PT517292E - Virus avipox recombinante - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VÍRUS AVIPOX RECOMBINANTE" O invento diz respeito a vírus recombinantes derivados de vírus Avipox e em particular de vírus responsável pela varíola aviária, geralmente designado Fowlpox. O invento diz respeito igualmente a um processo para a obtenção destes vírus através de culturas celulares, utilização destes vírus para obtenção de vacinas e vacinas contendo estes vírus. O invento diz respeito igualmente a sequências de transferência para a inserção no genoma deste vírus recombinante, assim como a plasmídeos portadores destas sequências. O vírus responsável pela varíola aviária, ou vírus Fowlpox (FPV), pertence ao género Avipox da família Poxviridae. O vírus Fowlpox tem características típicas dos Poxviridae. São vírus de grandes dimensões, cujo genoma consiste em DNA de cadeia dupla linear com cerca de 300 Kb e cujas extremidades de cadeia simples estão ligadas covalentemente. Cerca de 20 Kb do genoma foram sequenciadas, em particular a sequência das repetições terminais invertidas (TIR para Terminal Inverted Repeats) (Campbell et al, 1989; Tomley et al., 1988). As repetições terminais invertidas são duas sequências grandes idênticas, presentes em cada uma das extremidades do genoma em orientação inversa. O vírus da vacina ou Vaccinia foi o primeiro Pox desenvolvido como vírus recombinante vivo capaz de expressar proteínas heterólogas. A lista das proteínas expressas é muito longa. Em particular, a expressão de numerosos antigénios heterólogos permitiu obter imunizações contra diferentes doenças.

Foi proposto no pedido de patente europeia 0314 569 a utilização do vírus Fowlpox como vector de expressão de proteínas heterólogas para preparar uma vacina, ou seja a utilização de um vírus recombinante tendo integrada, numa região intergénica não codificante do seu genoma, uma sequência de DNA codificador de uma proteína heteróloga; esta região é uma sequência curta de 32 nucleótidos, situada entre as grelhas de leitura abertas (ORF para Open Reading Frame) ORF 7 e ORF 9, esta região foi geneticamente manipulada para ser um local de inserção essencial. Nestas regiões intergénicas assim curtas, é grande o risco de a inserção separar um sinal de transcrição do seu gene e por consequência introduzir uma mutação que inactiva este gene. Isto verifica-se: com efeito esta sequência de 32 nucleótidos parece ser uma região essencial, uma vez que teve de ser alargada em 55 nucleótidos para evitar a sobreposição possível entre o promotor da ORF 9 e a sequência codificante 3' da ORF 7. No caso da região que separa a ORF 7 da ORF 9, a inserção na sequência natural é portanto instável (Spehner et al., 1990) e a sua manipulação é indispensável. Igualmente a maneira de manipular uma região curta intergénica proposta não é geral.

Assim, propôs-se igualmente no pedido de patente internacional W088/02022 a construção de vírus Fowlpox, e de outros Avipox, recombinantes caracterizados pela inserção do DNA estranho no gene da cinase de timidina. Esta inserção criou uma mutação no gene que poderá atenuar o poder infeccioso do vírus. Esta inserção apresenta portanto o risco de uma grande atenuação da estirpe e um poder imunogénico reduzido para uma vacina derivada do vírus recombinante.

Assim, propôs-se igualmente no pedido de patente europeia -3- 0353851 a utilização de um vírus recombinante Fowlpox como vector de expressão de proteínas heterólogas. A inserção do gene estranho no genoma virai foi realizada nas grelhas de leitura abertas (ORF) situadas nas repetições terminais invertidas /TIR). A inserção de um ou mais genes estranhos em grelhas de leitura abertas apresenta o risco de se mutagenizar um gene de que se ignora a função. O presente invento fornece outras regiões para inserção de um ou mais genes estranhos no genoma virai, que não apresentam os inconvenientes das regiões de inserção referidas. O presente invento diz respeito a um vírus Avipox recombinante derivado de uma estirpe atenuada de vírus Avipox e tendo, numa parte não essencial do seu genoma uma sequência de DNA codificadora, da totalidade ou de uma parte, de uma proteína heteróloga para o vírus Avipox, assim como elementos susceptíveis de assegurar a expressão desta proteína numa célula infectada pelo referido vírus recombinante, caracterizado pela parte não essencial do genoma ser constituída por uma região intergénica não codificante, tendo uma sequência de mais de 60 nucleótidos e estar situada entre duas grelhas abertas de leitura (ORF), os seus sinais de expressão incluídos, esta região intergénica sendo escolhida entre a região, referida como região βΐ, situada entre a ORF1 e a ORF 2 da região TIR (repetições terminais invertidas) e a região, referida como região β2, situada entre a ORF2 e a ORF3 da região TIR.

Por uma parte não essencial do genoma do vírus Avipox, entende-se uma região que pode ser modificada sem alterar as fiinções implicadas no desenvolvimento do vírus in vitro e in vivo. Escolhe-se como parte não essencial uma região intergénica não codificante do genoma, ou seja situada entre duas ORFs, os seus sinais de expressão incluídos. *r *r

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As regiões intergénicas de acordo com o invento são grandes, de forma a que o risco de uma inserção separar os sinais de transcrição dos respectivos genes seja mínima e igualmente que a sua manipulação seja inútil. Por outro lado, as sequências destas regiões intergénicas são não codificantes e portanto o risco da mutação numa ORF é nulo. Por região grande entende-se uma região tendo uma sequência de mais de 60 nucleótidos. Geralmente, escolhe-se uma região tendo uma sequência de mais de 100 nucleótidos. De preferência escolhe-se uma região tendo uma sequência de mais de 200 nucleótidos. Prefere-se, particularmente escolher, uma região tendo uma sequência de mais de 400 nucleótidos.

Assim, geralmente, escolhe-se uma região intergénica, na qual pelo menos uma sequência de DNA é clonada, situada numa das duas regiões TIR do vírus Avipox. Habitualmente pelo menos uma sequência de DNA é clonado em pelo menos uma das duas regiões TIR do vírus Avipox. De preferência pelo menos uma sequência de DNA é clonada nas duas regiões TIR do vírus. Prefere-se ainda escolher a região intergénica, designada região βΐ, ou/e a região intergénica, designada região β2; a região intergénica, designada região β 1, estando situada entre os nucleótidos 1675 e 2165 e a região intergénica, designada região β2, estando situada entre os nucleótidos 2672 e 3605 considerando como nucleótido de origem o sítio de restrição BamHl presente nas TIR. Este sítio de restrição BamHl aqui escolhido para posicionar as regiões intergénicas é o primeiro nucleótido da sequência publicada por Tomley et al., 1988. Pode-se igualmente definir estas regiões de acordo com o invento como se segue: a região intergénica, designada região β 1, está situada entre as fases de leitura abertas ORF1 e ORF2, a grelha de leitura aberta ORF1 estando situada entre os nucleótidos 416-0 nucleótido A do ATG - e 1674 - o 3o nucleótido do codão stop - e a grelha de leitura aberta da ORF2 estando situado entre os -5-

^ssesss nucleótidos 2166-o nucleótido A do ATG - e 2671 - 3o nucleótido do codão stop considerando como nucleótido de origem o sítio de restrição BamHl nas TIR e a região intergénica, referida como região β2, está situado entre as grelhas de leitura abertas 0RF2 e 0RF3, a grelha de leitura aberta 0RF2 estando situada entre os nucleótidos 2166-0 nucleótido A do ATG - e 2671 - o 3o nucleótido do codão stop - e a a fase de leitura aberta 0RF3 estando situada entre os nucleótidos 3606 - o 3o nucleótido do codão stop - e 4055 - o nucleótido A do ATG -, considerando como nucleótido de origem o sítio de restrição BamHl nas TIR. De forma particularmente preferida, escolhe-se na região βΐ uma parte situada entre os nucleótidos 1775 e 2065 e na região β2 uma parte situada entre os nucleótidos 2772 e 3505. Obtiveram-se bons resultados clonando no sítio do nucleótido 1842, o referido sítio de inserção Bl, situado na região βΐ, e/ou no sítio do nucleótido 3062, o referido sítio de inserção B2, na região β2.

Obtiveram-se bons resultados quando pelo menosuma sequência de DNA foi clonada na região β2, numa das duas regiões TIR do vírus Avipox. Obtiveram-se igualmente bons resultados quando uma sequência de DNA foi clonada na região βΐ em cada uma das duas TIR. Isto representa uma outra vantagem do invento, uma vez que é possível obter duas cópias da sequência de DNA heterólogo por genoma.

Por vírus aviário recombinante derivado de uma estirpe atenuada do víms Avipox, entende-se um vírus pertencente ao género Avipox, atenuado, cujo genoma compreende uma sequência heteróloga acompanhada de sinais de expressão. Geralmente utiliza-se como vírus um vírus do género Avipox, como seja o Fowlpox, Pigeonpox ou o Canarypox. Habitualmente utiliza-se como vírus o Fowlpox. De preferência, utiliza-se como vírus Fowlpox uma estirpe vacinai do vírus da varíola das galinhas ou Fowlpox, tal como a vacina produzida e comercializada pela Sociedade SOLVAY com a marca POXINE ou a vacina produzida e comercializada pela Sociedade SOLVAY com as marcas CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE, POULVAC P. De forma particularmente preferida usa-se como vírus Fowlpox a vacina comercializada pela SOLVAY com as marcas CHICK-N-POX POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE, POULVAC P, abreviadamente CNP. A atenuação é conseguida por passagens sucessivas em embrião, ou se o vírus foi adaptado a culturas celulares, por passagens em culturas de células.

Por elementos susceptíveis de assegurar a expressão do gene que codifica a proteína heteróloga numa célula infectada pelo referido vírus recombinante, entende-se os sinais de expressão genética reconhecidos pelo vírus, principalmente o promotor e o terminador, elementos conhecidos dos familiarizados com a matéria e bem descritos, por exemplo por Moss, 1990. Geralmente utiliza-se um promotor de Pox. Habitualmente utiliza-se um promotor de Vaccinia ou de Fowlpox. De preferência utiliza-se o promotor Pile o promotor P7.5 de Vaccinia, tal como descrito por Venkatesan et al, 1981, Cochran et al, 1985 e Bertholet et al, 1985.

Por uma sequência de DNA codificante da totalidade ou parte de uma proteína heteróloga para o vírus Avipox, entende-se qualquer fragmento de DNA extraído de um genoma, ou de uma cópia de cDNA ou ainda um DNA sintético, acompanhado dos sinais de expressão, e portanto a sequência codifica a totalidade ou parte de uma proteína estranha para o vírus Avipox.

As figuras 1 a 11 destinam-se a permitir a compreensão do invento. -Ί Α figura 1 representa uma construção de um Avipox recombinante, modificado de acordo com Mackett et al, 1984. Células infectadas (I: infecção) pelo vírus Fowlpox (FPV) são transfectadas (T: "transfecção") com um plasmídeo de transferência. Este plasmídeo (P) é portador de uma promotor (Pr) orientado para permitir a expressão de um gene (g) heterólogo adjacente, flanqueado de um lado e doutro por sequências de DNA virai. A recombinação (R) homóloga tem lugar no citoplasma da célula (C), entre as sequências que flanqueiam o gene e as sequências presentes no genoma virai. Daqui resulta a inserção do gene heterólogo no genoma virai. Este genoma pode ser encapsidado e produzir partículas virais recombinantes (VR). N é o núcleo da célula (C). A figura 2 representa esquematicamente as extremidades do genoma do Fowlpox com as TIR da direita (TIR-R) e da esquerda (TIR-L) simbolizadas por rectângulos e com a sequência única simbolizada por uma linha. Os ponteados simbolizam a região central do genoma. O fragmento de restrição EcoRI da TIR-L é de 6,2 Kb enquanto o da TIR-R é de 9,0 Kb. Este esquema mostra que estes dois fragmentos possuem uma sequência comum e uma sequência única. Está indicado um sítio BamHl. situado a jusante de EcoRI nas TIR. A figura 3 representa um mapa de restrição do plasmídeo pTIRBl (PTIRB1) para alguns sítios únicos e a posição das ORF. O sítio único BamHl foi usado nas clonagens dos genes heterólogos. ori (ORI): origem de replicação do plasmídeo em Escherichia coli (E. coli); Ap: gene de resistência do plasmídeo em Escherichia coli (E. coli); Ap: gene de resistência à ampicilina; ORF1 a ORF6: grelhas de leitura abertas de Fowlpox; A figura 4 representa uma figura semelhante à da figura 3 mas para o plasmídeo pTIRB2 (PTIRB2). -8- A figura 5 representa um mapa de restrição do plasmídeo pllLac (PI 1LAC). Este plasmídeo é portador do gene LacZ de E. coli sob o controlo do promotor Pll de Vaccinia. PI 1: promotor Pll do vírus da vacina; LACZ: gene codifícante da β-galactosidase; ori: origem de replicação em E. coli; Cadeia +: cadeia encapsidada no fago Ml3; Ap: gene de resistência à ampicilina. A figura 6 representa um exemplo de um vector de transferência do gene LacZ nas TIR. Este vector é o pTIRBlP75Lac (PTIRB1P75LAC). A cassete P7.5-LacZ foi clonada no sítio BamHl do pTIRBl, no sentido dos ponteiros do relógio. A figura 7 é uma representação esquemática das inserções do gene LacZ (representado por um rectângulo a tracejado) no genoma do CNP. As cassetes P7.5-LacZ e Pll-LacZ são inseridas nas regiões terminais (TIR), numa ou noutra orientação. A região TIR da direita não está representada. As setas indicam o sentido da transcrição dos genes, representados pelos rectângulos. A escala não foi respeitada. A figura 8 representa o segmento A do IBDV, a posição das escorvas e os diferentes fragmentos otidos por transcrição reversa e amplificação do RNA do segmento A da estirpe de Edgar. A : organização das ORF. p : "escorvas" utilizadas para a amplificação do segmento A. >,< : orientação das "escorvas" relativamente à sequência codifícante do segmento A. fgt PCR: fragmentos gerados por amplificação do RNA do segmento A. pb : pares de bases. -9- A figura 9 (figura 9a a figura 9e) representa a sequência nucleotídica do DNA amplificado correspondendo ao RNA do segmento A da estirpe Edgar e a tradução dos aminoácidos das ORF 1, 2 e 3.

