CN116981686A

CN116981686A - I型膜蛋白异二聚体及其使用方法

Info

Publication number: CN116981686A
Application number: CN202280021045.XA
Authority: CN
Inventors: 阿米·塔米尔; 马克·L·泰科辛斯基; 埃德温·布雷默
Original assignee: Kahr Medical Ltd; Thomas Jefferson University
Current assignee: Kahr Medical Ltd; Thomas Jefferson University
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2022-01-13
Publication date: 2023-10-31

Abstract

提供了I型膜蛋白异二聚体。相应地，提供了一种异二聚体，其包含选自由SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10所组成的组的两种多肽，其中，两种多肽中的每一种都能够结合其天然结合对，并且其中异二聚体不包含能够结合其天然结合对的II型膜蛋白的氨基酸序列。还提供了编码该异二聚体的核酸构建体和系统，表达该异二聚体的宿主细胞及其使用方法。

Description

I型膜蛋白异二聚体及其使用方法

相关应用

本申请要求2021年1月13日提交的申请号为63/136,687的美国专利申请和2021年1月20日提交的申请号为63/139,331的美国专利申请的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。

序列表声明

与本申请同时提交的、创建于2022年1月13日名为89962SequenceListing.txt的ASCll文件包括303,104字节，该文件通过引用并入本文。

技术领域和背景技术

本发明在其一些实施方式中涉及I型膜蛋白异二聚体及其使用方法。

癌症和免疫系统之间的相互作用是复杂的和多方面的。尽管许多癌症患者似乎产生了抗肿瘤免疫应答，但癌症也产生了避开免疫检测和破坏的策略。癌细胞可以减少其表面肿瘤抗原的表达，使免疫系统更难检测到它们；在其表面表达诱导免疫细胞失活的蛋白质；和/或诱导微环境中的细胞释放抑制免疫应答和促进肿瘤细胞增殖和存活的物质。

最近，已经开发了免疫疗法，通过刺激免疫系统的特定成分或通过抵消抑制免疫应答的癌细胞产生的信号来增强针对肿瘤的免疫应答。在确定调节免疫应答的机制和分子方面的进展导致了用于治疗癌症的新的治疗靶标。这些靶标中的一些包括：在调节T细胞免疫应答中起中心作用的共刺激和共抑制分子(例如CTLA4、PD1)，有助于调节(regulate或modulate)免疫系统活性的蛋白质，例如白细胞介素和干扰素，肿瘤抗原和参与先天免疫系统活性的成分(例如CD47-SIRPα“别吃我”信号)。

其他背景技术文献包括：

公开号为WO/2020/146423、WO201712770、WO2017152132、WO2016023001和WO2013112986的国际专利申请；和

美国专利US7,569,663和US8,039,437。

发明内容

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种异二聚体，其包含选自由SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10所组成的组的两种多肽，其中，所述两种多肽中的每一种都能够结合其天然结合对，并且其中所述异二聚体不包含能够结合其天然结合对的II型膜蛋白的氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含与所述两种多肽连接的二聚化部分。

根据本发明的一些实施方式，所述二聚化部分是抗体的Fc结构域或其片段。

根据本发明的一些实施方式，所述Fc结构域被修饰以改变其与Fc受体的结合，降低其免疫激活功能和/或提高所述融合的半衰期。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述PD1多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述LILRB2多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述SIGLEC10多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述TIGIT多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述TIGIT多肽和所述PD1多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述TIGIT多肽和所述LILRB2多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述TIGIT多肽和所述SIGLEC10多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述PD1多肽和所述SIGLEC10多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述LILRB2多肽和所述SIGLEC10多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述异二聚体包含所述PD1多肽和所述LILRB2多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述多肽中的每一种是所述异二聚体中的单体。

根据本发明的一些实施方式，所述两种多肽包含在所述异二聚体的单体中。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种包含异二聚体的组合物，其中所述异二聚体是所述组合物中所述两种多肽的主要形式。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种核酸构建体或系统，包含至少一种编码异二聚体的多核苷酸，和用于指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节元件。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种包含异二聚体或核酸构建体或系统的宿主细胞。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种生产异二聚体的方法，所述方法包括将所述核酸构建体或系统引入宿主细胞或培养细胞。

根据本发明的一些实施方式，所述方法包括分离所述异二聚体。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种治疗有需要的对象中可受益于所述异二聚体治疗的疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的所述异二聚体、组合物、核酸构建体或系统或细胞，从而治疗所述对象的所述疾病。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了所述异二聚体、组合物、核酸构建体或系统或细胞，用于治疗有需要的对象中可受益于用所述异二聚体治疗的疾病的用途。

根据本发明的一些实施方式，所述疾病可受益于激活免疫细胞。

根据本发明的一些实施方式，与所述疾病相关的细胞表达所述天然结合对。

根据本发明的一些实施方式，所述疾病是癌症。

根据本发明的一些实施方式，所述癌症选自由淋巴瘤、白血病、结肠癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌和肝细胞癌所组成的组。

根据本发明的一些实施方式，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)或间皮瘤。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种激活免疫细胞的方法，所述方法包括在所述异二聚体、组合物、核酸构建体或系统或细胞的存在下，在体外激活免疫细胞。

根据本发明的一些实施方式，所述激活是在表达所述天然结合对的细胞的存在下进行的。

除非另有限定，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本发明的实施方式的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的方法和材料，但是下面描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以专利说明书(包括限定)为准。此外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意味着必须是限制性的。

附图简要说明

本文通过示例的方式参考附图描述了本发明的一些实施方式。现在详细地具体参考附图，需要强调的是，所示的细节是示例性的，并且是为了说明性地讨论本发明的实施方式。在这点上，结合附图所作的描述使得本领域技术人员清楚如何实施本发明的实施方式。

在附图中：

图1A是异二聚体的可能排列/构象的非限制性示例的示意图。

图1B显示了本发明一些实施方式所设想的异二聚体的组成和排列的示意图。

图2A是SIRPα-PD1异二聚体(在本文称为“DSP120V1”(SEQ ID NO:5和7))的示意图。

图2B-C显示了SIRPα-PD1异二聚体DSP120V1(SEQ ID NO:5和7)的所述预测3D结构。图2B是一示意性3D模型，图2C是一完整原子3D模型。SIRPα(在“杵(knob)”链中)以深灰色带显示(右下侧)表示。PD1(在“臼(hole)”链中)以灰色带显示(右上侧)表示。“杵”序列的hIgG4在图右下侧以白色带表示。“臼”序列的hIgG4在图右上侧以灰色带表示。在SIRPα、hIgG4和PD1的结构元件之间，用灰色带及白色带表示“间隔物”/“连接体(linker)”节段。hIgG4 Fc结构域(其稳定复合物)的铰链半胱氨酸残基用CPK表示。

图3A是SIRPα-LILRB2异二聚体(在本文称为“DSP216V1”(SEQ ID NOs:5和15))的示意图。

图3B-C显示了SIRPα-LILRB2异二聚体DSP216V1(SEQ ID NOs:5和15)的所述预测3D结构。图3B是一示意性3D模型，图3C是一完整原子3D模型。SIRPα(在“杵”链中)以深灰色带显示(右下侧)表示。LILRB2(在“臼”链中)以深灰色带显示(右上侧)表示。“杵”序列的hIgG4在图右下侧以白色带表示。“臼”序列的hIgG4在图右上侧以灰色带表示。在SIRPα、hIgG4和LILRB2的结构元件之间，以灰色及白色带表示“间隔物”/“连接体”节段。hIgG4 Fc结构域(稳定复合物)的铰链半胱氨酸残基用CPK表示。

图4A是TIGIT-SIGLEC10异二聚体(在本文称为“DSP404V1”(SEQ ID NOs:13和30))的示意图。

图4B-C显示了TIGIT-SIGLEC10异二聚体DSP404V1(SEQ ID NOs:13和30)的所述预测3D结构。图4B是一示意性3D模型，图4C是一完整原子3D模型。TIGIT(在“杵”链中)以灰色表面显示(右下侧)表示。SIGLEC10(在“臼”链中)以灰色表面显示(右上侧)表示。“杵”序列的hIgG4在图右下侧以白色表面表示。“臼”序列的hIgG4在图右上侧以灰色表面表示。TIGIT、hIgG4和SIGLEC10的结构元件之间，用灰色及白色带表示“间隔物”/“连接体”节段。hIgG4 Fc结构域(稳定复合物)的铰链半胱氨酸残基用CPK表示。

图5A是TIGIT-PD1异二聚体(在本文称为“DSP502V1”(SEQ ID NOs:13和7))的示意图。

图5B-C显示了TIGIT-PD1异二聚体DSP502V1(SEQ ID NOs:13和7)的所述预测3D结构。图5B是一示意性3D模型，图5C是一完整原子3D模型。TIGIT(在“杵”链中)以灰色带显示(右下侧)表示。PD1(在“臼”链中)以灰色带显示(右上侧)表示。“杵”序列的hIgG4在图右下侧以白色带表示。“臼”序列的hIgG4在图右上侧以灰色带表示。在TIGIT、hIgG4和PD1的结构元件之间，用灰色及白色带表示“间隔物”/“连接体”节段。hIgG4 Fc结构域(稳定复合物)的铰链半胱氨酸残基用CPK表示。

图6A-B显示了几种产生的异二聚体(参见下文表1中的描述和序列)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。图6A显示了用编码所示异二聚体的质粒转染的Expi293F细胞的粗(非纯化)-五天上清液样品的SDS-PAGE图像，在还原(R)和/或非还原(NR)条件下分离上清液。对照样品为未转染的Expi293F细胞的培养5天的上清液。图6B显示了如所示的使用蛋白-A或阴离子交换层析从用编码所示异二聚体的构建体转染的细胞的5天上清液中纯化的样品的SDS-PAGE图像。

图7A-C显示了几种产生的异二聚体(参见下文表1中的描述和序列)的蛋白印迹分析。图中提供的样品是用编码所示异二聚体的质粒转染的Expi293F细胞的粗(非纯化)-五天上清液。在非还原(NR)和/或还原(R)条件下，在SDS-PAGE上分离上清液，然后用抗PD1(图7A)、抗SIRPα(图7B)或抗LILRB2(图7C)抗体进行免疫印迹。

图8A-B显示了SIRPα-PD1异二聚体(本文中称为“DSP120”(SEQ ID NOs:1和3))与CD47和PDL1的结合。将含有异二聚体的上清液或对照上清液(来自未转染的Expi293F细胞)温育在CD47或PDL1预包被的96孔板中。温育后，用抗PD-1(对于CD47包被的板)或兔抗人SIRPα抗体(对于PDL1包被的板)进行检测，然后与相应的HRP缀合的二抗一起温育。根据标准ELISA协议，使用酶标仪(Plate reader)(Thermo Scientific,Multiscan FC)在450nm处，使用TMB底物进行检测，参考波长为620nm。图8A显示了DSP120以浓度依赖方式与CD47包被的板结合，图8B显示了DSP120以浓度依赖方式与PDL1包被的板结合。

图9A-C显示了SIRPα-LILRB2异二聚体(本文中称为“DSP216”(SEQ ID NOs:1和11，图9A)和“DSP216V1”(SEQ ID NOs:5和15，图9B-C))与HLA-G的结合。将含有异二聚体(来自未转染的Expi293F细胞)的上清液或对照上清液在HLA-G预包被的96孔板中温育。通过先与兔抗人SIRPα抗体温育，然后与山羊抗兔IgG-HRP和TMB底物温育，根据标准ELISA协议，使用酶标仪(Thermo Scientific,Multiscan FC)在450nm处检测结合，参考波长为620nm。图9A显示了DSP216与HLA-G蛋白包被的板以浓度依赖方式结合。未观察到与对照上清液(对照)的结合。图9B-C显示了含有DSP216V1(图9B)或纯化的DSP216V1(图9C)的粗上清液以浓度依赖方式与HLA-G包被的板结合。

图10A-B显示出PD1-TIGIT异二聚体(本文中称为“DSP502”(SEQ ID NOs:9和3))与其PVR对应物的结合。将含有异二聚体的上清液或对照上清液(来自未转染的Expi293F细胞)(图10A)或纯化的蛋白质(图10B)在PVR预包被的96孔板中温育。温育后，用抗PD1抗体进行检测，然后与相应的HRP缀合的二抗一起温育。根据标准ELISA协议，使用酶标仪(ThermoScientific,Multiscan FC)在450nm处，使用TMB底物进行检测，参考波长为620nm。图10A-B显示出DSP502以浓度依赖方式结合到PVR包被的板上。

图11A-E显示出DSP120和DSP120V1与表达PDL1或CD47的细胞的结合，如通过流式细胞术分析所确定的。所给出的MFI值用于通过FlowJo软件创建结合曲线图。图11A是显示出DLD1-PDL1过表达细胞系上PDL1表达的直方图。PDL1的表面表达水平通过用荧光标记的抗PDL1抗体对DLD1 WT和PDL1过表达细胞系(DLD1-PDL1)进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析来确定。图11B是显示出CHO-K1-CD47 HB9克隆细胞上CD47受体表达的直方图。CD47的表面表达水平通过使用抗CD47抗体对CHO-K1 WT和CD47过表达细胞系(克隆HB9)进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析来确定。图11C-D显示出与DLD1-WT相比，DSP120(图11C)和DSP120V1(图11D)与DLD1-PDL1过表达细胞系的结合。温育后，使用抗SIRPα抗体对其SIRPα结构域进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，从而确定异二聚体与细胞系的结合。图11E显示出DSP120V1与CHO-K1-CD47HB9克隆细胞的结合。温育后，通过使用抗IgG4抗体对其IgG-Fc结构域进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，确定异二聚体与hCD47过表达细胞系的结合。CHO-K1 WT细胞用作结合测定的阴性细胞对照。

图12E-F显示出DSP216和DSP216V1与表达CD47和HLA-G的细胞的结合，如通过流式细胞术分析所确定的。图12A和12C显示出CD47在HT1080(图12A)和HT1080-HLA-G(图12C)细胞系上的表达。CD47的细胞表面表达通过用抗人CD47抗体和IgG1同种型对照对细胞系进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析来确定。图12B和12D显示出HLA-G在HT1080(图12B)和HT1080-HLA-G(图12D)细胞系上的表达。通过用抗人HLA-G抗体和IgG2a同种型对照对细胞系进行免疫染色来确定HLA-G的表面表达水平。图12E显示出DSP216与表达CD47的细胞HT1080的结合。温育后，使用LILRB2抗体对其LILRB2结构域进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，从而确定异二聚体与细胞系的结合。显示了LILRB2阳性细胞的百分比，并用于通过GraphPad Prism软件来创建结合曲线图。图12F显示出含有异二聚体DSP216V1的上清液与HT1080-HLA-G细胞系的结合。通过使用抗IgG4抗体对IgG4主链进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析来确定异二聚体与细胞系的结合。给出了MFI值，并用于通过GraphPadPrism软件创建结合曲线图。

图13显示出SIGLEC10-PD1异二聚体(本文中称为“DSP402”(SEQ ID NOs:24和3))与DLD1 WT和PDL1过表达细胞系的结合，如通过流式细胞术分析所确定的。细胞与DSP402温育后，使用抗PD1抗体对其PD1结构域进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，从而确定异二聚体与DLD1 PDL1过表达细胞系的结合。DLD-1WT细胞用作结合测定的阴性细胞对照。给出了MFI值，并用于通过FlowJo软件创建结合曲线图。

图14A-G显示出TIGIT-PD1异二聚体(在本文中称为“DSP502”(SEQ ID NOs:9和3))与表达PVR和PDL1的细胞的结合。图14A-C显示出PVR在DLD-1WT(图14A)、DLD-1PDL1(图14B)和HT1080(图14C)细胞系上的表达。通过用APC标记的抗PVR抗体对细胞系进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来确定PVR的细胞表面表达。给出了MFI值。图14D显示出PDL1在HT1080细胞上的表达。通过用APC标记的抗PDL1抗体或同种型对照对细胞系进行免疫染色，随后进行流式细胞术分析，来确定PDL1的表面表达水平。图14E-F显示出DSP502与DLD1PDL1(图14E)或HT1080(图14F)细胞的结合。温育后，使用抗人IgG1抗体对其IgG1-Fc结构域进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，从而确定异二聚体与细胞系的结合。通过将细胞与针对PVR或PD-L1的封闭抗体一起温育来测试与DSP502的每个结构域的结合的特异性。图14G显示出TIGIT-PD1异二聚体(在本文中称为“DSP502V1”(SEQ ID NOs:13和7))、“DSP502V2”(SEQ ID NOs:31和7)、“DSP502V3”(SEQ ID NOs:33和7)与PVR的特异性结合，这通过与表达PVR但不表达PD1的DLD-1WT细胞的结合来证明。使用抗人IgG4抗体对其IgG4-Fc结构域进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，从而确定异二聚体的结合。给出了MFI值，并用于通过FlowJo软件创建结合曲线图。

图15显示了几种产生的异二聚体(参见下文表1中的描述和序列)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。该图显示了用编码所示异二聚体的质粒转染的Expi293F细胞的粗(非纯化)-五天上清液样品的SDS-PAGE图像，在还原(R)和/或非还原(NR)条件下分离上清液。

图16A-F显示出与HT1080-WT细胞相比，SIRPα-LILRB2异二聚体(在本文中称为“DSP216”(SEQ ID NOs:1和11，图16A)、“DSP216V1”(SEQ ID NOs:5和15，图16B)、“DSP216V3”(SEQ ID NOs:138和11，图16C)、“DSP216V4”(SEQ ID NOs:140和15，图16D)、“DSP216V5”(SEQ ID NOs:142和150，图16E)或“DSP216V6”(SEQ ID NOs:144和150，图16F))与过表达HLA-G的细胞(HT1080-HLA-G)的结合。如图所示，在与或不与封闭抗体一起温育后，通过使用APC缀合的抗人IgGl抗体对IgG主链进行免疫染色，或使用DSP216V1和DSP216V4的抗SIRPα对SIRPα结构域进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来确定异二聚体与细胞系的结合。给出了MFI值，并用于通过GraphPad Prism软件创建结合曲线图。

图17A-F显示出SIRPα-LILRB2异二聚体DSP216(SEQ ID NO:1和11，图17C)、DSP216V3(SEQ ID NO:138和11，图17D)、DSP216V5(SEQ ID NO:142和150，图17E)或DSP216V6(SEQ ID NO:144和150，图17F)与同时表达CD47和HLA-G的JEG-3细胞的结合(图17A-B)。如所示，在与或不与封闭抗体一起温育后，通过使用抗人IgG1抗体对IgG主链进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来确定异二聚体与细胞系的结合。给出了MFI值，并用于通过GraphPad Prism软件创建结合曲线图。

图18A-D显示出SIRPα-LILRB2异二聚体DSP216(SEQ ID NO:1和11，图18A)、DSP216V1(SEQ ID NO:5和15，图18B)、DSP216V3(SEQ ID NO:138和11，图18C)和DSP216V4(SEQ ID NO:140和15，图18D)与板结合的(PB)重组人CD47的结合。将含有异二聚体的上清液在CD47预包被的96孔板中温育。根据标准ELISA协议，使用酶标仪(Thermo Scientific,Multiscan FC)在450nm处，使用TMB底物进行检测，通过与抗人IgG1-或IgG4-HRP抗体温育来检测结合，参考波长为620nm。O.D.值用于通过GraphPad Prism软件创建结合曲线图。

图18E-H显示出SIRPα-LILRB2异二聚体DSP216(SEQ ID NOs:1和11，图18E)、DSP216V1(SEQ ID NO:5和15，图18F)、DSP216V3(SEQ ID NO:138和11，图18G)和DSP216V4(SEQ ID NO:140和15，图18H)与板结合的(PB)重组人HLA-G的结合。将含有异源二聚体的上清液在HLA-G预包被的96孔板中温育。根据标准ELISA协议，使用酶标仪(ThermoScientific,Multiscan FC)在450nm处，使用TMB底物进行检测，通过与抗人IgG1-或IgG4-HRP抗体温育来检测结合，参考波长为620nm。O.D.值用于通过GraphPad Prism软件创建结合曲线图。

图19A-I显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)和异二聚体(本文中称为“DSP502V4”(SEQ ID NOs:146和148))与表达PDL1和/或PVR的细胞的结合，如通过流式细胞术分析所确定的。给出了MFI值，并用于通过FlowJo software软件创建结合曲线图。图19A显示出DSP502与K562 PD-L1细胞的结合；图19B显示出DSP502与K562 PD-L1/PVR细胞的结合；图19C显示出DSP502V4与K562 PD-L1细胞的结合；图19D显示出DSP502V4与K562 PD-L1/PVR细胞的结合；图19G显示出DSP502与K562 PVR细胞的结合；图19H显示出DSP502V4与K562PVR细胞的结合。图19E、19F和19I是显示PDL1或PVR在K562 PD-L1、K562PVR和K562 PD-L1/PVR细胞上表达的直方图。如所示，通过用荧光标记的抗PDL1或抗PVR抗体进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来确定PDL1和PVR的表面表达水平。

图20A显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NOs:9和3)与表达PVR的SKOV3细胞的结合，如在有或没有封闭抗体的情况下温育后通过流式细胞术分析所确定的，如所示。给出了MFI值，并用于通过FlowJo软件创建结合曲线图。

图20B是显示出PVR在SKOV3细胞上表达的直方图。通过用荧光标记的抗PVR抗体对细胞进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来确定PVR的表面表达水平。

图21A显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NOs:9和3)与表达小鼠PDL1和PVR的Renca细胞的结合，在有或没有封闭抗体的情况下温育后通过流式细胞术分析所确定的，如图所示。给出了MFI值，并用于通过FlowJo软件创建结合曲线图。

图21B显示了表明PDL-1和PVR在Renca细胞上表达的直方图。如图所示，通过用荧光标记的抗PDL1或抗PVR抗体对细胞进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来确定PDL1和PVR的表面表达水平。

图22A显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)与鼠细胞系AB12的结合，如通过流式细胞术分析所确定的。给出了MFI值，并用于通过FlowJo软件创建结合曲线图。

图22B是显示出PDL1和PVR在AB12细胞上的表面表达水平的直方图。如图所示，通过用荧光标记的抗PDL1或抗PVR抗体对细胞进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来测定PDL1和PVR的表面表达水平。

图23A显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)与Jurkat NFAT-CD16细胞的结合，在有或没有封闭抗体的情况下温育后通过流式细胞术分析所确定的，如图所示。给出了MFI值，并用于通过FlowJo软件创建结合曲线图。

图23B是显示出CD16在Jurkat NFAT-CD16细胞上表达的直方图。如图所示，通过用荧光标记的抗CD16抗体对细胞进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析，来确定CD16的表面表达水平。

图24显示出在存在不同浓度的DSP502(SEQ ID NO:9和3)的情况下，与K562-WT或K562过表达PDL1和PVR细胞共培养后，Jurkat NFAT-CD16细胞的荧光素酶分泌水平。荧光素酶分泌的水平被测量为发光信号，通过荧光素酶和添加底物(QUANTI-Luc)相互作用产生。

图25A显示出DSP502(SEQ ID NO:9和3)的TIGIT和PD1结构域与其对应配体/受体同时结合。图25A显示与板结合的PDL1的结合，然后与人CD155(PVR)-小鼠IgG2a Fc一起温育。根据标准ELISA协议，使用酶标仪在450nm处检测链霉亲和素HRP，然后加入TMB底物，参考波长为540nm。

图25B-D显示出在存在不同浓度的TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)的情况下，NK细胞和K562 PVR/PD-L1细胞的双峰的形成。图25B是显示NK细胞上CD16表达水平的直方图，通过用荧光标记的抗CD16抗体对细胞进行免疫染色，然后进行流式细胞术分析来确定。图25C显示出在所示浓度的DSP502的存在下双峰的形成。图25D显示出在用如图所示的阻断剂抗体(Fc阻断、PVR阻断或PD-L1阻断)温育后，在所示浓度的DSP502的存在下双峰的形成。Q1(每个图中的左上四分之一)表示K562 PVR/PD-L1 CFSE标记的细胞(Y轴上的阳性细胞)；Q3(每个图中的右下四分之一)表示NK CPD标记的细胞(X轴上的阳性细胞)；并且Q2(每个图中的右上四分之一)表示具有双峰百分比的NK-K562 PVR/PD-L1细胞的双峰。

图26显示出在人源化NSG小鼠的A549-NSCLC异种移植物模型中TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)的体内抗肿瘤效应，其表现为与媒介物对照相比肿瘤体积减小。在每个实验组中n＝5。

图27显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)在携带AB12间皮瘤肿瘤的小鼠中的体内抗肿瘤效应，其表现为与媒介物对照相比生存时间延长。在每个实验组中n＝5。

图28显示出SIRPα-LILRB2异二聚体DSP216(SEQ ID NO:1和11，图16A)对癌细胞被粒细胞吞噬的作用。将HT1080或HT1080-HLA-G细胞标记，并用0、1、2或5μg/mL DSP216进行预温育，然后与粒细胞以1:1共培养，并通过流式细胞术分析。显示了取自三个供体的粒细胞的吞噬作用的百分比。

图29A显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)的细胞毒性作用。示出了在DSP502的存在下，按指定比例将指定的K562细胞与NK细胞共培养后死亡细胞的百分比。条形上方的星号表示相对于未处理的共培养的统计学显著性。

图29B显示出TIGIT-PD1异二聚体DSP502(SEQ ID NO:9和3)与所示K562细胞共培养后对NK细胞的颗粒酶B分泌的影响。条形上方的星号表示相对于未处理的共培养的统计学显著性。

具体实施方式

在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解的是，本发明在其应用中不一定局限于在下面的描述中阐述的或者由实施例示出的细节。本发明能够有其他实施方式，或者能够以各种方式实践或执行。

癌症免疫疗法旨在通过刺激免疫系统的特定成分或通过抵消抑制免疫应答的癌细胞产生的信号来增强针对肿瘤的免疫应答。

在将本发明的具体实施方式付诸实践的同时，本发明人已经生产了异源二聚体，其包含选自SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10的两种I型膜蛋白的胞外部分(例如参见下文的表1)。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种，包含选自SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10的两种多肽，其中所述两种多肽中的每一种都能够结合其天然结合对，并且其中所述异二聚体不包含能够结合其天然结合对的II型膜蛋白的氨基酸序列。

如本文所用，术语“异二聚体”是指通过人工连接两种不同蛋白质(本文中称为单体)形成的非天然存在的二聚体蛋白。

确定二聚化，特别是异二聚化的方法是本领域熟知的，包括但不限于NATIVE-PAGE、SEC-HPLC 2D凝胶、凝胶过滤、SEC-MALS、分析超速离心(AUC)质谱(MS)、毛细管凝胶电泳(CGE)。

根据具体实施方式，异二聚体的单体不是共价连接的。

根据其它具体实施方式，异二聚体的单体是共价连接的。

根据其它具体实施方式，异二聚体的单体通过一个二硫键连接。

根据具体实施方式，异二聚体的单体通过多个二硫键连接。

如本文所用，术语“SIRPα多肽”、“PD1多肽”、“TIGIT多肽”、“LILRB2多肽”和“SIGLEC10多肽”分别是指SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10的氨基酸序列或其功能同源物，其能够至少结合其天然结合对，如下文进一步所述。

如本文所用，短语“功能同源物”是指包含保守和非保守氨基酸取代的片段、同源物(天然存在或合成/重组产生)和/或氨基酸序列，其至少维持全长蛋白质与其天然结合对结合的活性。

如本文所用，短语“其天然结合对”是指所述多肽的天然配体或受体。

用于测试结合的测定在本领域是众所周知的，包括但不限于流式细胞术、BiaCore、生物膜层干涉测定、HPLC。

根据具体实施方式，异二聚体包含PD1多肽。

如本文所用，术语“PD1(程序性死亡1，也称为CD279)”是指由PDCD1基因(基因ID5133)编码的多肽。根据具体实施方式，PD1是人PD1。根据一个具体实施方式，PD1是指人PD1，例如在以下GenBank编号NP_005009中提供的人PD1。

到目前为止，已经识别了PD1的两种配体，即PDL1和PDL2(也称为B7-DC)。根据一个具体实施方式，PDL1蛋白是指人蛋白，例如在以下GenBank编号NP_001254635和NP_054862中提供的。根据一个具体实施方式，PDL2蛋白是指人蛋白，例如在以下GenBank编号NP_079515中提供的。

根据具体实施方式，PD1氨基酸序列包含SEQ ID NO:37。

根据具体实施方式，PD1氨基酸序列由SEQ ID NO:37组成。

根据具体实施方式，PD1多肽结合PD-L1，Kd为1nM至100μM、10nM至10μM、100nM至100μM、200nM至10μM，如通过SPR分析确定的，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，PD1多肽将结合PDL1，Kd为270nM，如通过SPR分析确定的。

根据具体实施方式，PD1多肽将结合PDL1，Kd为8μM至9μM，如通过SPR分析确定的。

根据具体实施方式，PD1多肽包含PD1的胞外结构域或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，PD1多肽包含SEQ ID NO:41、42或43或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，PD1多肽包含SEQ ID NO:41、42或43。

根据具体实施方式，PD1氨基酸序列由SEQ ID NO:41、42或43组成。

术语“PD1多肽”还包括表现出所需活性(即结合PD-L1和/或PD-L2)的功能同源物。此类同源物可以是例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于本文公开的多肽SEQ ID NO:37、41、42或43或任何其它PD1氨基酸序列；或至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同于编码其的所述多核苷酸序列(如下文进一步所述)。

如本文所用，“同一性”或“序列同一性”是指全域同一性，即，本文所公开的整个氨基酸或核酸序列上的同一性，而不是其部分上的同一性。

序列同一性或同源性可以使用任何蛋白质或核酸序列比对算法来确定，如Blast、ClustalW及MURCE。

同源物还可指直系同源、缺失、插入或取代变体，包括氨基酸取代，如下文进一步所述。

根据具体实施方式，PD1多肽可以包含保守的和非保守的氨基酸取代。此类取代在本领域中已知，并公开于如下文献：Maute等人，美国科学院院报(PNAS)2015年11月24，112(47):E6506-14；Ju Yeon等人，自然通讯(Nature Communications)2016，第7卷，文章编号：13354(DOI:10.1038/ncomms13354)；及Zack KM等人，结构(Structure)2015 23(12):2341-2348(DOI:10.1016/j.str.2015.09.010)，其内容通过引用完全并入本文。

根据具体实施方式，与SEQ ID NO:37相比，突变导致PD1多肽对PDL1的亲和力增加。

根据具体实施方式，一个或多个氨基酸突变位于选自V39、L40、N41、Y43、R44、M45、S48、N49、Q50、T51、D52、K53、A56、Q63、G65、Q66、V72、H82、M83、R90、Y96、L97、A100、S102、L103、A104、P105、K106和A107的氨基酸残基，对应于SEQ ID NO:42所示的PD1氨基酸序列。根据具体实施方式，一个或多个氨基酸突变位于选自V39、L40、N41、Y43、R44、M45、S48、N49、Q50、T51、D52、K53、A56、Q63、G65、Q66、C68、V72、H82、M83、R90、Y96、L97、A100、S102、L103、A104、P105、K106和A107的氨基酸残基，对应于SEQ ID NO:42所示的PD1氨基酸序列。

根据具体实施方式，从以下组中选择一种或多种氨基酸变化：(1)V39H或V39R；(2)L40V或L40I；(3)N41I或N41V；(4)Y43F或Y43H；(5)R44Y或R44L；(6)M45Q、M45E、M45L或M45D；(7)S48D、S48L、S48N、S48G或S48V；(8)N49C、N49G、N49Y或N49S；(9)Q50K、Q50E或Q50H；(10)T51V、T51L或T51A；(11)D52F、D52R、D52Y或D52V；(12)K53T或K53L；(13)A56S或A56L；(14)Q63T、Q63I、Q63E、Q63L或Q63P；(15)G65N、G65R、G65I、G65L、G65F或G65V；(16)Q66P；(17)V72I；(18)H82Q；(19)M83L或M83F；(20)R90K；(21)Y96F；(22)L97Y、L97V或L97I；(23)A100I或A100V；(24)S102T或S102A；(25)L103I、L103Y或L103F；(26)A104S、A104H或A104D；(27)P105A；(28)K106G、K106E、K106I、K106V、K106R或K106T；和(29)A107P、A107I或A107V，对应于SEQ ID NO:42所示的PD1氨基酸序列。

根据具体实施方式，从以下组中选择一种或多种氨基酸变化：(1)V39H或V39R；(2)L40V或L40I；(3)N41I或N41V；(4)Y43F或Y43H；(5)R44Y或R44L；(6)M45Q、M45E、M45L或M45D；(7)S48D、S48L、S48N、S48G或S48V；(8)N49C、N49G、N49Y或N49S；(9)Q50K、Q50E或Q50H；(10)T51V、T51L或T51A；(11)D52F、D52R、D52Y或D52V；(12)K53T或K53L；(13)A56S或A56L；(14)Q63T、Q63I、Q63E、Q63L或Q63P；(15)G65N、G65R、G65I、G65L、G65F或G65V；(16)Q66P；(17)C68S；(18)V72I；(19)H82Q；(20)M83L或M83F；(21)R90K；(22)Y96F；(23)L97Y、L97V或L97I；(24)A100I或A100V；(25)S102T或S102A；(26)L103I、L103Y或L103F；(27)A104S、A104H或A104D；(28)P105A；(29)K106G、K106E、K106I、K106V、K106R或K106T；和(30)A107P、A107I或A107V，对应于SEQ ID NO:42所示的PD1氨基酸序列。

根据具体的实施方式，氨基酸突变位于对应于SEQ ID NO:37所示的PD1氨基酸序列的氨基酸残基C93处(例如，相当于对应于SEQ ID NO:42所示的PD1氨基酸序列的氨基酸残基C68)。

因此，根据具体实施方式，PD1多肽包含SEQ ID NO:39或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，PD1多肽包含SEQ ID NO:39。

根据具体实施方式，PD1氨基酸序列由SEQ ID NO:39组成。

如本文所用，短语“对应于SEQ ID NO:37中所示的PD1氨基酸序列”、“对应于SEQID NO:37”、“对应于SEQ ID NO:42中所示的PD1氨基酸序列”或“对应于SEQ ID NO:42”旨在包括相对于任何其它PD1氨基酸序列的对应氨基酸残基。

关于保守性氨基酸和非保守性氨基酸取代的其它描述在上下文中进一步提供。

本发明一些实施方式的PD1多肽为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于多肽SEQ ID NO:39、41、42、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79或81；或至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于编码其的多核苷酸序列，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，PD1多肽不包含对应于SEQ ID NO:43的氨基酸节段P1-L5和/或F146-V150中的任一个。

根据具体实施方式，PD1多肽不包含对应于SEQ ID NO：43的氨基酸残基P1-L5和/或F146-V150中的任一个。

根据具体实施方式，PD1多肽包含100至288个氨基酸、100至200个氨基酸、120至180个氨基酸、120至160个氨基酸、130至170个氨基酸、130至160个氨基酸、130至150个氨基酸、140至160个氨基酸、145至155个氨基酸、123至166个氨基酸、138至145个氨基酸、123至148个氨基酸、126至148个氨基酸、123至140个氨基酸、126至140个氨基酸、127至140个氨基酸、130至140个氨基酸，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，PD1多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:39、41、42、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81所组成的组。

根据具体实施方式，PD1多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ IDNO:39、41、42、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79和81所组成的组。

根据具体实施方式，PD1多肽包含SEQ ID NO:49或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，PD1多肽包含SEQ ID NO:49。

根据具体实施方式，PD1多肽由SEQ ID NO:49组成。

根据具体实施方式，编码PD1多肽的核酸序列与SEQ ID NO:38、40、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80或82具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，编码PD1多肽的核酸序列包含核酸序列，该核酸序列选自由SEQ ID NO:38、40、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82所组成的组。

根据具体实施方式，编码PD1多肽的核酸序列由核酸序列组成，该核酸序列选自由SEQ ID NO:38、40、44、46、48、50、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80和82所组成的组。

根据具体实施方式，异二聚体包含SIRPα多肽。

如本文所用，术语“SIRPα(信号调节蛋白α，也称为CD172a)”是指由SIRPA基因(基因ID 140885)编码的多肽。根据具体实施方式，SIRPα是人SIRPα。根据一个具体实施方式，SIRPα是指人SIRPα，例如在以下GenBank编号NP_001035111、NP_001035112、NP_001317657或NP_542970中提供的。

根据具体实施方式，SIRPα氨基酸序列包含SEQ ID NO:83。

根据具体实施方式，SIRPα氨基酸序列由SEQ ID NO:83组成。

SIRPα的已知结合对是CD47。根据一个具体实施方式，CD47蛋白是指人蛋白，例如在以下GenBank编号NP_001768或NP_942088中提供的。

根据具体实施方式，SIRPα多肽结合CD47，Kd为0.1μM至100μM、0.1μM至10μM、1μM至10μM、0.1μM至5μM或1μM至2μM，如通过SPR分析确定的，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含所述SIRPα的胞外结构域或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含SEQ ID NO:85或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含SEQ ID NO:85。

根据具体实施方式，SIRPα多肽由SEQ ID NO:85组成。

术语“SIRPα多肽”还包括表现出所需活性(即结合CD47)的功能同源物。此类同源物可以是例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于本文公开的多肽SEQ ID NO:83或85或任何其它SIRPα氨基酸序列；或至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同于编码其的所述多核苷酸序列(如下文进一步所述)。

根据具体实施方式，SIRPα多肽可以包含保守的和非保守的氨基酸取代。此类取代在本领域中已知，并公开于如下文献：Weiskopf K等人，科学(Science)(2013),341(6141):88-91，其内容通过引用完全并入本文。

根据具体实施方式，一个或多个氨基酸突变位于选自L4、V6、A21、A27、I31、E47、K53、E54、H56、V63、L66、K68、V92和F96的氨基酸残基，对应于SEQ ID NO:85所示的SIRPα氨基酸序列。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含选自由L4、A27、E47和V92组成的组的氨基酸残基处的突变，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:85所示的SIRPα氨基酸序列。

根据具体实施方式，一个或多个氨基酸突变选自由L4V或I4I；V6I或V6I；A21V、A27I或A27L；I31F或I31T；E47V或E47L；K53R、E54Q、H56P或H56R；V63I、L66T或L66G；K68R、V92I；以及F94L或F94V组成的组，对应于SEQ ID NO:85所示的SIRPα氨基酸序列。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含选自由I41、A27I、E47V和V92I组成的组的突变，对应于SEQ ID NO：85中所示的SIRPα氨基酸序列。

如本文所用，短语“对应于SEQ ID NO:85中所示的SIRPα氨基酸序列”或“对应于SEQ ID NO:85”旨在包括相对于任何其它SIRPα氨基酸序列的相应氨基酸残基。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含SEQ ID NO:89或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含SEQ ID NO:89。

