljeno ili antitelo kao što je ovde objavljeno ili fuzioni polipeptid Fc regiona kao što je ovde objavljeno.
Jedan aspekt kao što je ovde objavljeno je varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde objavljeno ili antitelo kao što je ovde objavljeno ili fuzioni polipeptid Fc regiona kao što je ovde objavljeno za upotrebu kao lek.
Jedan aspekt kao što je ovde objavljeno je upotreba varijante (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde objavljeno ili antitela kao što je ovde objavljeno ili fuzionog polipeptida Fc regiona kao što je ovde objavljeno u proizvodnji leka.
Antitela kao što je ovde objavljeno mogu se koristiti npr. kao regruteri T-ćelija, kao vezivač Fc gama receptora sa visokom biološkom aktivnošću (potentnošću) i brzim klirensom iz krvotoka (krvni serum), kao konjugati antitelo-lek sa brzim klirensom radi smanjenja sistemskih neželjenih efekata, ili kao pred-ciljna antitela.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 Ilustrativni šematski dijagram eluiranja FcRn afinitetnom hromatografijom antitela koje sadrži različite Fc regione (varijante): 1: Mutacija I253A/H310A/H435A; 2: Fc region divljeg tipa; 3: M252Y/S254T/T256E u polipeptidu jednog Fc regiona, drugi Fc region divljeg tipa; 4: M252Y/S254T/T256E u oba polipeptida Fc regiona; 5: lanac sa dugmetom: M252Y/S254T/T256E, lanac sa rupicom: T307Q/N434A.
Slika 2 Dijagram eluiranja FcRn afinitetnom hromatografijom antitela koja sadrže
1
različite Fc regione (varijante): 1: Fc region divljeg tipa; 2: glikokonstruisani Fc region; 3: T307Q/N434A; 4: T307H/N434H; 5: T307H/N434H/ M252Y/S254T/T256E; 6: N434H; 7: M252Y/S254T/T256E.
Slika 3 Dijagram eluiranja FcRn afinitetnom hromatografijom antitela koja sadrže različite Fc regione (varijante): 1: Fc region lanca sa rupicom-lanca sa dugmetom; 2: lanac sa rupicom: T307Q/N434A, lanac sa dugmetom: M252Y/S254T/T256E; 3: lanac sa rupicom: T307H/N434H, lanac sa dugmetom: M252Y/S254T/T256E; 4: lanac sa rupicom: T250Q/M428L, lanac sa dugmetom: M252Y/S254T/T256E; 5: lanac sa rupicom: T307Q, N434H, lanac sa dugmetom: M252Y/S254T/T256E/T307Q/N434H; 6: lanac sa rupicom: T307H/Q311H/E430H/N434H, lanac sa dugmetom: M252Y/S254T/T256E; 7: lanac sa rupicom: T307H/Q311H/E430H/N434H, lanac sa dugmetom: M252Y/S254T/T256E/T307H/Q311H/E430H/N434H; 8: lanac sa rupicom/dugmetom: M252Y/S254T/T256E.
DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
I. DEFINICIJE
Izraz "oko" označava raspon od /- 20% od sledeće numeričke vrednosti. U jednom otelotvorenju, termin oko označava raspon od /- 10% od sledeće numeričke vrednosti. U jednom otelotvorenju, termin oko označava raspon od /- 5 % od sledeće numeričke vrednosti.
"Akceptorski humani okvir" je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisan dole. Akceptorski humani okvir "dobijen od" okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da obuhvati iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL akceptorski humani okvir je po sekvenci identičan sa sekvencom okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvencom okvira humanog konsenzusa.
Termin "afinitetno zrelo" antitelo odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Termin "izmena" označava mutaciju (supstituciju), ubacivanje (adiciju), ili izbacivanje jednog ili više aminokiselinskih ostataka u matičnom antitelu ili fuzionom polipeptidu, npr. fuzioni polipeptid koji sadrži bar deo za vezivanje FcRn Fc regiona, da bi se dobilo modifikovano antitelo ili fuzioni polipeptid. Termin "mutacija" označava da je specifični aminokiselinski ostatak zamenjen različitim aminokiselinskim ostatkom. Na primer, mutacija L234A označava da je aminokiselinski ostatak lizina na položaju 234 u Fc regionu antitela (polipeptida) supstituisan aminokiselinskim ostatkom alanina (supstitucija lizina alaninom) (numeracija prema EU indeksu).
Termin "aminokiselinska mutacija" označava supstituciju najmanje jednog postojećeg aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom (= zamena aminokiselinskog ostatka). Zamenski aminokiselinski ostatak može biti "prirodni aminokiselinski ostatak" i biti odabran iz grupe koja se sastoji od alanina (troslovna šifra: ala, jednoslovna šifra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), asparaginske kiseline (asp, D), cisteina (cys, C), glutamina (gln, Q), glutaminske kiseline (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), izoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lizina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P) serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofana (trp, W), tirozina (tyr, Y) i valina (val, V). Zamenski aminokiselinski ostatak može biti "neprirodni aminokiselinski ostatak". Vidi npr. US 6,586,207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin, J.W. i sar. J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. i Schultz, P.G. ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W. i sar. PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; i Wang, L. i Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10.
Termin "ubacivanje aminokiseline" označava (dodatno) inkorporiranje najmanje jednog aminokiselinskog ostatka na prethodno određenom položaju u aminokiselinskoj sekvenci. U jednom otelotvorenju, ubacivanje će biti ubacivanje jednog ili dva aminokiselinska ostatka. Umetnuti aminokiselinski ostaci mogu biti bilo koji prirodni ili neprirodni aminokiselinski ostataci.
Termin "izbacivanje aminokiselina" označava uklanjanje najmanje jednog aminokiselinskog ostatka na unapred određenom položaju u aminokiselinskoj sekvenci.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela, trispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen- i/ili protein A i/ili FcRn vezujuću aktivnost.
1
Termin "asimetrični Fc region" označava par polipeptida Fc regiona koji imaju različite aminokiselinske ostatke na odgovarajućim pozicijama prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa.
Termin "asimetrični Fc region u odnosu na vezivanje za FcRn" označava Fc region koji se sastoji od dva polipeptidna lanca koji imaju različite aminokiselinske ostatke na odgovarajućim položajima, pri čemu su položaji određeni prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa, pri čemu različiti položaji utiču na vezivanje Fc regiona za humani neonatalni Fc receptor (FcRn). U tu svrhu razlike između dva polipeptidna lanca Fc regiona u "asimetričnom Fc regionu u odnosu na vezivanje za FcRn" ne uključuju razlike koje su uvedene da olakšaju formiranje heterodimernih Fc regiona, npr. za proizvodnju bispecifičnih antitela. Ove razlike mogu biti i asimetrične, tj. dva lanca imaju razlike na neodgovarajućim aminokiselinskim ostacima prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa. Ove razlike olakšavaju heterodimerizaciju i smanjuju homodimerizaciju. Primeri za takve razlike su takozvane supstitucije "dugme u rupici" (vidi npr. US 7,695,936 i US 2003/0078385). Otkriveno je da sledeće supstitucije dugmeta i rupice u pojedinačnim polipeptidnim lancima Fc regiona IgG antitela potklase IgG1 povećavaju formiranje heterodimera: 1) Y407T u jednom lancu i T366Y u drugom lancu; 2) Y407A u jednom lancu i T366W u drugom lancu; 3) F405A u jednom lancu i T394W u drugom lancu; 4) F405W u jednom lancu i T394S u drugom lancu; 5) Y407T u jednom lancu i T366Y u drugom lancu; 6) T366Y i F405A u jednom lancu i T394W i Y407T u drugom lancu; 7) T366W i F405W u jednom lancu i T394S i Y407A u drugom lancu; 8) F405W i Y407A u jednom lancu i T366W i T394S u drugom lancu; i 9) T366W u jednom lancu i T366S, L368A, i Y407V u drugom lancu, pri čemu je posebno pogodna poslednja navedena. Osim toga, promene koje stvaraju nove disulfidne mostove između dva polipeptidna lanca Fc regiona olakšavaju formiranje heterodimera (vidi npr. US 2003/0078385). Otkriveno je da sledeće supstitucije koje dovode do cisteinskih ostataka prikladno udaljenih za formiranje novih intralančanih disulfidnih veza u pojedinačnim polipeptidnim lancima Fc regiona IgG antitela potklase IgG1 povećavaju formiranje heterodimera: Y349C u jednom lancu i S354C u drugom, Y349C u jednom lancu i E356C u drugom, Y349C u jednom lancu i E357C u drugom, L351C u jednom lancu i S354C u drugom, T394C u jednom lancu i E397C u drugom, ili D399C u jednom lancu i K392C u drugom. Dalji primeri za izmene aminokiselina koje olakšavaju heterodimerizaciju su su takozvane "supstitucije naelektrisanog para" (vidi npr. WO 2009/089004). Otkriveno je da sledeće supstitucije naelektrisanog para u pojedinačnim polipeptidnim lancima Fc regiona IgG antitela potklase IgG1 povećavaju formiranje heterodimera: 1) K409D ili K409E u
1
jednom lancu i D399K ili D399R u drugom lancu; 2) K392D ili K392E u jednom lancu i D399K ili D399R u drugom lancu; 3) K439D ili K439E u jednom lancu i E356K ili E356R u drugom lancu; 4) K370D ili K370E u jednom lancu i E357K ili E357R u drugom lancu; 5) K409D i K360D u jednom lancu plus D399K i E356K u drugom lancu; 6) K409D i K370D u jednom lancu plus D399K i E357K u drugom lancu; 7) K409D i K392D u jednom lancu plus D399K, E356K i E357K u drugom lancu; 8) K409D i K392D u jednom lancu i D399K u drugom lancu; 9) K409D i K392D u jednom lancu i D399K i E356K u drugom lancu; 10) K409D i K392D u jednom lancu i D399K i D357K u drugom lancu; 11) K409D i K370D u jednom lancu i D399K i D357K u drugom lancu; 12) D399K u jednom lancu i K409D i K360D u drugom lancu i 13) K409D i K439D u jednom lancu i D399K i E356K u drugom.
Termin "vezivanje (za antigen)" označava vezivanje antitela za njegov antigen u in vitro testu, u jednom otelotvorenju u testu vezivanja u kojem je antitelo vezano za površinu i vezivanje antigena za antitelo se meri pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR). Vezivanje označava afinitet vezivanja (KD) od 10<-8>M ili manje, u nekim otelotvorenjima 10<-13>do 10<-8>M, u nekim otelotvorenjima 10<-13>do 10<-9>M.
Vezivanje se može ispitati pomoću BIAcore testa (GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Švedska). Afinitet vezivanja je definisan izrazima ka(konstanta brzine asocijacije antitela iz kompleksa antitelo/antigen), kD(konstanta disocijacije), i KD(kd/ka).
Termin "himerno" antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
Termin "CH2 domen" označava deo polipeptida teškog lanca antitela koji se proteže otprilike od EU položaja 231 do EU položaja 340 (EU sistem numeracije prema Kabatu). U jednom otelotvorenju, CH2 domen ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 01:
Termin "CH3 domen" označava deo polipeptida teškog lanca antitela koji se proteže otprilike od EU položaja 341 do EU položaja 446. U jednom otelotvorenju, CH3 domen ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2:
„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od
1
njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Izraz "uporediva dužina" označava da dva polipeptida sadrže identičan broj aminokiselinskih ostataka ili se mogu razlikovati u dužini za jedan ili više, a najviše do 10 aminokiselinskih ostataka. U jednom otelotvorenju, polipeptidi Fc regiona sadrže identičan broj aminokiselinskih ostataka ili se razlikuju za od 1 do 10 aminokiselinskih ostataka. U jednom otelotvorenju, polipeptidi Fc regiona sadrže identičan broj aminokiselinskih ostataka ili se razlikuju za od 1 do 5 aminokiselinskih ostataka. U jednom otelotvorenju, polipeptidi Fc regiona sadrže identičan broj aminokiselinskih ostataka ili se razlikuju za 1 do 3 aminokiselinskih ostataka.
Izraz "izvedena iz" označava da je aminokiselinska sekvenca izvedena iz matične aminokiselinske sekvence uvođenjem izmena na najmanje jednom položaju. Tako izvedena aminokiselinska sekvenca razlikuje se od odgovarajuće matične aminokiselinske sekvence na najmanje jednom odgovarajućem položaju (numeracija prema Kabatovom sistemu numeracije EU indeksa za Fc regione antitela). U jednom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca izvedena iz matične aminokiselinske sekvence razlikuje se za jedan do petnaest aminokiselinskih ostataka na odgovarajućim položajima. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca izvedena iz matične aminokiselinske sekvence razlikuje se za jedan do deset aminokiselinskih ostataka na odgovarajućim položajima. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca izvedena iz matične aminokiselinske sekvence razlikuje se za jedan do šest aminokiselinskih ostataka na odgovarajućim položajima. Slično tome, izvedena aminokiselinska sekvenca ima visoku identičnost aminokiselinske sekvence sa svojom matičnom aminokiselinskom sekvencom. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca izvedena iz matične aminokiselinske sekvence ima 80% ili veću identičnost aminokiselinske sekvence. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca izvedena iz matične aminokiselinske sekvence ima 90% ili veću identičnost aminokiselinske sekvence. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca izvedena iz matične aminokiselinske sekvence ima 95% ili veću identičnost aminokiselinske sekvence.
"Efektorske funkcije" ukazuju na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koje variraju sa klasom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), vezivanje za Fc receptor, ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu, nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor) i aktivaciju B ćelija.
1
"Efikasna količina" agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Termin "fuzioni polipeptid Fc" označava fuziju vezujućeg domena (npr. antigen vezujućeg domena, kao što je jednolančano antitelo, ili polipeptid kao što je ligand receptora) sa Fc regionom antitela koji pokazuje željenu aktivnost vezivanja za cilj i/ili protein A i/ili za FcRn.
Termin "Fc region humanog porekla" označava C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca humanog porekla koji sadrži najmanje deo regiona šarke, CH2 domen i CH3 domen. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. U jednom otelotvorenju, Fc region ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 913242. Fc region je sastavljen od dva polipeptida teškog lanca Fc regiona, koji mogu biti kovalentno vezani jedan sa drugim preko ostataka cisteina regiona šarke, formirajući interpolipeptidne disulfidne veze.
Termin "FcRn" označava humani neonatalni Fc receptor. FcRn funkcioniše tako što spasava IgG iz lizozomskog puta degradacije, što dovodi do smanjenog klirensa i povećanog poluživota. FcRn je heterodimerni protein koji se sastoji od dva polipeptida: proteina od 50 kDa klase I nalik na glavni kompleks histokompatibilnosti (α-FcRn) i β2 mikroglobulina od 15 kDa (β2m). FcRn se vezuje sa visokim afinitetom za CH2-CH3 deo Fc regiona IgG. Interakcija između IgG i FcRn je strogo pH zavisna i javlja se u stehiometrijskom odnosu 1:2, pri čemu se jedan IgG vezuje za dva molekula FcRn preko svoja dva teška lanca (Huber, A.H. i sar. J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). Vezivanje FcRn se dešava u endozomu pri kiselom pH (pH <6,5) i IgG se oslobađa na neutralnoj površini ćelije (pH oko 7,4). Priroda interakcije osetljiva na pH olakšava FcRn posredovanu zaštitu IgG koji je pinocitozom prenet u ćelije iz intracelularne degradacije vezivanjem za receptor u kiselom okruženju endozoma. FcRn zatim olakšava recikliranje IgG na površini ćelije i kasnije oslobađanje u krvotok nakon izlaganja kompleksa FcRn-IgG neutralnom pH okruženju izvan ćelije.
Izraz "FcRn vezujući deo Fc regiona" označava deo polipeptida teškog lanca antitela koji se proteže približno od EU položaja 243 do EU položaja 261 i približno od EU položaja
1
275 do EU položaja 293 i približno od EU položaja 302 do EU položaja 319 i otprilike od EU položaja 336 do EU položaja 348 i otprilike od EU položaja 367 do EU položaja 393 i EU položaja 408 i približno od EU položaja 424 do EU položaja 440. U jednom otelotvorenju, jedan ili više od sledećih aminokiselinskih ostataka prema EU Kabatovoj numeraciji je izmenjen F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 i S440 (EU numeracija).
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Termin „antitelo pune dužine” označava antitelo koje ima strukturu u suštini sličnu nativnoj strukturi antitela ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano. Antitelo pune dužine može sadržati dodatne domene, kao što je npr. scFv ili scFab konjugovan sa jednim ili više lanaca antitela pune dužine. Ti konjugati su takođe obuhvaćeni terminom antitelo pune dužine.
