FR2750866A1 - Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire - Google Patents
Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire Download PDFInfo
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Abstract
Le vaccin vivant recombinant aviaire comprend, comme vecteur, un virus ILTV comprenant et exprimant au moins une séquence nucléotidique hétérologue, cette séquence nucléotidique étant insérée dans le locus d'insertion défini entre les nucléotides 1624 et 3606 à la SEQ ID NO: 5. Le vaccin peut notamment comprendre une séquence codant pour un antigène d'un agent pathogène aviaire choisi parmi le groupe consistant en le virus de la maladie de Newcastle (NDV), le virus de la maladie de Gumboro (IBDV), le virus de la maladie de Marek (MDV), le virus de la bronchite infectieuse (IBV), le virus de l'anémie du poulet (CAV), le virus de la pneumovirose du poulet, de préférence, sous le contrôle d'un promoteur eucaryote fort. Formule de vaccin multivalent.
Description
Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotrachéite infectieuse aviaire.
La présente invention a trait à des vaccins à usage aviaire à base de virus de la laryngotrachéite infectieuse (ILTV), dans lequel a été insérée, par recombinaison génétique, au moins une séquence nucléotidique hétérologue, notamment codant pour, et exprimant, un polypeptide antigénique d'un agent pathogène aviaire, dans des conditions assurant une immunisation conduisant à une protection efficace de l'animal vacciné contre ledit agent pathogène.
Le virus de la laryngotrachéite infectieuse (ILTV) est un alphaherpèsvirus (B.
Roizman, Arch. Virol. 1992. 123. 425-449) qui provoque une pathologie respiratoire importante (la laryngotrachéite infectieuse ou ILT) chez le poulet (L.E. Hanson et T.J.
Bagust, Diseases of Poultry 9th edn 1991.pp 485-495. Ames, Iowa State University
Press). Les vaccins actuellement disponibles contre cette affection contiennent une souche atténuée administrable par différentes voies dont les voies intranasales, conjonctivales, cloacales, dans l'eau de boisson et par aérosol (L.E. Hanson et T.J.
Press). Les vaccins actuellement disponibles contre cette affection contiennent une souche atténuée administrable par différentes voies dont les voies intranasales, conjonctivales, cloacales, dans l'eau de boisson et par aérosol (L.E. Hanson et T.J.
Bagust, Diseases of Poultry 9th Edition 1991.pp 485-495. Ames, Iowa State University
Press).
Press).
Les études de biologie moléculaire du virus ILTV ont permis de caractériser le génome viral (M.A. Johnson et al., Arch. Wro. 1991. 119. 181-198) et d'identifier quelques gènes du virus (A.M. Griffin, J. Gen. Virol. 1989. 70. 3085-3089) dont les gènes codant pour la thymidine kinase (UL23) (A.M. Griffin et M.E.G. Boursnell, J.
Gen. Viol. 1990. 71. 841-850; C.L. Keeler et al., Avian Dis. 1991. 35. 920-929), la glycoprotéine gB (UL27) (A.M. Griffin, J. Gen. Virol. 1991. 72. 393-398; K.
Kongsuwan et al., Virology 1991. 184. 404-410; D.J. Poulsen et al., Virus Genes 1991. 5. 335-347), la glycoprotéine gC (UL44) (D.H. Kingsley et al., Viroiogy 1994.
203. 336-343), la protéine de capside p40 (UL26) (A.M. Griffin, Nucl. Acids Res.
1990. 18. 3664), la protéine homologue de la protéine ICP4 de l'herpès simplex (HSV1) (M.A. Johnson et al., Virus Research 1995. 35. 193-204), les protéines homologues aux protéines ICP27 (UL54), glycoprotéine gK (UL53) et DNA hélicase (UL52) de l'HSV-l (M.A. Johnson et al., Arch. Viol. 1995. 140. 623-634), la ribonucléotide réductase (A.M. Griffin, J. Gen. Virol. 1989. 70. 3085-3089, WO-A-90/02802), les gènes présents dans la séquence unique courte du génome (Us) (M.A. Johnson et al.,
DNA Sequence- The Journal of Sequencing and Mapping 1995. Vol. 5. ppl91-194; K.