根据具体实施方式，SIRPα多肽由SEQ ID NO:89组成。

关于保守氨基酸和非保守氨基酸取代的其它描述在上下文中进一步提供。

本发明一些实施方式的SIRPα多肽为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于多肽SEQ ID NO:85、87、89、91或93；或至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于编码其的多核苷酸序列，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，SIRPα多肽不包含对应于SEQ ID NO：85的氨基酸节段K117-Y343。

根据具体实施方式，SIRPα多肽不包含对应于SEQ ID NO：85的氨基酸残基K117-Y343中的任一个。

根据具体实施方式，SIRPα多肽不包含对应于SEQ ID NO：85的氨基酸节段P118-Y343。

根据具体实施方式，SIRPα多肽不包含对应于SEQ ID NO：85的氨基酸残基P118-Y343中的任一个。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含100至504个氨基酸、100至500个氨基酸、150至450个氨基酸、200至400个氨基酸、250至400个氨基酸、300至400个氨基酸、320至420个氨基酸、340至350个氨基酸、300至400个氨基酸、340至450个氨基酸、100至200个氨基酸、100至150个氨基酸、100至125个氨基酸、100至120个氨基酸、100至119个氨基酸、105至119个氨基酸、110至119个氨基酸、115至119个氨基酸、105至118个氨基酸、110至118个氨基酸、115至118个氨基酸、105至117个氨基酸、110至117个氨基酸、115至117个氨基酸，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含氨基酸序列或其功能同源物(例如片段)，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：85、87、89、91和93所组成的组。

根据具体实施方式，SIRPα多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自由SEQ IDNO:85、87、89、91和93所组成的组。

根据具体实施方式，SIRPα多肽由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由SEQ IDNO:85、87、89、91和93所组成的组。

根据具体实施方式，编码SIRPα多肽的核酸序列与SEQ ID NO:86、88、90、92或94具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，编码SIRPα多肽的核酸序列包含核酸序列，该核酸序列选自由SEQ ID NO:86、88、90、92和94所组成的组。

根据具体实施方式，编码SIRPα多肽的核酸序列由核酸序列组成，该核酸序列选自由86、88、90、92和94所组成的组。

根据具体实施方式，异二聚体包含TIGIT多肽。

如本文所用，术语“TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)”是指由TIGIT基因(基因ID 201633)编码的多肽。根据具体实施方式，TIGIT是人TIGIT。根据一个具体实施方式，TIGIT是指人TIGIT，例如在以下GenBank编号NP_776160或XP_024309156中提供的人TIGIT。

根据具体实施方式，TIGIT氨基酸序列包含SEQ ID NO:106。

根据具体实施方式，TIGIT氨基酸序列由SEQ ID NO:106组成。

TIGIT的已知结合对是CD155(PVR)。根据一个具体实施方式，CD155蛋白是指人蛋白，例如在以下GenBank编号NP_001129240、NP_001129241、NP_001129242、NP_006496中提供的。

根据具体实施方式，TIGIT多肽结合CD155，Kd为0.01μM至100μM、0.1μM至100μM、0.1μM至10μM或0.1μM至5μM，如通过SPR分析确定的，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，TIGIT多肽包含TIGIT的胞外结构域或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，TIGIT多肽包含SEQ ID NO:107、113或115或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，TIGIT多肽包含SEQ ID NO:107、113或115。

根据具体实施方式，TIGIT多肽由SEQ ID NO:107、113或115组成。

根据具体实施方式，TIGIT多肽包含SEQ ID NO:113。

根据具体实施方式，TIGIT多肽由SEQ ID NO:113组成。

术语“TIGIT多肽”还包括表现出所需活性(即结合CD155)的功能同源物。此类同源物可以是例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于本文公开的多肽SEQ ID NO:106、107、113或115或任何其它TIGT氨基酸序列；或至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同于编码其的所述多核苷酸序列(如下文进一步所述)。

根据具体实施方式，TIGIT多肽可以包含保守的和非保守的氨基酸取代。

根据具体实施方式，一个或多个氨基酸突变位于选自I42和C69的氨基酸残基处，对应于SEQ ID NO:106中所示TIGIT氨基酸序列。

根据具体实施方式，一个或多个氨基酸突变选自I42A和C69S，对应于SEQ ID NO:106中所示TIGIT氨基酸序列。

如本文所用，短语“对应于SEQ ID NO:106中所示的TIGIT氨基酸序列”或“对应于SEQ ID NO:106”旨在包括相对于任何其它TIGIT氨基酸序列的相应氨基酸残基。

根据具体实施方式，TIGIT多肽包含SEQ ID NO:109或111或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，TIGIT多肽包含SEQ ID NO:109或111。

根据具体实施方式，TIGIT多肽由SEQ ID NO:109或111组成。

根据具体实施方式，TIGIT多肽包含100至244个氨基酸、100至200个氨基酸、100至150个氨基酸、120至140个氨基酸，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，编码TIGIT多肽的核酸序列与SEQ ID NO:108、110、112或114具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

根据具体实施方式，编码TIGIT多肽的核酸序列包含核酸序列，该核酸序列选自由SEQ ID NO:108、110、112和114所组成的组。

根据具体实施方式，编码TIGIT多肽的核酸序列由核酸序列组成，该核酸序列选自由108、110、112和114所组成的组。

根据具体实施方式，异二聚体包含LILRB2多肽。

本文所用的术语“LILRB2(白细胞免疫球蛋白样受体B亚家族成员2)”是指由LILRB2基因(基因ID 10288)编码的多肽。根据具体实施方式，LILRB2是人LILRB2。根据一个具体实施方式，LILRB2是指人LILRB2，例如在以下GenBank编号NP_001074447、NP_001265332、NP_001265333、NP_001265334、NP_001265335中提供的。

LILRB2的已知结合对是主要组织相容性分子(MHC，例如HLA-G)。根据具体实施方式，LILRB2多肽结合MHC(例如HLA-G)，Kd为0.1nM至100μM、0.1nM至10μM、1nM至1μM、1nM至100nM或1nM至10nM，如通过SPR分析确定的，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含所述LILRB2的胞外结构域或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含SEQ ID NO:95或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含SEQ ID NO:95。

根据具体实施方式，LILRB2多肽由SEQ ID NO:95组成。

LILRB2的胞外结构域包含4个Ig样结构域，称为D1-D4。

因此，根据具体实施方式，LILRB2多肽的氨基酸序列包含至少一个Ig样结构域。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含至少两个Ig样结构域，至少三个Ig样结构域或四个Ig样结构域。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含LILRB2的结构域D1和D2；LILRB2的结构域D1、D2和D3；LILRB2的结构域D1、D2和D4；或LILRB2的结构域D1、D2、D3和D4。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含SEQ ID NO:96或98或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含SEQ ID NO:96或98。

根据具体实施方式，LILRB2多肽由SEQ ID NO:96或98组成。

术语“LILRB2多肽”还包括表现出所需活性(即结合MHC，例如HLA-G)的功能同源物。此类同源物可以是例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于本文公开的多肽SEQ ID NO:95、96或98或任何其它LILRB2氨基酸序列；或至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同于编码其的所述多核苷酸序列(如下文进一步所述)。

根据具体实施方式，LILRB2多肽可以包含保守的和非保守的氨基酸取代。关于保守氨基酸和非保守氨基酸取代的其它描述在上下文中进一步提供。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含100至597个氨基酸、100至500个氨基酸、100至400个氨基酸、150至400个氨基酸、300至400个氨基酸、350至400个氨基酸、150至250个氨基酸，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，LILRB2多肽包含SEQ ID NO:96。

根据具体实施方式，LILRB2多肽由SEQ ID NO:96组成。

根据具体实施方式，编码LILRB2多肽的核酸序列与SEQ ID NO:97或99具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

根据具体实施方式，编码LILRB2多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:97。

根据具体实施方式，编码LILRB2多肽的核酸序列由SEQ ID NO:97组成。

根据具体实施方式，异二聚体包含SIGLEC10多肽。

如本文所用，术语“SIGLEC-10(唾液酸结合Ig样凝集素10)”是指由SIGLEC10基因(基因ID 89790)编码的多肽。根据一个具体实施方式，SIGLEC10是指人SIGLEC10，如在以下GenBank编号NP_001164627、NP_001164628、NP_001164629、NP_001164630、NP_001164632中提供的。

根据具体实施方式，SIGLEC10氨基酸序列包含SEQ ID NO:100。

根据具体实施方式，SIGLEC氨基酸序列由SEQ ID NO:100组成。

SIGLC10的已知结合对是在CD24和/或CD52上表达的唾液酸。根据具体实施方式，SIGLEC10多肽结合CD24或CD52，Kd为1nM至100μM、0.01μM至100μM、0.01μM至10μM、0.1μM至10μM、0.1μM至5μM或0.1μM至1μM，如通过SPR分析确定的，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，SIGLEC10多肽包含SIGLEC10的胞外结构域或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，SIGLEC10多肽包含至少一个Ig样结构域。

根据具体实施方式，SIGLEC10多肽包含至少两个Ig样结构域。

根据具体实施方式，SIGLEC10多肽包含SEQ ID NO:105或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，SIGLEC10多肽包含SEQ ID NO:105。

根据具体实施方式，SIGLEC10氨基酸序列由SEQ ID NO:105组成。

术语“SIGLEC10多肽”还包括表现出所需活性(即结合CD24和/或CD52上表达的唾液酸)的功能同源物。此类同源物可以是例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或同源于多肽SEQ ID NO:100或105；或至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同于编码其的所述多核苷酸序列(如下文进一步所述)。

根据具体实施方式，SIGLEC-10多肽可以包含保守的和非保守的氨基酸取代。

根据具体实施方式，一种突变位于氨基酸残基C36处，对应于SEQ ID NO:100中所示的SIGLEC10氨基酸序列。

根据具体实施方式，一种氨基酸突变是C36S，对应于SEQ ID NO:100中所示的SIGLEC10氨基酸序列。

如本文所用，短语“对应于SEQ ID NO:100中所示的SIGLEC10氨基酸序列”或“对应于SEQ ID NO:100”旨在包括相对于任何其它SIGLEC10氨基酸序列的相应氨基酸残基。

根据具体实施方式，SIGLEC10多肽包含SEQ ID NO:103或其功能同源物(例如片段)。

根据具体实施方式，SIGLEC10多肽包含SEQ ID NO:103。

根据具体实施方式，SIGLEC-10多肽由SEQ ID NO:103组成。

根据具体实施方式，SIGLEC10氨基酸序列包含100至639个氨基酸、100至600个氨基酸、100至550个氨基酸、100至300个氨基酸、100至200个氨基酸、100至150个氨基酸，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，编码SIGLEC10多肽的核酸序列与SEQ ID NO:102或104具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

根据具体实施方式，编码SIGLEC10多肽的核酸序列包含SEQ ID NO:104。

根据具体实施方式，编码SIGLEC10多肽的核酸序列由SEQ ID NO:104组成。

根据具体实施方式，所述异二聚体包含SIRPα多肽和PD1多肽；SIRPα多肽和TIGIT多肽；SIRPα多肽和LILRB2多肽；SIRPα多肽和SIGLEC10多肽；PD1多肽和TIGIT多肽；PD1多肽和LILRB2多肽；PD1多肽和SIGLEC10多肽；TIGIT多肽和LILRB2多肽；TIGIT多肽和SIGLEC10多肽；或LILRB2多肽和SIGLEC10多肽，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，异二聚体包含SIRPα多肽和PD1多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:85中所示的SIRPα多肽和SEQID NO:49中所示的PD1多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含SIRPα多肽和LILRB2多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:85中所示的SIRPα多肽和SEQID NO:96中所示的LILRB2多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:93中所示的SIRPα多肽和SEQID NO:96中所示的LILRB2多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含SIRPα多肽和SIGLEC10多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:85中所示的SIRPα多肽和SEQID NO:103中所示的SIGLEC10多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含SIRPα多肽和TIGIT多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:85中所示的SIRPα多肽和SEQID NO:109中所示的TIGIT多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含TIGIT多肽和PD1多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:109、111或113中所示的TIGIT多肽和SEQ ID NO:49中所示的PD1多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含TIGIT多肽和LILRB2多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:109中所示的TIGIT多肽和SEQ IDNO:96中所示的LILRB2多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含TIGIT多肽和SIGLEC10多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:109中所示的TIGIT多肽和SEQID NO:103中所示的SIGLEC10多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含PD1多肽和SIGLEC10多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:49中所示的PD1多肽和SEQ IDNO:103中所示的SIGLEC10多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含LILRB2多肽和SIGLEC10多肽。

根据一个具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:96所示的LILRB2多肽和SEQ IDNO:103所示的SIGLEC10多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含PD1多肽和LILRB2多肽。

根据具体实施方式，异二聚体包含SEQ ID NO:49中所示的PD1多肽和SEQ ID NO:96中所示的LILRB2多肽。

根据具体实施方式，异二聚体不包含能够结合其天然结合对的II型膜蛋白的氨基酸序列。

如本文所用，短语“II型膜蛋白的氨基酸序列”是指能够至少结合其天然结合对的II型膜蛋白的连续氨基酸序列。根据具体实施方式，这种氨基酸序列包含II型膜蛋白的胞外结构域或其功能片段。

如本文所用，短语“II型膜蛋白”是指具有C-端胞外结构域的跨膜蛋白。

此类II型膜蛋白的非限制性示例包括4-1BBL、FasL、TRAIL、TNF-α、TNF-β、OX40L、CD40L、CD27L、CD30L、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、LIGHT、VEGI、GITRL、EDAl/2、淋巴毒素α和淋巴毒素β。

根据具体实施方式，异二聚体不包含除了本文公开的两种多肽以外的能够结合其天然结合对的I型膜蛋白的氨基酸序列。

如本文所用，短语“I型膜蛋白的氨基酸序列”是指能够至少结合天然结合对的I型膜蛋白的连续氨基酸序列。根据具体实施方式，此类氨基酸序列包含I型膜蛋白的胞外结构域或其功能片段。

如本文所用，短语“I型膜蛋白”是指具有N-端胞外结构域的跨膜蛋白。

此类I型膜蛋白的非限制性示例包括LAG3、BTN3A1、CD27、CD80、CD86、ENG、NLGN4X、CD84、CD40、IL-8、IL-10、CD164、LY6G6F、CD28、CTLA4、BTLA、LILRB1、TYROBP、ICOS、VEGFA、CSF1、CSF1R、VEGFB、BMP2、BMP3、GDNF、PDGFC、PDGFD、RAET1E、CD155、CD166、MICA、NRG1、HVEM、DR3、TEK、TGFBR(例如TGFBR1)、LY96、CD96、IT、CD244和GFER。

根据具体实施方式，除了本文公开的两种多肽以及可选的如下文进一步描述的二聚化部分(例如抗体的Fc结构域或其片段)之外，异二聚体不包含蛋白质靶向、信号传导、免疫调节部分和/或治疗部分。

此类部分的非限制性示例包括细胞因子、配体、受体、免疫调节多肽和抗体的结合结构域(例如ScFv)。

根据具体实施方式，异二聚体由本文所述的两种多肽以及可选的如下文进一步描述的二聚化部分(例如抗体的Fc结构域或其片段)组成。

根据其它具体实施方式，异二聚体连接或包含异源治疗部分。该治疗部分可以是任何分子，包括小分子化合物和多肽。

可用于本发明具体实施方式的治疗部分的非限制性示例包括细胞毒性部分、毒性部分、细胞因子部分、免疫调节部分、多肽、抗体、药物、化学和/或放射性同位素。

根据本发明的一些实施方式，通过将编码本发明的一些实施方式的所述多肽的所述多核苷酸与编码所述治疗部分的核酸序列翻译融合，使所述治疗部分缀合。

附加地或替代地，可以使用本领域技术人员已知的任何缀合方法，将治疗部分化学缀合(偶联)到本发明一些实施方式的所述异二聚体上。例如，可以使用3-(2-吡啶二硫基丙酸N-羟基丁二酰亚胺酯(也称为N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯)(“SDPD”)(Sigma公司，Cat.号：P-3415；例如，参见Cumber等人，1985，酶学方法(Methods ofEnzymology)112:207-224)、戊二醛缀合方法(例如，参见G.T.Hermanson，1996，生物缀合技术中的抗体修饰和缀合(Antibody Modification and Conjugation,in BioconjugateTechniques)，学术出版社，圣地亚哥)，或碳二亚胺缀合方法[例如，参见J.March，高级有机化学：反应、机理和结构，第349-50及372-74页(第3版)]，1985；B.Neises等人，1978，德国应用化学(Angew Chem.,Int.Ed.Engl.)17:522；A.Hassner等人，1978，四面体通讯(Tetrahedron Lett.)，4475；E.P.Boden等人，1986，有机化学(J.Org.Chem.)50:2394以及L.J.Mathias 1979，合成(Synthesis)561]。

例如，可以使用本领域广泛采用的标准化学合成技术将治疗部分连接到本发明的一些实施方式的所述异二聚体上[例如，参见HypertextTransferrprotocol://worldwideweb.chemistry.org/portal/chemistry)]，例如，使用任何合适的直接或间接化学连接，如通过肽键(当功能部分是多肽时)或通过共价键与中间连接元件(例如连接肽或其他化学部分，例如有机聚合物)。嵌合肽可通过在所述肽的羧基(C)或氨基(N)端的键连接，或通过与内部化学基团(例如直链、支链或环状侧链、内部碳原子或氮原子等)的键连接。

根据具体实施方式，异二聚体包含可检测的标签。因此，根据具体的实施方式，包含在异二聚体中的任何多肽可以包含可检测的标签。如本文所用，在一个实施方式中，术语“可检测的标签”是指可以由技术人员使用本领域已知技术检测的任何部分。可检测的标签可以是肽序列。可选地，可以通过化学试剂或通过酶促方法(例如蛋白水解)来除去可检测的标签。本发明一些实施方式的可检测的标签可用于纯化多肽或异二聚体。例如，术语“可检测的标签”包括几丁质结合蛋白(CBP)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、聚(His)标签、FLAG标签、表位标签(例如V5标签、c-myc标签和HA标签)，以及荧光标签(例如，绿色荧光蛋白(GFP)标签、红色荧光蛋白(RFP)标签、黄色荧光蛋白(YFP)标签、蓝色荧光蛋白(BFP)标签和青色荧光蛋白(CFP)标签)，以及这些标签的衍生物，或本领域已知的任何标签。术语“可检测的标签”也包括术语“可检测标记物”。

根据具体实施方式，多肽包含与其N-端连接的可检测的标签(例如聚(His)标签)。

根据具体实施方式，多肽包含与其C-端连接的可检测的标签(例如聚(His)标签)。

根据具体实施方式，多肽的N-端不包含可检测的标签(例如聚(His)标签)。

根据具体实施方式，多肽的C-端不包含可检测的标签(例如聚(His)标签)。

根据具体实施方式，异二聚体包含可切割部分。因此，根据具体实施方式，包含在异二聚体中的任何多肽可以与可切割部分融合。因此，例如，为了便于回收，可以将表达的编码序列设计成编码本发明一些实施方式的多肽和融合的可切割部分。在一个实施方式中，多肽被设计成使其易于通过亲和层析分离；例如，通过固定在特异于可切割部分的柱上。在一个实施方式中，在多肽和可切割部分之间设计切割位点，并且可通过使用在所述位点特异性切割所述融合蛋白的适当酶或试剂处理从色谱管柱释放所述肽[例如，参见Booth等人，免疫学快报(Immunol.Lett.)，19:65-70(1988)；以及Gardella等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265:15854-15859(1990)]。根据具体实施方式，异二聚体包含与本文公开的两种多肽连接的二聚化部分。

如本文所用，术语“二聚化部分”是指能够连接两种不同单体以形成异二聚体的部分。这样的二聚化部分是本领域已知的，包括化学部分和蛋白质部分。

根据具体实施方式，二聚化部分直接与多肽连接。

根据具体实施方式，二聚化部分不直接与多肽连接。

根据具体实施方式，二聚化部分与多肽共价连接。

根据具体实施方式，二聚化部分与多肽非共价连接。

根据具体实施方式，二聚化部分与多肽(或多种)是异源的。

根据具体实施方式，二聚化部分是至少两种不同分子的组合物。

根据具体实施方式，二聚化部分能够在异二聚体与表达两种多肽中的至少一种的天然结合对的细胞和/或表达两种多肽的天然结合对的细胞结合时激活免疫应答。

如本文所用，短语“激活”是指刺激免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞)，其导致细胞增殖、成熟、细胞因子产生和/或诱导调节或效应功能。评价免疫细胞活化或功能的方法是本领域熟知的，包括但不限于：增殖检测(例如BRDU和胸腺嘧啶核苷掺入)、细胞毒性检测(例如铬释放)、细胞因子分泌检测(例如细胞内细胞因子染色ELISPOT和ELISA)、使用流式细胞术和多聚体(例如四聚体)检测的活化标记物如CD25、CD69和CD69的表达。

可与具体实施方式一起使用的此类二聚化部分的非限制性示例是抗体的Fc结构域，如下文进一步描述。

根据具体实施方式，二聚化部分是非蛋白质部分，例如交联剂、有机聚合物、合成聚合物、小分子等。

许多这样的非蛋白质部分是本领域已知的，并且可以从例如Santa Cruz、Sigma-Aldrich、Proteochem等公司商购获得。根据具体实施方式，非蛋白质部分是异源双官能交联剂。异源双官能交联剂具有两个不同的反应端。通常，在第一步骤中，用异源双官能试剂的一个反应基团来修饰单体；去除剩余的游离试剂。在第二步骤中，将修饰的单体与第二单体混合，然后使其与试剂的另一端的修饰的基团进行反应。最广泛使用的通过胺和巯基偶联蛋白质(最不稳定的胺反应性NHS-酯首先偶联，在去除未偶联的试剂之后，与巯基进行偶联)。巯基反应基团通常是马来酰亚胺、吡啶基二硫化物和α-卤代鲸蜡基(alpha-halocetyls)。其它交联剂包括碳二亚胺，其连接在羧基(-COOH)和伯胺(-NH₂)之间。另一种方法是将一种单体的赖氨酸残基修饰为硫醇，并通过添加马来酰亚胺基团然后在单体之间形成稳定的硫酯键来修饰第二单体。如果其中一种单体具有天然硫醇，这些基团可直接与连接到另一单体的马来酰亚胺反应。还存在具有荧光活性端的异源双官能交联剂，例如双[2-(4-叠氮基水杨基氨基)乙基]二硫醚、BASED。当没有特定基团可用于反应时，使用光活性基团，这是因为光活性基团在暴露于紫外光时会发生非特异性反应。此类异源双官能交联剂的非限制性示例包括但不限于：炔-PEG4-马来酰亚胺、炔-PEG5-N-羟基琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺基酯、叠氮基-PEG4-苯基噁二唑甲基砜、LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯))、MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼盐酸盐+1/2二氧六环)、PDPH(3-(2-吡啶二硫基)丙酰肼)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯)、SMPH(琥珀酰亚胺基-6-((b-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯)、Sulfo-KMUS(N-(κ-马来酰亚胺十二烷基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-SIAB(磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯)、3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲氧基羰基亚磺酰氯、炔丙基-PEG-酸、氨基-PEG-叔丁酯、BocNH-PEG5-酸、BMPH(N-(β-马来酰亚胺基丙酸)酰肼、三氟乙酸盐、ANB-NOS、BMPS、EMCS、GMBS、LC-SPDP、MBS、SBA、SIA、Sulfo-SIA、SMCC、SMPB、SMPH、SPDP、Sulfo-LC-SPDP、Sulfo-MBS、Sulfo-SANPAH、Sulfo-SMCC。

根据其它具体实施方式，二聚化部分是蛋白质部分。

根据其它具体实施方式，二聚化部分是蛋白质二聚体部分。

根据具体实施方式，多肽连接至二聚化蛋白质部分的N-端。

根据具体实施方式，两种多肽连接至二聚化蛋白质部分的N-端。

根据具体实施方式，多肽连接至二聚化蛋白质部分的C-端。

根据具体实施方式，两种多肽连接至二聚化蛋白质部分的C-端。

根据具体实施方式，两种多肽中的一种连接至二聚化蛋白质部分的N-端，而两种多肽中的第二种连接至二聚化蛋白质部分的C-端。

根据具体的实施方式，二聚化部分包含亲和对多肽的多个成员，所述多肽具有针对两种不同亲和互补标签的两种不同亲和部分。此类亲和对是本领域熟知的，包括但不限于：血凝素(HA)、抗HA、AviTagTM、V5、Myc、T7、FLAG、HSV、VSV-G、His、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、rhizavedin、金属亲和标签、凝集素亲和标签。本领域技术人员将知道选择哪一个标签。

根据具体实施方式，二聚化部分是抗体(例如IgG、IgA、IgD或IgE)的Fc结构域或其片段。

根据具体实施方式，Fc是IgG、IgA、IgD或IgE的。

根据具体实施方式，Fc结构域是IgG的。

根据具体实施方式，Fc结构域是IgG1或IgG4的。

根据具体实施方式，Fc结构域是人IgG4的。在SEQ ID NO:134中提供了可用于本发明具体实施方式的人IgG4 Fc结构域的非限制性示例。

根据具体的实施方式，Fc结构域是人IgG1的。在SEQ ID NOs:137和156中提供了可用于本发明具体实施方式的人IgG1 Fc结构域的非限制性示例。

根据具体实施方式，二聚化部分是Fc结构域单体。

根据其它具体实施方式，二聚化部分是Fc结构域二聚体。

有许多机制可用于使用抗体的Fc结构域生成异二聚体，例如但不限于：杵-进入-臼(knob-into-hole)或电荷对(参见Gunasekaran等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(2010)285(25):19637，其内容通过引用完全并入本文)。

因此，根据具体实施方式，Fc结构域可以包含保守的和非保守的氨基酸取代(本文也称为突变)。

当序列同一性百分比用于参比蛋白质时，人们认识到不完全相同的残基位置通常因保守的氨基酸取代而不同，氨基酸残基被具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能性质。当序列在保守取代上不同时，序列同一性百分比可以向上调整以校正取代的保守性质。因这种保守取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的方法为本领域技术人员所熟知。通常，这涉及将保守取代作为部分不匹配而非完全不匹配进行评分，从而增加所述序列同一性的百分比。因此，例如，当相同的氨基酸的评分为1，非保守取代的评分为0，保守取代的评分在0到1之间。数个保守取代的评分是根据Henikoff S和Henikoff JG的算法计算的[来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵.美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)1992,89(22):10915-9]。

下文进一步提供了关于保守氨基酸和非保守氨基酸取代的其它描述。

Fc结构域中的这种取代是本领域已知的。

可以与本发明的特定实施方式一起使用的代表性示例是“杵-进入-臼”(“KIH”)形式。此类杵及臼突变在本领域中是众所周知的，并公开于以下文献：美国专利US8216805；Shane Atwell等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1997)270,26-35；Cater et等人(蛋白质工程，第9卷，第7期，第617-621页，1996)；以及A.Margaret Merchant等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)1998年7月16日，其内容通过引用完全并入本文。此外，如Merchant等人，自然生物技术(Nature Biotech.)16:677(1998)所述，这些“杵及臼”突变可以与数个二硫键结合，使形成偏向于异二聚化。

因此，根据具体实施方式，其中一种单体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含杵突变，而另一单体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含臼突变。

从特定免疫球蛋白类及亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc结构域，并选择第一Fc变体用于杵突变，另一个用于臼突变，这在本领域技术人员的范围之内。可与具体实施方式一起使用的多个取代的多个非限制性示例包括：S228P、L235E、T366W、Y349C、T366S、L368A、Y407V和/或E356C[根据EU编号(Kabat,E.A.、T.T.Wu、M.Reid-Miller、H.M.Perry和K.S.Gottesman.1987，具有免疫学意义的蛋白质序列，美国卫生与公众服务部，Bethesda公司)作为全长抗体的一部分，与人IgG4相对应]，或L234A、L235A、Y349C、T366W、T354C、D356C、T366S，L368A和/或Y407V[根据EU编号(Kabat,E.A.、T.T.Wu、M.Reid-Miller、H.M.Perry和K.S.Gottesman.1987，具有免疫学意义的蛋白质序列，美国卫生与公众服务部，Bethesda公司)作为全长抗体的一部分，与人IgG1相对应]。

在SEQ ID NOs:135、157、158和163中提供了可以与本发明的具体实施方式一起使用的包含杵突变的IgG4 Fc结构域的非限制性示例。

在SEQ ID NOs:136、159和164中提供了可以与本发明的特定实施方式一起使用的包含臼突变的IgG4 Fc结构域的非限制性示例。

在SEQ ID NOs:27、51、154和160中提供了可以与本发明的具体实施方式一起使用的包含杵突变的IgG1 Fc结构域的非限制性示例。

在SEQ ID NOs:28、52、152、161和162中提供了可以与本发明的具体实施方式一起使用的包含臼突变的IgG1 Fc结构域的非限制性示例。

根据具体实施方式，Fc结构域包含氨基酸序列，其与选自由SEQ ID NO:27、28、51、52、134、135、136、137、152、154、156、157、158、159、160、161、162、163和164组成的组的氨基酸序列或表现出本文公开的所需活性的其功能片段，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性或同源性；或与编码其的多核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

根据具体实施方式，Fc结构域包含选自SEQ ID NO:135-136、27-28或51-52的氨基酸序列。

根据具体实施方式，Fc结构域被修饰以改变其与Fc受体的结合，降低其免疫激活功能和/或提高融合体的半衰期。

根据具体实施方式，当已知天然结合对在健康细胞上表达时，Fc结构域被修饰以减少其与Fc受体的结合和/或其免疫激活功能。

根据一个具体实施方式，SIRPα-LILRB2异二聚体被修饰以减少其与Fc受体的结合和/或其免疫激活功能。

根据其它具体实施方式，Fc结构域未被修饰以改变其与Fc受体的结合，降低其免疫激活功能和/或提高融合体的半衰期。

根据具体实施方式，当已知天然结合对仅在病理细胞(例如癌细胞)上表达或过表达时，Fc结构域不被修饰以改变其与Fc受体的结合和/或降低其免疫激活功能。

根据一个具体实施方式，TIGIT-PD1异二聚体包含Fc结构域，该结构域未被修饰以改变其与Fc受体的结合和/或降低其免疫激活功能。

根据具体实施方式，Fc结构域被修饰以减少或防止体内与Fc受体(例如Fc.γRI、Fc.γRII和Fc.γRIII)的结合。例如，Clark及其同事已经描述了此类修饰，他们设计并描述了一系列突变IgG1、IgG2和IgG4 Fc结构域及其FcγR结合特性(Armour等人，1999；Armour等人，2002，其内容通过引用完全并入本文)。CHAPPEL和同事(美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci)(1991)88:9036-9040，其内容通过引用完全并入本文)描述了对人lgG1的Fc进行额外或替代性修饰以减少其与Fc受体的结合，他们识别了氨基酸L234和L235[根据EU编号(Kabat等人)对应于全长抗体]对于Fc受体结合是必需的。P329对G的其他取代甚至使结合更弱，这种LALA-PG取代组合描述如下文献：Schlothauer,T.等人(2016)蛋白质工程设计与选择(Protein Eng.Des.Sel.)29,457-466；公开号为WO2012/130831的国际专利申请，其内容通过引用完全并入本文。对人IgG4的Fc进行额外或替代性修饰，以防止Fab臂交换并减少其与Fc受体的结合，描述于如下文献：John-Paul Silva等人(生物化学杂志290:9,5462-5469，其内容通过引用完全并入本文)和Newman等人(临床免疫学(2001)98:2，其内容通过引用完全并入本文)，其分别识别了S228P和L235E[根据EU编号(Kabat等人)对应于全长抗体]。

根据具体实施方式，Fc结构域被修饰以最大化FcγRIIIa结合。此类修饰描述于例如如下文献：Shields RL，生物化学杂志(J Biol Chem.)(2001)276:6591；Smith P，美国科学院学刊(Proc Natl Acad Sci USA.)(2012)109:6181；Stavenhagen等人，癌症研究(Cancer Res)(2007)67:8882；Lazar等人，美国科学院学刊(Proc Natl Acad Sci USA.)(2006)103:4005；Richards等人，2008，癌症治疗(Cancer Ther)7:2517；以及Mimoto等人，(2013)美国医学期刊(MAbs)5:229，其内容通过引用完全并入本文。可以与具体实施方式一起使用的此类修饰的非限制性示例包括选自S298、E333和K334(例如S298A、E333A、K334A)；G236A、S239A、A330L和I332E；F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；S239D、I332E和A330L；236A、S239D和I332E的一个或多个氨基残基中的取代[根据EU编号(Kabat等人)对应于全长抗体]；以及在一条重链中的不对称取代-L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A和在相对的重链中的不对称取代-D270E/K326D/A330M/K334E。

根据具体实施方式，Fc结构域被修饰以改变效应功能，例如减少补体结合和/或减少或消除补体依赖性细胞毒性。此类修饰描述于例如如下文献：美国专利US5,624,821和US5,648,260、美国专利US6,194,551、WO99/51642；Wines等人，2000；Idusogie等人，(2000)免疫学杂志(J.Immunol.)164:4178；Tao等人，(1993)实验医学杂志(J.Exp.Med.)178:661；以及Canfield&Morrison(1991)实验医学杂志(J.Exp.Med.)173:1483，其内容通过引用完全并入本文。可以与具体实施方式一起使用的此类修饰的非限制性示例包括在选自以下位置处的一个或多个氨基残基中的取代[根据EU编号(Kabat等人)对应于全长抗体]：234、235、236、237、297、318、320和322；329、331和322；L234和/或L235(例如L234A和/或L235A)；D270、K322、P329和P331(例如D270A、K322A、P329A和P331A)。

根据具体实施方式，Fc结构域被修饰以提高融合蛋白的半衰期。此类修饰描述于例如如下文献：美国专利US5,869,046和美国专利US6,121,022，其内容通过引用完全并入本文。例如，在选自[根据EU编号(Kabat等人)对应于全长抗体]252(如，引入Thr)、254(例如，引入Ser)和256(例如，引入Phe)的位置处的一个或多个氨基酸的取代。提高半衰期的另一种修饰可以是通过改变CH1或CL区域来引入补救受体基序，例如在IgG的Fc区的CH₂结构域的两个环中发现的。

例如，以下文献中还描述了最大化FcRn结合和延长半衰期：Stapleton NM，自然通讯(Nat Commun.)(2011)2:599；Shields RL.，生物化学杂志(J Biol Chem.)(2001)276:6591；Dall’acqua WF，免疫学杂志(J.Immunol.)(2002)169:5171；Zalevsky J，自然生物科技(Nat Biotechnol.)(2010)28:157；Ghetie V.，自然生物科技(Nat Biotechnol.)(1997)15:637；以及Monnet C，美国医学期刊(MAbs)(2014)6:422，其内容通过引用完全并入本文。可以与具体实施方式一起使用的此类修饰的非限制性示例包括在选自以下一个或多个氨基残基中的取代[根据EU编号(Kabat等人)对应于全长抗体]：Arg435His；Asn434Ala；Met252Tyr、Ser254Thr和Thr256Glu；Met428Leu和Asn434Ser；Thr252Leu、Thr253Ser和Thr254Phe；Glu294delta、Thr307Pro和Asn434Tyr；Thr256Asn、Ala378Val、Ser383Asn和Asn434Tyr。

根据具体实施方式，二聚化部分包含亮氨酸拉链(leucine zipper)或螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)。

根据具体实施方式，包含在异二聚体中的每个部分可以包含连接体，在这些部分之间，例如在多肽(例如SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2、SIGLEC10)和二聚化部分之间分开。

根据其它具体实施方式，异二聚体在多肽(例如SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2、SIGLEC10)和二聚化部分之间不包含连接体。

本领域已知的任何连接体可以与本发明的具体实施方式一起使用。

根据具体实施方式，连接体可衍生自天然存在的多结构域蛋白质或经验连接体(empirical linker)，例如，描述于以下文献：Chichili等人，2013，蛋白质科学(ProteinSci.)22(2):153-167；Chen等人，2013，先进药物输送评论(Adv Drug Deliv Rev.)65(10):1357-1369，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，可以使用连接体设计数据库及数个计算机程序来设计所述连接体，例如，描述于如下文献中的那些：Chen等人，2013，先进药物输送评论(Adv Drug Deliv Rev.)65(10):1357-1369，以及Crasto等人，2000，蛋白质工程(Protein Eng.)13(5):309-312，其内容通过引用完全并入本文。

根据具体实施方式，连接体是合成的连接体，例如PEG。

根据具体实施方式，连接体可以是功能性的。例如，但不限于，连接体可以起到改善异二聚体的折叠和/或稳定性、改善表达、改善药代动力学和/或改善生物活性的作用。在另一个实例中，连接体可以起将异二聚体靶向特定细胞类型或位置的作用。

根据具体实施方式，连接体是多肽。

多肽连接体的非限制性示例包括具有如下序列的连接体：LE,GGGGS(SEQ ID NO:124)、(GGGGS)_n(n＝1-4)(SEQ ID NO:123)、GGGGSGGGG(SEQ ID NO:122)、(GGGGS)x2(SEQID NO:125)、(GGGGS)x2+GGGG(SEQ ID NO:121)、(GGGGS)x3(SEQ ID NO:117)、(GGGGS)x4(SEQ ID NO:118)、(Gly)₈(SEQ ID NO:119)、(Gly)₆(SEQ ID NO:120)、(EAAAK)n(n＝1-3)(SEQ ID NO:126)、A(EAAAK)_nA(n＝2-5)(SEQ ID NO:127)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:128)、A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A(SEQ ID NO:129)、PAPAP(SEQ ID NO:130)、K ESGSVSS EQLAQ FRS LD(SEQ ID NO:131)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:132)、GSAGSAAGSGEF(SEQ IDNO:133)和(XP)_n，其中X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。

根据具体实施方式，连接体包含SEQ ID NO:117(例如但不限于作为LILRB2多肽和Fc结构域之间的连接体)。

根据具体实施方式，连接体包含SEQ ID NO：125(例如但不限于作为SIRPα、PD1、TIGIT或SIGLEC10多肽与Fc结构域之间的连接体)。

根据具体实施方式，连接体的长度为1至6个氨基酸。

根据具体实施方式，连接体基本上由甘氨酸和/或丝氨酸残基(例如约30％，或约40％，或约50％，或约60％，或约70％，或约80％，或约90％，或约95％，或约97％或100％的甘氨酸和丝氨酸)组成。

根据具体实施方式，连接体是单个氨基酸连接体。

在本发明的一些实施方式中，一个氨基酸是甘氨酸。

根据具体实施方式，连接体不是抗体的Fc结构域或铰链区或其片段。

本文公开的异二聚体包含选自SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10的两种多肽。此类异二聚体的可能排列的非限制性示例示意性地显示在图1A中。