Termini "heterodimer" ili "heterodimerni" označavaju molekul koji sadrži dva polipeptidna lanca (npr. slične dužine), pri čemu dva polipeptidna lanca imaju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje jedan različit aminokiselinski ostatak na odgovarajućem položaju, pri čemu se odgovarajući položaj određuje prema EU Kabatovom indeksu.
Termini "homodimer" i "homodimerni" označavaju molekul koji sadrži dva polipeptidna lanca uporedive dužine, pri čemu dva polipeptidna lanca imaju aminokiselinsku sekvencu koja je identična na odgovarajućim položajima, pri čemu se odgovarajući položaji određuju prema EU Kabatovom indeksu.
Antitelo ili fuzioni polipeptid Fc regiona, kako je ovde objavljeno, mogu biti homodimerni ili heterodimerni u odnosu na svoj Fc region koji je određen u odnosu na mutacije ili svojstva u fokusu. Na primer, u pogledu vezivanja za FcRn i/ili protein A (tj.
2
fokusirano na svojstva) Fc region (antitelo) je homodimeran (tj. oba polipeptida teškog lanca Fc regiona sadrže te mutacije) u odnosu na mutacije H310A, H433A i Y436A (ove mutacije su u fokusu u pogledu svojstva vezivanja za FcRn i/ili protein A fuzionog polipeptida Fc regiona ili antitela), ali je u isto vreme heterodimeran u odnosu na mutacije Y349C, T366S, L368A i Y407V (ove mutacije nisu u fokusu, jer su ove mutacije usmerene na heterodimerizaciju teških lanaca, a ne na svojstva vezivanja za FcRn/protein A), kao i mutacije S354C, odnosno T366W (prvi skup se nalazi samo u prvom polipeptidu Fc regiona, dok se drugi skup nalazi samo u drugom polipeptidu Fc regiona). Dalje, na primer, fuzioni polipeptid Fc regiona ili antitelo kako je ovde navedeno može biti heterodimerno u odnosu na mutacije I253A, H310A, H433A, H435A i Y436A (tj. ove mutacije su usmerene na sve karakteristike vezivanja FcRn i/ili proteina A dimernog polipeptida), tj. jedan polipeptid Fc regiona sadrži mutacije I253A, H310A i H435A, dok drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije H310A, H433A i Y436A.
Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelije domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.
„Humano antitelo” je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane antigen-vezujuće ostatke.
"Okvir humanog konsenzusa" je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, tomovi 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat i sar, gore. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat i sar, gore.
Termin "polipeptid humanog Fc regiona" označava aminokiselinsku sekvencu koja je identična polipeptidu humanog Fc regiona "nativnog" ili "divljeg tipa". Termin "polipeptid varijante (humanog) Fc regiona" označava aminokiselinsku sekvencu koja je izvedena iz "nativnog" ili "divljeg tipa" polipeptida humanog Fc regiona na osnovu najmanje jedne "aminokiselinske izmene". "Humani Fc region" se sastoji od dva polipeptida humanog Fc regiona. "Varijanta (humanog) Fc regiona" se sastoji od dva polipeptida Fc regiona, pri čemu oba mogu biti polipeptidi varijante (humanog) Fc regiona, ili je jedan polipeptid humanog Fc regiona, a drugi je polipeptid varijante (humanog) Fc regiona.
U jednom otelotvorenju, polipeptid humanog Fc regiona ima aminokiselinsku sekvencu polipeptida Fc regiona humanog IgG1 sa SEQ ID NO: 03, ili polipeptida Fc regiona humanog IgG2 sa SEQ ID NO: 04, ili polipeptida Fc regiona humanog IgG3 sa SEQ ID NO: 05, ili polipeptida Fc regiona humanog IgG4 sa SEQ ID NO: 06. U jednom otelotvorenju, polipeptid varijante (humanog) Fc regiona je izveden iz polipeptida Fc regiona sa SEQ ID NO: 03 ili 04, ili 05, ili 06, i ima najmanje jednu aminokiselinsku mutaciju u poređenju sa polipeptidom humanog Fc regiona sa SEQ ID NO: 03, ili 04, ili 05, ili 06. U jednom otelotvorenju, polipeptid varijante (humanog) Fc regiona sadrži/ima od oko jedne do oko dvanaest aminokiselinskih mutacija, a u jednom otelotvorenju od oko jedne do oko osam aminokiselinskih mutacija. U jednom otelotvorenju, polipeptid varijante (humanog) Fc regiona ima najmanje oko 80% homologije sa polipeptidom humanog Fc regiona sa SEQ ID NO: 03, ili 04, ili 05, ili 06. U jednom otelotvorenju, polipeptid varijante (humanog) Fc regiona ima najmanje oko 90% homologije sa polipeptidom humanog Fc regiona SEQ ID NO: 03, ili 04, ili 05, ili 06. U jednom otelotvorenju, polipeptid varijante (humanog) Fc regiona ima najmanje oko 95% homologije sa polipeptidom humanog Fc regiona sa SEQ ID NO: 03, ili 04, ili 05, ili 06.
Polipeptid varijante (humanog) Fc regiona izveden iz polipeptida humanog Fc regiona sa SEQ ID NO: 03, ili 04, ili 05, ili 06 je definisan aminokiselinskim izmenama koje sadrži. Tako, na primer, termin P329G označava polipeptid varijante (humanog) Fc regiona izveden iz polipeptida humanog Fc regiona sa mutacijom prolina u glicin na aminokiselinskom položaju 329 u odnosu na polipeptid humanog Fc regiona sa SEQ ID NO: 03, ili 04, ili 05, ili 06.
Kako se ovde koriste, aminokiselinski položaji svih konstantnih regiona i domena teškog i lakog lanca su numerisani prema Kabatovom sistemu za numeraciju koji je opisan u Kabat, i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), i ovde se naziva "numeracija prema Kabatu". Konkretno, Kabatov sistem numeracije (vidi strane 647-660) iz Kabat, i sar.
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) se koristi za konstantni domen lakog lanca CL kapa i lambda izotipa, i Kabatov sistem numeracije prema EU indeksu (vidi strane 661-723) se koristi za konstantne domene teškog lanca (CH1, šarka, CH2 i CH3).
Polipeptid Fc regiona humanog IgG1 ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama Y349C, T366S, L368A i Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i mutacijama Y349C, T366S, L368A, Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
2
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijom P329G ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i mutacijom P329G ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijom P239G i mutacijama Y349C, T366S, L368A, Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijom P329G i mutacijama S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G i Y349C, T366S, L368A, Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G i mutacijama S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc-regiona humanog IgG4 ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P i L235E ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i mutacijom P329G ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
2
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama Y349C, T366S, L368A, Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i Y349C, T366S, L368A, Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijom P329G ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
2
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P239G i Y349C, T366S, L368A, Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P239G i S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G i Y349C, T366S, L368A, Y407V ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
Polipeptid Fc regiona dobijenog od Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G i S354C, T366W ima sledeću aminokiselinsku sekvencu:
„Humanizovano” antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično
2
dva, varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR (npr. CDR), odgovaraju onima iz ne-humanog antitela, i svi, ili suštinski svi FR, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, npr. ne-humanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“) i formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigen kontakti“). Generalno, antitela sadrže šest HVR, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR, kako se ovde označava, uključuje
(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) (Chothia, C. i Lesk, A.M., J. Mol. Biol.196 (1987) 901-917);
(b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c) antigen kontakte koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3); (MacCallum et al. J. Mol. Biol.
262:732-745 (1996)); i
(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa (Kabat i sar., gore).
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim primerima izvođenja, pojedinac ili ispitanik je čovek.
„Izolovano” antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna
2
elektroforeza) ili hromatografski (npr. gel hromatografijom ili jonskom izmenom ili reversnofaznim HPLC postupkom). Za pregled postupaka za određivanje čistoće antitela pogledajte npr. Flatman, S. i sar. J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.
"Izolovana" nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
Termin „monoklonsko antitelo”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela koja sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Tako, reč „monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
"Nativna antitela" ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence svog konstantnog domena.
2
Termin „uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Termin „farmaceutska formulacija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
"Farmaceutski prihvatljiv nosač" upućuje na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Termin "peptidni linker" kako se ovde koristi označava peptid sa aminokiselinskim sekvencama, koji je u jednom otelotvorenju sintetičkog porekla. Peptidni linker je u jednom otelotvorenju peptid sa aminokiselinskom sekvencom čija je dužina najmanje 30 aminokiselina, u jednom otelotvorenju je dužine od 32 do 50 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, peptidni linker je peptid sa aminokiselinskom sekvencom dužine od 32 do 40 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, peptidni linker je (GxS)n, gde je G = glicin, S = serin, (x = 3, n = 8, 9 ili 10) ili (x = 4 i n = 6, 7 ili 8), u jednom otelotvorenju x = 4, n = 6 ili 7, u jednom otelotvorenju x = 4, n = 7. U jednom otelotvorenju, peptidni linker je (G4S)6G2.
Termin "rekombinantno antitelo" označava sva antitela (himerna, humanizovana i humana) koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana rekombinantnim sredstvima. Ovo uključuje antitela izolovana iz ćelije domaćina kao što je NS0 ili CHO ćelija, ili od životinje (npr. miša) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene ili antitela eksprimirana koristeći rekombinantni vektor ekspresije transficiran u ćeliju domaćina. Takva rekombinantna antitela imaju varijabilne i konstantne regione u preuređenom obliku. Rekombinantna antitela kao što je ovde navedeno mogu se podvrgnuti in vivo somatskoj hipermutaciji. Prema tome, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, budući da su dobijene iz VH i VL sekvenci humane germinativne linije i srodne su sa njima, ne mogu prirodno postojati in vivo u okviru repertoara antitela humane germinativne linije.
U smislu ovog dokumenta, „lečenje” (i njegovi gramatički oblici, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni
1
efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela ili fuzioni polipeptidi Fc regiona kako se ovde navode se koriste da odlože razvoj bolesti, ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin "valentni" kako se koristi u tekućoj prijavi označava prisustvo određenog broja mesta za vezivanje u molekulu (antitela). Kao takvi, termini "dvovalentni", "četvorovalentni" i "šestovalentni" označavaju prisustvo dva mesta za vezivanje, četiri mesta za vezivanje, odnosno šest mesta za vezivanje u molekulu (antitela). Bispecifična antitela, kao što je ovde navedeno, u jednom poželjnom otelotvorenju su "dvovalentna".
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antitela za njegov antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VL) antitela uopšteno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri regiona okvira (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR) (vidi, npr. Kindt, T.J. i sar. Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), strana 91). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VH, odnosno VL domena. Vidi, npr. Portolano, S. i sar. J. Immunol.150 (1993) 880-887; Clackson, T. i sar. Nature 352 (1991) 624-628).
Termin "vaskularna bolest oka" uključuje, ali nije ograničen na intraokularne neovaskularne sindrome kao što su dijabetička retinopatija, dijabetesni makularni edem, retinopatija nedonoščadi, neovaskularni glaukom, okluzije retinalne vene, okluzije centralne retinalne vene, degeneracija makule, starosna degeneracija makule, retinitis pigmentosa, retinalna angiomatska proliferacija, makularna telangiektazija, ishemijska retinopatija, neovaskularizacija irisa, intraokularna neovaskularizacija, neovaskularizacija rožnjače, neovaskularizacija retine, horoidalna neovaskularizacija i retinalna degeneracija (vidi npr. Gamer, A., Vascular diseases, u: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Gamer, A., i Klintworth, G.K., (izd.), 2. izdanje, Marcel Dekker, New York (1994), str.1625-1710).
Termin „vektor”, kako se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije
2
domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori”.
Termin "sa mutacijom IHH-AAA", kako se ovde koristi, odnosi se na kombinaciju mutacija I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) i H435A (His435Ala), a termin "sa mutacijom HHY-AAA", kako se ovde koristi, odnosi se na kombinaciju mutacija H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) i Y436A (Tyr436Ala), a termin "sa mutacijom YTE", kako se ovde koristi, odnosi se na kombinaciju mutacija M252Y (Met252Tyr), S254T (Ser254Thr) i T256E (Thr256Glu) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG1 ili IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.
Termin "sa mutacijama P329G LALA", kako se ovde koristi, odnosi se na kombinaciju mutacija L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) i P329G (Pro329Gly) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG1, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu. Termin "sa mutacijom SPLE", kako se ovde koristi, odnosi se na kombinaciju mutacija S228P (Ser228Pro) i L235E (Leu235Glu) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu. Termin "sa mutacijom SPLE i P239G", kako se ovde koristi, odnosi se na kombinaciju mutacija S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) i P329G (Pro329Gly) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.
II. TEKUĆI PRONALAZAK
Pronalazak se zasniva, bar delimično, na otkriću da se vezivanje za FcRn antitela ili fuzionog polipeptida Fc regiona može modifikovati izmenom aminokiselinskih ostataka na neodgovarajućim položajima u pojedinačnim polipeptidima Fc regiona, jer te izmene deluju zajedno u modifikaciji vezivanja za FcRn. Fc regioni, antitela i fuzioni polipeptidi Fc regiona, kako je ovde opisano, korisni su, npr. za lečenje bolesti kod kojih su potrebna prilagođena sistemska vremena retencije.
Ovde su prikazane varijante Fc regiona koje imaju modifikovana svojstva vezivanja za FcRn u poređenju sa odgovarajućim Fc regionom divljeg tipa. Ove varijante Fc regiona sadrže specifične aminokiselinske mutacije u CH2 i/ili CH3 domenu. Otkriveno je da ove mutacije, kada se koriste bilo same ili u kombinaciji u jednom ili u oba teška lanca Fc regiona, omogućavaju da se kreiraju prilagođeni in vivo poluživoti varijante Fc regiona.
A. Neonatalni Fc receptor (FcRn)
Neonatalni Fc receptor (FcRn) je važan za metaboličku sudbinu antitela klase IgG in vivo. FcRn funkcioniše tako što spašava IgG iz lizozomskog puta degradacije, što dovodi do smanjenog klirensa i povećanog poluživota. To je heterodimerni protein koji se sastoji od dva polipeptida: proteina od 50 kDa klase I nalik na glavni kompleks histokompatibilnosti (α-FcRn) i β2 mikroglobulina od 15 kDa (β2m). FcRn se vezuje sa visokim afinitetom za CH2-CH3 deo Fc regiona antitela klase IgG. Interakcija između antitela klase IgG i FcRn je zavisna od pH, i dešava se u stehiometrijskom odnosu 1:2, tj. jedan molekul IgG antitela može da stupi u interakciju sa dva molekula FcRn preko svoja dva polipeptida teškog lanca Fc regiona (vidi npr. Huber, A.H. i sar. J. Mol. Biol.230 (1993) 1077-1083).
Dakle, svojstva/karakteristike in vitro vezivanja IgG za FcRn ukazuju na njegove in vivo farmakokinetičke osobine u krvotoku.
U interakciji između FcRn i Fc regiona antitela IgG klase učestvuju različiti aminokiselinski ostaci CH2 i CH3 domena teškog lanca. Aminokiselinski ostaci koji su u interakciji sa FcRn nalaze se približno između EU položaja 243 i EU položaja 261, približno između EU položaja 275 i EU položaja 293, približno između EU položaja 302 i EU položaja 319, približno između EU položaja 336 i EU položaja 348, približno između EU položaja 367 i EU položaja 393, na EU položaju 408, i približno između EU položaja 424 i EU položaja 440. Preciznije, sledeći aminokiselinski ostaci prema Kabatovoj EU numeraciji su uključeni u interakciju između Fc regiona i FcRn: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 i S440.
Studije mutageneze usmerene na mesto pokazale su da su kritična mesta vezivanja u Fc regionu IgG za FcRn histidin 310, histidin 435 i izoleucin 253, a u manjoj meri histidin 433 i tirozin 436 (vidi npr. Kim, J.K. i sar. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825; Raghavan, M. i sar. Biochem.34 (1995) 14649-14657; Medesan, C. i sar. J. Immunol. 158 (1997) 2211-2217).
Metode za povećavanje vezivanja IgG za FcRn izvršene su mutiranjem IgG na različitim aminokiselinskim ostacima: Treonin 250, metionin 252, serin 254, treonin 256, treonin 307, glutaminska kiselina 380, metionin 428, histidin 433 i asparagin 434 (vidi Kuo, T.T. i sar. J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789).
4
U nekim slučajevima, poželjna su antitela sa smanjenim poluživotom u krvotoku. Na primer, lekovi za intravitrealnu primenu treba da imaju dug poluživot u oku i kratak poluživot u krvotoku pacijenta. Takva antitela takođe imaju prednost povećane izloženosti na mestu bolesti, npr. u oku.
