KR20210044220A - SIRPalpha-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법 - Google Patents

SIRPalpha-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법 Download PDF

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sirpα
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이리스 페커
이타이 블로크
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카 메디컬 리미티드
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Abstract

SIRP알파-4-1BBL 변이체 융합 단백질이 제공된다. 또한, SIRP알파 변이체를 포함하는 단리된 폴리펩타이드가 제공된다. 또한, 상기 SIRP알파-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 작제물, 이를 발현하는 숙주 세포 및 이들의 사용 방법이 제공된다.

Description

SIRP알파-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2018년 7월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/696,362호의 35 USC §119(e) 하에 우선권의 이익을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참조에 의해 포함된다.
서열목록 보고
본 출원의 제출과 동시에 제출된, 2019년 7월 11일에 생성된 192,512 바이트의 77794 SequenceListing.txt라는 명칭의 ASCII 파일은 본원에 참조에 의해 포함된다.
본 발명은, 이의 몇몇 실시형태들에서, SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
현재 당해 분야에 이-기능성(bi-functional) 융합 단백질로서 공지되어 있는, 신호-변환-단백질(SCP: Signal-Converting-Protein)로서도 공지되어 있는 이중 신호전달 단백질(DSP: Dual Signaling Protein)은 I형 막(membrane) 단백질의 세포외 부분(세포외 아미노-말단)을 II형 막 단백질의 세포외 부분(세포외 카르복실-말단)에 연결하여 2개의 활성 측들과의 융합 단백질을 형성한다(예를 들면, 미국 특허 제7,569,663호 및 제8,039,437호를 참조한다).
SIRPα (신호-조절 단백질 알파, signal-regulatory protein alpha)는 면역글로불린 상과(super family)의 세포 표면 수용체이다. SIRPα는 대식 세포와 수지상 세포(DC)와 같은 식세포 계통(phagocyte lineage)의 면역 세포의 표면 상에서 주로 발현된다. CD47은 SIRPα의 리간드이다. CD47은 면역글로불린 상과의 세포 표면 분자이다. CD47은 식세포 상에서 발현되는 SIRPα의 결찰(ligation)을 통해 식세포 작용(phagocytosis)의 억제제로 기능한다. CD47은 대부분의 정상 조직에서 널리 발현된다. 이런 식으로, CD47은 CD47의 손실이 노화되거나 손상된 세포의 항상성 식세포 작용을 유발하기 때문에 "나를 먹지 말라는 신호(don't eat me signal)" 및 자기 마커(marker of self) 역할을 한다. CD47은 여러 인간 종양 유형에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 종양은 CD47을 포함한 항-식세포 신호의 발현을 통해 대식 세포의 식세포 작용을 회피한다. CD47은 정상 세포에서 낮은 수준으로 편재적으로 발현되지만, 여러 종양은 정상 세포에 비해 CD47 수준이 증가하고, CD47의 과발현은 종양이 식세포 작용을 회피하여 타고난 면역계 감시를 벗어날 수 있게 한다.
4-1BBL은 TNF 수용체 상과의 구성원 및 강력한 활성화-유도된 T 세포 공동자극 분자인 4-1BB 수용체(CD137)의 활성화 리간드이다. 4-1BBL은 자연적으로 동종-삼량체(homo-trimer)를 형성하지만 4-1BB를 통한 신호전달은 4-1BBL의 상당한 올리고머화(oligomerization)를 요구한다. 4-1BBL은 수지상 세포(DC), B 세포 및 대식세포를 포함하는 각종 항원 제시 세포(APC: antigen presenting cell) 상에 존재한다. 4-1BB 수용체는 휴지 T 세포 또는 T 세포주에서 검출되지 않지만(< 3%), 4-1BB는 T 세포가 활성화되는 경우에 안정하게 상향조절된다. 4-1BB 활성화는 생존 유전자를 상향조절하고, 세포 분열을 강화하고, 사이토카인 생산을 유도하고, T-세포에서 활성화 유도된 세포 사멸을 방지한다.
추가의 배경 기술로는 하기가 포함된다:
Weiskopf K et al. Science. (2013); 341(6141):88-91;
국제 특허 출원 공개 제WO 2017027422호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2001086003호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2001075067호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2017194641호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2014180288호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2017059168호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2001/049318호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2016/139668호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2014/106839호;
국제 특허 출원 공개 제WO 2012/042480호;
미국 특허 출원 공개 제20150183881호;
미국 특허 출원 공개 제US20070110746호;
미국 특허 출원 공개 제US20070036783; 및
미국 특허 제US9562087호.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질(fusion protein)로서, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고, 및/또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열은:
(a) 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 197개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198 내지 E205를 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 72와 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 182개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 E23을 포함하지 않는 것이거나, 또는 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는 184개 길이의 아미노산들이고, 및/또는;
(b) 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복(three repeat)을 포함하고;
상기 융합 단백질은 하기:
(i) CD47 및 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함;
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극(co-stimulating)함; 및/또는
(iv) 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포(phagocyte)에 의해 상기 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킴;
중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 양상에 따르면, SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질로서, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고, 및/또는, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열변호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이고; 상기 융합 단백질은 하기:
(i) CD47 및 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함;
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극함; 및/또는
(iv) 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포에 의해 상기 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킴;
중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 양상에 따르면, SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고; 상기 폴리펩타이드는 CD47을 결합할 수 있는 것인, 단리된 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 양상에 따르면, 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이고, 상기 폴리펩타이드는 하기:
(i) 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함; 및/또는
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극함;
중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, 단리된 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 적어도 115개 길이의 아미노산들이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 116개 길이의 아미노산들이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 상응하는 L4, A27, E47 및 V92로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 돌연변이는 서열번호 2에 상응하는 L4I, A27I, E47V 및 V92I로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 상응하는 아미노산 잔기 K117 내지 Y343 중 어느 것도 포함하지 않는다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26으로 이루어진다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 내지 서열번호 23으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 잔기 A1 내지 V6 또는 A1 내지 G14 중 어느 것도 포함하지 않는다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어진다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면:
(i) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 25에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 제시되는 바와 같고; 또는
(ii) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 제시되는 바와 같다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면:
(i) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23에 제시되는 바와 같고; 또는
(ii) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되는 바와 같다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72, 서열번호 74 또는 서열번호 76을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72, 서열번호 74 또는 서열번호 76으로 이루어진다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70으로 이루어진다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 상기 SIRPα와 4-1BBL 사이에 링커(linker)를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 상기 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복 각각 사이에 링커를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 1개 내지 6개 길이의 아미노산을 갖는다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 단일 아미노산 링커이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 글리신이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 항체 또는 이의 단편의 Fc 도메인이 아니다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 항체 또는 이의 단편의 Fc 도메인이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 적어도 동종-삼량체(homo-trimer)의 형태로 존재한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 SEC-MALS에 의해 측정시 분자량이 적어도 100kD이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 상기 단리된 폴리펩타이드는 가용성이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 생산 수율보다 적어도 1.5배 더 높고, 상기 생산 조건은 포유동물 세포에서의 발현 및 5일 내지 13일 동안 32℃ 내지 37℃, 5% 내지 10%의 CO2에서의 배양을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)가 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, 폴리뉴클레오타이드, 및 숙주 세포에서의 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하기 위한 조절 요소를 포함하는, 핵산 작제물(nucleic acid construct)이 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 66 및 서열번호 68로 이루어진 그룹에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55, 서열번호 66 및 서열번호 58로 이루어진 그룹에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물을 포함하는, 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물을 발현시키는 단계를 포함하는, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 방법은 상기 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물, 또는 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 방법은 상기 질환을 치료하기 위해 상기 대상체에게 치료학적 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는데 사용하기 위한, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 또는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 조성물은 상기 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제를 추가로 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 측면에 따르면, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제를 패키징하는 패키징 재료; 및 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 또는 숙주 세포를 포함하는, 제조 물품이 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 질환의 세포들은 CD47을 발현한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 과다-증식성(hyper-proliferative) 질환을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 과다-증식성 질환은 경화증(sclerosis) 또는 섬유증(fibrosis), 특발성 폐 섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis), 건선(psoriasis), 전신 경화증/피부경화증(systemic sclerosis/scleroderma), 원발 담즙성 담관염(primary biliary cholangitis), 원발 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 간 섬유증(liver fibrosis), 방사선-유도된 폐 섬유증(radiation-induced pulmonary fibrosis), 골수 섬유증(myelofibrosis) 또는 후복막 섬유증(retroperitoneal fibrosis)의 예방을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 과다-증식성 질환은 암을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 암은 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia) 및 암종(carcinoma)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 면역 억제 또는 투약(medication) 유도된 면역 억제와 관련된 질환을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 HIV, 홍역, 인플루엔자(influenza), LCCM, RSV, 인간 리노바이러스(Rhinovirus), EBV, CMV 또는 파보(Parvo) 바이러스를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 감염을 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 한 양상에 따르면, 면역 세포를 활성화하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 또는 숙주 세포의 존재시에 면역 세포를 시험관내(in-vitro) 활성화하는 단계를 포함하는, 면역 세포를 활성화하는 방법이 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 CD47 또는 외인성 CD47을 발현하는 세포의 존재시에 이루어진다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 CD47을 발현하는 세포는 병리학적 세포를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 병리학적 세포는 암 세포를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 항암제의 존재시에 이루어진다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제 또는 항암제는 항체를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 항체는 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 알메투주맙(almetuzumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 파니투무맙(panitumumab), 벨리무맙(Belimumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 비바투주맙 메르탄신(Bivatuzumab mertansine), 블리나투모맙(Blinatumomab), 블론투베트맙(Blontuvetmab), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), 카투막소맙(Catumaxomab), 식수투무맙(Cixutumumab), 다클리주맙(Daclizumab), 아달리무맙(Adalimumab), 베즐로톡수맙(Bezlotoxumab), 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol), 시타투주맙 보가톡스(Citatuzumab bogatox), 다라투무맙(Daratumumab), 디누툭시맙(Dinutuximab), 엘로투주맙(Elotuzumab), 에르투막소맙(Ertumaxomab), 에타라시주맙(Etaracizumab), 겜투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 기렌툭시맙(Girentuximab), 네시투무맙(Necitumumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 페르투주맙(Pertuzumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 실툭시맙(Siltuximab), 토시투모맙(Tositumomab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 니몰루맙(Nivolumab), 펨브로리주맙(Pembrolizumab), 더발루맙(Durvalumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 및 이필리무맙(ipilimumab)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 항체는 리툭시맙, 세툭시맙 및 알메투주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제 또는 항암제는 IMiD(예를 들면, 탈리도마이드(Thalidomide), 레날리도마이드(Lenalidomide), 포말리도마이드(Pomalidomide))를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 방법은 상기 활성화 후 상기 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 양자 전이(adoptively transferring)하는 단계를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 T 세포를 포함한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 식세포를 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시형태들의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법들 및/또는 재료들이 하기에 기술된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 특허 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료들, 방법들 및 예시들은 단지 실례이고, 반드시 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들은 단지 예시로서 첨부된 도면을 참조하여 본원에 기술된다. 이하 도면을 상세하게 구체적으로 참조하면, 도시된 세부사항은 예시에 의한 것이고 본 발명의 실시형태들의 실례적 논의 목적을 위한 것임이 강조된다. 이와 관련하여, 도면과 함께 취해진 설명은 본 발명의 실시형태들이 어떻게 실시될 수 있는지 당업자들에게 명백하다.
도면에 있어서:
도 1은 N-말단 신호 펩타이드및 C-말단 his-태그(tag)(서열번호 43)를 포함하는 본원에서 "DSP107"(서열번호 5)로서 칭하는 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 개략적 표현이다. 신호 펩타이드(밑줄그어짐, 서열번호 4), SIRPα 도메인(적색, 서열번호 2), 글리신 링커(흑색), 4-1BBL 도메인(청색, 서열번호 3) 및 C-말단 His-태그(흑색 볼드체)가 도시됨
도 2a 내지 도 2c는 DSP107(서열번호 5)의 예측된 3D 구조를 보여준다. 도 2a는 개략적 3D 모델이다. SIRPα은 회색 띠로 나타내고, CD47(SIRPα 수용체)은 녹색 띠로 나타내며, 4-1BBL은 청색 띠로 나타내고 4-1BBL의 2개의 추가의 카피(copy)(삼량체 형성)들은 담청색으로 나타낸다. 도 2b는 개략적 전체 원자 3D 모델이다. 도 2c는 개략적 3D 모델이다. X-선 해상된(X-ray resolved) 도메인은 이의 표면으로 표시되고 소수성 척도에 의해 색상표시된다(청색(가장 친수성) 내지 갈색(소수성)). 4-1BBL은 더 높은 수준의 노출된 소수성 영역을 도시한다.
도 3은 DSP107(서열번호 5)에서 식별되는 상기 도메인 및 분절의 개략적 표시이다. Ig-유사 V-타입 도메인은 담청색으로 강조표시되고, Ig-유사 C1-타입1 도메인은 황색으로 강조표시되고, Ig-유사 C1-타입2 도메인은 녹색으로 강조표시되고, X-선 해상된 부분은 회색으로 강조표시되고 플랭킹(flanking)/비구조화(unstructured) 영역은 적색 상자로 표시된다.
도 4는 본원에서 "DSP107_var1"(서열번호 11)로서 칭하는 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질의 예측된 3D 구조를 보여준다. 상단 패널은 표면 표현의 3D 구조를 보여주고, 소수성 척도에 따라: 친수성은 청색, 소수성은 갈색으로 색상 지정된다. 하단 패널은 N-말단(청색)에서 C-말단(적색)까지의 서열 위치에 따라 색상이 지정된 리본 표현의 3D 구조를 보여준다.
도 5는 본원에서 "DSP107_var2"(서열번호 13)로서 칭하는 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질의 예측된 3D 구조를 보여준다. 상단 패널은 표면 표현의 3D 구조를 보여주고, 소수성 척도에 따라: 친수성은 청색, 소수성은 갈색으로 색상 지정된다. 하단 패널은 N-말단(청색)에서 C-말단(적색)까지의 서열 위치에 따라 색상이 지정된 리본 표현의 3D 구조를 보여준다.
도 6은 본원에서 "DSP107_var3"(서열번호 15)으로서 칭하는 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질의 예측된 3D 구조를 보여준다. 상단 패널은 표면 표현의 3D 구조를 보여주고, 소수성 척도에 따라: 친수성은 청색, 소수성은 갈색으로 색상 지정된다. 하단 패널은 N-말단(청색)에서 C-말단(적색)까지의 서열 위치에 따라 색상이 지정된 리본 표현의 3D 구조를 보여준다.
도 7a-b는 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. N-말단 his-태그된 DSP107 [(NH), 서열번호 44로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107 [(CH), 서열번호 1로 표시] 및 C-말단 his-태그된 DSP107 변이체 [(CH)-V1, (CH)-V2 및 (CH)-V3.1 (각각 서열번호 12, 14 및 17)로 표시됨] (2 μg/웰)은 환원(도 7a) 및 비환원(도 7b) 조건에서 4-20% SDS-PAGE에서 분리된다. 겔 상에서 단백질의 이동은 e-염색 패드로 염색하여 시각화했다. 또한, 분자 크기 단백질 마커는 동일한 겔에서 분리되었으며, 크기가 표시된다.
도 8a-c는 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 보여준다. N-말단 his-태그된 DSP107 [(NH), 서열번호 44로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107 [(CH), 서열번호 1로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V1 [(CH)-V1, 서열번호 12로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 14로 표시], 및 C-말단 his-태그된 DSP107_V3.1 [(CH)-V3.1, 서열번호 17로 표시](500ng//웰)은 비환원(도 8a) 및 환원(도 8b) 조건에서 SDS-PAGE에서 분리된 후, 항 4-1BBL 항체로 면역 블롯팅되었다. C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH) -V2, 서열번호 14로 표시] (50ng/웰)는 또한 환원 조건에서 SDS-PAGE에서 분리된 후, 항 SIRPα 항체로 면역 블롯팅되었다(도 8c).
도 9는 결합을 위한 항 4-1BBL 항체 및 검출을 위한 SIRPα-비오티닐화 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 결정된 것과 유사한 용량 반응 방식으로, N-말단 his-태그된 DSP107 [(NH), 서열번호 44로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V1 [(CH)-V1, 서열번호 12로 표시] 및 C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 14로 표시]을 SIRPα 및 4-1BBL에 결합하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 10은 유세포 분석에 의해 측정되는 바와 같이 C-말단 his-태그된 DSP107 [(CH), 서열번호 1로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V1 [(CH)-V1, 서열번호 12로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 14로 표시], 및 C-말단 his-태그된 DSP107_V3.1 [(CH)-V3.1, 서열번호 17로 표시]의 SIRPα 모이어티 결합을 보여주는 막대 그래프이다. GMFI 값이 표시된다.
도 11은 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 T 세포 증식을 촉진하는 것을 보여주는 그래프를 보여준다. PBMC는 지시되는 바와 같이 IL-2이 있거나 없이 항-CD3의 존재 하에 0.01 ㎍/ml의 N-말단 his-태그된 DSP107 [(NH), 서열번호 44로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V1 [(CH)-V1, 서열번호 12로 표시] 또는 C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 17로 표시]로 배양되고; 증식은 컨플루언시 측정에 의해 표시된 시점에 결정되었다.
도 12는 표시된 시점에서 자극되지 않은 세포(na)와 비교하여 최적 이하의 농도의 항-CD3 및/또는 IL-2의 존재 하에 자극 후 인간 PBMC에서 4-1BB 발현을 나타내는 막대 그래프이다. GMFI 값이 표시된다.
도 13a-c는 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 4-1BBL과 SIRPα의 상호 작용을 차단한다는 것을 보여준다. 도 13a는 분석 디자인을 보여준다: 재조합 인간 CD47은 ELISA 플레이트에 결합되었다. SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 양성 대조군인 항 CD47 항체는 플레이트에 첨가되었다. 세척 후, 비오티닐화된 재조합 인간 SIRPα가 첨가된 후 스트렙트아비딘 HRP 및 TMB 기질이 첨가되었다. SIRPα와 CD47의 상호 작용은 450 nm에서 흡광도로 측정되었다. 도 13b는 항체 양성 대조군과 비교하여 C-말단 his-태그된 DSP107 [(CH), 서열번호 1로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V1 [(CH)-V1, 서열번호 12로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 14로 표시], 및 C-말단 his-태그된 DSP107_V3.1 [(CH)-V3.1, 서열번호 17로 표시]에 의한 SIRPα 상호 작용의 차단을 보여주는 그래프이다. 도 13c는 제한된 농도 범위에 대해 계산된 EC50 값을 보여주는 그래프이다.
도 14a-b는 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 인간 암 세포의 다형 핵 (PMN) 매개 식세포 작용을 향상시키는 것을 보여주는 막대 그래프이다. 지시되는 바와 같이, 단독으로 또는 리툭시맙(rituximab) 또는 세툭시맙(cetuximab)과 조합하여, C-말단 his-태그된 DSP107 [(CH), 서열번호 1로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V1 [(CH)-V1, 서열번호 12로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 14로 표시], 및 C-말단 his-태그된 DSP107_V3.1 [(CH)-V3.1, 서열번호 17로 표시]을 갖는 PMN 및 Ramos 또는 DLD1 암 세포의 2시간 (도 14a) 또는 18시간 (도 14b) 배양 후 식세포 작용 퍼센트를 나타낸다.
도 15는 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 인간 림프종 세포의 대식세포 매개 식세포 작용을 향상시키는 것을 보여주는 막대 그래프를 보여준다. 지시되는 바와 같이, 단독으로 또는 리툭시맙(rituximab)과 조합하여, C-말단 his-태그된 DSP107 [(CH), 서열번호 1로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V1 [(CH)-V1, 서열번호 12로 표시], C-말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 14로 표시], 및 C-말단 his-태그된 DSP107_V3.1 [(CH)-V3.1, 서열번호 17로 표시]을 갖는 대식세포 및 SUDHL5, SUDHL4 및 OCI-LY3 암 세포의 2시간 배양 후 식세포 작용 퍼센트를 나타낸다.
도 16은 C- 말단 his-태그된 DSP107_V2 [(CH)-V2, 서열번호 14로 표시]가 용량 의존 방식으로 2시간의 배양 후 SUDHL4 암 세포의 대식세포 매개 식세포 작용을 향상시키는 것을 보여주는 그래프이다.
도 17은 이중 측 ELISA(Dual side ELISA)에 의해 결정된 바와 같이 유가 배양(fed batch cultures)으로부터 11일째에 취한 미니 풀 샘플에서의 DSP107_V2 (서열번호 13) 농도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 18은 DSP107_V2 (서열번호 13)의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 정제된 DSP107_V2 (5mg) 및 유가 배양 (5㎕)에서 11일째에 취한 미니 풀 샘플은 환원 조건에서 4-20% SDS-PAGE에서 분리한 후 쿠마시 염색(Coomassie staining)이 수행되었다.
도 19a-b는 CHO-K1 과발현 (OX) 인간 CD47 세포 (도 19a) 및 SUDHL4 세포 (도 19b)에서 CD47의 막 발현을 보여주는 히스토그램이며, 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 CHO-K1 세포 (도 19a)에서는 발현이 없음을 보여준다.
도 20은 HT1080 세포 OX 4-1BB에서 4-1BB 및 CD47의 막 발현을 보여주는 히스토그램이며, 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 HT1080 모 (WT) 세포 상에서 4-1BB의 발현이 없음을 보여준다.
도 21a-b는 CHO-K1-CD47 세포 (도 21a) 및 SUDHL4 세포 (도 21b)에 대한 DSP107_V2의 SIRPα 모이어티 (서열번호 13)의 결합을 보여주는 그래프이며, 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 CHO-K1 모세포에 대한 결합 없음을 보여준다. 양성으로 염색된 세포 또는 GMFI 값의 퍼센트로 표시된다.
도 22a-f는 유세포 분석에 의해 결정되는 바와 같이, DSP107_V2 (서열번호 13)의 양쪽 팔(arm)이 4-1BB를 과발현하는 HT1080 세포에 결합하거나 (도 22a-b, EF), 또는 SIRPα 팔이 HT1080 WT 세포에서 CD47에 결합하는 것을 보여준다 (도 22c-d). 표시된 경우, 항-CD47 항체 및/또는 항-4-1BB 항체의 첨가는 특이적 결합을 결정하는데 사용된다. 양성으로 염색된 세포의 퍼센트와 GMFI 값이 표시된다.
도 23a-b는 CHO K1-CD47 및 HT1080-4-1BB 세포에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 동시 결합을 보여준다. DSP107_V2 (서열번호 13)는 CFSE-표지된 HT1080 4-1BB OX 세포 및 사이토라이트 레드(CytoLight Red)-표지된 CHO-K1 CD47 OX 세포와 함께 배양되었고, 이중선 형성은 유세포 분석에 의해 결정되었다. 도 23a는 배지 대조군과 비교하여 DSP107_V2 (서열번호 13)로 표지된 세포의 배양 후 CFSE 대 사이토라이트 레드의 대표적인 유세포 분석 플롯을 보여준다. 도 23b는 3개의 독립적인 실험으로부터 이중선 형성의 평균 결과를 보여주는 그래프이다.
도 24는 CHO K1-CD47 및 HT1080-4-1BB 세포에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 동시 결합을 보여준다. DSP107_V2 (서열번호 13)는 항-4-1BB 항체의 항-CD47 항체가 있거나 없이 CFSE-표지된 HT1080 4-1BB OX 세포 및 사이토라이트 레드(CytoLight Red)-표지된 CHO-K1 CD47 OX 세포와 함께 배양되었고, 이중선 형성은 유세포 분석에 의해 결정되었다. 중간 효과를 뺀 후 2개의 독립적인 실험으로부터 이중선 형성의 평균 결과를 보여주는 그래프이다.
도 25a-b는 단일 배양 분석에서 HT1018-4-1BB 세포로부터의 IL8 분비에 의해 결정된 바와 같이 DSP107_V2 (서열번호 13)에 의한 4-1BB의 활성화를 보여준다.
도 26은 공동-배양 분석에서 HT1018-4-1BB 세포로부터의 IL8 분비에 의해 결정된 바와 같이 DSP107_V2 (서열번호 13)에 의한 4-1BB의 활성화를 보여준다.
도 27은 활성 마커 CD25 및 4-1BB의 발현에 의해 결정되는 바와 같이 DSP107_V2 (서열번호 13)가 용량 의존 방식으로 T 세포 활성화를 유도하는 것을 보여주는 막대 그래프를 보여준다. 3명의 공여자로부터의 PBMC를 플레이트-결합된 항-CD3의 존재 하에 표시된 농도의 DSP107_V2 (서열번호 13)와 함께 배양되었고; CD25 또는 4-1BB 발현은 유세포 분석에 의해 48시간 배양 후 결정되었다.
도 28은 Incucyte에 의해 결정된 바와 같이, PBMC 증식에 대한 DSP107-V2 (서열번호 13)의 효과를 보여주는 대표적인 이미지를 보여준다.
도 29는 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이, 3명의 인간 공여자로부터 수득된 CPD-염색된 T 세포의 증식에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 효과를 보여주는 막대 그래프를 보여준다.
도 30a-c는 Incucyte에 의해 결정된 바와 같이, SNU387 (도 26a), SNU423 (도 26b) 및 Ovcar8 (도 26c) 암 세포의 T 세포 매개 사멸에 대한 DSP107-V2 (서열번호 13)의 효과를 보여준다.
도 31a-b는 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이, MSTO (도 31a) 및 H2052 (도 31b) 중피종 세포의 T 세포 매개 사멸에 대한 DSP107-V2 (서열번호 13)의 효과를 보여준다.
도 32a-e는 DSP107_V2 (서열번호 13)가 상이한 림프종 세포주 (도 32b-d) 및 DLD-1 결장암 세포주 (도 32e)의 M1-대식세포 매개 식세포 작용을 향상시키는 것을 보여주는 대표 이미지 (도 32a) 및 그래프 (도 32 b-e)를 보여준다.
도 33a-h는 가용성 SIRPa, 가용성 4-1BBL 또는 조합에 비해(도 33d-f), 단일 요법으로 또는 리툭시주맙과의 조합으로(도 33a-d) 상이한 림프종 세포주의 과립구 매개 식세포 작용에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 효과를 나타낸다. 단일 요법으로 또는 트라스투주맙과의 조합으로 DSP107_V2에 의한 과립구에 의한 DLD1 결장암 세포주의 식세포 작용(도 33g-h).
도 34는 MC38 (마우스) 및 DLD1 (인간) 결장암 세포주에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 결합을 나타낸다.
도 35a-b는 h4-1BB 녹인(knock-in) 마우스에서 hCD47 MC38 종양 성장 (도 34a) 및 생존 (도 35b)에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13) 및 항-마우스 CD47 항체의 생체 내 효과를 보여준다.
도 36a-b는 인간화된 NSG 마우스에서 SUDHL6 DLBCL 종양에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 생체 내 효과를 보여준다. 도 36a는 22일에 마우스 희생 이후에 측정된 평균 종양 중량을 보여준다. 도 36b는 20일에 마우스 희생 이전에 측정된 평균 종양 부피를 보여준다.
도 37a-b는 이의 대응물(CD47 및 4-1BB)의 결합의 존재 하에 SIRPα (서열번호 2) 및 4-1BBL 아미노산 서열 (서열번호 78)의 3중 반복을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합의 예측된 3D 구조를 보여준다. 도 37a는 도식적인 3D 모델이고, 도 37b는 완전 원자 3D 모델이다. SIRPα는 어두운 회색 리본 디스플레이 (오른쪽 상단)로 표시된다. 4-1BBL은 짙은 회색 리본 (왼쪽)으로 표시된다. 스페이서 '/'링커' 분절은 SIRPα와 4-1BBL의 구조 요소 사이에 회색 및 흰색 리본으로 표시된다. CD47은 회색 리본 (오른쪽 상단)으로 표시되고, 3개의 4-1BB 수용체는 4-1BBL (왼쪽)과 복합체로 회색 리본으로 표시된다.
도 38은 DSP107-V2 (서열번호 13)의 SEC-MALS 분석을 보여준다. 단백질 (150μg)은 Superdex 200 증가 컬럼 (GE Healthcare)에 로딩되고, 이동상으로서 10 mM KPO4 pH 8.0 + 150 mM NaCl을 사용하여 0.8 ml/분의 유속으로 실행되었다. 검출은 AKTA Explorer (GE) + MiniDawn TREOS + OPTILAB T-reX (WYATT)를 사용하여 UV, MALS 및 RI에 의해 수행되었다.
본 발명은, 이들의 몇몇의 실시형태들에서 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 실시형태를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 이의 적용에 있어서 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 제시되거나 실시예에 의해 예시된 세부사항에 반드시 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시형태들이 가능하거나 다양한 방식으로 실행 또는 수행될 수 있다.
현재 당해 분야에 이-기능성(bi-functional) 융합 단백질로서 공지되어 있는, 신호-변환-단백질(SCP: Signal-Converting-Protein)로서도 공지되어 있는 이중 신호전달 단백질(DSP: Dual Signaling Protein)은 I형 막(membrane) 단백질의 세포외 부분(세포외 아미노-말단)을 II형 막 단백질의 세포외 부분(세포외 카르복실-말단)에 연결하여 2개의 활성 측들과의 융합 단백질을 형성한다.
본 발명자들은 구조적-기능성 도구를 사용하여, 개선된 생산 특성(예를 들면, 보다 높은 수율)을 갖는 SIRPα 변이체 및/또는 4-1BBL 변이체를 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 생성할 수 있었고; 이는 일반적으로 (공동-자극을 통해) 면역 세포를 활성화하고 특히 면역 세포의 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환(예를 들면, 암)을 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 일례로서 암의 치료에서의 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 작용 방식으로서 하기를 제안한다:
종양 세포의 표면 상의 그리고 종양 미세-환경(mirco-environment)에서의 상대적으로 높은 CD47의 발현으로 인하여, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합의 상기 SIRPα 모이어티는 분자를 종양 및 전이 부위에 표적하여, 종양 미세-환경 내에서 CD47에 대한 융합 단백질의 결합을 유도한다.
상기 융합 단백질을 상기 종양 세포 및/또는 종양 미세-환경에 표적하는 것은 종양 미세-환경에서의 SIRPα-4-1BBL 농도의 증가 및 종양 부위에서의 상기 융합 단백질의 4-1BBL 모이어티의 후속적 고정화(immobilization) 및 올리고머화(oligomerization)를 용이하게 하여, T 세포, B 세포, NK 세포, 특히 종양-침윤 림프구(TIL: Tumor-Infiltrating Lymphocyte) 및 기타 면역 세포의 활성화를 촉진시키는 4-1BB 공동-자극 신호를 종양 부위에 전달하여 암 세포를 죽인다.
4-1BBL ― 4-1BB 공동-자극 신호 이외에, 종양 부위에서의 CD47에의 상기 융합 단백질의 SIRPα 모이어티의 결합은 대식세포 및 수지상 세포 상에 발현된 내인성 SIRPα과 경쟁하고, 따라서 이러한 세포에 대한 억제를 제거하고 추가로 종양 세포의 식세포 작용 및 종양 미세-환경에서의 수지상 세포 및 T 세포의 활성화에 기여한다.
SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 상기 활성들은 종양 미세-환경 내에서의 TIL, 수지상 세포 및 대식세포의 활성화에 대한 상승작용(synergistic) 효과를 초래할 것으로 예상되고, 이는 각각의 모이어티 별개의 효과뿐만 아니라 이들의 2개의 상이한 모이어티들을 병용하여 사용하는 경우와 비교하여 보다 특이적이고 강력한 효과일 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명의 한 양상에 따르면, SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질(fusion protein)로서, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고, 및/또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열은:
(a) 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 197개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198 내지 E205를 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 72와 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 182개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 E23을 포함하지 않는 것이거나, 또는 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는 184개 길이의 아미노산들이고, 및/또는;
(b) 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함하고;
상기 융합 단백질은 하기:
(i) CD47 및 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함;
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극(co-stimulating)함; 및/또는
(iv) 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포에 의해 상기 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킴;
중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 대안의 또는 추가의 양상에 따르면, SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질로서,
상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고, 및/또는,
상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열변호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이고;
상기 융합 단백질은 하기:
(i) CD47 및 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함;
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극함; 및/또는
(iv) 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포에 의해 상기 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킴;
중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 대안의 또는 추가의 양상에 따르면, SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고; 상기 폴리펩타이드는 CD47을 결합할 수 있는 것인, 단리된 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 대안의 또는 추가의 양상에 따르면, 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 197개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198 내지 E205를 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 72와 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 182개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 E23을 포함하지 않는 것이거나, 또는 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는 184개 길이의 아미노산들이고; 상기 폴리펩타이드는 하기:
(i) 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함; 및/또는
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극함;
중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, 단리된 폴리펩타이드가 제공된다.
본 발명의 대안의 또는 추가의 양상에 따르면, 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이고; 상기 폴리 펩티드는 하기:
(i) 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함; 및/또는
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극함;
중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, 단리된 폴리펩타이드가 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "SIRPα(신호 조절 단백질 알파, CD172a로서도 공지되어 있음)"은 SIRPA 유전자(유전자 ID 140885)의 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 동족체(homolog), 예를 들면, 기능성 단편을 말한다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 용어 "SIRPα"은 SIRPα 폴리펩타이드의 기능성 동족체를 말한다. 특정 실시형태들에 따르면, SIRPα은 인간 SIRPα이다. 한 특정 실시형태에 따르면, 상기 SIRPα 단백질은 하기 GenBank 번호 NP_001035111, NP_001035112, NP_001317657 또는 NP_542970에 제공되는 바와 같은 인간 단백질을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "기능성 동족체" 또는 "기능성 단편"은 SIRPα과 관련된 경우 전장(full length) SIRPα의 활성, 예를 들면 CD47 결합을 유지하는 폴리펩타이드의 일부를 말한다.