根据具体实施方式，异二聚体排列选自图1A的图(panel)1至图6中所示的排列，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，两种多肽包含在异二聚体的单体中。可以与本发明的具体实施方式一起使用的这种异二聚体排列的非限制性示例显示在图1A的图1至图2中。

因此，根据具体实施方式，异二聚体的单体中的一种是包含两种多肽的融合多肽。

根据具体实施方式，异二聚体的单体中的一种是融合多肽，该融合多肽包含通过蛋白质二聚化部分(例如抗体的Fc结构域或其片段)连接的两种多肽。

如本文所用，术语“融合多肽”是指具有两个或多个部分的氨基酸序列，所述两个或多个部分在自然界中不一起存在于单个氨基酸序列中。

根据具体实施方式，异二聚体的单体中的一种是融合多肽，该融合多肽包含通过含有杵突变的抗体的Fc结构域或其片段连接的两种多肽，而另一种单体包含含有臼突变的抗体的Fc结构域或其片段。

根据具体实施方式，异二聚体的单体中的一种是融合多肽，该融合多肽包含通过含有臼突变的抗体的Fc结构域或其片段连接的两种多肽，而另一种单体包含含有杵突变的抗体的Fc结构域或其片段。

根据其它具体实施方式，两种多肽中的每一种都是异二聚体中的单体。可以与本发明的具体实施方式一起使用的此类异二聚体排列的非限制性示例显示在图1A的的图1至图6中。根据一个具体实施方式，异二聚体排列如图1A的图5所示。

根据具体实施方式，异二聚体包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含与蛋白质二聚化部分(例如抗体的Fc结构域或其片段)连接(例如作为翻译融合)的两种多肽中的一种；所述第二单体包含与蛋白质二聚化部分(例如抗体的Fc结构域或其片段)连接(例如作为翻译融合)的两种多肽中的第二种。

根据具体实施方式，异二聚体包含第一单体和第二单体，所述第一单体包含与抗体的Fc结构域或其片段连接(例如作为翻译融合)的两种多肽中的一种，该抗体的Fc结构域或其片段包含杵突变；所述第二单体包含与抗体的Fc结构域或其片段连接(例如作为翻译融合)的两种多肽中的第二种，该抗体的Fc结构域或其片段包含臼突变。

根据具体的实施方式，异二聚体组合物和排列选自图1B中示意性示出的异二聚体，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

可用于本发明具体实施方式的异二聚体的非限制性实例示于下表1中。

根据具体实施方式，所述异二聚体包含含有SIRPα多肽的单体，所述SIRPα多肽包含与SEQ ID NO:1或5具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有PD1多肽的单体，所述PD1多肽包含与SEQ ID NO:3或7具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:1的单体和含有SEQ ID NO:3的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:1中所示的单体和如SEQ ID NO:3中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:5的单体和含有SEQ ID NO:7的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:5中所示的单体和如SEQ ID NO:7中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有TIGIT多肽的单体，所述TIGIT多肽包含与SEQ ID NO:9或13具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有LILRB2多肽的单体，所述LILRB2多肽包含与SEQ ID NO:11或15具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:9的单体和含有SEQ ID NO:11的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:9中所示的单体和如SEQ ID NO:11中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:13的单体和含有SEQ ID NO:15的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:13中所示的单体和如SEQ ID NO:15中所示的单体。

根据具体实施方式，所述异二聚体包含含有SIRPα多肽的单体，所述SIRPα多肽包含与SEQ ID NO:1、5、17、138、140、142或144具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％的、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有LLIRB2多肽的单体，所述LLIRB2多肽包含与SEQ IDNO:11、15、19或150具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，所述异二聚体包含含有SIRPα多肽的单体，所述SIRPα多肽包含与SEQ ID NO:1、5或17具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有LLIRB2多肽的单体，所述LLIRB2多肽包含与SEQ ID NO:11、15或19具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:1的单体和含有SEQ ID NO:11的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:1中所示的单体和如SEQ ID NO:11中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:5的单体和含有SEQ ID NO:15的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:5中所示的单体和如SEQ ID NO:15中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:17的单体和含有SEQ ID NO:19的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:17中所示的单体和如SEQ ID NO:19中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:138的单体和含有SEQ ID NO:11的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:138中所示的单体和如SEQ IDNO:11中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:140的单体和含有SEQ ID NO:15的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:140中所示的单体和如SEQ IDNO:15中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:142的单体和含有SEQ ID NO:150的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:142中所示的单体和如SEQ IDNO:150中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:144的单体和含有SEQ ID NO:150的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:144中所示的单体和如SEQ IDNO:150中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有LILRB2多肽的单体，所述LILRB2多肽包含与SEQ ID NO:21或22具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有PD1多肽的单体，所述PD1多肽包含与SEQ ID NO:3或7具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:21的单体和含有SEQ ID NO:3的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:21中所示的单体和如SEQ ID NO:3中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:22的单体和含有SEQ ID NO:7的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:22中所示的单体和如SEQ ID NO:7中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SIGLEC10多肽的单体，所述SIGLEC10多肽包含与SEQ ID NO:24或25具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有PD1多肽的单体，所述PD1多肽包含与SEQ ID NO:3或7具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:24的单体和含有SEQ ID NO:3的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:24中所示的单体和如SEQ ID NO:3中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:25的单体和含有SEQ ID NO:7的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:25中所示的单体和如SEQ ID NO:7中所示的单体。

根据具体实施方式，所述异二聚体包含含有SIRPα多肽的单体，所述SIRPα多肽包含与SEQ ID NO:1或5具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；并包含含有SIGLEC10多肽的单体，所述SIGLEC10多肽包含与SEQ ID NO:29或30具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:1的单体和含有SEQ ID NO:29的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:1中所示的单体和如SEQ ID NO:29中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:5的单体和含有SEQ ID NO:30的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:5中所示的单体和如SEQ ID NO:30中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有TIGIT多肽的单体，所述TIGIT多肽包含与SEQ ID NO:9或13具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有SIGLEC10多肽的单体，所述SIGLEC10多肽包含与SEQ ID NO:29或30具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:9的单体和含有SEQ ID NO:29的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:9中所示的单体和如SEQ ID NO:29中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:13的单体和含有SEQ ID NO:30的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:13中所示的单体和如SEQ ID NO:30中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SIGLEC10多肽的单体，所述SIGLEC10多肽包含与SEQ ID NO:24或25具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有LILRB2多肽的单体，所述LILRB2多肽包含与SEQ ID NO:11或15具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:24的单体和含有SEQ ID NO:11的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:24中所示的单体和如SEQ ID NO:11中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:25的单体和含有SEQ ID NO:15的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:25中所示的单体和如SEQ ID NO:15中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有TIGIT多肽的单体，所述TIGIT多肽包含与SEQ ID NO:9、13、31、33或146具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同；并包含含有PD1多肽的单体，所述PD1多肽包含与SEQ ID NO:3、7或148具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有TIGIT多肽的单体，所述TIGIT多肽包含与SEQ ID NO:9、13、31或33具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有PD1多肽的单体，所述PD1多肽包含与SEQ ID NO:3或7具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:9的单体和含有SEQ ID NO:3的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:9中所示的单体和如SEQ ID NO:3中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:13的单体和含有SEQ ID NO:7的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:13中所示的单体和如SEQ ID NO:7中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:31的单体和含有SEQ ID NO:7的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:31中所示的单体和如SEQ ID NO:7中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:33的单体和含有SEQ ID NO:7的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:33中所示的单体和如SEQ ID NO:7中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:146的单体和含有SEQ ID NO:148的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:146中所示的单体和如SEQ IDNO:148中所示的单体。

根据具体实施方式，所述异二聚体包含含有SIRPα多肽的单体，所述SIRPα多肽包含与SEQ ID NO:1或5具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并包含含有TIGIT多肽的单体，所述TIGIT多肽包含与SEQ ID NO:35或36具有如下同一性的氨基酸序列：至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:1的单体和含有SEQ ID NO:35的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:1中所示的单体和如SEQ ID NO:35中所示的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含含有SEQ ID NO:5的单体和含有SEQ ID NO:36的单体。

根据具体实施方式，异二聚体包含如SEQ ID NO:5中所示的单体和如SEQ ID NO:36中所示的单体。

根据具体实施方式，本文公开的异二聚体是可溶的(即，未固定到合成的或天然存在的表面)。

根据具体实施方式，本文公开的异二聚体被固定到合成的或天然存在的表面上。

根据本发明的附加的或替代的方面，提供了包含本文公开的异二聚体的组合物，其中异二聚体是所述组合物中两种多肽的主要形式。

确定二聚化，特别是异二聚化的方法在本领域中是熟知的，并在上下文中进一步描述。

根据具体实施方式，主要形式包含至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％，每种可能性代表本发明的一个单独实施方式。

根据具体实施方式，本文所述的异二聚体或包含该异二聚体的组合物的产量、稳定性、活性、选择性和/或安全性高于包含含有相同的两种多肽的同型二聚体的组合物的产量、稳定性、活性、选择性和/或安全性，其中该同型二聚体是组合物中两种多肽的主要形式，分离的单体包含相同的两种多肽和/或作为单一试剂的两种多肽中的每一种。

根据具体实施方式，本文所述的异二聚体或包含该异二聚体的组合物的产量、稳定性、活性、选择性和/或安全性高于抗体(例如，靶向本文所述的两种多肽的天然结合对的双特异性抗体)的产量、稳定性、活性、选择性和/或安全性。

根据具体实施方式，增加的选择性和/或安全性可以通过仅在异二聚体与两种多肽的天然结合对结合(例如，与仅表达天然结合对中的一种的细胞相比，表达异二聚体的两种多肽的天然结合对的细胞)时的选择性活性来证明。在具体的实施方式中，当二聚化部分是Fc结构域时，选择性和/或安全性可以通过仅在与两种多肽的天然结合对结合时Fc受体的结合和/或激活来表现。

根据具体实施方式，术语“更高的”是指统计学上显著的增加。

根据具体实施方式，术语“更高的”是指增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少5倍。

根据具体实施方式，与作为单一试剂的两种多肽中的每一种相比，本文所述的异二聚体或包含异二聚体的组合物具有组合改善的活性。如本文所用，短语“组合改善的活性”是指至少相加的，但优选协同改善的活性。

根据具体实施方式，本文所述的异二聚体或包含该异二聚体的组合物的聚集体的量比包含含有相同的两种多肽的同型二聚体的组合物的聚集体的量低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，其中同型二聚体是组合物中两种多肽的主要形式，分离的单体包含相同的两种多肽和/或作为单一试剂的两种多肽中的每一种。

由于本发明的一些实施方式的异二聚体包含选自SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10的两种多肽，因此，该异二聚体可用于体外、离体和/或体内激活免疫细胞的方法中。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种激活免疫细胞的方法，该方法包括在异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统，或包含异二聚体的宿主细胞的存在下体外激活免疫细胞。

根据具体实施方式，免疫细胞包括外周单核血细胞(PBMC)。

如本文所用，术语“外周单核血细胞(PBMC)”是指具有单核的血细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞(DC)。

根据具体实施方式，PBMC选自树突状细胞(DC)、T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞。

根据具体实施方式，PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞。

获取PBMC的方法在本领域是众所周知的，例如从对象中抽取全血并收集在含有抗凝剂(例如肝素或柠檬酸盐)的容器中；以及单采术(apheresis)。随后，根据具体实施方式，从所述外周血纯化至少一种类型的PBMC。本领域技术人员已知用于从全血中纯化PBMC的几种方法及试剂，例如：白细胞除去法、沉积、密度梯度离心分离法(例如ficoll)、离心淘析法、分馏、例如红细胞的化学裂解(例如通过ACK)、使用细胞表面标记物以选择特定细胞类型(例如使用FACS分选仪或磁性细胞分离技术，例如可从Invitrogen、StemcellTechnologies、Cellpro、Advanced Magnetics或Miltenyi Biotec等商购获得)，以及通过例如用特定抗体以根除(例如杀死)的方法或基于阴性选择的基于亲和力的纯化(例如，使用磁性细胞分离技术、FACS分选仪和/或捕获ELISA标记物)来消除特定细胞类型。此等方法描述于如下文献中：例如实验免疫学手册(THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY)，第1卷至第4卷(D.N.Weir编辑)，以及流式细胞术和细胞分选(A.Radbruch编辑，德国斯普林格出版社(Springer Verlag)2000)。

根据具体实施方式，免疫细胞包括肿瘤浸润淋巴细胞。

如本文所用，术语“肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)”是指在所述血流中迁移并进入肿瘤的单核白细胞。

根据具体实施方式，TIL选自由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成的组。

获取TIL的方法在本领域中是众所周知的，例如通过例如活检(biopsy)或尸检(necropsy)从对象获取肿瘤样本并制备其单细胞悬浮液。可以任何合适的方式获得所述单细胞悬浮液，例如机械的方式(使用GentleMACS^TM解离器，Miltenyi Biotec公司，加州奥本市，来解离肿瘤)或酶促的方式(例如，胶原酶或DNA酶)。随后，可以从细胞悬浮液中纯化至少一种类型的TIL。本领域技术人员已知用于纯化所需类型TIL的几种方法及试剂，例如，使用细胞表面标记物以选择特定细胞类型(例如使用FACS分选仪或磁性细胞分离技术，例如可从Invitrogen、Stemcell Technologies、Cellpro、Advanced Magnetics或MiltenyiBiotec等商购获得)以及通过特定抗体以根除(如杀死)或基于阴性选择的亲和纯化(例如，使用磁性细胞分离技术、FACS分选仪和/或捕获ELISA标记物)等方法来消除特定细胞类型。此等方法描述于如下文献：例如实验免疫学手册(THE HANDBOOK OF EXPERIMENTALIMMUNOLOGY)，第1卷至第4卷(D.N.Weir编辑)，以及流式细胞术和细胞分选(A.Radbruch编辑，德国斯普林格出版社(Springer Verlag)2000)。

根据具体实施方式，免疫细胞包括吞噬细胞。

如本文所用，术语“吞噬细胞”是指能够吞噬的细胞，并包括专职性及非专职性的吞噬细胞。分析吞噬作用的方法在本领域是众所周知的，例如包括杀伤试验、流式细胞术和/或显微镜评估(活细胞成像、荧光显微术、共聚焦显微术、电子显微术)。根据具体实施方式，所述吞噬细胞选自由单核细胞、树突状细胞(DC)及粒细胞所组成的组。

根据具体实施方式，吞噬细胞包括粒细胞。

根据具体实施方式，吞噬细胞包括单核细胞。

根据具体实施方式，免疫细胞包括单核细胞。

根据具体实施方式，术语“单核细胞”是指循环单核细胞和存在于组织中的巨噬细胞(也称为单核吞噬细胞)。

根据具体实施方式，单核细胞包括巨噬细胞。通常，巨噬细胞的细胞表面表型包括CD14、CD40、CD11b、CD64、F4/80(小鼠)/EMR1(人)、溶菌酶M、MAC-1/MAC-3和CD68。

根据具体的实施方式，单核细胞包括循环单核细胞。通常，循环单核细胞的细胞表面表型包括CD14和CD16(例如CD14++CD16-、CD14++CD16、CD14++CD16+)。

根据具体实施方式，免疫细胞包含DC。

如本文所用，术语“树突状细胞(DC)”是指在淋巴组织或非淋巴组织中发现的形态相似的细胞类型的多样性群体中的任何成员。树突状细胞是一类专职性抗原递呈细胞，对HLA限制性T细胞具有较高的致敏能力。树突状细胞包括，例如：浆细胞样树突状细胞、髓样树突状细胞(包括未成熟的和成熟的树突状细胞)、朗格汉斯细胞、交错突细胞、滤泡树突状细胞。树突状细胞可以通过功能或表型识别，尤其是通过细胞表面表型识别。这些细胞的特点是其独特的形态，在细胞表面有面纱状突起，表面HLA II类表达水平介于中等至高水平，并具有向T细胞，特别是初始T细胞呈递抗原的能力(参见Steinman R等人，免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)1991,9:271-196)。通常，树突状细胞的细胞表面表型包括CDla+、CD4+、CD86+或HLA-DR。术语树突状细胞包括未成熟的及成熟的树突状细胞。

根据具体实施方式，免疫细胞包括粒细胞。

如本文所用，术语“粒细胞”是指多形核白细胞，其特征是它们的细胞质中存在颗粒。

根据具体实施方式，粒细胞包括嗜中性粒细胞。

根据具体实施方式，粒细胞包括肥大细胞。

根据具体实施方式，免疫细胞包括T细胞。

如本文所用，术语“T细胞”是指具有CD3+、T细胞受体(TCR)+的分化淋巴细胞，其具有CD4+或CD8+表型。T细胞可以是效应T细胞或调节性T细胞。

如本文所用，术语“效应T细胞”是指例如通过产生细胞因子激活或引导其他免疫细胞或具有细胞毒性活性(例如CD4+、Th1/Th2、CD8+细胞毒性T淋巴细胞)的T细胞。

如本文所用，术语“调节性T细胞”或“Treg”是指负调节其他T细胞(包括效应T细胞)以及先天免疫系统细胞的激活的T细胞。Treg细胞的特点是持续抑制效应T细胞反应。根据具体实施方式，所述Treg是CD4+CD25+Foxp3+T细胞。

根据具体实施方式，T细胞是CD4+T细胞。

根据其它具体实施方式，T细胞是CD8+T细胞。

根据具体实施方式，T细胞是记忆T细胞。记忆T细胞的非限制性示例包括具有CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7-表型的效应记忆CD4+T细胞、具有CD3+/CD4+/CD45RA-/CCR7+表型的中央记忆CD4+T细胞、具有CD3+/CD8+CD45RA-/CCR7-表型的效应记忆CD8+T细胞，以及具有CD3+/CD8+CD45RA-/CCR7+表型的中央记忆CD8+T细胞。

根据具体实施方式，T细胞包括用编码所需表达产物的核酸序列转导的工程化T细胞。

根据具体实施方式，所需表达产物是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。

如本文所用，短语“用编码TCR的核酸序列转导(transduced with a nucleicacid sequence encoding a TCR或transducing with a nucleic acid sequenceencoding a TCR)”是指从T细胞克隆可变α链及β链，所述可变α链及β链对MHC中存在的所需抗原具有特异性。用TCR转导的方法在本领域是已知的，并公开于如下文献，例如：Nicholson等人，血液学治疗进展(Adv Hematol.)2012,2012:404081；Wang and Rivière，癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)2015年3月，22(2):85-94；以及Lamers等人，癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)(2002)9,613-623。

如本文所用，短语“用编码CAR的核酸序列转导(transduced with a nucleicacid sequence encoding a CAR或transducing with a nucleic acid sequenceencoding a CAR)”是指编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的克隆，其中CAR包括抗原识别部分及T细胞激活部分。嵌合抗原受体(CAR)是人工构建的杂合蛋白质或多肽，含有与T细胞信号传导或T细胞激活域连接的抗体的抗原结合域(例如单链可变片段(scFv))。用CAR转导的方法在本领域中是已知的，并公开于如下文献，例如：Davila等人，肿瘤免疫学(Oncoimmunology)，2012年12月1日，1(9):1577-1583；癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)2015年3月，22(2):85-94；Maus等人，血液(Blood)，2014年4月24日，123(17):2625-35；Porter DL，新英格兰医学杂志(The New England journal of medicine)，2011,365(8):725-733；Jackson HJ，血液肿瘤科(Nat Rev Clin Oncol.)，2016,13(6):370-383；以及Globerson-Levin等人，分子治疗(Mol Ther.)，2014,22(5):1029-1038。

根据具体实施方式，免疫细胞包括B细胞。

如本文所用，术语“B细胞”是指具有B细胞受体(BCR)+、CD19+和/或B220+表型的淋巴细胞。B细胞的特点是能够结合特定抗原并引发体液应答。

根据具体的实施方式，免疫细胞包括NK细胞。

如本文所用，术语“NK细胞”是指具有CD16+CD56+和/或CD57+TCR-表型的分化淋巴细胞。NK的特点是它们通过激活特定的细胞溶解酶来结合并杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力，杀死表达NK激活受体配体的肿瘤细胞或其他患病细胞的能力，以及释放称为细胞因子的刺激或抑制免疫应答的蛋白质分子的能力。

根据具体实施方式，免疫细胞包括NKT细胞。

如本文所用，术语“NKT细胞”是指特化T细胞群，其表达半不变的αβT细胞受体，但也表达通常与NK细胞相关的多种分子标记物，例如NK1.1。NKT细胞包括NK1.1+和NK1.1-，以及CD4+、CD4-、CD8+和CD8-细胞。NKT细胞上的TCR是独特的，因为其识别由MHC I样分子CD1d所呈递的糖脂抗原。由于NKT细胞能够产生促进炎症或免疫耐受的细胞因子，因此它们可以具有保护作用或有害作用。

根据具体实施方式，免疫细胞获自健康对象。

根据具体实施方式，免疫细胞获自患有病状(例如癌症)的对象。

根据具体实施方式，激活是在表达两种多肽中至少一种的天然结合对或两种多肽中至少一种的外源结合对的细胞存在下进行的。

根据具体实施方式，激活是在表达两种多肽的天然结合对或两种多肽的外源结合对的细胞存在下进行的。

根据具体实施方式，外源结合对是可溶的。

根据其它具体实施方式，将外源结合对固定到固体支持物上。

根据具体实施方式，表达结合对的细胞包括病理性(患病)细胞，例如癌细胞。

根据具体实施方式，激活是在刺激剂存在下进行的，该刺激剂能够至少传递初级激活信号[例如，T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)/肽复合物的连接]，导致细胞增殖、成熟、细胞因子产生、吞噬作用和/或诱导免疫细胞的调节或效应功能。根据具体实施方式，所述刺激剂也可以传递次级共刺激信号。

确定刺激剂的量以及刺激剂与免疫细胞之间的比例的方法在本领域技术人员的能力范围内，因此在本文中不再具体说明。

刺激剂可以以抗原依赖或非依赖(即多克隆)方式激活免疫细胞。

根据具体实施方式，刺激剂包括抗原非特异性刺激物。

非特异性刺激物是本领域技术人员已知的。因此，作为非限制性示例，当免疫细胞包含T细胞时，抗原非特异性刺激物可以是能够结合T细胞表面结构并诱导T细胞的多克隆刺激的剂，例如但不限于与共刺激蛋白(例如抗CD28抗体)组合的抗CD3抗体。其他非限制性示例包括抗CD2、抗CD137、抗CD134、Notch配体，例如δ样1/4、Jaggedl/2，单独或以与抗CD3的各种组合。可诱导T细胞多克隆刺激的其他剂包括但不限于：促细胞分裂剂、PHA、PMA离子霉素、CEB及CytoStim(Miltenyi Biotech公司)。根据具体实施方式，抗原非特异性刺激物包含抗CD3及抗CD28抗体。根据具体实施方式，T细胞刺激物包括抗CD3及抗CD28包被珠，例如从Miltenyi Biotec公司获得的CD3CD28 MACSiBeads。

根据具体实施方式，刺激剂包括抗原特异性刺激物。

抗原特异性T细胞刺激物的非限制性示例包括负载抗原的抗原呈递细胞[APC，例如树突状细胞]和负载肽的重组MHC。因此，例如，T细胞刺激物可以是预载有所需抗原(例如肿瘤抗原)或用编码所需抗原的mRNA转染的树突状细胞。

根据具体实施方式，抗原是癌抗原。

如本文所用，术语“癌抗原”是指与非癌性细胞相比，癌性细胞过表达或仅表达的抗原。癌抗原可以是已知的癌抗原或癌细胞中产生的新的特异性抗原(即新抗原)。

已知癌抗原的非限制性示例包括：MAGE-AI、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-AS、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-AS、MAGE-A9、MAGE-AIO、MAGE-All、MAGE-A12、GAGE-I、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-l、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-Cl/CT7、MAGE-C2、NY-ES0-1、LAGE-1、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1和XAGE、黑素细胞分化抗原、p53、ras、CEA、MUCI、PMSA、PSA、酪氨酸酶、Melan-A、MART-I、gplOO、gp75、辅肌动蛋白-4(alphaactinin-4)、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-l、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-All、hsp70-2、KIAA0205、Mart2、Mum-2和3、neo-PAP、肌凝蛋白类I(myosin class I)、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、GnTV、Herv-K-mel、NA-88、SP17和TRP2-Int2、(MART-I)、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原(EpsteinBarr virus antigens)、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、plSOerbB-3、c-met、nm-23Hl、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、C0-029、FGF-5、0250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\170K、NYCO-I、RCASI、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、酪氨酸酶相关蛋白、TRP-1或TRP-2。

可能表达的其他肿瘤抗原在本领域是众所周知的(例如，参见W000/20581；癌症疫苗和免疫疗法(Cancer Vaccines and Immunotherapy)(2000)，Stern、Beverley及Carroll编辑，剑桥大学出版社，剑桥)。这些肿瘤抗原的序列可从公共数据库中随时获得，但也可在WO 1992/020356 AI、WO 1994/005304 AI、WO 1994/023031 AI、WO 1995/020974AI、WO1995/023874 AI及WO 1996/026214 AI中获得。

附加地或替代地，可以使用例如通过活检从所述对象获得的癌细胞来识别肿瘤抗原。

因此，根据具体实施方式，刺激剂包括癌细胞。

根据具体实施方式，激活是在抗癌剂的存在下进行的。

根据具体实施方式，免疫细胞在激活后被纯化。

因此，本发明还包括根据本发明的方法可获得的分离的免疫细胞。

根据具体实施方式，根据本发明使用和/或获得的免疫细胞可以是新鲜分离的、储存的，例如在任何阶段在例如液氮温度下长期(例如数月、数年)冷冻保存(例如冷冻)以备将来使用；和细胞系。

冷冻保存方法是本领域普通技术人员众所周知的，并且公开于例如如下文献：公开号为WO2007054160和WO2001039594的国际专利申请，以及公开号为US20120149108的美国专利申请。

根据具体实施方式，根据本发明获得的细胞可以储存在细胞库或保藏中心或储存设施中。

因此，本教导进一步建议使用本发明的分离的免疫细胞和方法作为(但不限于)过继免疫细胞疗法的来源，用于可受益于激活免疫细胞的疾病，例如过度增殖性疾病；与免疫抑制和感染有关的疾病。

因此，根据具体实施方式，本发明的方法包括在所述激活步骤后将免疫细胞过继转移到需要免疫细胞的对象。

根据具体实施方式，提供了可根据本发明的方法获得的用于过继细胞治疗的免疫细胞。

根据本发明的具体实施方式使用的细胞可以是自体的或非自体的；它们可以是同基因的或非同基因的：与对象同种异体的或异种的；每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

本教导还考虑了本发明的组合物(例如，异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸结构或系统或表达异二聚体的宿主细胞)在治疗可受益于用异二聚体治疗的疾病的方法中的用途。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种治疗可受益于用异二聚体治疗的疾病的方法，该方法包括给有需要的对象施用异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸结构或系统或包含异二聚体的宿主细胞，从而治疗所述对象的所述疾病。

根据本发明的另外的或替代的方面，提供了异二聚体、包含该异二聚体的组合物、编码该异二聚体的核酸结构或系统或表达该异二聚体的宿主细胞，用于治疗可受益于用所述异二聚体治疗的疾病。

术语“治疗”是指抑制、预防或阻止病状(疾病、病症或医学状况)的发展和/或使得病状或病状的症状减轻、缓解或消退。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法及分析来评估病状的发展，并且类似地，可以使用各种方法及分析来评估病状的减轻、缓解或消退。

如本文所用，术语“对象”包括哺乳动物，例如任何年龄和性别的人。根据具体实施方式，术语“对象”是指患有病状(疾病、病症或医学状况)的对象。根据具体实施方式，该术语涵盖有处于发展病状的风险中的个体。

根据具体实施方式，与疾病相关的细胞(例如癌细胞)表达两种多肽中至少一种的天然结合对。

根据具体实施方式，与疾病相关的细胞(例如癌细胞)表达两种多肽的天然结合对。

根据具体实施方式，所述疾病可受益于激活免疫细胞。

如本文所用，短语“可受益于激活免疫细胞的疾病”是指其中对象的免疫应答活性可能足以至少改善所述疾病的症状或延迟症状出现的疾病，然而，无论出于何种原因，所述对象在这样做时的免疫应答活性都不是优选的。

可受益于激活免疫细胞的疾病的非限制性示例包括：过度增殖性疾病、与免疫抑制相关的疾病、由药物(例如mTOR抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、类固醇)引起的免疫抑制和感染。

根据具体实施方式，所述疾病包括过度增殖性疾病。

根据具体实施方式，过度增殖性疾病包括：硬化症、纤维化、特发性肺纤维化、银屑病、系统性硬化症/硬皮病、原发性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝纤维化、预防辐射诱导的肺纤维化、骨髓纤维化或腹膜后纤维化。

根据其它具体实施方式，过度增殖性疾病包括癌症。

如本文所用，术语癌症包括恶性癌症和恶性前癌症。

关于癌症的恶变前或良性形式，可选地，所述组合物及其方法可用于阻止恶变前的癌症向恶性形式的进展。

可以通过本发明的一些实施方式的方法治疗的癌症可以是任何实体或非实体癌症和/或癌症转移。

根据具体实施方式，癌症包括恶性癌症。

可以通过本发明的一些实施方式的方法治疗的癌症可以是任何实体或非实体癌症和/或癌症转移。癌症的示例包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这种癌症的更具体的示例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer)(包括胃肠道肿瘤)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney或renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)非霍奇金淋巴瘤(NHL)；中级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤；中级别弥漫性非霍奇金淋巴瘤；高级别免疫母细胞性非霍奇金淋巴瘤；伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别淋巴母细胞性非霍奇金淋巴瘤；高级别小非分裂细胞非霍奇金淋巴瘤；大病性非霍奇金淋巴瘤(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；急性髓细胞性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病(CML)；移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、以及与斑痣性错构瘤病(phakomatose)相关的异常血管增生、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)，以及梅格斯综合征。

根据具体实施方式，所述癌症选自由以下所组成的组：乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤及多发性骨髓瘤。可用于本发明治疗的癌症状况包括转移性癌症。

根据具体实施方式，癌症包括恶性前癌症。

恶性前癌症(或癌前病变)在本领域中被充分表征和已知(例如，参见Berman JJ.和Henson DE.，2003，癌症前期分类：一种元数据方法，BMC医学信息学和决策(BMC MedInform Decis Mak.)3:8)。可通过本发明的方法进行治疗的恶性前癌症类别包括获得性小或微小的恶性前癌症、具有核异型性的获得性大病变、与进展为癌症的遗传性增生综合征一起发生的前体病变，以及获得性弥漫性增生及弥漫性化生。小或微小的恶性前癌症的示例包括HGSIL(子宫颈高级鳞状上皮内病变)、AIN(肛门上皮内瘤变)、声带发育不良、异常隐窝(结肠性的)、PIN(前列腺上皮内瘤变)。具有核异型性的获得性大病变的示例包括管状腺瘤、伴异常蛋白血症的血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)、非典型脑膜瘤、胃息肉、大斑块副银屑病、骨髓发育不良、原位乳头状移行细胞癌、难治性贫血伴母细胞增多(refractoryanemia with excess blasts)以及施奈德乳头状瘤(Schneiderian papilloma)。与进展为癌症的遗传性增生综合征一起发生的前体病变的示例包括非典型葡萄胎综合征、C细胞腺瘤病以及MEA。获得性弥漫性增生及弥漫性化生的示例包括艾滋病(AIDS)、非典型淋巴增生、骨佩吉特氏病、移植后淋巴增生性疾病，以及溃疡性结肠炎。

根据具体实施方式，所述癌症为急性髓系白血病、肛门癌、基底细胞癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤、胆管癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、滤泡性淋巴瘤、胃癌、胃食管(GE)交界癌、生殖细胞肿瘤(Germ Cell Tumors)、生殖细胞瘤(Germinomatous)(精原细胞瘤)、生殖细胞肿瘤(Germ Cell Tumors)、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、胶质肉瘤、头颈癌、肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、喉癌、平滑肌肉瘤、套细胞淋巴瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、多发性骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔(口)癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、周围神经鞘瘤(神经纤维肉瘤)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、腹膜癌、前列腺癌、肾细胞癌、唾液腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、输尿管癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。

根据具体实施方式，所述癌症为急性髓系白血病、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、结直肠癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、上皮性卵巢癌、上皮肿瘤、输卵管癌、滤泡性淋巴瘤、多形性胶质母细胞瘤、肝细胞癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或肾细胞癌。

根据具体实施方式，癌症选自由淋巴瘤、白血病和癌症(例如结肠癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌、肝细胞癌)所组成的组。

根据具体实施方式，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。

根据具体实施方式，癌症是间皮瘤[例如，恶性胸膜间皮瘤(MPM)]。

根据具体实施方式，所述白血病选自由以下所组成的组：急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞性白血病、白血病(aleukemic leukemia)、白血病性白血病(leukocythemicleukemia)、嗜碱细胞性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性粒细胞白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病(embryonal leukemia)、嗜酸性粒细胞白血病、罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞白血病(hemoblastic leukemia)、血母细胞性白血病(hemocytoblasticleukemia)、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemia)、淋巴细胞白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴性白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞性白血病、微髓母细胞白血病(micromyeloblastic leukemia)、单核细胞白血病、原始粒细胞性白血病(monocytic leukemia)、成髓细胞性白血病(myeloblasticleukemia)、髓细胞白血病、骨髓颗粒性细胞性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、奈杰利白血病、浆细胞白血病(plasma cell leukemia)、浆细胞性白血病(plasmacyticleukemia)、早幼粒细胞白血病、里德细胞白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏性白血病、干细胞白血病、亚白血病，以及未分化细胞白血病。

根据具体实施方式，白血病是早幼粒细胞白血病、急性髓细胞性白血病或慢性粒性白血病。

根据具体实施方式，癌症是淋巴瘤。

根据具体实施方式，淋巴瘤是B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

根据具体实施方式，非霍奇金淋巴瘤选自由以下所组成的组：侵袭性NHL、转化性NHL、惰性NHL、复发性NHL、难治性NHL、低级别非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞淋巴瘤，以及皮肤T细胞癌，包括蕈样肉芽肿/塞泽里综合征。

根据具体实施方式，癌症是多发性骨髓瘤。

根据至少一些实施方式，所述多发性骨髓瘤选自由以下所组成的组：产生κ型轻链和/或λ型轻链的多发性骨髓瘤癌；侵袭性多发性骨髓瘤，包括原发性浆细胞白血病(PCL)；可发展为多发性骨髓瘤的良性浆细胞疾病，例如MGUS(意义未明的单克隆丙种球蛋白病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM，也称为淋巴浆细胞性淋巴瘤)；也可能发展为多发性骨髓瘤的冒烟型多发性骨髓瘤(SMM)、惰性多发性骨髓瘤、也可能发展为多发性骨髓瘤的癌前形式；原发性淀粉样变。

根据具体实施方式，所述癌症被定义为在肿瘤微环境中存在具有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的肿瘤和/或在肿瘤微环境中具有相对高表达的天然结合对的肿瘤。

根据具体实施方式，所述疾病包括与免疫抑制或由药物(例如mTOR抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、类固醇)引起的免疫抑制相关的疾病。

根据具体实施方式，所述疾病包括HIV、麻疹、流感、LCCM、RSV、人鼻病毒、EBV、CMV或细小病毒。

根据具体实施方式，所述疾病包括感染。

如本文所用，术语“感染”或“干染性疾病”是指由病原体诱导的疾病。病原体的具体示例包括病毒病原体、细菌病原体(例如，细胞内分枝杆菌病原体(例如结核分枝杆菌))、细胞内细菌病原体(例如，单核细胞增生李斯特氏菌)或细胞内原生动物病原体(例如利什曼原虫和锥虫)。

根据本发明的教导可治疗的引起感染性疾病的病毒病原体的特定类型包括但不限于：反转录病毒、圆环病毒、细小病毒、乳多空病毒、腺病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、痘病毒、嗜肝病毒、小核糖核酸病毒、杯状病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、冠状病毒、沙粒病毒及丝状病毒。

根据本发明的教导可被治疗的病毒感染的具体示例包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)；流感；鼻病毒感染；病毒性脑膜炎；EB病毒(EBV)感染；甲型肝炎、乙型或丙型肝炎病毒感染；麻疹；乳头状瘤病毒感染/疣、巨细胞病毒(CMV)感染、单纯疱疹病毒感染、黄热病、埃博拉病毒感染、狂犬病等。

根据具体实施方式，本文公开的组合物(例如，异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统或表达异二聚体的宿主细胞)可以与其他已建立的或实验性的治疗方案联合给药于对象以治疗疾病，所述治疗方案包括但不限于：止痛剂、化疗剂、放射治疗剂、细胞毒性疗法(调理)、激素疗法、抗体和其他治疗方案(例如，手术)，这些是本领域众所周知的。

根据具体实施方式，与本发明的一些实施方式的组合物联合给药的治疗剂包含抗体。

根据具体实施方式，本文公开的组合物(例如，异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统或表达异二聚体的宿主细胞)可以与过继细胞移植联合给药于对象，所述过继细胞移植例如但不限于：骨髓细胞、造血干细胞、PBMC、脐带血干细胞和/或诱导的多能干细胞的移植。

根据具体实施方式，与本发明的一些实施方式的组合物联合给药的治疗剂包含抗癌剂。

根据具体实施方式，与本发明的一些实施方式的组合物联合给药的治疗剂包含抗感染剂(例如，抗生素和抗病毒剂)。

根据具体实施方式，与本发明的一些实施方式的组合物联合给药的治疗剂包含免疫抑制剂(例如，GCSF和其它骨髓刺激剂、类固醇)。

根据具体实施方式，联合疗法具有相加效应。

根据具体实施方式，联合疗法具有协同效应。

根据本发明的另一方面，提供了一种制品，其包括包装用于治疗疾病的治疗剂的包装材料；以及所述异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统，或包含异二聚体的宿主细胞。

根据具体的实施方式，所述制品被识别用于治疗可受益于用所述异二聚体治疗的疾病，例如可受益于激活免疫细胞的疾病。

根据具体实施方式，用于治疗所述疾病的所述治疗剂；以及所述异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统或表达异二聚体的宿主细胞被包装在单独的容器中。

根据具体实施方式，用于治疗所述疾病的所述治疗剂；以及所述异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统或表达异二聚体的宿主细胞被包装在共制剂中。

如本文所用，术语“氨基酸序列”、“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“蛋白质部分”，在本文中可互换使用，包括天然肽(降解产物、合成肽或重组肽)和肽模拟物(通常是合成肽)，以及作为肽类似物的类肽和半类肽，它们可以具有，例如修饰，使多肽在体内更稳定或更能渗入细胞。这种修饰包括但不限于N-末端修饰、C-末端修饰、肽键修饰、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟物化合物的方法是本领域熟知的，并且例如在定量药物设计(Quantitative DrugDesign，C.A.Ramsden Gd.，17.2章，F.Choplin Pergamon Press(1992))中有详细说明，该文献通过引用整体并入本文中，如同在本文中完全阐述一样。下文提供了这方面的进一步细节。