Poznate su različite mutacije koje utiču na vezivanje za FcRn i time na poluživot u krvotoku. Ostaci Fc regiona koji su kritični za interakciju mišjeg Fc sa mišjim FcRn identifikovani su mutagenezom usmerenom na mesto (vidi npr. Dall’Acqua, W.F. i sar. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Ostaci I253, H310, H433, N434 i H435 (EU numeracija prema Kabatu) uključeni su u interakciju (Medesan, C. i sar. Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M. i sar. Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K. i sar. Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). Otkriveno je da su ostaci I253, H310 i H435 kritični za interakciju humanog Fc sa mišjim FcRn (Kim, J.K. i sar. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825). Ostatke M252Y, S254T, T256E su opisali Dall'Acqua i sar. za poboljšanje vezivanja za FcRn pomoću studija interakcije između proteina (Dall'Acqua, W.F. i sar. J. Biol. Chem.
281 (2006) 23514-23524). Studije kompleksa humanog Fc i humanog FcRn pokazale su da su ostaci I253, S254, H435 i Y436 presudni za interakciju (Firan, M. i sar. Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L. i sar. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y.A. i sar. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) su objavili i ispitali različite mutante ostataka 248 do 259 i 301 do 317 i 376 do 382 i 424 do 437. Primeri za mutacije i njihov efekat na vezivanje za FcRn navedeni su u sledećoj Tabeli.
Tabela.
4 Otkriveno je da je jedna jednostrana mutacija u jednom polipeptidu Fc regiona dovoljna da značajno oslabi vezivanje za Fc receptor. Što se više mutacija uvede u Fc region, to vezivanje za FcRn postaje slabije. Ali jednostrane asimetrične mutacije nisu dovoljne da potpuno inhibiraju vezivanje za FcRn. Mutacije na obe strane su neophodne da bi se potpuno inhibiralo vezivanje za FcRn.
Prema tome, varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG je heterodimer i uparivanje prvog polipeptida (teškog lanca) Fc regiona i drugog polipeptida (teškog lanca) Fc regiona da bi se formirao funkcionalni Fc region dovodi do nastanka heterodimera.
Rezultati simetričnog konstruisanja Fc regiona IgG1 koji utiče na vezivanje za FcRn prikazani su u sledećoj tabeli (usklađivanje mutacija i retenciono vreme na koloni za FcRnafinitetnu hromatografiju).
Tabela.
Retenciono vreme ispod 3 minuta odgovara nepostojanju vezivanja, jer je supstanca u protoku (prazan pik).
Pojedinačna mutacija H310A je najtiša simetrična mutacija za ukidanje bilo kog vezivanja za FcRn.
Simetrična pojedinačna mutacija I253A i H435A dovodi do relativnog pomaka retencionog vremena od 0,3 - 0,4 min. Ovo se uopšteno može smatrati vezivanjem koje se ne može detektovati.
Pojedinačna mutacija Y436A dovodi do detektabilne snage interakcije za FcRn afinitetnu kolonu. Bez da bude vezana ovom teorijom, ova mutacija bi mogla imati FcRnposredovani poluživot koji se može razlikovati od nulte interakcije kao što je kombinacija I253A, H310A i H435A mutacija (IHH-AAA mutacija).
Rezultati dobijeni sa simetrično modifikovanim anti-HER2 antitelom su prikazani u sledećoj tabeli (vidi WO 2006/031370 za referencu).
Tabela.
Fc region u fuzionom polipeptidu Fc regiona daje gore opisane karakteristike svom fuzionom partneru. Fuzioni partner može biti bilo koji molekul koji ima biološku aktivnost čiji se in vivo poluživot smanjuje ili povećava, tj. čiji in vivo poluživot mora biti jasno definisan i prilagođen za njegovu nameravanu primenu.
Fuzioni polipeptidi Fc regiona mogu obuhvatati npr. varijantu (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde navedeno i receptorski protein koji se vezuje za cilj koji uključuje ligand, kao što je, na primer, fuzioni polipeptid TNFR-Fc regiona (TNFR = humani receptor faktora nekroze tumora), ili fuzioni polipeptid IL-1R-Fc regiona (IL-1R = humani interleukin-1 receptor), ili fuzioni polipeptidi VEGFR-Fc regiona (VEGFR = humani receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta), ili fuzioni polipeptidi ANG2R-Fc regiona (ANG2R = humani receptor angiopoetina 2).
Fuzioni polipeptidi Fc regiona mogu obuhvatati npr. varijantu (humanog) Fc regiona klase IgG kao što je ovde navedeno i fragment antitela koji se vezuje za cilj uključujući, na primer, Fab fragment antitela, scFvs (vidi npr. Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1126-1136), ili domenska antitela (dAbs) (vidi npr. WO 2004/058821, WO 2003/002609).
Fuzioni polipeptidi Fc regiona mogu obuhvatati npr. varijantu (humanog) Fc regiona klase IgG kako je ovde opisano i receptorski ligand (prirodni ili veštački).
B. Primeri za Fc regione i antitela koja sadrže te Fc regione
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje Fc regione koji imaju modifikovano vezivanje za FcRn, tj. ti Fc regioni se vezuju za humani FcRn sa afinitetom većim ili manjim od Fc regiona koji nema mutacije koje utiču na vezivanje za FcRn.
U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja imaju modifikovano vezivanje za FcRn, tj. ta antitela se vezuju za humani FcRn sa afinitetom većim ili manjim od antitela koje nema mutacije koje utiču na vezivanje za FcRn.
Jedan aspekt koji je ovde opisan je antitelo koje sadrži Fc region (varijantu) koji sadrži prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona,
pri čemu
a) prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona su dobijeni od istog polipeptida humanog Fc regiona, i
4
b) prvi polipeptid Fc regiona je modifikovan tako da se njegova aminokiselinska sekvenca razlikuje od aminokiselinske sekvence drugog polipeptida Fc regiona najmanje na jednom odgovarajućem položaju prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa, a drugi polipeptid Fc regiona je modifikovan tako što se njegova aminokiselinska sekvenca razlikuje od aminokiselinske sekvence prvog polipeptida Fc regiona najmanje na jednom odgovarajućem položaju prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa, pri čemu su modifikovana pozicija u prvom polipeptidu Fc regiona i modifikovana pozicija u drugom polipeptidu Fc regiona različite, i
c) Fc region ima različit afinitet prema humanom Fc receptoru u poređenju sa Fc regionom koji sadrži kao prvi i drugi polipeptid Fc regiona polipeptid humanog Fc regiona a) (tj. koji ima iste aminokiselinske ostatke kao i polipeptid humanog Fc regiona a) na odgovarajućim pozicijama prema sistemu numeracije Kabatovog EU indeksa).
pri čemu, ili prvi polipeptid Fc regiona ili drugi polipeptid Fc regiona ili oba polipeptida Fc regiona sadrže jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434H.
U jednom otelotvorenju svih aspekata koji su ovde navedeni
prvi polipeptid Fc regiona obuhvata nezavisno od drugog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H i M252Y i S254T i T256E,
i
drugi polipeptid Fc regiona obuhvata nezavisno od prvog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih mutacija ili kombinaciju mutacija
- T307H, ili
- T307Q, ili
- Q311H, ili
- E430 H, ili
- N434H, ili
- T307H i Q311H, ili
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H, ili
- T307H i M252Y i S254T i T256E, ili
- Q311H i M252Y i S254T i T256E, ili
- E430 H i M252Y i S254T i T256E, ili
- N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom otelotvorenju svih aspekata koji su ovde navedeni, prvi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- nijednu, ili
- M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A,
i
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H,
i drugi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih mutacija ili kombinacija mutacija:
- nijednu, ako prvi polipeptid Fc regiona sadrži najmanje jednu mutaciju, ili
- T307H, ili
- T307Q, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo mutaciju T307Q, ili - Q311H, ili
- E430 H, ili
- N434H, ili
- T307H i Q311H, ili
4
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307Q i N434A, ili
- M252Y i S254T i T256E, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija H310A i H433A i Y436A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E, i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H
4
i N434H.
U jednom poželjnom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, Fc region je varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG. U jednom otelotvorenju, varijanta (humanog) Fc regiona klase IgG je heterodimerni Fc region klase IgG.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, sparivanje prvog polipeptida Fc regiona i drugog polipeptida Fc regiona da bi se formirao (funkcionalni) Fc region dovodi do nastanka heterodimera.
U jednom otelotvorenju, polipeptid humanog Fc regiona je polipeptid humanog Fc regiona potklase IgG1 ili potklase IgG4.
U jednom otelotvorenju, polipeptid humanog Fc regiona je polipeptid humanog Fc regiona potklase IgG1 koji dalje sadrži mutacije L234A, L235A i P329G.
U jednom otelotvorenju, polipeptid humanog Fc regiona je polipeptid humanog Fc regiona potklase IgG4 koji dalje sadrži mutacije S228P i L235E.
U jednom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutacije S354C i T366W, i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrži mutacije Y349C, T366S, L368A i Y407V.
U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo je okarakterisano po tome što je Fcregion iii) humane potklase IgG1. U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo je okarakterisano time što Fc region humane IgG1 potklase dalje sadrži mutacije L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo je okarakterisano time što je Fc region iii) humane potklase IgG4. U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo je okarakterisano time što Fc region humane potklase IgG4 dalje sadrži mutacije S228P i L235E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo je okarakterisano time što Fc region humane potklase IgG4 dalje sadrži mutacije S228P, L235E i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Dalji aspekti koji su ovde navedeni su farmaceutska formulacija koja sadrži bispecifično antitelo, farmaceutska formulacija za upotrebu u lečenju vaskularnih bolesti oka, upotreba bispecifičnog antitela za proizvodnju leka za lečenje vaskularnih bolesti oka, metoda lečenja pacijenta koji boluje od vaskularnih bolesti oka davanjem bispecifičnog antitela pacijentu kome je takvo lečenje potrebno. U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo ili farmaceutska formulacija koja sadrži bispecifično antitelo se daje putem intravitrealne primene.
4
Ovde je opisana metoda za proizvodnju bispecifičnog antitela kako je ovde objavljeno, okarakterisana ekspresijom nukleinske kiseline kako je ovde objavljeno u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu i regeneracija bispecifičnog antitela iz ćelije ili supernatanta ćelijske kulture. Jedno otelotvorenje je metoda za pripremu bispecifičnog antitela, kako je ovde navedeno, koja obuhvata korake
a) transformacije ćelije domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo;
b) uzgajanje ćelije domaćina u uslovima koji omogućavaju sintezu antitela; i
c) regeneraciju antitela iz kulture.
Ovde je objavljeno antitelo dobijeno takvom metodom za proizvodnju bispecifičnog antitela.
Ovde opisana antitela imaju veoma vredna svojstva zbog svojih specifičnih modifikacija u Fc regionu, što dovodi do koristi za pacijenta koji boluje od vaskularnih bolesti oka. Ona pokazuju veliku stabilnost u intravitrealnom okruženju i usporavaju difuziju iz oka (u poređenju sa manjim fragmentima antitela bez konstantnog regiona teškog lanca), gde se aktuelna bolest nalazi i leči (tako da se raspored lečenja potencijalno može poboljšati u odnosu na antitela koja nisu IgG, poput npr. Fab i (Fab)2fragmenata). Antitela, kako je ovde navedeno, pored toga se vrlo brzo uklanjaju iz seruma (što je veoma poželjno, da bi se smanjili potencijalni neželjeni efekti koji nastaju usled sistemskog izlaganja). Iznenađujuće, ona takođe pokazuju manju viskoznost (u poređenju sa verzijama bez kombinacije mutacija I253A, H310A i H435A u konstantnom regionu) i stoga su posebno korisna za intravitrealnu primenu kroz tanke igle tokom lečenja bolesti oka (za takvu primenu koriste se tipično tanke igle, i visoka viskoznost otežava odgovarajuću primenu). Manja viskoznost takođe omogućava više koncentracije formulacija.
Takođe je iznenađujuće da antitela, kao što su ovde navedena, pokazuju manju sklonost ka agregaciji tokom skladištenja (u poređenju sa verzijama bez kombinacije mutacija I253A, H310A i H435A u Fc regionu) koja je kritična za intravitrealnu primenu u oku (jer agregacija u oku može dovesti do komplikacija tokom takvog lečenja).
Bispecifična antitela, kao što je ovde navedeno, pokazuju dobru efikasnost u inhibiciji vaskularnih bolesti.
U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela, kao što je ovde opisano, zbog svojih specifičnih modifikacija u konstantnom regionu (npr. P329G LALA) pokazuju vredna svojstva, kao što je nepostojanje vezivanja za receptore Fcgamma ili njihovog vezivanja, što smanjuje rizik od neželjenih efekata kao što su tromboza i/ili neželjena ćelijska smrt (usled
4
npr. ADCC).
U jednom otelotvorenju, kako je ovde opisano, bispecifično antitelo kao što je ovde opisano je dvovalentno.
U jednom otelotvorenju, varijabilni domen teškog lanca antitela (VH) i varijabilni domen lakog lanca antitela (VL) teškog i lakog lanca drugog antitela pune dužine se dalje stabilizuju uvođenjem disulfidne veze između sledećih položaja: položaja 44 varijabilnog domena teškog lanca i položaja 100 varijabilnog domena lakog lanca (numeracija prema Kabatu (Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Tehnike za uvođenje disulfidnih mostova za stabilizaciju opisane su npr. u WO 94/029350, Rajagopal, V. i sar. Prot. Eng. 10 (1997) 1453-1459, Kobayashi i sar. Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393, i Schmidt, M. i sar. Oncogene 18 (1999)1711-1721.
U jednom otelotvorenju, CH3 domeni bispecifičnog, dvovalentnog antitela kao što je ovde opisano, izmenjeni su tehnologijom "dugme u rupici" koja je detaljno opisana sa nekoliko primera, npr. u WO 96/027011, Ridgway J.B. i sar. Protein Eng. 9 (1996) 617-621, i Merchant, A.M. i sar. Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. U ovoj metodi, interakcijske površine dva CH3 domena su izmenjene kako bi se povećala heterodimerizacija oba teška lanca koji sadrže ova dva CH3 domena. Svaki od dva CH3 domena (iz dva teška lanca) može biti „lanac sa dugmetom“, dok je drugi „lanac sa rupicom“. Uvođenje disulfidnog mosta dodatno stabilizuje heterodimere (Merchant, A.M. i sar. Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S. i sar. J. Mol. Biol.270 (1997) 26-35) i povećava prinos.
U jednom poželjnom otelotvorenju svih aspekata, kao što je ovde navedeno, bispecifična antitela su okarakterisana time što
CH3 domen jednog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca susreću se na međupovršini koja sadrži originalnu međupovršinu između CH3 domena antitela,
pri čemu je međupovršina izmenjena da promoviše formiranje bispecifičnog antitela, pri čemu je izmena okarakterisana time što:
a) CH3 domen jednog teškog lanca je izmenjen,
tako da unutar originalne međupovršine CH3 domena jednog teškog lanca koji se susreće sa originalnom međupovršinom CH3 domena drugog teškog lanca unutar bispecifičnog antitela
aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veću zapreminu bočnog lanca, čime se generiše izbočina u međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca koja se može pozicionirati u šupljinu u međupovršini CH3 domena drugog
4
teškog lanca,
i
b) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen,
tako da unutar originalne međupovršine drugog CH3 domena koji se susreće sa originalnom međupovršinom CH3 domena unutar bispecifičnog antitela
aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manju zapreminu bočnog lanca, čime se generiše šupljina u međupovršini drugog CH3 domena u koju se može pozicionirati izbočina u međupovršini prvog CH3 domena.
Prema tome, antitelo prema pronalasku je u jednom poželjnom otelotvorenju okarakterisano time što
CH3 domen teškog lanca antitela pune dužine a) i CH3 domen teškog lanca antitela pune dužine b) se susreću na međupovršini koja sadrži izmenu u originalnoj međupovršini između CH3 domena antitela,
pri čemu
i) u CH3 domenu jednog teškog lanca
aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veću zapreminu bočnog lanca, čime se generiše izbočina u međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca koja se može pozicionirati u šupljinu u međupovršini CH3 domena drugog teškog lanca,
i pri čemu
ii) u CH3 domenu drugog teškog lanca
aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manju zapreminu bočnog lanca, čime se generiše šupljina u međupovršini drugog CH3 domena u koju se može pozicionirati izbočina u međupovršini prvog CH3 domena.
U jednom poželjnom otelotvorenju, aminokiselinski ostatak koji ima veću zapreminu bočnog lanca je odabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y) i triptofana (W).
U jednom poželjnom otelotvorenju, aminokiselinski ostatak koji ima manju zapreminu bočnog lanca je odabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), serina (S), treonina (T) i valina (V).
U jednom otelotvorenju, oba CH3 domena se dalje menjaju uvođenjem cisteinskog ostatka (C) u odgovarajuće položaje svakog CH3 domena, tako da se može formirati disulfidni most između oba CH3 domena.