특정 실시형태들에 따르면, CD47 단백질은 하기 GenBank 번호 NP_001768 또는 NP_942088에 제공되는 바와 같은 인간 단백질을 말한다.
결합을 시험하기 위한 검정은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 유세포측정법, 비아코어(BiaCore), 생물층 간섭계(bio-layer interferometry) 블리츠®(Blitz®) 검정, HPLC가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα은 SPR에 의해 측정시 0.1 내지 100 μM, 0.1 내지 10 μM, 1 내지 10 μM, 0.1 내지 5 μM, 또는 1 내지 2 μM의 Kd로 CD47에 결합하고, 각각의 가능성(possibility)은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα은 상기 SIRPα의 세포외 도메인 또는 이의 기능성 단편을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 29을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 29로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 핵산 서열은 서열번호 30을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 핵산 서열은 서열번호 30으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 핵산 서열은 서열번호 31 또는 서열번호 67을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 핵산 서열은 서열번호 31 또는 서열번호 67로 이루어진다.
상기 용어 "SIRPα"은 또한 목적하는 활성(즉, CD47에의 결합)을 나타내는 기능성 동족체(천연 발생 또는 합성적으로/재조합적으로 생산됨)를 포함한다. 이러한 동족체들은, 예를 들면 상기 폴리펩타이드 서열번호 2 또는 서열번호 29와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하거나 상동성(homologous)일 수 있거나; 또는 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열(본원 이하에 추가로 기술되는 바와 같음)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 기능성 동족체는 상기 폴리펩타이드 서열번호 2 또는 서열번호 29와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하거나 상동성일 수 있거나; 또는 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드(본원 이하에 추가로 기술되는 바와 같음)와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "동일성(identity)" 또는 "서열 동일성(sequence identity)"은 전반적인 동일성, 즉 본원에 개시된 아미노산 또는 핵산 서열의 일부가 아닌 이의 전체에 걸친 동일성을 말한다.
서열 동일성 또는 상동성은 Blast, ClustalW 및 MISCLE과 같은 임의의 단백질 또는 핵산 서열 정렬 알고리즘(algorithm)을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 상동성은 본원 이하에 추가로 기술되는 바와 같이 오솔로그(ortholog), 결실, 삽입, 또는 아미노산 치환을 포함하는 치환 변이체를 지칭할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 폴리펩타이드는 보존적(conservative) 또는 비-보존적(non-conservative) 아미노산 치환(본원에서 돌연변이로서도 칭함)을 포함할 수 있다. 이러한 치환은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 문헌 Weiskopf K et al. Science. (2013); 341(6141):88-91에 개시되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조에 의해 포함된다.
서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 흔히 상이한 것으로 인식되고, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환으로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율은 상기 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성(similarity)" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 간주된다. 이러한 조정을 행하기 위한 수단은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 전형적으로, 이는 완전 불일치(full mismatch)보다는 오히려 부분으로서의 보존적 치환을 점수평가(scoring)하는 것에 관여하여 서열 동일성 백분율을 증가시킨다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고 비-보존적 치환에 0의 점수가 주어지는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존적 치환의 점수평가는 예를 들면, 헤니코프(Henikoff) S 및 헤니코프 JG의 알고리즘[Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89(22): 10915-9]에 따라 계산한다.
특정 실시형태들에 따르면, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는, 서열번호 2에 제시되는 SIRPα 아미노산 서열에 상응하는 L4, V6, A21, A27, I31, E47, K53, E54, H56, V63, L66, K68, V92 및 F96으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 위치한다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 아미노산 서열은, 서열번호 2에 제시되는 SIRPα 아미노산 서열에 상응하는 L4, A27, E47 및 V92로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 위치한다.
특정 실시형태들에 따르면, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 서열번호 2에 제시되는 SIRPα 아미노산 서열에 상응하는 L4V 또는 L4I, V6I 또는 V6L, A21V, A27I 또는 A27L, I31F 또는 I31T, E47V 또는 E47L, K53R, E54Q, H56P 또는 H56R, V63I, L66T 또는 L66G, K68R, V92I 및 F94L 또는 F94V로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되는 SIRPα 아미노산 서열에 상응하는 L4I, A27I, E47V 및 V92I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "서열번호 2에 제시되는 SIRPα 아미노산 서열에 상응하는" 또는 "서열번호 2에에 상응하는"은 임의의 다른 SIRPα 아미노산 서열에 대한 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 것이다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 25를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 25로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 35를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 35로 이루어진다.
보존적 아미노산 및 비-보존적 아미노산 치환에 대한 추가의 기술은 본원 이하에 더 제공된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 SIRPα은 상기 폴리펩타이드 서열번호 24 또는 26과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하거나 상동성일 수 있거나; 또는 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열(본원 이하에 추가로 기술되는 바와 같음)과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 가지며, 각각의 가능성(possibility)은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 26과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 상응하는 아미노산 분절 K117 - Y343을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 상응하는 아미노산 잔기 K117 - Y343 중 어느 것을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 32 또는 이의 임의의 단편을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 32를 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열의 C-말단은 서열번호 8로 종결된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 26을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 26으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33 및/또는 서열번호 34와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 가지며, 각각의 가능성(possibility)은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33 및/또는 서열번호 34와 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33 및/또는 서열번호 34와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 34와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33 또는 서열번호 34를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 34를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33 또는 서열번호 34로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 33으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 핵산 서열은 서열번호 34로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 100개 내지 500개의 아미노산, 150개 내지 450개의 아미노산, 200개 내지 400개의 아미노산, 250개 내지 400개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 320개 내지 420개의 아미노산, 340개 내지 350개의 아미노산을 포함하고, 각각의 가능성(possibility)은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 300개 내지 400개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 340개 내지 450개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 343개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 100개 내지 200개의 아미노산, 100개 내지 150개의 아미노산, 100개 내지 125개의 아미노산, 100개 내지 120개의 아미노산, 100개 내지 119개의 아미노산을 포함하고, 각각의 가능성(possibility)은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 100개 내지 119개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 105개 내지 119개의 아미노산, 110개 내지 119개의 아미노산, 115개 내지 119개의 아미노산, 105개 내지 118개의 아미노산, 110개 내지 118개의 아미노산, 115개 내지 118개의 아미노산, 105개 내지 117개의 아미노산, 110개 내지 117개의 아미노산, 115개 내지 117개의 아미노산이고, 각각의 가능성(possibility)은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 적어도 115개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 115개 내지 119개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 116개 길이의 아미노산이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "4-1BBL(CD137L 및 TNFSF9로서도 공지되어 있음)"은 TNFSF9 유전자(유전자 ID8744)의 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 동족체, 예를 들면 기능성 단편을 말한다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 용어 "4-1BBL"은 4-1BBL 폴리펩타이드의 기능성 동족체를 말한다. 특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL은 인간 4-1BBL이다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 단백질은 하기 GenBank 번호 NP_003802에 제공되는 바와 같은 인간 단백질을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "기능성 동족체(functional homolog)" 또는 "기능성 단편(functional fragment)"은 4-1BBL과 관련된 경우 전장 4-1BBL의 활성, 예를 들면 (i) 4-1BB에 결합함; (ii) 4-1BB를 신호전달 경로를 활성화함; (iii) 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 활성화함, (iv) 동종 삼량체를 형성함을 유지하는 폴리펩타이드의 일부를 말한다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL과 관련된 경우 상기 기능성 동족체는 (i), (ii), (iii), (i)+(ii), (i)+(iii), (ii)+(iii)을 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL과 관련된 경우 상기 기능성 동족체는 (i)+(ii)+(iii)을 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL과 관련된 경우 상기 기능성 동족체는 (iv), (i)+(iv), (ii)+(iv), (iii)+(iv), (i)+(ii)+(iv), (i)+(iii)+(iv), (ii)+(iii)+(iv)을 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL과 관련된 경우 상기 기능성 동족체는 (i)+(ii)+(iii)+(iv)을 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BB 단백질은 하기 GenBank 번호 NP_001552에 제공되는 바와 같은 인간 단백질을 말한다.
결합을 시험하기 위한 검정은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 본원 상기에 추가로 기술된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL은 SPR 분석에 의해 측정시 0.1 내지 1000nM, 0.1nM 내지 100nM, 1nM 내지 100nM, 또는 55.2nM의 Kd로 4-1BB에 결합하고, 각각의 가능성은 청구된 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
삼량체화(trimerization)를 시험하기 위한 검정은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, NATIVE-PAGE, SEC-HPLC 2D 겔, 겔 여과(gel filtration), SEC-MALS, 분석적 초원심분리(AUC: Analytical ultracentrifugation), 질량 분광분석법(Mass spectrometry(MS)), 모세관 겔 전기영동(CGE: capillary gel electrophoresis(CGE))이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "활성화하는" 또는 "활성화"는 세포 증식, 성숙, 사이토카인 생산, 식세포 작용(phagocytosis) 및/또는 조절 및 이펙터(effector) 기능의 유도를 초래하는 면역 세포(예를 들면, T 세포, B 세포, NK 세포, 식세포(phagocytic cell))를 자극하는 프로세스를 말한다.
특정 실시형태들에 따르면, 활성화는 공동-자극을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "공동-자극하는(co-stimulating)" 또는 "공동-자극(co-stimulation)"은 상기 면역 세포의 활성화를 초래하는 2차 항원 독립적 자극 신호(예를 들면, 4-1BB 신호)를 전송하는 것을 말한다.
특정 실시형태들에 따르면, 활성화는 상기 면역 세포의 활성화를 초래하는 억제 신호(예를 들면, CD47 신호)를 억제하는 것을 포함한다.
자극 또는 억제 신호의 신호전달을 측정하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 또한 이어지는 실시예 섹션에 개시되어 있으며, 예를 들면, 비아코어, HPLC 또는 유세포측정법을 이용한 결합 검정, 키나제(kinase) 활성 검정과 같은 효소 활성 검정, 및 예를 들면 PCR, 웨스턴 블롯, 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역조직화학(immunohistochemistry)을 이용한 신호전달 캐스케이드(cascade)와 관련된 분자의 발현이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 추가로 또는 대안으로, 신호(공동-자극 또는 억제) 전송의 결정은 면역 세포 활성 또는 기능을 평가함으로써 달성될 수 있다. 면역 세포 활성화 또는 기능의 평가 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, CFSE 염색, MTS, 알라마르 블루(Alamar blue), BRDU 및 티미딘 이입(thymidine incorporation)과 같은 증식 검정, CFSE 염색, 크로뮴 방출, 칼신(Calcin) AM과 같은 세포 독성 검정, 세포내 사이토카인 염색, ELISPOT 및 ELISA와 같은 사이토카인 분비 검정, 유세포측정법을 이용한 CD25, CD69, CD137, CD107a, SIRPα 및 CD62L과 같은 활성 마커의 발현이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시형태들에 따르면, 신호전달 활성 또는 활성화의 결정은 본원 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 시험관내에서(in-vitro) 또는 생체외에서(ex-vivo), 예를 들면 혼합 림프구 반응(MLR: mixed lymphocyte reaction)에서 달성된다.
동일한 배양 조건에 대해, 상기 신호전달 활성 또는 상기 면역 세포 활성화 또는 기능은 일반적으로 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 암호화하는 숙주 세포와 접촉하지 않거나; 또는 대조군으로서도 칭하는 비히클(vehicle) 대조군과 접촉한 동일한 종의 세포에서의 신호전달, 활성화 또는 기능과 비교하여 표현된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL은 상기 4-1BBL의 세포외 도메인 또는 이의 기능성 단편을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 36을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 36으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 37을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 37로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 38을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 38로 이루어진다.
상기 용어 "4-1BBL"은 또한 원하는 활성(본원 상기에 정의된 바와 같음)을 나타내는 기능성 동족체(천연 발생 또는 합성적으로/재조합적으로 생산됨)를 포함한다. 이러한 동족체들은 예를 들면, 상기 폴리펩타이드 서열번호 3, 서열번호 36과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하거나 상동성일 수 있거나; 또는 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열(본원 이하에 추가로 기술되는 바와 같음)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 기능성 동족체는 상기 폴리펩타이드 서열번호 3, 서열번호 36과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하거나 상동성이거나; 또는 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드(본원 이하에 추가로 기술되는 바와 같음)와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 폴리펩타이드는 본원 상기 및 하기 추가로 기술되는 바와 같이 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 4-1BBL은 상기 폴리펩타이드 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하거나 상동성이거나; 또는 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열(본원 하기에 추가로 기술되는 바와 같음)과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및/또는 서열번호 28과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 및/또는 서열번호 23과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 23과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 27과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 28과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 V6를 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 G14를 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 잔기 A1 내지 V6 또는 A1 내지 G14 중 어느 것도 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "서열번호 3에 상응하는"은 임의의 다른 4-1BBL 아미노산 서열에 비교하여 상응하는 아미노산 잔기를 포함하는 것을 의미한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 7 또는 이들의 임의의 단편을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 7을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 23을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBLα 아미노산 서열은 서열번호 27을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 28을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 23으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBLα 아미노산 서열은 서열번호 27로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 28로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198 내지 E205를 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 잔기 G198 내지 E205를 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 97 또는 이의 임의의 단편을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 97을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 서열번호 76을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 74 또는 서열번호 76으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72와 적어도 80%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72와 적어도 85%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72와 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72와 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1-E23을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 잔기 A1 내지 E23 중 어느 것도 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 98 또는 이의 임의의 단편을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 98을 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 72로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70과 적어도 85%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70과 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70과 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 70으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및/또는 서열번호 42와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및/또는 서열번호 42와 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및/또는 서열번호 42와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39 및/또는 서열번호 40과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39 또는 서열번호 40을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 40을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBLα 핵산 서열은 서열번호 41을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 42를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39 또는 서열번호 40으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 39로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 40으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 41로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 42로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 75 및/또는 서열번호 77과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 75 및/또는 서열번호 77과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 75 및/또는 서열번호 77과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 75 또는 서열번호 77을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 75 또는 서열번호 77로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 73과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 73과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 73과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 73을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 73으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 71과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 71과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 71과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 71을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 71로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 100개 내지 300개의 아미노산, 150개 내지 250개의 아미노산, 100개 내지 250개의 아미노산, 150개 내지 220개의 아미노산, 180개 내지 220개의 아미노산, 180개 내지 210개의 아미노산, 185개 내지 205개의 아미노산, 190개 내지 210개의 아미노산을 포함하고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 190개 내지 210개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 204개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 185개 내지 200개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 185개 내지 199개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 170개 내지 197개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 170개 내지 182개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 184개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 185개, 191개, 197개 또는 199개 길이의 아미노산들이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 184개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 183개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 182개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 176개 길이의 아미노산들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 본원에 개시된 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 상기 4-1BBL 폴리펩타이드에 포함된 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 3중 반복의 각각은 하기: (i) 4-1BB에 결합함; (ii) 4-1BB를 신호전달 경로를 활성화함; (iii) 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 활성화함, (iv) 동종 삼량체를 형성함 중 적어도 하나를 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 상기 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복의 각각의 사이에 링커를 포함하지 않는다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복의 각각의 사이에 링커를 포함한다. 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 링커가 본 발명의 특정 실시형태들과 함께 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 링커들의 비-제한적 예는 본원 이하에 상세하게 기술된다.
한 특정 실시형태에 따르면, 상기 링커는 (GGGGS)x2+GGGG(서열번호 82) 링커이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 반복된 서열은 본원에 정의된 바와 같은 상기 4-1BBL 중 임의의 것일 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 3중 반복은 동일한 4-1BBL 아미노산 서열을 갖는다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 3중 반복은 독특하다, 즉 상이한 4-1BBL 아미노산 서열들을 갖는다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 3중 반복 중 둘은 동일한 4-1BBL 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 3중 반복 적어도 하나는 본원에 개시된 4-1BBL 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 3중 반복 적어도 하나는 본원에 개시된 4-1BBL 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 23을 포함하는 아미노산 서열의 3중 반복을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 23으로 이루어진 아미노산 서열의 3중 반복을 포함한다.
따라서, 특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 78과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 78과 적어도 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 78과 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 78과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 78과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 78을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 78로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 79와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 79와 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 핵산 서열은 서열번호 79와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 79를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 79로 이루어진다.
상기 용어 "DSP" 및 "융합 단백질", "키메라 단백질" 또는 "키메라"는 본원에서 상호교환적으로(interchangeably) 사용되고, 자연에서 단일 아미노산 서열에서 함께 발견되지 않는 2개 이상의 부분을 갖는 아미노산 서열을 말한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 융합 단백질은 SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열을 포함한다(본원에서 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질로서 칭함).
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα은 상기 4-1BBL에 대한 N-말단이다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα은 상기 4-1BBL에 대한 C-말단이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 본원에서 정의되는 바와 같은 임의의 SIRPα; 및 하기:
(a) 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 197개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198 내지 E205를 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 72와 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 182개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 E23을 포함하지 않는 것이거나, 또는 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는 184개 길이의 아미노산들이고, 및/또는;
(b) 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함하는, 임의의 4-1BBL 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다. 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 본원에 정의된 바와 같은 임의의 SIRPα; 및 예를 들면 본원에 개시된 바와 같이 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 가지며 185개 내지 202개 길이의 아미노산인 임의의 4-1BBL 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은, 예를 들면 본원에서 정의되는 바와 같은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 95%의 동일성을 갖고 100개 내지 119개 길이의 아미노산인 임의의 SIRPα 아미노산 서열; 및 본원에 개시되는 바와 같은 임의의 4-1BBL을 포함할 수 있고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은, 예를 들면 본원에 개시된 바와 같은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 95%의 동일성을 가지며 100개 내지 119개 길이의 아미노산인 임의의 SIRPα 아미노산 서열; 및 하기:
(a) 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 197개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198 내지 E205를 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 72와 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 182개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 E23을 포함하지 않는 것이거나, 또는 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는 184개 길이의 아미노산들이고, 및/또는;
(b) 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함하는, 임의의 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는, 임의의 4-1BBL 아미노산 서열을 포함할 수 있고; 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은, 예를 들면 본원에 개시되는 바와 같은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 95%의 동일성을 가지며 100개 내지 119개 길이의 아미노산인 임의의 SIRPα 아미노산 서열; 및 예를 들면 본원에 개시되는 바와 같은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 가지며 185개 내지 202개 길이의 아미노산인 임의의 4-1BBL 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 24 내지 서열번호 26 및/또는 서열번호 29와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은:
(a) 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 170개 내지 197개 길이의 아미노산으로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198-E205을 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 72와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 170개 내지 182개 길이의 아미노산으로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1-E23을 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는 184개 길이의 아미노산이고; 및/또는
(b) 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함하는 것이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 24 내지 서열번호 26 또는 서열번호 29를 포함하고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은:
(a) 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28을 포함하는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76을 포함하는 170개 내지 197개 길이의 아미노산이거나, 서열번호 72를 포함하는 170개 내지 182개 길이의 아미노산이거나, 서열번호 70을 포함하는 184개 길이의 아미노산이고; 및/또는
(b) 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함하는 것이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 24 내지 서열번호 26 또는 서열번호 29로 제시되고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 72 또는 서열번호 70으로 제시되고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 24 내지 서열번호 26 또는 서열번호 29와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및/또는 서열번호 28과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이며, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 24 내지 서열번호 26 또는 서열번호 29를 포함하고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28을 포함하는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이며, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 24 내지 서열번호 26 또는 서열번호 29로 제시되고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28로 제시되고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 25와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및/또는 서열번호 28과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 25를 포함하고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28을 포함하는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 25로 제시되고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28로 제시된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2를 포함하고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23을 포함하는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2로 제시되고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23으로 제시된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 28 및/또는 서열번호 36과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 것이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26을 포함하는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 28 및/또는 서열번호 36을 포함하는 것이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26으로 제시되고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 28 및/또는 서열번호 36으로 제시된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 26과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 것이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26을 포함하는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28을 포함하는 것이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26으로 제시되고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28로 제시된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및/또는 서열번호 28과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26을 포함하는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및/또는 서열번호 28을 포함하는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및/또는 서열번호 26으로 제시되고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및/또는 서열번호 28로 제시된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24를 포함하는 100개 내지 119개 길이의 아미노산이고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22를 포함하는 185개 내지 202개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24로 제시되고; 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22로 제시된다.
본 발명의 특정 실시형태들과 함께 사용될 수 있는 SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열의 특정 조합의 비-제한적 예는 이어지는 실시예 섹션의 표 4에 제공되고, 이는 본 명세서의 필수적인 부분으로서의 역할을 한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드 또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 가용성이다(즉, 합성 또는 천연 발생 표면에 고정되지 않음).
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드 또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 합성 또는 천연 발생 표면에 고정된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 가용성이다(즉, 합성 또는 천연 발생 표면에 고정되지 않음).
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 합성 또는 천연 발생 표면에 고정된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 적어도 동종-삼량체의 형태로 존재한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%는 적어도 동종-삼량체의 형태로 존재하고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 동종-삼량체를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 동종-사량체를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 동종-오량체를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 동종-육량체를 포함한다.
삼량체화를 측정하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, NATIVE-PAGE, SEC-HPLC 2D 겔, 겔 여과, SEC-MALS, 분석적 초원심분리(AUC), 질량 분광분석법(MS), 모세관 겔 전기영동(CGE)이 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 SEC-MALS에 의해 측정시 분자량이 적어도 100kD, 적어도 140kD, 적어도 160kD, 적어도 180kD, 적어도 200kD, 적어도 220kD, 적어도 240kD, 적어도 250kD이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 SEC-MALS에 의해 측정시 분자량이 적어도 100kD이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 SEC-MALS에 의해 측정시 분자량이 적어도 240kD이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 적어도 동종-삼량체는 SEC-MALS에 의해 측정시 분자량이 약 250 내지 270kD이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL은 상기 SIRPα과 상기 4-1BBL 사이에 링커를 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 상기 SIRPα과 상기 4-1BBL 사이에 링커를 포함한다.
당해 분야에 공지되어 있는 임의의 링커는 본 발명의 특정 실시형태들과 함께 사용될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 천연-발생 다중-도메인 단백질로부터 유도될 수 있거나, 또는 예를 들면, 문헌[Chichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2): 153-167, Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369]에 기술되어 있는 바와 같은 실증적 링커이고, 상기 문헌의 전문은 본원에 참조에 의해 포함된다. 몇몇의 실시형태들에 있어서, 상기 링커는 문헌[Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369 and Crasto et al., (2000), Protein Eng. 13(5):309-312]에 기술된 것들과 같은 링커 고안 데이터베이스 및 컴퓨터 프로그램을 이용하여 고안될 수 있고, 상기 문헌의 전문은 본원에 참조에 의해 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 PEG와 같은 합성 링커이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 항체(예를 들면, IgG, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 이의 단편의 Fc 도메인 또는 힌지(hinge) 영역이다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 항체 또는 이의 단편의 Fc 도메인 또는 힌지 영역이 아니다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 인간 IgG4의 Fc 도메인 또는 힌지 영역이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 Fc 도메인 링커는 서열번호 95를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 인간 IgG1의 Fc 도메인 또는 힌지 영역이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 Fc 도메인 링커는 서열번호 96을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 Fc 도메인 또는 상기 힌지 영역 링커는 보존적 및 비-보존적 아미노산 치환(본원에서 돌연변이로서도 칭함)을 포함할 수 있다. 이러한 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 기능성일 수 있다. 예를 들면, 상기 링커는 제한 없이 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 안정성을 개선하고/하거나, 발현을 개선하고/하거나, 약동학(pharmacokinetics)을 개선하고/하거나, 생물활성(bioactivity)을 개선하는 기능을 할 수 있다. 다른 예에서, 상기 링커는 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 특정 세포 유형 또는 위치에 대해 표적하는 기능을 할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 폴리펩타이드이다.
폴리펩타이드 링커의 비-제한적 예로는 서열 LE, GGGGS(서열번호 85), (GGGGS)n(n=1 내지 4)(서열번호 84), GGGGSGGGG(서열번호 83), (GGGGS)x2(서열번호 86), (GGGGS)x2+GGGG(서열번호 82), (Gly)8, (Gly)6, (EAAAK)n(n=1 내지 3)(서열번호 87), A(EAAAK)nA(n = 2 내지 5)(서열번호 88), AEAAAKEAAAKA(서열번호 89), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 90), PAPAP(서열번호 91), K ESGSVSS EQ LAQ FRS LD(서열번호 92), EGKSSGSGSESKST(서열번호 93), GSAGSAAGSGEF(서열번호 94) 및 X가 임의의 아미노산, 예를 들면 Ala, Lys 또는 Glu를 나타내는 (XP)n을 갖는 링커가 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 GGGGS(서열번호 85), (GGGGS)n(n=1 내지 4)(서열번호 84), GGGGSGGGG(서열번호 83), (GGGGS)x2(서열번호 86), (GGGGS)x2+GGGG(서열번호 82)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 (GGGGS)n(n=1 내지 4)(서열번호 84) 링커이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 (GGGGS)x2(서열번호 86) 링커이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 GGGGSGGGG(서열번호 83) 링커이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 (GGGGS)x2+GGGG(서열번호 82) 링커이다.
몇몇의 실시형태들에 있어서, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 1개 내지 6개 길이의 아미노산들의 링커를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 실질적으로 글리신 및/또는 세린 잔기(예를 들면, 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97% 또는 100%의 글리신 및 세린)로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 링커는 단일 아미노산 링커이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 있어서, SIRPα 및 4-1BBL을 연결하는 아미노산은 본원에서 SIRPα-G-4-1BBL 융합 단백질로서도 칭하는 글리신이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 13과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 16과 적어도 95%의 동일성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 13을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 16을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 13으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 16으로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 200개 내지 900개 길이의 아미노산, 200개 내지 700개 길이의 아미노산, 250개 내지 650개 길이의 아미노산, 250개 내지 600개 길이의 아미노산, 250개 내지 550개 길이의 아미노산이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 270개 내지 750개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 290개 내지 750개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 290개 내지 550개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 297개 내지 543개 길이의 아미노산이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 296개 내지 542개 길이의 아미노산이다.
본 발명의 특정 실시형태들과 함께 사용할 수 있는 특정 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 비-제한적 예는 이어지는 실시예 섹션의 표 4에 제공되고, 이는 본 명세서의 필수적인 부분으로서의 역할을 한다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2에 제시되어 있는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열 및 서열번호 3에 제시되어 있는 바와 같은 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2에 제시되어 있는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열 및 서열번호 3에 제시되어 있는 바와 같은 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율보다 적어도 1.5배 더 높다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2에 제시되어 있는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열 및 서열번호 3에 제시되어 있는 바와 같은 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율보다 적어도 2배 더 높다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 생산 수율보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 생산 수율보다 적어도 1.5배 더 높다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 생산 수율보다 적어도 2배 더 높다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2의 생산 수율보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 3의 생산 수율보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 응집체의 양은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2에 제시되어 있는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열 및 서열번호 3에 제시되어 있는 바와 같은 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 응집체의 양보다 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 더 낮고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 응집체의 양은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 응집체의 양보다 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 더 낮고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 응집체의 양은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 응집체의 양보다 적어도 20% 더 낮고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 응집체의 양은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 응집체의 양보다 적어도 50% 더 낮고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 활성은 예를 들면, 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2에 제시되어 있는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열 및 서열번호 3에 제시되어 있는 바와 같은 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 활성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 활성은 예를 들면, 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 활성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 활성은 예를 들면, 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2의 활성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 활성은 예를 들면, 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 3의 활성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 안정성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 3에 제시되어 있는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 안정성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 안정성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 안정성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 안정성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2의 안정성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 안정성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 3의 안정성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 안전성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2에 제시되어 있는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열 및 서열번호 3에 제시되어 있는 바와 같은 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 안전성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 안전성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 안전성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 안전성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 2의 안전성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드의 안전성은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 3의 안전성보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배 더 높고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 생산 조건은 포유동물 세포에서의 발현 및 5 내지 13일 동안 32℃ 내지 37℃, 5% 내지 10%의 CO2에서의 배양을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태들과 함께 사용할 수 있는 생산 조건들의 비-제한적 예는 이어지는 실시예 섹션에 개시된다.
따라서, 예를 들면 상기 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터, N 말단에 인공적 신호 펩타이드(예를 들면, 서열번호 4) 및 His-태그 및 C 말단에 정지 코돈(codon)을 포함하는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드 또는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 Expi293F 또는 ExpiCHO 세포와 같은 포유동물 세포에서 발현된다. 상기 형질도입된(transduced) 세포는 이어서 Expi293F 또는 ExpiCHO 세포 제조업자 지침(Thermo)에 따라 세포-특이적 배양 배지에서 32℃ 내지 37℃, 5 내지 10% CO2에서 배양하고, 적어도 5일의 배양 후 상청액(supernatant)으로부터 단백질을 수집하고 정제한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 배양은 배치(batch), 분할-배치(split-batch), 유가-배치(fed-batch) 또는 관류(perfusion) 방식으로 작동된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 배양은 유가-배치 조건 하에 작동된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 배양은 37℃에서 달성된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 배양은 32℃로의 온도 변화(temperature shift)를 갖는 37℃에서 달성된다. 이러한 온도 변화는 정지상(stationary phase)에 도달하기 전에 세포 대사를 서행시키기 위해 달성될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 CD47에 결합할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포에 의해 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킬 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇 실시형태의 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드는 서열번호 2와 비교하여 본원에 개시된 바와 같은 향상된 활성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 하기:
(i) 4-1BB에 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함; 및/또는
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극함
중 적어도 하나를 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 서열번호 3과 비교하여 본원에 개시되어 있는 바와 같은 향상된 활성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 (i), (ii), (iii), (i)+(ii), (i)+(iii), (ii)+(iii), (i)+(ii)+(iii)을 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 하기:
(i) CD47 및 4-1BB를 결합함;
(ii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포(예를 들면, T 세포)에서 상기 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함;
(iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포(예를 들면, T 세포)를 활성화함; 및/또는
(iv) 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포에 의해 상기 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킴;
중 적어도 하나를 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 서열번호 2에 제시되는 바와 같은 SIRPα 아미노산 서열 및 서열번호 3에 제시되는 바와 같은 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질과 비교하여 본원에 개시되는 바와 같이 향상된 활성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 서열번호 5와 비교하여 본원에 개시되는 바와 같이 향상된 활성을 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 (i), (ii), (iii), (iv), (i)+(ii), (i)+(iii), (i)+(iv), (ii)+(iii), (ii)+(iv), (i)+(ii)+(iii), (i)+(ii)+(iv), (ii)+(iii)+(iv)을 행할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 (i)+(ii)+(iii)+(iv)을 행할 수 있다.
결합을 결정하고, 4-1BB 신호전달 경로를 활성화하고 면역 세포를 활성화하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 본원의 상기 및 하기 및 이어지는 실시예 섹션에 추가로 기술된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드는 식세포에 의해 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킨다.
식세포 작용을 분석하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 또한 이어지는 실시예 섹션의 실험 4에 개시되어 있다; 예를 들면 사멸 분석(killing assay), 유세포 분석 및/또는 현미경 평가 (살아 있는 세포 이미징, 형광 현미경 공초점 현미경, 전자 현미경)를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 식세포 작용의 향상은, 예를 들면 유세포 분석 또는 현미경 평가에 의해 측정된 바와 같이, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드의 부재 하의 동일한 것, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구조물 또는 본 발명의 동일한 것을 발현하는 숙주와 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 20배이다.
다른 특정 실시형태에 따르면, 생존율의 증가는, 예를 들면 유세포 분석 또는 현미경 평가에 의해 측정된 바와 같이, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드의 부재 하의 동일한 것, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구조물 또는 본 발명의 동일한 것을 발현하는 숙주와 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 조성물(예를 들면, 상기 융합 단백질)로서, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 또는 (이를 발현하는) 숙주 세포는 면역 세포를 활성화할 수 있고, 이들은 시험관내에서, 생체외에서 및/또는 생체내에서(in-vivo) 면역 세포를 활성화하는 방법에서 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 양상에 따르면, 면역 세포를 활성화하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드 및/또는 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포의 존재시에 면역 세포를 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화하는 단계를 포함하는 것인, 면역 세포를 활성화하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, T 세포를 활성화하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 개시되는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 및 CD47을 발현하는 세포의 존재시에 T 세포를 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화하는 단계를 포함하는 것인, T 세포를 활성화하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 식세포를 활성화하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 개시되는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 및/또는 CD47을 발현하는 세포 및 본원에 개시되는 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드의 존재시에 T 세포를 시험관내에서 또는 생체외에서 활성화하는 단계를 포함하는 것인, 식세포를 활성화하는 방법이 제공된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포; 및 상기 4-1BBL 아미노산 서열, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 4-1BB를 발현한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 말초 단핵구 혈액 세포(PBMC: peripheral mononuclear blood cell)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "말초 단핵구 혈액 세포(PBMC)"는 단일 핵을 갖는 혈액 세포를 말하고, 림프구, 단핵구 및 수지상 세포(DC: dendritic cell)가 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 PBMC는 수지상 세포(DC), T 세포, B 세포, NK 세포 및 NKT 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한다.