多肽内的肽键(-CO-NH-)可以被例如N-甲基化酰胺键(-N(CH₃)-CO-)、酯键(-C(＝O)-O-)、酮亚甲基键(-CO-CH₂-)、亚磺酰亚甲基键(-S(＝O)-CH₂-)、-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基(例如，甲基)、胺键(-CH₂-NH-)、硫键(-CH₂-S-)、乙烯键(-CH₂-CH₂-)、羟基乙烯键(-CH(OH)-CH₂-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、氟化烯烃双键(-CF＝CH-)、反酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH₂-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正”侧链。

这些修饰可以发生在沿着多肽链的任何键上，甚至同时发生在几个(2至3)键上。

天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以被非天然芳香族氨基酸如1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、萘基丙氨酸、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或O-甲基-Tyr取代。

本发明一些实施方式的多肽还可以包括一个或多个修饰的氨基酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。

术语“氨基酸(amino acid或amino acids)”应理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些通常在体内翻译后修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸(nor-valine)、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸。

下表2和3列出了天然存在的氨基酸(表2)和非常规或修饰的氨基酸(例如，合成的，表3)，其可以用于本发明的一些实施方式。

表2

表3

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本发明的一些实施方式的多肽优选以线性形式使用，尽管应当理解，在环化不会严重干扰多肽特性的情况下，也可以使用所述多肽的环状形式。

由于本发明的多肽优选用于需要多肽为可溶性形式的治疗，本发明一些实施方式的多肽优选包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸和苏氨酸，它们由于其含羟基侧链而能够增加多肽溶解度。

本发明多肽的氨基酸可以被保守地或非保守地取代。

如本文所用，术语“保守取代”是指用天然或非天然存在的氨基酸或具有类似空间特性(steric properties)的肽模拟物取代肽中天然序列中存在的氨基酸。如果待取代的天然氨基酸的侧链是极性或疏水性的，则保守取代应使用天然氨基酸、非天然存在的氨基酸、或具有极性或疏水性的拟肽部分(除了具有与被取代氨基酸侧链相同的空间特性之外)。

由于天然存在的氨基酸通常根据它们的性质分类，因此可以容易地确定天然存在的氨基酸的保守取代，同时考虑到根据本发明，用空间相似的不带电氨基酸取代带电氨基酸被认为是保守取代。

为了通过非天然存在的氨基酸产生保守取代，也可以使用本领域熟知的氨基酸类似物(合成氨基酸)。天然存在的氨基酸的肽模拟物在本领域技术人员已知的文献中有充分的记载。

当影响保守取代时，取代的氨基酸在侧链中应具有与原始氨基酸相同或相似的官能团。

提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。关于哪些氨基酸变化可能是表型沉默的指导也可以在以下文献中找到：Bowie等人，1990年，科学(Science)247:1306 1310中找到。此类保守修饰的变体是除了多态性变体、种间同源物及等位基因之外的变体，但不排除多态性变体、种间同源物及等位基因。典型的保守取代包括但不限于：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如，参见，Creighton，蛋白质(Proteins)，1984)。可以根据与侧链相关的性质来取代氨基酸，例如可以取代具有极性侧链的氨基酸，例如丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；基于侧链电荷的氨基酸，例如精氨酸(R)及组氨酸(H)；及可以取代具有疏水侧链的氨基酸，例如缬氨酸(V)和亮氨酸(L)。正如所指出的，变化通常具有较小的性质，例如不会显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代。

如本文所用，短语“非保守取代”是指由具有不同电化学和/或空间特性的另一天然或非天然存在的氨基酸取代亲本序列中存在的氨基酸。因此，取代氨基酸的侧链可以明显大于(或小于)被取代的天然氨基酸的侧链和/或可以具有与被取代的氨基酸具有显著不同电子特性的官能团。这种类型的非保守取代的示例包括用苯丙氨酸或环己基甲基甘氨酸取代丙氨酸，用异亮氨酸取代甘氨酸，或用-NH-CH[(CH₂)₅COOH]-CO-取代天冬氨酸。落入本发明范围内的那些非保守取代是仍然构成具有抗菌特性的肽的那些非保守取代。

本发明的肽的N端和C端可以被官能团保护。合适的官能团描述于如下文献：Green和Wuts，“有机合成中的保护基团(Protecting Groups in Organic Synthesis)”，约翰威立国际出版公司，第5章和第7章，1991，其教导通过引用并入本文。优选的保护基团是那些促进与其连接的化合物转运到细胞中的保护基团，例如，通过降低化合物的亲水性并增加化合物的亲油性。

根据具体实施方式，一种或多种氨基酸可以通过例如添加官能团来进行修饰(概念上视为“化学修饰的”)。例如，天然序列中出现的侧向氨基酸残基(side amino acidresidues)可以任选地被修饰，尽管如下文所述，除了侧向氨基酸残基之外或者代替侧向氨基酸残基，蛋白质的其他部分也可以任选地被修饰。如果进行化学合成过程，则修饰可以任选地在分子合成期间进行，例如通过添加化学修饰的氨基酸。然而，当氨基酸已经存在于分子中时，对其进行化学修饰(“原位”修饰)也是可能的。例如，可以通过基因合成、定点(site-directed)(例如，基于PCR)或随机诱变(例如，EMS)(例如，通过外切酶缺失、化学修饰或通过编码异源结构域或结合蛋白的多核苷酸序列的融合)来引入对所述肽或蛋白质的修饰。

如本文所用，术语“化学修饰”，当涉及肽时，是指其氨基酸残基中的至少一个通过天然过程如加工或其他翻译后修饰或通过本领域熟知的化学修饰技术来修饰的肽。非限制性示例性修饰类型包括：羧甲基化；乙酰化；酰化；磷酸化；糖基化；酰胺化；ADP-核糖基化；脂肪酰化；法呢基、异法呢基、碳水化合物基团、脂肪酸基团的添加；用于缀合、功能化、GPI锚形成的连接体；脂质或脂质衍生物的共价连接；甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、异戊二烯化、磷酸化、泛素化或任何类似的过程，以及已知的保护/封闭基团。醚键可以任选地用于将丝氨酸或苏氨酸羟基连接到糖的羟基上。酰胺键可任选用于将谷氨酸或天冬氨酸羧基连接到糖上的氨基上(Garg和Jeanloz，碳水化合物化学与生物化学进展(Advances inCarbohydrate Chemistry and Biochemistry)，第43卷，美国学术出版社(1985)；Kunz，德国应用化学(Ang.Chem.Int.Ed.)英语，26:294-308(1987))。还可以任选地在氨基酸及碳水化合物之间形成缩醛及缩酮键。脂肪酸酰基衍生物可以任选地例如通过游离氨基(例如赖氨酸)的酰化来制备(Toth等人，肽：化学、结构和生物学(Peptides:Chemistry,Structureand Biology)，Rivier和Marshal编辑，ESCOM Publ.,Leiden,1078-1079(1990))。

根据具体实施方式，所述修饰包括向肽添加环烷部分，如PCT申请案WO2006/050262中所述，该申请案通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述一样。这些部分被设计用于与生物分子一起使用，并且可以任选地用于赋予蛋白质各种特性。

此外，任选地，可以修饰所述肽上的任何点。例如，可以任选地进行蛋白质上糖基化部分的聚乙二醇化，如PCT申请案WO 2006/050247中所述，该申请案通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述一样。一个或多个聚乙二醇(PEG)基团可任选地添加至O-连接和/或N-连接糖基化。PEG基团可以任选地是支链的或直链的。任选地，任何类型的水溶性聚合物可以通过糖基连接体连接到蛋白质上的糖基化位点。

“PEG化蛋白质”是指具有生物活性的蛋白质或其片段，具有与蛋白质的氨基酸残基共价地结合的聚乙二醇(PEG)部分。

“聚乙二醇”或“PEG”是指聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，具有或不具有偶联剂或用偶联或激活部分(例如，用硫醇、三氟甲磺酸酯、三氟乙基磺酸单甲氧基(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷，或优选用马来酰亚胺部分)衍生化。诸如马来酰亚胺基单甲氧基PEG的化合物是本发明的示例性或激活的PEG化合物。其它聚亚烷基二醇化合物，例如聚丙二醇，可用于本发明。其他合适的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于以下类型的带电或中性聚合物：葡聚醣、多聚乙酰神经氨酸(colominic acids)或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物及生物素衍生物。

根据具体实施方式，肽被修饰以具有改变的糖基化模式(即，从原始或天然糖基化模式改变)。如本文所用，“改变的”是指缺失一个或多个碳水化合物部分，和/或具有添加至原始蛋白质的至少一个糖基化位点。

蛋白质的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。所述三肽序列、天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中，X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接到羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

通过改变肽的氨基酸序列，使其包含一个或多个上述三肽序列(用于N-连接糖基化位点)，可以方便地在肽上添加糖基化位点。也可通过在原始肽的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接糖基化位点)来进行改变。肽的氨基酸序列也可以通过在所述DNA水平上引入变化而改变。

增加肽上碳水化合物部分数量的另一方法是通过糖苷与肽的氨基酸残基的化学或酶偶联。根据所使用的偶联模式，糖可连接到：(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(e)芳香残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的残疾；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于例如文献：WO 87/05330；Aplin和Wriston，CRC，生物化学及分子生物学(Crit.Rev.Biochem.)，22:259-306(1981)。

肽上存在的任何碳水化合物部分的去除可以通过化学、酶促或通过在DNA水平上引入变化来完成。化学去糖基化需要将肽暴露于三氟甲基磺酸或等效化合物中。这种处理导致除连接糖(N-乙酰氨基葡糖或N-乙酰半乳糖胺)外的大多数或所有糖被裂解，而使所述氨基酸序列保持完整。

化学去糖基化描述如下文献：Hakimuddin等人，生物化学与生物物理文献(Arch.Biochem.Biophys.)，259:52(1987)；和Edge等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)，118:131(1981)。肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，例如，描述于如下文献：Thotakura等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)，138:350(1987)。

可以通过肽合成领域技术人员已知的任何技术，例如但不限于固相和重组技术，来合成和纯化包含本发明一些实施方式的多肽和异二聚体。

根据具体实施方式，制备多肽和/或异二聚体涉及固相肽合成。

对于固相肽合成，许多技术可以总结在以下文献中：J.M.Stewart和J.D.Young,固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis),W.H.Freeman公司(旧金山),1963，以及J.Meienhofer，荷尔蒙蛋白质和肽(Hormonal Proteins and Peptides)，第2卷，第46页，学术出版社(Academic Press)(纽约)，1973。对于经典的溶液合成，参见G.Schroder和K.Lupke,肽(The Peptides),第1卷，学术出版社(Academic Press)(纽约)，1965。

通常，这些方法包括将一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸顺序加入到生长的肽链中。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基被合适的保护基保护。然后，在适于形成酰胺键的条件下，被保护或衍生的氨基酸可以附着在惰性固体支持物上，或者通过添加序列中具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸而在溶液中使用。然后从这个新加入的氨基酸残基中除去保护基团，然后加入下一个氨基酸(适当保护的)，等等。在所有所需氨基酸以适当的顺序连接后，依次或同时除去任何剩余的保护基团(和任何固体支持物)，以提供最终的多肽化合物。通过对该通用方法的简单修改，有可能在生长的链上一次加入一个以上的氨基酸，例如，通过将保护的三肽与适当保护的二肽偶联(在不使手性中心外消旋的条件下)，在去保护后形成五肽等。肽合成的进一步描述公开于美国专利US6472505。

Andersson[生物聚合物(Biopolymers)2000,55(3):227-50]描述了大规模肽合成。

根据具体实施方式，使用体外表达系统合成包含所述多肽或异二聚体的多肽或异二聚体。

因此，本文所述的任何多肽可由多核苷酸编码。这些多核苷酸本身可用于本文公开的多肽的重组生产。

“重组”多肽是指通过重组DNA技术产生的多肽；即，由编码所需多肽的外源DNA构建体转化的细胞产生。

因此，根据本发明的另一方面，提供了一种核酸构建体或系统，其包含至少一种编码异二聚体的多核苷酸，和用于指导多核苷酸在宿主细胞中表达的调节元件。

可用于本发明具体实施方式的多核苷酸序列的非限制性示例在上文和下文表1中进行了描述。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，上述组合)的形式分离和提供的单链或双链核酸序列。

根据具体实施方式，本文公开的任何多核苷酸及核酸序列可包含保守的核酸取代。保守修饰的多核苷酸是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本相同或相关的(例如，天然连续的)序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG及GCU都编码丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置，密码子可以被改变为另一个相应密码子，而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，这是保守修饰的多核苷酸的一种。根据具体实施方式，本文所述的编码多肽的任何多核苷酸和核酸序列也描述了核酸的沉默变异。本领域技术人员会认识到，在某些情况下，核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG，和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG)都可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的多核苷酸的沉默变异隐含在关于表达产物的所述序列中。

为了在哺乳动物细胞中表达外源性多肽，优选将编码所述多肽的多核苷酸序列连接到适于哺乳动物细胞表达的核酸构建体中。此类核酸构建体包括启动子序列，用于在细胞中以组成型或诱导型方式指导多核苷酸序列的转录。

根据具体实施方式，调节元件是异源调节元件。

本发明的一些实施方式的核酸构建体(本文中也称为“表达载体”)包括其他序列，使得该载体适合在原核生物、真核生物或优选两者(例如穿梭载体)中的复制和整合。此外，典型的克隆载体还可以包含转录及翻译起始序列、转录及翻译终止子以及多聚腺苷酸化信号。举例来说，此类构建体通常将包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起点、以及3'LTR或其一部分。

本发明的一些实施方式的核酸构建体通常包括用于从放置肽的宿主细胞分泌肽的信号序列。优选地，用于此目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明一些实施方式的多肽变体的信号序列。

真核启动子通常包含两种类型的识别序列，即TATA盒和上游启动子元件。TATA盒位于转录起始位点上游25个至30个碱基对，被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA合成。其它上游启动子元件确定转录启动的速率。

优选地，本发明一些实施方式的核酸构建体所使用的启动子在转化的特定细胞群中是有活性的。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的示例包括启动子，例如肝特异性白蛋白[Pinkert等人，1987，基因与发育(Genes Dev.)1:268-277]、淋巴特异性启动子[Calame等人，1988，免疫学进展(Adv.Immunol.)43:235-275]；尤其是T细胞受体的启动子[Winoto等人，1989，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)8:729-733]；以及免疫球蛋白[Banerji等人，1983，细胞(Cell)33729-740]；神经元特异性启动子，如神经丝启动子[Byrne等人，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:5473-5477]、胰腺特异性启动子[Edlunch等人，1985，科学(Science)230:912-916]；或乳腺特异性启动子，如乳清启动子(美国专利US4873316和公开号为264166的欧洲申请案)。

增强子元件可以从连接的同源或异源启动子刺激高达1000倍的转录。当增强子位于转录起始位点的下游或上游时，增强子是具有活性的。许多来源于病毒的增强子元件具有广泛的宿主范围，并在多种组织中具有活性。例如，SV40早期基因增强子适用于多种细胞类型。适用于本发明一些实施方式的其他增强子/启动子组合包括衍生自多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(CMV)、来自各种反转录病毒(例如鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒及HIV)的长期重复序列的增强子/启动子组合。参见，增强子和真核表达(Enhancers and EukaryoticExpression)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约，1983，通过引用并入本文。

在表达载体的构建过程中，启动子优选位于距异源转录起始点与其天然设置的转录起始位点大致相同的距离。然而，如本领域所知，在不损失启动子功能的情况下，可以适应该距离的一些变化。

还可以将多聚腺苷酸化序列添加到表达载体中，以提高mRNA翻译的效率。准确有效的聚腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于聚腺苷酸化位点下游的富含GU或U的序列和位于上游11个至30个核苷酸的高度保守的六个核苷酸序列AAUAAA。适用于本发明一些实施方式的终止及聚腺苷酸化信号包括衍生自SV40的信号。

除了已经描述的元件外，本发明的一些实施方式的表达载体通常可含有其他旨在增加克隆核酸的表达水平或促进携带重组DNA的细胞的识别的专门元件。例如，许多动物病毒含有在允许的细胞类型中促进病毒基因组的染色体外复制的DNA序列。只要质粒或宿主细胞基因组携带的基因提供了合适的因子，携带这些病毒复制子的质粒就可以游离复制。

载体可能包括也可能不包括真核复制子。如果存在真核复制子，则使用适当的选择标记物在真核细胞中扩增载体。如果载体不包含真核复制子，则不可能进行游离扩增(episomal amplification)。相反地，重组DNA整合到工程细胞的基因组中，启动子在工程细胞的基因组中指导所需核酸的表达。

本发明一些实施方式的表达载体可进一步包括额外的多核苷酸序列，其允许例如翻译来自单个mRNA的几种蛋白质，例如内部核糖体进入位点(IRES)和用于启动子嵌合多肽的基因组整合的序列。

因此，根据具体的实施方式，包含在异二聚体中的两种单体由单一构建体表达。

根据其它具体实施方式，异二聚体中包含的每个单体由不同的构建体表达。

应当理解，表达载体中包含的各个元件可以多种构型排列。例如，增强子元件、启动子等，甚至编码以“头尾”构型排列的单体或异二聚体的多核苷酸序列，可以以反向互补、或互补构型、作为反平行链存在。虽然这种多种构型更有可能发生在表达载体的非编码元件，但也设想了表达载体内编码序列的替代构型。

哺乳动物表达载体的示例包括但不限于：可从Invitrogen公司获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81；可从Promega公司获得的pCI；可从Strategene公司获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV；可从Clontech公司获得的pTRES，以及其衍生物。

还可以使用包含来自真核病毒(如反转录病毒)的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7及pMT2。源于牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，源于Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO及p2O5。其他示例性载体包括pMSG；pAV009/A+；pMTO10/A+；pMAMneo-5；杆状病毒pDSVE；以及允许在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体启动子，或其他在真核细胞中有效表达的启动子的指导下表达蛋白质的任何其他载体。

如上所述，病毒是非常特殊的感染源，在许多情况下，它们进化以逃避宿主防御机制。通常，病毒会在特定的细胞类型中感染和繁殖。病毒载体的靶向特异性利用其天然特异性来特异性地靶向预定的细胞类型，从而将重组基因引入被感染的细胞。因此，本发明的一些实施方式所使用的载体的类型将取决于所转化的细胞类型。根据转化的细胞类型选择合适载体的能力完全在本领域技术人员的能力范围内，因此本文不提供选择考虑的一般描述。例如，可以使用人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)靶向骨髓细胞，可以使用存在于杆状病毒苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(baculovirus Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)中的异源启动子靶向肾细胞，描述于如下文献：Liang CY等人，2004，病毒学档案(Arch Virol.149:51-60)。

重组病毒载体可用于单体和异二聚体的体内表达，因为它们具有横向感染及靶向特异性等优点。侧向感染在例如反转录病毒的生命周期中是固有的，是单个受感染细胞产生许多子代病毒粒子的过程，这些子代病毒粒子出芽并感染相邻细胞。结果是一大片区域被迅速感染，其中大部分最初并没有被原始病毒颗粒感染。这与垂直型感染形成对比，在垂直型感染中，感染源仅通过子代传播。也可以产生无法横向传播的病毒载体。如果期望的目的是只将特定基因导入局部数量的靶细胞，则这种特性可能有用的。

可以使用各种方法将本发明一些实施方式的表达载体引入细胞。此类方法通常描述于如下文献：Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:AlaboratoryManual)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约(1989，1992)；Ausubel等人，分子生物学实验(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威立国际出版公司(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)，1989；Chang等人，体细胞基因治疗(SomaticGene Therapy)，CRC出版社，密歇根州安娜堡市，1995；Vega等人，基因打靶(GeneTargeting)，CRC出版社，密歇根州安娜堡市，1995；载体：分子克隆载体及其用途的综述，巴特沃斯，波士顿马萨诸塞州，1988；以及Gilboa等人，[生物技术(Biotechniques)4(6):504-512,1986]，并包括，例如，稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。此外，用于阳性-阴性选择方法参见美国专利US5,464,764和US5,487,992。

通过病毒感染引入核酸与其他方法(例如，脂质体感染及电穿孔)相比具有一些优势，因为由于病毒的感染性，可以获得更高的转染效率。

目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒或非病毒构建体转染，例如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒I型或腺相关病毒(AAV)和基于脂质的系统。用于脂质介导的基因转移的有用脂质为，例如：DOTMA、DOPE和DC Chol[Tonkinson等人，癌症研究(CancerInvestigation)，14(1):54-65(1996)]。用于基因治疗的最优选建构体是病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒或反转录病毒。病毒构建体，例如反转录病毒构建体包含至少一种转录启动子/增强子或位点定义元件，或通过例如交替剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰等其他方式控制基因表达的其他元件。此类载体结构还包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适用于所用病毒的正链及负链引物结合位点，除非其已经存在于病毒构建体中。此外，这种建构体通常包括用于从放置肽的宿主细胞分泌肽的信号序列。优选地，用于此目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明一些实施方式的多肽变体的信号序列。任选地，建构体还可以包括指示聚腺苷酸化的信号、以及一个或多个限制位点和翻译终止序列。举例来说，此类建构体通常将包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点、以及3'LTR或其部分。可以使用其他非病毒载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸及树状聚合物。

如前所述，除了包含用于插入的编码序列的转录及翻译的必要元件外，本发明的一些实施方式的表达构建物还可以包括经设计以增强所表达的单体或异二聚体的稳定性、产生、纯化、产率或毒性的序列。例如，包含本发明一些实施方式的单体或异二聚体及异源蛋白质的融合蛋白或可切割融合蛋白的表达可被工程化。可以设计这样的融合蛋白，使得可以通过亲和层析容易地分离该融合蛋白；例如，通过固定在异源蛋白质的特定管柱上。如果在本发明的一些实施方式的单体或异二聚体及异源蛋白质之间设计切割位点，则可以通过用破坏裂解位点的适当酶或剂处理将单体或异源二聚体从色谱柱中释放出来[例如，参见Booth等人，免疫学通讯(Immunol.Lett.)19:65-70；以及Gardella等人，1990，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265:15854-15859]。

本发明还涵盖包含本文所述的组合物的细胞。

因此，根据本发明的一个方面，提供了包含异二聚体或核酸构建体或系统的宿主细胞。

如上所述，多种原核或真核细胞可用作宿主表达系统，以表达本发明一些实施方式的异二聚体。这些包括但不限于微生物，例如用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、CaMV、烟草花叶病毒、TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统。哺乳动物表达系统也可用于表达本发明一些实施方式的多肽。

细菌构建体的示例包括大肠杆菌表达载体的pET系列[Studier等人，1990，酶学方法(Methods in Enzymol.)185:60-89]。

可与本发明的教导一起使用的真核细胞的示例包括但不限于：哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、藻类细胞或植物细胞。

在酵母中，可以使用含有组成型或诱导型启动子的许多载体，如美国专利申请US5,932,447中所公开的。或者，可以使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。

在使用植物表达载体的情况下，编码序列的表达可由多个启动子驱动。例如，可以使用CaMV的35S RNA和19S RNA启动子等病毒启动子[Brisson等人，1984，自然(Nature)310:511-514]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等人，1987，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)6:307-311]。或者，可以使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚基[Coruzzi等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)3:1671-1680，以及Brogli等人，1984，科学(Science)224:838-843]，或热激蛋白启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人，1986，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)6:559-565]。可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔及本领域技术人员熟知的其他技术将这些构建体引入植物细胞。例如，参见Weissbach&Weissbach，1988，植物分子生物学方法(Methods forPlant Molecular Biology)，植物分子生物学方法(Methods for Plant MolecularBiology)(1988),美国学术出版社(Academic Press),NY，第VIII节，第421-463页。

本领域众所周知的其它表达系统，如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统，也可用于本发明的一些实施方式。

根据具体实施方式，细胞是哺乳动物细胞。

根据具体实施方式，细胞是人细胞。

根据一个具体实施方式，所述细胞是细胞系。

根据另一个具体实施方式，所述细胞是原代细胞。

所述细胞可以来自合适的组织，包括但不限于：血液、肌肉、神经、大脑、心脏、肺、肝脏、胰腺、脾脏、胸腺、食道、胃、肠、肾、睾丸、卵巢、头发、皮肤、骨、乳房、子宫、膀胱、脊髓或各种体液。这些细胞可能来自任何发育阶段(包括胚胎、胎儿及成人阶段)，以及发育起源(即外胚层、中胚层及内胚层起源)。

哺乳动物细胞的非限制性示例包括：由SV40转化的猴肾CV1系(COS，例如COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(HEK293或HEK293细胞亚克隆，用于悬浮培养生长，Graham等人，普通病毒学杂志(J.Gen Virol.)，36:59 1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK、ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251 1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa、ATCC CCL 2；NIH3T3、Jurkat、犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34)；水牛-大鼠肝细胞(BRL3A、ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138、ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2、HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562、ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，纽约科学院年报(AnnalsN.Y.Acad.Sci.)，383:44-68 1982)；MRC5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)、PER.C6、K562和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。

根据本发明的一些实施方式，哺乳动物细胞选自由中国仓鼠卵巢(CHO)、HEK293、PER.C6、HT1080、NS0、Sp2/0、BHK、Namalwa、COS、HeLa及Vero细胞所组成的组。

根据本发明的一些实施方式，宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)、PER.C6或293(例如Expi293F)细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种生产异二聚体的方法，该方法包括将本文所述的核酸构建体或系统引入宿主细胞或培养表达本文所述的核酸构建体或系统的细胞。

根据具体实施方式，所述生产包括在32℃至37℃、5％至10％ CO₂条件下培养5至13天。

可用于本发明具体实施方式的生产条件的非限制性示例公开于以下实施例部分中。

因此，例如将编码异二聚体的表达载体引入哺乳动物细胞，如Expi293F、ExpiCHO细胞、CHO-K1或CHO-DG44。然后根据Expi293F、ExpiCHO、CHO-K1或CHO-DG44细胞制造商说明书(Thermo)，将转导的细胞在32℃至37℃、5％至10％CO₂的细胞特异性培养基中培养，并在培养至少5天后，从上清液中收集蛋白质并纯化。

根据具体实施方式，培养物以批(batch)、分批(split-batch)、补料分批(fed-batch)或灌注模式操作。

根据具体实施方式，培养物在补料分批条件下操作。

根据具体实施方式，培养在36.5℃下进行。

根据具体实施方式，培养在36.5℃下进行，温度变化至32℃。这种温度变化可以在到达固定相之前减缓细胞代谢。

根据具体实施方式，该方法包括将二聚化部分添加到表达的多肽中。

根据具体实施方式，所述方法包括分离异二聚体。

根据具体实施方式，重组异二聚体的回收在适当的培养时间后进行。根据具体实施方式，回收重组异二聚体是指收集含有异二聚体的整个培养基，且无需暗示额外的分离或纯化步骤。根据具体的实施方式，本发明的一些实施方式的异二聚体可使用多种标准蛋白质纯化技术进行纯化，例如但不限于：亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、刀豆球蛋白A层析、混合模式层析、金属亲和层析、凝集素亲和层析、色谱聚焦及差异增溶法。

根据具体实施方式，在生产和纯化后，可在体内或体外测定异二聚体的治疗效果。此类方法为本领域所知，包括例如细胞活力、转基因小鼠的存活及激活标记物的表达。

本发明一些实施方式的组合物(例如，异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统和/或细胞)可施用于生物体本身，或施用于与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中。

因此，在一些实施方式中，本发明的特点是包含治疗有效量的本文公开的组合物的药物组合物。

本文中，术语“活性成分”是指负责生物效应的组合物(例如，异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码异二聚体的核酸构建体或系统和/或细胞)。

本文中，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。赋形剂的示例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚合物如聚乙二醇。

下文中，短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可互换使用，是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。辅料包括在这些短语中。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物所需的生物活性且不会产生任何不期望的毒理学效应的盐(参见Berge,S.M.等人，1977，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)66:1-19)。此类盐的示例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等)的盐，以及衍生自无毒有机酸(例如，脂肪族一元羧酸和二元羧酸、苯基取代烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙等)的盐，以及衍生自无毒有机胺(例如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的盐。

根据本发明的至少一些实施方式的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的示例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。根据本发明的至少一些实施方式的药物组合物还可包括添加剂，例如洗涤剂和增溶剂(例如TWEEN 20(聚山梨酯-20)、TWEEN 80(聚山梨酯-80))和防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)，以及填充剂(例如乳糖、甘露醇)。

可用于根据本发明至少一些实施方式的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的示例包括水；各种缓冲内容物(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH值和离子强度的缓冲盐水；乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油(例如橄榄油)；以及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。

例如，可以通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。

这些组合物还可包含辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序以及通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂(例如糖、氯化钠等)。此外，可通过加入延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和无菌粉末，用于临时制备无菌注射溶液或分散体。本领域已知将此类介质及剂用于药物活性物质。除了任何常规介质或剂与活性化合物不相容外，预期其在根据本发明至少一些实施方式的药物组合物中的用途。还可将补充活性化合物掺入到组合物中。

治疗性组合物在制造和储存条件下通常必须是无菌的和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇或氯化钠)。可通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。无菌可注射溶液的制备方法是，根据需要将所需量的活性化合物与上述成分的一种或多种的组合掺入适当的溶剂，然后进行灭菌微滤。一般而言，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包含基本分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分的粉末。

无菌可注射溶液的制备方法是，根据需要将所需量的活性化合物与上述成分的一种或多种的组合掺入适当的溶剂，然后进行灭菌微滤。一般而言，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包含基本分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分粉末加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分的粉末。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量，将根据所治疗对象和特定的施用方式而有所不同。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的组合物的量。一般而言，在100％中与药学上可接受的载体组合，该量的范围为活性成分的约0.01％至约99％，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％。

调整剂量方案，以提供最佳预期反应(例如治疗反应)。例如，可施用单次剂量，可随时间分几次施用，或可根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。为了便于施用和剂量的均匀性，将胃肠外组合物配制为剂量单位形式是特别有利的。本文所使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗对象的单一剂量的物理离散单位；每个单元含有预定量的活性化合物，经计算与所需药物载体结合产生所需的治疗效果。根据本发明的至少一些实施方式的剂量单位形式的规格直接取决于(a)活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，以及(b)配制此类活性化合物以治疗个体敏感性的技术中固有的局限性。

可以在以下文献中找到药物的配制和给药技术：“雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)”，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，Easton,PA，最新版，其通过引用并入本文。

本发明的一些实施方式的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。

本发明的组合物可以使用本领域已知的一种或多种方法经由一种或多种施用途径施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。根据本发明的至少一些实施方式的治疗剂的优选给药途径包括：血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内(intraperitoneal)、皮下、脊髓、口服、肠内、直肠、肺(例如吸入)、鼻、局部(包括经皮、口腔和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、脑内递送(例如脑室内、脑内及对流增强扩散)、中枢神经系统传递(例如鞘内、脊髓周围和脊髓内)或肠胃外(包括皮下、肌内、腹膜内、静脉内(IV)和皮内)、经皮(被动地或使用离子导入法或电穿孔)、经粘膜(例如舌下给药、经鼻、阴道、直肠或舌下给药)、通过植入物给药或施用、或其他非肠胃给药途径(例如通过注射或输注)、或本领域已知的其他递送途径和/或给药形式。本文使用的“肠胃外给药”一词是指除肠内及局部给药以外的给药方式，通常通过注射，包括但不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注，或使用可生物降解的插入物，并可配制成适合每种给药途径的剂型。在一个具体实施方式中，根据本发明至少一些实施方式的蛋白质、治疗剂或药物组合物可经腹膜内或静脉内给药。

根据具体实施方式，本文公开的组合物在通过肠胃外注射在水溶液中给药。制剂也可以是悬浮液或乳液的形式。一般而言，提供用于肠胃外注射的药物组合物，其包含有效量的本文所述的组合物，并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅料和/或载体。此类组合物任选地包括一种或多种用于以下物质：稀释剂；无菌水；各种缓冲内容物(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH值和离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，例如洗涤剂和增溶剂(例如TWEEN 20(聚山梨酯-20)、TWEEN 80(聚山梨酯-80))；抗氧化剂(例如，水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸)；防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)；以及填充剂(例如乳糖、甘露醇)。非水溶剂或媒介物的示例包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。制剂可在使用前立即冷冻干燥(冻干)或真空干燥，并重新溶解/再悬浮。可通过例如通过细菌截留滤器过滤、向组合物中加入灭菌剂、照射组合物或加热组合物来进行灭菌。

本文公开的各种组合物(例如多肽)可以局部给药。对于大多数肽制剂而言，局部给药效果不佳，尽管如果将其应用于肺、鼻、口(舌下、口腔)、阴道或直肠粘膜时可能特别有效。

本发明的组合物可以在吸入的同时递送至肺部，并在以气溶胶或喷雾干燥的颗粒(空气动力学直径小于约5微米)递送时，穿过肺上皮内层进入血流。可以使用各种设计用于肺部递送治疗产品的机械装置，包括但不限于：雾化器、计量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟悉的。市售设备的一些具体示例是：Ultravent雾化器(Mallinckrodt Inc.公司，圣路易斯密苏里州)；Acorn II雾化器(Marquest MedicalProducts公司，科罗拉多州恩格尔伍德)；Ventolin计量吸入器(Glaxo Inc.公司，北卡罗来纳州三角研究园)；以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.公司，马萨诸塞州贝德福德)。Nektar、Alkermes及Mannkind都有已批准的或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中该技术可应用于本文所述的制剂。

用于粘膜给药的制剂通常为喷雾干燥的药物颗粒，其可被掺入片剂、凝胶、胶囊、悬浮液或乳剂中。标准药物赋形剂可从任何配方师处获得。口服制剂可以是口香糖、凝胶条、片剂或锭剂的形式。

也可以制备透皮制剂。它们通常是软膏、洗液、喷雾剂或贴剂，所有这些都可以使用标准技术来制备。透皮制剂需要包含渗透促进剂。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以获得有效的活性成分的量，以实现对特定患者、组合物及给药方式的期望治疗反应，而不对患者有毒。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物的活性；给药途径；给药时间；所用特定化合物的排泄率；治疗持续时间；与所使用的特定组合物结合使用的其他药物、化合物和/或材料；被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况及既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。

根据具体实施方式，将本文公开的组合物以治疗有效量给药至对象。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”指足以治疗、抑制或缓解所治疗疾病的一种或多种症状或以其他方式提供期望的药理学和/或生理学效果的剂量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。

对于在本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可以从体外和细胞培养测定估计。例如，可以在动物模型中配制剂量，以实现所需的浓度或滴度。这种信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。鉴于患者状况，各个医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量(例如，参见Fingl等人所著，1975，“治疗药理学基础(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)”，Ch.1p.1)。

剂量的量和间隔可以单独调整，以提供足以诱导或抑制生物效应(最低有效浓度MEC)的活性成分的水平。MEC将因每种制剂而有差异，但可以从体外数据估算。实现MEC所需的剂量取决于个体特征和给药途径。检测分析可用于确定血浆浓度。

取决于要治疗的病症的严重性和反应性，给药可以是单次给药，治疗过程持续数天至数周，或直到治愈，或达到疾病状态的减轻

当然，要给药的组合物的量将取决于被治疗的对象、痛苦的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。

在某些实施方式中，组合物(例如，异二聚体、包含异二聚体的组合物、编码核酸构建体或系统或细胞)被局部给药，例如通过直接注射到待治疗的部位中。通常，注射引起组合物的局部浓度增加，其大于通过全身给药可实现的浓度。异二聚体组合物可以与如上所述的基质组合，以通过减少多肽从待治疗部位的被动扩散来协助产生增加的多肽组合物的局部浓度。

本发明的药物组合物可以使用与本领域已知的医疗设备进行给药。例如，在可选实施方式中，根据本发明的至少一些实施方式的药物组合物可以使用针头皮下注射装置进行给药，例如这些装置公开于如下文献：美国专利US5,399,163、US5,383,851、US5,312,335、US5,064,413、US4,941,880、US4,790,824或US4,596,556。可用于本发明的已知植入物和模块的示例包括：美国专利US 4487603，公开了一种可植入式微量输液泵，用于以受控速率分配药物；美国专利US4486194，公开了一种通过皮肤给药的治疗装置；美国专利US4447233，公开了一种药物输注泵，用于以精确输注速率递送药物；美国专利US4447224，公开了一种用于连续给药的可变流量植入式输液装置；美国专利US4439196，公开了一种具有多腔室的渗透性药物递送系统；以及美国专利US4475196，公开了一种渗透性药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。本领域技术人员已知许多其他此类植入物、递送系统和模块。

活性化合物可以与将保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已获得专利或者是本领域技术人员公知的。例如，参见，缓释和控释药物递送系统，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker,Inc.公司，纽约，1978。

在植入聚合物装置(杆、柱、膜、盘)或注射(微粒)后，可以制备用于系统性长期释放的控制释放聚合物装置。基质可以是微粒(例如微球)的形式，其中肽分散在固体聚合物基质或微胶囊中，其中核的材料与聚合物壳不同，并且肽分散或悬浮在核中，核可以是液体或固体。除非本文明确规定，否则微粒、微球及微胶囊可互换使用。或者，聚合物可以浇铸为薄片或薄膜(范围从纳米到四厘米)，通过研磨或其他标准技术产生的粉末，甚至是凝胶，例如水凝胶。

不可生物降解或可生物降解的基质可用于递送本文所公开的活性剂，但是可生物降解的基质是优选的。这些可能是天然或合成聚合物，但由于具有更好的降解和释放曲线特征，因此优选合成聚合物。根据需要释放的时间段选择聚合物。在某些情况下，线性释放可能最有用，但在其他情况下，脉冲释放或“批量释放”可能提供更有效的结果。聚合物可以是水凝胶的形式(通常吸收高达约90重量％的水)，并且可以任选地与多价离子或聚合物交联。

基质可以通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取及本领域技术人员已知的其他方法形成。可以使用为制备药物递送用的微球而开发的任何方法来制备生物可降解微球，例如描述于文献：Mathiowitz和Langer，控制释放期刊(J.Controlled Release)，5:13-22(1987)；Mathiowitz等人，反应性聚合物(Reactive Polymers)，6:275-283(1987)；以及Mathiowitz等人，应用高分子科学杂志(J.Appl Polymer ScL)，35:755-774(1988)。

