CN107802826A - eNOS突变体在促进血管生成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用调控细胞内eNOS活性的eNOS多肽突变体及其预防或治疗缺血性疾病的方法。所使用的突变型eNOS多肽相对于野生型eNOS具有更好的促进EPC的增殖、迁移以及血管生成的效果。
Description
技术领域
本发明属于血管生成研究领域，具体涉及eNOS的突变体在促进血管生成中的应用。
背景技术
成体的新血管形成不仅依赖于血管新生，而且与循环的内皮祖细胞(endothelialprogenitor cell，EPC)有关。EPC参与机体血管的动态维持和生理、病理性血管重建，对缺血性疾病具有治疗潜能。eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途径的关键酶，它诱导血管内皮细胞产生的NO不仅在血管生成、调节血管张力上发挥重要作用，而且在抗动脉粥样硬化，抑制血小板聚集和单核巨噬细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖等过程中，也起着非常重要的作用。近年研究认为，eNOS参与调节EPC动员及功能，是血管修复的重要调节因子。临床研究证实，循环EPC增殖、迁移能力受损与NO生物活性降低有关，提示eNOS活性和EPC之间存在着某种联系。越来越多的证据显示缺血所诱发的血管生成可能随年龄和内皮功能不全而受损。在动物模型中已经观察到血管生成不良，可能是因为内皮NO释放的减少和生长因子表达的减少。已经表明例如同源半胱氨酸血症和高胆固醇血症的危险因素可能通过减少内皮来源的NO的生物利用度而减弱后肢缺血的小鼠模型的血管生成。
eNOS主要存在于血管内皮细胞、血小板、肾小管上皮细胞等中。eNOS基因在人类染色体上定位于7q35-q36区，跨度约21kb，含有26个外显子和25个内含子，翻译生成含1203个氨基酸的蛋白产物，序列如SEQ ID NO：1所示。生理状态下主要由eNOS调节NO的持续生成，因而eNOS与体内NO的浓度密切相关。目前有关人血管eNOS基因的研究主要聚焦于：上调或下调eNOS活性的刺激因素，eNOS基因启动子中顺式调控元件的功能，eNOS基因多态性及eNOS基因表达的信号调控通路。关于eNOS基因的多态性与相关疾病的潜在联系，有文献表明G894→T多态性可导致所编码的氨基酸的Glu298Asp多态性,Glu298Asp的错义导致eNOS在此处的构象发生改变,由α-螺旋变为紧密折叠,由此推测此突变可能影响eNOS蛋白的功能,使NO生成减少,导致血小板聚集性增强,白细胞向内皮黏附,平滑肌细胞增生等病理生理现象。对于筛选有利于提高eNOS蛋白功能、促进NO生成增加从而改善内皮细胞功能的eNOS突变体的报道相对较少，本发明试图提供有利的eNOS蛋白突变体。
发明内容
本发明提供了突变型的eNOS多肽，以及用所述多肽预防和治疗缺血性疾病的方法。用本发明的方法，可以调控细胞内的eNOS活性使得可以改善与eNOS活性相关的疾病或病变。具体地，用本发明的方法通过增加缺血部位的局部的NO生成可以调控细胞内的eNOS活性，使得可以改善与缺血肢体中NO产生减少所相关的疾病或病变。因此，本发明提供了基因治疗的方法，它通过给需要治疗的患者施用eNOS多肽或它们的突变体或编码这些多肽的多核苷酸，提供给效应组织增高水平的NO。
本发明提供了突变型eNOS在制备促进血管生成的药物中的作用，所述突变型eNOS包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
提供了突变型eNOS在制备一种用于治疗有增加血管生成需求的患者的药物中的用途，所述突变型eNOS包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
所述应用中，突变型eNOS通过促进EPC的增殖和迁移来促进血管生成。
优选地，所述患者患有重症肢体缺血、缺血性心脏病或动脉粥样硬化。
提供了突变型eNOS在制备促进EPC增殖的试剂中的应用，所述突变型eNOS包含SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
提供了突变型eNOS在制备促进EPC迁移的试剂中的应用，所述突变型eNOS包含SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明与现有技术相比具有以下积极效果：突变型eNOS与野生型eNOS相比，显著增加了EPC细胞中eNOS的表达水平和NO生成量，显著提升EPC细胞的增殖能力、迁移能力以及血管生成能力，是潜在的缺血性疾病的治疗药物。
附图说明
图1为细胞免疫荧光对EPC细胞的鉴定结果。
图2为分别转染了pcDNA-eNOS-mut、pcDNA-eNOS以及空白载体的3组EPC细胞中eNOS蛋白和mRNA水平。
图3为分别转染了pcDNA-eNOS-mut、pcDNA-eNOS以及空白载体的3组EPC细胞的增殖能力。
图4为分别转染了pcDNA-eNOS-mut、pcDNA-eNOS以及空白载体的3组EPC细胞体外形成血管的效果(其中a为pcDNA-eNOS，b为pcDNA-eNOS-mut，c为空白载体)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：eNOS多肽突变体的制备和筛选
利用基因体外定向进化策略中易错PCR技术构建基因工程菌获得高效生产eNOS酶的方法，其是通过在大肠杆菌中表达突变的eNOS酶基因，然后对表达的eNOS分离纯化，获得高纯度高活力的eNOS酶。
1、由人内皮细胞通过PCR扩增eNOS的编码基因；。PCR扩增引物，上游引物5’－GAGCAGGCAGCAGAGT-3’，下游引物5’－GAACTGGAAGGGAAA－3’。