PBMC를 수득하는 방법은 대상체로부터의 전혈을 채취하고 항-응고제(예를 들면, 헤파린 또는 시트레이트)를 함유하는 용기(container)에 수집하는 것; 및 성분채집술(apheresis)과 같이 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이어서, 특정 실시형태들에 따르면, 적어도 하나의 유형의 PBMC가 말초 혈액으로부터 정제된다. 전혈로부터 PBMC를 정제하기 위한 몇몇의 방법들 및 시약들, 예를 들면 백혈구 성분채집술(leukapheresis), 침강(sedimentation), 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)(예를 들면, 피콜(ficoll)), 원심 세정(centrifugal elutriation), 분획화(fractionation), 예를 들면, 적혈구 세포의 화학적 용해(예를 들면, ACK에 의함), 세포 표면 마커를 이용한 특이적 세포 유형의 선별(selection)[예를 들면, 인비트로겐(Invitrogen), 스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies), 셀프로(Cellpro), 어드밴스트 마그네틱스(Advanced Magnetics) 또는 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec.)으로부터 상업적으로 입수가능한 예를 들면, FACS 분류기 또는 마그네틱 셀 분리(magnetic cell separation) 기술을 이용함], 및 특이적 항체로의 근절(eradication)(예를 들면, 사멸)과 같은 방법에 의한 또는 음성 선택(negative selection)(예를 들면, 마그네틱 셀 분리 기술, FACS 분류기 및/또는 포획 ELISA 라벨링(capture ELISA labeling)을 이용함)에 기초한 친화성 기반 정제에 의한 특이적 세포 유형의 고갈(depletion)이 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 문헌[THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor)] 및 문헌[FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000)]에 기술되어 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 종양 침윤 림프구를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte)"는 혈류를 막고 종양으로 이동하지 않은 단핵구 백혈구 세포를 말한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 TIL은 T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
TIL을 수득하는 방법은 예를 들면, 생검(biopsy) 또는 부검(necropsy)에 의해 대상체로부터 종양 샘플을 수득하고 이의 단일 세포 현탁액을 조제하는 것과 같이 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 상기 단일 세포 현탁액은 임의의 적합한 방식, 예를 들면 기계적으로(예를 들면, GentleMACS(TM) 분해기(밀테니 바이오텍, 오번, 캘리포니아)를 사용하여 종양을 분해함) 또는 효소적으로(예를 들면, 콜라게나 제 또는 DNase) 수득될 수 있다. 이어서, 적어도 하나의 유형의 TIL은 상기 세포 현탁액으로부터 정제될 수 있다. 원하는 유형의 TIL을 정제하기 위한 몇몇의 방법들 및 시약들, 예를 들면 세포 표면 마커를 이용한 특이적 세포 유형의 선별[예를 들면, 인비트로겐, 스템셀 테크놀로지스, 셀프로, 어드밴스트 마그네틱스 또는 밀테니 바이오텍으로부터 상업적으로 입수가능한 예를 들면, FACS 분류기 또는 마그네틱 셀 분리 기술을 이용함], 및 특이적 항체로의 근절(예를 들면, 사멸)과 같은 방법에 의한 또는 음성 선택(예를 들면, 마그네틱 셀 분리 기술, FACS 분류기 및/또는 포획 ELISA 라벨링을 이용함)에 기초한 친화성 기반 정제에 의한 특이적 세포 유형의 고갈이 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 문헌[THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor)] 및 문헌[FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000)]에 기술되어 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 식세포 작용 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "식세포"는 식세포 작용을 할 수 있는 세포를 말하고, 전문 및 비-전문 식세포 둘 다를 포함한다. 식세포 작용을 분석하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 상기 및 하기에 더 개시된다. 특정 실시형태들에 따르면, 식세포 작용 세포는 단핵구, 수지상 세포(DC) 및 과립구(granulocyte)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 식세포는 과립구를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 식세포는 단핵구를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 단핵구를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 용어 "단핵구"는 순환하는 단핵구 및 조직에 존재하는 대식세포(단핵구 식세포로서도 칭함) 둘 다를 말한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 단핵구는 대식세포를 포함한다. 전형적으로, 대식 세포의 세포 표면 표현형(phenotype)으로는 CD14, CD40, CD11b, CD64, F4/80(마우스)/EMR1(인간), 라이소자임(lysozyme) M, MAC-1/MAC-3 및 CD68이 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 단핵구는 순환하는 단핵구를 포함한다. 전형적으로, 순환하는 단핵구의 세포 표면 표현형으로는 CD14 및 CD16(예를 들면, CD14++ CD16-, CD14+CD16++, CD14++CD16+)이 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 DC를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "수지상 세포(DC)"는 림프 또는 비-림프 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 임의의 구성원을 말한다. DC는 전문적인 항원 제시 세포(antigen presenting cell)의 한 부류이고, HLA-제한된 T 세포를 감작하기 위한 높은 능력을 갖는다. DC로는 예를 들면, 형질세포양(plasmacytoid) 수지상 세포, 골수성 수지상 세포(미성숙 및 성숙 수지상 세포 포함), 랑게르한스(Langerhans) 세포, 지상감입 세포(interdigitating cell), 소포성(follicular) 수지상 세포가 포함된다. 수지상 세포는 기능에 의해 또는 표현형, 특히 세포 표면 표현형에 의해 인식될 수 있다. 이들 세포는 세포 표면 상의 베일(veil)-유사 돌출부를 갖는 이들의 독특한 형태, 중간 내지 높은 수준의 표면 HLA-클래스 II 발현 및 T 세포에, 특히 나이브(naive) T 세포에 항원을 제시하는 능력을 특징으로 한다(문헌[Steinman R, et al., Ann. Rev. Immunol. 1991; 9:271-196.]을 참조한다). 전형적으로, DC의 세포 표면 표현형으로는 CD1a+, CD4+, CD86+ 또는 HLA-DR이 포함된다. 상기 용어 DC는 미성숙 및 성숙 DC 둘 다를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 과립구를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "과립구"는 이들의 세포질에서 과립의 존재를 특징으로 하는 다형핵 백혈구를 말한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 과립구는 호중구(neutrophil)를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 과립구는 비만 세포(mast cell)를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 T 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "T 세포"는 CD4+ 또는 CD8+ 표현형 중 어느 하나를 갖는 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)+, CD3+를 갖는 분화된 림프구를 말한다. 상기 T 세포는 이펙터 또는 조절 T 세포 중 어느 하나일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "이펙터(effector) T 세포"는 예를 들면, 사이토카인을 생산함으로써 다른 면역 세포를 활성화하거나 지시하는 T 세포를 말하고, 세포독성 활성을 갖고, 예를 들면 CD4+, Th1/Th2, CD8+ 세포독성 T 림프구이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "조절 T 세포" 또는 "Treg"는 이펙터 T 세포뿐만 아니라 선천적(innate) 면역계 세포를 포함하는 다른 T 세포의 활성화를 음성적으로(negatively) 조절하는 T 세포를 말한다. Treg 세포는 이펙터 T 세포 반응의 지속적인 억제를 특징으로 한다. 한 특정 실시형태에 따르면, Treg는 CD4+CD25+Foxp3+ T 세포이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포이다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 T 세포는 기억(memory) T 세포이다. 기억 T 세포의 비-제한적 예로는 CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7- 표현형을 갖는 이펙터 기억 CD4+ T 세포, CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7+ 표현형을 갖는 중앙 기억 CD4+ T 세포, CD3+/CD8+ CD45RA-/CCR7- 표현형을 갖는 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 CD3+/CD8+ CD45RA-/CCR7+ 표현형을 갖는 중앙 기억 CD8+ T 세포가 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 T 세포는 목적하는 발현 생성물을 암호화하는 핵산 서열로 형질도입된 조작된(engineered) T 세포를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 목적하는 상기 발현 생성물은 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 어구 "TCR을 암호화하는 핵산 서열로 형질도입된" 또는 "TCR을 암호화하는 핵산 서열로의 형질도입"은 MHC의 맥락에서 제시되는 원하는 항원에 대한 특이성을 갖는 T 세포로부터의 가변성 α- 및 β-쇄(chain)의 클로닝(cloning)을 말한다. TCR로의 형질도입 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 문헌[Nicholson et al. Adv Hematol. 2012; 2012:404081; Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar;22(2):85-94)]; 및 문헌[Lamers et al, Cancer Gene Therapy (2002) 9, 613-623]에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "CAR을 암호화하는 핵산 서열로 형질도입된" 또는 "CAR을 암호화하는 핵산 서열로의 형질도입"은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열의 클로닝을 말하고, 여기서 상기 CAR은 항원 인식 모이어티 및 T-세포 활성화 모이어티를 포함한다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 인공적으로 작제된 하이브리드(hybrid) 단백질 또는 T-세포 신호전달 또는 T-세포 활성화 도메인에 연결된 항체(예를 들면, 단일쇄 가변성 단편(scFv: single chain variable fragment))의 항원 결합 도메인을 함유하는 폴리펩타이드이다. CAR로의 형질도입 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 예를 들면, 문헌[Davila et al. Oncoimmunology. 2012 Dec 1;1(9):1577-1583]; 문헌[Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar;22(2):85-94)]; 문헌[Maus et al. Blood. 2014 Apr 24;123(17):2625-35]; 문헌[Porter DL The New England journal of medicine. 2011, 365(8):725-733]; 문헌[Jackson HJ, Nat Rev Clin Oncol. 2016;13(6):370-383]; 및 문헌[Globerson-Levin et al. Mol Ther. 2014;22(5):1029-1038]에 개시되어 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 B 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "B 세포"는 B 세포 수용체(BCR)+, CD19+ 및 또는 B220+ 표현형을 갖는 림프구를 말한다. B 세포는 특이적 항원에 결합하여 체액성 반응을 유발하는 이들의 능력을 특징으로 한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 NK 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "NK 세포"는 CD16+ CD56+ 및/또는 CD57+ TCR- 표현형을 갖는 분화된 림프구를 말한다. NK는 특이적 세포용해성 효소의 활성화에 의해 "자기(self)" MHC/HLA 항원을 발현하는데 실패하는 세포에 결합하여 이를 사멸시키는 이들의 능력, NK 활성화 수용체에 대한 리간드를 발현하는 종양 세포 또는 다른 이환(diseased) 세포를 사멸시키는 능력, 및 상기 면역 반응을 자극하거나 억제하는 사이토카인이라고 칭하는 단백질 분자를 방출하는 능력을 특징으로 한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 NKT 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "NKT 세포"는 반-불변(semi-invariant) αβ T-세포 수용체를 발현하지만 NK1.1과 같은 NK 세포와 전형적으로 관련되어 있는 각종 분자 마커도 발현하는 T 세포의 특화된(specialized) 집단을 말한다. NKT 세포로는 NK1.1+ 및 NK1.1-, 및 CD4+, CD4-, CD8+ 및 CD8- 세포가 포함된다. NKT 세포 상의 상기 TCR은 MHC I-유사 분자 CD1d에 의해 제시된 당지질 항원을 인식한다는 점에서 고유하다. NKT 세포는 염증 또는 면역 내성(immune tolerance) 중 어느 하나를 촉진시키는 사이토카인을 생산하는 이들의 능력으로 인하여 보호 또는 유해 효과 중 어느 하나를 가질 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 건강한 대상체로부터 수득된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 병리(예를 들면, 암)를 앓고 있는 대상체로부터 수득된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 CD47 또는 외인성 CD47을 발현하는 세포의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 외인성 CD47을 발현하는 세포의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 외인성 CD47은 가용성이다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 외인성 CD47은 고체 지지체에 고정된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 CD47을 발현하는 세포의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 CD47을 발현하는 상기 세포는 병리학적(이환) 세포를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 CD47을 발현하는 상기 세포는 암 세포를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 적어도 1차 활성화 신호[예를 들면, 항원 제시 세포(APC) 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC: Major Histocompatibility Complex)/펩타이드 복합체와 T-세포 수용체(TCR)의 라이게이션(ligation)]을 전송할 수 있는 자극제의 존재시에 이루어지고, 이는 세포 증식, 성숙, 사이토카인 생산, 식세포 작용 및/또는 상기 면역 세포의 조절 또는 이펙터 기능의 유도를 초래한다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 자극제는 또한 2차 공동-자극 신호를 전송할 수 있다.
상기 자극제의 양 및 상기 자극제와 상기 면역 세포 사이의 비를 결정하는 방법은 당업자의 능력 내이고, 따라서 본원에 명시하지 않는다.
상기 자극제는 상기 면역 세포를 항원-의존적 또는 항원-독립적(즉, 폴리클로날(polyclonal)) 방식으로 활성화할 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 자극제는 항원 비-특이적 자극제를 포함한다.
비-특이적 자극제는 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 비-제한적 예로서, 상기 면역 세포가 T 세포를 포함하는 경우, 항원 비-특이적 자극제는 T 세포 표면 구조에 결합하여 상기 T 세포의 폴리클로날 자극을 유도할 수 있는 제제, 예를 들면 한정되는 것은 아니지만 항-CD28 항체와 같은 공동-자극 단백질과 병용된 항-CD3 항체일 수 있다. 다른 비-제한적 예로는 항-CD2, 항-CD137, 항-CD134, 노치(Notch)-리간드, 예를 들면, 델타-유사 1/4, 단독 또는 항-CD3과의 각종 조합으로의 Jaggedl/2가 포함된다. T 세포의 폴리클로날 자극을 유도할 수 있는 다른 제제로는 미토겐(mitogen), PHA, PMA-이오노마이신(ionomycin), CEB 및 CytoStim(밀테니 바이오테크)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 항원 비-특이적 자극제는 항-CD3 및 항-CD28 항체를 포함한다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 T 세포 자극제는 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 비드(bead), 예를 들면 밀테니 바이오텍으로부터 수득된 CD3CD28 MACSiBeads를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 자극제는 항원-특이적 자극제를 포함한다.
항원 특이적 T 세포 자극제의 비-제한적 예로는 항원-부하된(loaded) 항원 제시 세포[APC, 예를 들면 수지상 세포] 및 펩타이드 부하된 재조합 MHC가 포함된다. 따라서, 예를 들면, T 세포 자극제는 원하는 항원(예를 들면, 종양 항원)이 사전부하된 또는 원하는 항원을 암호화하는 mRNA로 형질감염된 수지상 세포일 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 항원은 암 항원이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "암 항원"은 비-암성 세포와 비교하여 암성 세포에 의해 과발현되거나 단독으로 발현된 항원을 말한다. 암 항원은 공지의 암 항원 또는 암 세포를 발병시키는 새로운 특이적 항원(즉, 신생항원(neoantigen))일 수 있다.
공지의 암 항원에 대한 비-제한적 예로는 MAGE-AI, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-AS, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-AS, MAGE-A9, MAGE-AIO, MAGE-All, MAGE-A12, GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-l, RAGE- 1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE- Cl/CT7, MAGE-C2, NY-ES0-1, LAGE-1, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 XAGE, 멜라닌세포(melanocyte) 분화 항원, p53, ras, CEA, MUCI, PMSA, PSA, 티로시나제(tyrosinase), Melan-A, MART-I, gplOO, gp75, 알파액티닌(alphaactinin)-4, Bcr-Abl 융합 단백질, Casp-8, 베타-카테닌(beta-catenin), cdc27, cdk4, cdkn2a, coa-l, dek-can 융합 단백질, EF2, ETV6-AML1 융합 단백질, LDLR-푸코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase)AS 융합 단백질, HLA-A2, HLA-All, hsp70-2, KIAA0205, Mart2, Mum-2, 및 3, neo-PAP, 미오신(myosin) 클래스 I, OS-9, pml-RAR 알파 융합 단백질, PTPRK, K-ras, N-ras, 트리오스포스페이트 이소머라제(Triosephosphate isomerase), GnTV, Herv-K-mel, NA-88, SP17, 및 TRP2-Int2, (MART-I), E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 항원, EBNA, 인간 유두종 바이러스(HPV: human papillomavirus) 항원 E6 및 E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, plSOerbB-3, c-met, nm-23Hl, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 알파-태아 단백질(fetoprotein), 13HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29＼BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼KP1, C0-029, FGF-5, 0250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB＼170K, NYCO-I, RCASI, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린(cyclophilin) C-관련 단백질), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, 티로시나제 관련 단백질, TRP-1 또는 TRP-2가 포함된다.
발현될 수 있는 다른 종양 항원은 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[W000/20581; Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridge]을 참조한다). 이들 종양 항원의 서열은 공공의 데이터베이스로부터 용이하게 입수가능하지만, 문헌[WO 1992/020356 AI, WO 1994/005304 AI, WO 1994/023031 AI, WO 1995/020974 AI, WO 1995/023874 AI & WO 1996/026214 AI]에서도 발견된다.
대안으로 또는 추가로, 종양 항원은 예를 들면, 생검에 의해 대상체로부터 수득된 암 세포를 이용하여 확인할 수 있다.
따라서, 특정 실시형태들에 따르면, 상기 자극제는 암 세포를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 활성화는 항암제의 존재시에 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 면역 세포는 상기 활성화 후에 정제된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 수득가능한 단리된 면역 세포를 고려하였다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명에 따라 사용되고/되거나 수득된 상기 면역 세포는 신선하게 단리되고, 보관, 예를 들면 향후 사용; 및 세포주(cell line)를 위해 장기간(예를 들면, 수개월, 수년) 동안 임의의 단계에서 예를 들면, 액체 질소 온도에서 냉동보존(cryopreserved)(즉 동결)될 수 있다.
냉동보존 방법은 당업자에 의해 흔히 공지되어 있고, 예를 들면, 국제 특허 출원 공개 제WO2007054160호 및 제WO 2001039594호 및 US 특허 출원 공개 제US20120149108호에 개시되어 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명에 따라 수득된 상기 세포는 세포 은행 또는 보관소 또는 보관 시설에 보관될 수 있다.
결과적으로, 본 교시는 또한 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들면 과다-증식성 질환; 면역 억제 및 감염과 관련된 질환에 대한 양자(adoptive) 면역 세포 치료요법들의 공급원으로서의 상기 단리된 면역 세포 및 본 발명의 방법의 사용을 제안하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 활성화 후에 상기 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 양자 전이하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 양자 세포 치료요법에서 사용하기 위한 본 발명의 방법에 따라 수득가능한 상기 면역 세포가 제공된다.
본 발명의 특정 실시형태들에 따라 사용되는 상기 세포는 자가(autologous) 또는 비-자가일 수 있고; 이들은 동계(syngeneic) 또는 비-동계: 대상체에 대해 동종이계(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic)일 수 있고; 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
본 교시는 또한 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법에 있어서 본 발명의 조성물(예를 들면, 상기 융합 단백질, 상기 SIRPα d아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 상기 4-1BB 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포)의 사용을 고려한다.
따라서, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드 및/또는 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물, 또는 이를 암호화하는 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환의 치료에 사용하기 위한 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드 및/또는 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 또는 이를 암호화하는 숙주 세포가 제공된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 치료하는 또는 상기 치료는 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 이용하여 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 치료하는 또는 상기 치료는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 이용하여 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 치료하는 또는 상기 치료는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 이용하여 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 치료하는 또는 상기 치료는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포; 및 상기 4-1BBL 아미노산 서열, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 이용하여 이루어진다.
상기 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 병리(질환, 장애 또는 의학적 병태)의 발병을 억제하거나, 예방하거나 또는 저지하고/하거나 병리 또는 병리의 증상의 감소, 경감 또는 퇴보를 야기하는 것을 말한다. 당업자들은 각종 방법론 및 검정을 이용하여 병리의 발병을 평가할 수 있고, 마찬가지로 각종 방법론 및 검정을 이용하여 병리의 감소, 경감 또는 퇴보를 평가할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"로는 포유동물, 예를 들면 임의의 연령 및 임의의 성별의 인간이 포함된다. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 용어 "대상체"는 병리(질환, 장애 또는 의학적 병태)를 앓고 있는 대상체를 말한다. 특정 실시형태들에 따르면, 이러한 용어는 병리를 발병할 위험이 있는 개체를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 대상체는 CD47을 발현하는 세포와 관련된 질환으로 고통받는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 대상체의 이환 세포는 CD47을 발현한다.
본원에서 사용되는 상기 어구 "면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환"은 대상체의 면역 반응 활성이 적어도 질환의 증상을 완화시키거나 증상의 개시를 지연시키는데 충분할 수 있지만 그렇게 하면 임의의 이유로 대상체의 면역 반응의 활성이 최적 미만인 것인 질환을 말한다.
면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환의 비-제한적 예로는 과다-증식성 질환, 면역 억제와 관련된 질환, 투약(medication)(예를 들면, mTOR 억제제, 칼시뉴린(calcineurin) 억제제, 스테로이드)에 의해 야기된 면역 억제 또는 감염과 관련된 질환 및 감염이 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 과다-증식성 질환을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 과다-증식성 질환은 경화증, 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 건선, 전신 경화증/피부경화증, 원발 담즙성 담관염, 원발 경화성 담관염, 간 섬유증, 방사선-유도된 폐 섬유증, 골수 섬유증 또는 후복막 섬유증의 예방을 포함한다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 과다-증식성 질환은 암을 포함한다.
따라서, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 본원에서 개시되는 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드 및/또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법이 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 암은 악성 및 전(pre)-악성 암 둘 다를 포함한다.
암의 전-악성 또는 양성 형태와 관련하여, 임의로 이의 조성물 및 방법은 전-악성 암의 악성 형태로의 진행을 정지시키기 위해 적용될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시형태들의 방법들에 의해 치료될 수 있는 암은 임의의 고형 또는 비-고형 암 및/또는 암 전이일 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 악성 암을 포함한다.
암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평 암종 포함), 복막의 암, 간세포암, 위암(gastric or stomach cancer)(위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암(kidney or renal cancer), 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암, 및 B-세포 림프종[저등급/소포성 비-호지킨 림프종(NHL: non-Hodgkin's lymphoma); 버킷(Burkitt) 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL: diffused large B cell lymphoma), 소형 림프구성(SL: mall lymphocytic) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL, 고등급 소형 비-분할(non-cleaved) 세포 NHL; 거대 질환(bulky disease) NHL; 외투 세포(mantle cell) 림프종, AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 거대 글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia) 포함]; T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 만성 림프구성 밸혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia); 급성 림프모구성 백혈병(ALL: acute lymphoblastic leukemia); 급성 골수성 백혈병(AML: Acute myeloid leukemia), 급성 전골수세포성 백혈병(APL: Acute promyelocytic leukemia), 모발상 세포 백혈병(Hairy cell leukemia); 만성 골수모구성 백혈병(CML: chronic myeloblastic leukemia) 및 이식-후 림프구 증식성 장애(PTLD: post-transplant lymphoproliferative disorder) 및 모반증(phakomatoses)과 관련된 비정상 혈관 증식, 부종(예를 들면, 뇌 종양과 관련된 것), 및 메이그 증후군(Meigs' syndrome)이 포함된다. 바람직하게, 상기 암은 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 비-호지킨 림프종(NHL), 신세포 암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시(Kaposi) 육종, 유암종 암종, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 치료를 받을 수 있는 암성 병태로는 전이성 암이 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 전-악성 암을 포함한다.
전-악성 암(또는 전암(pre-cancer)은 당해 분야에 익히 특성확인 및 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Berman JJ. and Henson DE., 2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med Inform Decis Mak. 3:8]을 참조한다). 본 발명의 방법을 통한 치료를 받을 수 있는 전-악성 암의 부류로는 후천적 소형 또는 미세한 전-악성 암, 핵 비정형성(nuclear atypia)을 갖는 후천적 거대 병변, 암으로 진행하는 유전적 과다형성 증후군(inherited hyperplastic syndrome)과 함께 발생하는 전구체 병변(precursor lesion) 및 후천적 미만성 과다형성증 및 미만성 화생(metaplasia)이 포함된다. 소형 또는 미세한 전-악성 암의 예로는 HGSIL(High grade squamous intraepithelial lesion of uterin cervix: 자궁 경부의 고등급 편평 상피내 병변), AIN(anal intraepithelial neoplasia: 항문 상피내 신생물), 성대의 이형성증, (결장의) 이상 음와(aberrant crypts), PIN(prostatic intraepithelial neoplasia: 전립성 상피내 신생물)이 포함된다. 핵 비정형성을 갖는 후천적 거대 병변의 예로는 관상 선종, AILD(angioimmunoblastic lymphadenopathy with dysproteinemia: 이상단백혈증을 갖는 혈관면역모세포 림프절병증), 비정형 수막종, 위 용종, 거대 플라크 유사건선(large plaque parapsoriasis), 골수 이형성증, 유두상 이행 세포 제자리 암종(papillary transitional cell carcinoma in-situ), 모세포 과다 불응성 빈혈(refractory anemia with excess blasts) 및 슈나이더 유두종(Schneiderian papilloma)이 포함된다. 암으로 진행하는 유전적 과다형성 증후군과 함께 발생하는 전구체 병변의 예로는 비정형 점 증후군(atypical mole syndrome), C 세포 선종증 및 MEA가 포함된다. 후천적 미만성 과다형성증 및 미만성 화생의 예로는 AIDS, 비정형 림프구 과다형성증, 뼈의 파제트(Paget) 질환, 이식-후 림프구 증식성 질환 및 궤양성 결장염이 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 백혈병, 만성 골수 단핵구 백혈병(CMML), 만성 골수세포성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML), 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), B 세포 만성 림프구 백혈병(B-CLL), 외투세포림프종(Mantle Cell Lymphoma, MCL), 소포성 림프종(FL), 변연부비세포림프종(Marginal Zone Lymphoma, MZL), pre-B 급성 림프구성 백혈병(pre-B ALL), 평활근육종(Leiomyosarcoma), 난소암, 유방암, 결장암, 방광암, 교모세포종(Glioblastoma), 간세포암종(Hepatocellular carcinoma), 전립선암, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 다발 골수증(Multiple Myeloma), 비소세포성 폐암(Non-small-cell lung carcinoma, NSCLC), 대장암(Colorectal cancer), 악성 흑색종, 두경부암(Head and Neck Cancer), 변연부비세포림프종, 췌장암(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma) 또는 뇌암이다.
몇몇 실시형태들에 따르면, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 미만성 거대 B-세포 림프종, 상피 난소암, 상피 종양, 나팔관암, 소포성 림프종, 다형성 교모세포종, 간세포 암종, 두경부암, 백혈병, 림프종, 외투 세포 림프종, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 비인두암, 비 호지킨 림프종, 비-소세포 폐 암종, 난소암, 전립선암 또는 신세포 암종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 림프종, 백혈병 및 암종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 림프종, 백혈병, 결장암, 췌장암, 난소암, 폐암 및 편평 세포 암종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 결장 암종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 난소 암종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 폐 암종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 두경부 암종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 백혈병이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 백혈병은 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수세포성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 무백혈성 백혈병(aleukemic leukemia), 백혈구증가성 백혈병(leukocythemic leukemia), 호염기성 백혈병(basophylic leukemia), 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수세포성 백혈병, 피부 백혈병, 태아 백혈병, 호산구성 백혈병, ()ross' 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 혈모세포성 백혈병, 혈구모세포성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 림프성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프형성 백혈병, 림프 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵구성 백혈병, 소골수모구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 골수 백혈병, 골수성 과립구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 네겔리(Naegeli) 백혈병, 형질 세포 백혈병, 형질구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리이더(Rieder) 세포 백혈병, 쉴링(Schilling) 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아백혈성 백혈병, 및 미분화 세포 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 백혈병은 전골수구성 백혈병, 급성 골수 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 림프종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 림프종은 B 세포 림프종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 림프종은 T 세포 림프종이다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 림프종은 호지킨 림프종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 림프종은 비-호지킨 림프종이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 비-호지킨 림프종은 공격성 NHL, 형질전환된 NHL, 지연형(indolent) NHL, 재발성 NHL, 난치성 NHL, 저등급 비-호지킨 림프종, 소포성 림프종, 거대 세포 림프종, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 외투 세포 림프종, 버키트 림프종, NK 세포 림프종, 미만성 B-세포 림프종, 급성 림프모구성 림프종, 및 균상 식육종/세자리(Sezary) 증후군을 포함하는 피부 T 세포 암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 다발성 골수종이다.
적어도 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 다발성 골수종은 카파-유형의 경쇄 및/또는 람다-유형의 경쇄를 생성시키는 다발성 골수종 암; 원발성 형질 세포 백혈병(PCL)을 포함하는 공격성 다발성 골수종; 다발성 골수종으로 진행할 수 있는 MGUS(monoclonal gaamopathy of undetermined significance), 발덴스트롬 거대 글로불린혈증(WM, 림프형질세포성 림프종으로서도 공지되어 있음)과 같은 양성 형질 세포 장애; 무증상 다발성 골수종(SMM: smoldering multiple myeloma), 지연형 다발성 골수종, 또한 다발성 골수종으로 진행할 수 있는 전악성 형태의 다발성 골수종; 원발성 아밀로이드증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암은 종양 미세-환경에 종양-침윤성 림프구(TIL)를 갖는 종양 및/또는 종양 미세-환경에 상대적으로 높은 CD47의 발현을 갖는 종양의 존재에 의해 정의된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 암의 세포는 CD47을 발현한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 면역 억제와 관련된 질환 또는 투약(예를 들면, mTOR 억제제, 칼시뉴린 억제제, 스테로이드)에 의해 야기된 면역억제를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 HIV, 홍역, 인플루엔자, LCCM, RSV, 인간 리노바이러스, EBV, CMV, 파르보 바이러스를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 질환은 감염을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "감염성 질환"의 "감염"은 병원체에 의해 유도된 질환을 말한다. 병원체의 구체예로는 바이러스성 병원체, 세균성 병원체, 예를 들면 세포내 마이코박테리아 병원체(예를 들면, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 세포내 세균성 병원체(예를 들면, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)) 또는 세포내 원생동물 병원체(예를 들면, 리슈마니아(Leishmania) 및 트리파노소마(Trypanosoma))가 포함된다.
본 발명의 교시에 따라 치료가능한 감염성 질환을 야기하는 바이러스성 병원체의 구체적 유형으로는 레트로바이러스, 서코바이러스(circovirus), 파보바이러스, 파포바바이러스(papovavirus), 아데노바이러스(adenovirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 이리도바이러스(iridovirus), 폭스바이러스(poxvirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 피코르나바이러스(picornavirus), 칼리시바이러스(calicivirus), 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스(reovirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 라브도바이러스(rhabdovirus), 분야바이러스(bunyavirus), 코로나바이러스(coronavirus), 아레나바이러스(arenavirus) 및 필로바이러스(filovirus)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 바이러스성 감염의 구체예로는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-유도된 후천적 면역결핍 증후군(AIDS), 인플루엔자, 리노바이러스 감염, 바이러스성 뇌수막염, 엡스타인-바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus) 감염, 간염 A, B 또는 C 바이러스 감염, 홍역, 유두종 바이러스 감염/사마귀, 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 감염, 헤르페스 심플렉스(Herpes simplex) 바이러스 감염, 황열, 에볼라(Ebola) 바이러스 감염, 광견병 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시형태들에 따르면, 본원에 개시되는 상기 조성물(예를 들면, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 및/또는 이를 발현하는 숙주-세포)은 당해 분야에 익히 공지되어 있는 진통제, 화학치료제, 방사선 치료제, 세포독성 치료요법(컨디셔닝(conditioning)), 호르몬 치료요법, 항체 및 기타 치료 용법(예를 들면, 수술)을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 면역 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환(예를 들면, 암)을 치료하기 위한 다른 확립된 또는 실험적 치료학적 용법과 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 본원에 개시된 상기 조성물(예를 들면, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 및/또는 이를 발현하는 숙주 세포)은 이들에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 골수 세포의 이식, 조혈모 세포(hematopoieitc stem cell), PBMC, 제대혈 줄기 세포(cord blood stem cell) 및/또는 유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cell)의 이식과 같은 양자 세포 이식과 함께 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 조성물과 함께 투여된 상기 치료학적 제제는 항암제를 포함한다.