这些装置可以被配制成局部释放，用于治疗植入或注射区域(常递送的剂量远小于治疗整个身体的剂量)或全身递送。它们可以被植入或皮下注射到肌肉、脂肪或被吞咽。

在某些实施方式中，为了确保根据本发明至少一些实施方式的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，它们可以例如在脂质体中配制。有关脂质体的制造方法，请参见例如美国专利US4522811、US5,374,548和US5399331。脂质体可包含一个或多个选择性转运至特定细胞或器官中的部分，从而增强靶向药物递送(例如，参见V.V.Ranade，1989，临床药理学杂志(J.Clin.Pharmacol.)，29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(例如，参见Low等人的美国专利US5416016)；甘露糖苷(Umezawa等人，1988，生物化学与分子生物学报(Biochem.Biophys.Res.Commun.)153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，1995，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)，357:140；M.Owais等人，1995，抗微生物制剂与化疗(Antimicrob.Agents Chemother.)39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等人，1995，美国生理期刊(Am.J Physiol.)1233:134)；p120(Schreier等人，1994，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994，免疫方法(Immunomethods)4:273。

如果需要，本发明的一些实施方式的组合物可以存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其可以包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。举例而言，所述包装可以包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配装置可附有给药说明书。包装或分配器也可以伴随着与容器相关的通知，其形式是由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定，该通知反映了该机构对组合物的形式或人类或兽医给药的批准。举例而言，这样的通知，可能是经过美国食品和药物管理局批准的处方药标签，或批准的产品插入物。还可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并贴上标签用于治疗适应症，如上文进一步详述的。

如本文所用，术语“约”是指±10％。

术语“包括(comprises、comprising、includes、including)”、“具有(having)”及其同源词(conjugates)意为“包括但不限于”。

术语“由……组成(consisting of)”是为“包括并限于”。

术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”意为组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性。

如本文所使用的，单数形式“一个(a、an)”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另有明确的指示。例如，术语“化合物(a compound)”或“至少一种化合物(at least onecompound)”可以包括多种化合物，包括其混合物。

在整个申请中，本发明的各个实施方式可以以范围的形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，都适用。

每当本文指出数值范围时，意为包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“第一指示数和第二指示数之间的范围”和“从第一指示数到第二指示数的范围”在本文中可互换使用，意为包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的或者容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

当提及特定的序列表时，这种提及应理解为还包括基本上与其互补序列相对应的序列，包括由例如测序错误、克隆错误或导致碱基替换、碱基缺失或碱基添加的其它改变引起的微小序列变异，只要这种变异的频率为50个核苷酸中少于1个；可替代地，100个核苷酸中少于1个；可替代地，200个核苷酸中少于1个；可替代地，500个核苷酸中少于1个；可替代地，1000个核苷酸中少于1个；可替代地，5,000个核苷酸中少于一个；可替代地，10,000个核苷酸中少于一个。

应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合地提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各个特征也可以单独提供，或者以任何合适的子组合提供，或者以本发明的任何其它描述的实施方式中的合适的方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有这些元件的情况下不起作用。

如上文所述以及如以下权利要求部分所要求的本发明的各个实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。

实施例

现在参考下面的实施例，这些实施例与上面的描述一起以非限制性的方式说明了本发明的一些实施方式。

通常，本文使用的命名和本发明中使用的实验室方法包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A laboratory Manual)”Sambrook等人，(1989)；“分子生物学实验(Current Protocols in Molecular Biology)”，第I-III卷，Ausubel,R.M.编辑(1994)；Ausubel等人，“分子生物学实验(Current Protocols in Molecular Biology)”，约翰威立国际出版公司(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Perbal，“分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，约翰威立国际出版公司，纽约(1988)；Watson等人，“重组DNA(Recombinant DNA)”，科学美国人书籍(Scientific American Books)，纽约；Birren等人(编辑)，“基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)”，第1-4卷，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Press)，纽约(1998)；如以下美国专利中所述的方法：US4,666,828、US 4,683,202、US 4,801,531、US 5,192,659和US 5,272,057；“细胞生物学：实验室手册(CellBiology:A Laboratory Handbook)”，第I-III卷，Cellis,J.E.编辑(1994)；Freshney的“动物细胞培养-基本技术手册”，Wiley-Liss出版，N.Y.(1994)；“当前免疫学方案”卷I-III，Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等人编辑，“基础和临床免疫学(Basic and ClinicalImmunology)”(第八版)，Appleton&Lange出版社，诺沃克，CT(1994)；Mishell和Shiigi编辑，“细胞免疫学中的选定方法(Selected Methods in Cellular Immunology)”，W.H.曼出版公司，纽约(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中被广泛描述，参见，例如：美国专利US3,791,932、US3,839,153、US3,850,752、US3,850,578、US3,853,987、US3,867,517、US3,879,262、US3,901,654、US3,935,074、US3,984,533、US3,996,345、US4,034,074、US4,098,876、US4,879,219、US5,011,771和US5,281,521；“寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)”，Gait,M.J.编辑(1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”，Hames,B.D.和Higgins S.J.编辑(1985)；“转录与翻译(Transcription and Translation)”，Hames,B.D.,and Higgins S.J.编辑(1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”，Freshney,R.I.编辑(1986)；“固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)”，IRL出版社(1986)；“分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，Perbal,B.(1984)和“酶学方法”，1-317卷，美国学术出版社；“PCR方案：方法和应用指南(A Guide To MethodsAnd Applications)”，美国学术出版社，圣地亚哥，CA(1990)；Marshak等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册(Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual)”，CSHL出版社(1996)；所有这些都通过引用的方式并入本文，如同在本文中完全阐述一样。在本文中还提供了其它的一般参考资料。其中的程序被认为是本领域公知的，是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息通过引用并入本文。

材料和方法

试剂-ExcelBand^TM 3-色高范围蛋白质标记物或ExcelBand^TM 3-色额外范围蛋白质标记物(SMOBIO，Cat#分别为PM2600或PM2800)、样品缓冲液(GenScript Cat#M00676)、聚丙烯酰胺凝胶(8％或4％至20％，Genscript Cat#分别为M00662或M00656)、ECL+蛋白质印迹底物(Pierce公司，Cat#32132)、TMB-ELISA底物溶液(Sigm公司a，Cat#T0440)、TMB终止溶液(Southern Biotech公司，Cat#0412-01)、链霉抗生物素蛋白-HRP(Pierce公司Cat#TS21126)。HD转染试剂(Promega公司，Cat#TM328)。Vybrant DiD细胞标记溶液(Thermo Fisher公司，Cat#V22887)、淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)、^TM密度梯度介质(StemCells Technologies公司，Cat#07801)。

抗体-LEAFTM纯化的小鼠抗人PD-L1(CD274)B7H1克隆29E.2A3，Biolegend公司，Cat#329711；抗人PD1(GenScript公司，Cat#A01829-40)；APC标记的抗PD1(Biolegend公司，Cat#329908)；APC小鼠IgG2b,κIC(Biolegend公司，Cat#400322)；生物素化兔抗人SIRPα(LsBio Cat#LS-C370337)；兔抗人SIRPα抗体(抗药物抗体DSP107)批号104；抗人LILRB2(R&D系统Cat#MAB2078)；APC抗人CD155抗体(Biolegend，Cat#337618)；APC小IgG1 k(Biolegend公司，Cat#400120)；APC抗人CD47抗体(Biolegend公司，Cat#323124)；APC抗人CD274(Biolegend公司，Cat#329708)；APC抗人CD172a/b SIRPα克隆SE5A5抗体；小鼠IgG1，κ(Biolegend公司，Cat#323809)；PE小鼠抗人IgG1-Fc(SouthernBiotech公司，Cat#9054-09)；PE小鼠抗人IgG4(SouthernBiotech公司，Cat#9190-09)；AF647抗人IgG4-Fc(SouthernBiotech公司，Cat#9200-31)；APC抗人CD85d(ILT4)抗体克隆41D1(Biolegend公司，Cat#338708)；山羊抗兔IgG(H+L)-HRP缀合物(R&D systems公司，Cat#170-6515)；山羊抗小鼠IgG HRP缀合物(Bio-rad Cat#170-6516)；APC抗人HLA-G(来自专利US2020/0102390A1)；APC人IgG4(Biolegend公司，Cat#403706)；CD47阻断剂Ab(来自专利WO2011/143624A2)；HLA-G阻断剂Ab(来自专利US2020/0102390A1)；小鼠抗人IgG1 HRP缀合物(Southern Biotech公司，Cat#9054-05)；小鼠抗人IgG4 HRP缀合物(Southern Biotech公司，Cat#9200-05)；PE小鼠抗人IgG1 FC(Southern Biotech公司，Cat#9054-09)；PE小鼠抗人IgG4-Fc(SouthernBiotech公司，Cat#9190-09)；抗人PVR(NOVUS公司，Cat#NB6001241)；APC小鼠抗人IgG1铰链(Southern Biotech公司，Cat#9054-09)；APC抗人TIGIT、mIgG2a克隆A15153G(Biolegend公司，Cat#372706)；APC mIgG2a MOPC-173(Biolegend公司，Cat#400220)；PE抗人PD-L1，29E2A3，mIgG2b(Biolegend公司，Cat#329706)；APC抗人CD16、mIgG1克隆ICRF44(Biolegend,Cat#301310)。

重组蛋白-人重组HLA-G蛋白(His标签)(Abcam Cat#ab225660)；人PDL-1FC标签(Acro Cat#PD1-H5258)；人PDL-1-Fc(GenScript U3420DK140-1)；人CD47蛋白HIS标签(Acro，Cat#CD7-H5227)；人CD155(PVR)蛋白Fc标签(Acro Cat#CD5-H5251和CD5-H5254)。

细胞系-EXPI 293F(Gibco公司，Cat#A14257)；DLD1-WT细胞系(ATCC,CCL-221)；DLD1-PDL1细胞系(Hendriks等人，2016)；HT1080WT(ATCC CCL-121)；CHO-K1、CHO-K1-CD47、CHO-K1-CD47(细胞库，澳大利亚，CBA-0146)；HT1080-HLA-G(用HLA-G表达质粒感染病毒生成细胞)；JEG-3细胞(ATCC,HTB-36)；K562(ATCC,CCL-243)；K562 PVR、K562 PD-L1、K562PVR/PD-L1(用表达PDL1和/或PVR的质粒转染K562细胞，并选择稳定表达的细胞)；AB12(ECACC,10092306)；Renca(ATCC,CRL-2947)；Jurkat NFAT-CD16(Promega,jktl-nfat-cd16)；SK-OV-3(ATCC,HTB-77)。

培养基和组织培养试剂-EXPI 269培养基(Gibco公司，Cat#A-14351-01)；RPMI1640(Biological Industries公司，Cat#01-100-1A)；FCS(Gibco公司，Cat#12657-029)；BSA、Sigma、A7030、EDTA、Sigma、E7889、细胞解离缓冲液、Gibco、13151-014、EMEM(Biological Industries公司，Cat#01-040-1A)；DMEM(Biological Industries公司，Cat#01-055-1A)；TrypLE Express(Gibco公司，Cat#12604-13)；Glutamax(Gibco公司，Cat#35050-038)；青霉素-链霉素(Gibco公司，Cat#151140-122)、丙酮酸钠(BiologicalIndustries公司，Cat#03-042-1B)；IMDM(Biological Industries公司，Cat#01-058-1A)。

设备-FACS设备，Stratadigm公司，细胞计数仪Cytometry S1000EXI、酶标仪(ELISA Reader)、Thermoscience Multiskan FC、ELISA软件、用于酶标仪RE的SkanIt软件4.1.0.43版。

异二聚体-蛋白质的结构分析-基于同源X-射线结构对每一部分进行同源性建模。对于PD1-PDB IDs：使用3RRQ、5GGR、5GGS、5JXE和4ZQK作为模板。对于hIgG4-PDB IDs：使用4C54、4C55、5W5M和5W5N作为模板。对于SIRPα-PDB ID's：使用2UV3、2WNG、4CMM、6BIT、2JJS和2JJT作为模板。对于LILRB2-PDB IDs：使用2GW5、4LLA、2DYP和6BCP作为模板。对于SIGLEC10-PDB IDs：使用SIGLEC8同源物2N7A和2N7B作为模板。对于TIGIT-PDB IDs：使用3QOH、3RQ3、3UCR、3UDW和5V52作为模板。

在CHARMM中使用环建模对连接体节段进行建模，主要是为了避免结构上违规，并能够对可能的“间隔物”长度进行可能的估计。

异二聚体的制备-为了比较功能分析和生产评价，使用“杵”-进入-“臼”方法(例如，在美国专利US8216805中描述的)设计和/或生产了几种异二聚体(本文称为“DSPs”)，参见下文表1。在用所需Fc融合蛋白的编码序列克隆的pcDNA3.4表达载体转染的Expi293F细胞中进行生产(见下表1)。

使用限制性内切酶如EcoRI和HindIII或XbaI和EcoRV将序列克隆到载体中，加入Kozak序列和STOP密码子以及加上人工信号肽(MESPAQLLFLLLLWLPDGVHA，SEQ ID NO:116)。从细胞培养物的上清液中收集蛋白质，在一些情况下，使用蛋白质A(PA)Poros MabCaptureA树脂或阴离子交换高捕获Q FF树脂(Anion Exchange High Trap Q FF resin)通过一步纯化来纯化蛋白质。

表1：设计的异二聚体的描述

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SDS-PAGE分析-将35μl的细胞培养物上清液或来自每个异二聚体样品的3μg纯化的蛋白质与含有或不含β-巯基乙醇(分别为还原和非还原条件)的上样缓冲液混合，在95℃下加热5分钟，并在8％或4％至20％梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE上分离。根据制造商的说明，通过e-Stain机器(Genscript)观察凝胶上的蛋白质迁移。

蛋白质印迹分析-在还原或非还原条件下(分别在含有或不含β-巯基乙醇的上样缓冲液中)处理含有所产生的异二聚体(每泳道50ng至500ng)的样品，在95℃下加热5分钟，并在8％或4％至20％梯度SDS-PAGE上分离。然后，将蛋白质转移到PVDF膜上，并与一抗温育1小时或过夜，然后与HRP缀合的第二抗体温育1小时。ECL显影后检测信号。

通过夹心ELISA法将异二聚体与它们的对应配体/受体结合-通过与重组对应蛋白(例如CD47蛋白、PDL1蛋白、HLA-G蛋白或PVR蛋白)在4℃下温育过夜，用所分析的异二聚体的一个臂的受体/配体预包被平底96孔板，然后进行封闭和洗涤。将含有所产生的异二聚体的连续稀释的细胞培养物上清液或纯化的蛋白质样品加入相应的预包被孔中。在另外的洗涤步骤之后，加入生物素化的、针对异二聚体的第二臂或lgG主链的未标记的Ab或HRP标记的Ab，并使其与捕获的蛋白质结合。此后，在检测到的Ab未被HRP标记的情况下，加入HRP缀合的二抗或链霉抗生物素-HRP。根据标准ELISA方案，使用酶标仪(Thermo Scientific,Multiscan FC)，在450nm处用TMB底物进行检测，参考波长为620nm。O.D.值用于通过GraphPad Prism软件创建结合曲线图。

异二聚体与在细胞表面表达的对应配体/受体的结合-将表达所分析的异二聚体对应物中的一种的细胞与所产生的异二聚体的连续稀释液在4℃下温育30分钟，然后用对异二聚体第二组分(即不与细胞表达的对应物结合的组分)或IgG主链具有特异性的荧光标记抗体进行免疫染色，并通过流式细胞术进行分析。可选地，在细胞表达两种对应物的情况下，在与异二聚体温育之前，将细胞与针对其中一种的阻断抗体进行预温育。O.D.值用于通过GraphPad Prism软件创建结合曲线图。

包含SIRPα和LILRB2结构域的异二聚体对巨噬细胞和PMN细胞的作用-为了测试粒细胞对癌细胞的吞噬作用，将表达人CD47的HT1080或表达人CD47和人HLA-G的HT1080-HLA-G细胞用DiD标记，并与0、1、2或5μg/mL DSP216在室温下预温育15分钟。然后，将细胞与粒细胞在37℃下以效应物与靶(E:T)比为1:1的比例共培养过夜，并通过流式细胞仪进行分析。MFI值用于通过GraphPad Prism软件创建结合曲线图。

细胞毒性测定-NK细胞(效应细胞)对靶细胞的杀伤作用在共培养实验中进行了测试。过夜温育后通过流式细胞术分析(FACS)分析了死亡靶细胞的百分比。将预标记的靶细胞[K562 WT、K562过表达PVR(本文中为K562 PVR)、K562过表达PDL1(本文中为K562 PDL1)或K562过表达PVR/PDL1(本文中为K562 PVR/PDL1)细胞]置于96孔板中，并在不同浓度的TIGIT-PD1异二聚体存在下，以不同的效应物-靶(E:T)比例与原代NK细胞一起温育。在37℃下ON温育后，通过流式细胞仪分析细胞。使用K562 WT靶细胞作为在靶细胞上表达的PVR/PD-L1配体的存在下抑制杀伤作用的参照。TIGIT-PD1异二聚体处理的参照是未处理的靶细胞。

颗粒酶B的分泌-颗粒酶B一种丝氨酸蛋白酶，最常见于NK细胞和细胞毒性T细胞的颗粒。它由这些细胞与成孔蛋白穿孔素一起分泌，以介导靶细胞中的细胞凋亡。将预标记的靶细胞(K562 WT、K562 PVR、K562 PDL1和K562 PVR/PDL1过表达细胞)置于96孔板中，并在不同浓度的TIGIT-PD1异二聚体存在下，以不同的效应物-靶(E:T)比例与原代NK细胞一起温育。在37℃下ON温育后，收集上清液，并使用ELISA分析颗粒酶B水平。

通过报告基因系统使用荧光素酶活性测定的FcγRIIIa结合-使用Jurkat NFATCD16过表达细胞(Promega)的报告系统对IgG1-Fc激活的FcγRIIIa进行检测。在该系统中，与FcγRIIIa的结合诱导了一系列信号交易，包括：细胞内钙水平的增加和钙敏感磷酸酶(钙调神经磷酸酶)的激活，该酶可快速使NFAT蛋白去磷酸化。去磷酸化的NFAT易位进入细胞核，并诱导荧光素酶的表达和分泌。荧光素酶分泌水平作为发光信号进行测量，该信号由荧光素酶和添加的基质(QUANTI-Luc)的相互作用产生。在K562 PVR/PDL-1细胞(靶细胞)与Jurkat NFAT-CD16过表达细胞(效应细胞)的共培养测定中，测试了TIGIT-PD1异二聚体的IgG1-Fc臂与Jurkat CD16过表达细胞上的FcγRIIIa(CD16)的结合。为此，K562 PVR/PD-L1在96孔板中培养，并在不同浓度的TIGIT-PD1异二聚体的存在下温育。在37℃下温育1小时后，将Jurkat NFAT CD16过表达细胞以2:1的E:T比例添加到靶细胞中。在37℃下温育6小时后，通过发光计分析荧光素酶活性。K562 WT靶细胞用作靶细胞上表达的PVR/PD-L1配体存在下荧光素酶活性的参照。TIGIT-PD1异源二聚体处理的对照组为未处理的靶细胞。

通过ELISA确定，TIGIT-PD1异二聚体与其对应物同时结合-用hrPDL1-Fc蛋白预包被平底96孔板，然后封闭和洗涤。将连续稀释的纯化TIGIT-PD1异源二聚体样品加入相应的预包被孔中。温育和另外的洗涤步骤后，加入检测蛋白-人CD155(PVR)与小鼠IgG2a Fc的缀合物，并使其与捕获的蛋白结合。随后进行另外的洗涤，添加过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG，并在温育和洗涤之后，根据标准ELISA方案，使用酶标仪(ThermoScientific,Multiscan FC)在450nm处用TMB底物进行检测，参考波长为620nm。

TIGIT-PD1异二聚体同时结合NK细胞和肿瘤细胞-在TIGIT-PD1异二聚体存在的情况下，在NK原代细胞和K562 PVR/PD-L1细胞的共培养细胞系统中测试了TIGIT和PD1与NK和肿瘤细胞的同时结合。两个部分与不同细胞类型的同时结合导致双峰的形成，通过流式细胞术将其检测为双阳性染色的细胞群。为了检测双峰细胞的形成，将用CPD染料预标记的原代NK细胞的共培养物与用CFSE染料预标记的K562 PVR/PD-L1细胞以2:1的比例混合。在4℃下温育2小时后，在不同浓度的TIGIT-PD1异二聚体的存在下，测试双峰细胞的形成。此外，在添加异二聚体之前，在与阻断抗体：Fc阻断剂、PVR抗体或PD-L1抗体温育1小时后，测试双峰细胞形成的特异性。

体内同基因模型：TIGIT-PD1异二聚体在AB12小鼠间皮瘤模型中的作用-将7周龄雌性BALB/c小鼠腹膜内接种AB12小鼠恶性胸膜间皮瘤(MPM)细胞，然后用TIGIT-PD1异源二聚体或媒介物对照进行治疗。通过异二聚体对小鼠存活的影响来评估异二聚体的效果。

治疗方案：

在研究的第0天腹膜内接种10⁵AB12细胞。

在实验中分了两个组：

组1-接种后，从第6天开始，用200μl媒介物/小鼠腹膜内治疗小鼠。媒介物每3天给药一次。

组2-接种后，从第6天开始，用200μl体积的150μg TIGIT-PD1异二聚体腹膜内治疗小鼠。每隔3天给药4次。

每天评估动物的发病率和死亡率。

体内NSG模型：TIGIT-PD1异二聚体在A549人肺腺癌模型中的作用-将11至13周龄NSG小鼠皮下接种(s.c.)人肺腺癌细胞，然后用TIGIT-PD1异二聚体或媒介物对照进行治疗。通过评估肿瘤体积并计算肿瘤生长抑制(TGI)来评估异二聚体的效果。

治疗方案：

在研究的第0天皮下接种5.0×10⁶A549细胞。在第9天，照射小鼠，并静脉内注射人PBMC(5×10⁶)，然后在第16天第二次注射人PBMC(5×10⁶)。

在实验中分了两个组：

组1-从第9天开始，每隔一天(EOD)向小鼠腹膜内注射200μl/小鼠PBS。

组2-从第9天开始，以200μl/小鼠EOD的体积，用150μg TIGIT-PD1异二聚体腹膜内治疗小鼠。总共给予4剂。

从第一个治疗日(第9天)开始测量肿瘤体积，并在随访期间测量EOD。在第18天处死所有动物。

实施例1

包含两种Fc融合蛋白的异二聚体的选择、设计、生产和表征

设计了几种包含选自SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10的两种蛋白质的异二聚体，其中每种蛋白质使用“杵”进入“臼”的方法(例如，在美国专利US8216805中描述的)与IgG1或IgG4的Fc结构域融合(参见上表1)。

进行异二聚体-蛋白质的结构分析以优化以下参数：

·折叠-适当的折叠，以允许与靶结合，最大限度地减少可能的二硫化物干扰。

·完整性-没有暴露的蛋白水解位点。

·在哺乳动物表达系统中高表达；和

·低免疫原性。

图2A-5C给出了本文中称为“DSP120V1”、“DSP216V1”、“DSP404V1”、“DSP502V1”(参见上文表1中的描述和序列)的异二聚体的示意图，以及为所识别的结构域和节段生成的3D模型。该分析预测可能与配体结合，并且不同结构域之间没有干扰。

接下来，生产并分析了几种异二聚体。如图6A-B和图15所示，在非还原条件下观察到高比例的预期异二聚体分子量形式的蛋白质，在还原条件下证实了两个亚基的表达。SDS-PAGE仅检测到少量的同型二聚体(包含两个“杵”或两个“臼”片段的二聚体)。

此外，所产生的异二聚体包含所有其设计的结构域；例如，DSP120V1同时包含PD1和SIRPα结构域(图7A-B和8A-B)；DSP216和DSP216V1同时包含LILRB2和SIRPα结构域(图7C和9A-C)；DSP402包含PD1结构域(图7A)；DSP502同时包含PD1和TIGIT结构域(图7A和10A-B)。

在下一步中，根据它们的组成，根据下面的实施例2至8进一步分析所生产的异二聚体。

实施例2

异二聚体结合它们的对应配体/受体

SIRPα-PD1异二聚体与细胞表面表达的CD47和PDL1的结合分析

本文中称为“DSP120”和“DSP120V1”的SIRPα-PD1异源二聚体的PD1结构域与在细胞上表达的人PDL1的结合是使用抗-SIRPα作为检测抗体的过表达PDL1的DLD1-PDL1细胞系(图11A)来确定的。表达低水平内源PDL1的DLD1-WT细胞(图11A)用作对照。如图11C-D所示，DSP120和DSP120V1以剂量依赖方式结合DLD1PDL1过表达细胞。

SIRPα-PD1异二聚体DSP120的SIRPα结构域与在细胞上表达的人CD47的结合是使用过表达人CD47的CHO-K1细胞系(图11B)来确定的，其中PE缀合的抗lgG4抗体作为检测抗体。CHO-K1细胞用作对照，因为它们不表达人CD47(图11B)。如图11E所示，DSP120以剂量依赖方式结合CHO-K1CD47过表达细胞。

SIRPα-PD1异二聚体和与板结合的CD47或PDL1的结合分析

使用抗-人PD-1(对于CD47包被的板)或抗-人SIRPα抗体(对于PDL1包被的板)温育，然后与相应的HRP缀合的二抗温育后，确定SIRPα-PD1异二聚体DSP120的PD1和SIRPα结构域和与板结合的PDL1或CD47的结合。用TMB底物进行检测。图8A显示了DSP120以浓度依赖方式与CD47包被的板结合，图8B显示了DSP120以浓度依赖方式与PDL1包被的板结合。

SIRPα-LILRB2异二聚体与在细胞表面表达的CD47和HLA-G的结合分析

使用表达人CD47(图12A)且不表达HLA-G(图12B)的HT1080细胞系和APC缀合的抗LILRB2作为检测抗体，确定SIRPα-LILRB2异二聚体(本文中称为“DSP216”)的SIRPα结构域与在细胞上表达的人CD47的结合。如图12E所示，DSP216以剂量依赖方式结合表达CD47的细胞。

使用过表达HLA-G的HT1080细胞系(图12D)和抗人IgG4抗体，确定了SIRPα-LILRB2异二聚体(本文称为“DSP216V1”)的SIRPα和LILRB2结构域与在细胞上表达的HLA-G和/或人CD47的结合。如图12F所示，DSP216V1以剂量依赖方式结合HLA-G和表达人CD47的细胞。

由于HT1080-HLA-G同时表达HLA-G和CD47，因此进一步使用针对每种配体的阻断抗体来检测其与人CD47和HLA-G的特异性结合。如图16A所示，使用抗人HLA-G阻断抗体(APC缀合的抗人IgG1抗体用作检测抗体)证实了DSP216与HT1080-HLA-G细胞系表达的HLA-G的特异性剂量依赖性结合。类似地，使用抗人CD47和抗人HLA-G阻断抗体证实了DSP216V1与HT1080细胞系上的人CD47以及与HT1080-HLA-G细胞系上表达的人CD47和人HLA-G的特异性剂量依赖结合(图16B，APC缀合的抗SIRPα抗体用作检测抗体)。

以相同的方式，使用过表达HLA-G的HT1080-HLA-G细胞系或JEG3细胞系(均同时表达人CD47和人HLA-G)，使用抗人HLA-G阻断抗体或抗人CD47阻断抗体(图16C-17F，APC缀合的抗人IgG1或APC缀合的抗SIRPα抗体用作检测抗体)，确定了LILRB2结构域与人HLA-G的特异性剂量依赖结合，以及SIRPα结构域与本文中称为“DSP216V3”、“DSP216V4”、“DSP216V5”和“DSP216V6”的其它SIRPα-LILRB2异二聚体的CD47的特异性剂量依赖结合。

SIRPα-LILRB2异二聚体和与板结合的人CD47或人HLA-G的结合分析

SIRPα-LILRB2异二聚体DSP216、DSP216V1、DSP216V3和DSP216V4的SIRPα和LILRB2结构域和与板结合的CD47或HLA-G的结合，是使用抗人SIRPα抗体(用于HLA-G包被的板)温育，然后与相应的HRP缀合的二抗温育，或使用抗人抗IgG1-HRP或抗人IgG4-HRP确定的。用TMB底物进行检测。如图9A-C和18A-H所示，所有测试的异二聚体以浓度依赖方式同时结合与板结合的CD47和与板结合的HLA-G。

SIGLEC-10-PD1异二聚体与细胞表面表达的CD24和PDL1的结合分析

使用过表达PDL1的DLD1-PDL1细胞系和APC缀合的抗PD1作为检测抗体(图11A)，确定了SIGLEC-10-PD1异二聚体(在本文中称为“DSP402”)的PD1结构域与人PDL1的结合。表达低水平内源性PDL1的DLD1-WT细胞用作对照(图11A)。如图13所示，DSP402以剂量依赖方式与DLD1 PDL1过表达细胞结合。

使用表达CD24的细胞测试SIGLEC-10结构域与其受体的结合。

TIGIT-PD1异二聚体与细胞表面表达的PVR、PDL1和FcγRIIIa(CD16)的结合分析

使用过表达PDL1的DLD1-PDL1细胞系(图11A)以及内源性表达PD-L1的HT1080细胞系(图14D)，确定了TIGIT-PD1异二聚体(本文中称为“DSP502”)的PD1结构域与人PDL1的结合。使用均表达高水平内源性PVR的DLD1-PDL1和HT1080细胞系，确定了DSP502的TIGIT结构域与人PVR的结合(14B和14C)。PE缀合的抗人IgG1抗体在两个试验中均用作检测抗体。

如图14E-F所示，DSP502以剂量依赖方式结合PDL1表达细胞，并且该结合被抗人PD-L1阻断剂抗体阻断。

图14E-F还显示出DSP502的TIGIT结构域与表达PVR的细胞的剂量依赖结合，如通过使用抗人PVR阻断抗体阻断DSP502与这些细胞的结合所指示的。

图14G显示出其它TIGIT-PD1异二聚体(本文中称为“DSP502V1”、“DSP502V2”和“DSP502V3”)的TIGIT结构域与表达PVR而非PD1的DLD-1WT细胞的剂量依赖结合(图14A和11A)。PE缀合的抗人IgG4抗体用作检测抗体。这三种蛋白质的结合模式是相似的。

此外，使用过表达PD-L1的K562 PD-L1细胞系、过表达PVR的K562细胞系、以及同时过表达PVR和PD-L1的K562 PVR/PD-L1细胞系，分别确定了DSP502的PD1和TIGIT结构域以及另一TIGIT-PD1异二聚体(本文中称为“DSP502V4”，其在Fc-IgG1结构域上含有LALA突变)与人PDL1和人PVR的剂量依赖结合(图19A-I)。

如图所示，PE缀合的抗人IgG1抗体或APC缀合的抗TIGIT和抗人IgG1抗体在结合测定中用作检测抗体。

还观察到DSP502的TIGIT结构域与表达高水平的内源性PVR的SKOV3细胞系的剂量依赖结合(图20A-B，PE缀合的抗人IgG1抗体用作检测抗体)。

使用内源性表达PVR的AB12细胞系(图22A-B，PE缀合的抗人IgG1抗体用作检测抗体)或内源性表达PD-L1和PVR的Renca细胞系(图21A-B，PE缀合的抗人IgG1抗体用作检测抗体)，还观察到DSP502的PD1和TIGIT结构域与在细胞上表达的小鼠PDL1和小鼠PVR的剂量依赖结合。使用抗mPDL1和抗mPVR阻断剂抗体证明了DSP502与在Renca细胞上表达的每种配体(PDL1和PVR)的特异性结合。

此外，使用过表达CD16的Jurkat NFAT细胞系，确定了DSP502的Fc结构域与人Fc受体CD16的结合(图23B)。PE缀合的抗人IgG1抗体用作检测抗体。如图23A所示，DSP502以剂量依赖方式结合细胞。使用完全阻断异二聚体与细胞结合的Fc阻断剂证明了与CD16结合的特异性。

为了进一步测试异二聚体与Fc受体结合的效果，对K562 PVR/PDL-1细胞(靶细胞)与过表达CD16的Jurkat NFAT细胞(效应细胞)进行共培养测定，随后在温育6小时后分析荧光素酶信号。Jurkat-NFAT-CD16细胞在与NFAT元件融合的ISG54启动子的控制下稳定表达Lucia荧光素酶报道基因。FcγRIIIa结合被测量为由加入检测试剂的荧光素酶产生的生物发光信号。如图24所示，在DSP502存在下，共培养细胞增加了荧光素酶分泌。重要的是，当作为单一培养测定(即，在不存在K562 PVR/PDL-1细胞的情况下)将Jurkat NFAT-CD16细胞与DSP502温育时，没有检测到荧光素酶分泌。因此，当DSP502未与PVR和/或PDL1锚定时，DSP502与在Jurkat细胞上表达的FcyRllla的结合不足以启动信号转导。

TIGIT-PD1异二聚体和与板结合的PVR的结合分析

TIGIT-PD1异二聚体DSP502的TIGIT结构域和与板结合的PVR的结合是在使用抗-人PD1抗体温育之后，接着与相应的HRP缀合的二抗温育之后确定的。用TMB底物进行检测。如图10A-B所示，DSP502结合板以浓度依赖方式结合PVR。

实施例3A

通过ELISA确定，异二聚体同时结合它们的对应配体/受体

异二聚体的两侧与它们的对应物的结合，即PD1与PDL1的结合、LILRB2与HLA-G的结合、SIRPα与CD47的结合、TIGIT与PVR的结合以及SIGLEC-10与CD24的结合，通过基于夹心ELISA的测定来测试。该测定还用于比较异二聚体蛋白的不同变体的功能特性。

通过与重组对应蛋白(例如CD47蛋白、PDL1蛋白、HLA-G或PVR)温育，用一个臂的受体/配体预包被平底96孔板，然后进行封闭和洗涤。将含有所产生的异二聚体的连续稀释的细胞培养物上清液或纯化的蛋白质样品加入相应的预包被孔中。在另外的洗涤步骤之后，加入异二聚体的第二臂的生物素化的和未标记的可溶受体/配体，并使其与捕获的蛋白质结合。此后，加入抗第二受体/配体的链霉亲和素-HRP或HRP缀合Ab，并根据标准ELISA方案，使用酶标仪(Thermo Scientific,Multiscan FC)，在450nm处用TMB底物进行检测，参考波长为620nm。

或者，用等摩尔量的两种蛋白质的混合物包被板，并用IgG特异性抗体检测结合。

如图25A所示，TIGIG-PD1异二聚体DSP502同时结合PVR和PDL1。

实施例3B

通过流式细胞术确定，异二聚体同时结合它们的对应配体/受体

使用表达FcγRIIIa的NK原代细胞(图25B)和表达PVR和PDL1的K562PVR/PD-L1(图19F)，通过流式细胞术测试TIGIT-PD1异二聚体DSP502与其所有对应物的同时结合(即，IgG1-Fc与FcγRIIIa的结合、TIGIT与PVR的结合，以及PD1与PDL1的结合)。具体地，在不同浓度的DSP502的存在下，将用CPD染料预标记的NK细胞与用CFSE染料预标记的K562 PVR/PD-L1细胞分别以2:1的比例共培养。使用流式细胞仪分析双峰的形成，并显示为双染色事件。如图25C所示，DSP502介导双峰的形成，表明DSP同时与两种细胞类型结合。此外，DSP502引起的这些双峰形成调解活性被PVR、PD-L1或FcγRIII(图25D)的特异性阻断抗体阻断，这表明双峰形成的最佳条件是当三种受体参与时。

实施例4

异二聚体对阻断配体-受体结合的作用

异二聚体被设计成阻断在靶细胞上表达的内源性配体/受体与天然受体/配体的相互作用。

因此，例如，相关异二聚体的PD1部分被设计为阻断在T细胞上表达的内源性PD1与在肿瘤细胞上表达的PDL1的相互作用。为此，评估了所产生的异二聚体作为这种相互作用的阻断剂的有效性。用重组人PDL1包被板。然后，洗涤板，并与不同浓度的所产生的含有PD1的异二聚体(例如，参见上文表1)或阳性对照抗PD1阻断剂抗体一起温育1小时。加入生物素化的PD1之后进行另外的温育，然后洗涤板，并根据标准ELISA方案用链霉亲和素-HRP和TMB底物印迹。使用酶标仪(Thermo Scientific,Multiscan FC)在450nm下分析板，参考波长为620nm。

类似地，研究了相关异二聚体的阻断活性，以评估它们阻断PVR-TIGIT、SIGLEC10-CD24、LILRB2-HLA-G和CD47-SIRPα结合的有效性。

实施例5

异二聚体的体内抗肿瘤作用

实验设计：

三种不同的体内小鼠模型用于测试所产生的异二聚体治疗癌症的功效：

1.用人干细胞或用人PBMC或用固定化人PBMC和用表达异二聚体靶的人肿瘤细胞接种的NSG小鼠。

2.接种人肿瘤细胞的裸-SCID小鼠。

3.使用测试的异二聚体的替代小鼠蛋白质的同基因小鼠肿瘤模型。

在所有模型中，小鼠均通过静脉内(IV)、腹膜内(IP)、皮下(SC)或原位接种肿瘤细胞。一旦肿瘤是可触知的(～80mm³)，就用所产生的异二聚体的不同剂量和不同方案对小鼠进行静脉内、腹膜内、皮下或原位治疗。

跟踪小鼠的体重和临床表现。每周用卡尺测量肿瘤几次；肿瘤体积根据以下等式计算：v＝长度×宽度²/2。常规测量小鼠体重。在整个实验过程中监测肿瘤生长和存活。

通过切除肿瘤或引流淋巴结，消化和使用特异性抗体染色和流式细胞术分析的免疫表型分析来检测肿瘤中免疫细胞的浸润和亚分型。替代地，或者附加地，通过切除肿瘤、石蜡包埋和切片用于特异性抗体进行免疫组织化学染色来确定免疫细胞的浸润或肿瘤的坏死等级。

在杀死时，收集小鼠器官并包埋在石蜡块中用于H&E和IHC染色。

根据常规方法，在不同时间点从小鼠采集血液样本，用于以下测试：PK分析、血浆细胞因子测定、循环中血细胞亚群的FACS分析、血液学测试、血清化学测试、抗药物-抗体(ADA)分析和中和抗体分析(Nab)。

结果：

TIGIT-PD1异二聚体在携带人NSCLC肿瘤的NSG小鼠中的抗肿瘤作用

在接种了A549细胞(人肺腺癌细胞系)的11至13周龄雄性NSG小鼠中评估了TIGIT-PD1异二聚体DSP502的体内抗肿瘤作用。在肿瘤接种后的18天内，用DSP502治疗的小鼠的肿瘤体积几乎没有增加，而对照小鼠中的肿瘤体积达到400mm³的体积，表明用DSP502治疗可以显著抑制肿瘤生长(图26)。