2、将eNOS基因连接在表达质粒上：PCR纯化产物装入克隆载体pMD18-T，大肠杆菌top0在LB固体培养基上涂片培养，经蓝白斑筛选，挑取单个白色菌落在含氨苄西林的LB培养液中扩增，DNA测序仪上测序分析。双酶切TA载体回收目的片段，表达载体pcDNA3.0用双酶切回收线性载体，采用T4连接酶连接并构建pcDNA－eNOS，经酶切电泳鉴定。
3、采用易错PCR技术，以重组质粒pcDNA－eNOS为模板，设计引物，扩增获得eNOS突变基因；
4、将步骤3所得易错PCR产物及表达质粒pcDNA－eNOS双酶切后连接，连接产物转入HUVEC细胞，培养转化后的细胞即得构建好的重组eNOS基因突变库；
5、对培养的HUVEC细胞的NO的生成情况进行检测：将对数生长期的细胞以2×105个/cm2接种于24孔培养板中，加入含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养。采用硝酸还原酶法测定各组细胞培养上清液中NO含量，操作按试剂盒说明书进行。获得NO生成显著增加的细胞。
6、eNOS突变体基因的获得：以步骤5的NO生成增加的细胞基因组DNA为PCR反应模板，设计引物扩增eNOS突变基因。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为：94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。取3μLPCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。再取100μLPCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。凝胶回收的PCR产物和pMD18-T载体分别用双酶切，并通过凝胶回收试剂盒回收，然后进行连接(16℃，16h)，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定，经核苷酸序列转化确定所述eNOS突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。构建的表达质粒被称为pcDNA-eNOS-mut。
野生型eNOS和筛选到的突变型的eNOS的序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示：
SEQ ID NO：1:
MGNLKSVAQEPGPPCGLGLGLGLGLCGKQGPATPAPEPSRAPASLLPPAPEHSPPSSPLTQPPEGPKFPRVKNWEVGSITYDTLSAQAQQDGPCTPRRCLGSLVFPRKLQGRPSPGPPAPEQLLSQARDFINQYYSSIKRSGSQAHEQRLQEVEAEVAATGTYQLRESELVFGAKQAWRNAPRCVGRIQWGKLQVFDARDCRSAQEMFTYICNHIKYATNRGNLRSAITVFPQRCPGRGDFRIWNSQLVRYAGYRQQDGSVRGDPANVEITELCIQHGWTPGNGRFDVLPLLLQAPDEPPELFLLPPELVLEVPLEHPTLEWFAALGLRWYALPAVSNMLLEIGGLEFPAAPFSGWYMSTEIGTRNLCDPHRYNILEDVAVCMDLDTRTTSSLWKDKAAVEINVAVLHSYQLAKVTIVDHHAATASFMKHLENEQKARGGCPADWAWIVPPISGSLTPVFHQEMVNYFLSPAFRYQPDPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAKRVKATILYGSETGRAQSYAQQLGRLFRKAFDPRVLCMDEYDVVSLEHETLVLVVTSTFGNGDPPENGESFAAALMEMSGPYNSSPRPEQHKSYKIRFNSISCSDPLVSSWRRKRKESSNTDSAGALGTLRFCVFGLGSRAYPHFCAFARAVDTRLEELGGERLLQLGQGDELCGQEEAFRGWAQAAFQAACETFCVGEDAKAAARDIFSPKRSWKRQRYRLSAQAEGLQLLPGLIHVHRRKMFQATIRSVENLQSSKSTRATILVRLDTGGQEGLQYQPGDHIGVCPPNRPGLVEALLSRVEDPPAPTEPVAVEQLEKGSPGGPPPGWVRDPRLPPCTLRQALTFFLDITSPPSPQLLRLLSTLAEEPREQQELEALSQDPRRYEEWKWFRCPTLLEVLEQFPSVALPAPLLLTQLPLLQPRYYSVSSAPSTHPGEIHLTVAVLAYRTQDGLGPLHYGVCSTWLSQLKPGDPVPCFIRGAPSFRLPPDPSLPCILVGPGTGIAPFRGFWQERLHDIESKGLQPTPMTLVFGCRCSQLDHLYRDEVQNAQQRGVFGRVLTAFSREPDNPKTYVQDILRTELAAEVHRVLCLERGHMFVCGDVTMATNVLQTVQRILATEGDMELDEAGDVIGVLRDQQRYHEDIFGLTLRTQEVTSRIRTQSFSLQERQLRGAVPWAFDPPGSDTNSP
SEQ ID NO:2:
MGNLKSVAQEPGPPCGLGLGLGLGLCGKQGPATPAPEPSRAPASLLPPAPEHSPPSSPLTQPPEGPSFPRVKNWEVGSITYDTLSAQAQQDGPCTPRRCLGSLVFPRKLQGRPSPGPPAPEQLLSQARDFINQYYSSIKRSGSQAHEQRLQEVEAEVAATGTYQLRESELVFGAKQAWRNAPRCVGRIEWGKLQVFDARDCRSAQEMFTYICNHIKYATNRGNLRSAITVFPQRCPGRGDFRIWNSQLVRYAGYRQQDGSVRGDPANVEITELCIQHGWTPGNGRFDVLPLLLQAPDEPPELFLLPPELVLEVPLEHPTLEWFAALGLRWYALPAVSNMLLEIGGLEFPAAPFSGWYMSTEIGTRNLCDPHRYNILEDVAVCMDLDTRTTSSLWKDKAAVEINVGVLHSYQLAKVTIVDHHAATASFMKHLENEQKARGGCPADWAWIVPPISGSLTPVFHQEMVNYFLSPAFRYQPDPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAVKVKATILYGSETGRAQSYAQQLGRLFRKAFDPRVLCMDEYDVVSLEHETLVLVVTSTFGNGDPPENGESFAAALMEMSGPYNSSPRPEQHKSYKIRFNSISCSDPLVSSWRRKRKESSNTDSAGALGTLRFCVFGLGSRAYPHFCAFARAVDTRLEELGGERLLQLGQGDELCGQEEAFRGWAQAAFQAACETFCVGEDAKAAARDIFSPKRSWKRQRYRLSAQAEGLQLLPGLIHVHRRKMFQATIRSVENLQSSKSTRATILVRLDTGGQEGLQYQPGDHIGVCPPNRPGLVEALLSRVEDPPAPTEPVAVEQLEKGSPGGPPPGWVRDPRLPPCTLRQALTFFLDITSPPSPQLLRLLSTLAEEPREQQELEALSQDPRRYEEWKWFRCPTLLEVLEQFPSVALPAPLLLTQLPLLQPRYYSVSSAPSTHPGEIHKTVAVLAYRTQDGLGPLHYGVCSTWLSQLKPGDPVPCFIRGAPSFRLPPDPSLPCILVGPGTGIAPFRGFWQEALHDIESKGLQPTPMTLVFGCRCSQLDHLYRDEVQNAQQRGVFGRVLTAFSREPDNPKTYVQDILRTELAAEVHRVLCLERGHMFVCGDVTMATNVLQTVQRILATEGDMELDEAGDVIGVLRDQQRYHEDIFGLTLRTQEVTSRIRTQSFSLQQRQLKGAVPWAFDPPGSDTNSP
突变eNOS与野生eNOS相比，有9个位置的氨基酸发生了突变。
实施例2：eNOS多肽突变体在EPC细胞中的活性的检测和测定
1、大鼠骨髓来源EPC细胞的分离、培养
用10％水合氯醛麻醉SD大鼠，置于75％乙醇中浸泡5min，75％酒精再次消毒双下肢及下腹部区域三遍；用无菌剪刀将下肢的皮肤剪开，剔除小腿、大腿、股部肌肉，暴露股骨、胫骨；将股骨及胫骨放入无菌玻璃培养皿中。除去骨头表面的肌肉、骨膜，取下股骨及胫骨，将分离出的股骨及胫骨移入无菌培养皿中，用含有5％青、链霉素的无菌预冷PBS溶液冲洗所取骨头表面3次，冲洗后再次用含有1％青、链霉素的无菌PBS溶液在大号50ml离心管中进行浸泡，用针管抽取适量DMEM-F12基础培养基将骨髓冲出，用移液器反复吹打，制成单细胞悬液，加入适量PBS，1600rpm、5min，离心淘洗2次，将细胞沉淀用5mL、DMEM-F12基础培养基重悬后，置于等体积大鼠淋巴细胞分离液之上，置于离心机，1600rpm室温离心15min，吸取中间的白色环状云雾细胞层(即单个核细胞层)，用PBS漂洗3遍，1600rpm离心5min，弃去上清液，加入适量EGM-2内皮细胞专用培养基，重悬细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为(1.0-2.0)×109/L，接种至T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养。
原代培养过程中，24h换液，收集悬液中未贴壁的细胞，用适量EGM-2内皮细胞专用培养基重悬细胞，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养；72h后全量更换培养基，以后每2d半量更换新鲜培养基。待细胞铺满培养瓶底至细胞融合成单层，密度长至70％～80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化，1:2的比例进行传代培养，培养15天后进行细胞免疫鉴定。图1是细胞免疫荧光对EPC细胞鉴定。EPC细胞可以摄取UEA-1(荆豆凝集素)以及结合Ac-LDL(乙酰化低密度脂蛋白)，因此可以用二者来鉴定EPC细胞。从图1可以看出UEA-1、Ac-LDL蛋白双阳性率接近100％，表明EPC细胞细胞纯度较高。
2、突变型eNOS及野生型eNOS转染EPC细胞
待细胞生长融合为75％～80％时，根据转染试剂说明配备各质粒的无血清培养基混合物，孵育15min后直接加入细胞培养基中。12h后更换新鲜的含10％FBS 1640培养液。根据转染质粒将实验细胞分为3组：pcDNA-eNOS-mut组、pcDNA-eNOS组和对照组(加入空pcDNA载体)。
3、Western blot及EPC功能的检测
1)Western blot、RT-PCR检测eNOS蛋白及mRNA水平
收集各组第1～2代对数生长期EPC，提取蛋白质，Western blot检测各组eNOS、p-eNOS的表达，以β-actin为内参。
收集各组第1～2代对数生长期EPC，提取RNA，逆转录为cDNA，qRT-PCR检测各组eNOS的表达，以GAPDH为内参。
由图2可以看出，pcDNA-eNOS-mut组的eNOS蛋白以及mRNA水平均显著高于pcDNA-eNOS组。也就是说突变的引入使得eNOS的转录和翻译水平均有所改变。
2)CCK-8检测EPC的增殖能力