따라서, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 암의 치료 방법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 항암제; 및 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드 및/또는 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 특정 실시형태들과 함께 사용될 수 있는 항암제로는 항암 약물 아시비신(Acivicin); 아클라루비신(Aclarubicin); 아코다졸 하이드로클로라이드(Acodazole Hydrochloride); 아크로닌(Acronine); 아드리아마이신(Adriamycin); 아도젤레신(Adozelesin); 알데스류킨(Aldesleukin); 알트레타민(Altretamine); 암보마이신(Ambomycin); 아메탄트론 아세테이트(Ametantrone Acetate); 아미노글루테티미드(Aminoglutethimide); 암사크린(Amsacrine); 아나스트로졸(Anastrozole); 안트라마이신(Anthramycin); 아스파라기나제(Asparaginase); 아스페를린(Asperlin); 아자시티딘(Azacitidine); 아제테파(Azetepa); 아조토마이신(Azotomycin); 바티마스타트(Batimastat); 벤조데파(Benzodepa); 비칼루타미드(Bicalutamide); 비스안트렌(Bisantrene) 하이드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트(Bisnafide Dimesylate); 비젤레신(Bizelesin); 블레오마이신 설페이트(Bleomycin Sulfate); 브레퀴나르 나트륨(Brequinar Sodium); 브로피리민(Bropirimine); 부설판(Busulfan); 칵티노마이신(Cactinomycin); 칼루스테론(Calusterone); 카라세미드(Caracemide); 카르베티머(Carbetimer); 카르보플라틴(Carboplatin); 카르무스틴(Carmustine); 카루비신(Carubicin) 하이드로클로라이드; 카르젤레신(Carzelesin); 세데핀골(Cedefingol); 클로람부실(Chlorambucil); 시롤레마이신(Cirolemycin); 시스플라틴(Cisplatin); 클라드리빈(Cladribine); 크리스나톨 메실레이트(Crisnatol Mesylate); 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide); 시타라빈(Cytarabine); 다카르바진(Dacarbazine); 닥티노마이신(Dactinomycin); 다우노루비신(Daunorubicin) 하이드로클로라이드; 데시타빈(Decitabine); 덱소르마플라틴(Dexormaplatin); 데자구아닌(Dezaguanine); 데자구아닌 메실레이트(Dezaguanine Mesylate); 디아지쿠온(Diaziquone); 도세탁셀(Docetaxel); 독소루비신(Doxorubicin); 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜(Droloxifene); 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트(Dromostanolone Propionate); 두아조마이신(Duazomycin); 에다트렉세이트(Edatrexate); 에플로니틴(Eflornithine) 하이드로클로라이드; 엘사미트루신(Elsamitrucin); 엔로플라틴(Enloplatin); 엔프로메이트(Enpromate); 에피프로피딘(Epipropidine); 에피루비신(Epirubicin) 하이드로클로라이드; 에르불로졸(Erbulozole); 에소루비신(Esorubicin) 하이드로클로라이드; 에스트라무스틴(Estramustine); 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨(Estramustine Phosphate Sodium); 에타니다졸(Etanidazole); 에토포시드(Etoposide); 에토포시드(Etoposide) 포스페이트; 에토프린(Etoprine); 파드로졸(Fadrozole) 하이드로클로라이드; 파자라빈(Fazarabine); 펜레티니드(Fenretinide); 플록스우리딘(Floxuridine); 플루다라빈(Fludarabine) 포스페이트; 플루오로우라실(Fluorouracil); 플루오로시타빈(Flurocitabine); 포스퀴돈(Fosquidone); 포스트리에신(Fostriecin) 나트륨; 겜시타빈(Gemcitabine); 겜시타빈 하이드로클로라이드; 하이드록시우레아(Hydroxyurea); 이다루비신(Idarubicin) 하이드로클로라이드; 이포스파미드(Ifosfamide); 일모포신(Ilmofosine); 인터페론 알파-2a(Interferon Alfa-2a); 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴(Iproplatin); 이리노테칸(Irinotecan) 하이드로클로라이드; 란레오티드(Lanreotide) 아세테이트; 레트로졸(Letrozole); 류프롤리드(Leuprolide) 아세테이트; 리아로졸(Liarozole) 하이드로클로라이드; 로메트렉솔(Lometrexol) 나트륨; 로무스틴(Lomustine); 로속산트론(Losoxantrone) 하이드로클로라이드; 마소프로콜(Masoprocol); 메이탄신(Maytansine); 메클로르에타민(Mechlorethamine) 하이드로클로라이드; 메게스트롤(Megestrol) 아세테이트; 멜렌게스트롤(Melengestrol) 아세테이트; 멜팔란(Melphalan); 메노가릴(Menogaril); 메르캅토퓨린(Mercaptopurine); 메토트렉세이트(Methotrexate); 메토트렉세이트 나트륨; 메토프린(Metoprine); 메투레데파(Meturedepa); 미틴도미드(Mitindomide); 미토카르신(Mitocarcin); 미토크로민(Mitocromin); 미토길린(Mitogillin); 미토말신(Mitomalcin); 미토마이신(Mitomycin); 미토스페르(Mitosper); 미토탄(Mitotane); 미톡산트론(Mitoxantrone) 하이드로클로라이드; 마이코페놀산(Mycophenolic Acid); 노코다졸(Nocodazole); 노갈라마이신(Nogalamycin); 오르마플라틴(Ormaplatin); 옥시수란(Oxisuran); 파클리탁셀(Paclitaxel); 페가스파르가제(Pegaspargase); 펠리오마이신(Peliomycin); 펜타무스틴(Pentamustine); 페플로마이신 설페이트(Peplomycin Sulfate); 페르포스파미드(Perfosfamide); 피포브로만(Pipobroman); 피포설판(Piposulfan); 피록산트론(Piroxantrone) 하이드로클로라이드; 플리카마이신(Plicamycin); 플로메스탄(Plomestane); 포르피머(Porfimer) 나트륨; 포르피로마이신(Porfiromycin); 프레드니무스틴(Prednimustine); 프로카르바진(Procarbazine) 하이드로클로라이드; 퓨로마이신(Puromycin); 퓨로마이신 하이드로클로라이드; 피라조푸린(Pyrazofurin); 리보프린(Riboprine); 로글레티미드(Rogletimide); 사핀골(Safingol); 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴(Semustine); 심트라젠(Simtrazene); 스파르포세이트(Sparfosate) 나트륨; 스파르소마이신(Sparsomycin); 스피로게르마늄(Spirogermanium) 하이드로클로라이드; 스피로무스틴(Spiromustine); 스피로플라틴(Spiroplatin); 스트렙토니그린(Streptonigrin); 스트렙토조신(Streptozocin); 설로페누르(Sulofenur); 탈리소마이신(Talisomycin); 탁솔(Taxol); 테코갈란(Tecogalan) 나트륨; 테가푸르(Tegafur); 텔록산트론(Teloxantrone) 하이드로클로라이드; 테모포르핀(Temoporfin); 테니포시드(Teniposide); 테록시론(Teroxirone); 테스토락톤(Testolactone); 티아미프린(Thiamiprine); 티오구아닌(Thioguanine); 티오테파(Thiotepa); 티아조푸이린(Tiazofuirin); 티라파자민(Tirapazamine); 토포테칸(Topotecan) 하이드로클로라이드; 토레미펜(Toremifene) 시트레이트; 트레스톨론(Trestolone) 아세테이트; 트리시리빈(Triciribine) 포스페이트; 트리메트렉세이트(Trimetrexate); 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트(Glucuronate); 트립토렐린(Triptorelin); 투불로졸(Tubulozole) 하이드로클로라이드; 우라실 머스타드(Uracil Mustard); 우레데파(Uredepa); 바프레오티드(Vapreotide); 베르테포르핀(Verteporfin); 빈블라스틴(Vinblastine) 설페이트; 빈크리스틴(Vincristine) 설페이트; 빈데신(Vindesine); 빈데신 설페이트; 비네피딘(Vinepidine) 설페이트; 빈글리시네이트(Vinglycinate) 설페이트; 빈류로신(Vinleurosine) 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트(Vinorelbine Tartrate); 빈로시딘(Vinrosidine) 설페이트; 빈졸리딘(Vinzolidine) 설페이트; 보로졸(Vorozole); 제니플라틴(Zeniplatin); 지노스타틴(Zinostatin); 조루비신(Zorubicin) 하이드로클로라이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 추가의 항신생물제는 항신생물제(폴 칼라브레시(Paul Calabresi) 및 브루스 에이. 채브너(Bruce A. Chabner)) 제52장에 개시되어 있는 것들 및 굿맨(Goodman) 및 길먼(Gilman)의 문헌["The Pharmacological Basis of Therapeutics", Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc.(보건 전문 사업부)]의 도입부 1202-1263이 포함된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 항암제는 항체를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 항체는 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 알레투주맙(alemtuzumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 파니투모맙(panitumumab), 벨리무맙(Belimumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 비바투주맙 메르탄신(Bivatuzumab mertansine), 블리나투모맙(Blinatumomab), 블론투베트맙(Blontuvetmab), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), 카투막소맙(Catumaxomab), 식수투무맙(Cixutumumab), 다클리주맙(Daclizumab), 아달리무맙(Adalimumab), 베즐로톡수맙(Bezlotoxumab), 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol), 시타투주맙 보가톡스(Citatuzumab bogatox), 다라투무맙(Daratumumab), 디누툭시맙(Dinutuximab), 엘로투주맙(Elotuzumab), 에르투막소맙(Ertumaxomab), 에타라시주맙(Etaracizumab), 겜투주맙 오조가마이신(Gemtuzumab ozogamicin), 기렌툭시맙(Girentuximab), 네시투무맙(Necitumumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 페르투주맙(Pertuzumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 실툭시맙(Siltuximab), 토시투모맙(Tositumomab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 두르발루맙(Durvalumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 및 이필리무맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 항체는 리툭시맙 및 세툭시맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 치료학적 제제 또는 항암제는 IMiD(예를 들면, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 포말리도마이드)를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 IMiD는 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 조성물과 함께 투여되는 상기 치료학적 제제는 항감염제(예를 들면, 항생제 및 항바이러스제)를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 조성물과 함께 투여되는 상기 치료학적 제제는 면역 억제제(예를 들면, GCSF 및 기타 골수 자극제, 스테로이드)를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 병용 치료요법은 부가적 효과를 갖는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 병용 치료요법은 상승작용 효과를 갖는다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제를 패키징하는 패키징 재료; 및 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드 및/또는 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 포함하는 제조 물품이 제공된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 제조 물품은 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환의 치료를 위해 확인된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 질환을 치료하기 위한 상기 치료학적 제제; 및 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드 및/또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 상기 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 상기 숙주 세포는 별도의 용기들에 패키징된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 질환을 치료하기 위한 상기 치료학적 제제; 및 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드 및/또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 상기 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 상기 숙주 세포는 공동-제형(co-formulation)에 패키징된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 제조 물품은 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 제조 물품은 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 제조 물품은 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 제조 물품은 상기 SIRPα 아미노산 서열, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포; 및 상기 4-1BBL 아미노산 서열, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 포함한다.
따라서, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 본원에 개시되는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포; 및 본원에 개시되는 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포를 패키징하는 패키징 재료를 포함하는 제조 물품이 제공된다.
특정 실시형태들에 따르면, 본원에 개시되는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포; 및 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포는 별도의 용기들에 패키징된다.
특정 실시형태들에 따르면, 본원에 개시되는 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포; 및 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 또는 이를 발현하는 숙주 세포는 공동-제형에 패키징된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드; 및/또는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 상기 단리된 폴리펩타이드는 이종(heterologous) 치료학적 모이어티에 부착되거나 또는 이를 포함한다. 상기 치료학적 모이어티는 소분자 화학적 화합물 및 폴리펩타이드를 포함하는 임의의 분자일 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태들과 함께 사용될 수 있는 치료학적 모이어티의 비-제한적 예로는 세포독성 모이어티, 독성 모이어티, 사이토카인 모이어티, 면역조절 모이어티, 폴리펩타이드, 항체, 약물, 화학물질 및/또는 방사성 동위원소가 포함된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 치료학적 모이어티는 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드를 상기 치료학적 모이어티를 암호화하는 상기 핵산 서열과 번역적으로 융합함(translationally fusing)으로써 접합된다(conjugated).
추가로 또는 대안으로, 상기 치료학적 모이어티는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 접합 방법을 이용하여 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드에 화학적으로 접합(커플링(coupling))될 수 있다. 예를 들면, 펩타이드는 3-(2-피리딜디티오) 프로피온산 N하이드록시석신이미드 에스테르[N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트로서도 칭함]("SDPD")(시그마(Sigma) Cat. No. P-3415; 예를 들면, 문헌[Cumber et al. 1985, Methods of Enzymology 112: 207-224]을 참조한다), 글루타르알데하이드 접합 절차(예를 들면, 문헌[G.T. Hermanson 1996, "Antibody Modification and Conjugation, in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego]을 참조한다), 또는 카르보디이미드 접합 절차[예를 들면, 문헌[J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction's, Mechanism, and Structure, pp. 349-50 & 372-74 (3d ed.), 1985; B. Neises et al. 1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17:522; A. Hassner et al. 1978, Tetrahedron Lett. 4475; E.P. Boden et al. 1986, J. Org. Chem. 50:2394 및 L.J. Mathias 1979, Synthesis 561]을 참조한다]를 이용하여 목적하는 제제에 접합될 수 있다.
치료학적 모이어티는 당해 분야에서 널리 실시되고 있는 표준 화학적 합성 기술[예를 들면, 문헌[hypertexttransferprotocol://worldwideweb (dot) chemistry (dot) org/portal/Chemistry)]을 참조한다]을 이용하여, 예를 들면 펩타이드 결합을 통해서(기능성 모이어티가 폴리펩타이드인 경우)와 같이 직접적 또는 간접적인 임의의 적합한 화학적 링크를 이용하여, 또는 링커 펩타이드와 같은 개재하는(intervening) 링커 요소 또는 유기 중합체와 같은 화학적 모이어티에의 공유 결합을 통해서 예를 들면, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드에 부착될 수 있다. 키메라 펩타이드는 상기 펩타이드들의 카복시(C) 또는 아미노(N) 말단에서의 결합을 통해 또는 직쇄형, 분지형(branched) 또는 환형 측쇄, 및 내부 탄소 또는 질소 원자 등과 같은 내부의 화학적 그룹에의 결합을 통해 링크될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 상기 용어들 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 천연 펩타이드(분해 생성물, 합성적으로 합성된 펩타이드 또는 재조합 펩타이드) 및 펩타이드 모방체(peptidomimetic)(전형적으로 합성적으로 합성된 펩타이드)뿐만 아니라 펩타이드 유사체인 펩토이드(peptoid) 및 세미펩토이드(semipeptoid)(예를 들면, 펩타이드를 더 안정하게 만드는 변형을 가질 수 있음)를 포함하고, 이는 예를 들면, 신체에 있는 동안 상기 펩타이드를 보다 안정하게 하거나 보다 세포에 침투할 수 있게 하는 변형을 가질 수 있다. 이러한 변형으로는 N 말단 변형, C 말단 변형, 펩타이드 결합 변형, 백본(backbone) 변형 및 잔기 변형이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 펩타이드 모방체를 제조하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 그 전문이 본원에 제시되는 바와 같이 참조에 의해 포함되는 문헌[Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)]에 명시되어 있다. 이와 관련하여 더 자세한 내용은 하기에 제공된다.
상기 펩타이드 내의 펩타이드 결합(-CO-NH-)은 예를 들면, N-메틸화된 아미드 결합(-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합(-C(=O)-O-), 케토메틸렌 결합(-CO-CH2-), 설피닐메틸렌 결합(-S(=O)-CH2-), α-아자 결합(-NH-N(R)-CO-)[여기서, R은 임의의 알킬(예를 들면, 메틸)이다], 아민 결합(-CH2-NH-), 설파이드 결합(-CH2-S-), 에틸렌 결합(-CH2-CH2-), 하이드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합(-CS-NH-), 올레핀 이중 결합(-CH=CH-), 플루오르화된 올레핀 이중 결합(-CF=CH-), 레트로(retro) 아미드 결합(-NH-CO-), 펩타이드 유도체(-N(R)-CH2-CO-)[여기서, R은 탄소 원자 상에 본래 존재하는 "정상" 측쇄이다]에 의해 치환될 수 있다.
이들 변형은 펩타이드 쇄에 따라 임의의 결합에서 그리고 심지어 동시에 몇몇의(2 내지 3개의) 결합에서 발생할 수 있다.
천연 방향족 아미노산들, Trp, Tyr 및 Phe는 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산(Tic: tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid), 나프틸알라닌, Phe의 환-메틸화된 유도체, Phe 또는 O-메틸-Tyr의 할로겐화된 유도체와 같은 비-천연 방향족 아미노산들에 의해 치환될 수 있다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 펩타이드들은 또한 하나 이상의 변형된 아미노산들 또는 하나 이상의 비-아미노산 단량체들(예를 들면, 지방산, 복합 탄수화물 등)을 포함할 수 있다.
상기 용어 "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 천연 발생 아미노산들; 예를 들면 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 포함하는 흔히 생체내 번역-후 변형된 이들 아미노산들; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-류신 및 오르니틴을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 기타 흔치 않은(unusual) 아미노산들을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 상기 용어 "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 둘 다를 포함한다.
하기 표 1 및 표 2는 천연 발생 아미노산들(표 1) 및 본 발명의 몇몇의 실시형태들과 함께 사용될 수 있는 비-전형적인 또는 변형된 아미노산들(예를 들면, 합성, 표 2)을 열거한다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 펩타이드들은 바람직하게는 선형 형태로 이용되지만, 환화(cyclicization)가 펩타이드 특성을 심하게 간섭하지 않는 경우에는 상기 펩타이드의 환 형태도 이용될 수 있음이 이해될 것이다.
상기 본 발명의 펩타이드는 바람직하게는 펩타이드가 가용성 형태로 존재하는 것을 요구하는 치료제에 이용되기 때문에, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 펩타이드로는 바람직하게는 이들의 하이드록실-함유 측쇄로 인하여 펩타이드 용해도를 증가시킬 수 있는 세린 및 트레오닌을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 하나 이상의 비-천연 또는 천연 극성 아미노산들이 포함된다.
본 발명의 상기 펩타이드들의 상기 아미노산들은 보존적으로 또는 비-보존적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "보존적 치환"은 상기 펩타이드의 본래 서열에 존재하는 아미노산을 유사한 입체배치적(steric) 특성을 갖는 천연 또는 비-천연 발생 아미노산 또는 펩타이드 모방체로 대체하는 것을 말한다. 대체될 상기 천연 아미노산의 측쇄가 극성 또는 소수성인 경우, 상기 보존적 치환은 천연 발생 아미노산, 비-천연 발생 아미노산으로 또는 (상기 대체되는 아미노산의 측쇄로서 동일한 입체배치적 특성을 갖는 것 이외에도) 또한 극성 또는 소수성인 펩타이드 모방체로 이루어져야만 한다.
천연 발생 아미노산은 전형적으로 이들의 특성에 따라 그룹화(grouped)되므로, 천연 발생 아미노산에 의한 보존적 치환은 본 발명에 따라 입체배치적으로 유사한 비-하전된 아미노산에 의한 하전된 아미노산의 대체가 보존적 치환으로서 고려된다는 사실을 염두에 두어 용이하게 결정될 수 있다.
비-천연 발생 아미노산에 의한 보존적 치환을 생성하기 위해, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 아미노산 유사체들(합성 아미노산들)을 사용하는 것도 가능하다. 상기 천연 발생 아미노산의 펩타이드 모방체는 숙련된 당업자에게 공지되어 있는 문헌에 잘 기록되어 있다.
보존적 치환에 영향을 미칠 때, 상기 치환 아미노산은 측쇄에 본래 아미노산과 동일하거나 유사한 기능성 그룹을 갖는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵하는 경향이 있는지에 관한 지침은 문헌[Bowie et al., 1990, Science 247 : 1306 1310]에서도 찾을 수 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체들은 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립 유전자(allele)에 추가되며 이들을 배제하지 않는다. 전형적인 보존적 치환으로는: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다(예를 들면, 문헌[Creighton, Proteins (1984)]을 참조한다). 아미노산은 측쇄와 관련된 특성에 기초하여 치환될 수 있고, 예를 들면 극성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들면 세린(S) 및 트레오닌(T); 측쇄의 전하에 기초한 아미노산, 예를 들면 아르기닌(R) 및 히스티딘(H); 그리고 소수성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들면 발린(V) 및 류신(L)이 치환될 수 있다. 나타낸 바와 같이, 변화는 전형적으로 상기 단백질의 폴딩 또는 활성에 현저하게 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환과 같은 사소한 성질로 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "비-보존적 치환"은 상이한 전기화학적 및/또는 입체배치적 특성을 갖는 다른 천연 또는 비-천연 발생 아미노산에 의한 모(parent) 서열에 존재하는 아미노산의 대체를 말한다. 따라서, 상기 치환 아미노산의 측쇄는 치환되는 본래 아미노산의 측쇄보다 현저하게 더 클 수 있고/있거나(또는 작을 수 있고/있거나) 치환되는 아미노산과 현저하게 상이한 전자적 특성을 갖는 기능성 그룹을 가질 수 있다. 이러한 유형의 비-보존적 치환의 예로는 알라닌 대신 페닐알라닌 또는 시코헥실메틸 글리신, 글리신 대신 이소류신, 또는 아스파르트산 대신 -NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-로의 치환이 포함된다. 본 발명의 범위에 속하는 이러한 비-보존적 치환은 여전히 항균 특성을 갖는 펩타이드를 구성하는 것들이다.
본 발명의 상기 펩타이드들의 N 및 C 말단은 기능 그룹에 의해 보호될 수 있다. 적합한 기능성 그룹은 문헌[Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Chapters 5 and 7, 1991]에 기술되어 있고, 이의 교시는 본원에 참조에 의해 포함된다. 바람직한 보호 그룹은 예를 들면, 화합물의 친수성(hydrophilicity)을 감소시키고 친유성(lipophilicity)을 증가시킴으로써 상기 보호 그룹에 부착된 화합물을 세포로 수송하는 것을 용이하게 하는 것들이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 아미노산들 중 하나 이상은 예를 들면, 기능성 그룹의 부가에 의해 변형(개념적 관점으로 "화학적 변형")될 수 있다. 예를 들면, 상기 본래 서열에 나타나는 상기 측쇄 아미노산 잔기는 임의로 변형될 수 있지만, 하기에 기술되는 바와 같이 대안으로 상기 단백질의 다른 부분이 상기 측쇄 아미노산 잔기에 추가하여 또는 상기 측쇄 아미노산 잔기 대신에 임의로 변형될 수 있다. 상기 변형은 예를 들면, 화학적으로 변형된 아미노산을 부가함으로써 화학적 합성 프로세스가 이어지는 경우 상기 분자의 합성 동안 임의로 수행될 수 있다. 그러나, 상기 분자에 이미 존재하는 경우의 아미노산의 화학적 변형("제자리" 변형)도 가능하다. 상기 펩타이드 또는 단백질에 대한 변형은 예를 들면, 유전자 합성, 부위-지시된(site-directed)(예를 들면, PCR 기반) 또는 무작위(random) 돌연변이유발(mutagenesis)(예를 들면, EMS)에 의해, 엑소뉴클레아제(exonuclease) 결실에 의해, 화학적 변형에 의해, 또는 이종 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 융합 또는 결합 단백질에 의해 도입될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "화학적 변형"은 펩타이드를 지칭하는 경우에 이의 아미노산 잔기들 중 적어도 하나가 프로세싱(processing) 또는 다른 번역-후 변형과 같은 자연적 프로세스에 의해 또는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형된 펩타이드를 말한다. 변형의 비-제한적 예시 유형으로는 카르복시메틸화(carboxymethylation), 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation), 인산화(phosphorylation), 글리코실화(glycosylation), 아미드화(amidation), ADP-리보실화(ribosylation), 지방 아실화(fatty acylation), 파르네실(farnesyl) 그룹, 이소파르네실 그룹, 탄수화물 그룹, 지방산 그룹, 접합용 링커의 부가, 관능화(functionalization), GPI 앵커(anchor) 형성, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 메틸화(methylation), 미리스틸화(myristylation), 페길화(pegylation), 프레닐화(prenylation), 인산화(phosphorylation), 유비퀴틴화(ubiquitination) 또는 임의의 유사한 프로세스 및 공지의 보호/차단 그룹이 포함된다. 에테르 결합은 임의로 세린 또는 트레오닌 하이드록실을 당의 하이드록실에 연결시키는데 사용될 수 있다. 아미드 결합은 임의로 글루타메이트 또는 아스파테이트 카르복실 그룹을 당의 아미노 그룹에 연결시키는데 사용될 수 있다(Garg and Jeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press (1985); Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308 (1987)). 아세탈 및 케탈 결합은 또한 아미노산과 탄수화물 사이에 임의로 형성될 수 있다. 지방산 아실 유도체는 예를 들면, 유리 아미노 그룹(예를 들면, 라이신)의 아실화에 의해 임의로 제조될 수 있다(Toth et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, 1078-1079 (1990)).
특정 실시형태들에 따르면, 상기 변형으로는 전문이 본원에 제시되는 바와 같이 본원에 참조에 의해 포함된 PCT 출원 번호 WO 2006/050262에 기술된 바와 같이 펩타이드에의 사이클로알칸 모이어티의 부가가 포함된다. 이들 모이어티는 생체분자(biomolecule)와 함께 사용하기 위해 고안되고, 임의로 단백질에 각종 특성들을 부여하는데 사용될 수 있다.
또한, 임의로 펩타이드 상의 임의의 점(point)이 변형될 수 있다. 예를 들면, 단백질 상의 글리코실화 모이어티의 페길화는 전문이 본원에 제시되는 바와 같이 본원에 참조에 의해 포함된 PCT 출원 번호 WO 2006/050247에 기술된 바와 같이 임의로 수행될 수 있다. 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 그룹은 임의로 O-링크된 및/또는 N-링크된 글리코실화에 부가될 수 있다. 상기 PEG 그룹은 임의로 분지형 또는 성형일 수 있다. 임의로 임의의 유형의 수용성 중합체는 글리코실 링커를 통해 단백질의 글리코실화 부위에 부착될 수 있다.
"페길화된 단백질"은 상기 단백질의 아미노산 잔기에 공유 결합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 갖는, 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 이의 단편을 의미한다.
"폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제 또는 커플링 또는 활성화 모이어티를 이용한(예를 들면, 티올(thiol), 트리플레이트(triflate), 트레실레이트(tresylate), 아지리딘(aziridine), 옥시란(oxirane)을 이용하거나 또는 바람직하게는 말레이미드 모이어티를 이용한) 유도체화의 존재 또는 부재 하의 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 이의 유도체를 의미한다. 말레이미도 모노메톡시 PEG와 같은 화합물은 본 발명의 예시이거나 본 발명의 활성화된 PEG 화합물이다. 폴리프로필렌 글리콜과 같은 다른 폴리알킬렌 글리콜 화합물이 본 발명에서 사용될 수 있다. 다른 적절한 폴리알킬렌 글리콜 화합물로는 하기 유형의 하전된 또는 중성의 중합체들: 덱스트란, 콜로민산(colominic acid) 또는 다른 탄수화물-기반 중합체, 아미노산들의 중합체, 및 비오틴(biotin) 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 펩타이드는 변경된 글리코실화 패턴을 갖도록 변형된다(즉, 본래 또는 천연 글리코실화 패턴으로부터 변경됨). 본원에서 사용되는 바와 같은 "변경된(altered)"은 결실된 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 갖고/갖거나 본래 단백질에 부가된 하나 이상의 글리코실화 부위를 갖는 것을 의미한다.
단백질의 글리코실화는 전형적으로 N-링크되거나 또는 O-링크된다. N-링크는 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 말한다. 트리펩타이드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열(recognition sequence)이다. 따라서, 폴리펩타이드에 이들 트리펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-링크된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 말하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 사용될 수 있다.
펩타이드에의 글리코실화 부위의 부가는 펩타이드의 아미노산 서열을 변경하여 상기 기술된 트리펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유하도록 함으로써 편리하게 달성된다(N-링크된 글리코실화 부위의 경우). 상기 변경은 또한 본래 펩타이드의 서열에서 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-링크된 글리코실화 부위의 경우). 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 DNA 수준에서 변화를 도입함으로써 변경될 수도 있다.
펩타이드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 펩타이드의 아미노산 잔기에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 사용된 커플링 방식에 따라, 당은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실 그룹, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설프하이드릴 그룹, (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 하이드록실 그룹, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드 그룹에 부착될 수 있다. 이들 방법은 예를 들면 WO 87/05330에 그리고 문헌[Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 22 : 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.
펩타이드에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로, 효소적으로 또는 DNA 수준에서 변화를 도입함으로써 달성될 수 있다. 화학적 탈당화(deglycosylation)는 펩타이드를 트리플루오로메탄설폰산 또는 동등한 화합물에 노출시키는 것을 필요로 한다. 이러한 처리는 링크하는 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 초래하여 아미노산 서열은 온전하게 유지한다.
화학적 탈당화는 문헌[Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987)]; 및 문헌[Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981)]에 기술되어 있다. 펩타이드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987)]에 기술된 바와 같이 각종 엔도(endo)- 및 엑소(exo)-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 펩타이드는 검출가능한 태그를 포함한다. 한 실시형태에 있어서, 본원에서 사용되는 바와 같은 상기 용어 "검출가능한 태그"는 당해 분야 공지의 기술을 이용하여 숙련된 당업자에 의해 검출될 수 있는 임의의 모이어티를 말한다. 검출가능한 태그는 펩타이드 서열일 수 있다. 임의로, 상기 검출가능한 태그는 화학적 제제에 의해 또는 단백질 가수분해(proteolysis)와 같은 효소적 수단에 의해 제거가능할 수 있다. 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 검출가능한 태그는 상기 펩타이드의 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 용어 "검출가능한 태그"로는 키틴 결합 단백질(BCP: chitin binding protein)-태그, 말토스 결합 단백질(MBP: maltose binding protein)-태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST: glutathione-S-transferase)-태그, 폴리(His)-태그, FLAG 태그, 에피토프(Epitope) 태그, 예를 들면 V5-태그, c-myc-태그 및 HA-태그, 및 형광성 태그, 예를 들면 녹색 형광성 단백질(GFP), 적색 형광성 단백질(RFP), 황색 형광성 단백질(YFP), 청색 형광성 단백질(BFP) 및 시안(cyan) 형광성 단백질(CFP); 및 이들 태그의 유도체 또는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 태그가 포함된다. 상기 용어 "검출가능한 태그"는 또한 용어 "검출가능한 마커"도 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드는 이의 N-말단에 부착된 검출가능한 태그(예를 들면, 폴리(His)-태그)를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드는 이의 C-말단에 부착된 검출가능한 태그(예를 들면, 폴리(His)-태그)를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드의 상기 N-말단은 검출가능한 태그(예를 들면, 폴리(His)-태그)를 포함하지 않는다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 펩타이드의 상기 C-말단은 검출가능한 태그(예를 들면, 폴리(His)-태그)를 포함하지 않는다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 펩타이드는 절단가능한 모이어티에 융합된다. 따라서, 예를 들면, 회수를 용이하게 하기 위해, 발현된 암호화 서열은 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 펩타이드 및 융합된 절단가능한 모이어티를 암호화하도록 조작될 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 펩타이드는 친화성 크로마토그래피에 의해; 예를 들면, 상기 절단가능한 모이어티에 대해 특이적인 컬럼 상의 고정화에 의해 쉽게 단리되도록 고안된다. 한 실시형태에서, 절단 부위는 상기 펩타이드와 상기 절단가능한 모이어티 사이에서 조작되고 상기 펩타이드는 이러한 부위에서 상기 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 적절한 효소 또는 제제로의 처리에 의해 크로마토그래피 컬럼으로부터 방출될 수 있다[예를 들면, 문헌[Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988)]; 및 문헌[Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)]을 참조한다]. 특정 실시형태들에 따르면, 상기 펩타이드는 단리된 펩타이드이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 펩타이드는 이들에 한정되는 것은 아니지만 고체상 및 재조합 기술과 같은 펩타이드 합성 분야의 숙련가들에게 공지되어 있는 임의의 기술에 의해 합성 및 정제될 수 있다.
고체상 펩타이드 합성에 관해서, 다수의 기술의 요약은 문헌[J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963] 및 문헌[J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973]에서 찾을 수 있다. 전형적인 용액 합성에 관해서는 문헌[G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (New York), 1965]을 참조한다.
일반적으로, 이들 방법은 성장하는 펩타이드 쇄에 하나 이상의 아미노산 또는 적합하게 보호된 아미노산을 순차적으로 부가하는 것을 포함한다. 보통, 제1 아미노산의 아미노 또는 카르복실 그룹은 적합한 보호 그룹에 의해 보호된다. 이어서, 보호된 또는 유도체화된 아미노산은 아미드 링크를 형성하기에 적합한 조건 하에서 적합하게 보호된 상보적 (아미노 또는 카르복실) 그룹을 갖는 서열에 다음 아미노산을 부가함으로써 불활성 고체 지지체에 부착되거나 용액으로 이용될 수 있다. 이어서, 상기 보호 그룹은 이러한 새롭게 부가된 아미노산 잔기로부터 제거되고, 이어서 다음 아미노산(적합하게 보호됨) 등이 부가된다. 원하는 모든 아미노산들이 적절한 서열로 링크된 후, 임의의 나머지 보호 그룹(및 임의의 고체 지지체)은 순차적으로 또는 동시에 제거되어 최종 펩타이드 화합물을 제공한다. 이러한 일반적 절차의 단순한 변형에 의해, 예를 들면 적절하게 보호된 디펩타이드와 보호된 트리펩타이드를 (키랄 중심을 라세미화하지 않는 조건 하에서) 커플링함으로써 성장하는 쇄에 한 번에 1개 초과의 아미노산을 부가하여 탈보호 후 펜타펩타이드 등을 형성할 수 있다. 펩타이드 합성의 추가의 설명은 U.S. Pat. 제6,472,505호에 개시되어 있다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 펩타이드 화합물을 제조하는 바람직한 방법은 고체상 펩타이드 합성을 포함한다.
대규모 펩타이드 합성은 문헌[Andersson Biopolymers 2000;55(3):227-50]에 의해 기술된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 펩타이드는 시험관내 발현 시스템을 사용하여 합성된다. 이러한 시험관내 합성 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고 상기 시스템의 구성요소는 상업적으로 입수가능하다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 펩타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. "재조합" 펩타이드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 생성된, 즉 원하는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 외인성 DNA 작제물에 의해 형질전환된 세포로부터 생성된 펩타이드 또는 단백질을 말한다.
따라서, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 상기 기술된 융합 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 66 또는 서열번호 68로 제시되는 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 66 또는 서열번호 68로 제시되는 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 66 또는 서열번호 68로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열을 포함하고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 66 또는 서열번호 68로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열로 이루어지고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 61 및 서열번호 68로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55 내지 서열번호 61 및 서열번호 68로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열로 이루어진다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55, 서열번호 56 및 서열번호 58로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 55, 서열번호 56 및 서열번호 58로 이루어진 그룹에서 선택된 핵산 서열로 이루어진다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, 서열번호 24 및/또는 서열번호 26과 적어도 95%의 동일성을 갖고 100개 내지 119개 길이의 아미노산인 상기 기재된 SIRPα 아미노산 서열 중 어느 하나; 또는 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열과 95%의 동일성을 갖고 185개 내지 202개 길이의 아미노산 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 33 또는 서열번호 34로 제시되는 바와 같은 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 33 또는 서열번호 34로 제시되는 바와 같은 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 33 또는 서열번호 34를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 33 또는 서열번호 34로 이루어진다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77 또는 서열번호 79로 제시되는 바와 같은 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이고, 각각의 가능성은 본 발명의 한 개별적 실시형태를 나타낸다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42로 제시되는 바와 같은 핵산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77 또는 서열번호 79로 제시되는 바와 같은 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42로 제시되는 바와 같은 핵산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77 또는 서열번호 79를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42를 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77 또는 서열번호 79로 이루어진다.