DNA Sequence- The Journal of Sequencing and Mapping 1995. Vol. 5. ppl91-194; K.
Kongsuwan et al., Arch. Virol. 1995. 140. 27-39; K. Kongsuwan et al., Virus Research 1993. 29. 125-140; K. Kongsuwan et ai., Virus Gene 1993. 7. 297-303; WO-A92/03554; WO-A-95/08622).
La présente invention a pour objectif de mettre au point un vaccin aviaire à base de virus ILTV recombinant exprimant un gène hétérologue, ce virus étant capable de se répliquer et d'induire une immunité chez l'hôte vacciné tout en conservant une bonne innocuité.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel vaccin qui soit en même temps particulièrement efficace contre la laryngotrachéite infectieuse (ILT).
Un autre objectif de l'invention est de proposer un tel vaccin qui soit utilisable dans la vaccination de masse par voie mucosale, par exemple par voie aérosol ou dans l'eau de boisson, de telle manière que la réplication du virus au niveau mucosal permette d'induire une immunité mucosale et systémique. Une telle immunité mucosale sera particulièrement efficace pour lutter contre les maladies respiratoires, ainsi que contre les autres maladies pour lesquelles la porte d'entrée de l'agent pathogène est mucosale.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un tet vaccin it qui utilisable aussi bien chez les adultes que chez les jeunes animaux.
Un objectif spécifique est de proposer un tel vaccin utilisable dans la vaccination de masse par voie mucosale des tout jeunes animaux tels que les poussins d'un jour.
Un autre objectif de l'invention est de proposer un vaccin contre l'ILT qui ait une efficacité accrue par rapport à la souche parentale et qui puisse même éventuellement permettre l'insertion et l'expression d'un gène hétérologue.
Au cours de leurs travaux sur le virus ILTV, les inventeurs ont trouvé une région génomique qui s'est révélée tout à fait appropriée comme site d'insertion de gènes hétérologues. Cela a permis de mettre au point un vaccin vivant recombinant à base d'un vecteur ILTV dans lequel est insérée au moins une séquence codant pour un immunogène aviaire, en particulier les protéines HN et F du virus de la maladie de
Newcastle (NDV), et/ou la glycoprotéine gB du virus de la maladie de Marek (MDV), et/ou la protéine VP2 du virus de la maladie de Gumboro (IBDV), et/ou les protéines
S et M du virus de la bronchite infectieuse (IBV). Un tel vaccin incorporant une séquence codant pour des protéines du NDV, du MDV et de l'IBV assure une protection satisfaisante des animaux contre la maladie de Newcastle, contre la maladie de Marek, contre la maladie de Gumboro, et contre la bronchite infectieuse respectivement.
Newcastle (NDV), et/ou la glycoprotéine gB du virus de la maladie de Marek (MDV), et/ou la protéine VP2 du virus de la maladie de Gumboro (IBDV), et/ou les protéines
S et M du virus de la bronchite infectieuse (IBV). Un tel vaccin incorporant une séquence codant pour des protéines du NDV, du MDV et de l'IBV assure une protection satisfaisante des animaux contre la maladie de Newcastle, contre la maladie de Marek, contre la maladie de Gumboro, et contre la bronchite infectieuse respectivement.
La présente invention a donc pour objet un vaccin vivant recombinant aviaire comprenant, comme vecteur, le virus ILTV comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue, notamment codant pour, et exprimant, un polypeptide antigénique d'un agent pathogène aviaire, insérée dans le locus d'insertion défini entre les nucléotides 1624 et 3606 à la séquence SEQ ID NO:5.