U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži T366W mutaciju u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i T366S, L368A i Y407V mutacije u CH3 domenu "lanca sa rupicom". Dodatni međulančani disulfidni most između CH3 domena se takođe može koristiti (Merchant, A.M. i sar. Nature Biotech 16 (1998) 677-681), npr. uvođenjem Y349C ili S354C mutacije u CH3 domen "lanca sa dugmetom" i Y439C ili E356C ili S354C mutacije u CH3 domen "lanca sa rupicom".
U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo kako je ovde opisano sadrži mutaciju Y349C ili S354C i mutaciju T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C ili E356C ili Y349C i mutacije T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena. U jednom poželjnom otelotvorenju, bispecifično antitelo mutacije sadrži Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena (dodatna mutacija Y349C u jednom CH3 domenu i dodatna mutacija S354C u drugom CH3 domenu koji formira međulančani disulfidni most) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). U jednom poželjnom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutacije S354C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena (dodatna mutacija Y349C u jednom CH3 domenu i dodatna mutacija S354C u drugom CH3 domenu koji formira međulančani disulfidni most) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Takođe, alternativno ili dodatno se mogu koristiti i druge tehnologije "dugme u rupici" kao što su opisane u EP 1870 459 A1. Tako, još jedan primer za bispecifično antitelo su mutacije R409D i K370E u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i mutacije D399K i E357K u CH3 domenu "lanca sa rupicom" (numeracija prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
U drugom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutaciju T366W u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i T366S, L368A i Y407V mutacije u CH3 domenu "lanca sa rupicom" i dodatno mutacije R409D, K370E u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i mutacije D399K, E357K u CH3 domenu "lanca sa rupicom".
U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena, ili bispecifično antitelo sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacijeS354C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena i dodatno
1
mutacije R409D, K370E u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i mutacije D399K, E357K u CH3 domenu "lanca sa rupicom".
U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutacije S354C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije Y349C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena, ili bispecifično antitelo sadrži mutacije S354C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije Y349C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena i dodatno mutacije R409D, K370E u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i mutacije D399K, E357K u CH3 domenu "lanca sa rupicom".
Antigen-vezujuće mesto bispecifičnog antitela, kao što je ovde navedeno, sadrži šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji u različitoj meri doprinose afinitetu mesta vezivanja prema njegovom antigenu. Postoje tri CDR-a varijabilnog domena teškog lanca (CDRH1, CDRH2 i CDRH3) i tri CDR-a varijabilnog domena lakog lanca (CDRL1, CDRL2 i CDRL3). Obim CDR-a i regiona okvira (FRs) se određuje upoređivanjem sa prikupljenom bazom podataka aminokiselinskih sekvenci u kojoj su ti regioni definisani prema varijabilnosti među sekvencama.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo se specifično ne vezuje za humani FcRn. U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo se dodatno specifično vezuje za stafilokokni protein A.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo se specifično ne vezuje za humani FcRn. U jednom otelotvorenju svih aspekata, antitelo se dodatno specifično ne vezuje za stafilokokni protein A.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, prvi polipeptid dalje sadrži mutacije Y349C, T366S, L368A i Y407V („rupica“), i drugi polipeptid sadrži mutacije S354C i T366W („dugme“).
U jednom otelotvorenju svih aspekata, prvi polipeptid dalje sadrži mutacije S354C, T366S, L368A i Y407V („rupica“), i drugi polipeptid sadrži mutacije Y349C i T366W („dugme“).
U jednom otelotvorenju svih aspekata, polipeptidi Fc regiona su humane potklase IgG1. U jednom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije L234A i L235A. U jednom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutaciju P329G.
U jednom otelotvorenju svih aspekata, polipeptidi Fc regiona su humane potklase IgG4. U jednom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona i drugi polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutacije S228P i L235E. U jednom otelotvorenju, prvi polipeptid Fc regiona i drugi
2
polipeptid Fc regiona dalje sadrže mutaciju P329G.
Antitelo kako je ovde opisano proizvodi se rekombinantnim sredstvima. Prema tome, jedan od aspekata koji je ovde naveden je nukleinska kiselina koja kodira antitelo kako je ovde navedeno, a dalji aspekt je ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo kako je ovde navedeno. Metode za rekombinantnu proizvodnju su opštepoznate u struci, i obuhvataju ekspresiju proteina u prokariotskim i eukariotskim ćelijama uz naknadnu izolaciju antitela, i obično prečišćavanje do farmaceutski prihvatljive čistoće. Za ekspresiju antitela u ćeliji domaćinu kao što je gore pomenuto, nukleinske kiseline koje kodiraju odgovarajuće (modifikovane) lake i teške lance ubacuju se u ekspresione vektore standardnim metodama. Ekspresija se vrši u odgovarajućim prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, kao što su CHO ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, HEK293 ćelije, COS ćelije, PER.C6 ćelije, ćelije kvasca ili E.coli, a antitelo se izdvaja iz ćelija (supernatant od uzgajanja ili ćelije nakon lize). Opšte metode za rekombinantnu proizvodnju antitela su dobro poznate u struci, i opisane, na primer, u revijalnim člancima Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202, Geisse, S. i sar. Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282, Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160, i Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.
Ovde je objavljeni postupak za pripremu bispecifičnog antitela kako je ovde objavljeno, koji obuhvata korake
b) transformisanja ćelije domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo,
c) uzgajanje ćelije domaćina u uslovima koji omogućavaju sintezu antitela, i d) regeneraciju antitela iz kulture.
U jednom otelotvorenju, korak regeneracije pod c) uključuje upotrebu reagensa za specifično hvatanje konstantnog domena lakog lanca (koji je npr. specifičan za kapa ili lambda konstantni laki lanac, u zavisnosti od toga da li je kapa ili lambda laki lanac sadržan u bispecifičnim antitela). U jednom otelotvorenju, ovaj reagens za specifično hvatanje lakog lanca se koristi u režimu vezivanja i eluiranja. Primeri takvih reagensa za specifično hvatanje konstantnog domena lakog lanca su npr. KappaSelect™ i LambdaFabSelect™ (dostupni od GE Healthcare/BAC), koji se temelje na vrlo krutoj agaroznoj baznoj matrici koja omogućava visok protok i nizak povratni pritisak u industrijskim razmerama. Ovi materijali sadrže ligand koji se vezuje za konstantni region kapa ili lambda lakog lanca, (tj. fragmenti kojima nedostaje konstantni region lakog lanca neće se vezati). Oba su stoga sposobna da vežu druge ciljne molekule koji sadrže konstantni region lakog lanca, na primer, IgG, IgA i IgM. Ligandi su pričvršćeni za matricu pomoću dugačkog hidrofilnog kraka spejsera, kako bi bili lako dostupni za vezivanje za ciljni molekul. Oni se zasnivaju na jednolančanom fragmentu antitela koji je testiran na humani Ig kapa ili lambda.
U jednom otelotvorenju, korak regeneracije pod c) uključuje upotrebu reagensa za hvatanje specifičnog za Fc region. U jednom otelotvorenju, reagens za hvatanje specifičan za Fc region se koristi u režimu vezivanja i eluiranja. Primeri takvih reagenasa za hvatanje specifičnih za Fc region su npr. materijali za afinitetnu hromatografiju na bazi stafilokoknog proteina A.
Bispecifična antitela su pogodno odvojena od medijuma za uzgajanje konvencionalnim procedurama za prečišćavanje imunoglobulina kao što su, na primer, afinitetna hromatografija (protein A-sefaroza, ili KappaSelect™, LambdaFabSelect™), hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza ili dijaliza.
DNK i RNK koje kodiraju monoklonska antitela se lako izoluju i sekvenciraju pomoću konvencionalnih postupaka. B-ćelije ili ćelije hibridoma mogu poslužiti kao izvor takve DNK i RNK. Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji se zatim transficiraju u ćelije domaćina, kao što su ćelije HEK 293, CHO ćelije ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza rekombinantnih monoklonskih antitela u ćelijama domaćina.
Neki od ovih molekula, kako je ovde objavljeno, obezbeđuju jednostavnost izolacije/prečišćavanja tako što sadrže Fc regione koji su različito modifikovani, pri čemu najmanje jedna od modifikacija dovodi do i) diferencijalnog afiniteta molekula prema (stafilokoknom) proteinu A i ii) diferencijalnog afiniteta molekula prema humanom FcRn, a molekul se može izolovati iz oštećene ćelije, iz medijuma, ili iz smeše molekula na osnovu njegovog afiniteta prema proteinu A.
Prečišćavanje antitela se vrši kako bi se eliminisale ćelijske komponente ili drugi kontaminanti, npr. druge ćelijske nukleinske kiseline ili proteini, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, vezivanje CsCl, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge tehnike dobro poznate u struci (vidi npr. Ausubel, F. i sar. izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)). Različite metode su dobro utvrđene i široko rasprostranjene za prečišćavanje proteina, kao što je afinitetna hromatografija sa mikrobnim proteinom (npr. afinitetna hromatografija sa proteinom A ili proteinom G), jonoizmenjivačka hromatografija (npr. katjonska izmena (karboksimetil smole), anjonska izmena (amino etil smole) i izmena u mešovitom režimu), tiofilna adsorpcija (npr. sa beta-merkaptoetanolom i drugim SH ligandima), hidrofobna interakcija ili aromatična adsorpciona hromatografija (npr. sa fenil-
4
sefarozom, aza-arenofilnim smolama ili m-aminofenilboronskom kiselinom), afinitetna hromatografija sa metalnim helatima (npr. sa Ni(II) i Cu(II) afinitetnim materijalom), gel hromatografija i elektroforetske metode (kao što je gel elektroforeza, kapilarna elektroforeza) (Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
Jedan aspekt, kao što je ovde objavljeno, je farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo kao što je ovde objavljeno. Drugi aspekt, kao što je ovde objavljeno, je upotreba antitela kao što je ovde objavljeno za proizvodnju farmaceutske formulacije. Dalji aspekt, kao što je ovde objavljeno je postupak za proizvodnju farmaceutske formulacije koja sadrži antitelo kao što je ovde objavljeno. U drugom aspektu, obezbeđena je formulacija, npr. farmaceutska formulacija, koja sadrži antitelo kao što je ovde objavljeno, formulisano zajedno sa farmaceutskim nosačem.
Formulacija iz predmetnog pronalaska može se primeniti različitim metodama poznatim u struci. Kao što će stručnjak shvatiti, put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Da bi se primenilo jedinjenje kao što je ovde objavljeno određenim putevima primene, može biti neophodno obložiti jedinjenje materijalom da bi se sprečila njegova inaktivacija, ili ga primeniti zajedno sa takvim materijalom. Na primer, jedinjenje se može dati ispitaniku u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima, ili razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju slane i vodene puferske rastvore. Farmaceutski nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporanu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci.
Mogu se koristiti mnogi mogući načini isporuke, uključujući, ali se ne ograničavajući na intraokularnu primenu ili topikalnu primenu. U jednom otelotvorenju, primena je intraokularna i uključuje, ali nije ograničena na, subkonjunktivnu injekciju, intrakameralnu injekciju, injekciju u prednju komoru putem termporalnog limbusa, intrastromalnu injekciju, intrakornealnu injekciju, subretinalnu injekciju, vodenu humornu injekciju, subtenonsku injekciju ili uređaj za produženu isporuku, intravitrealnu injekciju (npr. prednja, srednja ili zadnja vitrealna injekcija). U jednom otelotvorenju, primena je topikalna i uključuje, ali nije ograničena na kapi za oči u rožnjaču.
U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo ili farmaceutska formulacija, kao što je ovde objavljena, daje se intravitrealnom primenom, npr. putem intravitrealne injekcije. Ovo se može izvesti prema standardnim procedurama poznatim u struci (vidi, npr. Ritter i sar. J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro i sar. Neuropathol. Appl. Neurobiol.
25 (1999) 196-206, i Wray i sar. Arch. Neurol.33 (1976) 183-185).
U nekim otelotvorenjima, terapeutski kompleti kao što je ovde objavljeno mogu sadržati jednu ili više doza (bispecifičnog) antitela prisutnog u farmaceutskoj formulaciji kao što je ovde objavljeno, pogodan uređaj za intravitrealnu injekciju farmaceutske formulacije i uputstvo koje detaljno opisuje odgovarajuće subjekte i protokole za davanje injekcije. U ovim otelotvorenjima, formulacije se tipično daju subjektu kojem je potrebno lečenje intravitrealnom injekcijom. Ovo se može izvesti prema standardnim procedurama poznatim u struci (vidi, npr. Ritter i sar. J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro i sar. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206, i Wray i sar. Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185).
Formulacije mogu takođe da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, kvašljivci, emulgatori i disperzioni agensi. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se osigurati i postupcima sterilizacije, gore, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola, sorbinske kiseline, i slično. Takođe, može biti poželjno da se u formulacije uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koja odlažu apsorpciju, kao što je aluminijum monostearat i želatin.
Bez obzira na odabrani način primene, jedinjenja kao što je ovde objavljeno, koja se mogu koristiti u pogodnom hidratisanom obliku, i/ili farmaceutske formulacije kao što je ovde objavljeno, formulišu se u farmaceutski prihvatljive dozne oblike konvencionalnim metodama poznatim stručnjacima.
Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim formulacijama kao što je ovde objavljeno mogu biti različiti, tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je delotvorna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, formulaciju i način primene, a da nije toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih formulacija koje se koriste, način primene, vreme primene, brzinu izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim formulacijama, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.
Formulacija mora biti sterilna i tečna do te mere da se formulacija može isporučiti špricem. Pored vode, nosač je poželjno izotonični puferovani slani rastvor.
Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je uključiti u formulaciju izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol ili sorbitol, i natrijum hlorid.
Formulacija može sadržati oftalmičku depo formulaciju koja sadrži aktivni agens za subkonjunktivnu primenu. Oftalmička depo formulacija sadrži mikročestice u suštini čistog aktivnog agensa, npr. bispecifično antitelo kao što je ovde objavljeno. Mikročestice koje sadrže bispecifično antitelo, kao što je ovde objavljeno, mogu biti ugrađene u biokompatibilni farmaceutski prihvatljivi polimer ili agens za enkapsulaciju lipida. Depo formulacije se mogu prilagoditi tako da se oslobađaju svi suštinski aktivni materijali tokom dužeg vremenskog perioda. Polimerna ili lipidna matrica, ako je prisutna, može se prilagoditi da se dovoljno razgradi da bi se transportovala sa mesta primene nakon oslobađanja svog ili suštinski svog aktivnog agensa. Depo formulacija može biti tečna formulacija, koja sadrži farmaceutski prihvatljiv polimer i rastvoreni ili dispergovani aktivni agens. Nakon injektovanja, polimer formira depo na mestu injekcije, npr. nastajanjem gela ili precipitacijom.
Drugi aspekt ovog pronalaska je bispecifično antitelo kao što je ovde objavljeno za upotrebu u lečenju vaskularnih bolesti oka.
Drugi aspekt ovog pronalaska je farmaceutska formulacija kao što je ovde objavljeno za upotrebu u lečenju vaskularnih bolesti oka.
Ovde je objavljena upotreba antitela kao što je ovde objavljeno za proizvodnju leka za lečenje vaskularnih bolesti oka.
Ovde je izričito naglašeno da termin "sadrži" kako se ovde koristi obuhvata izraz "sastoji se od". Prema tome, svi aspekti i otelotvorenja koja sadrže termin "sadrži" su isto tako objavljeni sa terminom "koji se sastoji od".
Modifikacije
U daljem aspektu, Fc region ili antitelo kao što je ovde objavljeno ili prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-6 u nastavku:
1. Afinitet antitela
U jednom otelotvorenju, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE<®>. Na primer, obavljen je test uz korišćenje BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom na ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/minutu da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neproreagovale grupe. Za kinetička merenja, dve serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) su injektovane u PBS-u sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedanna-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Konstanta ravnoteže disocijacije (Kd) se izračunava kao odnos koff/kon(vidi, npr. Chen, Y. i sar. J. Mol. Biol.293 (1999) 865-881). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C kod 20 nM antiantigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.
2. Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u US 4,816,567; i Morrison, S.L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži ne-humani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili ne-humanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom”, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U određenim primerima izvođenja, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, ne-humano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog ne-humanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od ne-humanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim primerima izvođenja, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima ne-humanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovu pripremu daju, npr. Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, a dalje ih opisuju, npr. Riechmann, I. i sar. Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, i US 7,087,409; Kashmiri, S.V. i sar. Methods 36 (2005) 25-34) (opisuju graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (opisuje “preuređivanje površine”); Dall’Acqua, W.F. i sar. Methods 36 (2005) 43-60 (opisuje “mešanje FR”); Osbourn, J. i sar. Methods 36 (2005) 61-68; i Klimka, A. i sar Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (opisuje pristup “vođene selekcije” kod mešanja FR).