TIGIT-PD1异二聚体在携带小鼠间皮瘤的小鼠中的抗肿瘤作用

在接种了AB12细胞(小鼠恶性胸膜间皮瘤(MPM)细胞系)的7周龄雌性BALB/c小鼠中评估TIGIT-PD1异二聚体DSP502的体内抗肿瘤作用。与对照小鼠相比，用DSP502治疗显著延长了小鼠存活时间(图27)。例如，87.5％的对照治疗小鼠在肿瘤接种后第33天死亡，62％的DSP502治疗小鼠在肿瘤接种后存活超过80天。

实施例6

相关异二聚体中LILRB2臂对M-CSF依赖性巨噬细胞成熟的作用

异二聚体的LILRB2臂被设计为通过竞争和阻断它们的相互作用，阻断由肿瘤或免疫细胞上表达的HLA-G诱导的针对在APC(例如巨噬细胞和树突状细胞)上表达的内源性LILRB2的免疫抑制信号。M1-样巨噬细胞显示出抗肿瘤活性，而M2-样巨噬细胞已被报道促进肿瘤进展。在M-CSF依赖性巨噬细胞成熟过程中，用拮抗性抗体阻断LILRB2可导致更圆、紧密粘附的M1-样(抗肿瘤)表型，并降低CD14和CD163的表达。在用LPS刺激所生成的巨噬细胞之后，检测到促炎细胞因子TNFα的分泌增加，抗炎IL-10的分泌减少。

为此，使用基于流式细胞术的CD14和CD163的检测，以及LPS预处理巨噬细胞刺激后TNFα和IL-10释放的测量，来评估含有LILRB2的异二聚体对M-CSF依赖性巨噬细胞成熟的影响。

实施例7

包含SIRPα或LILRB2结构域的异二聚体对巨噬细胞和多形核细胞的作用

一些实施方式的异二聚体的SIRPα部分被设计为通过竞争和阻断肿瘤细胞上的CD47与内源性SIRPα的相互作用，来部分阻断由表达CD47的肿瘤细胞诱导的针对在APC(例如巨噬细胞和粒细胞)上表达的内源性SIRPα的“别吃我”信号。这种“别吃我”信号的阻断会诱导肿瘤细胞的吞噬作用。

一些实施方式的异二聚体的LILRB2部分被设计成通过竞争和阻断肿瘤和免疫细胞上的HLA-G与内源性LILRB2的相互作用，部分阻断由肿瘤或免疫细胞上表达的HLA-G诱导的针对在APC(例如巨噬细胞和DC)上表达的内源性LILRB2的免疫抑制信号。这种对HLA-G“别吃我”的阻断会诱导肿瘤细胞吞噬作用，并阻止免疫细胞之间的抑制性HLA-G-LILRB2信号传导，从而增强吞噬作用。

使用基于流式细胞术的测定法或荧光显微术评估所产生的包含SIRPα的异二聚体对人巨噬细胞或多形核细胞(PMN)吞噬肿瘤细胞的作用，以及包含LILRB2的异二聚体对人巨噬细胞或DC吞噬肿瘤细胞的作用。

为此，使用基于流式细胞术的测定评估了SIRPα-LILRB2异二聚体DSP216对人PMN(粒细胞)吞噬肿瘤细胞的作用。将来自三个不同供体的粒细胞与1、2或5μg/mL DSP216一起温育，然后以1:1的E:T比例与表达人CD47的肿瘤细胞系HT1080或同时表达人CD47和人HLA-G的HT1080-HLA-G共培养(图12A和12D)。如图28所示，DSP216处理更大程度地增加了HT1080细胞和HT1080-HLA-G的吞噬百分比。

实施例8

包含TIGIT结构域的异二聚体对NK细胞的细胞毒性活性

自然杀伤(NK)细胞诱导直接细胞毒性或细胞因子/趋化因子的分泌，而无需像B细胞和T细胞特异性抗原识别。NK细胞毒性在针对感染细胞、恶性肿瘤和应激细胞的免疫应答中起重要作用，并参与多种疾病的病理过程。

本领域已知的许多测定法用于确定所产生的异二聚体对NK激活的作用，包括但不限于：

-细胞毒性测定-在共培养测定中NK细胞(效应细胞)杀死靶细胞。通过流式细胞术分析(FACS)来分析杀死百分比。将预先标记的靶细胞(例如K562 PVR/PD-L1细胞或K562 WT细胞)置于96孔板中，并在37℃下与预先标记的原代NK细胞以不同的效应物-靶(E:T)比例温育。可选地，在测定前，NK细胞用1000U/mL IL2温育48小时。在4、12和/或24小时后，收集细胞，并通过流式细胞术进行测定。从没有NK细胞的培养物中回收的靶细胞数量用作参照。

-细胞毒性测定-在共培养测定中NK细胞(效应细胞)杀死靶细胞。通过Incucyte机器使用标记的靶细胞和半胱天冬酶敏感的荧光底物测定杀死百分比。

-炎性细胞因子的分泌：原代NK细胞被各种靶细胞以不同比例刺激24小时。无细胞培养上清液中干扰素γ(IFN-γ)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平通过ELISA或流式微球阵列(CBA)测定。

-颗粒酶B的分泌：原代NK细胞被各种靶细胞以不同比例刺激12小时。用ELISA测定无细胞培养上清液中的颗粒酶B的水平。

结果：

NK细胞对K562 WT靶细胞的杀死高于对表达PVR和/或PD-L1的K562细胞的杀死(图29A)。将TIGIT-PD1异源二聚体DSP502加入到包含K562 WT细胞作为靶细胞的共培养物中，不会增加NK细胞毒性(数据未显示)。然而，与未处理的细胞相比，在所有测试的E:T比例下，向包含表达PVR和/或PD-L1的K562细胞作为靶细胞的共培养物中加入DSP502，显著增加了NK细胞毒性(图29A)。对于用DSP502异二聚体处理的同时表达PVR和PD-L1的K562细胞，观察到最显著的细胞毒性作用。

与上文所述的细胞毒性测定一致，与作为靶细胞同时表达PVR和/或PD-L1的K562细胞相比，与作为靶细胞的K562 WT共培养的NK细胞的颗粒酶B的分泌更高(图29B)。与所有测试的E:T比例下，与未处理的细胞相比，向包含同时表达PVR和/或PD-L1的K562细胞作为靶细胞的共培养物中加入DSP502显著增加了颗粒酶B的分泌(图29B)。与细胞毒性测定相同，在同时表达PVR和PD-L1的K562细胞中观察到颗粒酶B的分泌的最显著增加。

尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是显然，对于本领域技术人员来说，许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，旨在包含落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。

申请人的意图在于，本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部并入本说明书中，结合程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都通过引用具体和单独地结合到本说明书中。此外，本申请中任何参考的引用或标识不应解释为承认此类参考可作为本发明的现有技术。就所使用的章节标题而言，它们不应被理解为必要的限制。此外，本发明的任何一个或多个优先权文件的全部内容过引用的方式整体并入本文。

序列表

<110> 卡尔医学有限公司（KAHR Medical Ltd.）

托马斯杰斐逊大学（Thomas Jefferson University）

阿米·塔米尔（TAMIR, Ami）

马克·L·泰科辛斯基（TYKOCINSKI, Mark L.）

埃德温·布雷默（BREMER, Edwin）

<120> I型膜蛋白异二聚体及其使用方法（TYPE I MEMBRANE PROTEINSHETERODIMERS AND METHODS OF USE THEREOF）

<130> 89962

<150> US 63/136,687

<151> 2021-01-13

<150> US 63/139,331

<151> 2021-01-20

<160> 164

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 585

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> SIRP Fc(IgG1 knob) 585AA first monomer of DSP120, DSP216, DSP403,

DSP503

<400> 1

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

340 345 350

Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

355 360 365

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

370 375 380

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

385 390 395 400

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

405 410 415

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

420 425 430

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

435 440 445

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

450 455 460

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

465 470 475 480

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu

485 490 495

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

500 505 510

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

515 520 525

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

530 535 540

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

545 550 555 560

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

565 570 575

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580 585

<210> 2

<211> 1755

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #1

<400> 2

gaggaggagc tgcaggtcat ccagcccgat aagtctgtgc tggtggcagc aggagagacc 60

gccacactga ggtgcaccgc cacaagcctg atcccagtgg gaccaatcca gtggtttagg 120

ggagcaggcc ctggcagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt cccaagagtg 180

accacagtga gcgacctgac caagcggaac aatatggatt tttccatcag aatcggcaat 240

atcacacctg ccgacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg ctccccagac 300

gatgtggagt ttaagagcgg agcaggcacc gagctgtccg tgcgggcaaa gccttccgcc 360

ccagtggtgt ctggaccagc agccagagcc accccacagc acacagtgtc cttcacctgt 420

gagtctcacg gctttagccc ccgggacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaatgag 480

ctgtctgact ttcagaccaa cgtggacccc gtgggcgagt ctgtgagcta ttccatccac 540

tctacagcca aggtggtgct gacccgcgag gacgtgcaca gccaggtcat ctgcgaggtg 600

gcacacgtga ccctgcaggg cgatcctctg aggggcacag ccaatctgag cgagaccatc 660

agagtgcccc ctacactgga ggtgacccag cagcccgtgc gcgcagagaa ccaagtgaat 720

gtgacatgtc aggtgaggaa gttctaccct cagcgcctgc agctgacctg gctggagaac 780

ggcaacgtga gccggaccga gacagccagc accgtgacag agaacaagga cggcacatat 840

aattggatgt cttggctgct ggtgaacgtg agcgcccaca gggacgatgt gaagctgacc 900

tgccaggtgg agcacgacgg acagccagcc gtgtctaaga gccacgatct gaaggtgagc 960

gcccacccta aggagcaggg ctccaacaca gccgccgaga ataccggcag caacgagcgg 1020

aatatctacg gaggaggagg cagcggagga ggaggctccg agcctaagag ctccgacaag 1080

acccacacat gcccaccatg tcctgcacca gagctgctgg gaggaccttc cgtgttcctg 1140

tttcctccaa agccaaagga tacactgatg atctccagaa caccagaggt gacctgcgtg 1200

gtggtggacg tgtctcacga ggaccccgag gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg 1260

gaggtgcaca atgccaagac caagccaagg gaggagcagt acaactccac atatcgcgtg 1320

gtgtctgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta taagtgtaag 1380

gtgagcaata aggccctgcc cgcccctatc gagaagacca tctccaaggc aaagggacag 1440

cccagggagc ctcaggtgta cacactgccc ccttgccgcg acgagctgac caagaaccag 1500

gtgtctctgt ggtgtctggt gaagggcttc tacccatctg acatcgccgt ggagtgggag 1560

agcaatggcc agcccgagaa caattacaag accacaccac ccgtgctgga cagcgatggc 1620

tccttctttc tgtattccaa gctgacagtg gacaagtctc ggtggcagca gggcaacgtg 1680

ttttcctgtt ctgtgatgca cgaggccctg cacaatcact atacccagaa gagcctgtcc 1740

ctgtctcccg gcaag 1755

<210> 3

<211> 382

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 Fc (IgG1 hole) 382 AA second monomer of DSP120, DSP220,

DSP402, DSP502

<400> 3

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

145 150 155 160

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

165 170 175

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

180 185 190

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

195 200 205

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

210 215 220

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

245 250 255

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

260 265 270

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

275 280 285

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

290 295 300

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

305 310 315 320

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

325 330 335

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

340 345 350

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

355 360 365

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 4

<211> 1146

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of# 3

<400> 4

gattcacccg atagaccttg gaacccacct accttctccc ccgccctgct ggtggtgaca 60

gagggcgaca atgccacctt cacatgctct tttagcaaca cctccgagtc tttcgtgctg 120

aattggtaca ggatgagccc ctccaaccag acagataagc tggccgcatt tccagaggac 180

cgcagccagc caggacagga ttcccggttc agagtgaccc agctgcctaa tggccgggac 240

tttcacatgt ctgtggtgag agcccggaga aacgatagcg gcacatacct gtgcggagcc 300

atctccctgg cccctaaggc acagatcaag gagtccctga gggcagagct gagggtgacc 360

gagaggaggg cagaggtgcc aacagcacac ccttctccaa gcccccggcc tgcaggacag 420

ggaggaggag gctccggcgg cggcggctct gagccaaaga gctccgacaa gacccacaca 480

tgcccaccat gtccagcacc agagctgctg ggaggaccta gcgtgttcct gtttcctcca 540

aagccaaagg ataccctgat gatctctagg accccagagg tgacatgcgt ggtggtggac 600

gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttt aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 660

aacgccaaga caaagcctag ggaggagcag tacaattcta cctatcgcgt ggtgagcgtg 720

ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaat ggcaaggagt ataagtgtaa ggtgtccaac 780

aaggccctgc ctgccccaat cgagaagacc atctctaagg caaagggaca gccccgggag 840

cctcaggtgt gcaccctgcc ccctagcaga gacgagctga caaagaatca ggtgtccctg 900

tcttgtgccg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgcag tggagtggga gtccaacgga 960

cagcctgaga acaattataa gaccacacca cccgtgctgg actctgatgg cagcttcttt 1020

ctggtgtcca agctgaccgt ggacaagtct cggtggcagc agggcaacgt gtttagctgc 1080

tccgtgatgc acgaagcact gcacaaccac tacacccaga agtcactgtc actgtcccca 1140

ggaaag 1146

<210> 5

<211> 582

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> SIRP alpha (IgG4 knob) 582 AA first monomer of DSP120V1,

DSP216V1, DSP403V1, DSP503V1

<400> 5

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

340 345 350

Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

355 360 365

Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

370 375 380

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

385 390 395 400

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

405 410 415

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

420 425 430

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

435 440 445

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

450 455 460

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

465 470 475 480

Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

485 490 495

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

500 505 510

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

515 520 525

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

530 535 540

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

545 550 555 560

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

565 570 575

Ser Leu Ser Leu Gly Lys

580

<210> 6

<211> 1746

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#5

<400> 6

gaggaggagc tgcaggtcat ccagcccgat aagtctgtgc tggtggcagc aggagagacc 60

gccacactga gatgcaccgc cacaagcctg atcccagtgg gaccaatcca gtggtttagg 120

ggagcaggac ctggaaggga gctgatctac aaccagaagg agggccactt cccaagggtg 180

accacagtgt ccgacctgac caagcggaac aatatggatt tttctatcag aatcggcaat 240

atcacacctg ccgacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tcagaaaggg cagcccagac 300

gatgtggagt ttaagtccgg agcaggaacc gagctgtctg tgagagcaaa gcctagcgcc 360

ccagtggtgt ccggaccagc agcaagggca accccacagc acacagtgtc cttcacctgt 420

gagtcccacg gcttttctcc acgcgatatc acactgaagt ggttcaagaa cggcaatgag 480

ctgagcgact ttcagaccaa cgtggatccc gtgggcgagt ctgtgagcta ctccatccac 540

tctacagcca aggtggtgct gacccgggag gacgtgcaca gccaggtcat ctgcgaggtg 600

gcacacgtga ccctgcaggg cgatcctctg agaggcacag ccaatctgtc cgagaccatc 660

agggtgcccc ctacactgga ggtgacccag cagcccgtga gggcagagaa ccaagtgaat 720

gtgacatgtc aggtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggagaac 780

ggcaatgtga gccgcaccga gacagcctcc accgtgacag agaacaagga cggcacatat 840

aattggatga gctggctgct ggtgaacgtg tccgcccaca gggacgatgt gaagctgacc 900

tgccaggtgg agcacgacgg acagccagcc gtgtctaaga gccacgatct gaaggtgtcc 960

gcccacccta aggagcaggg ctctaacaca gccgccgaga ataccggcag caacgagaga 1020

aatatctacg gaggaggagg atccggagga ggaggatccg agtctaagta tggaccacca 1080

tgccctccat gtccagcacc tgagtttgag ggaggaccta gcgtgttcct gtttccccct 1140

aagccaaagg acacactgat gatctccagg acaccagagg tgacctgcgt ggtggtggac 1200

gtgtctcagg aggatcccga ggtgcagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac 1260

aatgccaaga ccaagcctag ggaggagcag tttaactcta cataccgcgt ggtgagcgtg 1320

ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac ggcaaggagt ataagtgtaa ggtgagcaat 1380

aagggcctgc caagctccat cgagaagacc atctccaagg caaagggaca gccaagggag 1440

cctcaggtgt gcacactgcc accctctcag gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg 1500

tggtgtctgg tgaagggctt ctacccaagc gacatcgccg tggagtggga gtccaatggc 1560

cagcccgaga acaattacaa gaccacacct ccagtgctgg actctgatgg cagcttcttt 1620

ctgtattcta ggctgacagt ggataagagc cgctggcagg agggcaacgt gtttagctgt 1680

tccgtgatgc acgaggccct gcacaatcac tatacccaga agtctctgag cctgtccctg 1740

ggcaag 1746

<210> 7

<211> 379

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 (IgG4 hole) 379 AA Second monomer of DSP120V1, DSP402V1,

DSP502V2, DSP502V3

<400> 7

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

145 150 155 160

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

165 170 175

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

180 185 190

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

195 200 205

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

210 215 220

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

245 250 255

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

260 265 270

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Cys

275 280 285

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

290 295 300

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

305 310 315 320

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

325 330 335

Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

340 345 350

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

355 360 365

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

370 375

<210> 8

<211> 1137

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#7

<400> 8

gactctccag ataggccttg gaatccccct acctttagcc ccgccctgct ggtggtgaca 60

gagggcgata acgccacctt cacatgctct tttagcaaca cctccgagtc tttcgtgctg 120

aattggtaca ggatgagccc ttccaaccag acagacaagc tggcagcatt tcctgaggac 180

cgcagccagc caggacagga ttcccggttc agagtgaccc agctgccaaa tggcagggac 240

tttcacatgt ctgtggtgcg cgcccggaga aacgatagcg gcacatacct gtgcggagca 300

atctccctgg caccaaaggc acagatcaag gagtccctga gggcagagct gagggtgacc 360

gagaggaggg ccgaggtgcc aacagcacac ccatctccta gcccaaggcc agcaggacag 420

ggaggaggag gctctggagg aggaggatcc gagtctaagt acggaccacc atgccctcca 480

tgtcctgcac cagagttcga gggaggacca tccgtgttcc tgtttccacc taagcctaag 540

gacaccctga tgatctccag aacccccgag gtgacatgcg tggtggtgga cgtgtctcag 600

gaggatcctg aggtgcagtt caattggtac gtggatggcg tggaggtgca caacgccaag 660

acaaagcccc gggaggagca gtttaattct acctacagag tggtgagcgt gctgacagtg 720

ctgcaccagg attggctgaa tggcaaggag tataagtgta aggtgagcaa caagggcctg 780

cctagctcca tcgagaagac catctccaag gccaagggcc agccaagaga gccccaggtg 840

tacaccctgc cacccagcca gtgcgagatg acaaagaatc aggtgagcct gtcctgtgcc 900

gtgaagggct tctaccctag cgacatcgca gtggagtggg agtccaacgg acagccagag 960

aacaattata agaccacacc tccagtgctg gactccgatg gctctttctt tctggtgtcc 1020

cggctgaccg tggataagag ccggtggcag gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 1080

cacgaggccc tgcacaacca ctatacacag aagtccctgt ctctgagcct gggcaag 1137

<210> 9

<211> 354

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT Fc (IgG1 Knob) 354 AA first monomer of DSP205, DSP404,

DSP502

<400> 9

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ala Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp

115 120 125

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

165 170 175

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

180 185 190

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

195 200 205

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

210 215 220

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

225 230 235 240

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

245 250 255

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

260 265 270

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

275 280 285

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

290 295 300

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

325 330 335

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

340 345 350

Gly Lys

<210> 10

<211> 1062

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#9

<400> 10

atgaccggca caatcgagac aacaggcaac atctctgccg agaagggagg cagcatcgcc 60

ctgcagtgcc acctgagcag caccacagcc caggtgaccc aggtgaactg ggagcagcag 120

gaccagctgc tggccatctc taatgccgat ctgggctggc acatcagccc atcctttaag 180

gatagggtgg caccaggacc aggcctgggc ctgaccctgc agagcctgac cgtgaatgac 240

acaggcgagt acttctgtat ctaccacaca tatcccgatg gcacctatac aggcagaatc 300

tttctggagg tgctggagtc tagcgtggcc gagcacggag gaggaggcag cggaggagga 360

ggctccgagc ctaagtcctc tgacaagacc cacacatgcc ccccttgtcc tgcaccagag 420

ctgctgggcg gaccttccgt gttcctgttt ccacccaagc caaaggatac cctgatgatc 480

tccaggaccc ctgaggtgac atgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaggtg 540

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaatg ccaagacaaa gcctcgggag 600

gagcagtaca actccaccta tagagtggtg tctgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 660

ctgaacggca aggagtataa gtgtaaggtg agcaataagg ccctgcccgc ccctatcgag 720

aaaaccatca gcaaggcaaa gggacagcca agggagccac aggtgtacac cctgcctcca 780

tgccgcgacg agctgacaaa gaaccaggtg agcctgtggt gtctggtgaa gggcttctat 840

ccatctgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatggccagc ccgagaacaa ttacaagacc 900

acaccccctg tgctggactc cgatggctct ttctttctgt atagcaagct gaccgtggac 960

aagtccagat ggcagcaggg caacgtgttt tcttgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1020

aatcactaca cacagaagtc cctgtctctg agccccggca ag 1062

<210> 11

<211> 645

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB Fc (IgG1 hole) 645 AA second monomer of DSP205, DSP216,

DSP412

<400> 11

Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser

1 5 10 15

Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp

35 40 45

Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile

50 55 60

Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

195 200 205

Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys

210 215 220

Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

260 265 270

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

275 280 285

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

290 295 300

Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

305 310 315 320

Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

325 330 335

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

355 360 365

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

370 375 380

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys

405 410 415

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

420 425 430

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

435 440 445

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

450 455 460

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

465 470 475 480

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

485 490 495

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

500 505 510

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

515 520 525

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

530 535 540

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

545 550 555 560

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

565 570 575

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

580 585 590

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu

595 600 605

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

610 615 620

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

625 630 635 640

Leu Ser Pro Gly Lys

645

<210> 12

<211> 1935

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NA of #11

<400> 12

cagaccggca caatcccaaa gcccaccctg tgggccgagc ctgattccgt gatcacccag 60

ggctctccag tgacactgtc ctgccagggc tctctggagg cccaggagta ccggctgtat 120

agagagaaga agtctgccag ctggatcacc cggatcagac ctgagctggt gaagaacggc 180

cagtttcaca tcccaagcat cacctgggag cacacaggcc ggtacggatg ccagtactat 240

tcccgggcca gatggagcga gctgtccgac cctctggtgc tggtcatgac cggcgcctat 300

cctaagccaa cactgagcgc ccagccatcc cctgtggtga ccagcggcgg cagagtgaca 360

ctgcagtgtg agtcccaggt ggccttcggc ggctttatcc tgtgcaagga gggcgaggag 420

gagcacccac agtgtctgaa cagccagcca cacgcccggg gcagctccag agccatcttc 480

tccgtgggac ccgtgagccc aaaccggaga tggagccacc ggtgctacgg ctatgacctg 540

aatagccctt acgtgtggtc tagcccatcc gatctgctgg agctgctggt gcccggcgtg 600

tccaagaagc cttccctgtc tgtgcagcca ggaccagtgg tggcaccagg agagtctctg 660

accctgcagt gcgtgagcga cgtgggctac gatcggttcg tgctgtataa ggagggagag 720

agggatctga ggcagctgcc aggcagacag ccacaggccg gcctgagcca ggccaacttt 780

acactgggcc cagtgagcag gtcctatggc ggacagtaca ggtgctatgg agcacacaat 840

ctgtcctctg agtgttctgc ccccagcgac cccctggaca tcctgatcac cggccagatc 900

aggggcacac ccttcatctc cgtgcagcct ggaccaaccg tggcctctgg cgagaacgtg 960

acactgctgt gccagtcttg gcgccagttc cacacctttc tgctgacaaa ggcaggagca 1020

gcagacgcac cactgaggct gcgcagcatc cacgagtacc ccaagtatca ggccgagttt 1080

ccaatgtctc cagtgaccag cgcccacgca ggcacataca ggtgttatgg cagcctgaac 1140

agcgacccct acctgctgag ccacccttcc gagccactgg agctggtggt gagcggagga 1200

ggaggctccg gaggaggagg ctctggcggc ggcggcagcg agcctaagag ctccgacaag 1260

acccacacat gcccaccttg tccagcacct gagctgctgg gaggaccatc cgtgttcctg 1320

tttccaccca agcctaagga taccctgatg atctctcgca cccctgaggt gacatgcgtg 1380

gtggtggacg tgagccacga ggaccccgag gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg 1440

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gtgtccaata aggccctgcc agcccccatc gagaagacca tctctaaggc aaagggacag 1620

cccagggagc ctcaggtgtg caccctgcct ccaagccgcg acgagctgac aaagaaccag 1680

gtgtctctga gctgtgccgt gaagggcttc tacccatctg acatcgccgt ggagtgggag 1740

agcaatggcc agcccgagaa caattataag accacacccc ctgtgctgga ctctgatggc 1800

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ttttcctgtt ctgtgatgca cgaggccctg cacaatcact acacacagaa gagcctgtcc 1920

ctgtctcccg gcaag 1935

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<211> 351

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT Fc (IgG4 knob) 351 AA first monomer of DSP205V1

<400> 13

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

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Gly Ser Ile Ala Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

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Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

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Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

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Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val

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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

165 170 175

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

180 185 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

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Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

275 280 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

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Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#13

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cctgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg tcccaggagg accccgaggt gcagttcaac 540

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aaggagtata agtgtaaggt gtctaataag ggcctgccct cctctatcga gaaaaccatc 720

agcaaggcca agggccagcc aagagagcca caggtgtgca ccctgccacc ttcccaggag 780

gagatgacaa agaaccaggt gtctctgtgg tgtctggtga agggcttcta cccatctgac 840

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<210> 15

<211> 642

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB Fc (IgG4 hole) 642 AA second monomer of DSP205V1, DSP216V1,

DSP412V1

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Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

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Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

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Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

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Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

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Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

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Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

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Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

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Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

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Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

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Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

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Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

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Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

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Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

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Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

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His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

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Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys

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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

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Gly Lys

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<223> NA of#15

<400> 16

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aggggcacac cctttatcag cgtgcagcca ggacctaccg tggcctccgg cgagaacgtg 960

acactgctgt gccagagctg gcgccagttc cacacctttc tgctgacaaa ggcaggagca 1020

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ccaatgtccc cagtgacctc tgcccacgca ggcacataca ggtgttatgg cagcctgaac 1140

agcgacccct acctgctgtc tcaccctagc gagccactgg agctggtggt gtctggagga 1200

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ggcaag 1926

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

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<400> 17

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gtgagcaata aggccctgcc cgcccctatc gagaagacca tctccaaggc aaagggacag 1440

cccagggagc ctcaggtgtg cacactgccc ccttcccgcg acgagctgac caagaaccag 1500

gtgtctctgt ggtgtctggt gaagggcttc tacccatctg acatcgccgt ggagtgggag 1560

agcaatggcc agcccgagaa caattacaag accacaccac ccgtgctgga cagcgatggc 1620

tccttctttc tgtattccaa gctgacagtg gacaagtctc ggtggcagca gggcaacgtg 1680

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ctgtctcccg gcaag 1755

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<211> 645

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB2 FC (IgG1 hole as IgG4) 645 AA second monomer of DSP216V2

<400> 19

Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser

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Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu

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Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

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Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

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Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

195 200 205

Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys

210 215 220

Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

260 265 270

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

275 280 285

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

290 295 300

Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

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Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

325 330 335

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

355 360 365

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

370 375 380

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys

405 410 415

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

420 425 430

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

435 440 445

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450 455 460

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

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Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

485 490 495

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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln

545 550 555 560

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

565 570 575

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

580 585 590

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu

595 600 605

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

610 615 620

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

625 630 635 640

Leu Ser Pro Gly Lys

645

<210> 20

<211> 1935

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#19

<400> 20

cagaccggca caatcccaaa gcccaccctg tgggccgagc ctgattccgt gatcacccag 60

ggctctccag tgacactgtc ctgccagggc tctctggagg cccaggagta ccggctgtat 120

agagagaaga agtctgccag ctggatcacc cggatcagac ctgagctggt gaagaacggc 180

cagtttcaca tcccaagcat cacctgggag cacacaggcc ggtacggatg ccagtactat 240

tcccgggcca gatggagcga gctgtccgac cctctggtgc tggtcatgac cggcgcctat 300

cctaagccaa cactgagcgc ccagccatcc cctgtggtga ccagcggcgg cagagtgaca 360

ctgcagtgtg agtcccaggt ggccttcggc ggctttatcc tgtgcaagga gggcgaggag 420

gagcacccac agtgtctgaa cagccagcca cacgcccggg gcagctccag agccatcttc 480

tccgtgggac ccgtgagccc aaaccggaga tggagccacc ggtgctacgg ctatgacctg 540

aatagccctt acgtgtggtc tagcccatcc gatctgctgg agctgctggt gcccggcgtg 600

tccaagaagc cttccctgtc tgtgcagcca ggaccagtgg tggcaccagg agagtctctg 660

accctgcagt gcgtgagcga cgtgggctac gatcggttcg tgctgtataa ggagggagag 720

agggatctga ggcagctgcc aggcagacag ccacaggccg gcctgagcca ggccaacttt 780

acactgggcc cagtgagcag gtcctatggc ggacagtaca ggtgctatgg agcacacaat 840

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aggggcacac ccttcatctc cgtgcagcct ggaccaaccg tggcctctgg cgagaacgtg 960

acactgctgt gccagtcttg gcgccagttc cacacctttc tgctgacaaa ggcaggagca 1020

gcagacgcac cactgaggct gcgcagcatc cacgagtacc ccaagtatca ggccgagttt 1080

ccaatgtctc cagtgaccag cgcccacgca ggcacataca ggtgttatgg cagcctgaac 1140

agcgacccct acctgctgag ccacccttcc gagccactgg agctggtggt gagcggagga 1200

ggaggctccg gaggaggagg ctctggcggc ggcggcagcg agcctaagag ctccgacaag 1260

acccacacat gcccaccttg tccagcacct gagctgctgg gaggaccatc cgtgttcctg 1320

tttccaccca agcctaagga taccctgatg atctctcgca cccctgaggt gacatgcgtg 1380

gtggtggacg tgagccacga ggaccccgag gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg 1440

gaggtgcaca atgccaagac aaagccccgg gaggagcagt acaacagcac ctatagagtg 1500

gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 1560

gtgtccaata aggccctgcc agcccccatc gagaagacca tctctaaggc aaagggacag 1620

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gtgtctctga gctgtgccgt gaagggcttc tacccatctg acatcgccgt ggagtgggag 1740

agcaatggcc agcccgagaa caattataag accacacccc ctgtgctgga ctctgatggc 1800

agcttctttc tggtgtccaa gctgaccgtg gataagtcta ggtggcagca gggcaacgtg 1860

ttttcctgtt ctgtgatgca cgaggccctg cacaatcact acacacagaa gagcctgtcc 1920

ctgtctcccg gcaag 1935

<210> 21

<211> 645

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

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<400> 21

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65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

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100 105 110

Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

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130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

195 200 205

Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys

210 215 220

Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

260 265 270

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

275 280 285

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

290 295 300

Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

305 310 315 320

Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

325 330 335

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

355 360 365

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

370 375 380

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys

405 410 415

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

420 425 430

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

435 440 445

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

450 455 460

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

465 470 475 480

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

485 490 495

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

500 505 510

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

515 520 525

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

530 535 540

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

545 550 555 560

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

565 570 575

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

580 585 590

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

595 600 605

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

610 615 620

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

625 630 635 640

Leu Ser Pro Gly Lys

645

<210> 22

<211> 642

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB2 Fc IgG4 knob 642 AA first monomer of DSP220V1

<400> 22

Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser

1 5 10 15

Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp

35 40 45

Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile

50 55 60

Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

195 200 205

Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys

210 215 220

Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

260 265 270

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

275 280 285

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

290 295 300

Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

305 310 315 320

Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

325 330 335

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

355 360 365

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

370 375 380

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys

405 410 415

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly

420 425 430

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

435 440 445

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

450 455 460

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

465 470 475 480

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

485 490 495

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

500 505 510

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

515 520 525

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

530 535 540

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

545 550 555 560

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

565 570 575

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

580 585 590

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp

595 600 605

Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

610 615 620

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

625 630 635 640

Gly Lys

<210> 23

<211> 1926

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#22

<400> 23

cagaccggca caatccccaa gcctaccctg tgggccgagc cagatagcgt gatcacccag 60

ggctcccccg tgacactgtc ttgccagggc agcctggagg cacaggagta ccggctgtat 120

agagagaaga agagcgcctc ctggatcacc cggatcagac ccgagctggt gaagaacggc 180

cagtttcaca tcccttccat cacctgggag cacacaggcc ggtacggatg ccagtactat 240

tctcgggcca gatggagcga gctgtccgac cccctggtgc tggtcatgac cggcgcctat 300

ccaaagccca cactgtccgc ccagccttct ccagtggtga cctctggcgg cagagtgaca 360

ctgcagtgtg agagccaggt ggccttcggc ggctttatcc tgtgcaagga gggcgaggag 420

gagcaccccc agtgtctgaa tagccagcct cacgcccggg gcagctccag agccatcttc 480

tctgtgggcc ctgtgagccc aaaccggaga tggtcccaca ggtgctacgg ctatgacctg 540

aacagcccat acgtgtggtc tagcccctct gatctgctgg agctgctggt gcctggcgtg 600

agcaagaagc catctctgag cgtgcagcca ggccctgtgg tggcacctgg cgagtctctg 660

accctgcagt gcgtgagcga cgtgggctac gatcggttcg tgctgtataa ggagggagag 720

agggatctga ggcagctgcc aggcagacag cctcaggcag gactgtccca ggcaaacttt 780

acactgggcc ccgtgagccg gagctacggc ggacagtacc gctgctatgg agcacacaat 840

ctgtcctctg agtgttctgc ccccagcgac cccctggaca tcctgatcac cggccagatc 900

aggggcacac cattcatcag cgtgcagcca ggaccaaccg tggcctccgg cgagaacgtg 960

acactgctgt gccagagctg gcgccagttc cacacctttc tgctgacaaa ggcaggagca 1020

gcagacgcac ctctgaggct gcgctccatc cacgagtacc caaagtatca ggccgagttt 1080

ccaatgagcc ccgtgacctc cgcccacgca ggcacataca gatgctatgg cagcctgaac 1140

agcgacccct acctgctgag ccacccttcc gagccactgg agctggtggt gtccggcggc 1200

ggcggctctg gcggaggagg cagcggagga ggaggatccg agtctaagta cggaccacca 1260

tgccctccat gtcctgcacc agagttcgag ggaggaccat ccgtgttcct gtttccacct 1320

aagcctaagg acaccctgat gatctccaga acccccgagg tgacatgcgt ggtggtggac 1380

gtgtctcagg aggatcctga ggtgcagttc aattggtacg tggatggcgt ggaggtgcac 1440

aacgccaaga caaagccccg ggaggagcag tttaatagca cctacagagt ggtgtccgtg 1500

ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaat ggcaaggagt ataagtgtaa ggtgagcaac 1560

aagggcctgc ctagctccat cgagaagacc atctccaagg ccaagggcca gccaagagag 1620

ccacaggtgt gcaccctgcc accaagccag gaggagatga caaagaatca ggtgtccctg 1680

tggtgtctgg tgaagggctt ctacccttcc gacatcgccg tggagtggga gtctaacggc 1740

cagccagaga acaattacaa gaccacacct ccagtgctgg actctgatgg cagcttcttt 1800

ctgtattctc ggctgaccgt ggataagagc agatggcagg agggcaacgt gttcagctgc 1860

tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tatacacaga agtctctgag cctgtccctg 1920

ggcaag 1926

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

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Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val Thr

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Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg Glu

50 55 60

Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro Ala

65 70 75 80

Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp Glu

85 90 95

Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr Asn

100 105 110

Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

145 150 155 160

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

165 170 175

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

180 185 190

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

195 200 205

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

210 215 220

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

225 230 235 240

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

245 250 255

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

260 265 270

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys

275 280 285

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

290 295 300

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

305 310 315 320

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

325 330 335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

340 345 350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

355 360 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 25

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> SIGLEC10 Fc (IgG4) 367 AA first monomer of DSP402V1, DSP412V1

<400> 25

Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln Asp

20 25 30

Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val Thr

35 40 45

Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg Glu

50 55 60

Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro Ala

65 70 75 80

Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp Glu

85 90 95

Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr Asn

100 105 110

Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

130 135 140

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val

145 150 155 160

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

165 170 175

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

180 185 190

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

195 200 205

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

210 215 220

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

225 230 235 240

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

245 250 255

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

260 265 270

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

275 280 285

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

290 295 300

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

305 310 315 320

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

325 330 335

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

340 345 350

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

355 360 365

<210> 26

<211> 1101

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#25

<400> 26

gatggccggt tttggatcag agtgcaggag tccgtgatgg tgcctgaggg cctgtctatc 60

agcgtgccat gctccttctc ttaccccaga caggactgga ccggctctac acccgcctac 120

ggctattggt ttaaggccgt gaccgagaca acaaagggcg cccctgtggc cacaaaccac 180

cagagcagag aggtggagat gtccacccgg ggcagattcc agctgacagg cgaccccgcc 240

aagggcaatt gtagcctggt catcagggac gcccagatgc aggatgagtc tcagtacttc 300

tttagggtgg agcgcggcag ctacgtgcgc tataacttta tgaatgatgg cttctttctg 360

aaggtgaccg ccctgacaca gaagggagga ggaggctccg gcggaggagg cagcgagtcc 420

aagtatggac caccttgccc accatgtcct gcaccagagt tcgagggagg acctagcgtg 480

ttcctgtttc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatca gcaggactcc tgaggtgaca 540

tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaggac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtggat 600

ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag ccacgggagg agcagtttaa ctctacctac 660

agagtggtga gcgtgctgac agtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtataag 720

tgtaaggtgt ctaataaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggcaaag 780

ggacagcccc gggagcctca ggtgtgcacc ctgccccctt cccaggagga gatgacaaag 840

aaccaggtgt ctctgtggtg tctggtgaag ggcttctacc caagcgacat cgccgtggag 900

tgggagtcca atggccagcc cgagaacaat tacaagacca caccacccgt gctggactcc 960

gatggctctt tctttctgta ttccaggctg accgtggata agtctcgctg gcaggagggc 1020

aacgtgtttt cttgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca atcactatac acagaagtcc 1080

ctgtctctga gcctgggcaa g 1101

<210> 27

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc linker (knob V1 only in DSP216V2) 232 aa

<400> 27

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 28

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc linker (hole V1 only in DSP216V2) 232 aa

<400> 28

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 29

<211> 375

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> SIGLEC10 Fc (IgG1 hole) 475 AA first monomer of DSP404, DSP403