收集各组第1～2代对数生长期EPC，调整细胞悬液浓度至10×104/mL，96孔板每孔加入100μL细胞悬液，每组设3个复孔，5％CO2，37℃孵育24h，CCK-8检测各组细胞的增殖能力，时间点为24h、48h、72h。由图3可以看出，24h、48h以及96h三个时间点上，pcDNA-eNOS-mut组的细胞增殖能力显著高于野生型以及对照组。
3)Transwell检测EPC迁移能力
将用双无培养基混悬的第1～2代对数生长期EPC传代至Transwell小室的上室中，每孔加入100μL，调整细胞密度为1×105/孔。下室加入600μL不同浓度的SDF-1α(0、50ng/mL、100ng/mL和500ng/mL)无血清培养基，37℃、5％CO2条件下培养24h。取出小室液体，用棉签仔细擦净膜上未迁移的细胞，用0.1％结晶紫染色10min，随机选取6个视野，显微镜下计数迁移的细胞。结果表明，pcDNA-eNOS-mut组的细胞迁移数目相对于野生型组显著增加，野生型组的细胞迁移数目相对于空白对照组也显著增加，p<0.01。
4)Griess试剂显色法测定NO浓度
按照试剂盒说明书稀释标准品、准备试剂、配置酶混合液、加样并设置空白对照。每孔加入30μL酶混合液，轻轻混匀，30℃反应20min。每孔先后加入50μL室温Griess试剂I和II，轻轻混匀，540nm测定吸光度，根据标准品计算出样品中的NO的浓度。结果显示eNOS多肽突变体刺激EPC细胞合成NO，与野生型eNOS比较，突变体刺激了NO产生水平的显著增加。
5)EPC体外成血管实验
吸取100μL/孔基质胶加入96孔板，37℃，5％CO2孵育1h后，取各组第1～2代对数生长期的EPC以2×104/mL密度接种于Matrigel基质胶，8h后，倒置显微镜下拍照观察，利用图像分析软件Image-Pro Plus分析形成管腔的数量及面积。由图4可以看出，pcDNA-eNOS-mut组(图4b)的Matrigel小管样结构生成的数量和面积显著多于pcDNA-eNOS组(图4a)以及对照组(图4c)。
由以上结果可知，突变型eNOS可促进EPC的增殖、迁移及小管样结构的生成，这对于改善肢体缺血、急性心肌梗死及重度心衰患者心肌微循环的血液供应，抑制心肌重塑，提高患者的存活率及生活质量意义重大。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
序列表
<110> 李静
<120> eNOS突变体在促进血管生成中的应用
<141> 2017-10-26
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1203
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Glu Pro Gly Pro Pro Cys Gly
1 5 10 15
Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Cys Gly Lys Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Arg Ala Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro
35 40 45
Ala Pro Glu His Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Thr Gln Pro Pro Glu
50 55 60
Gly Pro Lys Phe Pro Arg Val Lys Asn Trp Glu Val Gly Ser Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Leu Ser Ala Gln Ala Gln Gln Asp Gly Pro Cys Thr Pro
85 90 95
Arg Arg Cys Leu Gly Ser Leu Val Phe Pro Arg Lys Leu Gln Gly Arg
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Pro Pro Ala Pro Glu Gln Leu Leu Ser Gln Ala Arg
115 120 125
Asp Phe Ile Asn Gln Tyr Tyr Ser Ser Ile Lys Arg Ser Gly Ser Gln
130 135 140
Ala His Glu Gln Arg Leu Gln Glu Val Glu Ala Glu Val Ala Ala Thr
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Gln Leu Arg Glu Ser Glu Leu Val Phe Gly Ala Lys Gln
165 170 175
Ala Trp Arg Asn Ala Pro Arg Cys Val Gly Arg Ile Gln Trp Gly Lys
180 185 190
Leu Gln Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys Arg Ser Ala Gln Glu Met Phe
195 200 205
Thr Tyr Ile Cys Asn His Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Arg Gly Asn Leu
210 215 220
Arg Ser Ala Ile Thr Val Phe Pro Gln Arg Cys Pro Gly Arg Gly Asp
225 230 235 240
Phe Arg Ile Trp Asn Ser Gln Leu Val Arg Tyr Ala Gly Tyr Arg Gln
245 250 255