Par séquence hétérologue, on entend une séquence qui ne provient pas de ce locus d'insertion, c'est-à-dire aussi bien une séquence n'ayant pas pour origine le virus
ILTV, qu'une séquence provenant d'une autre région génomique de ce virus.
ILTV, qu'une séquence provenant d'une autre région génomique de ce virus.
Par insertion dans la région d'insertion, on entend notamment insertion simple ou après délétion totale ou partielle du locus d'insertion.
On a déterminé dans ce locus d'insertion un cadre ouvert de lecture (COL B) apparaissant entre les nucléotides 1713 et 2897 à la SEQ ID NO:5, et une région intergénique (entre les nucléotides 2898 et 3606) entre COL B et COL G. On peut donc insérer aussi bien dans le COL B ou dans la région intergénique, qu'à cheval sur ces deux régions. On peut insérer une ou plusieurs cassettes d'expression chacune comprenant au moins une séquence à exprimer.
Pour exprimer la séquence insérée, on préfère utiliser un promoteur eucaryote fort tel que le promoteur CMV immediate early (IE), le LTR du virus du sarcome de
Rous (RSV), et le promoteur précoce du virus SV40.
Rous (RSV), et le promoteur précoce du virus SV40.
Par promoteur CMV immediate early (IE), on entend le fragment donné dans les exemples ainsi que ses sous-fragments conservant la même activité promotrice.
Le promoteur CMV IE peut être le promoteur humain (HCMV IE) ou le promoteur murin (MCMV IE), ou encore un promoteur CMV IE d'une autre origine, par exemple du singe, du rat, du cobaye ou du porc.
La séquence nucléotidique insérée dans le vecteur ILTV pour être exprimée peut être toute séquence codant pour un polypeptide antigénique, d'un agent pathogène aviaire, capable, une fois exprimé dans les conditions favorables procurées par l'invention, d'assurer une immunisation conduisant à une protection efficace de l'animal vacciné contre l'agent pathogène. On pourra donc insérer, dans les conditions de l'invention, les séquences nucléotidiques codant pour les antigènes d'intérêt pour une maladie donnée.
Cette séquence nucléotidique insérée dans le vecteur ILTV peut également coder pour un polypeptide immunomodulateur, et notamment une cytokine.
De manière remarquable, les vaccins selon l'invention pourront être utilisés pour la vaccination in ovo, des poussins d'un jour ou plus et des adultes. Différentes voies d'administration pourront être utilisées: la voie parentérale, ou les voies mucosales telles que oronasale (eau de boisson, aérosol), conjonctivale (goutte dans l'oeil) ou cloacale, avec une préférence pour les voies permettant une vaccination mucosale de masse (eau de boisson, aérosol).
L'invention se révèle particulièrement utile aussi bien pour la protection contre les pathologies respiratoires que contre les pathologies systémiques en bloquant les voies d'entrée naturelles de l'agent pathogène.
L'invention peut notamment être utilisée pour l'insertion d'une séquence nucléotidique codant convenablement pour une protéine antigénique du virus NDV et en particulier, la glycoprotéine HN ou la glycoprotéine F. On obtient ainsi un vaccin vivant recombinant assurant, en plus d'une protection contre la laryngotrachéite infectieuse, une protection satisfaisante contre la maladie de Newcastle.
Le vaccin recombinant contre la maladie de Newcastle contiendra de préférence de 10 à 104 PFU/dose.
D'autres cas préférés de l'invention sont l'insertion de séquences nucléotidiques codant pour des antigènes d'autres agents pathogènes aviaires, et notamment, mais de manière non limitative, des antigènes du virus de la maladie de Marek, en particulier gènes gB, gD, et gH+gL (WO-A-90/02803), du virus de la maladie de Gumboro, en particulier gène VP2, du virus de la bronchite infectieuse (IBV), en particulier gènes
S et M (M. Binns et al., J. Gen. Viol. 1985. 66. 719-726; M. Boursnell et al., Virus
Research 1984. 1. 303-313), du virus de l'anémie du poulet (CAV), en particulier VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) (N.H.M. Noteborn et al., J. Virol. 1991. 65. 3131-3139), du virus ILTV, en particulier les gènes codant pour gB (A.M. Griffin, J. Gen. Virol.