특정 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42로 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단리되어 RNA 서열, 상보적(complementary) 폴리뉴클레오타이드 서열(cDNA), 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 복합 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 상기의 조합)의 형태로 제공되는 단일 또는 이중 가닥의(stranded) 핵산 서열을 말한다.
포유동물 세포에서 외인성 폴리펩타이드를 발현하기 위해서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 포유동물 세포 발현에 적합한 핵산 작제물로 라이게이션된다. 이러한 핵산 작제물은 구성적 또는 유도적 방식으로 상기 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사를 지시하기 위한 프로모터(promoter) 서열을 포함한다.
따라서, 특정 실시형태들에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드 및 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하기 위한 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물이 제공된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 조절 요소는 이종성 조절 요소이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 핵산 작제물(본원에서 "발현 벡터"로서도 칭함)은 원핵생물(prokaryote), 진핵생물(eukaryote) 또는 바람직하게는 둘 다에서의 복제 및 통합(integraion)에 이러한 벡터(예를 들면, 셔틀 벡터(shuttle vector))를 적합하게 만드는 추가의 서열을 포함한다. 또한, 전형적인 클로닝 벡터는 또한 전사 및 번역 개시 서열, 전사 및 번역 종결자 및 폴리아데닐화 신호도 포함할 수 있다. 예로서, 이러한 작제물들은 전형적으로 5' LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 DNA 합성의 기원(origin) 및 3'LTR 또는 이의 일부를 포함할 것이다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 핵산 작제물은 전형적으로 상기 핵산 작제물이 위치하는 숙주 세포로부터의 펩타이드 분비를 위한 신호 서열을 포함한다. 바람직하게는 이러한 목적을 위한 상기 신호 서열은 포유동물 신호 서열 또는 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드 변이체의 신호 서열이다.
진핵생물 프로모터는 전형적으로 TATA 상자 및 상류(upstream) 프로모터 요소의 2개 유형의 인식 서열을 포함한다. 전사 개시 부위의 상류에 위치하는 25개 내지 30개의 염기 쌍(base pair)인 TATA 상자는 RNA 폴리머라제(polymerase)가 RNA 합성을 시작하도록 지시하는데 관여하는 것으로 생각된다. 다른 상류 프로모터 요소는 전사가 개시되는 속도를 결정한다.
바람직하게, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 핵산 작제물에 의해 이용되는 프로모터는 형질전환된 상기 특정 세포 집단에서 활성이다. 세포 유형-특이적 및/또는 조직-특이적 프로모터의 예로는 간 특이적인 알부민[Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], 림프구 특이적 프로모터[Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]와 같은 프로모터; 특히 T-세포 수용체의 프로모터[Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] 및 면역글로불린의 프로모터[Banerji et al. (1983) Cell 33729-740]; 신경미세섬유(neurofilament) 프로모터[Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477]와 같은 뉴런(neuron)-특이적 프로모터, 췌장-특이적 프로모터[Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916] 또는 유선-특이적 프로모터, 예를 들면 유청 프로모터(U.S. Pat. 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호)가 포함된다.
인핸서(Enhancer) 요소는 링크된 상동성 또는 이종성 프로모터로부터 1,000배까지 전사를 자극할 수 있다. 인핸서는 전사 개시 부위에서 하류(downstream) E또는 상류에 위치되는 경우에 활성이다. 바이러스로부터 유도된 다수의 인핸서 요소는 광범위한 숙주 범위를 갖고 다양한 조직에서 활성이다. 예를 들면, 상기 SV40 초기 유전자 인핸서 다수의 세포 유형에 적합하다. 본 발명의 몇몇의 실시형태들에 적합한 다른 인핸서/프로모터 병용은 폴리오마(polyoma) 바이러스, 인간 또는 뮤린(murine) 사이토메갈로 바이러스(CMV), 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 또는 라우스(Rous) 육종 바이러스 및 HIV와 같은 다양한 레트로 바이러스 유래의 장기 반복으로부터 유도된 것들이 포함된다. 문헌[Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1983]을 참조하고, 이는 본원에 참조에 의해 포함된다.
상기 발현 벡터의 구성에 있어서, 상기 프로모터는 이의 자연 환경에서 전사 시작 부위에서와 같이 이종성 전사 시작 부위로부터 대략 동일한 거리에 위치하는 것이 바람직하다. 그러나, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 이러한 거리의 일부 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
SIRPα-4-1BBL, SIRPα 또는 4-1BBL mRNA 번역의 효율성을 증가시키기 위해 폴리아데닐화 서열도 상기 발현 벡터에 추가될 수 있다. 정확하고 효율적인 폴리아데닐화를 위해서는 2개의 별개의 서열 요소들이 요구된다: 폴리아데닐화 부위의 하류에 위치한 GU 또는 U 풍부(rich) 서열 및 11개 내지 30개의 뉴클레오타이드 상류에 위치한 6개의 뉴클레오타이드의 고도로 보존된 서열, AAUAAA. 본 발명의 몇몇의 실시형태들에 적합한 종결 및 폴리아데닐화 신호로는 SV40으로부터 유도된 신호가 포함된다.
이미 기술된 요소들에 더하여, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 발현 벡터는 전형적으로 클로닝된 핵산의 발현 수준을 증가시키거나 재조합 DNA를 운반하는 세포의 확인을 용이하게 하도록 의도된 다른 특화된 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 다수의 동물 바이러스는 허용되는 세포 유형에서 바이러스 게놈의 추가 염색체 복제를 촉진시키는 DNA 서열을 함유한다. 이들 바이러스 레플리콘(replicon)을 지닌 플라스미드(Plasmid)는 상기 플라스미드 또는 상기 숙주 세포의 게놈으로 운반되는 유전자에 의해 적절한 인자들이 제공되는 한 에피솜으로 복제된다.
상기 벡터는 진핵생물 레플리콘을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 진핵생물 레플리콘이 존재하는 경우, 상기 벡터는 이어서 적절한 선택가능한 마커를 사용하여 진핵생물 세포에서 증폭될 수 있다. 상기 벡터가 진핵생물 레플리콘을 포함하지 않는 경우, 에피솜 증폭이 불가능하다. 대신에, 재조합 DNA는 조작된 세포의 게놈으로 통합되고, 여기서 상기 프로모터가 원하는 핵산의 발현을 지시한다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 발현 벡터는 예를 들면, 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site) 및 프로모터-키메라 폴리펩타이드의 게놈 통합을 위한 서열과 같은 단일 mRNA로부터 몇몇의 단백질의 번역을 허용하는 추가의 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터에 포함된 개별 요소들은 다양한 구성으로 배열될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 인핸서 요소들 및 프로모터들 등, 그리고 심지어 SIRPα-4-1BBL을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들), SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 역상 보체로서 존재할 수 있는 "헤드-투-테일(head-to-tail)" 구성으로, 또는 역-평행 가닥으로서 상보적 구성으로 배열될 수 있다. 이러한 다양한 구성이 상기 발현 벡터의 비-암호화 요소들과 함께 발생할 가능성이 더 높지만, 상기 발현 벡터 내의 상기 암호화 서열의 대안의 구성도 고려된다.
포유동물 발현 벡터의 예로는 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, PNMT81(인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수가능), pCI(프로메가(Promega)로부터 입수가능), pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV(스트레이트진(Strategene)으로부터 입수가능함), pTRES(클론테크(Clontech)로부터 입수가능함) 및 이들의 유도체들이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
레트로 바이러스와 같은 진핵생물 바이러스로부터의 조절 요소를 포함하는 발현 벡터도 사용할 수 있다. SV40 벡터로는 pSVT7 및 pMT2가 포함된다. 소 유두종 바이러스로부터 유도된 벡터로는 pBV-1MTHA가 포함되고, 엡스타인 바 바이러스로부터 유도된 벡터로는 pHEBO 및 p2O5가 포함된다. 다른 예시적인 벡터로는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 배큘로바이러스 pDSVE 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터 또는 진핵생물 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 밝혀진 기타 프로모터들의 지시 하에 단백질의 발현을 가능하게 하는 임의의 다른 벡터가 포함된다.
상기 기술된 바와 같이, 바이러스는 다수의 경우에 숙주 방어 메커니즘을 회피하도록 진화한 매우 특화된 감염원이다. 전형적으로, 바이러스는 특정 세포 유형에서 감염 및 증식한다. 바이러스 벡터의 표적화(targeting) 특이성은 사전 결정된 세포 유형을 특이적으로 표적화하고 이에 의해 상기 감염된 세포에 재조합 유전자를 도입하기 위해 이의 자연 특이성을 이용한다. 따라서, 본 발명의 몇몇의 실시형태들에 의해 사용되는 벡터의 유형은 형질전환된 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 형질전환된 세포 유형에 따라 적합한 벡터를 선택하는 능력은 당업자의 능력 범위 내이고, 따라서 선택 고려사항의 일반적인 기술은 본원에 제공되지 않는다. 예를 들면, 골수 세포는 상기 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 I(HTLV-I)를 이용하여 표적화될 수 있고, 신장 세포는 문헌[Liang CY et al., 2004 (Arch Virol. 149: 51-60)]에 기술된 바와 같이 배큘로바이러스 오토그라파 칼리포니카 뉴클레오폴리헤드로바이러스(AcMNPV: Autographa californica nucleopolyhedrovirus)에 존재하는 이종성 프로모터를 이용하여 표적화될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 이들이 측면 감염(lateral infection) 및 표적화 특이성과 같은 이점을 제공하므로 SIRPα-4-1BBL, SIRPα 또는 4-1BBL의 생체내 발현에 유용하다. 측면 감염은 예를 들면 레트로 바이러스의 생명 주기(life cycle)에 내재되어 있고, 단일 감염된 세포가 해당 프로세스에 의해 이웃하는 세포에 발아하여(bud off) 감염시키는 다수의 자손 비리온(virion)을 생성하는 프로세스이다. 그 결과 넓은 영역이 신속하게 감염되고 이의 대부분은 본래 바이러스 입자에 의해 처음에는 감염되지 않았다. 이는 감염원이 딸 자손을 통해서만 확산되는 수직형 감염과 대조적이다. 옆으로 확산할 수 없는 바이러스 벡터도 생성될 수 있다. 이러한 특징은 원하는 목적이 특정 유전자를 국소화된 수의 표적화된 세포에만 도입하는 것인 경우 유용할 수 있다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 발현 벡터를 세포에 도입하기 위해 각종 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)]에, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)], 문헌[Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)], 문헌[Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)], 문헌[Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)] 및 문헌[Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]]에 기술되어 있고, 예를 들면, 안정한 또는 일시적 형질감염, 리포펙션(lipofection), 전기천공(electroporation) 및 재조합 바이러스 벡터를 이용한 감염이 포함된다. 또한, 양성-음성 선택 방법에 대해서는 U.S. Pat. 제5,464,764호 및 제5,487,992호를 참조한다.
바이러스 감염에 의한 핵산의 도입은 바이러스의 감염성 성질로 인하여 보다 높은 형질감염 효율을 얻을 수 있으므로 리포펙션 및 전기천공과 같은 다른 방법에 비하여 몇몇의 이점을 제공한다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전이 기술로는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 지질-기반 시스템과 같은 바이러스 또는 비-바이러스 작제물을 이용한 형질감염이 포함된다. 상기 유전자의 지질-매개된 전이에 유용한 지질은 예를 들면, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol[Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)]이다. 유전자 치료요법에 사용하기 위한 가장 바람직한 작제물은 바이러스이고, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 작제물과 같은 바이러스 작제물은 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서 또는 유전자좌(locus)-정의 요소(들) 또는 대안의 스플라이싱(splicing), 핵 RNA 수송(export) 또는 메신저(messenger)의 번역-후 변형과 같은 다른 수단에 의해 유전자 발현을 제어하는 다른 요소들을 포함한다. 이러한 벡터 작제물은 또한 이미 바이러스 작제물에 존재하지 않는 한 패키징 신호, 긴 말단 반복(LTR: long terminal repeat) 또는 이의 일부, 사용된 바이러스에 적절한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위를 포함한다. 또한, 이러한 작제물은 전형적으로 이것이 위치하는 숙주 세포로부터의 상기 펩타이드의 분비를 위한 신호 서열을 포함한다. 바람직하게, 이러한 목적을 위한 상기 신호 서열은 포유동물 신호 서열 또는 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드 변이체의 신호 서열이다. 임의로, 상기 작제물은 또한 폴리아데닐화 및 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 지시하는 신호를 포함할 수 있다. 예로서, 이러한 작제물은 전형적으로 5' LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성의 기원, 및 3' LTR 또는 이의 일부를 포함할 것이다. 비-바이러스성인 다른 벡터들, 예를 들면 양이온 지질, 폴리라이신 및 덴드리머(dendrimer)가 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 삽입된 암호화 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함하는 것 이외에, 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 발현 작제물은 발현된 펩타이드의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 독성을 향상시키기 위해 조작된 서열도 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 SIRPα-4-1BBL 단백질 또는 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드 및 이종성 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 절단가능한 융합 단백질의 발현은 조작될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 상기 융합 단백질이 친화성 크로마토그래피에 의해; 예를 들면 이종 단백질에 대해 특이적인 컬럼 상의 고정화에 의해 쉽게 단리될 수 있도록 고안될 수 있다. 절단 부위가 SIRPα-4-1BBL 단백질 또는 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드와 이종성 단백질 사이에서 조작되는 경우, 상기 SIRPα-4-1BBL 단백질 또는 상기 폴리펩타이드는 상기 절단 부위를 붕괴시키는 적절한 효소 또는 제제를 이용한 처리에 의해 크로마토그래피 컬럼으로부터 방출될 수 있다[예를 들면, 문헌[Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70]; 및 문헌[Gardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:15854-15859]을 참조한다].
본 발명은 또한 본원에 기술된 상기 조성물을 포함하는 세포를 고려한다.
따라서, 특정 실시형태들에 따르면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 포함하는 숙주 세포, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및/또는 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 암호화하는 핵산 작제물이 제공된다.
상기 언급된 바와 같이, 다양한 원핵생물 또는 진핵생물 세포는 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드를 발현하기 위한 숙주-발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 이들로는 상기 암호화 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지(bacteriophage) DNA, 플라스미드(plasmid) DNA 또는 코스미드(cosmid) DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물; 상기 암호화 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 상기 암호화 서열을 포함하는 Ti 플라스미드와 같은 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포 시스템이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 포유동물 발현 시스템은 또한 본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있다.
박테리아 작제물의 예로는 대장균(E. coli) 발현 벡터의 pET 시리즈가 포함된다[Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89].
본 발명의 교시에 따라 사용할 수 있는 진핵생물 세포의 예로는 포유동물 세포, 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포 또는 식물 세포가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
효모에 있어서, U.S. Pat. 출원 제5,932,447호에 개시되어 있는 바와 같이 구성적 또는 유도성 프로모터들을 포함하는 다수의 벡터들을 사용할 수 있다. 대안으로, 외래 DNA 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진시키는 벡터가 사용될 수 있다.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우, 상기 암호화 서열의 발현은 다수의 프로모터들에 의해 구동될 수 있다. 예를 들면, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터들과 같은 바이러스 프로모터[Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514] 또는 TMV에 대한 코트(coat) 단백질 프로모터[Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311]를 사용할 수 있다. 대안으로, RUBISCO의 작은 서브유닛(subunit)과 같은 식물 프로모터[Cnoruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 and Brogli et al., (1984) Science 224:838-843] 또는 가열 충격(heat shock) 프로모터, 예를 들면 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B[Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565]를 사용할 수 있다. 이들 작제물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미세주입(microinjection), 전기천공 및 당업자에게 익히 공지되어 있는 기타 기술을 이용하여 식물 세포에 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463]을 참조한다.
당해 분야에 익히 공지되어 있는 곤충 및 포유동물 숙주 세포 시스템과 같은 다른 발현 시스템도 본 발명의 몇몇의 실시형태들에 의해 사용될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 세포는 포유동물 세포이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 세포는 인간 세포이다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 세포는 세포주이다.
다른 특정 실시형태들에 따르면, 상기 세포는 원발성 세포이다.
상기 세포는 혈액, 근육, 신경, 뇌, 심장, 폐, 간, 췌장, 비장, 흉선, 식도, 위, 장, 신장, 고환, 난소, 모발, 피부, 뼈, 유방, 자궁, 방광, 척수 또는 각종 체액을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌 적합한 조직으로부터 유도될 수 있다. 상기 세포는 배아, 태아 및 성인 단계를 포함하는 임의의 발달 단계뿐만 아니라 발달 기원, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽 기원으로부터 유도될 수 있다.
포유동물 세포의 비제한적 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS, 예를 들면 COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양액에서의 성장을 위해 서브클로닝된 HEK293 또는 HEK293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 1977); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL2); NIH3T3, 저카트(Jurkat), 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(HepG2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포종 세포주(Hep G2), PER.C6, K562, 및 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)가 포함된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO), HEK293, PER.C6, HT1080, NS0, Sp2/0, BHK, Namalwa, COS, HeLa 및 베로(Vero) 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들에 따르면, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO), PER.C6 및 293(예를 들면, Expi293F) 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 양상에 따르면, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 숙주 세포에서 본원에 기술된 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 핵산 작제물을 발현시키는 단계를 포함하는 것인, 방법이 제공된다.
특정 실시형태들에 따르면, 상기 방법은 상기 융합 단백질 또는 상기 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태들에 따르면, 재조합 폴리펩타이드의 회수는 배양에서 적절한 시간 후에 수행된다. 상기 어구 "재조합 폴리펩타이드 회수"는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 전체 발효 배지를 수집하는 것을 말하고, 추가의 분리 또는 정제 단계를 의미할 필요는 없다. 상기에도 불구하고, 본 발명의 일부 실시형태들의 폴리펩타이드는 다양한 표준 단백질 정제 기술, 예를 들면 이들에 한정되는 것은 아니지만 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 혼합 방식 크로마토그래피, 금속 친화성 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 차등 가용화(differential solubilization)을 이용하여 정제될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 합성 및 정제 후, 펩타이드의 치료학적 효능은 생체내에서 또는 시험관내에서 검정될 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 세포 생존력(viability), 형질전환 마우스의 생존 및 활성화 마커의 발현이 포함된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 상기 조성물(예를 들면, 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, 상기 SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 상기 폴리펩타이드 또는 본원에 개시되는 상기 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 암호화하는 핵산 작제물 및/또는 세포)은 그 자체로 유기체에게 또는 적합한 담체 또는 부형제와 혼합되는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 몇몇의 실시형태들에 있어서 본원에 개시되는 상기 조성물의 치료학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 "약제학적 조성물"은 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과 함께 본원에 기재된 하나 이상의 활성 성분의 제제를 말한다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본원에서 상기 용어 "활성 성분"은 생물학적 효과에 대한 책임이 있는 상기 조성물(예를 들면, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질, SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 작제물 및/또는 본원에 기술되는 세포)을 말한다.
본원에서 상기 용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 추가로 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 부가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제의 예로는 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 각종 당 및 전분 유형, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원 이하에, 상호교환적으로 사용될 수 있는 어구 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 현저한 과민(irritation)을 야기하지 않고 상기 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 보강제(adjuvant)는 이들 어구 하에 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"로는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 바람직하게, 상기 담체는 (예를 들면, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 상기 활성 화합물, 즉 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 작제물 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 세포는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"은 상기 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 원하지 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 말한다(예를 들면, 문헌[Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19]을 참조한다). 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염으로는 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 아인산 등과 같은 비독성 무기산 및 지방족(aliphatic) 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기 부가염으로는 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 및 칼슘 등과 같은 알칼리 토 금속, 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 및 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민으로부터 유도된 것들이 포함된다.
본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따르면 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들면 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설파이트 및 나트륨 설파이트 등; (2) 유용성(oil-soluble) 항산화제, 예를 들면 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제(chelating agent), 예를 들면 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 및 인산 등이 포함된다. 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 약제학적 조성물은 또한 세제 및 가용화제(예를 들면, TWEEN 20(폴리소르베이트-20), TWEEN 80(폴리소르베이트-80) 및 보존제(예를 들면, 티메르솔, 벤질 알콜) 및 벌킹(bulking) 물질(예를 들면, 락토스, 만니톨)과 같은 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따르면 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 각종 완충액 함량의 완충된 염수(예를 들면, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도, 에탄올 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들면 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트가 포함된다.
예를 들면, 레시틴과 같은 코팅 재료의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성(fluidity)을 유지할 수 있다.
이들 조성물은 또한 보강제, 예를 들면 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 예방은 상기 멸균 절차에 의해 그리고 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 확보될 수 있다. 당, 및 염화 나트륨 등과 같은 등장성 제제를 조성물에 포함시키는 것도 또한 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수를 초래할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물도 조성물에 포함될 수있다.
치료학적 조성물은 전형적으로 멸균되어 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼(microemulsion), 리포솜(liposome) 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 상기 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우, 등장성 제제, 예를 들면 당, 폴리알콜, 예를 들면 만니톨, 소르비톨 또는 염화 나트륨을 상기 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 상기 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분들의 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 다음 멸균 미세여과함으로써 조제될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클(vehicle)에 통합함으로써 조제된다. 멸균 주사가능한 용액의 조제를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 조제 방법은 이의 사전 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조(lyophilization))이다.
멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분들의 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 다음 멸균 미세여과함으로써 조제될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 포함하는 멸균 비히클에 통합하여 조제된다. 멸균 주사가능한 용액의 조제를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 조제 방법은 활성 성분 + 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 원하는 추가 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
단일 제형(dosage form)을 생성하기 위해 담체 물질과 병용될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 제형을 생성하기 위해 담체 재료와 병용될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료학적 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서 이러한 양은 약제학적으로 허용되는 담체와 병용하여 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
투약 용법은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들면, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있거나, 몇몇의 분할 용량들이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 또는 상기 용량이 치료학적 상황의 긴급성에 따라 나타내어지는 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 투약 단위 형태(dosage unit form)로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투약 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 말하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 투약 단위 형태에 대한 사양은 (a) 상기 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료학적 효과, 및 (b) 개체에서 감수성(sensitivity)의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 구성하는 것의 당해 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존한다.
약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌[“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에서 찾을 수 있고, 이는 본원에 참조에 의해 포함된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 약제학적 조성물은 당해 분야에 익히 공지되어 있는 프로세스에 의해, 예를 들면 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정(dragee)-제조, 레비게이팅(levigating), 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 프로세스의 수단에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법들 중 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 치료학적 제제의 바람직한 투여 경로로는 혈관내 전달(예를 들면, 주사 또는 주입), 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척추, 경구, 장, 직장, 폐(예를 들면, 흡입), 비강, 국소(경피, 협측 및 설하 포함), 방광내, 유리체내, 복강내, 질내, 뇌 전달(예를 들면, 뇌실내, 뇌내 및 확산 증강된 대류(convection enhanced diffusion)), CNS 전달(예를 들면, 척수강내, 척추주위 및 척추내) 또는 비경구(피하, 근육내, 복강내, 정맥내(IV) 및 피내 포함), 경피(수동적으로 또는 이온영동(iontophoresis) 또는 전기천공 사용), 경점막(예를 들면, 설하 투여, 비강, 질, 직장 또는 설하), 투여 또는 임플란트(implant)를 통한 투여, 또는 예를 들면 주사 또는 주입에 의한 다른 비경구 투여 경로, 또는 당해 분야에 공지되어 있는 다른 전달 경로 및/또는 투여 형태가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 어구 "비경구 투여"는 장 및 국소 투여 이외의 보통 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 이로는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 캡슐내, 안와내, 심장내, 피부내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 또는 생분해성(bioerodible) 삽입물의 사용이 이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 각 투여 경로에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다. 한 특정 실시형태에서, 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 단백질, 치료학적 제제 또는 약제학적 조성물은 복강내 또는 정맥내 투여될 수 있다.
특정 실시형태들에 따르면, 본원에 개시되는 상기 조성물은 수용액으로, 비경구 주사에 의해 투여된다. 상기 제형은 또한 현탁액 또는 유제의 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로 본원에 기술되는 상기 조성물의 유효량을 포함하는 비경구 주사용 약제학적 조성물이 제공되고, 임의로 약제학적으로 허용되는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보강제 및/또는 담체를 포함한다. 이러한 조성물은 하기: 희석제, 멸균수, 다양한 완충액 함량의 완충된 염수(예를 들면, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도; 및 세제 및 가용화제(예를 들면, TWEEN 20(폴리소르베이트-20), TWEEN 80(폴리소르베이트-80)), 항산화제(예를 들면, 수용성 항산화제, 예를 들면 아스코르브산, 나트륨 메타바이설파이트, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트)와 같은 첨가제; 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤과 같은 유용성 항산화제; 및 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산과 같은 금속 킬레이트화제), 및 보존제(예를 들면, 티메르솔, 벤질 알콜) 및 벌킹 물질(예를 들면, 락토스, 만니톨) 중 하나 이상을 임의로 포함한다. 비-수성 용매 또는 비히클의 예로는 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들면 올리브 오일 및 옥수수 오일, 젤라틴 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트가 있다. 상기 제형은 냉동 건조(동결건조)되거나 진공 건조되고 사용 직전에 재용해/재현탁될 수 있다. 상기 제형은 예를 들면, 박테리아 보유 필터를 통한 여과, 멸균제를 조성물에 혼입시킴으로써, 조성물을 방사선 조사함에 의해, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다.
본원에 개시되는 각종 조성물(예를 들면, 폴리펩타이드)은 국소적으로 적용될 수 있다. 국소 투여는 대부분의 펩타이드 제형에 양호하게 작용하지 않지만, 특히 폐, 비강, 구강(설하, 협측), 질 또는 직장 점막에 적용할 경우 효과적일 수 있다.
본 발명의 조성물은 약 5 마이크론(micron) 미만의 공기역학적 직경을 갖는 에어로졸 또는 분무 건조된 입자로서 전달될 때 흡입하고 폐 상피 내벽을 가로질러 혈류로 횡단하면서 폐로 전달될 수 있다. 치료학적 제품의 폐 전달을 위해 고안된 광범위한 기계적 장치가 사용될 수 있으며, 이로는 네뷸라이저(nebulizer), 계량된 용량의 흡입기 및 분말 흡입기가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니고, 이들 전부는 당업자에게 친숙하다. 상업적으로 입수가능한 장치의 몇몇의 구체예로는 울트라벤트(Ultravent) 네뷸라이저(Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.); 아콘(Acorn) II 네뷸라이저(Marquest Medical Products, Englewood, Colo.); 벤톨린(Ventolin) 계량된 용량의 흡입기(Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.); 및 스핀헬러(Spinhaler) 분말 흡입기((Fisons Corp., Bedford, Mass.)가 있다. 넥타(Nektar), 알케르메스(Alkermes) 및 맨카인드(Mannkind)는 전부 흡입가능한 인슐린 분말 조제를 승인받았거나 상기 기술이 본원에 기술된 제형에 적용될 수 있는 임상 시험 중이다.
점막에 투여하기 위한 제형은 전형적으로 분무 건조된 약물 입자일 것이고, 이는 정제, 겔, 캡슐, 현탁액 또는 유제에 포함될 수 있다. 표준 약제학적 부형제는 임의의 제조사로부터 입수가능하다. 경구 제형은 츄잉 검, 겔 스트립, 정제 또는 로젠지(lozenge) 형태일 수 있다.
경피제형이 또한 조제될 수 있다. 이들은 전형적으로 연고, 로션, 스프레이 또는 패치(patch)일 것이고, 이들 전부는 표준 기술을 이용하여 조제될 수 있다. 경피 제형은 침투 향상제의 포함을 필요로 할 것이다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은 환자에게 독성이지 않으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료학적 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다. 선택된 투약 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 사용된 상기 특정 조성물과 병용하여 사용된 치료, 다른 약물, 화합물 및/또는 재료의 지속기간, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적 건강 및 이전 병력을 포함하는 다양한 약동학적 인자들, 및 의학 분야에 익히 공지되어 있는 유사 인자들에 따라 달라질 것이다.
특정 실시형태들에 따르면, 본원에 개시되는 조성물은 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여된다. 본원에서 사용되는 상기 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 치료되는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나, 억제하거나 또는 완화시키거나, 또는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 제공하기에 충분한 용량을 의미한다. 정확한 용량은 대상체-의존적 변수(예를 들면, 연령, 면역계 건강 등), 질환 및 수행되는 치료와 같은 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. 본원에 개시된 폴리펩타이드 조성물, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 작제물 및 본원에 기술된 상기 세포의 경우, 추가 연구가 수행됨에 따라, 다양한 환자에서의 다양한 병태를 치료하기 위한 적절한 용량 수준에 관한 정보가 나타날 것이며, 치료학적 맥락, 수용자의 연령 및 일반적인 건강 상태를 고려하여 통상의 숙련된 작업자는 적절한 용량을 확인할 수 있을 것이다. 상기 선택된 용량은 원하는 치료학적 효과에, 투여 경로에 그리고 원하는 치료의 지속기간에 의존한다. 폴리펩타이드 조성물의 경우, 일반적으로 1일 0.0001 내지 100mg/kg 체중의 용량 수준이 포유동물에게 투여되고, 보다 통상적으로 0.001 내지 20mg/kg 체중이다. 예를 들면, 용량은 0.3mg/kg 체중, 1mg/kg 체중, 3mg/kg 체중, 5mg/kg 체중 또는 10mg/kg 체중 또는 1 내지 10mg/kg의 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 용법은 주당 5회, 주당 4회, 주당 3회, 주당 2회, 주당 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 월 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회를 수반한다. 일반적으로, 정맥내 주사 또는 주입의 경우, 용량은 더 낮을 수 있다. 투약 용법은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료학적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들면, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 몇몇의 분할된 용량들이 시간에 따라 투여될 수 있거나, 상기 용량이 치료학적 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투약 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 말하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 투약 단위 형태에 대한 사양은 (a) 상기 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료학적 효과, 및 (b) 개체에서 감수성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 구성하는 것의 당해 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존한다.
임의로, 상기 폴리펩타이드 제형은 임의의 적합한 타이밍(timing) 용법에 따라, 0.0001 내지 100mg/kg 환자의 체중/일 사이, 바람직하게는 0.001 내지 20.0mg/kg/일의 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 치료학적 조성물은 예를 들면, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 매주 3회, 매주 2회 또는 매주 1회, 2주 또는 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주에 1회 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단기간 또는 장기간(예를 들면, 1주, 1개월, 1년, 5년)에 걸쳐 투여될 수 있다.
대안으로, 본원에 개시된 상기 조성물은 서방성(sustained release) 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 용량 및 빈도는 환자의 치료학적 제제의 반감기에 따라 다르다. 일반적으로, 인간 항체는 최장의 반감기를 나타내고, 이어서 인간화된(humanized) 항체, 키메라 항체 및 비인간(nonhuman) 항체가 이어진다. 융합 단백질의 반감기는 매우 다양할 수 있다. 용량 및 투여 빈도는 상기 치료가 예방학적인지 치료학적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방학적 적용에 있어서, 상대적으로 낮은 용량은 장기간에 걸쳐 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자들은 이들의 남은 생애 동안 계속해서 치료를 받는다. 치료학적 적용에 있어서, 상기 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 그리고 바람직하게는 상기 환자가 질환의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격으로 상대적으로 높은 용량이 때때로 필요하다. 그 후, 상기 환자는 예방학적 용법을 투여받을 수 있다.
소정 실시형태들에 있어서, 상기 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 핵산 작제물 또는 세포 조성물은 치료되는 부위에 직접적으로 예를 들면, 주사에 의해 국부적으로 투여된다. 전형적으로, 상기 주사는 상기 조성물의 증가된 국부 농도를 야기하고, 이는 전신 투여에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 크다. 상기 폴리펩타이드 조성물은 치료될 부위로부터 상기 폴리펩타이드의 수동적 확산을 감소시킴으로써 상기 폴리펩타이드 조성물의 증가된 국부 농도를 생성하는 것을 돕기 위해 상기 기술된 바와 같은 매트릭스(matrix)와 병용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에 공지되어 있는 의학적 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 한 임의의 실시형태에서, 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 약제학적 조성물은 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 개시된 장치와 같은 바늘 피하 주사 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 익히 공지되어 있는 임플란트 및 모듈(module)의 예로는 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료학적 장치를 개시하는 미국 특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,447,233호; 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능한 주입 장치를 개시하는 미국 특허 제4,447,224호; 다중-챔버(multi-chamber) 구획(compartment)을 갖는 삼투압 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제4,439,196호; 및 삼투압 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제 4,475,196호가 포함된다. 이들 특허는 본원에 참조에 의해 포함된다. 다수의 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자들에게 공지되어 있다.