Gln Asp Gly Ser Val Arg Gly Asp Pro Ala Asn Val Glu Ile Thr Glu
260 265 270
Leu Cys Ile Gln His Gly Trp Thr Pro Gly Asn Gly Arg Phe Asp Val
275 280 285
Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Pro Asp Glu Pro Pro Glu Leu Phe Leu
290 295 300
Leu Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val Pro Leu Glu His Pro Thr Leu
305 310 315 320
Glu Trp Phe Ala Ala Leu Gly Leu Arg Trp Tyr Ala Leu Pro Ala Val
325 330 335
Ser Asn Met Leu Leu Glu Ile Gly Gly Leu Glu Phe Pro Ala Ala Pro
340 345 350
Phe Ser Gly Trp Tyr Met Ser Thr Glu Ile Gly Thr Arg Asn Leu Cys
355 360 365
Asp Pro His Arg Tyr Asn Ile Leu Glu Asp Val Ala Val Cys Met Asp
370 375 380
Leu Asp Thr Arg Thr Thr Ser Ser Leu Trp Lys Asp Lys Ala Ala Val
385 390 395 400
Glu Ile Asn Val Ala Val Leu His Ser Tyr Gln Leu Ala Lys Val Thr
405 410 415
Ile Val Asp His His Ala Ala Thr Ala Ser Phe Met Lys His Leu Glu
420 425 430
Asn Glu Gln Lys Ala Arg Gly Gly Cys Pro Ala Asp Trp Ala Trp Ile
435 440 445
Val Pro Pro Ile Ser Gly Ser Leu Thr Pro Val Phe His Gln Glu Met
450 455 460
Val Asn Tyr Phe Leu Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Asp Pro Trp
465 470 475 480
Lys Gly Ser Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe
485 490 495
Lys Glu Val Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr
500 505 510
Val Met Ala Lys Arg Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Gly Ser Glu Thr
515 520 525
Gly Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Gln Leu Gly Arg Leu Phe Arg Lys
530 535 540
Ala Phe Asp Pro Arg Val Leu Cys Met Asp Glu Tyr Asp Val Val Ser
545 550 555 560
Leu Glu His Glu Thr Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn
565 570 575
Gly Asp Pro Pro Glu Asn Gly Glu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Met Glu
580 585 590
Met Ser Gly Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gln His Lys Ser
595 600 605
Tyr Lys Ile Arg Phe Asn Ser Ile Ser Cys Ser Asp Pro Leu Val Ser
610 615 620
Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Gly
625 630 635 640
Ala Leu Gly Thr Leu Arg Phe Cys Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala
645 650 655
Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Ala Arg Ala Val Asp Thr Arg Leu Glu
660 665 670
Glu Leu Gly Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Asp Glu Leu
675 680 685
Cys Gly Gln Glu Glu Ala Phe Arg Gly Trp Ala Gln Ala Ala Phe Gln
690 695 700
Ala Ala Cys Glu Thr Phe Cys Val Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala
705 710 715 720
Arg Asp Ile Phe Ser Pro Lys Arg Ser Trp Lys Arg Gln Arg Tyr Arg