<400> 29

Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln Asp

20 25 30

Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val Thr

35 40 45

Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg Glu

50 55 60

Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro Ala

65 70 75 80

Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp Glu

85 90 95

Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr Asn

100 105 110

Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

145 150 155 160

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

165 170 175

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

180 185 190

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

195 200 205

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

210 215 220

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

225 230 235 240

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

245 250 255

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

260 265 270

Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

275 280 285

Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

290 295 300

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

305 310 315 320

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser

325 330 335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

340 345 350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

355 360 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 30

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> SIGLEC10 Fc (IgG4 hole) second monomer of DSP404V1, DSP403V1

<400> 30

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ala Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp

115 120 125

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Glu Ser Lys Tyr

130 135 140

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro

145 150 155 160

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

165 170 175

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

180 185 190

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

195 200 205

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

210 215 220

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

245 250 255

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

260 265 270

Leu Pro Pro Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

275 280 285

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

290 295 300

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

305 310 315 320

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

325 330 335

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

340 345 350

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

355 360 365

Lys

<210> 31

<211> 351

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT No I42D Fc (IgG4 knob) 351 AA first monomer of DSP502V2

<400> 31

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

145 150 155 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

165 170 175

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

180 185 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

195 200 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

210 215 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

225 230 235 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

245 250 255

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

260 265 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

275 280 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305 310 315 320

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

325 330 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

340 345 350

<210> 32

<211> 1053

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of#31

<400> 32

atgaccggca caatcgagac aacaggcaac atctctgccg agaagggagg cagcatcatc 60

ctgcagtgcc acctgagcag caccacagcc caggtgaccc aggtgaactg ggagcagcag 120

gaccagctgc tggccatctc caatgccgat ctgggctggc acatcagccc ctcctttaag 180

gatagggtgg cacctggacc aggcctgggc ctgaccctgc agagcctgac cgtgaatgac 240

acaggcgagt acttctgtat ctaccacaca tatcctgatg gcacctatac aggcagaatc 300

tttctggagg tgctggagtc tagcgtggcc gagcacggag gaggaggctc cggaggagga 360

ggctctgaga gcaagtacgg accaccttgc ccaccatgtc cagcacctga gttcgaggga 420

ggacctagcg tgttcctgtt tcctccaaag ccaaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 480

cctgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg tcccaggagg accccgaggt gcagttcaac 540

tggtatgtgg atggcgtgga ggtgcacaat gccaagacaa agcccaggga ggagcagttt 600

aactccacct accgcgtggt gtctgtgctg acagtgctgc accaggactg gctgaacggc 660

aaggagtata agtgtaaggt gtctaataag ggcctgccct cctctatcga gaaaaccatc 720

agcaaggcca agggccagcc aagagagcca caggtgtgca ccctgccacc ttcccaggag 780

gagatgacaa agaaccaggt gtctctgtgg tgtctggtga agggcttcta cccatctgac 840

atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca attacaagac cacaccaccc 900

gtgctggaca gcgatggctc cttctttctg tatagccggc tgaccgtgga taagtccaga 960

tggcaggagg gcaacgtgtt ttcctgctct gtgatgcacg aggccctgca caatcactat 1020

acacagaaga gcctgtccct gtctctgggc aag 1053

<210> 33

<211> 355

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT WT Fc (IgG4 knob) 355AA first monomer of DSP502V3

<400> 33

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser

115 120 125

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

145 150 155 160

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

165 170 175

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

180 185 190

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

195 200 205

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

210 215 220

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

225 230 235 240

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

245 250 255

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

260 265 270

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

275 280 285

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

290 295 300

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

305 310 315 320

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

325 330 335

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

340 345 350

Leu Gly Lys

355

<210> 34

<211> 1065

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NA of #33

<400> 34

atgatgaccg gcactattga aactaccggc aacatctctg ccgagaaggg cggcagcatc 60

atcctccagt gccacctgag cagcaccaca gcccaggtga cacaggtgaa ctgggagcag 120

caggaccagc tgctggccat ctgtaatgcc gatctgggct ggcacatcag cccttccttc 180

aaggacaggg tggcccctgg cccaggcctg ggcctgaccc tccagagcct gaccgtgaat 240

gacacaggcg agtacttctg catctaccac acatatccag atggcaccta tacaggccgg 300

atctttctgg aggtgctgga gtctagcgtg gcagagcacg gcgccagagg cggaggaggc 360

agcggaggag gaggctctga gagcaagtac ggccctcctt gcccaccatg tccagcacct 420

gagtttgagg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga caccctgatg 480

atcagcagga ccccagaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccagga ggaccccgag 540

gtgcagttca actggtatgt ggatggcgtg gaggtgcaca atgccaagac aaagcccagg 600

gaggagcagt ttaactccac ctaccgcgtg gtgtctgtgc tgacagtgct gcaccaggat 660

tggctgaacg gcaaggagta taagtgtaag gtgtctaata agggcctgcc ttcctctatc 720

gagaaaacca tcagcaaggc aaagggacag ccacgcgagc cacaggtgtg caccctgccc 780

ccttcccagg aggagatgac aaagaaccag gtgtctctgt ggtgtctggt gaagggcttc 840

tacccctctg acatcgccgt ggagtgggag agcaatggcc agcctgagaa caattacaag 900

accacaccac ccgtgctgga cagcgatggc tccttctttc tgtatagccg gctgaccgtg 960

gataagtcca gatggcagga gggcaacgtg ttcagctgct ccgtgatgca cgaagcactg 1020

cacaatcatt acactcagaa gtccctgtcc ctgtcactgg gcaag 1065

<210> 35

<211> 354

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT Fc (IgG1 Hole) 354 AA second monomer of DSP503

<400> 35

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ala Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp

115 120 125

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

165 170 175

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

180 185 190

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

195 200 205

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

210 215 220

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

225 230 235 240

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

245 250 255

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

260 265 270

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

275 280 285

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

290 295 300

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

325 330 335

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

340 345 350

Gly Lys

<210> 36

<211> 351

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT Fc (IgG4 Hole) 351 AA second monomer of DSP503V1

<400> 36

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ala Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

145 150 155 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

165 170 175

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

180 185 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

195 200 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

210 215 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

225 230 235 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

245 250 255

Pro Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

260 265 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

275 280 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305 310 315 320

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

325 330 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

340 345 350

<210> 37

<211> 288

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> aa sequence of full length PD1

<400> 37

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 38

<211> 867

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> na sequence of full length PD1

<400> 38

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540

ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600

ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660

gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720

tgtgtccctg agcagacgga gtatgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780

tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840

gatggacact gctcttggcc cctctga 867

<210> 39

<211> 150

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 ECD Full with CYS93>Ser substitution

<400> 39

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val

145 150

<210> 40

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> na sequence encoding SEQ ID NO:39

<400> 40

cccggctggt ttctggactc tccagacaga ccttggaacc ctccaacctt ctctcccgct 60

ctgctggtgg ttaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gttccttcag caacacctcc 120

gagtccttcg tgctgaactg gtacagaatg tcccctagca accagaccga caagctggcc 180

gcctttcctg aggacagatc tcagccaggc caggactctc ggttcagagt tacccagctg 240

cctaacggcc gggacttcca catgtctgtt gtgcgggcca gacggaacga ctctggcaca 300

tatctgtgcg gcgccatctc tctggctccc aaggctcaga tcaaagagtc tctgcgggcc 360

gagctgagag tgacagaaag acgagctgag gtgcccaccg ctcatccctc accttctcca 420

agacctgctg gccagtttca gacactcgtg 450

<210> 41

<211> 167

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 ECM KNOWN FRAGMENT

<400> 41

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

165

<210> 42

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 ECM KNOWN FRAGMENT

<400> 42

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg

115 120

<210> 43

<211> 150

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 150 aa ORIGINAL PD1 DOMAIN

<400> 43

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val

145 150

<210> 44

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> na pf SEQ ID NO 43

<400> 44

ccaggatggt tcttagactc tccagatagg ccttggaatc cccctacctt tagccccgcc 60

ctgctggtgg tgacagaggg cgataacgcc accttcacat gctcttttag caacacctcc 120

gagtctttcg tgctgaattg gtacaggatg agcccttcca accagacaga caagctggca 180

gcatttcctg aggaccgctc ccagccaggc caggattgcc ggttcagagt gacccagctg 240

ccaaatggca gggactttca catgagcgtg gtgcgcgccc ggagaaacga ttccggcaca 300

tacctgtgcg gagcaatctc tctggcacca aaggcacaga tcaaggagtc cctgagggca 360

gagctgaggg tgaccgagag gagggccgag gtgccaacag cacacccatc tcctagccca 420

aggccagcag gacagttcca aaccctggtg 450

<210> 45

<211> 150

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 150 aa ORIGINAL PD1 DOMAIN with CYS93>Ser substitution

<400> 45

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val

145 150

<210> 46

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> na of SEQ ID NO 45

<400> 46

ccaggatggt tcttagactc tccagatagg ccttggaatc cccctacctt tagccccgcc 60

ctgctggtgg tgacagaggg cgataacgcc accttcacat gctcttttag caacacctcc 120

gagtctttcg tgctgaattg gtacaggatg agcccttcca accagacaga caagctggca 180

gcatttcctg aggaccgctc ccagccaggc caggattctc ggttcagagt gacccagctg 240

ccaaatggca gggactttca catgagcgtg gtgcgcgccc ggagaaacga ttccggcaca 300

tacctgtgcg gagcaatctc tctggcacca aaggcacaga tcaaggagtc cctgagggca 360

gagctgaggg tgaccgagag gagggccgag gtgccaacag cacacccatc tcctagccca 420

aggccagcag gacagttcca aaccctggtg 450

<210> 47

<211> 140

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 140 aa -5-5 in PD1 DOMAIN

<400> 47

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130 135 140

<210> 48

<211> 419

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> na of SEQ ID NO 47

<400> 48

gactctccag ataggccttg gaatccccct acctttagcc ccgccctgct ggtggtgaca 60

gagggcgata acgccacctt cacatgctct tttagcaaca cctccgagtc tttcgtgctg 120

aattggtaca ggatgagccc ttccaaccag acagacaagc tggcagcatt tcctgaggac 180

cgctcccagc caggccagga ttgccggttc agagtgaccc agctgccaaa tggcagggac 240

tttcacatga gcgtggtgcg cgcccggaga aacgattccg gcacatacct gtgcggagca 300

atctctctgg caccaaaggc acagatcaag gagtccctga gggcagagct gagggtgacc 360

gagaggaggg ccgaggtgcc aacagcacac ccatctccta gcccaaggcc agcaggaca 419

<210> 49

<211> 140

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 140 aa -5-5 in PD1 DOMAIN with CYS93>Ser substitution

<400> 49

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130 135 140

<210> 50

<211> 419

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> na of SEQ ID NO 49

<400> 50

gactctccag ataggccttg gaatccccct acctttagcc ccgccctgct ggtggtgaca 60

gagggcgata acgccacctt cacatgctct tttagcaaca cctccgagtc tttcgtgctg 120

aattggtaca ggatgagccc ttccaaccag acagacaagc tggcagcatt tcctgaggac 180

cgctcccagc caggccagga tctccggttc agagtgaccc agctgccaaa tggcagggac 240

tttcacatga gcgtggtgcg cgcccggaga aacgattccg gcacatacct gtgcggagca 300

atctctctgg caccaaaggc acagatcaag gagtccctga gggcagagct gagggtgacc 360

gagaggaggg ccgaggtgcc aacagcacac ccatctccta gcccaaggcc agcaggaca 419

<210> 51

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc linker (knob) 232 aa

<400> 51

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 52

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc linker (hole) 232 aa

<400> 52

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 53

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 128 aa PD1 segment

<400> 53

Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu

1 5 10 15

Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser

20 25 30

Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys

35 40 45

Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg

50 55 60

Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val

65 70 75 80

Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile

85 90 95

Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu

100 105 110

Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

115 120 125

<210> 54

<211> 384

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #53

<400> 54

ccttggaacc ctccaacctt ctctcccgct ctgctggtgg ttaccgaggg cgacaatgcc 60

accttcacct gttccttcag caacacctcc gagtccttcg tgctgaactg gtacagaatg 120

tcccctagca accagaccga caagctggcc gcctttcctg aggacagatc tcagccaggc 180

caggactgcc ggttcagagt tacccagctg cctaacggcc gggacttcca catgtctgtt 240

gtgcgggcca gacggaacga ctctggcaca tatctgtgcg gcgccatctc tctggctccc 300

aaggctcaga tcaaagagtc tctgcgggcc gagctgagag tgacagaaag acgagctgag 360

gtgcccaccg ctcatccctc acct 384

<210> 55

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 135 aa PD1 segment

<400> 55

Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu

1 5 10 15

Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser

20 25 30

Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys

35 40 45

Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg

50 55 60

Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val

65 70 75 80

Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile

85 90 95

Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu

100 105 110

Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

115 120 125

Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130 135

<210> 56

<211> 405

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #55

<400> 56

ccttggaacc ctccaacctt ctctcccgct ctgctggtgg ttaccgaggg cgacaatgcc 60

accttcacct gttccttcag caacacctcc gagtccttcg tgctgaactg gtacagaatg 120

tcccctagca accagaccga caagctggcc gcctttcctg aggacagatc tcagccaggc 180

caggactgcc ggttcagagt tacccagctg cctaacggcc gggacttcca catgtctgtt 240

gtgcgggcca gacggaacga ctctggcaca tatctgtgcg gcgccatctc tctggctccc 300

aaggctcaga tcaaagagtc tctgcgggcc gagctgagag tgacagaaag acgagctgag 360

gtgcccaccg ctcatccctc accttctcca agacctgccg gccag 405

<210> 57

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 133 aa PD1 segment

<400> 57

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro

130

<210> 58

<211> 399

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #57

<400> 58

gactcccctg acagaccttg gaaccctcca accttctctc ccgctctgct ggtggttacc 60

gagggcgaca atgccacctt cacctgttcc ttcagcaaca cctccgagtc cttcgtgctg 120

aactggtaca gaatgtcccc tagcaaccag accgacaagc tggccgcctt tcctgaggac 180

agatctcagc caggccagga ctgccggttc agagttaccc agctgcctaa cggccgggac 240

ttccacatgt ctgttgtgcg ggccagacgg aacgactctg gcacatatct gtgcggcgcc 300

atctctctgg ctcccaaggc tcagatcaaa gagtctctgc gggccgagct gagagtgaca 360

gaaagacgag ctgaggtgcc caccgctcat ccctcacct 399

<210> 59

<211> 135

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -10-5 (with CYS93>Ser substitution)

<400> 59

Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu

1 5 10 15

Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser

20 25 30

Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys

35 40 45

Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg

50 55 60

Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val

65 70 75 80

Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile

85 90 95

Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu

100 105 110

Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

115 120 125

Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130 135

<210> 60

<211> 405

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #59

<400> 60

ccttggaacc ctccaacctt ctctcccgct ctgctggtgg ttaccgaggg cgacaatgcc 60

accttcacct gttccttcag caacacctcc gagtccttcg tgctgaactg gtacagaatg 120

tcccctagca accagaccga caagctggcc gcctttcctg aggacagatc tcagccaggc 180

caggactctc ggttcagagt tacccagctg cctaacggcc gggacttcca catgtctgtt 240

gtgcgggcca gacggaacga ctctggcaca tatctgtgcg gcgccatctc tctggctccc 300

aaggctcaga tcaaagagtc tctgcgggcc gagctgagag tgacagaaag acgagctgag 360

gtgcccaccg ctcatccctc accttctcca agacctgctg gccag 405

<210> 61

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -10-12 (with CYS93>Ser substitution)

<400> 61

Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu

1 5 10 15

Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser

20 25 30

Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys

35 40 45

Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg

50 55 60

Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val

65 70 75 80

Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile

85 90 95

Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu

100 105 110

Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

115 120 125

<210> 62

<211> 384

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #61

<400> 62

ccttggaacc ctccaacctt ctctcccgct ctgctggtgg ttaccgaggg cgacaatgcc 60

accttcacct gttccttcag caacacctcc gagtccttcg tgctgaactg gtacagaatg 120

tcccctagca accagaccga caagctggcc gcctttcctg aggacagatc tcagccaggc 180

caggactctc ggttcagagt tacccagctg cctaacggcc gggacttcca catgtctgtt 240

gtgcgggcca gacggaacga ctctggcaca tatctgtgcg gcgccatctc tctggctccc 300

aaggctcaga tcaaagagtc tctgcgggcc gagctgagag tgacagaaag acgagctgag 360

gtgcccaccg ctcatccctc acct 384

<210> 63

<211> 133

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -5-12 (New, from V20) (with CYS93>Ser substitution)

<400> 63

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro

130

<210> 64

<211> 399

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #63

<400> 64

gactctccag acagaccttg gaaccctcca accttctctc ccgctctgct ggtggttacc 60

gagggcgaca atgccacctt cacctgttcc ttcagcaaca cctccgagtc cttcgtgctg 120

aactggtaca gaatgtcccc tagcaaccag accgacaagc tggccgcctt tcctgaggac 180

agatctcagc caggccagga ctctcggttc agagttaccc agctgcctaa cggccgggac 240

ttccacatgt ctgttgtgcg ggccagacgg aacgactctg gcacatatct gtgcggcgcc 300

atctctctgg ctcccaaggc tcagatcaaa gagtctctgc gggccgagct gagagtgaca 360

gaaagacgag ctgaggtgcc caccgctcat ccctcacct 399

<210> 65

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -11-12

<400> 65

Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly

1 5 10 15

Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe

20 25 30

Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe

50 55 60

Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser

85 90 95

Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg

100 105 110

Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

115 120 125

<210> 66

<211> 381

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #65

<400> 66

tggaaccctc caaccttctc tcccgctctg ctggtggtta ccgagggcga caatgccacc 60

ttcacctgtt ccttcagcaa cacctccgag tccttcgtgc tgaactggta cagaatgtcc 120

cctagcaacc agaccgacaa gctggccgcc tttcctgagg acagatctca gccaggccag 180

gactgtcggt tcagagtgac ccagctgcct aacggcagag acttccacat gtccgtcgtg 240

cgggccagaa gaaacgactc tggcacctat ctgtgcggcg ccatctctct ggctcccaag 300

gctcagatca aagagtctct gcgggccgag ctgagagtga cagaaagacg agctgaggtg 360

cccaccgctc atccctcacc t 381

<210> 67

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -11-12 (New, from V18) (with CYS93>Ser substitution)

<400> 67

Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly

1 5 10 15

Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe

20 25 30

Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe

50 55 60

Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser

85 90 95

Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg

100 105 110

Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro

115 120 125

<210> 68

<211> 381

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #67

<400> 68

tggaaccctc caaccttctc tcccgctctg ctggtggtta ccgagggcga caatgccacc 60

ttcacctgtt ccttcagcaa cacctccgag tccttcgtgc tgaactggta cagaatgtcc 120

cctagcaacc agaccgacaa gctggccgcc tttcctgagg acagatctca gccaggccag 180

gactctcggt tcagagtgac ccagctgcct aacggcagag acttccacat gtccgtcgtg 240

cgggccagaa gaaacgactc tggcacctat ctgtgcggcg ccatctctct ggctcccaag 300

gctcagatca aagagtctct gcgggccgag ctgagagtga cagaaagacg agctgaggtg 360

cccaccgctc atccctcacc t 381

<210> 69

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -11-5

<400> 69

Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly

1 5 10 15

Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe

20 25 30

Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe

50 55 60

Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser

85 90 95

Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg

100 105 110

Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130

<210> 70

<211> 402

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #69

<400> 70

tggaaccctc caaccttctc tcccgctctg ctggtggtta ccgagggcga caatgccacc 60

ttcacctgtt ccttcagcaa cacctccgag tccttcgtgc tgaactggta cagaatgtcc 120

cctagcaacc agaccgacaa gctggccgcc tttcctgagg acagatctca gccaggccag 180

gactgtcggt tcagagtgac ccagctgcct aacggcagag acttccacat gtccgtcgtg 240

cgggccagaa gaaacgactc tggcacctat ctgtgcggcg ccatctctct ggctcccaag 300

gctcagatca aagagtctct gcgggccgag ctgagagtga cagaaagacg agctgaggtg 360

cccaccgctc atccctcacc ttctccaaga cctgctggcc ag 402

<210> 71

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -11-5 (New, from V19) (with CYS93>Ser substitution)

<400> 71

Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly

1 5 10 15

Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe

20 25 30

Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Ser Arg Phe

50 55 60

Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val

65 70 75 80

Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser

85 90 95

Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg

100 105 110

Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Arg Pro Ala Gly Gln

130

<210> 72

<211> 402

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #71

<400> 72

tggaaccctc caaccttctc tcccgctctg ctggtggtta ccgagggcga caatgccacc 60

ttcacctgtt ccttcagcaa cacctccgag tccttcgtgc tgaactggta cagaatgtcc 120

cctagcaacc agaccgacaa gctggccgcc tttcctgagg acagatctca gccaggccag 180

gactctcggt tcagagtgac ccagctgcct aacggcagag acttccacat gtccgtcgtg 240

cgggccagaa gaaacgactc tggcacctat ctgtgcggcg ccatctctct ggctcccaag 300

gctcagatca aagagtctct gcgggccgag ctgagagtga cagaaagacg agctgaggtg 360

cccaccgctc atccctcacc ttctccaaga cctgctggcc ag 402

<210> 73

<211> 138

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -5-7

<400> 73

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala

130 135

<210> 74

<211> 414

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #73

<400> 74

gactctccag acagaccttg gaaccctcca accttctctc ccgctctgct ggtggttacc 60

gagggcgaca atgccacctt cacctgttcc ttcagcaaca cctccgagtc cttcgtgctg 120

aactggtaca gaatgtcccc tagcaaccag accgacaagc tggccgcctt tcctgaggac 180

agatctcagc caggccagga ctgtcggttc agagtgaccc agctgcctaa cggcagagac 240

ttccacatgt ccgtcgtgcg ggccagaaga aacgactctg gcacctatct gtgcggcgcc 300

atctctctgg ctcccaaggc tcagatcaaa gagtctctgc gggccgagct gagagtgaca 360

gaaagacgag ctgaggtgcc caccgctcat ccctcacctt ctccaagacc tgct 414

<210> 75

<211> 138

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -5-7 (New, from V21) (with CYS93>Ser substitution)

<400> 75

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala

130 135

<210> 76

<211> 414

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #75

<400> 76

gactctccag acagaccttg gaaccctcca accttctctc ccgctctgct ggtggttacc 60

gagggcgaca atgccacctt cacctgttcc ttcagcaaca cctccgagtc cttcgtgctg 120

aactggtaca gaatgtcccc tagcaaccag accgacaagc tggccgcctt tcctgaggac 180

agatctcagc caggccagga ctctcggttc agagtgaccc agctgcctaa cggcagagac 240

ttccacatgt ccgtcgtgcg ggccagaaga aacgactctg gcacctatct gtgcggcgcc 300

atctctctgg ctcccaaggc tcagatcaaa gagtctctgc gggccgagct gagagtgaca 360

gaaagacgag ctgaggtgcc caccgctcat ccctcacctt ctccaagacc tgct 414

<210> 77

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -5-9 from (with out CYS93>Ser substitution)

<400> 77

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

130 135

<210> 78

<211> 408

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #77

<400> 78

gactctccag acagaccttg gaaccctcca accttctctc ccgctctgct ggtggttacc 60

gagggcgaca atgccacctt cacctgttcc ttcagcaaca cctccgagtc cttcgtgctg 120

aactggtaca gaatgtcccc tagcaaccag accgacaagc tggccgcctt tcctgaggac 180

agatctcagc caggccagga ctgtcggttc agagttaccc agctgcctaa cggccgggac 240

ttccacatgt ctgttgtgcg ggccagacgg aacgactctg gcacatatct gtgcggcgcc 300

atctctctgg ctcccaaggc tcagatcaaa gagtctctgc gggccgagct gagagtgaca 360

gaaagacgag ctgaggtgcc caccgctcat ccctcacctt ctccaaga 408

<210> 79

<211> 145

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -0-5 from (with out CYS93>Ser substitution)

<400> 79

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln

145

<210> 80

<211> 435

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #79

<400> 80

cccggctggt ttctggactc tccagacaga ccttggaacc ctccaacctt ctctcccgct 60

ctgctggtgg ttaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gttccttcag caacacctcc 120

gagtccttcg tgctgaactg gtacagaatg tcccctagca accagaccga caagctggcc 180

gcctttcctg aggacagatc tcagccaggc caggactgtc ggttcagagt tacccagctg 240

cctaacggcc gggacttcca catgtctgtt gtgcgggcca gacggaacga ctctggcaca 300

tatctgtgcg gcgccatctc tctggctccc aaggctcaga tcaaagagtc tctgcgggcc 360

gagctgagag tgacagaaag acgagctgag gtgcccaccg ctcatccctc accttctcca 420

agacctgctg gccag 435

<210> 81

<211> 143

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1 -0-7 from (with out CYS93>Ser substitution) 143 aa

<400> 81

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala

130 135 140

<210> 82

<211> 429

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #81

<400> 82

cccggctggt ttctggactc tccagacaga ccttggaacc ctccaacctt ctctcccgct 60

ctgctggtgg ttaccgaggg cgacaatgcc accttcacct gttccttcag caacacctcc 120

gagtccttcg tgctgaactg gtacagaatg tcccctagca accagaccga caagctggcc 180

gcctttcctg aggacagatc tcagccaggc caggactgtc ggttcagagt tacccagctg 240

cctaacggcc gggacttcca catgtctgtt gtgcgggcca gacggaacga ctctggcaca 300

tatctgtgcg gcgccatctc tctggctccc aaggctcaga tcaaagagtc tctgcgggcc 360

gagctgagag tgacagaaag acgagctgag gtgcccaccg ctcatccctc accttctcca 420

agacctgct 429

<210> 83

<211> 504

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> aa sequence of full length SIRP alpha

<400> 83

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val

130 135 140

Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser

165 170 175

Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser

195 200 205

Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser

210 215 220

Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu

225 230 235 240

Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu

245 250 255

Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr

260 265 270

Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu

275 280 285

Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu

290 295 300

Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val

305 310 315 320

Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp

325 330 335

Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His

340 345 350

Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn

355 360 365

Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val

370 375 380

Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys

385 390 395 400

Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn

405 410 415

Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu

420 425 430

Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn

435 440 445

Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser

450 455 460

Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg

465 470 475 480

Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr

485 490 495

Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys

500

<210> 84

<211> 1512

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NA OF #83

<400> 84

atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60

gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 120

aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg gccattctgc actgcactgt gacctccctg 180

atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac cagcccggga attaatctac 240

aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagagtccac aaagagagaa 300

aacatggact tttccatcag catcagtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 360

tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac acggagttta agtctggagc aggcactgag 420

ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca 480

cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag tcccacggct tctcacccag agacatcacc 540

ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta 600

ggagagagcg tgtcctacag catccacagc acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac 660

gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt 720

gggactgcca acttgtctga gaccatccga gttccaccca ccttggaggt tactcaacag 780

cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag 840

agactacagc tgacctggtt ggagaatgga aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc 900

gttacagaga acaaggatgg tacctacaac tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct 960

gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc caggtggagc atgacgggca gccagcggtc 1020

agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc 1080

gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac atctatattg tggtgggtgt ggtgtgcacc 1140

ttgctggtgg ccctactgat ggcggccctc tacctcgtcc gaatcagaca gaagaaagcc 1200

cagggctcca cttcttctac aaggttgcat gagcccgaga agaatgccag agaaataaca 1260

caggacacaa atgatatcac atatgcagac ctgaacctgc ccaaggggaa gaagcctgct 1320

ccccaggctg cggagcccaa caaccacacg gagtatgcca gcattcagac cagcccgcag 1380

cccgcgtcgg aggacaccct cacctatgct gacctggaca tggtccacct caaccggacc 1440

cccaagcagc cggcccccaa gcctgagccg tccttctcag agtacgccag cgtccaggtc 1500

ccgaggaagt ga 1512

<210> 85

<211> 343

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> ORIGINAL SIRPa DOMAIN (343AA)

<400> 85

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr

340

<210> 86

<211> 1029

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NA OF #85

<400> 86

gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtat cagttgcagc tggagagtcg 60

gccattctgc actgcactgt gacctccctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120

ggagctggac cagcccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180

acaactgttt cagagtccac aaagagagaa aacatggact tttccatcag catcagtaac 240

atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccctgac 300

acggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gtgccaaacc ctctgccccc 360

gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag 420

tcccacggct tctcacccag agacatcacc ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc 480

tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta ggagagagcg tgtcctacag catccacagc 540

acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc 600

cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt gggactgcca acttgtctga gaccatccga 660

gttccaccca ccttggaggt tactcaacag cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc 720

acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag agactacagc tgacctggtt ggagaatgga 780

aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc gttacagaga acaaggatgg tacctacaac 840

tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc 900

caggtggagc atgacgggca gccagcggtc agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc 960

cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac 1020

atctatatt 1029

<210> 87

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 116 aa SIRPa segment

<400> 87

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala

115

<210> 88

<211> 348

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #87

<400> 88

gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60

gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120

ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180

accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240

atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300

gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagct 348

<210> 89

<211> 343

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 343 amino acids sequence of SIRPa with 4 point mutations

<400> 89

Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr

340

<210> 90

<211> 1029

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #89

<400> 90

gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60

gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120

ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180

accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240

atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300

gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa accttctgct 360

cccgtggtgt ctggccctgc cgctagagct acacctcagc acaccgtgtc ttttacctgc 420

gagtcccacg gcttcagccc tagagacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaacgag 480

ctgtccgact tccagaccaa cgtggaccct gtgggagagt ccgtgtccta ctccatccac 540

tctaccgcca aggtggtgct gacccgagag gacgtgcaca gccaagtgat ctgtgaagtg 600

gcccacgtga ccctccaggg cgatcctttg agaggcaccg ccaacctgtc cgagacaatc 660

agagtgcctc ctacactgga agtgacccag cagcctgtgc gggccgagaa tcaagtgaac 720

gtgacctgcc aagtgcggaa gttctaccct cagagactgc agctgacctg gctggaaaac 780

ggcaatgtgt ccagaaccga gacagcctcc accgtgaccg agaacaagga tggcacctac 840

aattggatgt cctggctgct cgtgaacgtg tccgctcaca gagatgacgt gaagctgaca 900

tgccaggtgg aacacgatgg ccagcctgcc gtgtctaagt cccacgacct gaaagtgtct 960

gctcacccca aagagcaggg ctccaatacc gccgctgaga acaccggctc caacgagaga 1020

aacatctac 1029

<210> 91

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 116 amino acids sequence of SIRPa with 4 point mutations

<400> 91

Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala

115

<210> 92

<211> 348

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #91

<400> 92

gaagaggaaa tccaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60

gccacactga gatgtaccat cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120

ggcgctggac ctggcagagt gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180

accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240

atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcatcaagt tccggaaggg ctcccctgac 300

gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagct 348

<210> 93

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> aa SIRPa segment - addition K at the C-ter of SEQ ID 87 (117 aa

SIRPa segment)

<400> 93

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys

115

<210> 94

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA OF #93

<400> 94

gaagaggaac tgcaagtgat ccagcctgac aagtccgtgc tggtggctgc tggcgaaacc 60

gccacactga gatgtaccgc cacctctctg atccctgtgg gccctatcca gtggtttaga 120

ggcgctggac ctggcagaga gctgatctac aaccagaaag agggccactt tcctagagtg 180

accaccgtgt ccgacctgac caagcggaac aacatggact tctccatccg gatcggcaac 240

atcacccctg ctgatgccgg cacctactac tgcgtgaagt tccggaaggg ctcccctgac 300

gacgtcgagt ttaaatccgg cgctggcacc gaactgtccg tgcgagctaa g 351

<210> 95

<211> 440

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LILRB2 Full ECD AA SEQUENCE

<400> 95

Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser

1 5 10 15

Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp

35 40 45

Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile

50 55 60

Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

195 200 205

Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys

210 215 220

Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

260 265 270

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

275 280 285

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

290 295 300

Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

305 310 315 320

Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

325 330 335

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

355 360 365

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

370 375 380

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro

385 390 395 400

Ser Met Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly Pro Ile Ser Thr Pro Ala

405 410 415

Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly Ser Asp Pro Gln Ser

420 425 430

Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val

435 440

<210> 96

<211> 398

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB2 D1-4, AA 22-419 (Q8N423-1 UniParc) AA SEQUENCE

<400> 96

Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser

1 5 10 15

Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp

35 40 45

Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile

50 55 60

Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

195 200 205

Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys

210 215 220

Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

260 265 270

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

275 280 285

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

290 295 300

Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

305 310 315 320

Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

325 330 335

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

355 360 365

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

370 375 380

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser

385 390 395

<210> 97

<211> 1194

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB2 D1-4, AA 22-419 (Q8N423-1 UniParc) NA SEQUENCE

<400> 97

cagaccggca caatccccaa gcctaccctg tgggccgagc cagatagcgt gatcacccag 60

ggctcccccg tgacactgtc ttgccagggc agcctggagg cacaggagta ccggctgtat 120

agagagaaga agagcgcctc ctggatcacc cggatcagac ccgagctggt gaagaacggc 180

cagtttcaca tcccttccat cacctgggag cacacaggcc ggtacggatg ccagtactat 240

tctcgggcca gatggagcga gctgtccgac cccctggtgc tggtcatgac cggcgcctat 300

ccaaagccca cactgtccgc ccagccttct ccagtggtga cctctggcgg cagagtgaca 360

ctgcagtgtg agagccaggt ggccttcggc ggctttatcc tgtgcaagga gggcgaggag 420

gagcaccccc agtgtctgaa tagccagcct cacgcccggg gcagctccag agccatcttc 480

tctgtgggcc ctgtgagccc aaaccggaga tggtcccaca ggtgctacgg ctatgacctg 540

aacagcccat acgtgtggtc tagcccctct gatctgctgg agctgctggt gcctggcgtg 600

agcaagaagc catctctgag cgtgcagcca ggccctgtgg tggcacctgg cgagtctctg 660

accctgcagt gcgtgagcga cgtgggctac gatcggttcg tgctgtataa ggagggagag 720

agggatctga ggcagctgcc aggcagacag cctcaggcag gactgtccca ggcaaacttt 780

acactgggcc ccgtgagccg gagctacggc ggacagtacc gctgctatgg agcacacaat 840

ctgtcctctg agtgttctgc ccccagcgac cccctggaca tcctgatcac cggccagatc 900

aggggcacac cattcatcag cgtgcagcca ggaccaaccg tggcctccgg cgagaacgtg 960

acactgctgt gccagagctg gcgccagttc cacacctttc tgctgacaaa ggcaggagca 1020

gcagacgcac ctctgaggct gcgctccatc cacgagtacc caaagtatca ggccgagttt 1080

ccaatgagcc ccgtgacctc cgcccacgca ggcacataca gatgctatgg cagcctgaac 1140

agcgacccct acctgctgag ccacccttcc gagccactgg agctggtggt gtcc 1194

<210> 98

<211> 198

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB2 D1-2, AA 22-219 (Q8N423-1 UniParc) AA SEQUENCE

<400> 98

Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser

1 5 10 15

Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp

35 40 45

Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile

50 55 60

Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro

195

<210> 99

<211> 594

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB2 D1-2, AA 22-219 (Q8N423-1 UniParc) NA SEQUENCE

<400> 99

cagaccggca caatccccaa gcctaccctg tgggccgagc cagatagcgt gatcacccag 60

ggctcccccg tgacactgtc ttgccagggc agcctggagg cacaggagta ccggctgtat 120

agagagaaga agagcgcctc ctggatcacc cggatcagac ccgagctggt gaagaacggc 180

cagtttcaca tcccttccat cacctgggag cacacaggcc ggtacggatg ccagtactat 240

tctcgggcca gatggagcga gctgtccgac cccctggtgc tggtcatgac cggcgcctat 300

ccaaagccca cactgtccgc ccagccttct ccagtggtga cctctggcgg cagagtgaca 360

ctgcagtgtg agagccaggt ggccttcggc ggctttatcc tgtgcaagga gggcgaggag 420

gagcaccccc agtgtctgaa tagccagcct cacgcccggg gcagctccag agccatcttc 480

tctgtgggcc ctgtgagccc aaaccggaga tggtcccaca ggtgctacgg ctatgacctg 540

aacagcccat acgtgtggtc tagcccctct gatctgctgg agctgctggt gcct 594

<210> 100

<211> 697

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Siglec 10 full length (Q96LC7-1 Uniprot) AA SEQUENCE

<400> 100

Met Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gly Ser Gln Ala

1 5 10 15

Met Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln

35 40 45

Asp Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val

50 55 60

Thr Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg

65 70 75 80

Glu Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro

85 90 95

Ala Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp

100 105 110

Glu Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr

115 120 125

Asn Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln

130 135 140

Lys Pro Asp Val Tyr Ile Pro Glu Thr Leu Glu Pro Gly Gln Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ile Cys Val Phe Asn Trp Ala Phe Glu Glu Cys Pro Pro Pro

165 170 175

Ser Phe Ser Trp Thr Gly Ala Ala Leu Ser Ser Gln Gly Thr Lys Pro

180 185 190

Thr Thr Ser His Phe Ser Val Leu Ser Phe Thr Pro Arg Pro Gln Asp

195 200 205

His Asn Thr Asp Leu Thr Cys His Val Asp Phe Ser Arg Lys Gly Val

210 215 220

Ser Ala Gln Arg Thr Val Arg Leu Arg Val Ala Tyr Ala Pro Arg Asp

225 230 235 240

Leu Val Ile Ser Ile Ser Arg Asp Asn Thr Pro Ala Leu Glu Pro Gln

245 250 255

Pro Gln Gly Asn Val Pro Tyr Leu Glu Ala Gln Lys Gly Gln Phe Leu

260 265 270

Arg Leu Leu Cys Ala Ala Asp Ser Gln Pro Pro Ala Thr Leu Ser Trp

275 280 285

Val Leu Gln Asn Arg Val Leu Ser Ser Ser His Pro Trp Gly Pro Arg

290 295 300

Pro Leu Gly Leu Glu Leu Pro Gly Val Lys Ala Gly Asp Ser Gly Arg

305 310 315 320

Tyr Thr Cys Arg Ala Glu Asn Arg Leu Gly Ser Gln Gln Arg Ala Leu

325 330 335

Asp Leu Ser Val Gln Tyr Pro Pro Glu Asn Leu Arg Val Met Val Ser

340 345 350

Gln Ala Asn Arg Thr Val Leu Glu Asn Leu Gly Asn Gly Thr Ser Leu

355 360 365

Pro Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Cys Leu Val Cys Val Thr His Ser

370 375 380

Ser Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Gln Arg Gly Gln Val Leu Ser