S et M (M. Binns et al., J. Gen. Viol. 1985. 66. 719-726; M. Boursnell et al., Virus
Research 1984. 1. 303-313), du virus de l'anémie du poulet (CAV), en particulier VP1 (52 kDa) + VP2 (24 kDa) (N.H.M. Noteborn et al., J. Virol. 1991. 65. 3131-3139), du virus ILTV, en particulier les gènes codant pour gB (A.M. Griffin, J. Gen. Virol.
1991. 72. 393-398), ou pour gD (M.A. Johnson et ai., DNA Sequence-The Journal of
Sequencing and Mapping 1995. Vol. 5. ppl91-194. Harwood Academic Publishers
GmbH), ou pour gp60 (K.K. Kongsuwan et al., Virus Genes 1993. 7. 297-303), et du virus du syndrome infectieux du gonflement de la tête ("swollen head syndrome" ou pneumovirose du poulet ou turkey rhinotracheitis virus (TRTV) de la dinde; pneumovirus), en particulier la glycoprotéine de fusion F (Q. Yu et al., J. Gen. Virol.
Sequencing and Mapping 1995. Vol. 5. ppl91-194. Harwood Academic Publishers
GmbH), ou pour gp60 (K.K. Kongsuwan et al., Virus Genes 1993. 7. 297-303), et du virus du syndrome infectieux du gonflement de la tête ("swollen head syndrome" ou pneumovirose du poulet ou turkey rhinotracheitis virus (TRTV) de la dinde; pneumovirus), en particulier la glycoprotéine de fusion F (Q. Yu et al., J. Gen. Virol.
1991. 72. 75-81), ou la glycoprotéine d'attachement G (R. Ling et al., J. Gen. Viol.
1992. 73. 1709-1715; K. Juhasz etj. Easton, J. Gen. Virai. 1994. 75. 2873-2880). Les doses seront de préférence les mêmes que celles pour le vaccin de Newcastle.
Dans le cadre de la présente invention, on peut bien entendu insérer plus d'une séquence hétérologue dans le même virus ILTV, notamment dans ce locus. On peut notamment y insérer des séquences provenant d'un même virus ou de virus différents, ce qui comprend également l'insertion de séquences d'ILTV et d'un autre virus aviaire.
On peut également y associer des séquences codant pour des immunomodulateurs, et en particulier des cytokines.
Par exemple, on associe au promoteur CMV IE un autre promoteur de façon que leurs extrémités 5' soient adjacentes (ce qui implique des transcriptions dans des sens opposés), ce qui permet d'insérer, dans la zone d'insertion, deux séquences nucléotidiques, l'une sous la dépendance du promoteur CMV IE, l'autre sous celle du promoteur associé. Cette construction est remarquable par le fait que la présence du promoteur CMV IE, et notamment de sa partie activatrice (enhancer), active la transcription induite par le promoteur associé. Le promoteur associé peut être en particulier un promoteur d'un gène du virus ILTV ou du virus MDV ou HVT.
Un cas intéressant de l'invention est un vaccin comprenant une séquence nucléotidique codant pour HN de NDV et une séquence nucléotidique codant pour- F de NDV ou un antigène d'une autre maladie aviaire, notamment celles citées plus haut, l'un des gènes étant sous le contrôle du promoteur CMV IE, et l'autre sous le contrôle du promoteur associé.
On peut aussi monter deux promoteurs CMV lE d'origines différentes avec leurs extrémités 5' adjacentes.