Escorvas 0, 1, lb, 2, 3, 4, 5 e 6: escorvas utilizadas para gerar, por transcrição reversa e amplificação, os fragmentos de DNA correspondendo ao segmento A da estirpe Edgar. A figura 10 representa o esquema de resconstrução do segmento de DNA correspondendo ao segmento A da estirpe Edgar a partir dos fragmentos obtidos por transcrição reversa e amplificação. * : mutagénese dirigida. A figura 11 representa um mapa de restrição do plasmídeo pTIR7.5ElLAC (PTIR75E1LAC). O fragmento do plasmídeo a traço forte corresponde às sequências homólogas do genoma do FPV. ori (ORI): origem de replicação do plasmídeo em E. coli; Ap: gene de resistência à ampicilina; P7.5: promotor P7.5 do vírus da vacina; ORF1-IBDV: ORF1 do segmento A da estirpe Edgar; PI 1: promotor Pll do vírus da vacina; LACZ: gene codificante da β-galactosidase; pb: pares de bases; ORF1 a ORF6. grelhas de leitura aberta do Fowlpox. A figura 12 representa a caracterização pelo teste de ELISA das proteínas IBDV expressas nos recombinantes FPV/IBDV. A caracterização foi realizada como se segue: 50 μΐ das suspensões celulares e das diluições seriadas de duas destas suspensões foram distribuídas pelos alvéolos da placa. Após incubação do segundo anticorpo anti-IBDV (monoclonal anti-VP3 ou anti-VP2), uma amplificação do sinal foi realizada com ajuda do sistema anti-IgG de ratinho marcado com biotina + estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina. -10- A figura 12 A corresponde à detecção com a ajuda do anticorpo monoclonal anti-VP3. A figura 12B corresponde à detecção com a ajuda do anticorpo monoclonal anti-VP2.

Nas figuras a abcissa representa diluições seriadas de dois dos extractos celulares em unidades logarítmicas e a ordenada representa a razão das absorvâncias medidas a 690 nm e a 405 nm. A figura 13 representa a caracterização por Western das proteínas IBDV expressas nos recombinantes FPV/IBDV. Esta caracterização foi realizada como se segue: as suspensões celulares foram centrifugadas a 3000 g e os sobrenadantes obtidos foram centrifugados a 185000 g; os sedimentos resultantes das duas centrifugações foram reunidos e ressuspensos no tampão PBS (Tampão de Fosfatos Salino, Gibco).

Um sedimento de proteínas de 20 a 40 pg para os recombinantes FPV/IBDV e 5 pg para as células infectadas pelo IBDV (testemunha positiva) foi aplicado num gel de SDS-acrilamida. Após transferência para membrana, as proteínas IBDV são detectadas com a ajuda de soro policlonal que reconhece todas as proteínas IBDV para a figura 13A ou com a ajuda do anticorpo monoclonal anti-VP3 para a figura 13B. Uma amplificação do sinal foi conseguida com a ajuda do sistema anti-IgG marcado com biotina e o conjugado estreptavidina-fosfatase alcalina. PM: proteínas de pesos moleculares conhecidos. O processo usado para a execução do invento está esquematizado na figura 1 (modificado de acordo com Mackett et al., 1984). As células infectadas pelo Avipox ou por Fowlpox foram transfectadas com um plasmídeo de transferência. Este plasmídeo possui um promotor orientado de forma a - 11 - permitir a expressão de um gene heterólogo adjacente, flanqueado de um lado e doutro por sequências de DNA virai. A recombinação homóloga tem lugar no citoplasma da célula entre as sequências que flanqueiam o gene e as sequências presentes no genoma virai. Daqui resulta a inserção do gene heterólogo no genoma virai. Este genoma pode ser encapsidado e produzir partículas virais recombinantes. Esta técnica de inserção por infecção das células com Pox, seguido de transfecção com um plasmídeo foi optimizada para o vírus da vacina e é utilizada em numerosos laboratórios para a construção de vírus Pox recombinantes (Mackett et al., 1985). O processo de acordo com o invento compreende habitualmente as seguintes etapas: - a primeira etapa consiste na construção de plasmídeos de transferência que permitam o rastreio dos recombinantes, - a segunda etapa consiste em clonar os genes codificadores dos antigénios heterólogos nos plasmídeos de transferência, - a terceira etapa consiste em construir os vírus Avipoxs recombinantes e - a quarta etapa consiste em efectuar testes de vacinação com os vírus recombinantes.

De preferência o processo compreende as seguintes etapas: a. Construção de plasmídeos de transferência que permitam o rastreio - Clonagem dos fragmentos contendo as TIR. - Inserção do sítio de clonagem nas TIR. - Clonagem dos promotores Pile P7.5 do vírus da vacina. - Construção de uma cassete portadora do gene LacZ e sua clonagem a seguir ao promotor PI 1 ou P7.5. - Clonagem dos elementos PllLacZ ou P7.5LacZ nos plasmídeos de transferência TIR. - 12- b. Construção de vírus CNP recombinantes (gene LacZ para efectuar um teste preliminar): - Infecção das células QT35 pelo vírus CNP e transfecção com um plasmídeo de transferência. - Rastreio seguido de purificação dos recombinantes graças à expressão do gene LacZ. - Análise de genomas dos recombinantes e expressão de LacZ. c. Teste de vacinação: - Vacinação de pintainhos pelos vírus recombinantes e protecção contra a varíola aviária conferida pelo vírus recombinante LacZ. d. Clonagem de genes codificadores de antigénios heterólogos (proteína heteróloga) nos plasmídeos de transferência: - Clonagem de genes codificadores de antigénios heterólogos a seguir a Pll ou a P7.5. - Clonagem de cassetes Pll-Antigénio e P7.5-LacZ ou P7.5-Antigénio e Pll -LacZ nos plasmídeos TIR. e. Construção de vírus CNP recombinantes: - Infecção de células QT35 pelo vírus CNP e transfecção com um plasmídeo de transferência. - Rastreio seguido de purificação dos vírus recombinantes graças à expressão do gene LacZ. - Análise da expressão do antigénio em culturas de células e análise do genoma dos vírus recombinantes. -13- f. Vacinação: - Vacinação pelos vírus CNP recombinantes. - Avaliação do grau de protecção conferido pela expressão do antigénio heterólogo em CNP. O invento diz igualmente respeito a sequências de transferência que permitem inserir o DNA heterólogo no genoma do vírus Avipox, tal como definido anteriormente e principalmente nos locais BI ou B2. O invento está ainda relacionado com os plasmídeos que são portadores destas sequências. Por plasmídeo de transferência, entende-se um plasmídeo portador de um gene heterólogo sob o controlo de um promotor reconhecido pelo vírus Avipox, flanqueado de um e de outro lado por sequências situadas de um e de outro lado do sítio BI ou do sítio B2. O comprimento destas sequências homólogas do FPV que flanqueiam o gene heterólogo deve ser suficientemente grande para permitir uma recombinação à esquerda e à direita do gene heterólogo. Geralmente escolhe-se sequências com pelo menos 1Kb. Obtem-se bons resultados para BI flanqueado por uma sequência de aproximadamente 1850 nucleótidos a jusante e 4321 nucleótidos a montante, e, para B2, cerca de 3070 nucleótidos a jusante e 3100 nucleótidos a montante. Os plasmídeos de transferência interferem no processo para isolar os vírus Avipoxs recombinantes, o processo incluindo a transfecção das células da linha QT35, previamente infectadas pelo vírus Avipox. O invento diz igualmente respeito a uma cultura de células eucarióticas infectadas por um vírus Avipox recombinante derivado de uma estirpe atenuada de vírus Avipox e possuindo numa parte não essencial do seu genoma pelo menos uma sequência de DNA codificante da totalidade ou de parte de uma proteína heteróloga para o vírus Avipox, assim como elementos susceptíveis de assegurar a expressão desta proteína numa célula infectada pelo referido vírus recombinante, a parte não essencial sendo constituída por uma - 14- região intergénica não codificante do vírus Avipox, situada entre duas ORFs, os seus sinais de expressão incluídos.

De preferência utiliza-se uma cultura de células aviárias. Obtiveram-se bons resultados com uma cultura de células de uma linha celular. Obtiveram-se resultados excelentes com a cultura de células da linha QT35, tal como descrito por Cho (1981). O vírus Avipox recombinante, de acordo com o invento, foi desenvolvido como vector capaz de expressar a totalidade ou parte da proteína heteróloga. O presente invento diz assim igualmente respeito à utilização do vírus de acordo com o invento como vector capaz de expressar a totalidade ou parte de uma proteína heteróloga, nomeadamente um antigénio. O invento diz igualmente respeito a uma vacina contendo um vírus Avipox recombinante, derivado de uma estirpe atenuada de vírus Avipox e tendo numa parte não essencial do seu genoma pelo menos uma sequência de DNA codificador da totalidade ou de parte de uma proteína heteróloga para o vírus Avipox, assim como elementos susceptíveis de assegurar a expressão desta proteína numa célula infectada pelo referido vírus recombinante, a parte não essencial do genoma sendo constituída por uma região intergénica não codificante do vírus Avipox, situada entre duas ORF, sinais de expressão incluídos.

Por proteína heteróloga, entende-se qualquer proteína ou fragmento proteico estranho para o vírus Avipox, proteína natural ou modificada. Geralmente, esta proteína pode ser um antigénio permitindo desenvolver uma vacina contra um organismo patogénico. Habitualmente os antigénios são principalmente proteínas de agentes infecciosos aviários, vírus, bactérias, -15- clamídias, micoplasmas, protozoários, fungos e vermes. São principalmente os Adenoviridae. como seja o vírus responsável pela anemia aplástica (AA) e pelo síndrome da baixa da postura (EDS), os Bimaviridae. como seja o vírus da doença de Gumboro (IBDV), os Coronaviridae. como seja o vírus da bronquite infecciosa (IBV), os Herpesviridae, como seja o vírus da doença de Marek (MDV) e o vírus responsável pela laringotraqueíte infecciosa (ILTV), os Orhtomvxoviridae. como seja o vírus responsável pela gripe (vírus da gripe), os Paramvxoviridae. como seja ao vírus da doença de Newcastle (NDV), os Picomaviridae. como seja o vírus responsável pela encefalomielite (AE), os Reoviridae. responsáveis pela tenosinovite, os retrovírus como seja o vírus responsável pela leucose linfóide (LL), o vírus responsável pela anemia das galinhas (CAV).

As clamídias poderão ser nomeadamente Chlamvdia psittaci.

Os micoplasmas poderão ser nomeadamente Mvcoplasma gallisepticum e M. svnoviae.

As bactérias poderão ser nomeadamente Escherichia coli. Haemophilus. como seja H. paragallinarum que é responsável pela coriza, Pasteurella. como seja P. multocida que é responsável pela cólera, Salmonella. como seja S. gallinarium responsável pelo tifo e S. pullorum. Clostridium. como seja C. botulinum que produz uma toxina responsável pelo butolismo, Ç. perfringens e Ç. septicum responsáveis por dermatoses, C. colinum, Campilobacter i ei uni. Streptococcus aureus.

Os protozoários poderão ser nomeadamente protozoários tais como Eimeria responsável pela coccidiose e Crvptosporídiosis bailev responsável pela - 16- criptosporodiose.

Os vermes poderão ser noeadamente os cestodos e nemátodos como sejam Ascaridia galli.

Os fungos poderá ser nomeadamente Aspergillus fumigatus.

Os antigénios preferidos são os do vírus da doença de Gumboro (IBDV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus responsável pela anemia das galinhas (CAV), protozoário Eimeria responsável pela coccidiose, vírus da doença de Newcastle (NDV) e vírus da doença de Marek (MDV).

Os antigénios particularmente preferidos são os do vírus da doença de Gumboro (IBDV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus responsável pela anemia da galinha (CAV) e do protozoário Eimeria. responsável pela coccidiose. Obtiveram-se bons resultados nas seguintes condições: - para o IBDV: a totalidade ou parte das grelhas de leitura abertas e consequentemente a poliproteína e partes da poliproteína. Proteínas tais como VP2, VP3, VP4. São igualmente incluídas todas as combinações ou modificações. Estas modificações consistem por exemplo na inserção de um sítio de clivagem. - para o IBV: o antigénio E2. - para Eimeria: o antigénio de superfície TA4 natural e o antigénio de superfície TA4 cuja sequência do sítio de clivagem proteolítica foi modificada. - para o VAC: a proteína P50.

Obtiveram-se excelentes resultados para o IBDV, a proteína heteróloga sendo uma parte da poliproteína compreendendo os aminoácidos 1 a 493 seguido dos aminoácidos 1010 a 1012, na qual está incluída a proteína VP2 ; conforme representado na figura 9.

As sequências de DNA podem codificar a proteína completa ou fragmentos da proteína, e induzir no animal a resposta imunológica adequada.. Outras moléculas para além de antigénios poderão ser igualmente tidas em consideração, tais como factores de crescimento e imunomoduladores, tais como interleucinas. O presente invento tem igualmente como objectivo produzir in vivo, na criação, um factor que tenha intervenção no metabolismo do animal, como seja por exemplo uma hormona de crescimento ou um factor indutor desta. O presente invento diz igualmente respeito à preparação de proteínas ou de peptídeos em culturas celulares in vitro ou in vivo no animal. Em função da proteína heteróloga introduzida, pode intervir nomeadamente como enzima, como constituinte nutritivo ou no domínio da saúde humana ou animal enquanto produto farmacêutico para utilização em humanos ou em animais.

Por outro lado, podem ser produzidos múltiplos vírus recombinantes portadores de vários genes heterólogos, quer clonando vários genes no mesmo genoma, num mesmo local ou em regiões ou sítios diferentes. Pode-se criar igualmente um produto polivalente combinando vírus recombinantes diferentes.

Os animais alvo do vírus Avipox de acordo com o invento são as aves, em particular a criação. O vírus recombinante pode ser igualmente empregue em espécies não aviárias. A vacina de acordo com o invento poderá ser administrada sob - 18- diversas formas conhecidas dos familiarizados com a matéria. Geralmente a vacina é administrada por via oral, nos alimentos ou na água de beber, por via intranasal, por injecção subcutânea, por aerossol, por injecção intramuscular ou por perfuração da asa de acordo com o método referido como "wing web". De preferência a vacina é administrada por perfuração da membrana alar de acordo com o método referido como "wing web", por injecção intramuscular ou por injecção subcutânea. A vacina de acordo com o invento é formulada de forma conhecida pelos familiarizados com a matéria. Habitualmente a composição vacinai possui estabilizadores adapatados ao modo de administração da vacina. A vacina pode ser conservada sob a forma liofilizada. O presente invento é ilustrado pelos exemplos que se seguem.