상기 활성 화합물은 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제형과 같은 신속한 방출로부터 상기 화합물을 보호할 담체와 함께 조제될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 조제를 위한 다수의 방법이 특허를 받았거나 일반적으로 당업자들에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
제어 방출 중합체 장치는 중합체 장치(막대, 실린더, 필름, 디스크) 또는 주사(미세입자)의 이식 후 전신적 장기 방출을 위해 만들어질 수 있다. 상기 매트릭스는 마이크로스피어(microsphere)와 같은 미세 입자의 형태로 존재할 수 있으며, 여기서 펩타이드는 고체 중합체 매트릭스 또는 미세캡슐 내에 분산되어 있고, 여기서 코어는 중합체 쉘(shell)과 다른 재료로 이루어지고, 상기 펩타이드는 상기 코어에 분산되거나 현탁되며, 이는 본질적으로 액체 또는 고체일 수 있다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 미세 입자, 마이크로스피어 및 미세캡슐은 상호교환적으로 사용된다. 대안으로, 상기 중합체는 나노미터 내지 4 센티미터 범위의 얇은 슬래브(slab) 또는 필름, 분쇄 또는 기타 표준 기술에 의해 생성된 분말, 또는 심지어 하이드로겔(hydrogel)과 같은 겔로서 주조될 수 있다.
본원에 개시된 활성제의 전달을 위해 비-생분해성 또는 생분해성 매트릭스가 사용될 수 있지만, 생분해성 매트릭스가 바람직하다. 이들은 천연 또는 합성 중합체일 수 있지만, 보다 양호한 분해 및 방출 프로파일의 특성확인으로 인하여 합성 중합체가 바람직하다. 중합체는 방출이 요구되는 기간에 기초하여 선택된다. 몇몇의 경우에는 선형 방출이 가장 유용할 수 있지만, 다른 경우에는 펄스(pulse) 방출 또는 "벌크(bulk) 방출"이 더 효과적인 결과를 제공할 수 있다. 상기 중합체는 하이드로겔(전형적으로 최대 약 90중량%의 물을 흡수함)의 형태로 존재할 수 있고, 임의로 다가 이온 또는 중합체와 가교(crosslinked)될 수 있다.
매트릭스는 용매 증발, 분무 건조, 용매 추출 및 당업자에게 공지되어 있는 다른 방법에 의해 형성될 수 있다. 생분해성 마이크로스피어는 예를 들면, 문헌[Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987); 및 Mathiowitz, et al., J. Appl Polymer ScL, 35:755-774 (1988)]에 의해 기술된 바와 같이 약물 전달용 마이크로스피어를 만들기 위해 개발된 임의의 방법을 사용하여 조제될 수 있다.
상기 장치는 이식 또는 주사 부위를 치료하기 위해 국소 방출용으로 제형화될 수 있고, 이는 전형적으로 전신 치료 또는 전신 전달을 위한 용량보다 훨씬 더 적은 용량을 전달할 것이다. 이들은 이식되거나 피하, 근육, 지방에 주사되거나 삼킬 수 있다. 소정 실시형태들에 있어서, 본 발명의 적어도 몇몇의 실시형태들에 따른 치료학적 화합물이 BBB(원하는 경우)를 통과하는 것을 보장하기 위해, 이들은 예를 들면, 리포솜으로 제형화될 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 관해서, 예를 들면, 미국 특허 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서 표적화된 약물 전달을 향상시킨다(예를 들면, 문헌[V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685]을 참조한다). 예시의 표적화 모이어티로는 폴레이트 또는 비오틴(예를 들면, 미국 특허 제5,416,016호 내지 문헌[Low et al.]을 참조한다); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134); p120(문헌[Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090]; 또한 문헌[K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다)이 포함된다.
본 발명의 몇몇의 실시형태들의 조성물은 필요에 따라 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser) 장치, 예를 들면 상기 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투약 형태를 함유할 수 있는 FDA 승인 키트(kit)로 제시될 수 있다. 상기 팩은 예를 들면, 블리스터 팩(blister pack)과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여를 위한 지침이 수반될 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서는 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에서 규정한 형태로 용기와 관련된 고지(notice)에 의해 수용될 수도 있고, 이 고지는 해당 조성물의 형태 또는 인간 또는 수의학적 투여에 대한 기관의 승인을 반영한다. 예를 들면, 이러한 고지는 처방 약물에 대해 미국 식품의약국에서 승인한 라벨링(labeling) 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 상용성(compatible) 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 조제를 포함하는 조성물도 조제될 수 있고, 적절한 용기에 배치되고, 상기에 추가로 상세히 설명된 바와 같이 명시된 병태의 치료에 대해 라벨링될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 ±10%를 말한다.
상기 용어 "포함한다", "포함하는", 포함된다", "포함되는", "갖는" 및 이들의 활용형은 "포함하지만 이들에 한정되는 것은 아님"을 의미한다.
상기 용어 "으로 이루어진"은 "포함하지만 이들에 한정되는 것은 아님"을 의미한다.
상기 용어 "본질적으로 이루어지는"은 추가의 성분들, 단계들 및/또는 부분들이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본 및 신규 특성들을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 상기 조성물, 방법 또는 구조가 추가의 성분들, 단계들 및/또는 부분들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 단수 형태 "한", "하나" 및 "상기"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수의 참조물을 포함한다. 예를 들면, 용어 "한 화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물들을 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시형태들은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식으로의 설명은 단지 편의성과 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 불가변적 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위 범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수적 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위에 대한 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라, 해당 범위 내의 개별 수, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 및 6도 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에서 수적 범위가 표시될 때마다, 표시된 범위 내에서 인용된 숫자(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 어구 첫번째 표시된 수와 두번째 표시된 수 "사이의 범위의/사이의 범위이다" 및 첫번째 표시된 수"로부터" 두번째 표시된 수"까지의 범위의/까지의 범위이다"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 이는 첫번째 및 두번째 표시된 수 및 이들 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "방법"은, 공지의 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 전문가에게 공지되어 있거나 이들에 의해 용이하게 개발된 이들 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아닌, 주어진 과제를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 말한다.
특정 서열목록을 참조할 때, 이러한 참조는 예를 들면, 서열분석(sequencing) 오류, 클로닝 오류 또는 염기 치환, 염기 결실 또는 염기 부가를 초래하는 기타 변경으로 인한 사소한 서열 변이를 포함하는 것과 같이 이의 상보적 서열에 실질적으로 대응하는 서열도 포함하는 것으로 이해되어야 하고, 단 이러한 변이의 빈도는 50개의 뉴클레오타이드 중 1개 미만, 대안으로 100개의 뉴클레오타이드 중 1개 미만, 대안으로 200개의 뉴클레오타이드 중 1개 미만, 대안으로 500개의 뉴클레오타이드 중 1개 미만, 대안으로 1000개의 뉴클레오타이드 중 1개 미만, 대안으로 5,000개의 뉴클레오타이드 중 1개 미만, 대안으로 10,000개의 뉴클레오타이드 중 1개 미만이다.
실시예
이제 상기 설명과 함께 본 발명의 몇몇의 실시형태들을 비제한적 방식으로 예시하는 하기 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 이용되는 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)]; 문헌[Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]; 문헌[Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)]; 문헌[Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York]; 문헌[Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)]; 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 제시되는 바와 같은 방법론; 문헌["Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)]; 문헌["Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition]; 문헌["Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)]; 문헌[Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)]을 참조하고, 입수가능한 면역검정은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있으며, 예를 들면 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)]; 문헌["Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)]; 문헌["Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)]; 문헌["Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)]; 문헌["Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)]; 문헌["A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press]; 문헌["PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)]; 문헌[Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)]을 참조하고; 이들 전부는 전문이 본원에 제시되는 바와 같이 참조에 의해 포함된다. 다른 일반적인 참조문헌도 이 문서 전체에 걸쳐 제공된다. 이의 절차는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 것으로 생각되고, 독자의 편의를 위해 제공된다. 이에 포함된 모든 정보는 본원에 참조에 의해 포함된다.
실시예 1
SIRPα-4-1BBL 변이체의 선택
하기 매개변수들을 최적화하기 위해, 본원에서 "DSP107"로 칭하는 N-말단 신호 펩타이드 및 C-말단 his-태그를 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질(서열번호 43, 도 1)의 구조적 분석을 수행하였다:
● 폴딩 - 표적에의 결합을 가능하게 하는 적절한 폴딩, 잠재적인 디설파이드 스크램블링(scrambling) 최소화;
● 무결성(Integrity) - 노출된 단백질 가수분해 부위 없음;
● 다량체화(Multimerization) - 2개의 도메인의 잠재적인 다량체화를 탐색함. 구체적으로, C-말단 도메인 형성의 삼량체화를 최적화함.
● 포유동물 발현 시스템에서의 고발현; 및
● 낮은 면역원성.
구체적으로, SIRPα 도메인(UniProt ID P78324 EM 도메인의 아미노산 31 내지 373에 상응함, 서열번호 2)의 경우:
1. SIRPα 종합적 모델은 PDB 구조에 기초하여 생성했다: 2JJS, 2JJT, 2UV3, 2WNG, 4CMM, 4KJY, 6BIT. SIRPα의 C-말단부는 이러한 PDB 구조에서 누락되기 때문에(VAL338로부터 시작, 즉 VSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIY, 서열번호 9), 타당한 예측 모델을 만들기 위해 모델링 및 상동성 모델링 기술을 적용했다.
2. 구조적 분석- 목적하는 프로파일에 영향을 미칠 수 있는 융합 단백질 내의 잠재적 요소를 강조하기 위해 구조 분석을 수행했다. 이러한 분석은 하기를 포함한다:
- Delphi 및 CHARMM 기반 알고리즘을 사용한 정전기 전위 표면 계산(electrostatic potential surface calculation)을 사용하여 단백질 응집 및 비-천연 올리고머화(non-native oligomerization)를 유발할 수 있는 소수성 분절 식별.
- 공개된 X-선 구조를 기반으로 하는 융합 단백질의 상동성 모델링.
- 결정된 고해상도 구조가 없는 영역에 대한 구조 예측 (구조 예측 서버(structure prediction server): robetta, TASSER 및 PEP-FOLD3 사용).
- 단백질 분해 부위 예측을 위한 PROSPER 서버에 따른 융합 단백질 (또는 제안된 변이체)의 서열에서 잠재적 절단 부위 예측.
3. 4-1BBL로 SIRPα 발현 도메인의 DSP107 도킹(docking)을 평가하기 위해 잠재적인 잘못 폴딩된 형태에 대한 조잡한 모델을 생성했다.
4-1BBL(UniProt ID P41273 EM 도메인의 아미노산 50 내지 254에 상응함, 서열번호 3)의 경우:
1. 4-1BBL 세포외(EC) 도메인 모델은 PDB 구조: 2X29에 기초하여 생성되었다. 4-1BBL의 N-말단 부분이 누락되고 X-선에서 해상되지 않았기 때문에, 이러한 분절(ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPD, 서열번호 10)은 소수성 잔기를 용매에 노출시키는 것으로 보이고, 이의 구조를 예측하려는 시도는 구조화되지 않은 영역을 나타냈다. 이는 상기 융합 DSP107의 안정성을 저하시킬 수 있고, 또한 4-1BBL을 통한 삼량체화를 위한 적절한 배향(orientation)을 방해할 수도 있다.
2. 상기 융합 단백질은 PROSPER 서버를 이용하여 단백질 가수분해 부위에 대해 분석하였다.
3. 상기 4-1BBL 해상된 도메인 내에서 용매를 향하여 바깥쪽을 직면하고 있는 루프가 검출되었고, 이는 프로세싱을 경험하는 영역일 수 있음을 의미한다.
하기 도 2a 내지 도 3 및 표 3은 생성된 3D 모델, 확인된 도메인 및 분절, 및 DSP107 융합 단백질의 분석에서 검출된 예측된 단백질 가수분해 부위를 입증한다.
종합하면, 구조적 분석은 하기를 나타냈다:
1. 상기 4-1BBL 도메인의 N-말단 분절(ACPWAVSGARASPG, 서열번호 6/ACPWAV, 서열번호 7)을 제거하는 것은 DSP107의 유연성 및 소수성을 저하시킬 것으로 예측된다.
2. Ig-유사 C1 타입1 및 Ig-유사 C1 타입2의 제거는 CD47 상호 작용 도메인을 활성 상태로 유지하면서 단백질의 크기를 줄일 수 있다. 따라서, SIRPα의 C- 말단은 4-1BBL에 연결된 TELSVRAKPS (서열번호 8)로 끝나야 한다.
3. 4-1BBL 도메인의 N-말단 분절(ACPWAVSGARASPG, 서열번호 6/ACPWAV, 서열번호 7)에는, 부정확한 디설파이드 결합으로 인하여 적절한 폴딩/재배열을 방지할 수 있는 유리 Cys 잔기가 존재한다.
4. SIRPα의 N-말단에 있는 6-His 태그는 SIRPα의 초기 3개의 글루타민산과 상호 작용하여, 이 영역을 마스킹할 것으로 예상된다.
5. 플랭킹/비구조화된 영역에 절단 부위가 거의 없는 것 같다.
[표 3]
Figure pct00006
상기 구조 분석에 기초하여, 서열번호 24 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 몇몇의 SIRPα 변이체가 고안되었고, 이는 4-1BBL 또는 이의 임의의 변이체에 융합될 수 있다.
또한, 상기 구조 분석에 기초하여, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74 또는 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 몇몇의 4-1BBL 변이체가 고안되었고, 이는 SIRPα 또는 이의 임의의 변이체에 융합될 수 있다.
또한, 4-1BBL 모이어티의 활성을 유도하기 위한 상기 융합 단백질의 삼량체화의 필요성을 회피하기 위해, 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함하는 4-1BBL 변이체가 고안되었고, 이는 SIRPα 또는 이의 임의의 변이체에 융합될 수 있다. 이러한 4-1BBL 변이체의 예시의 서열은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 반복들 사이의 (GGGGS)x2+GGGG(서열번호 82) 링커를 갖는 서열번호 23의 3중 반복을 포함한다.
이러한 3중 반복 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합에 대한 일례로서, 예측된 3D 모델은 상동성 모델링에 이어 측쇄 및 루프 개선(refinement)을 이용하여 생성되었다. 이러한 모델 분석은 리간드에 대한 가능한 결합 및 상이한 도메인들 사이의 간섭이 없음을 예측하였다(도 37 a-b).
이어서, 몇몇의 SIRPα-4-1BBL 변이체가 고안되었다. 이들의 선택에 대한 근거를 포함하는 이들의 서열 및 이들의 3D 모델은 본원 하기의 표 4 및 도 4 내지 도 6 및 37에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예 2
SIRPα-4-1BBL 변이체의 제조
비교 기능 분석 및 생산 평가를 위해, 몇몇의 히스티딘-태그된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 생성했다.
본원에서 C-말단 His 태그(서열번호 1) 및 C-말단 His 태그(각각, 서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 17)을 포함하는 본원에서 "DSP107_V1", "DSP107_V2", 및 "DSP107_V3"으로 칭하는 3개의 SIRPα-4-1BBL 변이체를 포함하는 "DSP107"로 본원에서 칭하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 생성을 ExpiCHO 세포로 수행했다.
N-말단 His 태그 (서열번호 44)를 포함하는 "DSP107"의 생성은 Expi293F 세포로 수행했다.
세포는 전체 융합 단백질 및 2개의 변이체에 대한 코딩 서열로 클로닝된 pcDNA3.4 발현 벡터에 의해 형질 감염되었다. 상기 서열은 N-말단에서 Kozak 서열, 인공 신호 펩티드 (MGWSCIILFLVATATGVH, 서열번호 4), N-말단 또는 C-말단에서 6개의 His-태그, 및 C 말단에서 정지 코돈의 부가와 함께 EcoRI 및 HindIII 제한 효소를 이용하여 벡터에 클로닝되었다. 상기 단백질은 세포 배양의 상청액으로부터 수집되고, HisTrapTM FF 크루드 컬럼에 의해 1단계로 정제되었다.
이러한 생산 조건 하에서, C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1)의 수율은 배양액 1리터당 약 67 mg이었다. 비교하여, C-말단 his-태그 DSP107_V1 (서열번호 12) 및 DSP107_V2 (서열번호 14)의 수율은 배양액 1리터당 약 150mg이었으며; C-말단 His 태그 DSP107_V3.1 (서열번호 17)의 수율은 배양 1리터당 약 212mg이었다. 수율은 최종 제품의 BCA 단백질 측정에 의해 결정되었다.
이어서, His-태그 단백질을 크기 배제 크로마토 그래피로 정제하여 정제된 삼량체의 분획을 수집하였다. 10 mg의 His-태그 DSP107_V1 및 DSP107_V2 (서열번호 12 및 서열번호 14)를 이동상으로서 PBS와 1 ml/min의 유속으로 Superdex 200 컬럼 (60 + 100x1.6cm)에 로딩했다. 단백질 삼량체에 해당하는 주요 피크를 수집했다.
본원에서 "DSP107_V1" 및 "DSP107_V2"(각각 서열번호 11 및 서열번호 13)로 언급되는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 2개의 변이체의 생성은 CHO-K1 및 CHO-S 세포 (오직 DSP107-V2)에 수행되었다.
CHO-K1 세포를 DSP107_V1 및 DSP107_V2 변이체에 대한 코딩 서열로 클로닝 된 pGenHT1.0 발현 벡터로 형질 감염시켰다. N-말단에서 Kozak 서열 및 인공 신호 펩티드 (MGWSCIILFLVATATGVH, 서열번호 4)의 부가와 함께 서열을 벡터로 클로닝하였다. CHO-S 세포는 DSP107_V2 변이체에 대한 코딩 서열로 클로닝된 pMAXX1 발현 벡터에 의해 형질 감염시켰다. 5' 비번역 DNA 서열, Kozak 서열 및 리툭시맙 중쇄의 신호 펩티드 (MGWSLILLFLVAVATRVLS, 서열번호 99)의 부가와 함께 서열을 벡터에 클로닝하였다. 형질 감염된 세포를 미니 풀로 선택하고, DSP107 변이체의 발현을 배치 또는 유가 배치에서 평가했다. 단백질은 세포 배양의 상청액으로부터 수집하고, ELISA (도 17) 및 SDS-PAGE (도 18)에 의해 평가했다.
CHO-K1 유래 선택된 미니 풀의 5일 배치 배양의 수율은 DSP107_V1의 경우 75 mg/L 이하, DSP107_V2의 경우 327 mg/L 이하였다. CHO-S 유래 선택된 미니 풀의 11일 유가 배치 수율은 1200 mg/L 이하였다.
실시예 3
상기 SIRPα-4-1BBL 변이체의 올리고머 상태의 측정
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44); 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1), DSP107_V1 (서열번호 12), DSP107_V2 (서열번호 14) 및 DSP107_V3.1 (서열번호 17)을 포함하는 DSP107. 스펙트라(Spectra) BR 단백질 분자량 마커(Thermo Fisher Scientific, cat# 26634), 4 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔(BioRad, cat# 556-8094), 이-스테인 페드(e-Stain ped)(GenScript, cat #L02011), 라엠멜리(Laemmeli) 부하 완충액(BioRad, cat# 161-0747).
방법 -
SDS-PAGE 분석 - 각각의 샘플로부터의 2㎍의 단백질을 β-메르캅토에탄올의 존재 또는 부재(각각 환원 및 비-환원 조건) 하에 부하 완충액과 혼합하였고, 95℃에서 5분 동안 가열하였고, 4 내지 20% 농도구배(gradient) 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 상기 겔 상에서의 단백질 이동은 제조업자의 지침에 따라 이-스테인 페드로 염색하고 이-스테인 기기(GenScript)를 사용하여 세척함으로써 가시화된다.
질량 분석법 (MS) 분석 - 각 단백질 샘플의 5 μg을 환원 없이 IAA cys 변형 후 또는 환원적 디메틸화 환원 및 IAA cys 변형 후 트립신 처리했다. 샘플은 HFX 질량 분석기 (Thermo)를 사용하여 분석하고, Discoverer 소프트웨어 버전 1.4와 인간 uniprot 데이터베이스 및 디코이(decoy) 데이터베이스 (잘못된 발견 비율-FDR을 결정하기 위해)와 Sequest 검색 엔진을 사용하여 특정 시퀀스에 대해 식별했다. 또한, s-s 결합을 감지하기 위해 매스매트릭스 및 starvoX 소프트웨어를 사용했다.
SEC-MALS 분석 - 단백질을 수퍼덱스 200 증가 컬럼(GE Healthcare)에 부하하고 이동상으로서 10mM KPO4 pH 8.0 + 150mM NaCl을 사용하여 0.8ml/min의 유속으로 실행했다. 검출은 AKTA 익스플로러(GE) + MiniDawn TREOS + OPTILAB T-reX(WYATT)를 사용하여 UV, MALS 및 RI에 의해 수행했다.
결과 -생성된 SIRPα-4-1BBL 변이체의 SDS-PAGE 분석은, N-말단 his-태그 DSP107 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44 및 서열번호 1) 및 C-말단 his-태그 DSP107_V1 및 DSP107_V2는 70kDa-분자량 마커보다 약간 느린 환원 조건에서 이동되었다 (도 7A). 예상대로, 유사한 조건에서, C-말단 his-태그 DSP107-V3.1 (서열번호 17)은 40 kDa 마커와 유사한 위치에 나타나는 다른 변이체와 다르게 이동했다. 비환원 조건 하에서, N-말단 his-태그 DSP107 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44 및 1)은 주로 고분자량 단백질 (~ 210 kDa)로 나타났다 (도 7B). 이러한 단백질의 작은 분획과 C-말단 his-태그 DSP107_V1 및 DSP107_V2는 환원 조건 (즉, ~ 75kDa)에서의 이동과 유사하게 이동했다. 이는 DSP107 융합 단백질에 S-S 연결된 다량체가 함유되는 것이 시사될 수 있다. C-말단 his-태그 DSP107-V3.1은 C-말단 his-태그 DSP107-V1 및 DSP107-V2와 같은 환원 및 비환원 조건 하에서 유사하게 이동되었으며, 이는 DSP107 단백질에서 S-S 예측 결합이 3개의 모든 변이체의 서열에서 제거된 유리된 시스테인 잔기 (Cys346)로 조절되는 것을 시사한다.
환원 대 비환원 N-말단 his-태그 DSP107 및 C-말단 his-태그 DSP107의 질량 분석법 (MS) 분석은, Cys346이 부분적으로 S-S 결합되었음을 입증했다. 이 발견은 N-말단 his-태그 DSP107 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44 및 서열번호 1)의 비환원 SDS-PAGE 분석에서 이량체의 존재와 상관 관계가 있다. 반면에, C-말단 his-태그 DSP_V1, DSP107_V2 및 DSP107-V3.1에서 Cys346이 제거되었고, 따라서 3개의 변이체의 비환원 SDS-PAGE 분석에서는 고차 올리고머가 검출되지 않았다.
생성된 SIRPα-4-1BBL 단백질의 SEC-MALS 분석은, 3개의 His-태그 SIRPα-4-1BBL 변이체 (서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 17)와 태그가 없는 DSP107_V2 (서열번호 13)이 삼량체를 형성하는 것을 보여준다. 총 단백질의 계산된 질량은 C-말단 his-태그 DSP107_V1 (서열번호 12)의 경우 약 258 kDa, his 태그 DSP107_V2 (서열번호 14)의 경우 269 kDa, his 태그 DSP107_V3.1 (서열번호 17)의 경우 107 kDa 및 DSP107_V2 (서열번호 13)의 경우 210 ± 20 kDa 였다(도 38).
실시예 4
상기 SIRPα-4-1BBL 변이체는 도메인 둘 다를 포함한다
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44); 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1), DSP107_V1 (서열번호 12), DSP107_V2 (서열번호 14) 및 DSP107_V3.1 (서열번호 17)을 포함하는 DSP107. 웨스턴 블롯 분석의 경우: 스펙트라 BR 단백질 마커(Thermo Fisher Scientific, cat# 26634), 라엠멜리 부하 완충액(BioRad, cat# 161-0747), 4 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔(BioRad, cat# 556-8094), 항 4-1BBL(BioVision, 5369-100), 항 SIRPα-비오티닐화된, (# LS-C370337, LsBio), 2차 염소 항 토끼 IgG (H + L)-HRP 접합체(R&D, cat# 170-6515), 스트렙트아비딘 단백질, HRP: (# 21126, Thermoscientific), ECL Plus 웨스턴 블롯팅 기질(Pierce, cat# 32132). 샌드위치(sandwich) ELISA의 경우: 항 4-1BBL 항체(매칭된 쌍(matched pair)으로부터의 포획 항체; Abnova #H00008744-AP41), 항 SIRPα-비오티닐화된 항체 (LsBio #LS-C370337), 스트렙트아비딘(Streptavidin) 단백질, HRP(#21126, Thermo Scientific), TMB 기질(1-Step™ Ultra TMB-ELISA 기질 용액, Thermo Scientific #34028).
방법 -
웨스턴 블롯 분석 - 단백질(레인(lane)당 50 mg 또는 500 ng)을 환원 또는 비환원 조건(각각 β-머캅토에탄올을 함유하는 부하 완충액에서 또는 95℃에서 5분 동안 끓임, 또는 동일한 완충액에서 β-머캅토에탄올의 부재 하에 가열하지 않음)으로 처리하였고, 4 내지 20% 농도구배 SDS-PAGE 겔에서 분리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 이동시켰고, 1차 항체, 항 4-1BBL(1:10000) 또는 비오티닐화된 항-SIRPα(1:10000)와 함께 밤새 인큐베이션하였고, 이어서 HRP-접합된 2차 항체(1:10000) 또는 스트렙트아비딘-HRP 기질 (1:20000) 각각을 함께 1시간 인큐베이션하였다. ECL 전개 후 신호가 검출되었다.
샌드위치 ELISA - 플레이트는 항 4-1BBL 항체(PBS에서 2.5 μg/ml)로 코팅되고 차단 용액(PBS, 1% BSA, 0.005% Tween)으로 차단된다. 차단 용액에 일련 희석된 상기 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 코팅된 플레이트에 첨가하고, 2시간 동안 배양하고, 이어서 항-SIRPα 비오티닐화된 항체(1:100)를 검출하면서 배양하고, 제조업자의 지침에 따라 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질로 후속 검출한다. 플레이트는 620nm에서를 기준으로 450nm에서 플레이트 판독기(Thermo Scientific, Multiscan FC)를 사용하여 분석했다.
결과 - 비환원 및 환원 조건 하에서, SDS-PAGE 겔 상에서 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44) 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1) 및 3개의 C-말단 his-태그 DSP107 변이체(DSP107_V1, DSP107_V2 및 DSP107_V3.1) (서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 17)의 분리 후 항-4-1BBL 항체 (도 8a-b) 또는 항 SIRPα 항체 (도 8c)와의 면역 블로팅은, 분자의 N-말단측 및 분자의 C-말단측 모두 존재하는 것이 입증되었다. SDS-PAGE 분석(상기 실시예 3)에 따라, 웨스턴 블롯 분석은 N-말단 his-태그 DSP107; 및 C-말단 his-태그 DSP107, DSP107_V1 및 DSP107_V2 단백질은 예상되는 DSP107 단량체 크기에 해당하는 75 kDa의 대략적인 크기로 환원 조건에서 이동하는 것이 입증되었다. 비환원 조건 하에서, N-말단 his-태그 DSP107 및 C-말단 his-태그 DSP107 융합 단백질에서 항 4-1BBL 항체로 더 높은 분자량의 추가 밴드도 검출되었으며, 이는 S-S 연결된 다량체의 형성을 시사한다.
이어서, 4-1BBL 도메인에 결합하는 포획 항체와 SIRPα 도메인에 결합하는 검출 항체를 사용하여 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 검출하기 위한 샌드위치 ELISA 방법을 고안했다. 도 9에 도시되는 바와 같이, N-말단 his-태그 DSP107과 C-말단 his-태그 DSP107_V1 및 DSP107_V2는 이중 측면 ELISA를 사용하여 유사한 용량 반응 방식으로 검출 및 정량화했으며, 이는 시험된 모든 융합 단백질이 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인 모두를 포함하는 것을 나타낸다.
실시예 5
상기 SIRPα-4-1BBL 변이체는 CD47 및 4-1BB에 결합한다
CD47에 대한 SIRPα-4-1BBL 단백질의 상기 SIRPα 모이어티의 결합 분석
인간 CD47에 대한 SIRPα-4-1BBL의 SIRPα 도메인의 결합은 CD47을 과발현하는 CHO-K1 세포주 또는 CD47을 내인성으로 발현하는 SUDHL4 인간 B 세포 림프종 세포주를 사용하여 평가했다. CHO-K1 WT 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 인간 4-1BB에 대한 SIRPα-4-1BBL의 4-1BBL 도메인의 결합은 4-1BB를 과발현하는 인간 섬유 육종 세포주 HT1080을 사용하여 평가했다 (Wyzgol A. et al., J Immunol. 2009 183 : 1851- 61). 야생형 HT1080 세포주는 음성 대조군으로 작용하였다. 세포를 상이한 농도의 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질과 함께 배양한 후, 2차 항 4-1BBL 항체로 면역 염색하여 CD47에 대한 결합을 검출했다. 대안적으로, DSP107_V2는 분자의 총 결합 능력을 측정하기 위해 비오티닐화되었다. 특이적 결합은 항-CD47 차단 항체 또는 항-4-1BB 차단 항체 또는 두 항체의 조합을 사용하여 평가했다. 결합은 유세포 분석 (FACS)에 의해 분석했다.
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1), DSP107_V1 (서열번호 12), DSP107_V2 (서열번호 14) 및 DSP107_V3.1 (서열번호 17), 및 DSP107_V2 (서열번호 13).
CHO-K1-WT 및 CHO-K1-CD47 세포주 (Bommel et al, 2017, Oncoimmunology 7(2): e1386361), SUDHL4 세포 (ATCC CRL-2957), HT1080 세포 (ATCC CCL-121), 4-1BB를 과발현한 HT1080 세포 (Wyzgol A. et al., J Immunol. 2009 183 : 1851-61), 고정성 생존성 염료(Fixable Viability Dye) (BD Biosciences, cat # 562247), 인간 Fc 차단제, 트루 스테인 FCX (Biolegend, cat # 422302), EZ-링크 NHS-PEG4- 비오틴 키트 (Thermo Scientific, cat # A39259) 및 하기 항체: 항 4-1BBL (Biolegend, cat # 311506), 항-CD47 (KAHR 의료 지침에 따라 GenScript에서 생성된 "Inhibrix-유사"); Biolegend, cat # 323124), 항-4-1BB (BD, cat # 552532 Biolegend, cat # 309810), 아이소타입(isotype) IgG1, k (Biolegend, cat # 400112), APC 스트렙트아비딘 (SA) (Biolegend, cat # 405207) , CFSE (Thermo Fisher, cat # C34554), 사이토라이트 레드(CytoLight Red) (Incucyte, cat # 4706).
방법 - CD47 또는 4-1BB의 막 발현은 각각 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)-컨쥬게이트된 항-CD47 및 항-4-1BB 항체와 해당 아이소타입 대조군을 사용하여 유세포 분석으로 평가했다. CD47에 대한 SIRPα-4-1BBL의 결합을 결정하기 위해, 얼음 위에서 30분 또는 1시간 동안 생성된 SIRPα-4-1BBL 단백질을 상이한 농도 (0.01-50 ㎍/ml 또는 0.156-80 ㎍/mL 또는 0.05-25 ㎍/mL, 표시된대로)로 배양하기 전에 인간 Fc 차단제로 세포를 미리 배양한 후, 4-1BBL에 대한 항체로 면역 염색, 고정 및 유세포 분석에 의한 분석을 했다. 4-1BB에 SIRPα-4-1BBL의 결합을 결정하기 위해, 제조업체의 프로토콜에 따라 EZ-링크 NHS-PEG4-비오틴 키트를 사용하여 SIRPα-4-1BBL을 비오티닐화했다. 이어서, 세포를 세척하고, 항-CD47 차단제 Ab를 사용하여 37 ℃에서 1시간 동안 배양하여 SIRPα 팔(arm)이 CD47에 결합하는 것을 방지하거나, 차단 없이 결합을 수행하여 세포에 분자의 총 결합(두 리간드에 의해)을 입증했다. 배양 후, 비오티닐화된 SIRPα-4-1BBL을 세포에 첨가하고 (연속 희석: 0.05-50 ㎍/mL; 0.238-238 nM), 4 ℃에서 20분 동안 배양했다. 배양 후, 세포를 세척하고, 검출 Ab, APC-스트렙트아비딘 (SA)으로 염색하고, 4 ℃에서 30분 동안 배양하고, 세척하고, 유세포 분석으로 분석했다. CHO-K1-CD47 세포는 제조업체 지침에 따라 CFSE로 염색하고, 세포를 과발현하는 HT1080 세포를 사이토라이트 레드로 염색했다. 2개의 염색된 세포주를 1:1 비율 (세포주당 30,000 개 세포)로 혼합했다. 일부 실험에서, 차단 항체 (αCD47, α41BB-10 μg/ml)를 첨가하고, 4 ℃에서 30분 동안 배양했다. 5 μg/ml의 DSP107_V2 (서열번호 13)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 배양했다. 2개의 염료에 대해 유세포 분석을 사용하여 세포를 분석했다.
결과 - CD47의 높은 막 발현은 CHO-K1-CD47 과발현 세포, SUDHL4 세포 및 HT1018 세포에서 관찰되었지만, CHO-K1 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 19a-b 및 20). 모든 시험된 융합 단백질은 CHO-K1-CD47 및 DSP107_V2(서열번호 13)의 CD47에 결합하여 SUDHL4 세포에 결합하고 4-1BB를 과발현하는 HT1080 세포에서 4-1BB 및 CD47에 결합했다(도 10, 21a-d 및 22). 결과는, 비오티닐화된 DSP107_V2의 HT1080 4-1BB OX 세포에 대한 총 결합이 HT1080 모세포에 대한 결합에 비해 더 높음을 보여준다 (도 22). 또한, HT1080 WT 세포에 대한 결합은 특정 차단 Ab를 사용한 CD47 차단 후에 완전히 폐기되었고; HT1080 4-1BB OX 세포에 대한 결합은 부분적으로만 감소되었다. 유사하게, HT1080 4-1BB OX 세포에 대한 오직 부분적인 차단은 항-4-1BB Ab에 의해 유도되었다. DSP107_V2 결합의 전체 폐기는 두 Abs를 사용하여 CD47 및 4-1BB 대응물 모두의 이중 차단으로 달성되었다 (도 22). 단백질은 CHO-K1-WT 세포에 결합하지 않았다 (도 21 a-b). 최고 농도의 단백질로 배양 된 아이소타입 대조군은 배경 염색을 보이지 않았다.