La présente invention a aussi pour objet un vaccin contre l'ILT comprenant un virus ILTV recombinant dans lequel on a inséré en amont des gènes codant pour des immunogènes majeurs de l'ILTV, de préférence les gènes codant pour gB (A.M.
Griffin, J. Gen. Viol. 1991. 72. 393-398), ou pour gD (M.A. Johnson et al., DNA
Sequence-The Journal of Sequencing andMapping 1995. Vol. 5. ppl91-194. Harwood
Academic Publishers GmbH), ou pour gp60 (K.K. Kongsuwan et al., Virus Genes 1993. 7. 297-303), un promoteur exogène, en particulier un promoteur fort tel que décrit plus haut. Cela permet d'augmenter le niveau d'expression de l'un ou plusieurs de ces gènes et ainsi conduire à un vaccin à efficacité accrue contre l'ILT. On peut bien sûr combiner cela avec une construction telle que décrite plus haut comprenant l'insertion d'une séquence hétérologue dans le locus d'insertion.
Sequence-The Journal of Sequencing andMapping 1995. Vol. 5. ppl91-194. Harwood
Academic Publishers GmbH), ou pour gp60 (K.K. Kongsuwan et al., Virus Genes 1993. 7. 297-303), un promoteur exogène, en particulier un promoteur fort tel que décrit plus haut. Cela permet d'augmenter le niveau d'expression de l'un ou plusieurs de ces gènes et ainsi conduire à un vaccin à efficacité accrue contre l'ILT. On peut bien sûr combiner cela avec une construction telle que décrite plus haut comprenant l'insertion d'une séquence hétérologue dans le locus d'insertion.
La présente invention a aussi pour objet une formule de vaccin multivalent, comprenant, en mélange ou à mélanger, un vaccin tel que défini plus haut avec un autre vaccin, et notamment un autre vaccin vivant recombinant aviaire tel que défini plus haut, ces vaccins comprenant des séquences insérées différentes, notamment de pathogènes différents.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de préparation des vaccins selon l'invention, telle qu'elle ressort de la description.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de vaccination aviaire comprenant l'admmistrationd'unvaccin vivantrecombinant ou d'une formulede vaccin multivalent tel que défini plus haut. Elle a notamment pour objet une telle méthode pour la vaccination in ovo, des poussins d'un jour ou plus et des adultes. Différentes voies d'administration du vaccin peuvent être utilisées (voir plus haut) avec une préférence pour les voies permettant une vaccination de masse par voie mucosale (aérosol, eau de boisson), la dose de vaccin étant choisie de préférence entre 10t et 104 par animal.
La présente invention a aussi pour objet un virus ILTV comprenant au moins une séquence nucléotidique hétérologue telle que décrite ci-dessus insérée dans le locus d'insertion tel que défini plus haut.
L'invention a encore pour objet un fragment d'ADN constitué de tout ou partie de la séquence entre les nucléotides 1 et 3841 de SEQ ID NO:5.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de réalisation non limitatifs, pris en référence au dessin, dans lequel
Figure 1 : Carte de restriction, position des fragments clonés et position des COLs
Figure 2 : Séquence de 3841 pb et traduction des COLs A, B et C
Figure 3 : Schéma d'obtention du plasmide pMB035
Figure 4: Schéma d'obtention du plasmide pMB039
Figure S : Schéma d'obtention du plasmide pMB042