Exemplo 1 - Purificação do vírus CNP e do seu DNA

Utiliza-se como vírus Fowlpox a estirpe vacinai comercializada pela firma Solvay com a marca POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC (TNP), como vacina viva atenuada. O vírus de partida provém de uma estirpe selvagem passada várias vezes em ovos e adaptada culturas celulares in vitro através de duas passagens em CEF (fibroblastos de embrião de galinha) e 5 passagens na linha celular de codorniz QT35 descrita por Cho (1981). A linha celular de codorniz QT35 pode ser obtida do Dr. Moscovici (6816 Northwest 18th Avenue, Gainesville, Florida 32605, Estados Unidos) que a isolou e que a distribui. CNP foi cultivada na linha celular QT35 cujo meio de crescimento é composto por EI99 (Gibco, 500 ml), F12 (Gibco, 500 ml), LAH (Gibco, - 19- hidrolisado de lactalbumina, 25 ml), FCS (Gibco, Soro Fetal Bovino, 25 ml) e frutose (5 ml de uma solução a 200 g/1); incubação a 38°C, 3% de C02. A multiplicidade de infecção (moi) habitual é de 0,01 partículas virais infecciosas por célula, as células estando a 80% de confluência.

Um lote de vírus de partida foi purificado como se segue: as células infectadas pelo vírus Fowlpox CNP e ressuspensas em tampão de fosfatos PBS (Tampão de Fosfatos Salino, Gibco) foram centrifugadas a 6000 g (15 min). O sedimento foi ressuspenso em Tris (pH 9, 1 mM), tripsina a 0,25 mg/ml concentração; Gibco) e sonicado. Este material foi depositado sobre uma almofada de sacarose a 35% (peso/volume) e centrifugado 45 minutos a 30000 g. O sedimento foi ressuspenso em Tris 1 mM, pH 9,0. Os vírus foram centrifugados uma última vez 30 minutos a 40000 g. O sedimento foi ressuspenso em tampão de lise: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS (Dodecilsulfato de sódio) 1%, proteinase K 500 μg/ml (Boehringer), RNase 0,1 mg/ml (Boehringer) e incubado 2 horas a 37°C. O DNA extraído com fenol foi precipitado com etanol. Purificou-se cerca de 20 μg de DNA a partir de de 40 frascos de 150 cm2 infectados.

Exemplo 2 - Construção de uma biblioteca genómica EcoRI e de uma biblioteca genómica BamHl para CNP

As técnicas de genética utilizadas estão descritas por Maniatis et al. 1982. As enzimas de restrição, polimerases, ligases e fosfatases foram fornecidas pelas firmas Pharmacia, Boehringer e Biolabs. Os DNAs sintéticos foram fornecidos pela firma Eurogentec.

Os fragmentos de restrição do DNA virai obtidos com EcoRI ou BamHl foram ligados ao vector pUC18 descrito por Messing (1983) e introduzidos na bactéria E. coli MC 1061 (araD139, (ara, leu)7697, lacX74. galU, galK, hsdR. strA. vendida pela Pharmacia). Os dois bancos genómicos são conservados a -70°C em glicerol sob a forma de duas suspensões de células transformadas. Oitenta por cento dos plasmídeos contêm um inserto. Dezassete fragmentos BamHl e 45 fragmentos EcoRl foram seleccionados com base no seu tamanho e no seu perfil de restrição com Bgl2 ou Hinf 1. Os insertos têm tamanhos de 0,5 a 15 Kb; a soma dos insertos BamHl assim caracterizados é de 82 Kb e de 210 Kb para os fragmentos EcoRl. O tamanho do genoma do Avipox é próximo de 300 Kb (Coupar et al., 1990). Os fragmentos isolados representam assim 25%, para BamHl. e 70%, para EcoRl. do genoma total.

Exemplo 3 - Clonagem dos fragmentos portadores de TIR

As repetições terminais invertidas (TIR) são duas sequências idênticas presentes nas extremidades do genoma dos Pox com orientação oposta. Foi publicada uma sequência de mais de 17 Kb de uma extremidade do genoma da estirpe HP do Fowlpox (Campbell et al., 1989 e Tomley et al, 1988). Ela compreende cerca de 10 Kb da sequência repetida e 7,0 Kb da sequência adjacente.

Procedeu-se à clonagem dos fragmentos EcoRl das TIR. A sequência repetida contem um sítio EcoRl. Como mostra a Figura 2, foram clonados dois fragmentos EcoRl: cada um deles é portador de uma parte da TIR e de uma sequência adjacente única. A sequência única está delimitada pelo sítio EcoRl. o mais próximo das TIR. Estes dois fragmentos foram isolados graças a um oligonucleótido complementar da sequência situada na parte repetida. O primeiro fragmento tem um tamanho de 6,2 Kb e será, por convenção, designado TIR-L. O segundo tem um tamanho de 9,0 Kb e será, por convenção, designado TIR-R. A sequência do fragmento EcoRl TIR-L de CNP é idêntica à publicada. -21 -

A junção entre a TIR e a sequência única deduzida da comparação das sequências de TIR-L e de TIR-R situa-se no nucleótido 4007, o sítio BamHl da sequência publicada por Tomley et al (1988) foi considerada como nucleótido número 1. A junção está situada na grelha de leitura aberta designada ORF3 pelos autores.

Exemplo 4 - Criação, por mutagénese dirigida, de sítios BamHl em

TIR

As grelhas de leitura abertas (ORF) foram deduzidas por análise das sequências de nucleótidos das TIR. Em particular, a ORF1 está situada entre os nucleótidos 416 e 1674, ORF2 está situada entre os nucleótidos 2166 e 2671 e finalmente a ORF 3 está situada entre os nucleótidos 3606 e 4055 e é codificada na cadeia complementar. Consideramos como nucleótido número 1 o primeiro nucleótido G do sítio BamHl das TIR. Estas ORF delimitam duas sequências intergénicas grandes não codificantes, designadas região βΐ, entre a ORF1 e a ORF2 por um lado, e a região β2 entre a ORF2 e a ORF3 por outro lado. São estas duas regiões intergénicas que são escolhidas como regiões de inserção.

Um sítio de clonagem único foi introduzido por mutagénese dirigida (estojo de mutagénese BioRad) em βΐ e β2. O sítio BamHl foi escolhido como sítio de clonagem porque é compatível com outros sítios de restrição, nomeadamente Bdl e Bgl2. A localização do sítio de clonagem foi escolhida dentro das regiões intergénicas para evitar o risco de separar os sinais de transcrição dos respectivos genes, ou seja: - na região β 1: o sítio BI é a sequência 5'GATC3', no nucleótido 1842, transformada em BamHl GGATCC por inserção de um G em 5' e de um C em 3'; - na região β2: o sítio B2 é a sequência 5'GGATT3', no nucleótido 3062, -22- transformado em BamHl por mutação do segundo T em CC.

Existem dois sítios BamHl no plasmídeo que possui o fragmento TIR-L (exemplo 3). Um sítio é proveniente do vector pUC18. O segundo sítio é proveniente de TIR e está situado 71 nucleótidos a jusante do sítio EcoRI escolhido para a clonagem (Campbell et al., 1989; figura 2). Estes dois sítios de clonagem BamHl foram eliminados do plasmídeo portador da TIR-L cortando com BamHl seguido de preenchimento com a polimerase de Klenow e ligação. O plasmídeo resultante é o pTIRl.

Para gerar um sítio BamHl em Bl, o fragmento HindII de 0,9 Kb de pTIRl foi clonado no vector pBSPlus comercializado pela firma Stratagene. A escorva de mutagénese foi: 5'TTTCGAAAGACTTTGGATCCGTAGTATAATATTATA 3'. Os nucleótidos a cheio, ou seja GGATCC, são a sequência reconhecida por BamHl.

Para gerar um sítio BamHl em B2, o fragmento Xbal de 1,7 Kb do pTIRl foi clonado em pBSPlus. A escorva foi: 5'TATATCACGGGATCCAAAAGGTTATTAGTAGTC3\ Os nucleótidos a cheio, ou seja GGATCC, ou seja a sequência reconhecida por BamHl. A reinserção de cada fragmento mutagenizado em pTIRl é o resultado das ligações: - para Bl: Hind3-Scal do pTIRl (1491 pb) + Scal-Aat2 do pBSPlus após mutagénese (485 pb) + Aat2-EcoRI do pTIRl (4220 pb) + EcoRI-Hind3 do pTIRl (2635 pb); - para B2: Xhol-Spll do pTIRl (8512 pb) + Spll-Xhol do pBSPlus após mutagénese (318 pb). -23-

Estas duas ligações geraram os vectores pTIRBl e pTIRB2. Os seus mapas de restrição são as figuras 3 e 4. A partir do plasmídeo pTIRl, gerou-se o plasmídeo pTIRBID através da deleção do seu fragmento EcoRl-Hpal de 2657 pb.

Exemplo 5 - Clonagem dos promotores PI 1 e P7.5 de Vaccinia

Pll e P7.5 são promotores conhecidos de Vaccinia. Pll é o promotor do gene codificador da proteína Pll, transcrito no decurso da fase tardia da infecção virai. P 7.5 é o promotor do gene codificador da proteína 7.5, transcrita nas fases precoce e tardia.

Construção de vectores com os sítios únicos Bgl2 e Bell.

Dois vectores de clonagem contendo os sítios únicos Bgl2, Bell e BamHl foram construídos para permitir as clonagens sucessivas de cassetes compatíveis com BamHl. As sequências dos sítios Bgl2 e Bell foram introduzidas no sítio BamHl do pBSPlus por clonagem do DNA sintético seguinte:

Bgl2 Bell BamHl 5'GATCGAGATCTTGATCAG 3' 31 CTCTAGAACTAGTCCTAG 5'

Os vectores são pBSLKl e pBSLK2. Os adaptadores estão na orientação: pBSLKl —Aval/Smal-BamHl-Bcll-Bgl2-Xbal... pBSLK2 ..Aval/Smal-Bgl2-Bcll-BamHl-Xbal...

Clonagem do promotor P7.5 O fragmento Bcll-BamHl de 143 pb de comprimento do plasmídeo pGS20 contem a sequência do promotor P7.5 (Mackett et al, 1984). A sequência está apresentada abaixo (Venkatesan et al, 1981; Cochran et al, 1985). Os promotores tardio e precoce estão sublinhados. A última base de BamHl está a 10 pb do ATG iniciador do gene.

51TGATCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATA

Bell ----------Tardio CAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGTAAGGAAGTAGAa -------Imediato

TCATAAAGAACAGTGACGGATCC

BamHl O fragmento Bcll-BamHl foi clonado nos sítios Bell e BamHl dos plasmídeos pBSLKl e pBSLK2, gerando respectivamente os plasmídeos plP75 e p2P75. Para permitir a digestão com Bell pBSLKl e pBSLK2 foram extraídos da estirpe JM110 adquirida à ATCC (American Type Culture Collection) sob a referência ATCC 47013.

Clonagem do promotor PI 1 A sequência do promotor PI 1 foi clonada sob a forma de um DNA sintético a partir dos dados de sequências de Bertholet et al, 1985. Hanggi et al (1986) mostraram que um fragmento de 30 nucleótidos a montante do primeiro nucleótido do mRNA contem o promotor. O DNA sintético é um 40mero possuindo um sítio Bgl2 e um sítio BamHl nas suas extremidades. Este DNA foi clonado em pBSLKl, para gerar -25- plPl 1 e em pBSLK2, para gerar p2Pl 1. O fragmento Bgl2-BamHl de p2Pl 1 foi em seguida clonado nos locais Xho2-BamHl de pACYC184. pACYC184 é um vector descrito por Chang e Cohen (1978). A ligação entre Xho2 (GGATCT) e Bgl2 (AGATCT) restaura Bgl2. A sequência do DNA sintético portador de PI 1 é:

51 GATCAAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAATAAG 3' TTTAAAGTAAAACAAAAAAAGATACGATATTTATTCCTAG

Bgl2 BamHl

Exemplo 6 - Construção de uma cassete portadora do gene LacZ compatível com o sitio de restrição BamHl A expressão do gene LacZ permitirá detectar os vírus recom- binantes.

Uma cassete Bgl2-BamHl portadora do gene LacZ foi alterada por mutagénese dirigida. Esta cassete foi clonada no plasmídeo pBSplus (Stratagene) sem o fragmento LacZa e isto para evitar a recombinação entre as duas sequências homólogas, uma em LacZ, outra em LacZa. Este plasmídeo é o pBSMutLacZl. A sequência das extremidades do gene LacZ após mutagénese está apresentada a seguir. Os números correspondem aos números dos aminoácidos da proteína natural.

Em 5',

Bgl2 Ncol 8 9 10 ... AGATCTCACC ATG GCC GTC GTT ...

Met Ala Vai Vai <- β-gal -26-

Em 3', ... CAA AAA TAA TAA TAA CCGGGCAGG GGGGATCC ... ... Gin Lis *** *** ***

Exemplo 7 - Clonagem do gene LacZ a seguir aos promotores P7.5 ouPll A cassete LacZ, Bgl2-BamHl. do pBSMutLacZl foi clonado nos sítios Bgl2-BamHl de p2P75 e de p2Pll para gerar respectivamente p75Lac e pl ILac. Obtem-se a expressão do gene LacZ em E. coli quando este é colocado a seguir aos promotores P7.5 ou Pl 1. As colónias transformadas são de cor azul em meio contendo X-Gal (substrato cromogénio: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-galactopiranosido) que origina uma coloração azul sob a acção da β-galactosidase. Este teste prova que o gene está funcional. A cassete Pl ILac sob a forma de um fragmento Bgl2-Hind3 do plasmídeo pl ILac foi igualmente clonada nos sítios Xhol e Hind3 do pACYC184, dando origem a pACPl ILac. O mapa de pl ILac está apresentado na figura 5.

Exemplo 8 - clonagem das cassetes P75Lac e PllLac nos plasmí-deos pTIRB 1 e pTIRB2 O fragmento Bgl2-BamHl de pllLac (ou pACPllLac) e o fragmento Bgl2-BamHl de p75Lac possui a cassete "Promotor P7.5 ou Pll seguido do gene LacZ" (exemplo 7). Estes fragmentos foram clonados nos sítios BamHl de pTIRBl e de pTIRB2 (exemplo 4), nas duas orientações possíveis, para conferir fenótipo LacZ útil na detecção dos recombinantes. Seis plasmídeos foram isolados entre os oitos recombinantes possíveis. A sua numeração está -27- % apresentada abaixo. Por convenção a orientação "+" é a que coloca a transcrição do gene LacZ no sentido ORF1 para ORF2 ou ORF2 para ORF3, e a orientação é a que corresponde à orientação inversa. No nome dos plasmídeos, "P75Lac" e "PllLac" significam que estas cassetes estão na orientação enquanto que "LacP75" e "LacPll" significa que estas cassetes estão na orientação Como exemplo, na figura 6 está apresentado o mapa do plasmídeo pTIRBlP75Lac. N° i Prom i Sítio Ori Nome ! N° i Prom i Sítio Ori i Nome 3 1 1 l P7.5 1 1 BI + pTIRBlP75Lac 1 1 l 8 1 1 1 l Pll 1 1 BI + 1 1 l pTIRBIPl ILac 4 1 l P7.5 1 l B2 + pTIRB2P75Lac 1 l 9 1 1 l Pll 1 l BI - 1 i pTIRBlLacPll 5 l l P7.5 1 B2 - pTIRB2LacP75 1 l 10 1 l Pll l B2 _ 1 i pTIRB2LacPll N° Prom Sítio BI ou B2 Ori

Nome - número dado ao plasmídeo = promotor = sítio de clonagem BamHl introduzido em TIR. = orientação. A orientação é + quando o sentido da transcrição de LacZ é no sentido ORF1 para ORF2 ou ORF2 para ORF3. A orientação - é a inversa. = nome do plasmídeo da transferência.