385 390 395 400

Pro Ser Gln Pro Ser Asp Pro Gly Val Leu Glu Leu Pro Arg Val Gln

405 410 415

Val Glu His Glu Gly Glu Phe Thr Cys His Ala Arg His Pro Leu Gly

420 425 430

Ser Gln His Val Ser Leu Ser Leu Ser Val His Tyr Ser Pro Lys Leu

435 440 445

Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Ser Cys

450 455 460

Ser Ser Gln Ala Ser Pro Ala Pro Ser Leu Arg Trp Trp Leu Gly Glu

465 470 475 480

Glu Leu Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asp Ser Phe Glu Val Thr Pro

485 490 495

Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ser Leu His Gly Gly

500 505 510

Leu Ser Ser Gly Leu Arg Leu Arg Cys Glu Ala Trp Asn Val His Gly

515 520 525

Ala Gln Ser Gly Ser Ile Leu Gln Leu Pro Asp Lys Lys Gly Leu Ile

530 535 540

Ser Thr Ala Phe Ser Asn Gly Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ile Thr Ala

545 550 555 560

Leu Leu Phe Leu Cys Leu Ala Leu Ile Ile Met Lys Ile Leu Pro Lys

565 570 575

Arg Arg Thr Gln Thr Glu Thr Pro Arg Pro Arg Phe Ser Arg His Ser

580 585 590

Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Asn Val Val Pro Thr Ala Gly Pro Leu Ala

595 600 605

Gln Lys Arg Asn Gln Lys Ala Thr Pro Asn Ser Pro Arg Thr Pro Leu

610 615 620

Pro Pro Gly Ala Pro Ser Pro Glu Ser Lys Lys Asn Gln Lys Lys Gln

625 630 635 640

Tyr Gln Leu Pro Ser Phe Pro Glu Pro Lys Ser Ser Thr Gln Ala Pro

645 650 655

Glu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Glu Leu His Tyr Ala Thr Leu Asn Phe

660 665 670

Pro Gly Val Arg Pro Arg Pro Glu Ala Arg Met Pro Lys Gly Thr Gln

675 680 685

Ala Asp Tyr Ala Glu Val Lys Phe Gln

690 695

<210> 101

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Siglec 10, AA 18-145 NO MUTATION (Q96LC7-1 Uniprot) AA SEQUENCE

<400> 101

Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Leu Cys Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln Asp

20 25 30

Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val Thr

35 40 45

Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg Glu

50 55 60

Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro Ala

65 70 75 80

Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp Glu

85 90 95

Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr Asn

100 105 110

Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln Lys

115 120 125

<210> 102

<211> 186

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Siglec 10, AA 18-145 NO MUTATION (Q96LC7-1 Uniprot) NA SEQUENCE

<400> 102

gatggccggt tttggatcag agtgcaggag tccgtgatgg tgcctgaggg cctgtgcatc 60

agcgtgccat gctccttctc ttaccccaga caggactgga ccggctctac acccgcctac 120

ggctattggt ttaaggccgt gaccgagaca acaaagggcg cccctgtggc cacaaaccac 180

cagagc 186

<210> 103

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Siglec 10, AA 18-145 plus C36S (Q96LC7-1 Uniprot) AA SEQUENCE

<400> 103

Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro Glu

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln Asp

20 25 30

Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val Thr

35 40 45

Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg Glu

50 55 60

Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro Ala

65 70 75 80

Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp Glu

85 90 95

Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr Asn

100 105 110

Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln Lys

115 120 125

<210> 104

<211> 384

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Siglec 10, AA 18-145 plus C36S (Q96LC7-1 Uniprot) NA SEQUENCE

<400> 104

gatggccggt tttggatcag agtgcaggag tccgtgatgg tgcctgaggg cctgtctatc 60

agcgtgccat gctccttctc ttaccccaga caggactgga ccggctctac acccgcctac 120

ggctattggt ttaaggccgt gaccgagaca acaaagggcg cccctgtggc cacaaaccac 180

cagagcagag aggtggagat gtccacccgg ggcagattcc agctgacagg cgaccccgcc 240

aagggcaatt gtagcctggt catcagggac gcccagatgc aggatgagtc tcagtacttc 300

tttagggtgg agcgcggcag ctacgtgcgc tataacttta tgaatgatgg cttctttctg 360

aaggtgaccg ccctgacaca gaag 384

<210> 105

<211> 534

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Siglec 10 full ECD, AA 17-550 (Q96LC7-1 Uniprot) AA SEQUENCE

<400> 105

Met Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro

1 5 10 15

Glu Gly Leu Cys Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln

20 25 30

Asp Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val

35 40 45

Thr Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg

50 55 60

Glu Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro

65 70 75 80

Ala Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp

85 90 95

Glu Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr

100 105 110

Asn Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln

115 120 125

Lys Pro Asp Val Tyr Ile Pro Glu Thr Leu Glu Pro Gly Gln Pro Val

130 135 140

Thr Val Ile Cys Val Phe Asn Trp Ala Phe Glu Glu Cys Pro Pro Pro

145 150 155 160

Ser Phe Ser Trp Thr Gly Ala Ala Leu Ser Ser Gln Gly Thr Lys Pro

165 170 175

Thr Thr Ser His Phe Ser Val Leu Ser Phe Thr Pro Arg Pro Gln Asp

180 185 190

His Asn Thr Asp Leu Thr Cys His Val Asp Phe Ser Arg Lys Gly Val

195 200 205

Ser Ala Gln Arg Thr Val Arg Leu Arg Val Ala Tyr Ala Pro Arg Asp

210 215 220

Leu Val Ile Ser Ile Ser Arg Asp Asn Thr Pro Ala Leu Glu Pro Gln

225 230 235 240

Pro Gln Gly Asn Val Pro Tyr Leu Glu Ala Gln Lys Gly Gln Phe Leu

245 250 255

Arg Leu Leu Cys Ala Ala Asp Ser Gln Pro Pro Ala Thr Leu Ser Trp

260 265 270

Val Leu Gln Asn Arg Val Leu Ser Ser Ser His Pro Trp Gly Pro Arg

275 280 285

Pro Leu Gly Leu Glu Leu Pro Gly Val Lys Ala Gly Asp Ser Gly Arg

290 295 300

Tyr Thr Cys Arg Ala Glu Asn Arg Leu Gly Ser Gln Gln Arg Ala Leu

305 310 315 320

Asp Leu Ser Val Gln Tyr Pro Pro Glu Asn Leu Arg Val Met Val Ser

325 330 335

Gln Ala Asn Arg Thr Val Leu Glu Asn Leu Gly Asn Gly Thr Ser Leu

340 345 350

Pro Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Cys Leu Val Cys Val Thr His Ser

355 360 365

Ser Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Gln Arg Gly Gln Val Leu Ser

370 375 380

Pro Ser Gln Pro Ser Asp Pro Gly Val Leu Glu Leu Pro Arg Val Gln

385 390 395 400

Val Glu His Glu Gly Glu Phe Thr Cys His Ala Arg His Pro Leu Gly

405 410 415

Ser Gln His Val Ser Leu Ser Leu Ser Val His Tyr Ser Pro Lys Leu

420 425 430

Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Ser Cys

435 440 445

Ser Ser Gln Ala Ser Pro Ala Pro Ser Leu Arg Trp Trp Leu Gly Glu

450 455 460

Glu Leu Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asp Ser Phe Glu Val Thr Pro

465 470 475 480

Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ser Leu His Gly Gly

485 490 495

Leu Ser Ser Gly Leu Arg Leu Arg Cys Glu Ala Trp Asn Val His Gly

500 505 510

Ala Gln Ser Gly Ser Ile Leu Gln Leu Pro Asp Lys Lys Gly Leu Ile

515 520 525

Ser Thr Ala Phe Ser Asn

530

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<211> 244

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT full length (Q495A1 Uniprot ID) AA SEQUENCE

<400> 106

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

165 170 175

Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

195 200 205

Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp

210 215 220

Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe

225 230 235 240

Thr Glu Thr Gly

<210> 107

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, AA 22-134 NO MUTATIONS (Q495A1 Uniprot ID) AA SEQUENCE

<400> 107

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

<210> 108

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, ECD AA 22-134 NO MUTATIONS (Q495A1 Uniprot ID) NA SEQUENCE

<400> 108

atgaccggca caatcgagac aacaggcaac atctctgccg agaagggagg cagcatcatc 60

ctgcagtgcc acctgagcag caccacagcc caggtgaccc aggtgaactg ggagcagcag 120

gaccagctgc tggccatctg caatgccgat ctgggctggc acatcagccc ctcctttaag 180

gatagggtgg cacctggacc aggcctgggc ctgaccctgc agagcctgac cgtgaatgac 240

acaggcgagt acttctgtat ctaccacaca tatcctgatg gcacctatac aggcagaatc 300

tttctggagg tgctggagtc tagcgtggcc gagcac 336

<210> 109

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, AA 22-134 plus I42A C69S (Q495A1 Uniprot ID) AA SEQUENCE

<400> 109

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ala Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

<210> 110

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, AA 22-134 plus I42A C69S (Q495A1 Uniprot ID) NA SEQUENCE

<400> 110

atgaccggca caatcgagac aacaggcaac atctctgccg agaagggagg cagcatcgcc 60

ctgcagtgcc acctgagcag caccacagcc caggtgaccc aggtgaactg ggagcagcag 120

gaccagctgc tggccatctc caatgccgat ctgggctggc acatcagccc ctcctttaag 180

gatagggtgg cacctggacc aggcctgggc ctgaccctgc agagcctgac cgtgaatgac 240

acaggcgagt acttctgtat ctaccacaca tatcctgatg gcacctatac aggcagaatc 300

tttctggagg tgctggagtc tagcgtggcc gagcac 336

<210> 111

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, AA 22-134 C69S (Q495A1 Uniprot ID in DSP 502V2) 112 AA,

SEQUENCE

<400> 111

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

<210> 112

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, AA 22-134 C69S (Q495A1 Uniprot ID in DSP 502V2)336 NA,

SEQUENCE

<400> 112

atgaccggca caatcgagac aacaggcaac atctctgccg agaagggagg cagcatcatc 60

ctgcagtgcc acctgagcag caccacagcc caggtgaccc aggtgaactg ggagcagcag 120

gaccagctgc tggccatctc caatgccgat ctgggctggc acatcagccc ctcctttaag 180

gatagggtgg cacctggacc aggcctgggc ctgaccctgc agagcctgac cgtgaatgac 240

acaggcgagt acttctgtat ctaccacaca tatcctgatg gcacctatac aggcagaatc 300

tttctggagg tgctggagtc tagcgtggcc gagcac 336

<210> 113

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, ECD AA 22-137 (Q495A1 Uniprot ID in DSP 502V3) 116 AA,

SEQUENCE

<400> 113

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg

115

<210> 114

<211> 348

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT, ECD AA 22-137 (Q495A1 Uniprot ID in DSP 502V3) 348 NA,

SEQUENCE

<400> 114

atgatgaccg gcactattga aactaccggc aacatctctg ccgagaaggg cggcagcatc 60

atcctccagt gccacctgag cagcaccaca gcccaggtga cacaggtgaa ctgggagcag 120

caggaccagc tgctggccat ctgtaatgcc gatctgggct ggcacatcag cccttccttc 180

aaggacaggg tggcccctgg cccaggcctg ggcctgaccc tccagagcct gaccgtgaat 240

gacacaggcg agtacttctg catctaccac acatatccag atggcaccta tacaggccgg 300

atctttctgg aggtgctgga gtctagcgtg gcagagcacg gcgccaga 348

<210> 115

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT full ECD AA 22-141 (Q495A1 Uniprot ID) 120 AA, SEQUENCE

<400> 115

Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln

20 25 30

Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys

35 40 45

Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val

50 55 60

Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn

65 70 75 80

Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu

100 105 110

His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro

115 120

<210> 116

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> artificial signal peptide

<400> 116

Met Glu Ser Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Asp Gly Val His Ala

20

<210> 117

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 117

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 118

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 118

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 119

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 120

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 120

Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 121

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 121

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 122

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 122

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 123

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<220>

<221> REPEAT

<222> (6)..(10)

<223> may be absent

<220>

<221> REPEAT

<222> (11)..(15)

<223> may be absent

<220>

<221> REPEAT

<222> (16)..(20)

<223> may be absent

<400> 123

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 124

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 124

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 126

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<220>

<221> REPEAT

<222> (6)..(10)

<223> may be absent

<220>

<221> REPEAT

<222> (11)..(15)

<223> may be absent

<400> 126

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

<210> 127

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<220>

<221> REPEAT

<222> (12)..(16)

<223> may be absent

<220>

<221> REPEAT

<222> (17)..(21)

<223> may be absent

<220>

<221> REPEAT

<222> (22)..(26)

<223> may be absent

<400> 127

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

20 25

<210> 128

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 128

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 129

<211> 46

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 129

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala

20 25 30

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

35 40 45

<210> 130

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 130

Pro Ala Pro Ala Pro

1 5

<210> 131

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 131

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 132

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 132

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr

1 5 10

<210> 133

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 133

Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe

1 5 10

<210> 134

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4 Fc linker 229 aa

<400> 134

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 135

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4 Fc linker (knob) 229 aa

<400> 135

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 136

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4 Fc linker (hole) 229 aa

<400> 136

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 137

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc linker , (AA 99-330 fromP01857-1 plus C220S (kabat)

substitution 232 amino acids.

<400> 137

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 138

<211> 359

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> short SIRPa- Fc (IgG1 knob)359 AA, first monomer of DSP216V3

<400> 138

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 139

<211> 1077

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #138

<400> 139

gaggaggagc tgcaggtcat ccagcccgat aagtctgtgc tggtggcagc aggagagacc 60

gccacactga ggtgcaccgc cacaagcctg atcccagtgg gaccaatcca gtggtttagg 120

ggagcaggcc ctggcagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt cccaagagtg 180

accacagtga gcgacctgac caagcggaac aatatggatt tttccatcag aatcggcaat 240

atcacacctg ccgacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg ctccccagac 300

gatgtggagt ttaagagcgg agcaggcacc gagctgtccg tgcgggcaaa gggaggagga 360

ggcagcggag gaggaggctc cgagcctaag agctccgaca agacccacac atgcccacca 420

tgtcctgcac cagagctgct gggaggacct tccgtgttcc tgtttcctcc aaagccaaag 480

gatacactga tgatctccag aacaccagag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac 540

gaggaccccg aggtgaagtt taactggtac gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag 600

accaagccaa gggaggagca gtacaactcc acatatcgcg tggtgtctgt gctgaccgtg 660

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag tataagtgta aggtgagcaa taaggccctg 720

cccgccccta tcgagaagac catctccaag gcaaagggac agcccaggga gcctcaggtg 780

tacacactgc ccccttgccg cgacgagctg accaagaacc aggtgtctct gtggtgtctg 840

gtgaagggct tctacccatc tgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg ccagcccgag 900

aacaattaca agaccacacc acccgtgctg gacagcgatg gctccttctt tctgtattcc 960

aagctgacag tggacaagtc tcggtggcag cagggcaacg tgttttcctg ttctgtgatg 1020

cacgaggccc tgcacaatca ctatacccag aagagcctgt ccctgtctcc cggcaag 1077

<210> 140

<211> 356

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> short SIRPa- Fc (IgG4 knob)356 AA, first monomer of DSP216V4

<400> 140

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu

130 135 140

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

145 150 155 160

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

165 170 175

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

180 185 190

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

195 200 205

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

210 215 220

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

225 230 235 240

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

245 250 255

Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

260 265 270

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

275 280 285

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

290 295 300

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

305 310 315 320

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

325 330 335

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

340 345 350

Ser Leu Gly Lys

355

<210> 141

<211> 1068

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #140

<400> 141

gaggaggagc tgcaggtcat ccagcccgat aagtctgtgc tggtggcagc aggagagacc 60

gccacactga ggtgcaccgc cacaagcctg atcccagtgg gaccaatcca gtggtttagg 120

ggagcaggcc ctggcagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt cccaagagtg 180

accacagtga gcgacctgac caagcggaac aatatggatt tttccatcag aatcggcaat 240

atcacacctg ccgacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg ctccccagac 300

gatgtggagt ttaagagcgg agcaggcacc gagctgtccg tgcgggcaaa gggaggagga 360

ggatccggag gaggaggatc cgagtctaag tatggaccac catgccctcc atgtccagca 420

cctgagtttg agggaggacc tagcgtgttc ctgtttcccc ctaagccaaa ggacacactg 480

atgatctcca ggacaccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgtctca ggaggatccc 540

gaggtgcagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcct 600

agggaggagc agtttaactc tacataccgc gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag 660

gattggctga acggcaagga gtataagtgt aaggtgagca ataagggcct gccaagctcc 720

atcgagaaga ccatctccaa ggcaaaggga cagccaaggg agcctcaggt gtgcacactg 780

ccaccctctc aggaggagat gaccaagaac caggtgagcc tgtggtgtct ggtgaagggc 840

ttctacccaa gcgacatcgc cgtggagtgg gagtccaatg gccagcccga gaacaattac 900

aagaccacac ctccagtgct ggactctgat ggcagcttct ttctgtattc taggctgaca 960

gtggataaga gccgctggca ggagggcaac gtgtttagct gttccgtgat gcacgaggcc 1020

ctgcacaatc actataccca gaagtctctg agcctgtccc tgggcaag 1068

<210> 142

<211> 585

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> SIRPa- Fc (IgG1 knob LALA)358 AA, first monomer of DSP216V5

<400> 142

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala

115 120 125

Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly

130 135 140

Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu

145 150 155 160

Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val

180 185 190

His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp

195 200 205

Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro

210 215 220

Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr

245 250 255

Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val

260 265 270

Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val

275 280 285

Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu

290 295 300

His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser

305 310 315 320

Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

340 345 350

Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

355 360 365

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

370 375 380

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

385 390 395 400

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

405 410 415

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

420 425 430

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

435 440 445

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

450 455 460

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

465 470 475 480

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu

485 490 495

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

500 505 510

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

515 520 525

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

530 535 540

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

545 550 555 560

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

565 570 575

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580 585

<210> 143

<211> 1755

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #142

<400> 143

gaggaggagc tgcaggtcat ccagcccgat aagtctgtgc tggtggcagc aggagagacc 60

gccacactga ggtgcaccgc cacaagcctg atcccagtgg gaccaatcca gtggtttagg 120

ggagcaggcc ctggcagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt cccaagagtg 180

accacagtga gcgacctgac caagcggaac aatatggatt tttccatcag aatcggcaat 240

atcacacctg ccgacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg ctccccagac 300

gatgtggagt ttaagagcgg agcaggcacc gagctgtccg tgcgggcaaa gccttccgcc 360

ccagtggtgt ctggaccagc agccagagcc accccacagc acacagtgtc cttcacctgt 420

gagtctcacg gctttagccc ccgggacatc accctgaagt ggttcaagaa cggcaatgag 480

ctgtctgact ttcagaccaa cgtggacccc gtgggcgagt ctgtgagcta ttccatccac 540

tctacagcca aggtggtgct gacccgcgag gacgtgcaca gccaggtcat ctgcgaggtg 600

gcacacgtga ccctgcaggg cgatcctctg aggggcacag ccaatctgag cgagaccatc 660

agagtgcccc ctacactgga ggtgacccag cagcccgtgc gcgcagagaa ccaagtgaat 720

gtgacatgtc aggtgaggaa gttctaccct cagcgcctgc agctgacctg gctggagaac 780

ggcaacgtga gccggaccga gacagccagc accgtgacag agaacaagga cggcacatat 840

aattggatgt cttggctgct ggtgaacgtg agcgcccaca gggacgatgt gaagctgacc 900

tgccaggtgg agcacgacgg acagccagcc gtgtctaaga gccacgatct gaaggtgagc 960

gcccacccta aggagcaggg ctccaacaca gccgccgaga ataccggcag caacgagcgg 1020

aatatctacg gaggaggagg cagcggagga ggaggctccg agcctaagag ctccgacaag 1080

acccacacat gcccaccatg tcctgcacca gaggcagcag gaggaccttc cgtgttcctg 1140

tttcctccaa agccaaagga tacactgatg atctccagaa caccagaggt gacctgcgtg 1200

gtggtggacg tgtctcacga ggaccccgag gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg 1260

gaggtgcaca atgccaagac caagccaagg gaggagcagt acaactccac atatcgcgtg 1320

gtgtctgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggagta taagtgtaag 1380

gtgagcaata aggccctgcc cgcccctatc gagaagacca tctccaaggc aaagggacag 1440

cccagggagc ctcaggtgta cacactgccc ccttgccgcg acgagctgac caagaaccag 1500

gtgtctctgt ggtgtctggt gaagggcttc tacccatctg acatcgccgt ggagtgggag 1560

agcaatggcc agcccgagaa caattacaag accacaccac ccgtgctgga cagcgatggc 1620

tccttctttc tgtattccaa gctgacagtg gacaagtctc ggtggcagca gggcaacgtg 1680

ttttcctgtt ctgtgatgca cgaggccctg cacaatcact atacccagaa gagcctgtcc 1740

ctgtctcccg gcaag 1755

<210> 144

<211> 359

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> short SIRPa- Fc (IgG1 knob LALA )359 AA, first monomer of

DSP216V6

<400> 144

Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro

20 25 30

Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser

50 55 60

Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn

65 70 75 80

Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys

85 90 95

Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Ser Val Arg Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 145

<211> 1077

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #144

<400> 145

gaggaggagc tgcaggtcat ccagcccgat aagtctgtgc tggtggcagc aggagagacc 60

gccacactga ggtgcaccgc cacaagcctg atcccagtgg gaccaatcca gtggtttagg 120

ggagcaggcc ctggcagaga gctgatctac aaccagaagg agggccactt cccaagagtg 180

accacagtga gcgacctgac caagcggaac aatatggatt tttccatcag aatcggcaat 240

atcacacctg ccgacgccgg cacctactat tgcgtgaagt tcaggaaggg ctccccagac 300

gatgtggagt ttaagagcgg agcaggcacc gagctgtccg tgcgggcaaa gggaggagga 360

ggcagcggag gaggaggctc cgagcctaag agctccgaca agacccacac atgcccacca 420

tgtcctgcac cagaggcagc aggaggacct tccgtgttcc tgtttcctcc aaagccaaag 480

gatacactga tgatctccag aacaccagag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcac 540

gaggaccccg aggtgaagtt taactggtac gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag 600

accaagccaa gggaggagca gtacaactcc acatatcgcg tggtgtctgt gctgaccgtg 660

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag tataagtgta aggtgagcaa taaggccctg 720

cccgccccta tcgagaagac catctccaag gcaaagggac agcccaggga gcctcaggtg 780

tacacactgc ccccttgccg cgacgagctg accaagaacc aggtgtctct gtggtgtctg 840

gtgaagggct tctacccatc tgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg ccagcccgag 900

aacaattaca agaccacacc acccgtgctg gacagcgatg gctccttctt tctgtattcc 960

aagctgacag tggacaagtc tcggtggcag cagggcaacg tgttttcctg ttctgtgatg 1020

cacgaggccc tgcacaatca ctatacccag aagagcctgt ccctgtctcc cggcaag 1077

<210> 146

<211> 354

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> TIGIT- Fc (IgG1 knob LALA )354 AA, first monomer of DSP502V4

<400> 146

Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ala Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val

20 25 30

Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Ser Asn

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala

50 55 60

Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp

65 70 75 80

Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr

85 90 95

Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp

115 120 125

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

165 170 175

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

180 185 190

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

195 200 205

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

210 215 220

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

225 230 235 240

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

245 250 255

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

260 265 270

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

275 280 285

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

290 295 300

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

325 330 335

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

340 345 350

Gly Lys

<210> 147

<211> 1062

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #146

<400> 147

atgaccggca caatcgagac aacaggcaac atctctgccg agaagggagg cagcatcgcc 60

ctgcagtgcc acctgagcag caccacagcc caggtgaccc aggtgaactg ggagcagcag 120

gaccagctgc tggccatctc taatgccgat ctgggctggc acatcagccc atcctttaag 180

gatagggtgg caccaggacc aggcctgggc ctgaccctgc agagcctgac cgtgaatgac 240

acaggcgagt acttctgtat ctaccacaca tatcccgatg gcacctatac aggcagaatc 300

tttctggagg tgctggagtc tagcgtggcc gagcacggag gaggaggcag cggaggagga 360

ggctccgagc ctaagtcctc tgacaagacc cacacatgcc ccccttgtcc tgcaccagag 420

gcagcaggcg gaccttccgt gttcctgttt ccacccaagc caaaggatac cctgatgatc 480

tccaggaccc ctgaggtgac atgcgtggtg gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaggtg 540

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaatg ccaagacaaa gcctcgggag 600

gagcagtaca actccaccta tagagtggtg tctgtgctga cagtgctgca ccaggattgg 660

ctgaacggca aggagtataa gtgtaaggtg agcaataagg ccctgcccgc ccctatcgag 720

aaaaccatca gcaaggcaaa gggacagcca agggagccac aggtgtacac cctgcctcca 780

tgccgcgacg agctgacaaa gaaccaggtg agcctgtggt gtctggtgaa gggcttctat 840

ccatctgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatggccagc ccgagaacaa ttacaagacc 900

acaccccctg tgctggactc cgatggctct ttctttctgt atagcaagct gaccgtggac 960

aagtccagat ggcagcaggg caacgtgttt tcttgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1020

aatcactaca cacagaagtc cctgtctctg agccccggca ag 1062

<210> 148

<211> 382

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PD1- Fc (IgG1 hole LALA )382 AA, second monomer of DSP502V4

<400> 148

Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser

20 25 30

Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser

35 40 45

Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro

50 55 60

Gly Gln Asp Ser Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp

65 70 75 80

Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr

85 90 95

Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser

100 105 110

Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr

115 120 125

Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

145 150 155 160

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

165 170 175

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

180 185 190

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

195 200 205

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

210 215 220

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

245 250 255

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

260 265 270

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

275 280 285

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

290 295 300

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

305 310 315 320

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

325 330 335

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

340 345 350

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

355 360 365

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 149

<211> 1146

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #148

<400> 149

gattcacccg atagaccttg gaacccacct accttctccc ccgccctgct ggtggtgaca 60

gagggcgaca atgccacctt cacatgctct tttagcaaca cctccgagtc tttcgtgctg 120

aattggtaca ggatgagccc ctccaaccag acagataagc tggccgcatt tccagaggac 180

cgcagccagc caggacagga ttcccggttc agagtgaccc agctgcctaa tggccgggac 240

tttcacatgt ctgtggtgag agcccggaga aacgatagcg gcacatacct gtgcggagcc 300

atctccctgg cccctaaggc acagatcaag gagtccctga gggcagagct gagggtgacc 360

gagaggaggg cagaggtgcc aacagcacac ccttctccaa gcccccggcc tgcaggacag 420

ggaggaggag gctccggcgg cggcggctct gagccaaaga gctccgacaa gacccacaca 480

tgcccaccat gtccagcacc agaggcagca ggaggaccta gcgtgttcct gtttcctcca 540

aagccaaagg ataccctgat gatctctagg accccagagg tgacatgcgt ggtggtggac 600

gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttt aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 660

aacgccaaga caaagcctag ggaggagcag tacaattcta cctatcgcgt ggtgagcgtg 720

ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaat ggcaaggagt ataagtgtaa ggtgtccaac 780

aaggccctgc ctgccccaat cgagaagacc atctctaagg caaagggaca gccccgggag 840

cctcaggtgt gcaccctgcc ccctagcaga gacgagctga caaagaatca ggtgtccctg 900

tcttgtgccg tgaagggctt ctaccccagc gacatcgcag tggagtggga gtccaacgga 960

cagcctgaga acaattataa gaccacacca cccgtgctgg actctgatgg cagcttcttt 1020

ctggtgtcca agctgaccgt ggacaagtct cggtggcagc agggcaacgt gtttagctgc 1080

tccgtgatgc acgaagcact gcacaaccac tacacccaga agtcactgtc actgtcccca 1140

ggaaag 1146

<210> 150

<211> 645

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> LILRB2- Fc (IgG1 hole LALA )382 AA, second monomer of DSP216V5

and DSP216V6

<400> 150

Gln Thr Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser

1 5 10 15

Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu

20 25 30

Glu Ala Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp

35 40 45

Ile Thr Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile

50 55 60

Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Arg Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Thr Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Gly Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe

145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr

165 170 175

Gly Tyr Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val

195 200 205

Gln Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys

210 215 220

Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu

225 230 235 240

Arg Asp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser

245 250 255

Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln

260 265 270

Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro

275 280 285

Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro

290 295 300

Phe Ile Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val

305 310 315 320

Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr

325 330 335

Lys Ala Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu

340 345 350

Tyr Pro Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala

355 360 365

His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr

370 375 380

Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Gly

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys

405 410 415

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

420 425 430

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

435 440 445

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

450 455 460

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

465 470 475 480

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

485 490 495

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

500 505 510

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

515 520 525

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

530 535 540

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

545 550 555 560

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

565 570 575

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

580 585 590

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu

595 600 605

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

610 615 620

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

625 630 635 640

Leu Ser Pro Gly Lys

645

<210> 151

<211> 2019

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #150

<400> 151

tctagagcca ccatggagtc cccagcacag ctgctgttcc tgctgctgct gtggctgcct 60

gacggagtgc acgcacagac cggcacaatc ccaaagccca ccctgtgggc cgagcctgat 120

tccgtgatca cccagggctc tccagtgaca ctgtcctgcc agggctctct ggaggcccag 180

gagtaccggc tgtatagaga gaagaagtct gccagctgga tcacccggat cagacctgag 240

ctggtgaaga acggccagtt tcacatccca agcatcacct gggagcacac aggccggtac 300

ggatgccagt actattcccg ggccagatgg agcgagctgt ccgaccctct ggtgctggtc 360

atgaccggcg cctatcctaa gccaacactg agcgcccagc catcccctgt ggtgaccagc 420

ggcggcagag tgacactgca gtgtgagtcc caggtggcct tcggcggctt tatcctgtgc 480

aaggagggcg aggaggagca cccacagtgt ctgaacagcc agccacacgc ccggggcagc 540

tccagagcca tcttctccgt gggacccgtg agcccaaacc ggagatggag ccaccggtgc 600

tacggctatg acctgaatag cccttacgtg tggtctagcc catccgatct gctggagctg 660

ctggtgcccg gcgtgtccaa gaagccttcc ctgtctgtgc agccaggacc agtggtggca 720

ccaggagagt ctctgaccct gcagtgcgtg agcgacgtgg gctacgatcg gttcgtgctg 780

tataaggagg gagagaggga tctgaggcag ctgccaggca gacagccaca ggccggcctg 840

agccaggcca actttacact gggcccagtg agcaggtcct atggcggaca gtacaggtgc 900

tatggagcac acaatctgtc ctctgagtgt tctgccccca gcgaccccct ggacatcctg 960

atcaccggcc agatcagggg cacacccttc atctccgtgc agcctggacc aaccgtggcc 1020

tctggcgaga acgtgacact gctgtgccag tcttggcgcc agttccacac ctttctgctg 1080

acaaaggcag gagcagcaga cgcaccactg aggctgcgca gcatccacga gtaccccaag 1140

tatcaggccg agtttccaat gtctccagtg accagcgccc acgcaggcac atacaggtgt 1200

tatggcagcc tgaacagcga cccctacctg ctgagccacc cttccgagcc actggagctg 1260

gtggtgagcg gaggaggagg ctccggagga ggaggctctg gcggcggcgg cagcgagcct 1320

aagagctccg acaagaccca cacatgccca ccttgtccag cacctgaggc agcaggagga 1380

ccatccgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaggataccc tgatgatctc tcgcacccct 1440

gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gtttaactgg 1500

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 1560

agcacctata gagtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 1620

gagtacaagt gtaaggtgtc caataaggcc ctgccagccc ccatcgagaa gaccatctct 1680

aaggcaaagg gacagcccag ggagcctcag gtgtgcaccc tgcctccaag ccgcgacgag 1740

ctgacaaaga accaggtgtc tctgagctgt gccgtgaagg gcttctaccc atctgacatc 1800

gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaatt ataagaccac accccctgtg 1860

ctggactctg atggcagctt ctttctggtg tccaagctga ccgtggataa gtctaggtgg 1920

cagcagggca acgtgttttc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacaca 1980

cagaagagcc tgtccctgtc tcccggcaag tgagatatc 2019

<210> 152

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> IgG1 Fc Hole LALA, Fc (AA 99-330) C220S L234A, L235A plus Hole

T366S and L368A Y407V) and Y349C (the numbers from KABAT) used in

DSP216V5, DSP216V6 and DSP502V4

<400> 152

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 153

<211> 696

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #152

<400> 153

gagcctaaga gctccgacaa gacccacaca tgcccacctt gtccagcacc tgaggcagca 60

ggaggaccat ccgtgttcct gtttccaccc aagcctaagg ataccctgat gatctctcgc 120

acccctgagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttt 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 240

tacaacagca cctatagagt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ttggctgaac 300

ggcaaggagt acaagtgtaa ggtgtccaat aaggccctgc cagcccccat cgagaagacc 360

atctctaagg caaagggaca gcccagggag cctcaggtgt gcaccctgcc tccaagccgc 420

gacgagctga caaagaacca ggtgtctctg agctgtgccg tgaagggctt ctacccatct 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaattataa gaccacaccc 540

cctgtgctgg actctgatgg cagcttcttt ctggtgtcca agctgaccgt ggataagtct 600

aggtggcagc agggcaacgt gttttcctgt tctgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 660

tacacacaga agagcctgtc cctgtctccc ggcaag 696

<210> 154

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> IgG1 Fc knob LALA (Fc IgG1 (AA 99-330) P01857-1 C220S (kabat)

plus Knob T366W (kabat) and S354C (kabat) plus L234A, L235A

(kabat), used in DSP216v5 and DSP502V4

<400> 154

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 155

<211> 698

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> NA of #154

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 155

nagagcctaa gagctccgac aagacccaca catgcccacc atgtcctgca ccagaggcag 60

caggaggacc ttccgtgttc ctgtttcctc caaagccaaa ggatacactg atgatctcca 120

gaacaccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgtctca cgaggacccc gaggtgaagt 180

ttaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaatgccaa gaccaagcca agggaggagc 240

agtacaactc cacatatcgc gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga 300

acggcaagga gtataagtgt aaggtgagca ataaggccct gcccgcccct atcgagaaga 360

ccatctccaa ggcaaaggga cagcccaggg agcctcaggt gtacacactg cccccttgcc 420

gcgacgagct gaccaagaac caggtgtctc tgtggtgtct ggtgaagggc ttctacccat 480

ctgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg gccagcccga gaacaattac aagaccacac 540

cacccgtgct ggacagcgat ggctccttct ttctgtattc caagctgaca gtggacaagt 600

ctcggtggca gcagggcaac gtgttttcct gttctgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc 660

actataccca gaagagcctg tccctgtctc ccggcaag 698

<210> 156

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc

<400> 156

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 157

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4-SPLE- Fc knob

<400> 157

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 158

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4 Fc knob

<400> 158

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 159

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4 Fc hole

<400> 159

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 160

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc knob only

<400> 160

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 161

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 Fc hole only

<400> 161

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 162

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG1 C220S Fc Hole

<400> 162

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 163

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4-SPLE- Fc knob NO Y349C

<400> 163

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 164

<211> 229

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> hIgG4-SPLE- Fc Hole NO E356C

<400> 164

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

Claims

1.一种异二聚体，包含选自由SIRPα、PD1、TIGIT、LILRB2和SIGLEC10所组成的组的两种多肽，其中，所述两种多肽中的每一种都能够结合其天然结合对，并且其中所述异二聚体不包含能够结合其天然结合对的II型膜蛋白的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含与所述两种多肽连接的二聚化部分。

3.根据权利要求2所述的异二聚体，其中，所述二聚化部分是抗体的Fc结构域或其片段。

4.根据权利要求3所述的异二聚体，其中，所述Fc结构域被修饰以改变其与Fc受体的结合，降低其免疫激活功能和/或提高所述融合的半衰期。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述PD1多肽。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述LILRB2多肽。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述SIGLEC10多肽。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述SIRPα多肽和所述TIGIT多肽。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述TIGIT多肽和所述PD1多肽。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述TIGIT多肽和所述LILRB2多肽。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述TIGIT多肽和所述SIGLEC10多肽。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述PD1多肽和所述SIGLEC10多肽。

13.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述LILRB2多肽和所述SIGLEC10多肽。

14.根据权利要求1至3中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体包含所述PD1多肽和所述LILRB2多肽。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的异二聚体，其中，所述多肽中的每一种是所述异二聚体中的单体。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的异二聚体，其中，所述两种多肽包含在所述异二聚体的单体中。

17.一种组合物，包含权利要求1至16中任一项所述的异二聚体，其中，所述异二聚体是所述组合物中所述两种多肽的主要形式。

18.一种核酸构建体或系统，包含至少一种编码权利要求1至16中任一项所述的异二聚体的多核苷酸，和用于指导所述多核苷酸在宿主细胞中表达的调节元件。

19.一种宿主细胞，包含权利要求1至16中任一项所述的异二聚体或权利要求18所述的核酸构建体或系统。

20.一种生产异二聚体的方法，所述方法包括将权利要求18所述的核酸构建体或系统引入宿主细胞或培养权利要求19所述的细胞。

21.根据权利要求20所述的方法，包括分离所述异二聚体。

22.一种治疗有需要的对象中可受益于用所述异二聚体治疗的疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的权利要求1至16中任一项所述的异二聚体、权利要求17所述的组合物、权利要求18所述的核酸构建体或系统或权利要求19所述的细胞，从而治疗所述对象中的所述疾病。

23.根据权利要求1至16中任一项所述的异二聚体、权利要求17所述的组合物、权利要求18所述的核酸构建体或系统或权利要求19所述的细胞，用于治疗有需要的对象中可受益于用所述异二聚体治疗的疾病的用途。

24.根据权利要求22所述的方法或权利要求23所述的所述异二聚体、所述组合物、所述核酸构建体或系统或所述细胞的用途，其中，所述疾病可受益于激活免疫细胞。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法或所述异二聚体、所述组合物、所述核酸构建体或系统或所述细胞的用途，其中，与所述疾病相关的细胞表达所述天然结合对。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法或所述异二聚体、所述组合物、所述核酸构建体或系统或所述细胞的用途，其中，所述疾病是癌症。

27.根据权利要求26所述的方法或所述异二聚体、所述组合物、所述核酸构建体或系统或所述细胞的用途，其中，所述癌症选自由淋巴瘤、白血病、结肠癌、卵巢癌、肺癌、头颈癌和肝细胞癌所组成的组。

28.根据权利要求26所述的方法或所述异二聚体、所述组合物、所述核酸构建体或系统或所述细胞的用途，其中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)或间皮瘤。

29.一种激活免疫细胞的方法，所述方法包括在权利要求1至16中任一项所述的异二聚体、权利要求17所述的组合物、权利要求18所述的核酸构建体或系统或权利要求19所述的细胞的存在下，在体外激活免疫细胞。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述激活是在表达所述天然结合对的细胞的存在下进行的。