Humani regioni okvira koji se mogu upotrebiti za humanizaciju uključuju, bez ograničenja: regione okvira izabrane pomoću postupka „najboljeg slaganja” (vidi, npr. Sims, M.J. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regione okvira dobijene iz sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (vidi, npr. Carter, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Presta, L.G. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira humane germinativne linije (vidi, npr. Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); i regione okvira dobijene skriningom biblioteka FR (vidi, npr. Baca, M. i sar. J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 i Rosok, M.J. i sar. J. Biol. Chem.
271 (1996922611-22618).
3. Humana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su generalno opisali van Dijk, M.A. i van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 i Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol.20 (2008) 450-459.
Humana antitela se mogu pripremiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su generalno inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Vidite takođe, npr. US 6,075,181 i US 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; US 5,770,429 koji opisuje tehnologiju HUMAB®; US 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE® i US 2007/0061900, koji opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koja stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela mogu se takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (vidite, npr. Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. i sar. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), str. 51-63; i Boerner, P. i sar. J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B ćelije takođe su opisali Li, J. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u US 7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) je takođe opisana u Vollmers, H.P. i Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 i Vollmers, H.P. i Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
4. Antitela dobijena iz biblioteke
Antitela kao što je ovde objavljeno mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka za antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka displeja faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih metoda dat je, npr. u Hoogenboom, H.R. i sar. Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 i dalje su opisane, npr. u McCafferty, J. i sar. Nature348 (1990) 552-554; Clackson, T. i sar. Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. i sar. J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. i Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. i sar. J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. i sar. J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; i Lee, C.V. i sar. J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter, G. i sar. Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Fagi uobičajeno izlažu fragmente antitela, bilo kao fragmente jednolančanog Fv (scFv) ili kao fragmente Fab. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths, A.D. i sar. EMBO J.12 (1993) 725-734.
Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom, H.R. i Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US 5,750,373 i US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 i US 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
5. Multispecifična antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju jedan ili više ciljnih antigena. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac sa različitim specifičnostima (vidi Milstein, C. i Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, i Traunecker, A. i sar. EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), i inženjerstvo "dugme u rupici" (vidite, npr. US 5,731,168). Multispecifična antitela se takođe mogu dobiti dizajniranjem pomoću efekata elektrostatičkog upravljanja, za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004); biokonjugacijom dva ili više antitela ili fragmenata (vidite, npr. US 4,676,980, i Brennan, M. i sar. Science 229 (1985) 81-83); primenom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (vidite, npr. Kostelny, S.A. i sar. J. Immunol.
148 (1992) 1547-1553; primenom tehnologije "dijatela" za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela (vidite, npr. Holliger, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993)
1
6444-6448); i primenom jednolančanih Fv (sFv) dimera (vidite, npr. Gruber, M i sar. J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); i pripremom trispecifičnih antitela kao što opisuju, npr., Tutt, A. i sar. J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
Ovde su takođe obuhvaćena dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući "antitela hobotnice" (vidi, npr. US 2006/0025576).
Ovde dato antitelo ili fragment takođe uključuje "dvojno delujuće Fab" ili "DAF", koje sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za prvi antigen, kao i za drugi, različit antigen (vidite, na primer US 2008/0069820).
Ovde dato antitelo ili njegov fragment takođe obuhvata multispecifična antitela opisana u WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 i WO 2010/145793.
6. Fc region i varijante antitela
U pojedinim otelotvorenjima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci Fc regiona ili antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja antigena i/ili druge biološke osobine antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci Fc regiona ili antitela mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, izbacivanja, i/ili ubacivanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama Fc regiona ili antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen-vezujuće.
a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja
U pojedinim otelotvorenjima, date su varijante Fc regiona ili antitela koje imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli u nastavku pod naslovom „poželjne supstitucije”. Veće izmene su date u sledećoj Tabeli pod naslovom "Primeri supstitucija", i kako je dalje opisano ispod u odnosu na klase bočnih lanaca aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA.
2
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog niza: (1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog Fc regiona ili antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Uopšteno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matični Fc region ili antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog Fc regiona ili antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutiran, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti na "žarištima" HVR, tj. ostacima kodiranim kodonima koji trpe mutaciju sa visokom učestalošću tokom procesa somatskog sazrevanja (vidi, npr. Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), i/ili ostacima koji ostvaruju kontakt sa antigenom, pri čemu se dobijene varijante VH ili VL ispituju na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka su opisali, npr. Hoogenboom, H.R. i sar. u Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. U nekim otelotvorenjima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze alaninom ili modelovanja. Posebno su često cilj CDR-H3 i CDR-L3.
U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja mogu se desiti u jednom ili više HVR-ova, dokle god takve izmene znatno ne smanje sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne smanjuju znatno afinitet vezivanja mogu se načiniti u HVR-ima. Takve
4
izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim otelotvorenjima varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona Fc regiona ili antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove "ciljana mutageneza sa alaninom", i opisali su je Cunningham, B.C. i Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na željeno biološko svojstvo, kao što je npr. interakcija antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, može se koristiti kristalna struktura Fc regiona ili antitela koja sadrži kompleks za identifikaciju kontaktnih tačaka. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih ubacivanja uključuju Fc region ili antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula Fc regiona ili antitela uključuju fuziju sa N- ili C-krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot Fc regiona ili antitela u serumu.
b) Varijante glikozilacije
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dati Fc region ili antitelo su izmenjeni da bi se povećao ili smanjio stepen do koga je Fc region ili antitelo glikozilovano. Adicija ili uklanjanje mesta glikozilacije Fc regiona ili antitela može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.
Kada antitelo uključuje Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativni Fc regioni ili antitela koje proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Vidite, npr. Wright, A. i Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Oligosaharidi mogu da uključuju različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u "osnovi" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, ovde opisane modifikacije oligosaharida u Fc regionu ili antitelu mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim osobinama.
U jednom otelotvorenju, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1 % do 80 %, od 1 % do 65 %, od 5 % do 65 % ili od 20 % do 40 %. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Vidite, npr. US 2003/0157108; US 2004/0093621. Primeri publikacija vezanih za "defukozilovane" ili "sa manjkom fukoze" varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. i sar. J. Mol. Biol.336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. i sar. Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Primeri za ćelijske linije sposobne za proizvodnju defukozilovanih antitela uključuju Lec13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka, J. i sar. Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; i WO 2004/056312, naročito u Primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (vidi, npr. Yamane-Ohnuki, N. i sar. Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. i sar. Biotechnol. Bioeng.94 (2006) 680-688; i WO 2003/085107).
Varijante Fc regiona ili antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisekciran pomoću GlcNAc. Takve varijante Fc regiona ili antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878, US 6,602,684 i US 2005/0123546. Varijante Fc regiona ili antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region su takođe date. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087, WO 1998/58964 i WO 1999/22764.
c) Varijante Fc regiona
U pojedinim otelotvorenjima, jedna ili više daljih modifikacija aminokiselina može biti uvedena u ovde dat Fc region, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju/mutaciju) na jednom ili više aminokiselinskih mesta.
U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu Fc regiona koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što su CDC i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) se mogu sprovesti kako bi se obezbedilo da Fc region ili antitelo nema FcγR vezivanje (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464, Ravetch, J.V. i Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Neograničavajući primeri za in vitro testove za procenu aktivnosti ADCC željenog molekula opisani su u US 5,500,362 (vidi, npr. Hellstrom, I. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; i Hellstrom, I. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (vidi Bruggemann, M. i sar. J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativno, mogu biti korišćeni neradioaktivni postupci analize (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes, R. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. C1q vezujući testovi mogu takođe da se izvedu da bi se potvrdilo da Fc region ili antitelo ne može da veže C1q, i stoga nema CDC aktivnost. Pogledajte, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (vidite, na primer Gazzano-Santoro, H. i sar. J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. i sar. Blood 101 (2003) 1045-1052; i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (vidi, npr. Petkova, S.B. i sar. Int.
Immunol. 18 (2006) 1759-1769).
Fc regioni ili antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US 6,737,056). Takve varijante Fc regiona uključuju Fc regione sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani "DANA" Fc region sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (US 7,332,581).
Određene varijante Fc regiona ili antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcRs su opisane (vidi npr. US 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields, R.L. i sar. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
U pojedinim otelotvorenjima, varijanta Fc regiona ili antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U nekim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US 6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie, E.E. i sar. J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus (Guyer, R.L. i sar. J. Immunol. 117 (1976) 587-593, i Kim, J.K. i sar. J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), opisana su u US 2005/0014934. Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve varijante Fc regiona uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US 7,371,826).
Vidi i Duncan, A.R. i Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; i WO 94/29351 za druge primere varijanti Fc-regiona.
d) Varijante antitela projektovane sa cisteinom
U pojedinim otelotvorenjima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. "tioMAb", kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjeno ostacima cisteina. U naročitim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je u nastavku opisano. U pojedinim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca i S400 (EU numeracija) Fc regiona teškog lanca. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u US 7,521,541.
e) Fc region i derivati antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dati Fc region ili antitelo mogu se dalje modifikovati da sadrže dodatne neproteinske ostatke koji su poznati u struci i dostupni su. Ostaci pogodni za derivatizaciju Fc regiona ili antitela uključuju, ali nisu ograničeni na hidrosolubilne polimere. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za Fc region ili antitelo može da varira, i ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, ali se ne ograničavajući na naročite osobine ili funkcije Fc regiona ili antitela koje treba poboljšati, da li će derivat Fc regiona ili antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugom otelotvorenju, dati su konjugati Fc regiona ili antitela i jednog ili više neproteinskih ostataka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski deo je ugljenična nanocevčica (Kam, N.W. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.
f) Heterodimerizacija
Postoji nekoliko pristupa za modifikacije CH3 radi sprovođenja heterodimerizacije, koji su dobro opisani npr. u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Tipično, u svim takvim pristupima, i prvi CH3 domen i drugi CH3 domen su konstruisani na komplementaran način, tako da svaki CH3 domen (ili teški lanac koji ga sadrži) više ne može da se homodimerizuje sam sa sobom, već je primoran da se heterodimerizuje sa komplementarno projektovanim drugim CH3 domenom (tako da se prvi i drugi CH3 domen heterodimerizuju, i nema homodimera između prva dva ili druga dva CH3 domena). Ovi različiti pristupi za poboljšanje heterodimerizacije teškog lanca se razmatraju kao različite alternative u kombinaciji sa modifikacijama teškog-lakog lanca (VH i VL razmena/zamena u jednom vezujućem kraku, i uvođenje supstitucija naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem u međupovršinu CH1/CL) u multispecifičnim antitelima prema pronalasku, što smanjuje pogrešno povezivanje lakog lanca i sporedne proizvode tipa Bens Džons.
U jednom poželjnom otelotvorenju ovog pronalaska (u slučaju da multispecifično antitelo sadrži CH3 domene u teškim lancima) CH3 domeni pomenutog multispecifičnog antitela prema pronalasku mogu biti promenjeni tehnologijom "dugme u rupici" koja je detaljno opisana sa nekoliko primera u npr. WO 96/027011, Ridgway, J.B. i sar. Protein Eng.
9 (1996) 617-621; i Merchant, A.M. i sar. Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; WO 98/ 050431. U ovoj metodi, interakcijske površine dva CH3 domena su izmenjene kako bi se povećala heterodimerizacija oba teška lanca koji sadrže ova dva CH3 domena. Svaki od dva CH3 domena (iz dva teška lanca) može biti „dugme“, dok je drugi „rupica“. Uvođenje disulfidnog mosta dodatno stabilizuje heterodimere (Merchant, A.M. i sar. Nature Biotech.16 (1998) 677-681; Atwell, S. i sar. J. Mol. Biol.270 (1997) 26-35) i povećava prinos.
Tako, u jednom otelotvorenju ovog pronalaska navedeno multispecifično antitelo (sadrži CH3 domen u svakom teškom lancu i) je dalje okarakterisano time što
prvi CH3 domen prvog teškog lanca antitela pod a) i drugi CH3 domen drugog teškog lanca antitela pod b) se susreću na međupovršini koja sadrži originalnu međupovršinu između CH3 domena antitela.
pri čemu je navedena međupovršina izmenjena da promoviše formiranje multispecifičnog antitela, pri čemu je promena okarakterisana time što:
i) CH3 domen jednog teškog lanca je izmenjen,
tako da unutar originalne međupovršine CH3 domena jednog teškog lanca koji se sreće sa originalnom međupovršinom CH3 domena drugog teškog lanca unutar multispecifičnog antitela,
aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veću zapreminu bočnog lanca, usled čega nastaje izbočina u međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca koja se može pozicionirati u šupljinu u međupovršini CH3 domena drugog teškog lanca
i
ii) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen,
tako da unutar originalne međupovršine drugog CH3 domena koji se sreće sa originalnom međupovršinom prvog CH3 domena unutar multispecifičnog antitela aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manju zapreminu bočnog lanca, čime se generiše šupljina u međupovršini drugog CH3 domena u koju se može pozicionirati izbočina u međupovršini prvog CH3 domena.
Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima veću zapreminu bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y), triptofana (W).
Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima manju zapreminu bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).
U jednom aspektu ovog pronalaska, oba CH3 domena su dalje izmenjena uvođenjem cisteina (C) kao aminokiseline u odgovarajuće položaje svakog CH3 domena, tako da se može formirati disulfidni most između oba CH3 domena.
U jednom poželjnom otelotvorenju, pomenuto multispecifično antitelo sadrži aminokiselinsku mutaciju T366W u prvom CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i aminokiselinske mutacije T366S, L368A, Y407V u drugom CH3 domenu "lanca sa rupicom". Može se koristiti i dodatni međulančani disulfidni most između CH3 domena (Merchant, A.M. i sar. Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), npr. uvođenjem aminokiselinske mutacije Y349C u CH3 domenu "lanca sa rupicom" i aminokiselinske mutacije E356C ili aminokiselinske mutacije S354C u CH3 domenu "lanca sa dugmetom".
U jednom poželjnom otelotvorenju, navedeno multispecifično antitelo (koje sadrži CH3 domen u svakom teškom lancu) sadrži aminokiselinske mutacije S354C, T366W u jednom od dva CH3 domena i aminokiselinske mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena (dodatna aminokiselinska mutacija S354C u jednom CH3 domenu i dodatna aminokiselinska mutacija Y349C u drugom CH3 domenu formiraju međulančani disulfidni most) (numeracija prema Kabatu).
Ostale tehnike modifikacije CH3 za sprovođenje heterodimerizacije su razmatrane kao alternative pronalasku, i opisane su npr. u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u
1
EP 1 870 459A1. Ovaj pristup se zasniva na uvođenju supstitucija/mutacija naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem na specifičnim aminokiselinskim položajima na međupovršini CH3/CH3 domena između oba teška lanca. Jedno poželjno otelotvorenje za navedeno multispecifično antitelo su aminokiselinske mutacije R409D, K370E u prvom CH3 domenu (multispecifičnog antitela) i aminokiselinske mutacije D399K, E357K u drugom CH3 domenu multispecifičnog antitela (numeracija prema Kabatu).
U drugom otelotvorenju, navedeno multispecifično antitelo sadrži aminokiselinsku mutaciju T366W u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i aminokiselinske mutacije T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu "lanca sa rupicom" i dodatno aminokiselinske mutacije R409D, K370E u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i aminokiselinske mutacije D399K, E357K u CH3 domenu "lanca sa rupicom".
U drugom otelotvorenju, navedeno multispecifično antitelo sadrži aminokiselinske mutacije S354C, T366W u jednom od dva CH3 domena i aminokiselinske mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena ili pomenuto multispecifično antitelo sadrži aminokiselinske mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i aminokiselinske mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena i dodatno aminokiselinske mutacije R409D, K370E u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i aminokiselinske mutacije D399K, E357K u CH3 domenu "lanca sa rupicom".
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO2013/157953. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366K, i drugi polipeptid CH3 domena sadrži aminokiselinsku mutaciju L351D. U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži dalju aminokiselinsku mutaciju L351K. U daljem otelotvorenju, drugi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju izabranu od Y349E, Y349D i L368E (poželjno L368E).
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO2012/058768. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem otelotvorenju, drugi CH3 domen sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju na položaju T411, D399, S400, F405, N390, ili K392 npr. odabranu od a) T411 N, T411 R, T411Q, T411 K, T411D, T411E ili T411W, b) D399R, D399W, D399Y ili D399K, c) S400E, S400D, S400R, ili S400K F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ili F405W N390R, N390K ili N390D K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E. U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366V, K409F. U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži
2
aminokiselinsku mutaciju Y407A, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem otelotvorenju, drugi CH3 domen sadrži dalje aminokiselinske mutacije K392E, T411E, D399R i S400R.