Exemplo 9 - Qptimizacão das condições de transferência e de deteccão e isolameto dos vírus recombinantes CNP/LacZ A estratégia de construção de um vírus CNP recombinante está apresentado na figura 1. O protocolo de transferência é o seguinte:

No dia J=l, 2,5 106 células QT35 em 5 ml de meio de crescimento (composição descrita no exemplo 1) foram semeadas em frascos de 25 cm2.

No dia J=2, efectuou-se a transformação: -28-

Vírus: um frasco de 1 ml de vacina CNP liofilizada foi reidratado com 3 ml de água Milli Q estéril e conservado a -70°C. Este lote de vírus foi descongelado e submetido a uma sonicação suave durante 1 minuto. Diluiu-se em seguida em meio de cultura de referência EI 19-F12 e que corresponde ao meio EI 19 descrito no exemplo 1 sem LAH, nem soro, nem frutose para se obter uma multiplicidade de infecção de 0,05 vírus por célula em 2 ml de meio. Substituiu-se então o meio de cultura pela suspensão virai e incubou-se a cultura 2 h a 38°C.

Plasmídeos: misturou-se 20 pg de plasmídeo em 400 μΐ de água e 100 μΐ de CaCl2, 1,25M, adicionou-se gota a gota 500 μΐ de tampão BBS (Tampão BES salino) 2 vezes concentrado (50 mM de BES (Sigma), NaCl 280 mM, NaHPO 1,5 mM; pH 7,0) e incubou-se entre 15 e 30 minutos a 25°C. Um ml da preparação de plasmídeos foi em seguida adicionado às células, após eliminação do meio. Em seguida incubou-se 30 minutos a 38°C. Adicionou-se então 4 ml de meio sem LAH, suplementado com 5% de FCS e Hepes 15 mM (Sigma) pH 7,2. Incubou-se novamente 4 horas a 38°C. Em seguida substitui-se o meio por 5 ml de meio de crescimento referência EI99 (composição descrita no exemplo 1).

No dia J=0, colheu-se os vírus como descrito no exemplo 1. O rastreio baseia-se na produção de β-galactosidase posta em evidência pelo ensaio em caixa de Petri "ensaio de placas". O protocolo para uma caixa de Petri de 6 cm é o seguinte:

No dia J=l: semeia-se 2,5x106 células em 5 ml de meio de crescimento.

No dia J=2: infecta-se esta cultura com 1 ml de vírus nas diluições de 1:10 e 1:100, incuba-se 4 h a 38°C em seguida adiciona-se 4 ml de meio de crescimento (composição descrita no exemplo 1). -29-

No dia J=3: substitui-se o meio por 5 ml de uma camada de agarose composta por um volume de agarose a 2% [Sea Plaque Agarose (FMC) dissolvida em água] e um volume da seguinte mistura: 9 ml de meio 199 2X (Gibco), 0,5 ml de LAH (Gibco) e 0,1 ml de Hepes (pH 7,2, 15 mM final) e 1,0 ml de FCS. A agarose fundida e a mistura foram mantidas a 38°C antes de serem misturados. Deixa-se gelificar a agarose durante 30 minutos à temperatura ambiente e em seguida incuba-se a 38°C.

No dia J=6: cobre-se a cultura com 2 ml de agarose a 1% em PBS (Gibco) contendo 0,3 mg/ml de X-Gal (5-Bromo-4cloro 3-Indolilo β-D-galactopiranósido, Boehringer). O X-Gal foi dissolvido a 30 mg/ml em DMSO (Dimetilsulfóxido, Fluka).

No dia J= 7: conta-se o número e a proporção de placas azuis relativamente ao número de placas não coradas. Em seguida, com a ajuda de uma pipeta de Pasteur colhe-se 5 placas individuais. Guarda-se o vírus em 500 μΐ de meio de crescimento a -70°C. As frequências de recombinação para cada plasmídeo estão apresentadas no quadro abaixo. A notação dos vírus recombinantes é "V" seguido do número do plasmídeo de transferência (conforme definido no exemplo 8). A percentagem de recombinantes varia entre 0,1% e 0,5%, o que corresponde aos dados descritos para os Pox. Na figura 7 está esquematizada uma representação dos genomas recombinantes. Vírus i Azuis/Totais ! % i Vírus i Azuis/Totais ! % V3 1 ! 7/1400 | 1 ! 0,5 I 1 ! V8 1 1 ! í/iooo I 1 ! o,i l V4 ! 10/2000 | ! 0,5 I ! V9 l ! 60/25000 1 ! 0,25 1 V5 ! 15/5000 ! 0,3 ! vio ! 50/30000 ! 0,17

Azuis/Totais = número de placas azuis/número total de placas % = percentagem de placas azuis -30-

Exemplo 10 - Purificação dos vírus recombinantes CNP/LacZ

Obteve-se um clone por purificação sucessiva de uma placa azul na caixa (como descrito no exemplo 9). Em princípio, quando todas as placas são azuis, todos os vírus expressam o gene LacZ e não estão contaminadas por vírus selvagem. São necessárias três a quatro passagens para atingir esta homogeneidade. Como exemplo, a evolução da proporção de placas azuis no decurso das passagens foi: i Número da passagem i 1 ! ia 2a 3a 4a ! Vírus 1 i Azuis/totais % Azuis/totais % Azuis/totais % Azuis/Totais % ! V3 1 ! 20/200 1 10 40/50 80 22/22 100 V4 ! 1/20 1 20 20/30 70 95/100 95 100/100 100 ! V5 ! 50/500 1 10 2/5 40 30/30 100 V8 ! 50/200 1 25 4/5 80 8/8 100 V9 ! 1/5 1 20 1/1 100 V10 ! í/ioo 1 3/20 15 12/12 100

Azuis/Totais = número de placas azuis/número total de placas % = percentagem de placas azuis

Numa fotografia de microscopia electrónica de um corte de células QT35 infectadas pelo vírus recombinante V8, são claramente visíveis estruturas típicas de vírus Pox, em particular a estrutura interna que tem a forma de um osso de cão. -31 -

Exemplo 11 - Produção de uma grande quantidade de cada recombinante

Os seis recombinantes foram amplificados por três passagens sucessivas em frascos. O título da segunda passagem varia de 4xl05 a Ι,ΙχΙΟ7 TCID50 (Dose infecciosa em cultura de tecidos) por ml. Apenas VI0 tem um título inferior a 104. Os outros recombinantes multiplicam-se tão bem quanto o víms selvagem para o qual os títulos se situam geralmente entre 105 e 107.

Exemplo 12 - Análise por "ensaio de placas" da estabilidade do gene LacZ inserido em TIR O gene LacZ inserido no genoma virai pode ser estável ou não, em função do tipo de recombinação que teve lugar (este está explicitado por Shuman et ai, 1989). Assim, se houver duas recombinações, de um lado e outro da inserção, o gene LacZ inserido é estável. Pelo contrário, uma recombinação simples implica a inserção do plasmídeo de transferência completo, e portanto de LacZ. Este víms dá placas azuis. Mas o genoma virai é portador de sequências homólogas na orientação directa e portanto a recombinação pode levar à perda do inserto e ao aparecimento de placas não azuis.

Por outro lado, nos Pox, uma alteração na sequência de uma TIR pode ser transferida para outra TIR no decurso dos ciclos de infecção e de replicação do víms. Uma dupla recombinação pode inserir LacZ em TIR-L, a placa deste víms surge azul. No decurso das infecções seguintes, uma combinação entre esta TIR-L recombinante e uma TIR-R selvagem dá origem a uma população mista de víms TIR-L/LacZ, TIR-L/LacZ-TIR-R/LacZ e WT (selvagem). De forma idêntica outras recombinações podem gerar o último tipo possível que é TIR-R/LacZ. Por consequência, uma placa azul pode onter três -32- tipos de vírus: vírus que perderam o gene LacZ, vírus que possuem uma única cópia do gene LacZ e vírus que possuem duas cópias do gene LacZ.

Testa-se a homogeneidade de uma preparação virai por um "ensaio de placas" após algumas infecções sucessivas em meio líquido (exemplo 9). Os "ensaios de placas" das 3as passagens dos vírus V3, V4, V5, V8, V9 e V10 fizeram aparecer as seguintes proporções de azuis: i Vírus -! í P3: Azuis/totais % P6: Azuis/totais % ! V3 1 ! 60/70 I 85 - ! V4 ! 80/90 I 88 70/80 88 ! V5 ! 95/100 I 95 - ! V8 ! 50/50 I 100 40/40 100 ! V9 ! 70/70 I 100 - ! vio ! 3/10 30 - P3eP6 = 3a e 6a passagem do vírus.

Azuis/totais = número de placas azuis/número total de placas. % = percentagem de placas azuis. = não realizado.

Concluindo, as preparações de vírus recombinantes V8 e V9 são homogéneos. O recombinante V8 é estável até à 6a passagem. Pelo contrário, as preparações V3, V4 e V5 não são homogéneas. Elas possuem uma proporção de 5 a 20% de vírus do tipo selvagem. Esta proporção é mais elevada ainda para V10.

Exemplo 13 - Análise dos genomas de CNP/LacZ por Southern A homogeneidade de uma preparação virai é testada por Southern -33- (Maniatis et al, 1982). Os fragmentos de restrição dos genomas dos vírus recombinantes e dos vírus não recombinantes distinguem-se com base no seu tamanho. O protocolo de preparação do DNA virai é o seguinte:

No dia J = 1: inocula-se um frasco de 25 cm2 contendo 5 ml de meio de crescimento com 2 x 106 células QT35.

No dia J = 2: infecta-se com uma multiplicidade de infecção de 0,01.

No dia J = 5: destacam-se as células com o auxílio de um raspador (Costar). Centrifuga-se 10 minutos a 6000 g. Ao sedimento da centrifugação adiciona-se 500 μΐ de tampão de lise constituído por Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 0,1%, RNAse 0,1 mg/ml, Proteinase K 0,1 mg/ml. Transfere-se as células para um tubo Eppendorf. Em seguida agita-se a suspensão obtida e incuba-se 1 hora a 50°C. Em seguida extrai-se a fase aquosa 3 vezes com fenol/clorofórmio. Precipita-se o DNA com acetato de sódio 0,3M e 2 volumes de etanol a -20°C durante 15 minutos. Centrifuga-se 10 minutos a 18300g. Ressuspende-se o sedimento da centrifugação em 500 μΐ de água. Cerca de 5 μΐ desta suspensão de DNA são suficientes para um Southern.

Para o sítio BI

Os genomas são digeridos com EcoRI. A sonda é o plasmídeo pTIRBlLacP75 digerido com EcoRI. Esta sonda distingue os fragmentos TIR-L e TIR-R recombinantes e parentais. Os fragmentos têm tamanhos de 9,3 e 6,2 Kb para o vírus selvagem, 7,4, 5J, (dupla) e 4,4 para V3, 7,4, 4,9 e 4,4 Kb para V8 e -34- fmalmente, para V9, 10,4, 7,3 e 2j) Kb (dupla). Os vírus V8 e V9 adquiriram duas cópias do gene LacZ, uma em cada TIR, e não contêm o fragmento TIR do tipo parental. Pelo contrário, o vírus V3 possui-o.

Uma vez que se pode clonar uma cópia de LacZ em cada TIR, conclui-se que o sítio de inserção BI não é essencial para o desenvolvimento do vírus e para o seu crescimento em células em cultura. Por outro lado, o gene LacZ tendo um comprimento de aproximadamente 3 Kb, o isolamento destes duplos recombinantes demonstra que se pode inserir 6 Kb por genoma do vírus CNP.

Para o sítio B2

Os Southern mostram a presença de fragmentos recombinantes TIR-L e TIR-R, mas também fragmentos parentais nas preparações de V4, V5 e VI0. Estas três preparações não são portanto homogéneas.

Exemplo 14 - Alternativa para isolar um duplo recombinante no sítio de inserção B1 A evolução das recombinações nas TIR prevê o aparecimento de um duplo recombinante estável na descendência de um vírus portador de uma TIR selvagem e de uma TIR recombinante. Os vírus são novamente isolados de uma placa azul de uma caixa de Petri com um "ensaio de placas" , seja por um novo ensaio de placas, seja em placas de titulação de 96 cavidades. Pode-se analisar o genoma de cada placa por Southern ou por PCR. Foram exploradas estas diferentes possibilidades. O Southern efectuado com o genoma dos vírus de 10 placas azuis diferentes obtidas num "ensaio de placas" da 3a passagem de V3 mostra que, nas 10 placas, uma preparação é homogénea e contem um inserto de LacZ em cada uma das TIR.

Para a titulação em placas, a diluição é tal que tem zero ou uma placa virai por alvéolo. Obtem-se bons resultados infectando uma placa de titulação (200 μΐ por alvéolo, 20 ml por placa) com 50 μΐ da suspensão virai retirada de uma caixa de Petri com um "ensaio de placas" ressuspenso em 1 ml. Uma vez visíveis as placas, os alvéolos onde se encontram são anotados. Após congelação seguido de descongelação, colhe-se 100 μΐ de meio por alvéolo.

Para o PCR, extraiu-se rapidamente o DNA total nas seguintes condições: centrifuga-se 10 minutos a 10000 g, ressuspende-se o sedimento em 200 μΐ de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 0,1%), adiciona-se RNase (0,1 mg/ml) e proteinase K (0,1 mg/ml) e incuba-se a mistura assim obtida durante 1 hora a 50°C. Depois extrai-se a fase aquosa três vezes com fenol/clorofórmio. A partir desta fase aquosa precipita-se o DNA com etanol. Ressuspende-se o sedimento obtido em 50 μΐ de água. Utiliza-se 10 μΐ desta suspensão para PCR. As condições de PCR usadas são as recomendadas pela Perkin Elmer (GeneAmp DNA Amplification Reagente kit). Os fragmentos amplificados foram analisados em gel de agarose.