Figure 6 : Schéma d'obtention du plasmide pEL024
Figure 7: Schéma d'obtention du plasmide pEL027
Figure 8: Schéma du plasmide pMB043
Figure 9 : Schéma d'obtention du plasmide pCD009
Figure 10: Schéma d'obtention du plasmide pEL070
Figure 11 : Schéma du plasmide pMB044
Figure 12 : Schéma du plasmide pMB045
Figure 13 : Schéma du plasmide pMB046
Figure 14 : séquence du gène HN du NDV
Figure 15 : Schéma d'obtention du plasmide pEL030
Figure 16 : Schéma du plasmide pMB047
Figure 17: Schéma du plasmide pEL033
Figure 18 : Schéma du plasmide pMB048
Figure 19 : Schéma de double cassette d'expression
Figure 20 : Schéma du plasmide pCD011
Figure 21 : Schéma du plasmide pMB049
Liste des séquences
SEQ ID NO:1 Oligonucléotide EL207
SEQ ID NO:2 Oligonucléotide EL208
SEQ ID NO:3 Oligonucléotide LP018
SEQ ID NO:4 Oligonucléotide LP020
SEQ ID NO:5 Séquence du fragment SalI-BamHI séquencé (3841 pb; voir
figure 2)
SEQ ID NO:6 Oligonucléotide MB088
SEQ ID NO:7 Oligonucléotide MB089
SEQ ID NO:8 Oligonucléotide MB090
SEQ ID NO:9 Oligonucléotide MB091 SEQ ID NO:10 Oligonucléotide MB092
SEQ ID NO:ll Oligonucléotide MB093
SEQ ID NO:12 Oligonucléotide MB070
SEQ ID NO:13 Oligonucléotide MB071
SEQ ID NO:14 Séquence du gène HN du NDV (voir figure 14)
SEQ ID NO:15 Oligonucléotide EL071
SEQ ID NO:16 Oligonucléotide EL073 SEQ ID NO:17 Oligonucléotide EL074
SEQ ID NO:18 Oligonucléotide EL075
SEQ ID NO:19 Oligonucléotide EL076
SEQ ID NO:20 Oligonucléotide EL077
SEQ ID NO:21 Oligonucléotide CD001
SEQ ID NO:22 Oligonucléotide CD002
SEQ ID NO:23 Oligonucléotide CD003
SEQ ID NO:24 Oligonucléotide CD004
EXEMPLES
Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire décrites par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring
Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention ont été isolés en utilisant le kit "Geneclean" (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
Figure 1 : Carte de restriction, position des fragments clonés et position des COLs
Figure 2 : Séquence de 3841 pb et traduction des COLs A, B et C
Figure 3 : Schéma d'obtention du plasmide pMB035
Figure 4: Schéma d'obtention du plasmide pMB039
Figure S : Schéma d'obtention du plasmide pMB042
Figure 6 : Schéma d'obtention du plasmide pEL024
Figure 7: Schéma d'obtention du plasmide pEL027
Figure 8: Schéma du plasmide pMB043
Figure 9 : Schéma d'obtention du plasmide pCD009
Figure 10: Schéma d'obtention du plasmide pEL070
Figure 11 : Schéma du plasmide pMB044
Figure 12 : Schéma du plasmide pMB045
Figure 13 : Schéma du plasmide pMB046
Figure 14 : séquence du gène HN du NDV
Figure 15 : Schéma d'obtention du plasmide pEL030
Figure 16 : Schéma du plasmide pMB047
Figure 17: Schéma du plasmide pEL033
Figure 18 : Schéma du plasmide pMB048
Figure 19 : Schéma de double cassette d'expression
Figure 20 : Schéma du plasmide pCD011
Figure 21 : Schéma du plasmide pMB049
Liste des séquences
SEQ ID NO:1 Oligonucléotide EL207
SEQ ID NO:2 Oligonucléotide EL208
SEQ ID NO:3 Oligonucléotide LP018
SEQ ID NO:4 Oligonucléotide LP020
SEQ ID NO:5 Séquence du fragment SalI-BamHI séquencé (3841 pb; voir
figure 2)
SEQ ID NO:6 Oligonucléotide MB088
SEQ ID NO:7 Oligonucléotide MB089
SEQ ID NO:8 Oligonucléotide MB090
SEQ ID NO:9 Oligonucléotide MB091 SEQ ID NO:10 Oligonucléotide MB092
SEQ ID NO:ll Oligonucléotide MB093