U jednom otelotvorenju, heterodimerizacioni pristup opisan u WO2011/143545 koristi se alternativno, npr. sa aminokiselinskom modifikacijom u položaju izabranom iz grupe koja se sastoji od 368 i 409.
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO2011/090762, koji takođe koristi gore opisanu tehnologiju dugmeta u rupici. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366W, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije Y407A. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366Y, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije Y407T.
U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo je izotipa IgG2, a heterodimerizacioni pristup opisan u WO2010/129304 može se koristiti alternativno.
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO2009/089004. U jednom otelotvorenju, prvi CH3 domen uključuje aminokiselinsku supstituciju K392 ili N392 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K392D ili N392D), i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku supstituciju D399, E356, D356 ili E357 sa pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (npr. lizin (K) ili arginin (R), poželjno D399K, E356K, D356K, ili E357K, i još poželjnije D399K i E356K). U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju K409 ili R409 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K409D ili R409D). U daljem otelotvorenju, prvi CH3 domen dodatno ili alternativno sadrži aminokiselinsku supstituciju K439 i/ili K370 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D)).
U jednom otelotvorenju, može alternativno da se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO2007/147901. U jednom otelotvorenju prvi CH3 domen sadrži mutacije aminokiselina K253E, D282K i K322D, i drugi CH3 domen sadrži mutacije aminokiselina D239K, E240K i K292D.
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO2007/110205.
Rekombinantni postupci i formulacije
Fc regioni i antitela se mogu proizvesti upotrebom rekombinantnih postupaka i formulacija, npr. kao što je opisano u US 4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina (kiseline) koja kodira ovde opisani Fc region ili antitelo. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećem otelotvorenju obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela, naznačen time što postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju varijante Fc regiona, nukleinska kiselina koja kodira varijantu Fc regiona, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu selektivno da se vežu za gene koji kodiraju polipeptide varijante Fc regiona ili teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, vidite npr. US 5,648,237, US 5,789,199 i US 5,840,523 (vidite takođe Charlton, K.A. u: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), str. 245-254, koji opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.). Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitelo, uključujući
4
sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije "humanizovani", što dovodi do proizvodnje antitela sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Vidi Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; i Li, H. i sar. Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog Fc regiona ili antitela, isto tako, izvedene su iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Vidite, npr. US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 i US 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linije bubrega majmuna transformisane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije bubrega (ćelije HEK293 ili 293, kao što je opisano u npr. Graham, F.L. i sar. J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), sertoli ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano u npr. Mather, J.P., Biol. Reprod.23 (1980) 243-252), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije burega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što je opisano u npr. Mather, J.P. i sar. Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub, G. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr. Yazaki, P. i Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), str.255-268.
Testovi
Antitela koja su ovde data mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
U jednom aspektu, antitelo kao što je ovde objavljeno ispitano je da se odredi njegova antigen vezujuća aktivnost, npr. poznatim postupcima kao što je ELISA, vestern blot, itd. Imunokonjugati
Pronalazak takođe daje imunokonjugate, uključujući antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
U jednom otelotvorenju, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na, majtanzinoid (vidi US 5,208,020, US 5,416,064 i EP 0 425 235 B1); auristatin, kao što su funkcionalni ostaci leka monometil auristatina DE i DF (MMAE i MMAF) (vidite US 5,635,483, US 5,780,588 i US 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (vidi US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001 i US 5,877,296; Hinman, L.M. i sar. Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; i Lode, H.N. i sar. Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (vidite Kratz, F. i sar. Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. i sar. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. i sar. Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. i sar. Bioorg.& Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. i sar. J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; i US 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecene i CC1065.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući, ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, diantin proteine, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer TC<99m>ili I<123>, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina se može dobiti kao što opisuju Vitetta, E.S. i sar. Science 238 (1987) 1098-1104. Ugljenikom 14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO 94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselo labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari, R.V. i sar. Cancer Res.
52 (1992) 127-131; US 5,208,020).
Imunokonjugati ili ADC koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za unakrsne linkere koji uključuju, ali nisu ograničeni na BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD).
Postupci i formulacije za dijagnostiku i detektovanje
U pojedinim otelotvorenjima, svako od antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje prisustva njemu srodnog/srodnih antigena u biološkom uzorku. Termin "detekcija" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo.
U jednom otelotvorenju, dato je antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju.
U određenim otelotvorenjima, obezbeđena su obeležena antitela kao što je ovde objavljeno. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (US 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.
Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije antitela kako je ovde opisano pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. (izd.) (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecil dimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je poli(vinilpirolidon); aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rhuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i postupke primene, uključujući rhuPH20, opisuje US 2005/0260186 i US 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela su opisani u US 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US 6,171,586 i WO 2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno mikrokapsula poli(metilmetakrilata), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, a te matrice su u određenom obliku, npr. film ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
Postupci lečenja i formulacije
Svako od antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u postupcima lečenja. U jednom aspektu, obezbeđena su antitela kao što je ovde opisano za upotrebu kao lek.
U pojedinim otelotvorenjima, dato je antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U jednom takvom otelotvorenju, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja je u jednom poželjnom otelotvorenju čovek.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela u proizvodnji ili pripremi leka. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih antitela, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih antitela i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Antitela kao što je ovde objavljeno se mogu koristiti sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo kao što je ovde objavljeno može biti primenjeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens.
Antitelo kao što je ovde objavljeno (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela kao što je ovde objavljeno bi bila formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99 % doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela kako je ovde opisano (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitela, i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,5 mg/kg-10 mg/kg) antitela može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto antitela ili kao njegovog dodatka.
Proizvodi
U drugom aspektu kao što je ovde objavljeno, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje goreopisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži formulaciju koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom formulacijom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u formulaciji je antitelo kao što je ovde opisano. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se formulacija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa formulacijom koja se u njemu nalazi, pri čemu formulacija sadrži antitelo, kao što je ovde opisano; i (b) drugo pakovanje sa formulacijom koja se u njemu nalazi, pri čemu formulacija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju kao što je ovde objavljeno može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da formulacija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da svaki od proizvoda pomenutih u prethodnom tekstu može da sadrži imunokonjugat kao što je ovde objavljeno, umesto ili pored antitela kao što je ovde objavljeno.
1
III. SPECIFIČNA OTELOTVORENJA
1. Fc region klase IgG koji sadrži polipeptid prve varijante Fc regiona i polipeptid druge varijante Fc regiona,
pri čemu
a) polipeptid prve varijante Fc regiona je izveden iz prvog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG i polipeptid druge varijante Fc regiona je izveden iz drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, pri čemu je prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG identičan ili različit od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, i
b) polipeptid prve varijante Fc regiona se razlikuje od polipeptida druge varijante Fc regiona u jednom ili više aminokiselinskih ostataka, osim onih aminokiselinskih ostataka u kojima se prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG razlikuje od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, i
c) Fc region klase IgG koji sadrži polipeptid prve varijante Fc regiona i polipeptid druge varijante Fc regiona ima afinitet prema humanom Fc receptoru koji se razlikuje od Fc regiona klase IgG koji sadrži prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a) i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a),
pri čemu ili prvi polipeptid Fc regiona ili drugi polipeptid Fc regiona ili oba polipeptida Fc regiona sadrže nezavisno jedan od drugog sledeću kombinaciju mutacija:
- T307H i N434H.
2. Fc region klase IgG prema otelotvorenju 1, pri čemu je humani Fc receptor humani neonatalni Fc receptor (FcRn) ili humani FcgamaIII receptor (FcγRIII).
3. Fc region klase IgG klase prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 2, pri čemu je humani Fc receptor humani neonatalni Fc receptor.
4. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 3, pri čemu se afinitet Fc regiona klase IgG koji sadrži polipeptid prve varijante Fc regiona i polipeptid druge varijante Fc regiona prema humanom Fc receptoru povećava ili smanjuje za 10% ili više, utvrđeno površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), u poređenju sa afinitetom Fc regiona klase IgG koji sadrži prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a) i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a).
5. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 4, pri čemu barem neki od onih aminokiselinskih ostataka u kojima se prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG razlikuje od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG promoviše formiranje heterodimernog Fc regiona klase IgG.
6. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 5, pri čemu
2
i) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je izabran iz grupe koja sadrži - polipeptid Fc regiona humanog IgG1,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG2,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG3,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama S354C, T366S, L368A, Y407V, - polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, S354C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, - polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S354C, T366S, L368A, Y407V, - polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, S354C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, S354C, T366S, L368A, Y407V,
- humani IgG1, IgG2 ili IgG4 sa mutacijom K392D, i
- humani IgG3 sa mutacijom N392D,
i
ii) drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je izabran iz grupe koja sadrži - polipeptid Fc regiona humanog IgG1,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG2,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG3,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama S354C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama Y349C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, S354C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, Y349C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, - polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, S354C, T366W, - polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, Y349C, T366W, - polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, S354C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, Y349C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G,
4
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S354C, T366W, - polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama Y349C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, S354C, T366W, - polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, Y349C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, S354C, T366W, - polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, Y349C, T366W, - polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, S354C, T366W,
- polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, Y349C, T366W,
- humani IgG1 sa mutacijama D399K, D356K i/ili E357K, i
- humani IgG2, IgG3 ili IgG4 sa mutacijama D399K, E356K i/ili E357K.
7. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 6, pri čemu
i) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1, ili
ii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, ili
iii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, ili
iv) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, S354C, T366W i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V, ili
v) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, S354C, T366W i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, ili
vi) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4, ili
vii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, ili
viii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, ili
ix) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, S354C, T366W, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V, ili
x) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, S354C, T366W, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V.
8. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 7, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona ili drugi polipeptid Fc regiona ili oba polipeptida Fc regiona sadrže jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
9. Fc region kase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 8, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži nezavisno od drugog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih mutacija ili kombinacija mutacija:
- T307H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H i M252Y i S254T i T256E,
i
drugi polipeptid Fc regiona obuhvata nezavisno od prvog polipeptida Fc regiona jednu od sledećih mutacija ili kombinaciju mutacija
- T307H, ili
- T307Q, ili
- Q311H, ili
- E430H, ili
- N434H, ili
- T307H i Q311H, ili
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H, ili
- T307H i M252Y i S254T i T256E, ili
- Q311H i M252Y i S254T i T256E, ili
- E430 H i M252Y i S254T i T256E, ili
- N434H i M252Y i S254T i T256E.
10. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 9, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- nijednu, ili
- M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A,
i
jednu od sledećih kombinacija mutacija:
- T307H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H,
i drugi polipeptid Fc regiona sadrži
jednu od sledećih mutacija ili kombinacija mutacija:
- nijednu, ako prvi polipeptid Fc regiona sadrži najmanje jednu mutaciju, ili
- T307H, ili
- T307Q, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo mutaciju T307Q, ili - Q311H, ili
- E430 H, ili
- N434H, ili
- T307H i Q311H, ili
- T307H i E430H, ili
- T307H i N434A, ili
- T307H i N434H, ili
- T307Q i Q311H, ili
- T307Q i E430H, ili
- T307Q i N434H, ili
- T307Q i N434A, ili
- M252Y i S254T i T256E, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija M252Y i S254T i T256E, ili
- I253A i H310A i H435A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija I253A i H310A i H435A, ili
- H310A i H433A i Y436A, ako prvi polipeptid Fc regiona ne sadrži isključivo kombinaciju mutacija H310A i H433A i Y436A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307H i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434A, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434H, ili
- T307Q i Q311H i E430H i N434Y, ili
- T307Q i V308P i N434Y i Y436H.
11. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 10, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije M252Y i S254T i T256E.
12. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 10, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije M252Y i S254T i T256E.
13. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 10, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i Q311H i E430H i N434H.
14. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 10, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H.
15. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 10, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E i drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
16. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 10, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H.
17. Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 10, pri čemu prvi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T307H i N434H i M252Y i S254T i T256E.
18. Antitelo koje sadrži Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 17.
19. Antitelo prema otelotvorenju 18, pri čemu je antitelo monoklonsko antitelo.
20. Antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 18 do 19, pri čemu je antitelo humano, humanizovano ili himerno antitelo.
21. Antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 18 do 20, naznačeno time što je antitelo bispecifično antitelo.
22. Antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 18 do 21, naznačeno time što je antitelo dvovalentno antitelo.
23. Fuzioni polipeptid Fc regiona koji sadrži Fc region klase IgG prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 17.
24. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 18 do 22 ili fuzioni polipeptid Fc regiona prema otelotvorenju 23.
25. Farmaceutska formulacija prema otelotvorenju 24, naznačena time što je farmaceutska formulacija za upotrebu u lečenju vaskularnih bolesti oka.
26. Antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 18 do 22 ili fuzioni polipeptid Fc regiona prema otelotvorenju 23 za upotrebu kao lek.
27. Antitelo za upotrebu prema otelotvorenju 26, pri čemu je upotreba za lečenje vaskularnih bolesti oka.
28. Upotreba antitela prema bilo kom od otelotvorenja 18 do 22 ili fuzionog polipeptida Fc regiona prema otelotvorenju 23 u proizvodnji leka.
29. Upotreba prema otelotvorenju 28, pri čemu je upotreba za proizvodnju leka za lečenje vaskularnih bolesti oka.
30. Antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 18 do 22 ili fuzioni polipeptid Fc regiona prema otelotvorenju 23 za upotrebu u lečenju vaskularnih bolesti oka.
IV. PRIMERI
U nastavku su dati primeri za postupke i formulacije iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razna druga otelotvorenja, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.
Iako je gornji pronalazak opisan prilično detaljno putem ilustracije i pomoću primera koji bi olakšali razumevanje, opisi i primeri ne treba da se tumače kao ograničavajući za obim primene pronalaska kao što je ovde objavljeno.
Postupci
Masena spektrometrija elektrosprej jonizacijom (ESI-MS)
Alikvoti proteina (50 µg) su deglikozilovani dodavanjem 0,5 µl N-glikanaze plus (Roche) i natrijum fosfatnog pufera (0,1 M, pH 7,1) da bi se dobio konačni volumen uzorka od 115 µl. Smeša je inkubirana na 37°C tokom 18 h. Nakon toga, za redukciju i denaturisanje je dodato 60 µl 0,5 M TCEP (Pierce) u 4 M gvanidin x HCl (Pierce) i 50 µl 8 M gvanidin x HCl. Smeša je inkubirana na 37°C tokom 30 minuta. Uzorci su desalinizovani pomoću gel hromatografije (sefaroza G-25, izokratski, 40% acetonitril sa 2% mravlje kiseline). ESI maseni spektri (+ve) snimljeni su na Q-TOF instrumentu (maXis, Bruker) opremljenom nano ESI izvorom (TriVersa NanoMate, Advion). Postavke MS parametara su bile sledeće: Transfer: Levak RF, 400 Vpp; ISCID energija, 0 eV; multipol RF, 400 Vpp; kvadrupol: jonska energija, 4,0 eV; mala masa, 600 m/z; izvor: suvi gas, 8 l/min; temperatura suvog gasa, 160°C; koliziona ćelija: koliziona energija, 10 eV; kolizioni RF: 2000 Vpp; jonski hladnjak: jonski hladnjak RF, 300 Vpp; vreme prenosa: 120 µs; Pre Puls skladištenje, 10 µs; opseg skeniranja m/z 600 do 2000. Za procenu podataka korišćen je interni softver (MassAnalyzer).
Analiza FcRn površinskom plazmonskom rezonancom (SPR)
Svojstva vezivanja antitela divljeg tipa i mutanata za FcRn analizirana su tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) korišćenjem instrumenta BIAcore T100 (BIAcore AB, Uppsala, Švedska). Ovaj sistem je dobro poznat za proučavanje molekulskih interakcija. On omogućava kontinuirano praćenje vezivanja liganda/analita u realnom vremenu, a time i određivanje kinetičkih parametara u različitim postavkama analize. SPR tehnologija se zasniva na merenju indeksa prelamanja blizu površine zlatom premazanog biosenzorskog čipa. Promene u indeksu prelamanja ukazuju na masene promene na površini uzrokovane interakcijom imobilisanog liganda i analita injektovanog u rastvor. Ako se molekuli vežu za imobilisani ligand na površini masa se povećava, u slučaju disocijacije masa se smanjuje. U tekućem testu, receptor FcRn je imobilisan na BIAcore CM5 biosenzorskom čipu (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Švedska) putem aminskog kuplovanja na nivou od 400 jedinica odgovora (RU). Test je izveden na sobnoj temperaturi sa PBS, 0,05% Tween-20TM pH 6,0 (GE Healthcare Bioscience) kao puferom za rad i razblaživanje. 200 nM uzoraka antitela je injektovano pri protoku od 50 µl/min na sobnoj temperaturi. Vreme asocijacije je bilo 180 sekundi, faza disocijacije je trajala 360 sekundi. Regeneracija površine čipa postignuta je kratkim injektovanjem HBS-P, pH 8,0. Procena podataka SPR je izvršena poređenjem visine signala biološkog odgovora 180 sekundi nakon injektovanja i 300 sekundi nakon injektovanja. Odgovarajući parametri su maksimalni nivo RU (180 sekundi nakon injektovanja) i kasna stabilnost (300 sekundi po završetku injektovanja).