As escorvas 5168 e 5169 hibridam de um lado e de outro da inserção Bl, respectivamente a jusante e a montante do sítio. A sua sequência é a

seguinte: Número Sequência de 5' para 3' Complementar de 5169 5 ' CCTTTACTGTTAGTTCTACAATCGAAATTATGC 3' FPV 5168 5 1 CATGTAGATTTTAATCCGTTAACACGCGCAG 3' FPV 3254 5' GCCGGAAAACCTACCGGATTGATGG 3' LacZ -36-

Amplificou-se um fragmento de 220 pb das TIR selvagens e um fragmento de mais de 3 Kb da TIR recombinante contendo o gene LacZ. Para por em evidência o gene LacZ, uma segunda amplificação utiliza a escorva 5168 situada a jusante do sítio BI e a escorva 3254 situada no gene LacZ. Amplificou-se um fragmento de 674 pb. Esta escolha criteriosa das escorvas permite assim distinguir as TIR recombinantes e as TIR não recombinantes. Uma suspensão virai é considerada duplo recombinante homogéneo se o fragmento WT (selvagem) não é amplificado. Os controlos são o genoma do vírus WT, os plasmídeos pTIRBl e pTIRBILac.

Escorvas Fragmento selvagem Fragmento recombinante 5169 + 5168 220 pb 3 Kb 3254 + 5168_--_674 pb_ — = sem fragmento amplificado.

Exemplo 15 - Expressão do gene LacZ em cultura de tecidos pelos vírus recombinantes CNP/LacZ A actividade de β-galactosidase (β-gal) foi medida usando o-nitrofenil^-D-galactopiranósido (ONPG) como substrato. A enzima converte ONPG em galactose e o-nitrofenol de cor amarela cuja quantidade é medida por absorção a 420 nm. Esta absorção foi convertida em unidades de β-gal com a ajuda de uma curva de calibração de acordo com a regra de "1 unidade β-gal = 1 pmole de ONP produzido/3 x 106 células/60 minutos de incubação dos extractos a 28°C".

Este ensaio "β-gal" é realizado como se segue, para um frasco de 25 cm2 de superfície. Nos Pox, pode-se distinguir as fases precoce e tardia da infecção. A fase precoce é a mais curta; dura cerca de 6 horas. Ela termina quando se dá a replicação do genoma. A fase tardia começa com a replicação e termina no fim do ciclo infeccioso com a libertação de partículas virais, ou seja três dias mais tarde. Para ter uma expressão suficiente de LacZ no decurso da fase precoce, prolonga-se artificialmente a fase precoce com citosina β-D arabinofuranósido (AraC) que é um inibidor da replicação. a. Células

No dia J = 1, por frasco, semeia-se 3 x 106 células QT35 em 5 ml de meio de crescimento.

No dia J = 2: infecta-se com uma multiplicidade de infecção de 3 vírus por célula. Incuba-se 1 hora a 38°C. Em seguida retira-se o inoculo virai com a ajuda de uma pipeta. Depois adiciona-se, por frasco, 5 ml de meio de manutenção suplementado ou não com AraC (Sigma) a 40 μg/ml. Incuba-se as culturas 16 horas a 38°C. b. Colheita no dia J = 3.

Raspa-se as células do frasco.

Centrifuga-se a cultura 10 minutos a 6000 g. Ressuspende-se o sedimento da centrifugação em 500 μΐ de PBS, mistura-se esta suspensão e transfere-se para um tubo Eppendorf de 1,4 ml.

Em seguida lisa-se as células pela adição de 50 μΐ de CHC13 e 5 μΐ de SDS a 10%. Mistura-se a suspensão de células rapidamente. Depois centrifuga-se esta suspensão 5 minutos a 9000 g. c. Reaccão enzimática O substrato ONPG para 25 amostras foi preparado como se segue: 27,7 mg ONPG (Sigma) e 50 ml de diluente constituido por 1 ml de MgS04 0,1M e 1 ml de 2-mercaptoetanol (Merck) num volume final de 100 ml de tampão (90 ml NaHP04 0,1M, pH 7,0, MgS04 0,1M, mercaptoetanol 1 ml).

Mistura-se 1,95 ml da solução de ONPG e 50 μΐ da suspensão de células, que se incuba 1 hora a 28°C. Em seguida adiciona-se a esta suspensão 2 ml de Na2C03 e mede-se a absorvância desta suspensão a 420 nm. A comparação da actividade β-gal para os vírus recombinantes está apresentada a baixo em unidades β-gal. Vírus Precoce (AraC) Precoce + Tardio (-AraC) Abs u β-gal Abs u β-gal wt 0 0 0 0 V3 0,28 57 0,58 120 V4 0,34 71 0,58 120 V5 0,26 52 0,49 101 V8 0,05 10 0,65(1:5) 670 V9 0,05 10 0,31 (1:10) 640 wt = tipo selvagem, não recombinante

Precoce (AraC) = fase de crescimento precoce prolongada artificialmente durante 16 horas por AraC. Imediato + Tardio (-AraC) = fases precoce e tardia naturais, sem AraC. Abs = absorvância. u β-gal = unidade de β-galactosidase medida. 1:5 e 1:10 = diluições dos extractos 5 e 190 vezes. -39- O promotor P7,5 de Vaccinia funciona nas fases precoce e tardia da infecção (V3, V4 e V5); o promotor PI 1 tem apenas uma actividade tardia (V8 e V9); o promotor Pll é mais forte que o promotor P7,5, como em Vaccinia. A regulação temporal assim como a força relativa dos dois promotores são portanto conservados no vírus CNP, quer a inserção seja em BI ou em B2 e qualquer que seja a orientação de LacZ.

Exemplo 16 - Vacinação de pintainhos com o vírus recombinante CNP/LacZ. Protecção contra a varíola aviária. Resposta imunitária contra a β-gal.

Testou-se o poder vacinante dos recombinantes CNP/LacZ. Os dois critérios considerados são a protecção contra a varíola aviária e a resposta imunológica contra a β-galactosidase. a. Administração por perfuração alar

Uma suspensão de vírus recombinantes V4, V8 ou uma suspensão da estirpe CNP vacinai foram injectados em pintainhos com um dia de idade, desprovidos de agentes patogénicos específicos (SPF), por perfuração da membrana alar (método referido como"wing web").

Os testes foram efectuados com três grupos de 28 a 30 pintainhos, vacinados com V4 ou com V8 ou com CNP, e com um grupo de 15 pintainhos não vacinados como testemunha negativa.

Cada um dos pintainhos vacinados recebeu 10 μΐ de uma suspensão a 5x105 TCID50 (Tissue Çulture Infectious Dose, dose infecciosa em cultura de tecidos)/ml de vírus, equivalente a 5xl03 TCID50 por ave. Aos 29 dias, os pintainhos foram postos em contacto com o vírus virulento (estirpe Fowlpox Challenge Virus adquirido a Aphis, USA). A ausência de lesões avaliada dez dias mais tarde mostra uma protecção de todos os pintainhos vacinados contra a varíola aviária. Pelo contrário, os pintainhos não vacinados apresentam lesões. A análise dos títulos em anticorpos contra a β-galactosidase por um ELISA directo mostrou que 21 dos 29 (72%) pintainhos vacinados com o vírus V4 e 20 dos 28 (71%) pintainhos vacinados com o vírus V8 apresentam uma seroconversão, ou seja são seropositivos. O título de ELISA é a última diluição que dá uma densidade óptica superior a 100, o título de ELISA médio anti-β galactosidase nos soros destes pintainhos foi de 1:800. b. Administração por via intramuscular e subcutânea

Os pintainhos com um dia foram vacinados no primeiro dia com 104·4 TCID50 de vírus V8 por via intramuscular (IM, 27 pintainhos) ou subcutânea (SC, 34 pintainhos). Foram observados 27 dias mais tarde. Encontrou-se que estavam protegidos contra a varíola aviária (100%). A seroconversão contra a β-galactosidase foi observada em 24 dos 27 (88%) dos pintainhos vacinados IM e em 27 dos 34 (79%) dos pintainhos vacinados SC).

Em conclusão, os resultados de imunização mostram: - que os vírus recombinantes que contêm o gene LacZ nas regiões TIR do seu genoma, no sítio BI ou B2, conservaram o seu poder imunogénico; - que os promotores P7.5 e PI 1 funcionam no animal; - que uma resposta de anticorpos é induzida contra a β-galactosidase, considerada -41 - aqui como uma proteína heteróloga expressa pelo recombinante CNP. - que as vias intramuscular (IM), subcutânea (SC) e por perfuração da membrana alar (WW) são equivalentes, tanto em termos de protecção contra a varíola aviária como relativamente à percentagem de seroconversão contra a β-galactosidase.

Exemplo 17 - Inserção de genes que codificam a glicoproteína E2 do vírus da bronquite aviária em vectores de transferência O vírus responsável pela bronquite infecciosa aviária (IBV) é um coronavírus. O antigénio de superfície mais importante deste vírus é a proteína E2, composta por duas subunidades SI e S2 (cavanagh, 1983, Cavanagh et al, 1988). Existem numerosos serotipos, nomeadamente o Massachutts, designado M41 e os serotipos holandeses, designadamente D1466 e D274 (Kusters et al, 1987).

Desenvolvemos uma vacina recombinante CNP que expressa a proteína E2 de um IBV para obter uma vacina eficaz contra o vírus responsável pela bronquite infecciosa aviária (IBV). O gene da proteína E2 do serotipo M41 foi obtido do Dr. Kusters da Université de Utrcht (NL), assim como grandes fragmentos dos genes E2 dos serotipos D1466, D207 e D274.

Uma cassete BamHl do gene E2 de M41 foi construída por mutagénese dirigida. O gene completo da estirpe D1466 e um gene completo híbrido D207/D274 foram construídos a partir de fragmentos, igualmente em cassetes compatíveis com BamHl. Estas três cassetes foram clonadas a jusante do promotor P7.5, gerando os três plasmídeos p75M41, p75D1466 e p75D207. -42-

As cassetes P7.5-E2 foram clonadas no sítio BamHl do vector de transferência pTIRBl, depois a casste PI ILac foi clonada a juante de E2, no sítio BamHl. Estes plasmídeos de transferência são pTIRBlP75M41Lac, pTIRBlP75D1466Lac e pTIRBlP75D207Lac. Os vírus recombinantes foram construídos por transformação e purificados como descrito nos exemplos 9, 10 e 11. Os genomas foram analisados por transferência Southern como descrito no exemplo 13. A expressão do antigénio E2 foi posta em evidência por técnicas imunológicas tais como ELISA, Western ou imunofluorescência com a ajuda de anticorpos específicos. Produziu-se um lote de vírus recombinante. A criação foi vacinada com uma dose destes recombinantes. A eficácia da vacina fói avaliada após uma infecção experimental com vírus patogénicos, de acordo com os métodos clássicos para a bronquite infecciosa, e por avaliação da taxa de anticorpos contra o vírus.

Exemplo 18 - Inserção de um gene de Eimeria em plasmídeos de transferência - Construção de recombinantes CNP/TA4 O género Eimeria compreende parasitas da criação responsáveis pela coccidiose. Foram descritos antigénios de superfície, em particular para as espécies E. tenella. E. necatrix. E. maxima (pedido de patente europeia 0 164 176 e 0 231 537).

Desenvolvemos uma vacina recombinante eficaz contra a coccidiose. O antigénio de E. tenella. designado TA4 ou A4, é uma proteína de 25 Kd, composta por duas subunidades de 17 Kd e 8 Kd ligadas por uma ponte dissulfureto. O gene foi isolado a partir de um banco genómico e igualmente a -43- partir de mRNA. A descrição completa do gene foi publicada nos pedidos de patente referidos.

Uma cassete BamHl do gene TA4 foi construída por suBclonagem. O plasmídeo pTA406 contem a sequência codifícante de TA4. O plasmídeo pTA410 é portador do gene TA4 com uma modificação na sequência proteolítica que separa as duas subunidades.Por mutagénese dirigida, a sequência nativa Arg-Arg-Leu foi substituída pela sequência Arg-Glu-Lis-Arg (descrita por Kieny et al., 1988). Estas duas cassetes BamHl foram igualmente clonadas a jusante do promotor P7.5 do plasmídeo plP7.5, na orientação que coloca o gene TA4 sob o controlo de P7.5.

As cassetes P7.5-TA406 eP7.5-TA410 foram clonadas no sítio BamHl do vector de transferência pTIRBID. Em seguida a cassete PI 1-Lac foi clonada no sítio BamHl. a jusante do gene TA4. Os plasmídeos de transferência são pTIRTA406Lac e pTIRTA410Lac.

Os vírus recombinantes foram obtidos por transferência como descrito nos exemplos 9, 10 e 11. Obtiveram-se placas azuis. O recombinante portador do gene TA406 é o V20; o recombinante portador do gene TA410 é o V21.

Um vírus V21 duplo recombinante, ou seja portador de uma cópia de TA410 e do gene LacZ em cada uma das TIR, foi purificado num ensaio de titulação por placas e o seu genoma analisado por PCR, como descrito no exemplo 14. As escorvas utilizadas e o tamanho dos fragmentos amplificados estão apresentados na tabela abaixo. A escorva 1871 écomplementar do gene LacZ. -44- -44- Escorvas

Fragmentos selvagens Fragmentos recombinantes 5169 + 5168 220 pb 4,0 Kb 5169 + 1871 - 1,2 Kb A expressão do antigénio TA4 foi posta em evidência pelas técnicas imunológicas de ELISA, Western ou imunofluorescência com a ajuda de anticorpos específicos.

Produziu-se um lote de vírus recombinantes. A criação foi vacinada com uma dose destes recombinantes. A eficácia da vacina foi avaliada após uma infecção experimental ("challenge") por Eimeria virulenta segundo os métodos clássicos para a coccidiose, ou seja por análise dos soros, velocidade de aumento de peso e sinais clínicos.