725 730 735
Leu Ser Ala Gln Ala Glu Gly Leu Gln Leu Leu Pro Gly Leu Ile His
740 745 750
Val His Arg Arg Lys Met Phe Gln Ala Thr Ile Arg Ser Val Glu Asn
755 760 765
Leu Gln Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala Thr Ile Leu Val Arg Leu Asp
770 775 780
Thr Gly Gly Gln Glu Gly Leu Gln Tyr Gln Pro Gly Asp His Ile Gly
785 790 795 800
Val Cys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Leu Val Glu Ala Leu Leu Ser Arg
805 810 815
Val Glu Asp Pro Pro Ala Pro Thr Glu Pro Val Ala Val Glu Gln Leu
820 825 830
Glu Lys Gly Ser Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Trp Val Arg Asp Pro
835 840 845
Arg Leu Pro Pro Cys Thr Leu Arg Gln Ala Leu Thr Phe Phe Leu Asp
850 855 860
Ile Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gln Leu Leu Arg Leu Leu Ser Thr Leu
865 870 875 880
Ala Glu Glu Pro Arg Glu Gln Gln Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Asp
885 890 895
Pro Arg Arg Tyr Glu Glu Trp Lys Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu
900 905 910
Glu Val Leu Glu Gln Phe Pro Ser Val Ala Leu Pro Ala Pro Leu Leu
915 920 925
Leu Thr Gln Leu Pro Leu Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Val Ser Ser
930 935 940
Ala Pro Ser Thr His Pro Gly Glu Ile His Leu Thr Val Ala Val Leu
945 950 955 960
Ala Tyr Arg Thr Gln Asp Gly Leu Gly Pro Leu His Tyr Gly Val Cys
965 970 975
Ser Thr Trp Leu Ser Gln Leu Lys Pro Gly Asp Pro Val Pro Cys Phe
980 985 990
Ile Arg Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro Pro Asp Pro Ser Leu Pro
995 1000 1005
Cys Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Phe Arg Gly Phe
1010 1015 1020
Trp Gln Glu Arg Leu His Asp Ile Glu Ser Lys Gly Leu Gln Pro Thr
1025 1030 1035 1040
Pro Met Thr Leu Val Phe Gly Cys Arg Cys Ser Gln Leu Asp His Leu
1045 1050 1055
Tyr Arg Asp Glu Val Gln Asn Ala Gln Gln Arg Gly Val Phe Gly Arg
1060 1065 1070
Val Leu Thr Ala Phe Ser Arg Glu Pro Asp Asn Pro Lys Thr Tyr Val
1075 1080 1085
Gln Asp Ile Leu Arg Thr Glu Leu Ala Ala Glu Val His Arg Val Leu
1090 1095 1100
Cys Leu Glu Arg Gly His Met Phe Val Cys Gly Asp Val Thr Met Ala
1105 1110 1115 1120
Thr Asn Val Leu Gln Thr Val Gln Arg Ile Leu Ala Thr Glu Gly Asp
1125 1130 1135
Met Glu Leu Asp Glu Ala Gly Asp Val Ile Gly Val Leu Arg Asp Gln
1140 1145 1150
Gln Arg Tyr His Glu Asp Ile Phe Gly Leu Thr Leu Arg Thr Gln Glu
1155 1160 1165
Val Thr Ser Arg Ile Arg Thr Gln Ser Phe Ser Leu Gln Glu Arg Gln
1170 1175 1180
Leu Arg Gly Ala Val Pro Trp Ala Phe Asp Pro Pro Gly Ser Asp Thr
1185 1190 1195 1200
Asn Ser Pro