Analiza proteina A površinskom plazmonskom rezonancom (SPR)
Test se zasniva na površinskoj plazmonskoj rezonantnoj spektroskopiji. Protein A je imobilisan na površini SPR biosenzora. Injektovanjem uzorka u protočne ćelije SPR spektrometra formira se kompleks sa imobilisanim proteinom A, što dovodi do povećanja mase na površini senzorskog čipa, a time i do većeg odgovora (1 RU je definisana kao 1 pg/mm<2>). Nakon toga se senzorski čip regeneriše rastvaranjem kompleksa uzorak-protein A. Dobijeni odgovori se zatim procenjuju, kako bi se uočio najviši signal u jedinicama odgovora (RU) i ponašanje disocijacije.
Oko 3500 jedinica odgovora (RU) proteina A (20 µg/ml) je vezano za CM5 čip (GE Healthcare) na pH 4,0 upotrebom kompleta za kuplovanje amina GE Healthcare.
Uzorak i sistemski pufer su bili HBS-P+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 0,005% surfaktant P20 sterilno-filtriran, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25°C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12°C. Sistem je napunjen radnim puferom. Zatim je 5 nM rastvora konstrukata uzorka injektovano tokom 120 sekundi sa protokom od 30 µl/min, nakon čega sledi faza disocijacije od 300 sekundi. Tada je površina senzorskog čipa regenerisana pomoću dve duge injekcije glicin-HCl pH 1,5 od po 30 sekundi pri protoku od 30 µl/min. Svaki uzorak je meren u triplikatu.
Termin "sa mutacijom IHH-AAA" kako se ovde koristi odnosi se na kombinaciju mutacija I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) i H435A (His435Ala) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG1 ili IgG4 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), termin "sa mutacijom HHY-AAA" kako se ovde koristi odnosi se na kombinaciju mutacija H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) i Y436A (Tyr436Ala) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG1 ili IgG4 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), termin "sa mutacijom P329G LALA" kako se ovde koristi odnosi se na kombinaciju mutacija L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) i P329G (Pro329Gly) u konstantnom regionu teškog lanca
1
potklase IgG1 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), a termin "sa mutacijom SPLE" kako se ovde koristi odnosi se na kombinaciju mutacija S228P (Ser228Pro) i L235E (Leu235Glu) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG4 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Opšte
Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Aminokiselinski ostaci lanaca antitela su označeni prema numeraciji EU (Edelman, G.M. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Tehnike rekombinantne DNK
Standardne metode su korišćene za manipulaciju DNK kako je opisano u Sambrook, J. i sar. Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača.
Genska sinteza
Željeni segmenti gena su naručeni u skladu sa datim specifikacijama od Geneart (Regensburg, Nemačka).
Određivanje sekvence DNK
Sekvence DNK su određene dvolančanim sekvenciranjem obavljenim u MediGenomix GmbH (Martinsried, Nemačka) ili SequiServe GmbH (Vaterstetten, Nemačka).
Analiza DNK i sekvenci proteina i upravljanje podacima o sekvenci
Softverski paket GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) verzija 10.2 i Infomax Vector NT1 Advance suite verzija 8.0 su korišćeni za kreiranje sekvenci, mapiranje, analizu, označavanje i ilustraciju.
Ekspresioni vektori
Za ekspresiju opisanih antitela korišćeni su ekspresioni plazmidi za prolaznu ekspresiju (npr. u HEK293-F ćelijama) koji se baziraju ili na organizaciji kDNK sa CMV-Intron A promoterom ili bez njega ili na genomskoj organizaciji sa CMV promoterom.
Jedinica transkripcije gena antitela se sastoji od sledećih elemenata:
- jedinstvenog restrikcionog mesta na 5' kraju,
2
- trenutnog ranog pojačivača i promotera iz humanog citomegalovirusa, - u slučaju organizacije kDNK Intron A sekvence,
- 5'-netranslatovanog regiona humanog imunoglobulinskog gena,
- nukleinske kiseline koja kodira signalnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca, - nukleinske kiseline koja kodira lanac humanog antitela (divlji tip ili sa razmenom domena) ili kao kDNK ili u genomskoj organizaciji sa imunoglobulinskom organizacijom ekson-intron,
- 3' netranslatovanog regiona sa poliadenilacionom signalnom sekvencom, i
- jedinstvenog restrikcionog mesta na 3' kraju.
Osim ekspresione kasete antitela, plazmidi su sadržali:
- poreklo replikacije koje omogućava replikaciju tog plazmida u E. coli,
- ß-laktamazni gen koji daje otpormost na ampicilin u E. coli, i
- gen dihidrofolat reduktaze iz Mus musculus kao selektabilni marker u eukariotskim ćelijama.
Nukleinske kiseline koje kodiraju lance antitela su generisane PCR-om i/ili sintezom gena i sastavljene poznatim rekombinantnim metodama i tehnikama povezivanjem odgovarajućih segmenata nukleinske kiseline, npr. upotrebom jedinstvenih restrikcionih mesta u odgovarajućim vektorima. Sekvence subklonirane nukleinske kiseline verifikovane su sekvenciranjem DNK. Za prolazne transfekcije su pripremljene veće količine plazmida putem pripreme plazmida iz transformisanih kultura E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).
Tehnike gajenja ćelija
Standardne tehnike gajenja ćelija su korišćene kako je opisano u Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. i Yamada, K.M. (izd.), John Wiley & Sons, Inc.
Bispecifična antitela su eksprimirana tranzijentnom kotransfekcijom odgovarajućih ekspresionih plazmida u HEK293-F ćelijama koje rastu u suspenziji kao što je opisano u nastavku.
Primer 1
Ekspresija i prečišćavanje
Prolazne transfekcije u HEK293-F sistemu
Monospecifična i bispecifična antitela su generisana tranzijentnom transfekcijom sa odgovarajućim plazmidima (npr. kodiranje teškog i modifikovanog teškog lanca, kao i odgovarajućeg lakog i modifikovanog lakog lanca) korišćenjem HEK293-F sistema (Invitrogen) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, HEK293-F ćelije (Invitrogen) koje rastu u suspenziji bilo u posudi za mućkanje ili uz mešanje u fermentoru bez seruma u ekspresionom medijumu FreeStyle™ 293 (Invitrogen) transficirane su mešavinom odgovarajućih ekspresionih plazmida i reagensa 293fectin™ ili fektina ( Invitrogen). U balonima od 2 l (Corning), HEK293-F ćelije su zasejane pri gustini od 1x10<6>ćelija/ml u 600 ml, i inkubirane na 120 o/min, 8% CO2. Sledećeg dana nakon što su ćelije transficirane pri gustini ćelija od oko 1,5x10<6>ćelija/ml sa oko 42 ml smeše A) 20 ml Opti-MEM (Invitrogen) sa 600 µg ukupne plazmidne DNK (1 µg/ml) koja kodira teški ili modifikovani teški lanac, odnosno odgovarajući laki lanac u ekvimolarnom odnosu i B) 20 ml Opti-MEM sa 1,2 ml 293 fektina ili fektina (2 µl/ml). U skladu sa potrošnjom glukoze, dodat je rastvor glukoze tokom fermentacije. Supernatant koji sadrži izlučeno antitelo je sakupljen nakon 5-10 dana, i antitela su direktno prečišćena od supernatanta, ili je supernatant zamrznut i uskladišten.
Prečišćavanje
Bispecifična antitela su prečišćena iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, koristeći MabSelectSure-Sepharose™ (za ne-IHH-AAA mutante) (GE Healthcare, Švedska) ili kapaselekt agarozu (za IHH-AAA mutante) (GE Healthcare, Švedska), hromatografiju hidrofobnih interakcija koristeći butil sefarozu (GE Healthcare, Švedska) i gel hromatografiju na Superdex 200 (GE Healthcare, Švedska).
Ukratko, sterilno filtrirani supernatanti ćelijskih kultura su uhvaćeni na MabSelectSuRe smoli ekvilibrisanoj (ne-IHH-AAA mutacije i antitela divljeg tipa) PBS puferom (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl, pH 7,4), isprani puferom za ekvilibraciju i eluirani 25 mM natrijum citratom na pH 3,0. IHH-AAA mutanti su uhvaćeni na KappaSelect smoli ekvilibrisanoj sa 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,2, isprani puferom za ekvilibraciju i eluirani 25 mM natrijum citratom pH 2,9. Eluirane frakcije antitela su spojene i neutralisane pomoću 2 M Tris, pH 9,0. Spojena antitela su pripremljena za hromatografiju hidrofobnih interakcija dodavanjem 1,6 M rastvora amonijum sulfata do konačne koncentracije od 0,8 M amonijum sulfata, i pH je podešen na pH 5,0 pomoću sirćetne kiseline. Nakon ekvilibracije smole butil sefaroze 35 mM natrijum acetatom, 0,8 M amonijum sulfatom, pH 5,0, antitela su naneta na smolu, isprana puferom za ekvilibraciju i eluirana linearnim gradijentom do 35 mM natrijum acetata pH 5,0. Frakcije koje sadrže (monospecifično ili bispecifično) antitelo su spojene i dalje prečišćene gel hromatografijom koristeći kolonu Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Švedska) ekvilibrisanu 20 mM histidinom, 140 mM NaCl, pH 6,0. Frakcije koje sadrže (monospecifično ili bispecifično) antitelo su sakupljene, koncentrovane do potrebne koncentracije koristeći Vivaspin
4
ultrafiltracione uređaje (Sartorius Stedim Biotech SA, Francuska) i čuvane na -80°C.
Čistoća i integritet antitela su analizirani nakon svakog koraka prečišćavanja pomoću CE-SDS koristeći mikrofluidnu Labchip tehnologiju (Caliper Life Science, SAD). Za analizu CE-SDS pripremljeno je pet µL rastvora proteina pomoću kompleta reagensa HT Protein Express prema uputstvu proizvođača, i analizirani su na LabChip GXII sistemu koristeći HT Protein Express Chip. Podaci su analizirani pomoću softvera LabChip GX.
Sadržaj agregata u uzorcima antitela analiziran je visokoefikasnom gel hromatografijom koristeći kolonu Superdex 200 analitičke veličine (GE Healthcare, Švedska) u 2xPBS (20 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 274 mM NaCl i 5,4 mM KCl, pH 7,4) radni pufer na 25°C.25 µg proteina je injektovano na kolonu pri protoku od 0,75 ml/min i eluirano izokratski tokom 50 minuta.
Primer 2
Hromatografija FcRn
Vezivanje za streptavidin sefarozu:
Jedan gram streptavidin sefaroze (GE Healthcare) dodat je u biotinilovani i dijalizirani receptor, i inkubiran je dva sata uz trešenje. Sefaroza derivatizovana receptorom je napunjena u XK kolonu od 1 ml (GE Healthcare).
Hromatografija pomoću FcRn afinitetne kolone:
Uslovi:
dimenzije 50 mm x 5 mm
kolone:
visina sloja: 5 cm
punjenje: 50 µg uzorka
pufer za 20 mM MES, sa 150 mM NaCl, podešen na pH 5,5
ekvilibraciju:
pufer za 20 mM Tris/HCl, sa 150 mM NaCl, podešen na pH 8,8
eluiranje:
eluiranje: 7,5 zapremina kolone pufera za ekvilibraciju, u 30 zapremina kolone do 100% pufera za eluiranje, 10 zapremina kolone pufera za eluiranje
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
�

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Fc region klase IgG koji sadrži polipeptid prve varijante Fc regiona i polipeptid druge varijante Fc regiona,
pri čemu
a) polipeptid prve varijante Fc regiona je izveden iz prvog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG i polipeptid druge varijante Fc regiona je izveden iz drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, pri čemu je prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG identičan ili različit od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, i
b) polipeptid prve varijante Fc regiona se razlikuje od polipeptida druge varijante Fc regiona u jednom ili više aminokiselinskih ostataka, osim onih aminokiselinskih ostataka u kojima se prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG razlikuje od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG, i
c) Fc region klase IgG koji sadrži polipeptid prve varijante Fc regiona i polipeptid druge varijante Fc regiona ima afinitet prema humanom Fc receptoru koji se razlikuje od Fc regiona klase IgG koji sadrži prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a) i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG pod a),
pri čemu ili prvi polipeptid Fc regiona ili drugi polipeptid Fc regiona ili oba polipeptida Fc regiona sadrže nezavisno jedan od drugog sledeću kombinaciju mutacija:
- T307H i N434H.
2. Fc region klase IgG premazahtevu 1, pri čemu je humani Fc receptor humani neonatalni Fc receptor.
3. Fc-region klase IgG prema bilo kom od zahteva 1 do 2, pri čemu oni aminokiselinski ostaci u kojima se prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG razlikuje od drugog polipeptida matičnog Fc regiona klase IgG promovišu formiranje heterodimernog Fc regiona klase IgG.
4. Fc region klase IgG prema bilo kom od zahteva od 1 do 3, pri čemu
i) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je izabran iz grupe koja sadrži polipeptid Fc regiona humanog IgG1, polipeptid Fc regiona humanog IgG2, polipeptid Fc regiona humanog IgG3, polipeptid Fc regiona humanog IgG4, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama Y349C, T366S, L368A, Y407V, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama Y349C, T366S, L368A, Y407V, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, humani IgG1, IgG2 ili IgG4 sa mutacijama K392D i humani IgG3 sa mutacijom N392D, i
ii) drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je izabran iz grupe koja sadrži polipeptid Fc regiona humanog IgG1, polipeptid Fc regiona humanog IgG2, polipeptid Fc regiona humanog IgG3, polipeptid Fc regiona humanog IgG4, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama S354C, T366W, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, S354C, T366W, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama P329G, S354C, T366W, polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, S354C, T366W, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S354C, T366W, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, S354C, T366W, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama P329G, S354C, T366W, polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, S354C, T366W, humani IgG1 sa mutacijama D399K, D356K i/ili E357K i humani IgG2, IgG3 ili IgG4 sa mutacijama D399K, E356K i/ili E357K.
5. Fc region klase IgG prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu
i) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1, ili
ii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, ili
iii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog
1
IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, ili
iv) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, S354C, T366W i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V, ili
v) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, S354C, T366W i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, ili
vi) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4, ili
vii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, ili
viii) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, ili
ix) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, S354C, T366W, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V, ili
x) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, S354C, T366W, i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG4 sa mutacijama S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, ili
xi) prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1, IgG2 ili IgG4 sa mutacijom K392D ili je prvi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG polipeptid Fc regiona humanog IgG3 mutacijom N392D i drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG je polipeptid Fc regiona humanog IgG1 sa mutacijama D399K, D356K i/ili E357K ili je drugi polipeptid matičnog Fc regiona klase IgG polipeptid Fc regiona humanog IgG2, IgG3 ili IgG4 sa mutacijama D399K, E356K i/ili E357K.
6. Antitelo koje sadrži Fc region IgG klase prema bilo kom od zahteva 1 do 5.
14
7. Antitelo prema zahtevu 6, pri čemu je antitelo monoklonsko antitelo.
8. Antitelo prema bilo kom od zahteva 6 do 7, pri čemu je antitelo humano, humanizovano ili himerno antitelo.
9. Antitelo prema bilo kom od zahteva 6 do 8, pri čemu je antitelo bispecifično antitelo.
10. Antitelo prema bilo kom od zahteva 6 do 9, pri čemu je antitelo dvovalentno antitelo.
11. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 6 do 10.
12. Farmaceutska formulacija prema zahtevu 11, pri čemu je farmaceutska formulacija namenjena upotrebi u lečenju vaskularnih bolesti oka.
13. Antitelo prema bilo kom od zahteva 6 do 10 za primenu kao lek.
14. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je upotreba za lečenje vaskularnih bolesti oka.