Exemplo 19 - Inserção do gene da poliproteína de Gumboro nos vectores de transferência O agente responsável pela doença de Gumboro é um vírus da família dos Bimaviridae. O vírus, designado IBDV (Infectious Bursal Disease Virus) provoca uma doença contagiosa grave (doença de Gumboro) que afecta os frangos e se caracteriza pela destruição das células linfóides da bursa de Fabricius. O vírus possui um genoma constituído por 2 segmentos de RNA de cadeia dupla, designadas segmento A (cerca de 3400 pares de bases) e segmento B (cerca de 2900 pb). As partículas virais não possuem invólucro e têm forma forma icosaédrica de aproximadamente 60 nanómetros de diâmetro. Identificaram-se claramente quatro proteínas virais: VP1, com um peso molecular (PM) de 90 KD (K: kilodalton); VP2, PM de 37 K a 40 K; VP3, PM de 32 K a 35 K e VP4, PM de 24 K a 29 K (Dobos 1979; Fahey et al., 1985). VP2 deriva de -45- um precursor VPX com um PM de 41K a 54 K. O segmento B codifica VP1 que é provavelmente a polimerase virai. O segmento A codifica as outras 3 proteínas. Estas são geradas por clivagem proteolítica a partir de um precursor com um PM de aproximadamente 110 K correspondendo a uma grelha de leitura aberta grande do segmento A. A proteína VP4 está implicada na clivagem proteolítica (Jagadish et al. 1988). As proteínas VP2 e VP3 constituem a cápside virai. VP2 contem os determinantes antigénicos capazes de induzir a síntese de anticorpos que neutralisam o vírus (Becht et al., 1988; Fahey et al., 1989).

Desenvolvemos uma vacina recombinante Fowlpox contra a doença de Gumboro.

As etapas deste desenvolvimento são as seguintes: 1. Isolamento do material genético da estirpe IBDV escolhida, ou seja a estirpe EDGAR. A estirpe de vírus EDGAR pode ser adquirida no departamento de agricultura dos Estados Unidos (USDA, APHIS 6505 Belcrest Road, Hyattsville, MD 20782, Estados Unidos). 2. A síntese, clonagem e determinação da sequência nucleotídica do cDNA correspondendo ao segmento A. 3. Inserção do cDNA assim como das sequências necessárias à expressão deste material genético nas células animais infectadas pelo Fowlpox e sequências que permitem a identificação dos vírus Fowlpox recombinantes, no plasmídeo de transferência pTIBBl descrito no exemplo 4. 4. Isolamento e purificação dos vírus recombinantes. -46- 5. Análise genética dos vírus recombinantes. 6. Análise da expressão in vitro, em culturas celulares, dos genes de IBDV inseridos nestes vírus recombinantes. 7. A vacinação dos pintainhos com os vírus recombinantes e análise da protecção contra a doença de Gumboro.

Passo 1 O RNA virai da estirpe EDGAR foi isolado a partir de bursas de galinhas infectadas pelo vírus.

Cerca de 40 g de bursas, colhidas 7 dias após infecção pelo vírus, são trituradas em 40 ml de tampão TNE: TRIS-HC1 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). O material triturado foi centrifugado a 17000 g e a fase aquosa obtida foi depositada num gradiente de sacarose pré-formado constituído por 2 almofadas, 40% e 60% de sucrose (% em peso/volume, no tampão TNE). O gradiente foi centrifugado a 134000 g durante 2 horas e 30 minutos. A interfase entre 40% e 60% do gradiente de sacarose foi colhida e contem o vírus parcialmente purificado. 5 ml desta fase foi adicionado a 5 ml de tampão contendo TRIS-HC1 10 mM, NaCl 100 mM, SDS 0,5%, EDTA 10 mM, Proteinase K 2 mg/ml, pH 7,5. A mistura foi incubada 1 hora a 37°C. A fase aquosa foi em seguida extraída com fenol/clorofórmio. Os ácidos nucleicos da fase aquosa foram precipitados com etanol na presença de LiCl 0,8M e ressuspensos em 500 μΐ de água. -47-

Passo 2 A síntese e amplificação do cDNA correspondente ao segmento A foi realizada seguindo o método descrito em "GENEAMP RNA PCR KIT, PERKIN ELMER CETUS" e com a ajuda de oligonucleótidos sintéticos ou "escorvas", complementares da sequência do segmento A, como iniciadores da síntese da primeira cadeia de DNA pela transcriptase reversa. A escolha destes oligonucleótidos sintéticos foi definida por análise das sequências publicadas para os segmentos A de outras estirpes de IBDV: a estirpe Australiana 002-73 (Hudson et ah, 1986), a estirpe alemã CU-1 (Spies et al., 1989) e a estirpe britânica 52/70 (Bayliss et ah, 1990). A sequência das escorvas e a sua posição relativamente ao segmento A da estirpe EDGAR estão apresentadas nas figuras 8 e 9. A análise das sequências publicadas para as estirpes de IBDV indicam que para além de uma grande grelha de leitura aberta, ORF1, codificadora das proteínas VP2, VP4, VP3, existem duas outras grelhas de leitura abertas na mesma cadeia codificante do segmento A. Uma, a ORF2, iniciada 34 pb a montante do ATG da ORF1 sobrepõe-se a esta última numa extensão de 435 pb. A outra, ORF3, inicia-se 32 pb a montante da ORF2 e tem um comprimento de 31 pb. O papel eventual destas ORFs na biologia do vírus não está ainda definido.

Produziram-se quatro fragmentos de cDNA de cadeia dupla, delimitados respectivamente pelos pares de escorvas ("primers"), 0-lb (585 pb, 1-2 (1129 pb), 3-4 (670 pb), 5-6 (1301 pb) e cobrindo as ORF1 e ORF2 do segmento A (ver figura 8).

Estes fragmentos foram clonados nos plasmídeos pBSPlus ou -48- pBSLKl; seis plasmídeos foram assim construídos (ver figuras 8 e 10).

Nome do plasmídeo tamanho (Pb) Esquema de construção pBSIBDVO 3478 pBSPlus (Pstl + Hinc2) + fragmento Pstl de 277 pb do fragmento 0-lb pBSlA2 3932 pBSLKl (Pstl + DNA polimerase de T4, Saci) + fragmento Saci de 760 pb do fragmento 1-2 pBSIB 3538 pBSLKl (Pstl + DNA polimerase de T4, Saci) + fragmento Saci de 369 pb do fragmento 1-2 pEDGAR34 i 3887 pBSLKl (Pstl + DNA polimerase de T4, Hinc2) + fragmento 3-4 de 670 pb pBS3A 4175 pBSLKl (Pstl + DNA polimerase de T4, Sphl) + fragmento Sphl de 956 pb do fragmento 5-6 pBS3B 3509 pBSLKl (Pstl + DNA polimerase de T4, Sphl) + fragmento Sphl de 345 pb do fragmento 5-6

As sequências nucleotí dicas dos fragmentos IBDV destes plasmídeos foram determinadas e alinhadas de maneira a reconstituir a sequência do segmento A da estirpe EDGAR amplificada por PCR (ver figura 9). As sequências originais da estirpe EDGAR, que foram substituídas pela utilização de "escorvas" definidas com base nas sequências publicadas para outras estirpes de IBDV, foram igualmente determinadas a partir de produtos de amplificação destas regiões com a ajuda de escorvas situados no exterior destas. A reconstrução do segmento A, a partir dos clones obtidos, está esquematizado na figura 10. -49-

Os passos são os seguintes: 1. Construção de pEDGAR12: pBSl A2 (EçoRl + DNA polimerase de T4, Saci) + pBSIB (Sphl + DNA polimerase de T4, Saci) 2. Construção de pEDGARM12 por mutagénese dirigida de pEDGAR12: a. deleção do sítio Sphl de pEDGAR12 situado a montante da sequência de IBDV:

Sphl

Sequência original 51 gtctgatctctacgcatgcaagcttttgttccctttagtgaggg 3 · Escorva de mutagénese 5' gtctgatctctacggttccctttagtgaggg 31 b. deleção do sítio EçoRl de pEDGAR12 e introdução de um sítio Sphl, a jusante da sequência IBDV;

Sequência original: EçoRl 5' CGACTCACTATAGGGCGAATTCCCCCCAGCGACCGTAACGACTG 3'

IBDV

Escorva de mutagénese:

Sphl 5' CGACTCACTATAGGGCGGATCCCGCATGCCCCAGCGACCGTAACGACTG 31

IBDV 3. Construção de pACEDGARM12:

Inserção do fragmento Bcll-Sphl de pEDGARM12 nos sítios Bdl-Sphl depACYC184 4. Construção de pEDGARM34i por mutagénese dirigida de pEDGAR34i:

Substituição do sítio Sphl por um sítio Nsil;

Sequência original: 51 gctcgaagttgctcaggcatgcaagcttttg3 1 IBDV -»

Escorva de mutagénese: 51 gctcgaagttgctcatgcatgcaagctttt3 1 IBDV -» 5. Construção de pEDGAR45: pBS3A (Hinc2 + Pstl) + fragmento Hinc2-Pstl de pEDGAR34i 6. Construção de pACEDGAR14: pACEDGARM12 (Sphl + DNA polimerase T4, BamHl) + pEDGARM34i (Nsil + DNA polimerase, BamHl) 7. Construção de pACEDGAR15: pACEDGAR14 (BamHl + DNA polimerase de T4, Sall) + pEDGAR45 (Pvu2-Sall) 8. Construção de pACEDGARl: pACEDGAR15 (Sphl + EçoRV) + pBS3B (Sphl + Pvu2).

Este plasmídeo contem a sequência completa da ORF1 do segmentos A num fragmento Bcll-BamHl. 9. Construção de pBSIBDVOb por mutagénese dirigida de PBSIBDVO:

Introdução da ORF3 em pBSIBDVO, o qual possui o início das ORF1 e ORF2;

Sequência original: pBSplus -> --ORF2—> 5' CCCGGGGATCCTCTAGAGTCCCTCCTTCTACAACGTGATCATTGATGC3'

Bell

Escorva de mutagénese: --ORF2—> pBSplus -> -----------------0RF3--------------» 5' CCCGGGGATCCTCTAGAGTCTGATCAGGATGGAACTCCTCCTCCTTCTACAACGCTATCATTGATGG 3'

Bell 10. Construção de pACEDGAR2 e pACEDGAR3:

Os plasmídeos pACEDGAR2 e pACEDGAR3 foram obtidos por troca da região Bcll-Rsr2 do plasmídeo pACEDGARl pelo fragmento Bcll-Rsr2. respectivamente, dos plasmídeos pBSIBDVO e pBSIBDVOb.

Os 3 plasmídeos pACEDGARl, pACEDGAR2 e pACEDGAR3 permitem portanto isolar num fragmento Bcl 1 -BamH 1, respectivamente. a 0RF1, as 0RF1-0RF2 e as ORF1-ORF2-ORF3 do segmento A da estirpe EDGAR.

As sequências destes 3 plasmídeos, do lado do ATG das ORFs estão representados a seguir:

Bell pACEDGARl: 5' TGATCACAGCGATGACA ... 3' ---ORF1---->

Bell pACEDGAR2: 5' TGATCATTGATGGTTAGTAGAGATCAGACAAACGATCGCAGCGATGACA ... 3' -------------------0RF2-----------------------> --ORF1----->

Bell pACEDGAR3: 5'TGATCAGGATGGAACTCCTCCTTCTACAACGCTATCATTGATGGTTAGT ... 3' --------------0RF3----------------> ----0RF2------>

Passo 3

Estes fragmentos Bell-BamH 1 foram em seguida clonados no sítio BamHl do plasmídeo p2P75, gerando os plasmídeos p75EDGARl, p75EDGAR2 e p75EDGAR3, e colocando as sequências codificantes do segmento A sob o controlo do promotor P7.5. Estas sequências codificantes foram igualmente colocadas sob o controlo do promotor Pll. O fragmento Bell-BamHl do plasmídeo pACPll e portanto o promotor Pll foi inserido no sítio BamHl dos plasmídeos pACEDGARl, pACEDGAR2 e pACEDGAR3 para gerar, respectivamente, os plasmídeos pl 1EDGAR1, pl 1EDGAR2 e pl 1EDGAR3.

Cassetes Bcll-BamHl P75-EDGAR ou Pll-EDGAR foram -53- isoladas a partir destes diferentes plasmídeos e inseridas no sítio BamHl do plasmídeo pTIRBl produzindo os plasmídeos pTIR75EDGARl, pTIR75EDGAR2, pTIR75EDGAR3, pTIRllEDGARl, pTIRll EDGAR 1, pTIRl 1EDGAR2 e pTIRl 1EDGAR3. A orientação das cassetes Bell-BamHl no plasmídeo pTIRBl que foi conservada é tal que o sentido da transcrição iniciada a partir dos promotores P7.5 e PI 1 coincide com a das ORF1 e ORF2 presentes no plasmídeo pTIRBl. O fragmento Bgll-BamHl do plasmídeo pACPl 1LAC, portador da cassete Pll-LACZ, foi inserido no sítio BamHl dos plasmídeos pTIR75EDGARl e pTIR75EDGAR2 para gerar, respectivamente, os plasmídeos pTIR75ElLAC e pTIR75E2LAC. A orientação de Pll-LACZ nestes plasmídeos é tal que o sentido da transcrição do gene LACZ coincide com a das ORF1 e ORF2.

De forma análoga, os plasmídeos pTIRl 1E1LAC, pTIRl 1E2LAC e pTIRllE3LAC foram gerados por inserção, no sítio BamHl. respectivamente dos plasmídeos pTIRl EDGAR 1, pTIRllEDGAR2 e pTIRllEDGAR3, da cassete P75-LACZ isolada sob a forma de um fragmento Bgl2-BamHl do plasmídeo p75LAC.

Finalmente o plasmídeo pTIRl 1VP2LAC foi gerado inserindo nos sítios PpuMl (tratado com DNA polimerase de T4) e Bgl2 do plasmídeo pTIRl 1E1LAC o fragmento Xhol (tratado com DNA polimerase de T4)-Bgl2 do plasmídeo pl 1EDGAR1. O plasmídeo de transferência pTIRl 1VP2LAC contem, sob o controlo do promotor Pll, a sequência completa da proteína VP2 assim como a parte amino-terminal da proteína vP4; na construção, são fundidas, em fase, os três últimos aminoácidos (Asp, Leu, Glu; parte carboxi-terminal de VP3) e o codão de terminação da tradução (TGA) da poliproteína. Relativamente à -54-

figura 9, esta proteína heteróloga corresponde assim a uma parte da poliproteína compreendendo os aminoácidos 1 a 493 seguido dos aminoácidos 1010 a 1012, no qual está incluída a proteína VP2.

Como exemplo, o plasmídeo pTIR75ElLAC está representado na figura 11.

Passo 4 e Passo 5

Os vírus recombinantes do Fowlpox nos quais foram integradas as ORFs da estirpe EDGAR foram isolados, purificados e caracterizados de acordo com os métodos descritos nos exemplos 9, 10, 11, 12, 13 e 14. A notação dos vírus recombinantes é: VI1 = P7.5E1 V12 = P7.5E2 V14 = P11E1 V15 = P11E2 V17 = P11VP2 V16 = P11E3

As escorvas utilizadas para a selecção das TIRs duplas recombinantes em PCR distingue as TIR WT, as TIR contendo LacZ, El, E2, E3 ou VP2. As combinações de escorvas e o tamanho dos fragmentos amplificados estão na tabela abaixo.