<210> 2
<211> 1203
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Glu Pro Gly Pro Pro Cys Gly
1 5 10 15
Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Cys Gly Lys Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Arg Ala Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro
35 40 45
Ala Pro Glu His Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Thr Gln Pro Pro Glu
50 55 60
Gly Pro Ser Phe Pro Arg Val Lys Asn Trp Glu Val Gly Ser Ile Thr
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Leu Ser Ala Gln Ala Gln Gln Asp Gly Pro Cys Thr Pro
85 90 95
Arg Arg Cys Leu Gly Ser Leu Val Phe Pro Arg Lys Leu Gln Gly Arg
100 105 110
Pro Ser Pro Gly Pro Pro Ala Pro Glu Gln Leu Leu Ser Gln Ala Arg
115 120 125
Asp Phe Ile Asn Gln Tyr Tyr Ser Ser Ile Lys Arg Ser Gly Ser Gln
130 135 140
Ala His Glu Gln Arg Leu Gln Glu Val Glu Ala Glu Val Ala Ala Thr
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Gln Leu Arg Glu Ser Glu Leu Val Phe Gly Ala Lys Gln
165 170 175
Ala Trp Arg Asn Ala Pro Arg Cys Val Gly Arg Ile Glu Trp Gly Lys
180 185 190
Leu Gln Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys Arg Ser Ala Gln Glu Met Phe
195 200 205
Thr Tyr Ile Cys Asn His Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Arg Gly Asn Leu
210 215 220
Arg Ser Ala Ile Thr Val Phe Pro Gln Arg Cys Pro Gly Arg Gly Asp
225 230 235 240
Phe Arg Ile Trp Asn Ser Gln Leu Val Arg Tyr Ala Gly Tyr Arg Gln
245 250 255
Gln Asp Gly Ser Val Arg Gly Asp Pro Ala Asn Val Glu Ile Thr Glu
260 265 270
Leu Cys Ile Gln His Gly Trp Thr Pro Gly Asn Gly Arg Phe Asp Val
275 280 285
Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Pro Asp Glu Pro Pro Glu Leu Phe Leu
290 295 300
Leu Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val Pro Leu Glu His Pro Thr Leu
305 310 315 320
Glu Trp Phe Ala Ala Leu Gly Leu Arg Trp Tyr Ala Leu Pro Ala Val
325 330 335
Ser Asn Met Leu Leu Glu Ile Gly Gly Leu Glu Phe Pro Ala Ala Pro
340 345 350
Phe Ser Gly Trp Tyr Met Ser Thr Glu Ile Gly Thr Arg Asn Leu Cys
355 360 365
Asp Pro His Arg Tyr Asn Ile Leu Glu Asp Val Ala Val Cys Met Asp
370 375 380
Leu Asp Thr Arg Thr Thr Ser Ser Leu Trp Lys Asp Lys Ala Ala Val
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Lys Gly Ser Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe
485 490 495
Lys Glu Val Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr
500 505 510
Val Met Ala Val Lys Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Gly Ser Glu Thr
515 520 525
Gly Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Gln Leu Gly Arg Leu Phe Arg Lys