이어서, CFSE-표지된 HT1080 4-1BB OX 세포 및 사이토라이트 레드-표지된 CHO-K1 CD47 OX 세포에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 동시 결합을 평가했다. 배양 후, CD47 및 4-1BB OX 세포와 함께 DSP107_V2의 공동 염색된 복합체의 이중선 형성이 관찰되었으며(도 23a), 이는 면역 원성 시냅스를 통한 인접 세포의 근사를 시사한다. DSP107_V2를 배지 대조군과 비교한 3개의 독립적인 실험의 평균 결과는, ~10% 내지 30% 초과의 이중선이 크게 증가한 것으로 나타났다 (도 23b 및 24). 중요한 것은, DSP107_V2에 의한 이중선의 형성은 항-CD47 또는 항-4-1BB 차단 Ab와의 공동-배양 시 강력하게 억제되었다는 것이다. 이러한 발견은 SIRPα-4-1BBL 작용 모드와 일치하며, CD47과 4-1BB 모두에 동시에 결합한다.
인간, 마우스 및 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 CD47 및 4-1BB 대응부에 대한 SIRPα-4-1BBL의 결합
CD47 및 4-1BB에 대한 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 결합은 표면 플라스몬 공명(SPR: Surface Plasmon Resonance) 검정에 의해 측정했다.
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44); C-말단 his-태그 DSP107_V1 (서열번호 12) 및 DSP107_V2 (서열번호 14) 및 DSP107_V2 (서열번호 13).
시리즈 S 센서 칩 CM5(GE, cat. # BR100530), 인간 Ab 포획 키트(GE, cat. # BR100839), 인간 PDL1-hFc (R&D, cat. # 156-B7-100), 인간 CD47-hFc (R&D, cat # 4670-CD-050), 마우스 CD47-hFc (R&D, cat. # 1866-CD-050), 사이노몰거스 CD47-hFc (ACROBiosystems, cat. # CD7-C5252), 인간 4-1BB-hFc (LsBio, cat # LS-G4041-100), 마우스 4-1BB-hFc (R&D, cat. # 937-4B-050), 사이노몰거스 4-1BB-hFc (R&D, cat. # 9324-4B-100).
방법 - 비아코어(Biacore) T100 바이오센서(biosensor)(GE Healthcare)를 이용하여 SPR 검정을 수행했다. 인간 Ab 포획 키트로부터의 25 μg/mL 항-인간 IgG(항-Fc)는 제조업자에 의해 권고되는 바와 같은 표준 아민 커플링 프로토콜을 사용하여 칩(Fc1-4)의 모든 4개의 유동-채널에 커플링된다. 상기 칩에 대한 CD47 및 4-1BB의 결합은 HBS-EP + 실행 완충액(10mM HEPES pH7.3, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.0 5% Tween20)에서 수행된다: 인간 PDL1(음성 대조군)은 참조 채널 Fc1에 부하되고(첫번째 실험에서 10 μg/mL 및 두번째 실험에서 5 μg/mL, 10초 동안 20 μl/min에서), 한편 Fc2-4는 인간, 마우스 및 사이노몰거스 CD47-hFc 단백질이 부하된다(첫번째 실험에서 10 μg/mL 및 두번째 실험에서 5 μg/mL, 5초 동안 20 μl/min에서). 칩의 자동화된 재생 후, 칩은 채널 Fc1 상에 인간 PDL1-hFc로, 그리고 채널 Fc2-4 상에 인간, 마우스 및 사이노몰거스 4-1BB-hFc 단백질로 재-부하된다(첫번째 실험에서 10, 5 및 7.5 μg/mL; 및 두번째 실험에서 5, 2.5 및 3.75 μg/mL, 각각 5초 동안 20 μl/min에서). 칩은 모든 대응부로 완전히 변경된다(리간드의 평균 고정화된 양은 150RU임). 이어서, N-말단 his-태그 DSP107 (SEQ ID NO: 44), C-말단 his-태그 DSP107_V1 (SEQ ID NO: 12) 및 DSP107_V2 (SEQ ID NO: 14)은 모든 4개의 채널을 통과되었다. 이 공정은 다양한 농도의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 (500-0.1 2nM, 연속 1:2 희석)을 사용하여 50 μL/min (결합 시간: 120초; 해리 시간: CD47 단백질의 경우 300초, 4-1BB 단백질의 경우 600초)의 유속으로 반복적으로 반복되었다. 3M MgCl2 용액은 각 사이클이 끝날 때 (20 μl/분에서 45초) 주입되어, 포획된 분자를 제거하여 활성 표면을 재생성했다. 결합 파라미터는 BiaEvaluation 소프트웨어 v. 3.0.2 (GE Healthcare)에서 키네틱 1:1 결합 모델을 사용하여 평가되었다.
결과 - 동역학 분석은, N-말단 his-태그 DSP107 및 2개의 C-말단 his-태그 SIRPα-4-1BBL 변이체 DSP107_V1 및 DSP107_V2가 인간 및 사이노몰거스 CD47과 유사하고 높은 친화성을 가지며, 뮤린 CD47에 대해 더 낮은 친화성을 가짐을 입증했다 (하기 표 5a). DSP107_V2 (서열번호 13)의 동역학적 분석은 인간 및 사이노몰거스 CD47에 대해 유사하고 높은 친화성을 보였고, 뮤린 CD47에 대해 친화성이 없었다 (표 5b-c). 시험된 4개의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은, 모두 인간 및 사이노몰거스 4-1BB와 유사하고 높은 친화성을 나타내며 뮤린 4-1BB에 결합하지 않았다. 시험된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 중 어느 것도 인간 PDL1 음성 대조군에 결합되지 않았다.
[표 5a]
Figure pct00013
[표 5b]
Figure pct00014
[표 5c]
Figure pct00015
실시예 6
상기 SIRPα-4-1BBL 변이체에 의한 4-1BB의 활성화
생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질에 의한 4-1BB 수용체의 활성화 효과는 4-1BB 수용체를 과발현하는 HT1080 세포를 사용하여 시험되었다. 구체적으로, HT1080-4-1BB 세포주는 4-1BB를 과발현하고 4-1BBL의 결합시 IL8을 분비하는 것으로 공지되어 있다(Wyzgol et al., 2009, J Immunol. 183(3):1851-61). 따라서, 4-1BBL이 이들 세포 표면 상의 4-1BB 수용체에 결합하면, 신호전달 경로가 활성화되어 IL8의 분비를 초래하는 것이 예측된다. 이를 위해, 상이한 농도의 His-태그 SIRPα-4-1BBL의 존재 하에 세포를 배양하였고, 상기 배양 배지로의 IL8 분비를 ELISA에 의해 측정하였다.
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44); 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1), DSP107_V1 (서열번호 12), DSP107_V2 (서열번호 14) 및 DSP107_V3.1 (서열번호 17), 및 DSP107_V2 (서열번호 13).
HT1080-4-1BB 세포 (Wyzgol, et al, 2009, The Journal of Immunology), 재조합 인간 His-태그 CD47 protein (ACRO Biosystem, cat# CD7-H5227), 재조합 인간 His-태그 4-1BBL 단백질 (Cell Signaling, cat# 8460LF), IL8 ELISA 키트 (cat#D8000C, R&D), DMEM (cat# 01-055-1A, Biological industries), FBS (cat# 10270106, Rhenium), AIM V (serum free medium) (ThermoScientific), 항-CD47 Ab (Invitrogen, cat# 16-0479-85, clone B6H12).
방법 - 평평한 바닥, 96-웰 플레이트를 5 ㎍/mL 재조합 인간 His-태그 CD47 단백질로 코팅했다. 세척 단계 후, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 첨가하고 (0-5 ㎍/mL), 37 ℃에서 1시간 동안 배양했다. WT HT1080 세포 또는 HT1018-4-1BB 세포를 웰 (10,000 세포/웰)에 첨가하고 무 혈청 배지에서 37 ℃에서 24시간 동안 배양했다. 배양 후, 상층 액의 IL8 농도는 제조업체의 프로토콜에 따라 IL-8 ELISA 키트로 결정되었다. 플레이트는 540 nm에서의 기준으로 450 nm에서 플레이트 판독기 (Thermo Scientific, Multiscan FC)를 사용하여 분석했다. SIRPα-4-1BBL의 효과는 개별 가용성 성분, 인간 SIRPα, 인간 4-1BBL 또는 둘의 조합의 효과와도 비교되었다. 결합 특이성을 결정하기 위해, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 첨가하기 1시간 전에 항-CD47 차단 항체 경쟁자를 배양물에 첨가하여, SIRPα의 팔(arm)을 통한 결합을 차단했다.
공동 배양 분석: CHO-K1 WT 또는 CHO-K1-CD47 세포를 평평한 바닥 96-웰 플레이트 (10,000 세포/웰)에 접종하고, 37 ℃에서 밤새 배양했다. 다음날, 상층액을 버리고, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 (0-10 ㎍/mL)을 첨가하여 37 ℃에서 1시간 동안 배양한 후 세척 단계를 거친다. 그 후, HT1080 WT 또는 HT1080-4-1BB 세포를 첨가하고 (10,000개 세포/웰), 37 ℃에서 24시간 동안 배양했다. 배양 후, 상층액의 IL8 농도는 제조업체의 프로토콜에 따라 IL-8 ELISA 키트로 결정되었다. 플레이트는 540 nm에서 기준으로 450 nm에서 플레이트 판독기 (Thermo Scientific, Multiscan FC)를 사용하여 분석되었다.
결과 - 단일 배양 분석에서, DSP107-V2 (서열번호 13)는 플레이트 결합 CD47의 존재 하에 HT1080-4-1BB 세포로부터 IL-8 분비를 유도하고, CD47이 없을 경우 현저히 낮은 활성화 효과가 보인다 (도 25A, p <0.003; ~ 3 배 감소). 플레이트 결합 및 가용성 DSP107_V2의 활성은 항 CD47 항체에 의해 완전히 제거되었다. 가용성 DSP107_V2의 차단은 HT1080 세포에서 발현되는 내인성 CD47에 대한 낮은 결합의 폐지에 기인할 수 있다.
또한, DSP107_V2는 가용성 4-1BBL 또는 가용성 SIRPα와 4-1BBL의 조합보다 더 효과적으로(~ 3 배 증가) 4-1BB 신호를 활성화 했다 (도 25b). 예상대로, 가용성 SIRPα는 4-1BB 수용체와의 상호 작용이 없기 때문에 효과가 없었다.
또한, DSP107_V2로 처리 한 후 HT1080-4-1BB 세포로부터의 IL-8 분비는 CHO-K1 WT 세포와 비교하여 CHO-K1-CD47 세포의 존재하에 현저히 향상되었다 (p < 0.0032) (~ 3.5 배). IL-8 분비는 항-CD47 항체에 의해 완전히 차단되었으며, 추가로 4-1BB 수용체를 통해 4-1BBL 팔(arm)에 의한 공동 자극 신호를 전송하기 위해 교차 제시가 필요함을 시사한다 (도 26).
실시예 7
상기 SIRPα-4-1BBL 변이체에 의한 T 세포의 활성화
T 세포의 활성화는 2개의 신호를 필요로 한다: 항원 제시 세포(APC) 상의 중 조직적합성 복합체(MHC)/펩타이드 복합체와 상기 T-세포 수용체(TCR)의 라이게이션 및 항원 제시 세포(APC) 상에 상응하는 리간드를 갖는 T 세포에 대한 공동자극 수용체의 가교. 4-1BB는 4-1BBL에 대한 라이게이션시 CD8+ 및 CD4+ T 세포 둘 다의 확장, 생존, 분화 및 사이토카인 발현을 촉진하는 T 세포 공동-자극 수용체이다.
T 세포의 활성화를 측정하기 위한 다수의 방법들이 당해 분야에 공지되어 있고, 하기가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다:
- T 세포의 표면에서의 활성화 마커의 발현(예를 들면: CD25, CD69, CD62L, CD137, CD107a, SIRPα 등). 활성화 마커의 발현은 특이적 항체와 유세포측정 분석(FACS)을 이용하여 상기 세포를 염색함으로써 시험한다.
- 염증성 사이토카인(예를 들면: IL2, IL6, IL8, INF 감마 등)의 분비. 염증성 사이토카인의 분비는 ELISA에 의해 시험된다.
- CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester: 카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르)로 T 세포를 사전-염색하고 FACS에 의해 측정되는 CFSE 희석에 의한 세포의 편차를 측정하여 측정되는, 증식.
- 예를 들면, 칼신-AM 시약을 이용하여 암 세포를 사전-라벨링하고 발광 플레이트 판독기를 이용하여 상기 배양 배지로의 칼신의 방출을 측정함으로써 측정되는, 표적 세포, 예를 들면 암 세포의 사멸.
이를 위해, 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell)의 증식에 대한 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 영향을 평가한다.
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44); 및 C-말단 his-태그 DSP107_V1 (서열번호 12) 및 DSP107_V2 (서열번호 14).
피콜 파크(Ficoll-Paque) (cat# 17-1440-03, GE Healthcare), RPMI 1640 (cat# 01-100-1A, Biological industries), FBS (cat# 12657-029, Gibco), L-글루타민 (cat# 25030-024, Gibco), Pen Strep (cat# 15140-122, Gibco), 잎 정제된 항-인간 CD3 (Leaf purified Anti-human CD3) (cat# BLG-317315, BioLegend), 재조합 인간 IL-2 (cat# 589106, Biolegend), 항-4-1BB 항체 (cat# BLG-106109), 항-IgG 항체 (cat# BLG-402012).
방법 - 인간 PBMC는 피콜-파크 방법(Grienvic et al. 2016 Biopreserv Biobank. 14 (5) : 410-415)을 사용하여 건강한 공여자의 말초 혈액에서 단리했다. 이어서, 항-CD3(30ng/ml) 또는 IL-2(1000U/ml) 또는 항-CD3 + IL-2의 최적 이하의 농도의 존재시에 상이한 농도의 다양한 His-태그 SIRPα-4-1BBL 단백질을 부가하여 7일 동안 세포를 배양한다. PBMC의 증식은 제조업자의 프로토콜에 따라 IncuCyte® S3 생-세포 분석 시스템(IncuCyte)에 의해 측정된다. 세포는 유세포측정법에 의해 4-1BB 표면 발현에 대해 시험된다.
결과 - N-말단 his-태그 DSP107, C-말단 his-태그 DSP107_V1 및 C-말단 his-태그 DSP107_V2와 PBMC의 배양은 세포 컨플루언시를 증가시켰으며, 이는 IL-2 추가가 있거나 없이 항-CD3 항체로 자극된 세포의 더 높은 증식률을 나타낸다 (도 11). 시험된 모든 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 0.01 ㎍/ml 농도에서 최적의 유도가 얻어졌다. 따라서, N-말단 his-태그 C-말단 his-태그 DSP107, C-말단 his-태그 DSP107_V1 및 C-말단 his-태그 DSP107_V2의 결합은 4-1BBL/4-1BB-매개 공동 자극 및 T 세포 증식의 유도를 가능하게 했다. 이러한 결과는 IL-2가 있거나 없이 항 CD3로 자극한 후 유도된 4-1BB 발현과 상관 관계가 있다 (도 12).
다음 설정에서, 인간 PBMC 및 T 세포 증식에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 효과는 다음과 같이 평가했다:
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 DSP107_V2 (서열번호 13).
피콜-파크(Ficoll-Paque) (cat# 17-1440-03, GE Healthcare), RPMI 1640 (cat# 01-100-1A, Biological industries), FBS (cat# 12657-029, Gibco), L-글루타민 (cat# 25030-024, Gibco), Pen Strep (cat# 15140-122, Gibco), 재조합 인간 IL-2 (cat# 589106, Biolegend), 항-CD3/CD28 활성화 Dynabeads, EasySep Direct 인간 T-세포 단리 키트 (STEMCELL Technologies), 세포 증식 염료 (CPD, e-Biosciences, cat# 65-0842-85), His 태그-CD47 재조합 단백질 (ACRO Biosystem, cat# CD7-H5227).
방법 - 인간 PBMC는 피콜-파크 방법(Grienvic et al. 2016 Biopreserv Biobank. 14 (5) : 410-415)을 사용하여 건강한 공여자의 말초 혈액에서 단리했다. 이어서, Incucyte 분석을 위해, 96-웰, 평평한 바닥 플레이트를 폴리-L-오르니틴 (0.01 %, 50 μL, 37 ℃에서 1시간 동안 배양)으로 코팅하여, PBMC 세포 부착을 허용했다. PBMC는 rhIL-2 (1000 U/mL) 및 DSP107_V2 (0.33 μg/mL)의 존재 하에 접종되었다(50,000 /웰). 플레이트를 IncuCyte 기계에서 37 ℃에서 5일 동안 배양했다. 3시간마다 위상 스크리닝 이미지를 촬영하고, IncuCyte Live Cell Analysis System (Sartorius)을 사용하여 세포 밀도를 분석했다. 유세포 분석 분석을 위해, T-세포는 음성 선택 자기 비드 (EasySep Direct Human T-cell Isolation kit, STEMCELL Technologies)에 의해 PBMC에서 분리되었고, 제조업체의 지침에 따라 세포 증식 염료 (CPD)로 염색했다. 염색된 T-세포를 96 웰 플레이트에서 3일 또는 5일 동안, 또는 인간 항-CD3/CD28 Dynabeads T-세포 활성화제 (T-세포당 1:10 비드) 및 DSP107_V2 (0.3-3 μg/mL)의 차선 농도의 존재 하에, His 태그-CD47 재조합 단백질 (2 μg/mL, 37 ℃에서 3 시간 동안)으로 플레이트를 사전 코팅한 후 배양했다. 이어서, CD3+ T 세포를 CPD 수준에 대해 유세포 분석법으로 분석했다.
결과 - DSP107_V2 (서열번호 13)는 Incucyte 소프트웨어에 의해 캡처된 위상 이미지 분석에 의해 결정된 바와 같이 IL-2에 의해 유도된 새로 단리된 인간 PBMC의 증식을 증가시켰다. 특히, IL-2만으로 처리된 PBMC에 비해 IL-2 (1000 U/mL) 및 1.6 nM (0.33 μg/mL) DSP107_V2와 함께 PBMC를 5일 동안 배양한 후 세포 밀도가 극적으로 증가했다. 대표적인 이미지가 도 28에 도시된다. 유사하게, DSP107_V2 (서열번호 13)는 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 플레이트 결합 CD47 존재 하에서 최적 이하 수준의 항-CD3/CD28 Dynabead에 의해 유도되는 CPD- 염색 T-세포의 증식을 16-35 % (p < 0.0025)까지 현저히 향상시켰다 (도 29).
T 세포 활성화 마커의 발현에 대한 생산된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 효과를 다음과 같이 평가했다.
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 DSP107_V2 (서열번호 13).
피콜-파크(Ficoll-Paque) (cat# 17-1440-03, GE Healthcare), RPMI 1640 (cat# 01-100-1A, Biological industries), FBS (cat# 12657-029, Gibco), L-Glutamine (cat# 25030-024, Gibco), Pen Strep (cat# 15140-122, Gibco), 잎 정제된 항-인간 CD3 (cat# BLG-317315, BioLegend), 항-4-1BB 항체 (cat# BLG-106109), PE 항-CD25 항체 (Biolegend, cat# 302606), FITC 항-인간 CD3 Ab (Biolegend, cat# 317310).
방법 - 인간 PBMC는 제조업체 지침에 따라 표준 피콜 구배 방법을 사용하여 건강한 공여자의 말초 혈액에서 단리했다. 96-웰 플레이트를 37 ℃에서 3시간 동안 배양하여 항-인간 CD3 항체 (0.5 ㎍/mL)로 사전 코팅했다. 3명의 공여자로부터의 PBMC를 상이한 농도의 DSP107_V2 (서열번호 13, 0-5 ㎍/mL)로 항-CD3 사전 코팅된 플레이트 (100,000 세포/웰)에서 37 ℃, 5% CO2, 48시간 동안 배양했다. 배양 후, 활성화 마커 CD25 및 4-1BB의 발현에 대해 유동 세포 측정법에 의해 게이트된 CD3 + T 세포를 분석했다.
결과 - CD25 및 4-1BB 활성화 마커의 발현은 항-CD3에 의해 T 세포에서 유도되었고, 3명의 시험된 공여자 모두에서 용량 의존적 방식으로 DSP107_V2 (서열번호 13)에 의해 현저히 향상되었다 (도 27, 4-1BB 발현의 경우 0.0012 < p < 0.041; CD25 발현의 경우 0.0039 < p < 0.047)
표적 암세포의 T- 세포 매개 사멸에 대한 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 효과를 다음과 같이 평가했다:
재료 및 방법 - Incucyte 분석을 위해, 4개의 ATCC 암 세포주, SNU423, SNU387 및 SNU423 간세포 암종 (HCC) 및 Ovcar8 난소암 세포주를 비-교란 핵 제한 적색 형광 라벨을 갖는 형질 도입 세포에 적합한 IncuCyte NucLight Red 렌티 바이러스 시약 (EF1α, Puro; 3TU / Cell)로 형질 도입했다. 안정적인 세포주를 얻기 위해 퓨로마이신 선택 (2 ㎍ / mL)을 적용했다. 암 세포주 표면의 Nuc-red 형광 및 CD47 발현은 분석 전에 유세포 분석에 의해 검증되었다 (데이터는 표시되지 않음). 음성 선택 자기 비드를 사용하여 2명의 건강한 공여자의 말초 혈액 샘플에서 T 세포를 단리했다. 단리된 T-세포를 종양 대 이펙터 비율 (E:T)을 5:1로 다른 암 세포주와 공동 배양하고, 최적 이하 농도의 항-CD3/CD28 dynabeads (1:10 비드) 및 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 DSP107_V2 (서열번호 13)으로 활성화했다(0.11, 0.33 및 1 μg/mL). IncuCyte 녹색 형광 Caspase 3/7 기질 시약을 공동 배양에 첨가하여, 세포 사멸 세포를 표시했다. 세포는 Incucyte 기계에서 5일 동안 배양했다. 위상, 녹색 및 적색 형광 이미지는 1.5시간마다 기록되었고, 중첩 된 녹색 및 적색 형광 ("노란색") 신호는 세포 사멸성 암 세포 신호로 정량화되었다.
세포 사멸성 CFSE-표지된 종양 세포의 유세포 분석을 위해, PBMC를 건강한 공여자의 말초 혈액에서 분리하고, 11일 동안 항-CD3 및 IL-2를 사용하여 확장했다. 중피종 암 세포주 MSTO 및 H2052 (ATCC)는 프로토콜에 따라 CFSE로 염색했다. 확장된 PBMC 및 염색된 암 세포를 상기 실시 예 2에 기재된 바와 같이 생성된 0.1 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL의 DSP107_V2 (서열번호 13)의 존재 하에 여러 E:T 비율로 공동 배양했다. 라이브 CFSE 표지된 암 세포는 트립신으로 분리한 후 유세포 분석에 의해 분석했다.
결과 - DSP107_V2는 T-세포에 의해 매개되는 간세포, 난소 및 중피종 암 세포주의 사멸을 향상시켰다 (도 30 a-d 및 31 a-b).
구체적으로, Incucyte 분석은, T 세포의 존재 하에서 간세포 및 난소 암 세포주의 공동 배양이 최적 농도 이하의 항-CD3/CD28 Dynabead를 활성화 암 세포를 사멸시켰고; DSP107_V2의 첨가가 SNU387, SNU423 및 Ovcar8 세포의 T-세포 매개 사멸을 각각 49%, 27% 및 23% 향상시킴을 입증했다 (도 30a-c). DSP107_V2 단독으로 이들 암 세포주를 배양한 후에는 사멸이 관찰되지 않았으며 (도 30a-c), T-세포의 부재하에 암 세포주에 대한 직접적인 세포 독성 효과를 지지하지 않았다.
유세포 분석 분석은 CFSE 표지된 중피종 암 세포주를 다양한 E:T 비율에서 T-세포와 공동 배양한 결과 DSP107_V2의 존재 하에 향상된 암 세포 사멸 (E:T 비율 1:1-1:5에서 DSP107_V2의 부재하에 사멸이 없는 것과 비교하여, DSP107_V2에 의해 52% 이하의 세포 사멸이 유도됨, 도 31a-b)을 보였다. 간세포 및 난소 암 세포주와 유사하게, CFSE-표지된 중피종 암 세포주의 사멸은 T-세포의 부재 하에 DSP107_V2와 함께 배양한 후 관찰되지 않았다.
실시예 8
CD47 결합 차단에 대한 SIRPα-4-1BBL 변이체의 효과
SIRPα-4-1BBL의 SIRPα 부분은 항원 제시 세포 (APC)에서 발현되는 내인성 SIRPα와 종양 세포에서 발현되는 CD47의 상호 작용을 차단하여 "나를 먹지 말라는 신호"를 차단하도록 설계되었다.
이를 위해, 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 이러한 상호 작용에 대한 차단제로서의 효과를 평가했다.
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 44); 및 C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1), DSP107_V1 (서열번호 12), DSP107_V2 (서열번호 14), 및 DSP107_V3.1 (서열번호 17), 및 DSP107_V2 (서열번호 13).
재조합 인간 CD47 (Acrobiosystems, CD7-H5227), 항 hCD47 중화능(neutralizing_ ab (Novus, AF4670), 비오티닐화 SIRPα (Acrobiosystems, CDA-H82F2).
방법 - ELISA 플레이트를 재조합 인간 CD47로 밤새 코팅했다. 플레이트를 세척하고 상이한 농도의 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 양성 대조군 항 CD47 항체를 1시간 동안 배양했다. 이어서, 비오티닐화된 SIRPα를 추가하고; 1시간 배양 후, 플레이트를 세척하고 표준 ELISA 프로토콜에 따라 스트렙트아비딘-HRP 및 TMB 기질로 블롯팅했다 (도 13a). 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기 (Thermo Scientific, Multiscan FC)를 사용하여 620 nm에서 기준으로 분석했다.
결과 - 시험된 모든 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 양성 대조군 차단 항체와 유사하게 SIRPα와 CD47의 상호 작용을 효율적으로 차단했다 (도 13b). EC50 값은 0.075-0.238 μg/ml의 범위 내였다 (도 13c).
실시예 9
대식세포 및 고분자 세포핵 세포에 대한 SIRPα-4-1BBL 변이체의 효과
언급한 바와 같이, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 SIRPα 부분은, 종양 세포의 CD47과 내인성 SIRPα의 상호 작용을 경쟁하고 차단함으로써, 대식세포 및 과립구와 같은 APC에서 발현되는 내인성 SIRPα쪽으로, CD47 발현 종양 세포에 의해 유도된 "나를 먹지 말라는 신호"를 차단하도록 설계된다. "날 먹지 말라"는 신호의 이러한 차단은 종양 세포 식세포 작용을 유도한다.
이를 위해, 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질이 인간 대식세포 또는 다형 핵 세포 (PMN)에 의한 종양 세포의 식세포 작용에 미치는 영향을 유세포 분석 기반 분석 또는 형광 현미경을 사용하여 평가했다.
재료 - 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1); 및 C-말단 his-태그 DSP107_V1 (서열번호 12), DSP107_V2 (서열번호 14), 및 DSP107_V3.1 (서열번호 17); 및 DSP107_V2 (서열번호 13).
인간 암 세포주 Ramos (Lymphoma), DLD-1 (결장암), Daudi, SUDHL5, SUDHL4, U2932, SUDHL2, SUDHL6, SUDHL10, DUDHL4 및 OCI-LY3 (림프종).
방법 - 다형 핵 세포 (PMN) 및 PBMC는 밀도 구배 원심 분리에 이어서 적혈구의 염화암모늄 용해에 의해 건강한 지원자의 혈액 샘플에서 분리했다.
PMN 분석을 위해, Ramos 및 DLD-1 암 세포를 Vybrant DiD로 표지하고. 1:1의 효과기 대 표적의 비율로 단리된 PMN과 혼합했다. 혼합된 배양물을 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질로 단독으로 또는 치료 항체 리툭시맙 (RTX; 항-CD20) 또는 세툭시맙 (CTX; 항-EGFR)과 조합하여 2시간 동안; 또는 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질만으로 18시간 동안 처리했다. 이어서, PMN에 의한 암세포의 식세포 작용을 유세포 분석으로 분석했다.
대식세포 분석을 위해, 단핵구는 CD14 자기 마이크로비즈 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 MACS 분류에 의해 단리된 PBMC로부터 추가로 농축했다. 단핵구는 7일 동안 GM-CSF (50 ng/ml) 및 M-CSF (50 ng/ml)가 보충된 RPMI 1640 배양 배지 + 10% FCS에서 대식세포 (M0)로 분화되었다. 1형 대식세포 (M1)를 생성하기 위해, M0 세포를 LPS 및 IFN-γ로 추가 24시간 동안 프라이밍했다. 대안적으로, 2형 대식세포 (M2)를 생성하기 위해, M0 세포를 100 ng/mL IL-4와 함께 24시간 동안 배양했다. SUDHL5, SUDHL4, OCI-LY3, SUDHL2, SUDHL6, SUDHL10, SC-1, Ramos 및 Daudi 암 세포를 V450 세포질 염료로 표지하고, 단리된 및 시험관 내 분화된 I형 대식세포(M1)과 효과기 대 표적의 비율이 1:1 또는 1:5로 혼합했다. 혼합된 배양물을 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질을 단독으로 또는 RTX, 트라스투주맙 또는 CTX와 함께 2-2.5시간 동안 처리했다. 배양 후, 완전히 뒤덮이지 않은 종양 세포를 세척하고, 대식세포를 항-CD11b AF 594 Ab로 염색했다. 대식세포에 의한 암세포의 식균 작용을 형광 현미경으로 분석했다. 다른 실험에서, 식균 작용은 Incucyte에 의해 다음과 같이 평가했다: 다양한 림프종 세포주의 종양 세포를 CFSE로 사전 염색하고, 대식세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 IncuCyte Cytolight 적색 세포질 염료로 사전 염색했다. 염색된 종양 세포와 대식세포를 1:5 대식세포 대 종양 세포 비율로 공동 배양하고, 위상 적색 및 녹색 이미지를 Incucyte에 의해 촬영했다. 식세포 작용은 전체 대식세포 (적색 신호) 중 종양 세포 침윤 ("황색" 신호)에 양성인 대식세포의 비율로 정량화했다.
결과 - 시험된 모든 His-태그 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 치료 항체인 리툭시맙 (RTX) 또는 세툭시맙 (CTX)과 조합하여 2시간 동안 배양한 후, Ramos 및 DLD1 암 세포의 PMN 매개 식세포 작용을 향상시켰다 (도 14a). Ramos 및 DLD1 암 세포의 PMN 매개 식세포 작용의 추가 향상은 18시간의 배양 후 입증되었다 (도 14b).
또한, 시험된 모든 His-태그 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 2 시간의 배양 후 SUDHL4, SUDHL5 및 Oci-Ly3 림프종 세포주의 대식세포 매개 식세포 작용을 증가시켰으며, 이는 리툭시맙 (RTX)과 결합했을 때 더욱 향상되었다 (도 15). 또한, C-말단 his-태그 DSP107_V2 (서열번호 14)는 용량 의존 방식으로 2시간 배양 후 SUDHL4의 대식세포 매기된 식세포 작용을 증가켰다 (도 16).
또한, M1 대식세포에 의한 종양 세포의 리툭시맙 유도 식세포 작용은 2.5 ㎍/ml DSP107_V2 (서열번호 13)와의 배양 후에 향상되었다 (도 32a). 또한, DSP107_V2는 각 대식세포에 의해 잠긴 Ramos 세포의 수를 증가시켰다 (도 32b).
그 후, Incucyte 이미징 시스템을 사용하여 광범위한 림프종 세포주 패널을 시험했다. 암 세포주의 M1 대식세포 매개된 식세포 작용은 단일 제제로서 암세포 및 2.1 ㎍/ml DSP107_V2와 함께 M1 대식세포의 배양 후에 관찰했다 (도 32c). 또한, 단일 제제로서 리툭시맙에 의해 유도된 효과와 비교하여, DSP107_V2가 리툭시 맙과 조합하여 사용될 때 부가적인 식세포 효과가 관측되었다 (도 32d).
흥미롭게도, DSP107_V2 (서열번호 13)는 또한 단일 제제로서 및 리툭시맙과 조합하여, M0 및 M2 대식세포에 의해 유도된 식세포 작용을 향상시켰지만, M1 대식세포에 대해 관측된 것보다 덜 확장되었다 (데이터는 표시되지 않음). DLD-1 결장 암종 세포를 사용한 유사한 실험에서, 훨씬 더 많은 DLD-1 세포가 배지 대조군에 비해 DSP107_V2 단일 제제 처리 (2.1 ㎍ / mL)로 대식세포에 의해 식세포되었다 (도 32e). 또한, DSP107_V2 및 트라스투주맙 (항-Her2 항체)의 병용 요법은 단일 제제로서 트라스투주맙 치료에 비해 종양 세포의 식세포 작용의 증가를 명확하게 입증했다 (도 32e).