As escorvas IBDV16, 3, lb e 22 hibridam com IBDV. As escorvas IBDV16, lb e 3 hibridam com a parte codificante de VP2. A escorva IBDV22 híbrida com a parte codificante de VP3, e portanto com o genoma do VI7. As escorvas 5168 e 5169 hibridam com o FPV. A escorva 1871 híbrida com o gene da β-galactosidase. A sequência destas escorvas está definida na tabela "Lista e sequências das escorvas".

Escorvas Vírus

Fragmentos £nt]_ 5169 + 5168 WT 220 recombinantes 6,0 Kb 5169+ 1871 V8 310 recombinantes 3,6 Kb 5169 + IBDV16 VI1 341 V14, V17 339 V12 373 V15 371 V16 402 5169 + IBDVlb V17 766 IBDV22+ 1871 Vil, V12 379 V14, V15, V16 479 V17 — IBDV3 + 1871 V14, V15, V16 2280 V17 732

Passo 6

Comparou-se a expressão dos antigénios IBDV dos vírus recombinantes nas células QT35.

Os anticorpos utilizados, dirigidos contra a estirpe de IBDV Cu-1, foi gentilmente cedidos pelo Professor H. Muller, Institut fur virologie, Justus-Liebig-Universitat, Giessen, Allemagne.

Estes são: Io um soro policlonal (N° B22) de coelho hiper-imunizado contra a estirpe Cu-1 -56- 2o um anticorpo monoclonal de ratinho anti-VP3 (N° I/A10) que reconhece a proteína VP3 sob a forma nativa e desnaturada 3o um anticorpo monoclonal de ratinho anti-VP2 (N° Bl) reconhece um epitopo conformacional da proteína VP2; o anticorpo BI é um anticorpo capaz de neutralizar a estirpe virai Cu-1. a. Condições experimentais da infeccão

No dia J = 1, por frasco de 25 cm2, inocula-se 2,5 10® células QT35 em 5 ml de meio de crescimento (composição descrita no exemplo 1). Prepara-se oito frascos.

No dia J = 2, infecta-se as células com uma multiplicidade de infecção de 0,01 vírus por célula para cada um dos vírus recombinantes, VI1, V12, V14, V15, V16, V17, V8 (controlo negativo) e IBDV (estirpe Bursine 2, controlo positivo).

No dia J = 5, colhe-se as células infectadas e o meio após um congelação seguido de descongelação. b. Análise dos produtos de expressão por ELISA do tipo sanduíche O teste ELISA foi realizado usando como primeiro anticorpo o anticorpo policlonal B22 e como segundo anticorpo o monoclonal anti-VP3 (N° I/A10) ou o anticorpo monoclonal neutralizante anti-VP2 (N° Bl). As curvas de ELISA estão apresentadas nas figuras 12A, para o anti-VP3, e 12B, para o anti-VP2. os resultados destas análises mostram que: -57- 1 - Figura 12A: a proteína VP3 é expressa em todos os recombinantes (VI1, V12, V14, VI5 e V16) que contem pelo menos a sequência codificante das poliproteína (ORF1, proteínas VP2, VP4-VP3), mas não no recombinante VI7, uma vez que ele apenas possui a região codificante para VP2 e a parte amino-terminal de VP4, nem o recombinante V8, uma vez que ele não contem qualquer sequência IBDV. O nível de expressão da proteína VP3 é mais fraco nos recombinantes Vil eV12do que nos recombinantes VI4, VI5 e VI6, o que está provavelmente relacionado com a força dos promotores presentes nos diferentes recombinantes: a actividade do promotor p7.5 (recombinantes VI1 e VI2) sendo menos forte que a do promotor pll (recombinantes VI4, VI5, VI6) (ver exemplo 15). Não se observa diferença ao nível da expressão de VP3 em função das grelhas de leitura do segmento A introduzidas nos diferentes recombinantes: ORF1 para os recombinantes VI1 e VI4, ORF1 + ORF2 para os recombinantes V12 e VI5 e ORF1 + ORF2 + ORF3 para o recombinante VI6. 2 - Figura 12B: a proteína VP2 é expressa em todos os recombinantes com excepção de V8 que não contem sequências de IBDV. O nível de expressão mais elevado é o do recombinante VI7; neste caso, aproxima-se do da proteína VP2 expressa nas células infectadas pelo vírus IBDV.

Observa-se novamente uma correlação entre a força dos promotores presentes nos diferentes recombinantes e o nível de expressão da proteína VP2. -58-

Estes resultados mostram, por um lado, que o epítopo da proteína VP2, reconhecida pelo anticorpo neutralisante BI dirigido contra a estirpe Cu-1, está igualmente presente na proteína VP2 da estirpe americana Edgar, e por outro lado, que a conformação original da proteína VP2 é, em todos os recombinantes, conservada pelo menos nesta região. c. Análise dos produtos de expressão por Western A análise, por Western, das proteínas produzidas pelos diferentes recombinantes foi realizada por um lado, com a ajuda do soro policlonal (B22) que reconhece o conjunto das proteínas IBDV e por outro lado, com a ajuda do anticorpo monoclonal anti-VP3 (I/A10).

Os resultados, ilustrados na figura 13A, mostram que o soro poiclonal reconhece nos extratos de células infectadas pelo IBDV essencialmente 3 proteínas correspondendo a VP2 («40 Kd), VP3 (« 32 Kd) e VP4 (« 28 Kd). Observou-se igualmente uma proteína com cerca de 46 Kd que poderá constituir o precursor (VPX, « 48-49 Kd) de VP2.

Para todos os recombinantes (VI1, VI2, VI4, V15 e VI6) que contêm pelo menos a sequência codificante da poliproteína (ORF1, VP2-VP3-VP4), proteínas com um peso molecular (PM) coincidente respectivamente com VP3, VP4 e provavelmente VPX foram postas emevidência pelo soro policlonal anti-IBDV (Figura 13 A). Para o recombinante V17, foi detectada uma única proteína cujo peso molecular é próximo do da proteína de fusão VP2 + região aminoterminal de VP4 (« 52 Kd). O anticorpo monoclonal anti-VP3 (Figura 13B) reconhece -59- essencialmente duas proteínas, VP3 e provavelmente um produto de degradação de VP3, nas células infectadas pelo IBDV e todos os recombinantes que expressam a poliproteína. Nenhuma proteína de IBDV é reconhecida no recombinante V17 que expressa a proteína de fusão VP2-VP4. O conjunto destes resultados indica que a grelha de leitura codificante da poliproteína (ORF1) é traduzida em todos os recombinantes independentemente da presença das grelhas de leitura adicionais ORF2 (recombinantes VI2, VI5) ou ORF2 e ORF3 (recombinante VI6). A clivagem da poliproteína precursora é feita correctamente mas parece incompleta no que respeita a VP2; foi sugerido que a maturação completa do precursor VPX se realiza quando ou após o transporte das partículas virais IBDV para a superfície das células (Muller et al., 1982).

Passo 7

Teste do poder vacinante dos recombinantes FPV/IBDV. a. Seroconversão por V11

Uma primeira campanha de vacinação por um recombinante FPV/IBDV comparou a seroconversão contra a β-galactosidase e contra o vírus IBDV por três vias de administração diferentes: por via intramuscular (IM), subcutânea (SC) e por perfuração da asa (WW ou "wing web").

Os pintainhos com um dia foram vacinados com IO4·4 vírus recombinantes VI1 pelas três vias de administração IM, SC ou WW. Os pintainhos foram sacrificados 11 dias mais tarde. A análise dos soros por ELISA directa mostrou que 2/14 (14%) dos pintainhos vacinados por via intramuscular, 3/6 (50%) dos pintainhos vacinados por via subcutânea e 8/15 (53%) dos pintainhos vacinados por perfuração da asa têm anticorpos contra a β-galactosidase, enquanto que 5/14 (36%) dos pintainhos vacinados por via intramuscular, 1/6 (17%) dos pintainhos vacinados por via subcutânea e 1/15 (7%) dos pintainhos vacinados por perfuração da asa têm anticorpos contra o vírus IBDV.

Concluindo, as proteínas de IBDV foram expressas pelo recombinante FPV/IBDV11 no animal vacinado e induzem uma resposta de anticorpos nalguns pintainhos. Das três vias de administração, a via intramuscular induz uma resposta superior relativamente às outras duas. b. Proteccão precoce por VI1. VI5 e VI6

Pintainhos com um dia receberam uma dose de 104-4 vírus V8 (controlo negativo), V11,V15 ouV16 por via intramuscular e foram infectados experimentalmente 10 dias mais tarde por 100 LD50 (100 vezes a dose letal) do vírus 849VB administrado por via ocular. A estirpe 849VB está descrita por Van Den Berg et al, 1991.

Os pintainhos foram sacrificados 20 dias mais tarde. A razão, multiplicada por 100, entre o peso da bursa e o peso total é um índice de protecção.

No grupo testemunha vacinado por V8 e não submetido à infecção experimental com IBDV, esta razão foi de 0,57 (média de 10 pintainhos). -61 - t

No grupo V8 submetido à infecção experimental, esta razão passa para 0,11 (9 pintainhos).

Nos pintainhos vacinados por VI1, V15 e VI6, estas razões são respectivamente 0,11 (20 pintainhos), 0,12 (18 pintainhos) e 0,12 (18 pintainhos).

Com base neste critério, não existe protecção precoce contra o vírus IBDV pelos recombinantes Vll,V15eV16. c. Protecção tardia por Vll.V15eV16

Pintainhos vacinados por V8, VI1, V15 e VI6, como descrito anteriormente, foram infectados experimentalmente com IBDV 42 dias após injecção.

Os soros colhidos antes da infecção foram analisados pelo método de ELISA para avaliar a resposta de anticorpos contra a β-galactosidase e contra o vírus IBDV. A resposta anti-β-galactosidase mostra que se obtem 100% da seroconversão em todos os pintainhos vacinados, ou seja num total de 70 pintainhos. Os títulos variam de 1:200 até 1:51200. Não há diferença significativa entre os títulos obtidos para VI1, em que o gene LacZ está sob o controlo de P7.5, e V8, VI5 e VI6, em que os genes LacZ estão sob o controlo do promotor PI 1. A resposta anti-IBDV nos 10 pintainhos vacinados pelo V8 é nula; ela é positiva em todos os pintainhos vacinados com VI1, V15 e V16. Mais detalhadamente, os títulos das respostas nos 20 pintainhos vacinados por VI1 varia de 1:800 até 1:51200, com uma média de 1:6400. São de 1:6400 a 1:102400, com uma média de 1:25600 para os 20 pintainhos vacinados com V15. Estão entre 1:6400 e 1:204800, com uma média de 1:25600 nos 20 pintainhos vacinados com VI6. As taxas de anticorpos são nitidamente mais elevadas para os grupos vacinados com VI5 ou VI6 do que com VI1.

Os títulos de seroneutralização da estirpe vacinai PBG68 adaptada às células em cultura são de 1:10 para VI1, como o controlo negativo; 4 soros em 20 para V15 e 1 soro em 20 para V16 têm títulos de seroneutralização de 1:20. este título é portanto fraco e foi observado apenas nalguns animais. A razão (peso das bursas/peso total) xlOO é em média 0,66 no grupo testemunha V8 e não infectado experimentalmente (10 pintainhos). Passa de 0,1 no grupo V8 infectado experimentalmente (1 sobrevivente). É de 0,1,0,11, 0,11 para os três grupos VI1 (3 pintainhos), VI5 (11 pintainhos) e VI6 (8 pintainhos) respectivamente. Não há protecção contra a atrofia das bursas. A mortalidade nos quatro dias que se seguiram à infecção experimental foi quase total para o grupo testemunha (9 pintainhos em 10). No grupo VI1, 3 pintainhos em 20 sobreviveram, enquanto que 11 pintainhos em 20 vacinados com VI5 8 pintainhos em 20 vacinado com VI6 sobreviveram. Observa-se portanto uma protecção da ordem de 50% dos animais vacinados com V15 ou V16. d. Protecção por VI4. V15eV17

Quatro grupos de galinhas com três semanas de idade receberam 0,2 ml de vírus recombinante V8 (controlo negativo), VI4, VI5 ou VI7. A quantidade de vírus por galinha foi de IO6-4 TCID50. A via de administração é intramuscular. -63 -

Vinte e um dias mais tarde, colheu-se soro de cada animal para avaliar o título em anticorpos anti-IBDV. Injectou-se cem vezes a dose letal de IBDV nos animais dos grupos VI4, V15eV17e uma parte dos animais do grupo V8 (ou seja o grupo de galinhas que recebeu o vírus recombinante V8). 11 dias mais tarde, ou seja 32 dias após a vacinação, os animais testemunha do grupo V8 e os que sobreviveram à infecção foram sacrificados e determinada a razão (peso das bursas/peso das galinhas) xlOO.

Resultados: - Mortalidade: o número de galinhas tendo morrido após infecção reparte-se como se segue:

Para V8: 12 galinhas/14 (85%), para V14: 21/24 (87%), para V15: 17/25 (68%) e para VI7: 0/25 (0%).

Noutros termos, todas as galinhas vacinadas pelo recombinante VI7 resistiram à infecção experimental. Neste grupo, a protecção é total. Por outro lado, nenhuma outra galinha mostrou o mínimo sinal clínico de doença. A protecção de 32% obtida com o recombinante VI5 está próxima da protecção de 50% obtida na experiência anterior. - ELISA: os títulos médios avaliados com o vírus são:

Para V8 títulos inferiores a 1:100 e considerados como negativos; para VI4 t'titulos de 1:12800 (de 1:6400 a 1:51200), para VI5 t'titulos de 1:6400 (de 1:800 a 1:25600), para V17 ftitulos inferiores a 1:100 salvo para 3 galinhas (1:800, 1:6400 e 1:51200). -64-

Assim, a resposta em anticorpos contra o IBDV induzida pela expressão da poliproteína do FPV/IBDV recombinante é muito elevada. A resposta contra o vírus completo induzida por VI7 é pelo contrário fraca. - Seroneutralizacâo: os títulos de seroneutralização contra a estirpe PBG68 são em média: para V8, V14 e VI5 títulos inferiores a 1:10 e considerados como negativos; para VI7, 5 galinhas em 20 têm um títu0,01), para VI4 a razãolo superior a 1:20, ou seja, detalhadamente, de 1:20 (duas vezes), 1:40, 1:80 e 1:320.