530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Gly Asp Pro Pro Glu Asn Gly Glu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Met Glu
580 585 590
Met Ser Gly Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gln His Lys Ser
595 600 605
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610 615 620
Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Gly
625 630 635 640
Ala Leu Gly Thr Leu Arg Phe Cys Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala
645 650 655
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660 665 670
Glu Leu Gly Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Asp Glu Leu
675 680 685
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Ala Ala Cys Glu Thr Phe Cys Val Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala
705 710 715 720
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785 790 795 800
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820 825 830
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850 855 860
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1170 1175 1180
Leu Lys Gly Ala Val Pro Trp Ala Phe Asp Pro Pro Gly Ser Asp Thr
1185 1190 1195 1200
Asn Ser Pro
Claims (6)
1.突变型eNOS在制备促进血管生成的药物中的作用，所述突变型eNOS包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.突变型eNOS在制备一种用于治疗有增加血管生成需求的患者的药物中的用途，所述突变型eNOS包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的应用，所述突变型eNOS通过促进EPC的增殖和迁移来促进血管生成。
4.如权利要求2所述的应用，所述患者患有重症肢体缺血、缺血性心脏病或动脉粥样硬化。
5.突变型eNOS在制备促进EPC增殖的试剂中的应用，所述突变型eNOS包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
6.突变型eNOS在制备促进EPC迁移的试剂中的应用，所述突变型eNOS包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
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Family Applications (1)
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1688197A (zh) * | 2002-08-16 | 2005-10-26 | 舍林股份公司 | 以野生型或突变型eNOS对重症肢体缺血的基因治疗 |
| CN1691958A (zh) * | 2002-08-16 | 2005-11-02 | 舍林股份公司 | 用于基因治疗的eNOS突变体 |
| UA82681U (ru) * | 2013-03-11 | 2013-08-12 | Научно-Исследовательский Институт Реабилитации Инвалидов (Учебно-Научно-Лечебный Комплекс) Винницкого Национального Медицинского Университета Им. М.И. Пирогова | Способ лечения ложного сустава кости |
-
2017
- 2017-10-26 CN CN201711013899.0A patent/CN107802826B/zh active Active
Patent Citations (4)
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| 朱娜等: "eNOS基因T-786C和G894T单核苷酸多态性与冠心病关系的病例对照研究", 《浙江预防医学》 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107802826B (zh) | 2020-02-18 |
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