15. Upotreba antitela prema bilo kom od zahteva 6 do 10 za proizvodnju leka.
RSP20191266 2014-11-06 2015-11-04 Varijante fc regiona sa modifikovanim vezivanjem za fcrn i metode upotrebe RS59340B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14192052 2014-11-06
EP15790922.7A EP3215528B1 (en) 2014-11-06 2015-11-04 Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
PCT/EP2015/075656 WO2016071376A2 (en) 2014-11-06 2015-11-04 Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59340B1 true RS59340B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=51947132

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191266 RS59340B1 (sr) 2014-11-06 2015-11-04 Varijante fc regiona sa modifikovanim vezivanjem za fcrn i metode upotrebe

Country Status (20)

Country Link
US (2) US10683368B2 (sr)
EP (2) EP3611188B1 (sr)
JP (2) JP6707090B2 (sr)
KR (1) KR20170078677A (sr)
CN (1) CN107108720A (sr)
AR (1) AR102521A1 (sr)
BR (1) BR112017006178A2 (sr)
CA (1) CA2960797A1 (sr)
DK (1) DK3215528T3 (sr)
ES (1) ES2749383T3 (sr)
HR (1) HRP20191766T1 (sr)
HU (1) HUE045466T2 (sr)
LT (1) LT3215528T (sr)
MX (2) MX378451B (sr)
PL (1) PL3215528T3 (sr)
PT (1) PT3215528T (sr)
RS (1) RS59340B1 (sr)
RU (1) RU2714116C2 (sr)
SI (1) SI3215528T1 (sr)
WO (1) WO2016071376A2 (sr)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2814587T1 (en) 2012-02-15 2018-08-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Affinity chromatography based on the Fc receptor
BR112016023417A2 (pt) 2014-03-21 2019-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag predição in vitro de meia-vida in vivo
CA3016563A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
KR20250036943A (ko) 2016-08-02 2025-03-14 비스테라, 인크. 조작된 폴리펩티드 및 그의 용도
CN107698684B (zh) * 2016-08-03 2021-09-28 广东东阳光药业有限公司 包含突变的免疫球蛋白Fc部分的GLP-1融合蛋白
EP3511340B1 (en) 2016-08-10 2024-10-02 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Heterodimeric fc-fused cytokine and pharmaceutical composition comprising the same
WO2018129713A1 (zh) * 2017-01-13 2018-07-19 杭州翰思生物医药有限公司 提高IgG类抗体对FcRn的结合亲和力并延长其血清半衰期的方法
EP3569616B1 (en) * 2017-01-13 2021-09-29 Taizhou Hanzhong Biopharmaceutics, Inc. Monoclonal antibody against pd-1 and applications thereof
JP7231549B2 (ja) * 2017-02-06 2023-03-01 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 抗体媒介性受容体シグナル伝達を増強するための組成物及び方法
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
FR3064007A1 (fr) * 2017-03-20 2018-09-21 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Anticorps pour le traitement de cancers
EP3615678B1 (en) * 2017-04-28 2024-07-31 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody selection method
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
KR102867311B1 (ko) * 2017-08-11 2025-10-01 리서치 디벨럽먼트 파운데이션 증강된 혈청 반감기를 위한 조작된 항체 fc 변이체
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
MA50746A (fr) 2017-10-02 2020-08-12 Denali Therapeutics Inc Protéines de fusion comprenant des enzymes d'enzymothérapie substitutive
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
IL276286B2 (en) * 2018-01-26 2025-07-01 Genzyme Corp FC variants with improved binding to FCRN and extended half-life
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN108640997A (zh) * 2018-05-22 2018-10-12 蔡毓旻 一种双特异性抗体
WO2019228406A1 (en) * 2018-05-29 2019-12-05 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. A novel anti-cd3/anti-cd20 bispecific antibody
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
AU2019366956B2 (en) 2018-10-23 2025-10-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Heterodimeric Fc-fused proteins
EP3870331B1 (en) * 2018-10-25 2025-07-23 F. Hoffmann-La Roche AG Modification of antibody fcrn binding
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
EP3927744A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
CN114127112A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 与t细胞结合的多功能分子及其治疗自身免疫性病症的用途
EP3927431A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
EP3927746A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
JP7691927B2 (ja) * 2019-03-06 2025-06-12 キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド Ｔ細胞調節抗原提示ポリペプチド及びその使用方法
TW202120539A (zh) * 2019-07-25 2021-06-01 美商健臻公司 以FcRn拮抗劑治療抗體媒介之病症的方法
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
EP4084823A4 (en) 2020-01-03 2024-05-15 Marengo Therapeutics, Inc. ANTI-TCR ANTIBODY MOLECULES AND THEIR USES
BR112022020440A2 (pt) 2020-04-10 2022-12-27 Cytomx Therapeutics Inc Construtos de citocinas ativáveis e composições e métodos relacionados
CA3180321A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
WO2022046920A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
JP2023540248A (ja) 2020-08-26 2023-09-22 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔｒｂｃ１またはｔｒｂｃ２を検出する方法
GB2616128A (en) 2020-08-26 2023-08-30 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
MX2023004023A (es) * 2020-10-09 2023-07-07 Hospital For Sick Children Polipéptidos que eligen como objetivo a sars-cov-2 y composiciones y métodos relacionados.
CR20230178A (es) 2020-10-14 2023-07-26 Denali Therapeutics Inc Proteínas de fusión que comprenden enzimas sulfoglucosamina sulfohidrolasa y métodos de estas
TW202235107A (zh) * 2020-11-25 2022-09-16 美商維爾生物科技股份有限公司 結合至多種乙型冠狀病毒的抗體
EP4308594A2 (en) 2021-03-16 2024-01-24 CytomX Therapeutics, Inc. Masked activatable cytokine constructs and related compositions and methods
KR20240004462A (ko) 2021-04-08 2024-01-11 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Tcr에 결합하는 다기능성 분자 및 이의 용도
WO2022265331A1 (ko) * 2021-06-14 2022-12-22 고려대학교 산학협력단 제어된 면역 작용 기작과 증가된 혈중 반감기를 갖는 fc변이체들
JP2024538706A (ja) 2021-10-08 2024-10-23 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化可能サイトカイン構成体及び併用方法
JP2024537101A (ja) 2021-10-08 2024-10-10 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化可能サイトカイン構成体ならびに関連する組成物及び方法
EP4694934A1 (en) 2023-04-12 2026-02-18 CytomX Therapeutics, Inc. Masking polypeptides, activatable cytokine constructs, and related compositions and methods
WO2024216170A2 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
CN120958015A (zh) 2023-04-12 2025-11-14 西托姆克斯治疗公司 掩蔽多肽、可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法
WO2025240659A2 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable constructs, compositions and methods
WO2026011013A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Epibiologics, Inc. Binding agents and uses thereof
WO2026020161A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable il-12 constructs and related compositions and methods
WO2026050572A2 (en) 2024-08-29 2026-03-05 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof

Family Cites Families (170)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4900660A (en) 1985-11-25 1990-02-13 University Of Florida Streptococcal fc rc
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5169936A (en) 1989-04-14 1992-12-08 Biogen, Inc. Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
MX9203138A (es) 1991-03-12 1992-09-01 Biogen Inc Dominio de enlace cd2-de antigeno 3 (lfa-3) asociado con funcion linfositos.
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5623053A (en) 1992-01-10 1997-04-22 California Institute Of Technology Soluble mammal-derived Fc receptor which binds at a pH ranging from about 5.5 to 6.5 and releases at a pH ranging from about 7.5 to 8.5
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5429746A (en) 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5610285A (en) 1994-08-24 1997-03-11 Bayer Corporation Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
IL118069A (en) 1995-05-02 2000-06-01 Japan Tobacco Inc Monoclonal antibody reactive to human CETP and assay method for human CETP
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6451308B1 (en) 1996-04-26 2002-09-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Antagonists of interleukin-15
EP0915987A2 (en) 1997-04-21 1999-05-19 Donlar Corporation POLY-($g(a)-L-ASPARTIC ACID), POLY-($g(a)-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
ES2292682T3 (es) 1998-05-06 2008-03-16 Genentech, Inc. Purificacion de anticuerpos mediante cromatografia de intercambio ionico.
WO1999062942A2 (en) 1998-06-01 1999-12-09 Urogenesys, Inc. Tumor antigen useful in diagnosis and therapy of prostate and colon cancer
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
EP1242438B1 (en) 1999-12-29 2006-11-08 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
PT1324776E (pt) 2000-10-12 2009-12-23 Genentech Inc Formulações de proteína concentradas de viscosidade reduzida
EE200300179A (et) 2000-10-13 2003-08-15 Biogen, Inc. Humaniseeritud LT-ß-R-i vastased antikehad
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
ES2184594B1 (es) 2001-01-17 2004-01-01 Probitas Pharma Sa Procedimiento para la produccion de gammaglobulina g humana inactivada de virus.
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
CA2447851C (en) 2001-06-28 2012-08-28 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
RU2321630C2 (ru) 2001-08-03 2008-04-10 Гликарт Биотекнолоджи АГ Гликозилированные антитела (варианты), обладающие повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1490677A4 (en) 2002-02-27 2006-01-18 California Inst Of Techn COMPUTER METHOD FOR DESIGNING ENZYMES FOR THE INCORPORATION OF AMINO ACID ANALOGUES INTO PROTEINS
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2347241T3 (es) 2002-12-16 2010-10-27 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
ES2737837T3 (es) 2003-10-09 2020-01-16 Ambrx Inc Derivados poliméricos
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
ES2672640T3 (es) 2003-11-05 2018-06-15 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
CN107213469A (zh) 2003-11-06 2017-09-29 西雅图基因公司 能够与配体偶联的单甲基缬氨酸化合物
CN101124245A (zh) * 2003-11-12 2008-02-13 比奥根艾迪克Ma公司 新生儿Fc受体(FcRn)-结合多肽变体、二聚体Fc结合蛋白及其相关方法
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US8778880B2 (en) 2004-02-02 2014-07-15 Ambrx, Inc. Human growth hormone modified at position 35
SE0400501D0 (sv) 2004-02-27 2004-02-27 Amersham Biosciences Ab Antibody purification
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CN1942483B (zh) 2004-04-13 2012-09-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗p型选凝素抗体
US20060067930A1 (en) 2004-08-19 2006-03-30 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
ES2720160T3 (es) 2005-05-09 2019-07-18 Ono Pharmaceutical Co Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1(PD-1) y métodos para tratar el cáncer usando anticuerpos dirigidos contra PD-1 solos o junto con otras sustancias inmunoterapéuticas
TWI320788B (en) 2005-05-25 2010-02-21 Hoffmann La Roche Method for the purification of antibodies
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1790716A1 (en) 2005-11-23 2007-05-30 UMC Utrecht Holding B.V. Uses of the FcRn receptor
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2006329963B2 (en) 2005-12-06 2011-06-09 Amgen Inc. Polishing steps used in multi-step protein purification processes
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
EP1878739A1 (en) 2006-07-14 2008-01-16 LEK Pharmaceuticals D.D. One step IMAC (MCAC) purification of proteins
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
US20080167450A1 (en) 2007-01-05 2008-07-10 Hai Pan Methods of purifying proteins
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
BRPI0807952A2 (pt) 2007-02-20 2014-06-10 Anaptysbio Inc Sistemas de hipermutação somática
US8198409B2 (en) 2007-05-21 2012-06-12 Nomadic Bioscience Co., Ltd. Polypeptide, an affinity chromatography material, and a method for separating and/or purifying immunoglobulin
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
RU2009148891A (ru) 2007-06-01 2011-07-20 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг (Ch) Очистка иммуноглобулина
MX336725B (es) 2007-09-26 2016-01-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos medinate la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PL2808343T3 (pl) * 2007-12-26 2019-11-29 Xencor Inc Warianty Fc ze zmienionym wiązaniem do FcRn
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
TWI700293B (zh) 2008-04-11 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗體
US20100069617A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Enhanced protein aggregate removal by mixed mode chromatography on hydrophobic interaction media in the presence of protein-excluded zwitterions
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
EP3524620A1 (en) * 2008-10-14 2019-08-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
EP2365979A2 (en) 2008-10-22 2011-09-21 Biogen Idec MA Inc. Recombinant fcrn and variants thereof for purification of fc-containing fusion proteins
PE20120591A1 (es) 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
CN102369214B (zh) 2009-04-07 2019-04-12 罗氏格黎卡特股份公司 三价、双特异性抗体
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
EP2435473B1 (en) 2009-05-27 2013-10-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
KR101747103B1 (ko) * 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
US9493578B2 (en) * 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG181952A1 (en) 2009-12-29 2012-07-30 Emergent Product Dev Seattle Heterodimer binding proteins and uses thereof
WO2011106272A1 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel binding assays useful in identifying antibodies with altered half-lives
MX348739B (es) 2010-03-10 2017-06-27 F Hoffmann-La Roche Ag * Metodo para purificar soluciones de inmunoglobulina.
TWI667257B (zh) * 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2011159877A2 (en) 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
ES2668895T3 (es) * 2011-03-16 2018-05-23 Amgen Inc. Variantes de Fc
BR112013024574B1 (pt) 2011-03-29 2022-08-09 Roche Glycart Ag Anticorpo e uso do anticorpo
WO2013004587A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for separation of monomeric polypeptides from aggregated polypeptides
CN103827134A (zh) 2011-07-20 2014-05-28 泽普泰恩股份有限公司 多肽分离方法
US20140359902A1 (en) 2011-12-16 2014-12-04 Synthon Biopharmaceuticals B.V. EXPRESSION OF SECRETORY IgA ANTIBODIES IN DUCKWEED
HRP20201004T1 (hr) 2011-12-20 2020-10-16 Medimmune, Llc Modificirani polipeptidi za skelete bispecifičnog protutijela
SI2814587T1 (en) 2012-02-15 2018-08-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Affinity chromatography based on the Fc receptor
DK2838917T3 (da) 2012-04-20 2019-08-26 Merus Nv Fremgangsmåder og midler til frembringelse af heterodimere ig-lignende molekyler
AU2013285355A1 (en) * 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP2872534B1 (en) * 2012-07-13 2018-08-08 Roche Glycart AG Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
UA119320C2 (uk) 2013-02-26 2019-06-10 Рош Глікарт Аг Активуюча т-клітини біспецифічна антигензв'язувальна молекула
US20160068613A1 (en) * 2013-04-29 2016-03-10 Hoffmann-La Roche Inc. Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
EP3628685A1 (en) * 2013-04-29 2020-04-01 F. Hoffmann-La Roche AG Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
BR112016023417A2 (pt) 2014-03-21 2019-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag predição in vitro de meia-vida in vivo
JP6288332B2 (ja) 2017-03-06 2018-03-07 東洋紡株式会社 新規なグルコース脱水素酵素

Also Published As

Publication number Publication date
CA2960797A1 (en) 2016-05-12
JP6707090B2 (ja) 2020-06-10
WO2016071376A2 (en) 2016-05-12
EP3611188A1 (en) 2020-02-19
PL3215528T3 (pl) 2020-01-31
JP2020111588A (ja) 2020-07-27
US20200270367A1 (en) 2020-08-27
KR20170078677A (ko) 2017-07-07
MX378451B (es) 2025-03-11
LT3215528T (lt) 2019-10-25
SI3215528T1 (sl) 2019-11-29
BR112017006178A2 (pt) 2018-05-02
PT3215528T (pt) 2019-10-11
HUE045466T2 (hu) 2019-12-30
US20170342167A1 (en) 2017-11-30
CN107108720A (zh) 2017-08-29
MX2020010061A (es) 2020-10-15
DK3215528T3 (da) 2019-10-07
RU2714116C2 (ru) 2020-02-11
EP3611188B1 (en) 2022-05-04
JP7023306B2 (ja) 2022-02-21
JP2018502143A (ja) 2018-01-25
US10683368B2 (en) 2020-06-16
RU2017117856A (ru) 2018-12-06
WO2016071376A3 (en) 2016-06-30
MX2017005148A (es) 2017-08-08
EP3215528A2 (en) 2017-09-13
ES2749383T3 (es) 2020-03-20
US11440971B2 (en) 2022-09-13
EP3215528B1 (en) 2019-08-07
AR102521A1 (es) 2017-03-08
RU2017117856A3 (sr) 2019-08-08
HRP20191766T1 (hr) 2019-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11440971B2 (en) Fc-region variants with modified FcRn-binding and methods of use
US20220324955A1 (en) Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
EP3215524B1 (en) Fc-region variants with modified fcrn- and protein a-binding properties
JP2021113214A (ja) ＦｃＲｎ結合特性が改変されているＦｃ領域変異体
JP2017505767A (ja) ＦｃＲｎ結合特性が改変され、プロテインＡ結合特性が保持されているＦｃ領域変異体
HK40110271A (zh) Fc-受体结合的修饰的非对称抗体及使用方法
HK1243097A1 (en) Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
HK1218761B (zh) Fc-受体结合的修饰的非对称抗体及使用方法