Assim, observou-se uma seroneutralização unicamente nos soros das galinhas vacinadas com VI7. - Bursas: a média da razão (pesos das bursas/pesos totais) xlOO apresenta-se como se segue: para V8 não infectado experimentalmente a razão de 0,68 (±0,13), para V8 infectadas experimentalmente a razão de 0,09 (±0,01), para V14 a razão de 0,10 (±0,02), para VI5 a razão de 0,13 (±0,04) e para VI7 a razão de 0,34 (±0,23).

Assim, uma protecção parcial das bursas de Fabricius foi observada unicamente no grupo VI7. De facto, 8 galinhas em 24 têm uma razão semelhante à das testemunhas não infectadas. Os outros dezasseis têm uma razão mais elevada que as testemunhas infectadas.

Conclusões

As principais conclusões destas campanhas de vacinação são: -65- - Os recombinantes que expressam a poliproteína do IBDV induzem nas galinhas uma forte resposta em ELISA, com os títulos contra o vírus que são elevados. - O recombinante que expressa o fragmento VP2 da poliproteína protege totalmente as galinhas contra a mortalidade e parcilamente contra a atrofia da bursa. -66- .Lista de plasmídeos

Nome Características

Vectores de clonagem em E. coli pUC 18 Vector de clonagem (Messing 1983) pBSPlus Vector de clonagem (Stratagene) pBSLKl pBSPlus com um sítio Bdl e Bgl2 no poliadaptador pBSLK2 idem pBSLKl mas os sítios Bell e Bgl2 estão por ordem inversa pACYC184 Vector de clonagem (Chang, 1978)

Promotores de Vaccinia pGS20 Vector de transferência para Vaccinia (Mackett, 1984) plP75 pBSLKl + fragmento Bcll-BamHl do pGS20 com o promotor p7.5 de Vaccinia em Bcll-BamHl p2P75 idem P1P75 mas em pBSLK2 plPll pBSLKl + DNA sintético de 40 meros com o promotor PI 1 de Vaccinia em Bgl2-BamHl p2Pll idem plPl 1 mas em pBSLK2 pACPl 1 idem mas em Xho2-BamHl de pACYC184 Gene LacZ pBSMutLacZl pBSPlus com LacZ numa cassete Bgl2-BamHl p751ac p2P75 + cassete Bgl2-BamHl com LacZ em Bgl2-BamHl pllLac idem p75Lac mas em p2Pl 1 pACPllLac pACYC184 + cassete PI 1-Lac num fragmento Bgl2-Hind3 de pl ILac em Xho2-Hind3

Vectores de transferência para o CNP

pTIRl pUC18 com o fragmento EcoRl TIR-L de CNP. O fragmento que separa os sítios BamHl do adaptador de pUC18 do BamHl de CNP foi eliminado pTIRBl Inserção de um BamHl em pTIRl, entre a ORF1 e a ORF2. pTIRB2 idem pTIRBl mas entre a ORF2 e a ORF3. pTIRB 1D idem pTIRB 1, mas com eliminação do fragmento EcoR 1 -

Hpal.

Vectores de transferência com LacZ pTIRB lP75Lac pTIRB2P75Lac pTIRB2LacP75 pTIRB 1P1 ILac pTIRB ILacP 11 pTIRB2LacPl 1 + cassete P75-Lac do p75Lac num fragmento Bgl2-

BamHl clonado em BamHl. idem mas em pTIRB2 idem mas na orientação oposta pTIRBl + cassete PI 1-Lac num fragmento Bgl2-

BamHl clonado em BamHl idem mas em orientação oposta idem mas no pTIRB2

Plasmídeos portadores de E2 do IBV p75M41 p75D1466 p75D207

Gene E2 do serotipo M41 clonado a jusante de P7.5 idem mas serotipo D1466 idem mas serotipo D207/D274

Vectores de transferência com E2 de IBV pTIRB 1P75M4ILac Cassetes P7.5-E2 de M41 e PI 1-Lac clonados no sítio BamH 1 de TIRB1. pTIRB lP75D1466Lac idem mas E2 de D1466. pTIRBlP75D207Lac idem mas E2 de D207/D274. -68-

Plasmídeos portadores de TA4 de Eimeria pTA406 cDNA do antigénio TA4 de Eimeria tenella clonado numa cassete BamHl pTA410 p75TA406 p75TA410 pTIRTA406 pTIRTA410

idem mas o sítio proteolítico é diferente gene TA406 clonado a jusante de P7.5 idem mas com o gene TA410 cassete P7.5-TA406 clonado em BamHl de pTIRBID idem mas cassete P7.5-TA410

Vectores de transferência com TA4 de Eimeria pTIRTA406Lac Cassete P11 Lac clonado em pTIRTA406 pTIRTA41 OLac idem mas em pTIRTA410

Plasmídeos para a clonagem de IBDV pBSIBDVO pBSPlus (Pstl-Hinç2) este trabalho + fragmento Pstl

de 277 pb do fragmento EDGAR O-lb obtido por PCR pBSIBDVOb pBSlA2 pBSIB pEDGAR34i pEDGARM34i derivado de pBSIBDVO por mutagénese dirigida pBSLKl (Pstl + T4 DNA polimerase, Saci + fragmento Saci de 760 pb do fragmento EDGAR 1-2 obtido por PCR. pBSLKl (Pstl + T4 DNA polimerase, Saci) + fragmento saci de 369 pb do fragmento EDGAR 1-2 obtido por PCR. pBSLKl (Pstl + T4 DNA polimerase, Hinç2) + fragmento EDGAR 3-4 de 670 pb obtido por PCR. derivado de pEDGAR34i por mutagénese dirigida pBS3A pBSLKl (Pstl + T4 DNA polimerase, Sphl) + fragmento Sphl de 956 pb do fragmento EDGAR 5-6 obtido por PCR. pBS3B pBSLKl (Pstl + T4 DNA polimerase, Sphl) + fragmento Sphl de 345 pb do fragmento EDGAR 5-6 obtido por PCR. pEDGAR12 pBSlA2 (EcoRl + T4 DNA polimerase. Saci) + fragmento pBSIB (Sphl + T4 DNA polimerase, Saci) pEDGARM12 derivado de pEDGAR12 por mutagénese dirigida pACEDGARM 12 inserção do fragmento Bell-Sphl de pEDGARM12 nos sítios Bell-Sphl de pACYC184 pEDGAR45 pBS3A (Hinc2-Pstl) + fragmento Hinc2-Pstl de pEDGAR34i pACEDGARM pACEDGARM12 (Sphl + T4 DNA polimerase, BamHl) + fragmento pEDGARM34i (Nsil + T4 DNA polimerase, BamHl) pACEDGARM pACEDGARM (BamHl + T4 DNA polimerase, Sall) + fragmento pEDGAR45 (Pvu2-Sall) pACEDGAR pACEDGAR (Sphl-EcoRV) + fragmento pBS3B (Sphl-Pvu2) pACEDGAR2 troca do fragmento Bcll-Rsr2 de pBSIBDVO pACEDGAR3 idem com o fragmento Bcll-Rsr2 de pBSIBDVOb

Plasmídeos com IBDV e um promotor de Vaccinia p75EDGARl fragmento Bcll-BamHl de pACEDGAR iserido no p75EDGAR sítio BamHl de p2P75 idem com o fragmento Bcll-BamHl de pACEDGAR2 -70- p75EDGAR3 pllEDGARl idem com o fragmento Bcll-BamHl de pACEDGAR fragmento Bcll-BamHl portador de PI 1 de pACP11 inserido no sítio BamHl de pACEDGAR 1 pllEDGAR2 pllEDGAR3 idem no plasmídeo pACEDGAR2 idem no plasmídeo pACEDGAR3

Vectores de transferência apenas com IBDV pTIR7 5EDGAR1 fragmento Bclll-BamHl dep75EDGARl inserido no sítio BamHl de pTIRBl pTIR75EDGAR2 pTIR75EDGAR3 pTIRl 1EDGAR1 pTIRllEDGAR2 pTIRllEDGAR3 idem com o plasmídeo p75EDGAR2 idem com o plasmídeo p75EDGAR3 idem com o plasmídeo pl 1 EDGAR 1 idem com o plasmídeo pl 1EDGAR2 idem com o plasmídeo pl 1EDGAR3

Vectores de transferência com IBDV e Lac pTIR75ElLAC fragmento Bgl2-BamHl de pACPl 1LAC inserido no

pTIR75E2LAC pTIRl 1E1LAC sítio BamHl de pTIR75EDGARl idem com o plasmídeo pTIR75EDGAR2 fragmento Bgl2-BamHl de o75LAC inserido no sítio BamHl de pTIRl 1 EDGAR 1 pTIRllE2LAC pTIRllE3LAC pTIRllVP2LAC idem com o plasmídeo pTIRl 1EDGAR2 idem com o plasmídeo pTIRl 1EDGAR3 fragmento Xhol (T4 DNA polimerase) - Bgl2 de pl 1 EDGAR 1 clonado nos sítios PpuMl (T4 DNA polimerase) - Bgl2 de pTIRl 1E1LAC -71 -

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XXX -73-

-73- Nome 1. BACTÉRIAS E. COLI MC1061 JM1110 2. VÍRUS CNP LVCO CNP V3 em V4 V5 V8 V10 3. VÍRUS IBDV EDGAR

849VB PBG98 Bursine2 4. CÉLULAS QT35 CEF

Lista de organismos Características araD139. (ara, leu) 7697, lacX74. galU, galK, hsdR, strA (Pharmacia utilizada pelo seu fenótipo dam-. (N3837dam4) estirpe infecciosa padrão de Fowlpox da USDA. estirpe vacinai de Fowlpox (SOLVAY) vírus rEcombinante CNP com a cassete P7.5-LacZ TIRB1 idem V3, mas a cassete é TIRB2 idem V4, mas a cassete está na orientação oposta idem V3, mas a cassete está na orientação oposta idem V9, mas a cassete está em TIRB2 estirpe EDGAR isolado americano de S.A. EDGAR,

Aubum University, propagado 3 vezes em galinha e uma vez em ovos embrionados. Padrão para testes de infecção experimental da USDS. estirpe patogénica, descrita por Van Berg et ai, 1991

estirpe adaptada a células CEF estirpe vacinai adaptada às células QT35 linha celular de codorniz fibroblastos de embrião de galinha -74- 5. VÍRUS CNP/IBD VI1 portador das cassetes PI ILac e P7.5E1 V12 portador das cassetes PI ILac e P7.5E2 V14 portador das cassetes P7.5E1 e PI ILac V15 portador das cassetes P7.5E2 e PI ILac V16 portador das cassetes P7.5E3 e PI ILac V17 portador das cassetes P7.5VP2 e PI ILac 6. VÍRUS CNP/TA4 V21 portador das cassetes PI ILac e P7.5TA410 -75- LISTA E SEQUÊNCIAS DAS ESCORVAS Número Sequência de 5' para 3' Complementar de

5169 5 ' CCTTTACTGTTAGTTCTACAATCGAAATTATGC 31 FPV 5168 5 1 CATGTAGATTTTAATCCGTTAACACGCGCAG 3' FPV 3254 5 1 GCCGGAAAACCTACCGGATTGATGG 3' Lac 1871 5' GAAACCAGGCAAAGCGCC 3' Lac IBDV16 5' CCAGGGTGTCGTCCGGAATGG 3' IBDV IBDVlb 5 ' CCCAAGATCATATGATGTGGGTAAGCTGAGG 3' IBDV IBDV3 5 ' TGAGCAACTTCGAGCTGATCCCAAATCCTG 31 IBDV IBDV22 5 ' CTGCTCTTGACTGCGATGGAG 3' IBDV

Lisboa, 22 de Março de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR ÇORDON, 14 1200 LISBÒA

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. O vírus Avipox recombinante derivado de uma estirpe atenuada de vírus Avipox e portador, numa parte não essencial do seu genoma, de pelo menos uma sequência de DNA codificante da totalidade ou parte de uma proteína heterlóga para o vírus Avipox, assim como elementos susceptíveis de assegurar a expressão desta proteína numa célula infectada pelo referido vírus recombinante, caracterizado por a parte não essencial do genoma ser constituída por uma região intergénica não codifícante, tendo uma sequência de mais de 60 nucleótidos e situada entre duas grelhas de leitura abertas (ORF), os sinais de expressão incluídos, esta região intergénica sendo escolhida entre a região, referida como região βΐ, situada entre as ORF1 e ORF2 da região TIR (repetições terminais invertidas) e a região, referida como região β2, situada entre as ORF2 e ORF3 da região, a referida região β2, situada entre as ORF2 e ORF3 da região TIR.
2. 2. Vírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por derivar de uma estirpe atenuada de vírus Fowlpox.
3. 3. Vírus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por pelo menos uma sequência de DNA ser clonada nas duas regiões TIR do vírus.
4. 4. Vírus de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a sequência de DNA ser clonada na região βΐ em cada uma das TIR.
5. 5. Vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a proteína heteróloga ser escolhida entre os antigénios do vírus -2- da doença de Gumboro (IBDV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus responsável pela anemia da galinha (CAV), protozoário Eimeria responsável pela coccidiose, vírus da doença de Newcastle (NDV) e vírus da doença de Mareck (MDV).
6. 6. Vírus de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a proteína heteróloga ser escolhida entre os antigénios do vírus da doença de Gumboro (IBDV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus responsável pela anemia da galinha (CAV) e protozoário Eimeria.
7. 7. Vírus de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a proteína heteróloga ser escolhida entre toda ou parte da grelha de leitura aberta da poliproteína e partes da poliproteína de IBDV, antigénio E2 de IBV, antigénio de superfície TA4 de Eimeria. proteína P50 de CAV.
8. 8. Vírus de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a protéina heteróloga ser uma parte das grelhas da poliproteína de IBDV compreendendo os aminoácidos 1 a 493 seguido dos aminoácidos 1010al012.
9. 9. Cultura das células eucariotas infectadas por um vírus Avipox recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. 10. Cultura de células de acordo com a reivindicação 9 caracte-rizada por se tratar de células aviárias.
11. 11. Vacina caracterizada por conter um vírus Avipox de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
12. 12. Utilização de um vírus Avipox de acordo com qualquer uma -3- das reivindicações 1 a 8 como vector capaz de expressar a totalidade ou parte de uma protéina heteróloga para o vírus.
13. 13. Sequência de transferência que permite inserir uma sequência de DNA codificante da totalidade ou de parte de uma protéina heteróloga nas regiões intergénicas do genoma do vírus Avipox de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
14. 14. Plasmídeo portador de uma sequência de acordo com a reivindicação 13. Lisboa, 22 de Março de 2000

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