실시예 10
과립구 세포에 대한 SIRPα-4-1BBL 변이체의 효과
재료 및 방법 - 표준 절차를 사용하여 건강한 공여자의 말초 혈액에서 백혈구를 단리했다. 종양 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 CFSE (Thermo Fisher) 또는 Vybrant DiD Cell-Labeling Solution (Thermo Fisher)으로 사전 염색했다. 단리된 백혈구 및 염색된 종양 세포를 1:1 백혈구 대 종양 세포 비율로 혼합하고, 치료용 항체 리툭시맙 (1㎍ / mL)이 있거나 없이 DSP107_V2 (서열번호 13)의 존재하에 배양했다. 과립구에 의한 종양 세포의 흡수는 Vybrant DiD-양성 과립구 집단을 정량화하여 유동 세포 측정법에 의해 후속적으로 평가했다. 암종 세포주의 식세포 작용을 평가하기 위해, DLD-1 결장 암 세포를 CFSE로 염색하고, DSP107_V2 (서열번호 : 13), 또는 트라스투주맙 (항 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) Ab; 0.1 ㎍/mL), 또는 DSP107_V2와 트라스투 주맙의 조합의 존재 하에, 대식세포:종양 세포 비율을 1:5로 2시간 동안 공동 배양했다. 배양 후, 트립신/EDTA 용액을 사용하여 세포를 플레이트에서 분리하고, 대식세포를 CD11b-APC Ab를 사용하여 염색하고, 샘플을 FACS로 분석했다. 과립구에 의한 종양 세포의 흡수에 대한 DSP107_V2 (서열번호 13)의 효과는 또한 His-태그 SIRPα 또는 가용성 4-1BBL 또는 이둘의 조합과 비교했다.
결과 - DSP107_V2 및 가용성 His-태그 SIRPα와 가용성 4-1BBL의 조합이 과립구 매개 종양 세포 식세포 작용에 미치는 영향을 다중 림프종 세포주에서 추가로 평가했다. DSP107_V2 또는 그 가용성 성분의 조합으로 배양한 후 식세포 작용을 단일 제제로 시험하고, 배양 배지와 비교했다. 종양 세포의 식세포 작용은 또한 단일 제제로서 리툭시맙과 DSP107_V2 또는 용해성 성분의 조합과 함께 시험했다. 2.1 μg/ml DSP107_V2로 2.5시간 배양한 후, 림프종 세포의 과립구 매개 식세포 작용은 DSP107_V2에 의해 자극되었지만, 가용성 SIRPα와 가용성 4-1BBL의 조합에 의해 자극되지 않았다 (도 33B). 리툭시맙은 또한 과립구 매개 종양 세포의 식세포 작용의 강력한 단일 작용제 자극을 입증했다. 이 효과는 DSP107_V2와 조합하여 향상되었지만, 가용성 SIRPα 및 가용성 4-1BBL의 혼합물과 조합하여 향상되지 않았다 (도 33b-f).
실시예 11
SIRPα-4-1BBL 변이체의 생체내 항-종양 효과
암 치료에서 생성된 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 효능을 시험하기 위해 4개의 상이한 생체내 마우스 모델들이 사용된다:
1. 인간 종양 세포를 접종한 누드-SCID 마우스. 이러한 모델에서, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 마우스 및 인간 CD47 (종양 세포에서 발현됨)과 상호 작용하고, 마우스의 대식세포 활성에 대한 융합 단백질의 효과를 시험했다.
2. 인간 줄기 세포로 및 인간 종양 세포로 접종된 NSG 마우스. 이러한 모델에서, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 마우스 및 인간 CD47(종양 및 면역 세포에서 발현됨)과 그리고 인간 T 세포 상의 4-1BB와 상호작용한다. 마우스 및 인간 대식세포, 및 인간 T 세포에 대한 융합 단백질의 효과를 시험했다.
3. C57BL/6 - MC38 마우스 결장 암종 또는 다른 암 세포주로 또는 인간 CD47을 과발현하는 암 세포주로 접종된 인간-4-1BB 녹-인(knock-in) 마우스. 이러한 모델에서, 상기 마우스 4-1BB 세포외 도메인은 인간 4-1BB의 도메인에 의해 대체된다. 따라서, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 마우스 T 세포에서 발현된 인간 4-1BB와 상호작용할 수 있다. 융합 단백질은 종양 세포 상의 마우스 및 인간 CD47과 상호작용한다. 마우스 대식세포, 및 마우스 T 세포에 대한 융합 단백질의 효과를 시험했다.
4. 마우스 CD47을 발현하는 동계(Syngeneic) 마우스 종양 모델. 이러한 모델에서, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 종양 세포 상의 마우스 CD47과 상호작용한다. 마우스 대식세포에 대한 융합 단백질의 효과를 시험했다.
방법 - 4개 모델 모두에서, 마우스에게 정맥내로(IV), 복강내로(IP), 피하로(SC) 또는 정위적으로(orthotopically) 종양 세포를 접종한다. 일단 종양이 촉진되면(약 80mm3), 마우스는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 상이한 용량 및 상이한 요법으로 IV, IP, SC 또는 정위적으로로 처리된다; 예를 들면, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 생성된 N-말단 his-태그 (서열번호 44), C-말단 his-태그 DSP107 (서열번호 1), C-말단 his-태그 DSP107_V1 (서열번호 12), C-말단 his-태그 DSP107_V2 (서열번호 14) 및 C-말단 his-태그 DSP107_V3.1 (서열번호 17).
체중과 임상학적 징후에 대해 마우스를 추적한다. 종양은 캘리퍼(caliper)로 일주일에 수회 측정하고; 종양 체적은 다음 방정식에 따라 계산된다: V = 길이 X 너비2/2. 마우스 체중은 일상적으로 측정된다. 종양 성장 및 생존은 전체 실험을 통해 모니터링된다.
상기 종양에서 면역 세포의 침윤은 특이적 항체 염색 및 유세포측정 분석을 사용하여 종양 절제 또는 림프절 배출, 소화 및 면역 표현형 검사에 의해 시험한다. 추가로 또는 대안으로, 특이적 항체를 사용한 면역조직화학 염색을 위해 종양 절제, 파라핀 포매 및 절편화(sectioning)에 의해 면역 세포의 침윤 또는 종양의 괴사 등급을 결정한다.
희생시, 마우스 장기를 수거하고 H&E 및 IHC 염색을 위해 파라핀 블록에 포매한다.
하기 시험들: PK 분석, 혈장내 사이토카인 측정, 순환중인 혈액 세포 하위-집단의 FACS 프로파일링, 혈액학 시험, 혈청 화학 시험, 항-약물-항체(ADA) 분석 및 중화 항체 분석(NAB)을 위해, 일반적 절차에 따라 상이한 시점에 마우스로부터 혈액 샘플을 채취한다.
실시예 12
인간 4-1BB 녹인 마우스 모델(HUMAN 4-1BB KNOCK IN MOUSE MODEL)을 사용하는 SIRPα-4-1BBL 변이체의 생체 내 항 종양 효과
마우스에서 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질의 효과를 시험하기 위해, 인간 4-1BB (h4-1BB) 녹인 마우스 (C57BL/6 배경)를 사용했다. 인간 CD47 발현 MC38 (hCD47 MC38) 세포를 종양 모델로 선택했다. 참고로, C57BL/6 마우스의 SIRPα는 인간 CD47과 상호 작용하지 않는 것으로 나타났고 [[Yamauchi, T., et al., (2013) Blood, 121(8): p. 1316-25], 따라서 천연 식세포에 의한 hCD47 MC38 세포의 식세포 작용은 이 모델에서 발생할 수 없다. 또한, DSP107의 뮤린 WT MC38 결장 암 세포에 대한 결합을 유세포 분석을 사용하여 인간 DLD1 결장 암 세포의 결합과 비교했다 (도 34). 뮤린 MC38에 대한 DSP107의 낮은 결합에 기초하여, hCD47 MC38 세포를 생체 내 효능 연구를 위해 선택했다. 결과적으로, SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질의 SIRPα 팔(arm)은 인간 CD47을 발현하는 종양 세포를 표적할 것으로 예상되었지만, 이 모델에서 종양 세포의 식세포 작용을 촉진하는데 아무런 영향을 미치지 않을 것으로 예상되었다.
재료 및 방법 - 8-9 주령의 암컷 h4-1BB 녹인 C57BL/6 마우스 (Crown Bioscience)에 1 x 106 hCD47 MC38 세포 (Crown Bioscience)를 피하 접종했다. 종양이 60-100 mm3 크기에 도달하면 치료를 시작했다. 무작위 배정 후, 그룹당 6마리의 동물이 0일, 1일, 2일, 3일 및 4일에 매일 1회 투여로 DSP107_V2 (서열번호 13; 250 ㎍/주사; 12.5 mg/kg), 또는 3주 동안 격주로 IP 투여로 항-뮤린 PD-L1 Ab (클론 10F.9G2, Bioxcell; 60 ㎍/주사), 또는 DSP107_V2 (서열번호 13)와 항-뮤린 PD-L1 Ab의 조합으로 복강 내(IP) 주사를 받았다. 대조군 마우스에 200 μl의 인산염 완충 식염수 (PBS)를 주사했다. DSP107_V2는 마우스-항-인간 항체의 잠재적 발달을 피하기 위해 실험 첫 주 동안에만 투여했다. 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 일주일에 세 번 측정하고, 개별 부피는 공식 V = ([폭] 2 x 길이)/2로 계산했다. 종양이 3000 mm3의 부피에 도달하면, 마우스를 개별적으로 희생시켰다.
결과 - 단일 제제로서 항 PD-L1 또는 DSP107_V2 (서열번호 13)를 사용한 치료는 종양 성장을 억제했다 (각각 50.4% 및 29.5%, 도 35a). 종양 성장 억제 비율 (TGI)은 PD-L1 또는 DSP107_V2가 결합되었을 때 더욱 향상되었다 (비히클 처치된 대조군과 비교하여 83%, p = 0.02). 또한, Mental cox 분석에 근거하여, DSP107_V2 및 항 PD-L1을 병용한 치료는 비히클 처치된 대조군 마우스에 비해 통계적으로 유의미한 생존 향상을 가져 왔다 (p = 0.01; 35b).
실시예 13
NSG 마우스 모델을 사용하는 SIRPα-4-1BBL 변이체의 생체 내 항-DLBCL 효과
인간 면역계의 맥락에서 인간 DLBCL 종양의 생체 내 치료에서 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질의 효과는 SUDHL6 인간 DLBCL 세포 및 인간 PBMC로 접종된 NSG 마우스를 사용하여 평가했다. 이들 마우스는 단일 제제로서 SIRPα-4-1BBL 변이체 융합 단백질로 추가 처치했다. 종양 성장을 위해 마우스를 추적했다.
재료 및 방법 - 14 주령, 암컷, NSG 마우스에 0일에 1 x 106 SUDHL6 세포를 S.C.에 접종했다. 7일에 마우스를 무작위로, 다음 두 그룹으로 분류했다:
1. 5마리 마우스- PBMC
2. 6마리 마우스- PBMC + DSP107_V2 (서열번호 13)
PBMC는 제조업체의 지침에 따라 표준 피콜 구배 방법을 사용하여 건강한 공여자의 말초 혈액에서 단리했다. 7일에 마우스에 마우스당 단리된 PBMC 1 x 106 세포로 I.V. 접종했다. 동일한 공여자의 냉동 PBMC를 사용하여 13일에 마우스를 재 주입했다 (마우스 당 1 x 106 세포). DSP107_V2 그룹의 마우스는 7일째부터 시작해서 2주 동안 매일, 쉬는 날 I.P.로 250 ㎍/마우스 DSP107_V2 (서열번호 13)를 처치했다. 마우스의 임의의 임상 징후를 확인했다. 종양은 마이크로 캘리퍼로 측정했다. 종양 부피는 다음 방정식에 의해 계산했다: 길이 X 길이 X 너비/2. 22일에 마우스를 희생시키고, 종양을 제거하고 칭량했다.
결과 - PBMC 및 DSP107_V2를 사용한 치료는 PBMC만을 주사한 대조군에 비해 20일까지 종양 성장을 약 3.7배 억제했다 (도 36a). PBMC + DSP107_V2를 사용한 치료는 22일에 마우스 희생 후 결정된 바와 같이 종양 중량을 상당히 감소시켰다 (도 36b). 중요한 것은, 어떤 치료도 마우스 체중에 영향을 미치지 않았으며, 이는 마우스 건강에 큰 부작용이 없음을 시사한다 (데이터는 표시되지 않음).
[표 6]
Figure pct00016
본 발명이 이의 특정 실시형태들과 관련하여 설명되었지만, 다수의 대안, 변형 및 변경이 당업자에게 명백할 것임이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신 및 넓은 범위 내인 모든 이러한 대안, 변형 및 변경을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 본원에 포함되도록 명시된 바와 동일한 정도로 본 명세서에 이들의 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다. 또한, 본 출원의 임의의 참조의 인용 또는 확인은 이러한 참조가 본 발명에 대한 선행 기술로서 입수가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 섹션 제목이 사용되는 한, 이들은 반드시 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
또한, 본 출원의 임의의 우선권 문서(들)는 이의 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> KAHR Medical Ltd. 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segment <400> 24 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala 115 <210> 25 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 343 amino acids sequence of SIRPa with 4 point mutations <400> 25 Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg 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197 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 197 amino acid sequence of 4-1BBL segment <400> 27 Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly 1 5 10 15 Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln 20 25 30 Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly 35 40 45 Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr 50 55 60 Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys 65 70 75 80 Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val 85 90 95 Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro 100 105 110 Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu 115 120 125 Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly 130 135 140 Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His 145 150 155 160 Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr 165 170 175 Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro 180 185 190 Ser Pro Arg Ser Glu 195 <210> 28 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 185 amino acid sequence of 4-1BBL segment <400> 28 Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu 20 25 30 Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly 35 40 45 Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu 50 55 60 Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu 65 70 75 80 Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu 85 90 95 His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu 100 105 110 Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe 115 120 125 Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly 130 135 140 Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr 145 150 155 160 Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro 165 170 175 Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 185 <210> 29 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of full length SIRP <400> 29 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu 85 90 95 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val 130 135 140 Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala 145 150 155 160 Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser 165 170 175 Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser 180 185 190 Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser 195 200 205 Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser 210 215 220 Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu 225 230 235 240 Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu 245 250 255 Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr 260 265 270 Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu 275 280 285 Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu 290 295 300 Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val 305 310 315 320 Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp 325 330 335 Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His 340 345 350 Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn 355 360 365 Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val 370 375 380 Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg 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aacatggact tttccatcag catcagtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360 tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac acggagttta agtctggagc aggcactgag 420 ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca 480 cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag tcccacggct tctcacccag agacatcacc 540 ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta 600 ggagagagcg tgtcctacag catccacagc acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac 660 gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt 720 gggactgcca acttgtctga gaccatccga gttccaccca ccttggaggt tactcaacag 780 cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag 840 agactacagc tgacctggtt ggagaatgga aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc 900 gttacagaga acaaggatgg tacctacaac tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct 960 gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc caggtggagc atgacgggca gccagcggtc 1020 agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc 1080 gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac atctatattg tggtgggtgt ggtgtgcacc 1140 ttgctggtgg ccctactgat ggcggccctc tacctcgtcc gaatcagaca gaagaaagcc 1200 cagggctcca cttcttctac aaggttgcat gagcccgaga agaatgccag agaaataaca 1260 caggacacaa atgatatcac atatgcagac ctgaacctgc ccaaggggaa gaagcctgct 1320 ccccaggctg cggagcccaa caaccacacg gagtatgcca gcattcagac cagcccgcag 1380 cccgcgtcgg aggacaccct cacctatgct gacctggaca tggtccacct caaccggacc 1440 cccaagcagc cggcccccaa gcctgagccg tccttctcag agtacgccag cgtccaggtc 1500 ccgaggaagt ga 1512 <210> 31 <211> 1029 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 2 <400> 31 gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60 gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120 ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180 acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtaac 240 atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300 acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc 360 gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag 420 tcccacggct tctcacccag agacatcacc ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc 480 tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta ggagagagcg tgtcctacag catccacagc 540 acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc 600 cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt gggactgcca acttgtctga gaccatccga 660 gttccaccca ccttggaggt tactcaacag cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc 720 acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag agactacagc tgacctggtt ggagaatgga 780 aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc gttacagaga acaaggatgg tacctacaac 840 tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc 900 caggtggagc atgacgggca gccagcggtc agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc 960 cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac 1020 atctatatt 1029 <210> 32 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> THE DELETED PART OF SEQ ID NO: 2 FOR GENERATION OF THE 116 AA VARIANT <400> 32 Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala Thr Pro 1 5 10 15 Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser Pro Arg 20 25 30 Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser Asp Phe 35 40 45 Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser Ile His 50 55 60 Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser Gln Val 65 70 75 80 Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu Arg Gly 85 90 95 Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu Glu Val 100 105 110 Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr Cys Gln 115 120 125 Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu Asn Lys 145 150 155 160 Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val Ser Ala 165 170 175 His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp Gly Gln 180 185 190 Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His Pro Lys 195 200 205 Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn Glu Arg 210 215 220 Asn Ile Tyr 225 <210> 33 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 24 <400> 33 gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60 gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120 ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180 accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240 atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300 gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagct 348 <210> 34 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 26 <400> 34 gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60 gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120 ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180 accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240 atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300 gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagct 348 <210> 35 <211> 1029 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 25 <400> 35 gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60 gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120 ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180 accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240 atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300 gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360 cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420 gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480 ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540 tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600 gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660 agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720 gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780 ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840 aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900 tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960 gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020 aacatctac 1029 <210> 36 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> amino acid sequence of full length 4-1BBL <400> 36 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 37 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence of full length 4-1BBL <400> 37 atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60 gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120 ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180 tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240 cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300 ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360 acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420 tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480 gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540 ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600 ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660 agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720 acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765 <210> 38 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 3 <400> 38 gcctgcccct gggccgtgtc cggggctcgc gcctcgcccg gctccgcggc cagcccgaga 60 ctccgcgagg gtcccgagct ttcgcccgac gatcccgccg gcctcttgga cctgcggcag 120 ggcatgtttg cgcagctggt ggcccaaaat gttctgctga tcgatgggcc cctgagctgg 180 tacagtgacc caggcctggc aggcgtgtcc ctgacggggg gcctgagcta caaagaggac 240 acgaaggagc tggtggtggc caaggctgga gtctactatg tcttctttca actagagctg 300 cggcgcgtgg tggccggcga gggctcaggc tccgtttcac ttgcgctgca cctgcagcca 360 ctgcgctctg ctgctggggc cgccgccctg gctttgaccg tggacctgcc acccgcctcc 420 tccgaggctc ggaactcggc cttcggtttc cagggccgct tgctgcacct gagtgccggc 480 cagcgcctgg gcgtccatct tcacactgag gccagggcac gccatgcctg gcagcttacc 540 cagggcgcca cagtcttggg actcttccgg gtgacccccg aaatcccagc cggactccct 600 tcaccgaggt cggaa 615 <210> 39 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 22 <400> 39 atctacggcg cctgtccttg ggctgtgtct ggcgctagag catctcctgg ctctgctgcc 60 tctcctagac tgagagaggg acctgagctg tctcctgatg atcctgctgg cctgctggat 120 ctgagacagg gcatgtttgc tcagctggtg gcccagaacg tgctgctgat tgatggccct 180 ctgtcctggt actctgatcc tggattggct ggcgtgtccc tgactggcgg cctgtcttac 240 aaagaggaca ccaaagaact ggtggtggcc aaggccggcg tgtactacgt gttctttcag 300 ctggaactgc ggagagtggt ggccggcgaa ggatctggat ctgtgtctct ggcactgcat 360 ctgcagcccc tgagatctgc tgcaggcgct gctgctctgg ctctgacagt tgatctgcct 420 cctgcctcct ccgaggccag aaactccgcc tttggcttcc aaggcagact gctgcatctg 480 tctgccggcc agagactggg agtccatctg catacagagg ctagagccag gcacgcctgg 540 cagttgacac aaggtgctac agtgctgggc ctgttcagag tgaccccaga gattccagcc 600 ggcctgcctt ctccaagatc cgag 624 <210> 40 <211> 573 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 23 <400> 40 tctgctgcct ctcctagact gagagaggga cctgagctgt ctcctgatga tcctgctggc 60 ctgctggatc tgagacaggg catgtttgct cagctggtgg cccagaacgt gctgctgatt 120 gatggccctc tgtcctggta ctctgatcct ggattggctg gcgtgtccct gactggcggc 180 ctgtcttaca aagaggacac caaagaactg gtggtggcca aggccggcgt gtactacgtg 240 ttctttcagc tggaactgcg gagagtggtg gccggcgaag gatctggatc tgtgtctctg 300 gcactgcatc tgcagcccct gagatctgct gcaggcgctg ctgctctggc tctgacagtt 360 gatctgcctc ctgcctcctc cgaggccaga aactccgcct ttggcttcca aggcagactg 420 ctgcatctgt ctgccggcca gagactggga gtccatctgc atacagaggc tagagccagg 480 cacgcctggc agttgacaca aggtgctaca gtgctgggcc tgttcagagt gaccccagag 540 attccagccg gcctgccttc tccaagatcc gag 573 <210> 41 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 27 <400> 41 gctagagcat ctcctggctc tgctgcctct cctagactga gagagggacc tgagctgtct 60 cctgatgatc ctgctggcct gctggatctg agacagggca tgtttgctca gctggtggcc 120 cagaacgtgc tgctgattga tggccctctg tcctggtact ctgatcctgg attggctggc 180 gtgtccctga ctggcggcct gtcttacaaa gaggacacca aagaactggt ggtggccaag 240 gccggcgtgt actacgtgtt ctttcagctg gaactgcgga gagtggtggc cggcgaagga 300 tctggatctg tgtctctggc actgcatctg cagcccctga gatctgctgc aggcgctgct 360 gctctggctc tgacagttga tctgcctcct gcctcctccg aggccagaaa ctccgccttt 420 ggcttccaag gcagactgct gcatctgtct gccggccaga gactgggagt ccatctgcat 480 acagaggcta gagccaggca cgcctggcag ttgacacaag gtgctacagt gctgggcctg 540 ttcagagtga ccccagagat tccagccggc ctgccttctc caagatccga g 591 <210> 42 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding SEQ ID NO: 28 <400> 42 ctgagagagg gacctgagct gtctcctgat gatcctgctg gcctgctgga tctgagacag 60 ggcatgtttg ctcagctggt ggcccagaac gtgctgctga ttgatggccc tctgtcctgg 120 tactctgatc ctggattggc tggcgtgtcc ctgactggcg gcctgtctta caaagaggac 180 accaaagaac tggtggtggc caaggccggc gtgtactacg tgttctttca gctggaactg 240 cggagagtgg tggccggcga aggatctgga tctgtgtctc tggcactgca tctgcagccc 300 ctgagatctg ctgcaggcgc tgctgctctg gctctgacag ttgatctgcc tcctgcctcc 360 tccgaggcca gaaactccgc ctttggcttc caaggcagac tgctgcatct gtctgccggc 420 cagagactgg gagtccatct gcatacagag gctagagcca ggcacgcctg gcagttgaca 480 caaggtgcta cagtgctggg cctgttcaga gtgaccccag agattccagc cggcctgcct 540 tctccaagat ccgag 555 <210> 43 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> ORIGINAL SIRPa-4-1BBL with signal peptide and C-term His Tag <400> 43 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 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gatgtcctgg ctgctcgtga acgtgtccgc tcacagagat 960 gacgtgaagc tgacatgcca ggtggaacac gatggccagc ctgccgtgtc taagtcccac 1020 gacctgaaag tgtctgctca ccccaaagag cagggctcca ataccgccgc tgagaacacc 1080 ggctccaacg agagaaacat ctacggcgcc tgtccttggg ctgtgtctgg cgctagagca 1140 tctcctggct ctgctgcctc tcctagactg agagagggac ctgagctgtc tcctgatgat 1200 cctgctggcc tgctggatct gagacagggc atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg 1260 ctgctgattg atggccctct gtcctggtac tctgatcctg gattggctgg cgtgtccctg 1320 actggcggcc tgtcttacaa agaggacacc aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg 1380 tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg agagtggtgg ccggcgaagg atctggatct 1440 gtgtctctgg cactgcatct gcagcccctg agatctgctg caggcgctgc tgctctggct 1500 ctgacagttg atctgcctcc tgcctcctcc gaggccagaa actccgcctt tggcttccaa 1560 ggcagactgc tgcatctgtc tgccggccag agactgggag tccatctgca tacagaggct 1620 agagccaggc acgcctggca gttgacacaa ggtgctacag tgctgggcct gttcagagtg 1680 accccagaga ttccagccgg cctgccttct ccaagatccg ag 1722 <210> 51 <211> 1749 <212> DNA <213> Artificial 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agctgtccga cttccagacc aacgtggacc 600 ctgtgggaga gagcgtgtcc tacagcatcc acagcacagc caaggtggtg ctgacccggg 660 aagatgtgca ctcccaagtg atttgcgagg tggcccacgt taccctgcaa ggcgatcctc 720 tgagaggcac cgccaatctg agcgagacaa tccgggtgcc acctacactg gaagtgaccc 780 agcagcctgt gcgggccgag aatcaagtga acgtgacctg ccaagtgcgg aagttctacc 840 ctcagagact gcagctgacc tggctggaaa acggcaatgt gtccagaacc gagacagcca 900 gcaccgtgac cgagaacaag gatggcacct acaattggat gagctggctg ctcgtgaatg 960 tgtctgccca ccgggacgat gtgaagctga catgccaggt ggaacacgat ggccagcctg 1020 ccgtgtctaa gagccacgac ctgaaggtgt ccgctcatcc caaagagcag ggctctaata 1080 ctgccgccga gaacaccggc agcaacgaga gaaatatcta cggcgcttgt ccttgggccg 1140 tttctggcgc tagagcctct cctggatctg ccgcttctcc cagactgaga gagggacctg 1200 agctgagccc tgatgatcct gctggactgc tggatctgag acagggcatg tttgcccagc 1260 tggtggccca gaatgtgctg ctgattgatg gccctctgtc ctggtacagc gatcctggac 1320 ttgctggcgt tagcctgact ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa gaactggtgg 1380 tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga 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315 320 Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly 325 330 335 Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 340 345 350 Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser 355 360 365 Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val 370 375 380 His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp 385 390 395 400 Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro 405 410 415 Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn 420 425 430 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr 435 440 445 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val 450 455 460 Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val 465 470 475 480 Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu 485 490 495 His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser 500 505 510 Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly 515 520 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Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 82 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> may repeat 1-4 times <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 85 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 86 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 87 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> may repeat 1-3 times <400> 87 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <220> <221> REPEAT <222> (2)..(6) <223> repeat 2-5 times <400> 88 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 89 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 89 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 90 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 90 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 91 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 92 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 92 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 93 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 94 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 95 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 95 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 96 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 96 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 97 Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 1 5 <210> 98 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 98 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu 20 <210> 99 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> polypeptide linker <400> 99 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser

Claims (47)

  1. SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질(fusion protein)로서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고, 및/또는
    상기 4-1BBL 아미노산 서열은:
    (a) 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27, 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이거나, 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 197개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 G198 내지 E205를 포함하지 않는 것이거나, 서열번호 72와 적어도 80%의 동일성을 갖는 170개 내지 182개 길이의 아미노산들로서 서열번호 3에 상응하는 아미노산 분절 A1 내지 E23을 포함하지 않는 것이거나, 또는 서열번호 70과 적어도 80%의 동일성을 갖는 184개 길이의 아미노산들이고, 및/또는;
    (b) 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복을 포함하고;
    상기 융합 단백질은 하기:
    (i) CD47 및 4-1BB를 결합함;
    (ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함;
    (iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극(co-stimulating)함; 및/또는
    (iv) 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포(phagocyte)에 의해 상기 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킴;
    중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  2. SIRPα 아미노산 서열 및 4-1BBL 아미노산 서열을 포함하는 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질로서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고, 및/또는,
    상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열변호 23, 서열번호 27 및 서열번호 28로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산과 적어도 95%의 동일성을 갖는 185개 내지 202개 길이의 아미노산들이고;
    상기 융합 단백질은 하기:
    (i) CD47 및 4-1BB를 결합함;
    (ii) 상기 4-1BB를 발현하는 세포에서 4-1BB 신호전달 경로를 활성화함;
    (iii) 상기 4-1BB를 발현하는 면역 세포를 공동-자극함; 및/또는
    (iv) 상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질의 부재 하의 동일한 것과 비교하여 식세포에 의해 상기 CD47을 발현하는 병리학적 세포의 식세포 작용을 향상시킴;
    중 적어도 하나를 행할 수 있는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  3. SIRPα 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드로서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 100개 내지 119개 길이의 아미노산들이고;
    상기 폴리펩타이드는 CD47을 결합할 수 있는 것인, 단리된 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 적어도 115개 길이의 아미노산들인 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 116개 길이의 아미노산들인 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 상응하는 L4, A27, E47 및 V92로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 돌연변이는 서열번호 2에 상응하는 L4I, A27I, E47V 및 V92I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 상응하는 아미노산 잔기 K117 내지 Y343 중 어느 것도 포함하지 않는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제4항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26으로 이루어지는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  11. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3에 상응하는 아미노산 잔기 A1 내지 V6 또는 A1 내지 G14 중 어느 것도 포함하지 않는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  12. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  13. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28로 이루어지는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (i) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 25에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 제시되는 바와 같고; 또는
    (ii) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 서열번호 26에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 3, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 28에 제시되는 바와 같은 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (i) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23에 제시되는 바와 같고; 또는
    (ii) 상기 SIRPα 아미노산 서열은 서열번호 24에 제시되는 바와 같고, 상기 4-1BBL 아미노산 서열은 서열번호 22에 제시되는 바와 같은 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  16. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질은 상기 SIRPα와 4-1BBL 사이에 링커(linker)를 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  17. 제1항 및 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 4-1BBL 아미노산 서열의 3중 반복 각각 사이에 링커를 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 링커는 단일 아미노산 링커인 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 링커가 글리신인 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드는 가용성인 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드.
  21. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 생산 수율은 동일한 생산 조건 하에서 서열번호 5의 생산 수율보다 적어도 1.5배 더 높고, 상기 생산 조건은 포유동물 세포에서의 발현 및 5일 내지 13일 동안 32℃ 내지 37℃, 5% 내지 10%의 CO2에서의 배양을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  22. 제1항, 제2항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  23. 제1항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹에서 선택되는 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  24. 제1항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  25. 제1항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  26. 제1항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 18 내지 서열번호 21 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  27. 제1항 및 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 서열번호 13, 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide).
  29. 제28항의 폴리뉴클레오타이드, 및 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하기 위한 조절 요소를 포함하는, 핵산 작제물(nucleic acid construct).
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 제28항 또는 제29항의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물을 포함하는, 숙주 세포.
  31. SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 숙주 세포에서 제28항 또는 제29항의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물을 발현시키는 단계를 포함하는, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 방법은 상기 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 포함하는 것인, SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  33. 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법으로서,
    치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 제28항 또는 제29항의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물, 또는 제30항의 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 방법은 상기 질환을 치료하기 위해 상기 대상체에게 치료학적 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 방법.
  35. 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 제28항 또는 제29항의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 또는 제30항의 숙주 세포.
  36. 제35항에 기재된 용도에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  37. 면역 세포 활성화로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제를 패키징하는 패키징 재료; 및 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 제28항 또는 제29항의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 작제물 또는 제30항의 숙주 세포를 포함하는, 제조 물품.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환의 세포들은 CD47을 발현하는 것인, 방법, 용도에 사용하기 위한 조성물 또는 제조 물품.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환은 과다-증식성(hyper-proliferative) 질환을 포함하는 것인, 방법, 용도에 사용하기 위한 조성물 또는 제조 물품.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 과다-증식성 질환은 암을 포함하는 것인, 방법, 용도에 사용하기 위한 조성물 또는 제조 물품.
  41. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환이 면역 억제 또는 투약(medication) 유도된 면역 억제 또는 감염과 관련된 질환을 포함하는 것인, 방법, 용도에 사용하기 위한 조성물 또는 제조 물품.
  42. 면역 세포를 활성화하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 SIRPα-4-1BBL 융합 단백질 또는 단리된 폴리펩타이드, 제28항 또는 제29항의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 또는 제30항의 숙주 세포의 존재시에 면역 세포를 시험관내(in-vitro) 활성화하는 단계를 포함하는 것인, 면역 세포를 활성화하는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 활성화는 CD47 또는 외인성 CD47을 발현하는 세포의 존재시에 이루어지는 것인, 면역 세포를 활성화하는 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    상기 활성화는 항암제의 존재시에 이루어지는 것인, 면역 세포를 활성화하는 방법.
  45. 제34항, 제36항, 제37항 내지 제41항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환을 치료하기 위한 상기 치료학적 제제 또는 항암제는 항체를 포함하는 것인, 방법, 용도에 사용하기 위한 조성물 또는 제조 물품.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 항체는 리툭시맙(rituximab), 세툭시맙(cetuximab), 및 알메투주맙(almetuzumab)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 방법, 용도에 사용하기 위한 조성물 또는 제조 물품.
  47. 제34항, 제36항, 제37항 내지 제41항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환을 치료하기 위한 치료학적 제제 또는 항암제는 IMiD (예를 들면, 탈리도마이드(Thalidomide), 레날리도마이드(Lenalidomide), 포말리도마이드(Pomalidomide))를 포함하는 것인, 방법, 용도에 사용하기 위한 조성물 또는 제조 물품.
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