SEQ ID NO:12 Oligonucléotide MB070
SEQ ID NO:13 Oligonucléotide MB071
SEQ ID NO:14 Séquence du gène HN du NDV (voir figure 14)
SEQ ID NO:15 Oligonucléotide EL071
SEQ ID NO:16 Oligonucléotide EL073 SEQ ID NO:17 Oligonucléotide EL074
SEQ ID NO:18 Oligonucléotide EL075
SEQ ID NO:19 Oligonucléotide EL076
SEQ ID NO:20 Oligonucléotide EL077
SEQ ID NO:21 Oligonucléotide CD001
SEQ ID NO:22 Oligonucléotide CD002
SEQ ID NO:23 Oligonucléotide CD003
SEQ ID NO:24 Oligonucléotide CD004
EXEMPLES
Toutes les constructions de plasmides ont été réalisées en utilisant les techniques standards de biologie moléculaire décrites par Sambrook J. et al. (Molecular Cloning:
A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring
Harbor. New York. 1989). Tous les fragments de restriction utilisés pour la présente invention ont été isolés en utilisant le kit "Geneclean" (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
Le virus utilisé comme virus parental peut être choisi parmi les souches vaccinales décrites dans J.R. Andreasen et al. (Avian Diseases 1990. 34. 646-656) ou la souche T-20 12-8-66 provenant de Select laboratories 10026 Main Street P.O. Box 6 Berlin, Maryland 21811, USA. On peut également utilisé des souches virulentes telles que la souche N-71851 (ATCC VR-783) ou la souche 83-2 de l'USDA, que l'on peut atténuer par les techniques connues, par exemple celle décrite dans WO-A-95/08622.
Exemple 1: Culture du virus ILTV:
Le virus ILTV est cultivé sur des cellules primaires de reins de poulets (CRP); ces cellules sont mises en culture en milieu MEM complémenté avec 3 % de sérum de veau foetal (SVF) dans des flacons de culture de 75 cm2 (2 105 cellules/cm2) un ou deux jours avant inoculation.
Le virus ILTV est cultivé sur des cellules primaires de reins de poulets (CRP); ces cellules sont mises en culture en milieu MEM complémenté avec 3 % de sérum de veau foetal (SVF) dans des flacons de culture de 75 cm2 (2 105 cellules/cm2) un ou deux jours avant inoculation.
Le jour de l'inoculation, un flacon de 1000 doses de vaccin lyophilisé est resuspendu dans 10 ml de milieu MEM complémenté avec 1 % de SVF; environ 0,5 ml de cette solution est ensuite déposé sur la culture de CRP. Le lendemain, le milieu est changé, et le surlendemain, lorsque l'effet cytopathogène (ECP) se généralise, les flacons de culture sont congelés à -70 C.
La culture du virus ILTV peut également être faite sur des cellules immortalisées de foie de poulet, et notamment sur la lignée LMH (W.M. Schnitzlein et al., Avian
Diseases 1994. 38. 211-217).
Diseases 1994. 38. 211-217).
Exemple 2: Préparation de l'ADN génomique de 1'ILTV:
Aprés 2 cycles de congelation/décongelation, la culture d'ILTV (2 flacons de 75 cm2) est récoltée et centrifugée à basse vitesse (5000 tr/min dans un rotor 20, centrifugeuse
Beckman JA21, pendant 5 minutes) pour éliminer les gros débris celIulaires. Le surnageant est ensuite ultracentrifugé (100000 tr/min rotor TLA100.3, centrifugeuse
Beckman TL100, pendant 1 heure). Le culot est alors repris dans 1,6 ml de TEN-SDS (Tris pH 8,0 lOmM; EDTA lmM; NaCl 0,5M; sodium dodecyl sulfate 0,5%), et 35 ,ul d'une solution de protéinase K à 20 mg/ml sont ensuite ajoutés; la solution est incubée 3 à 4 heures au bain marie à 37"C, et l'ADN est ensuite extrait 3 fois au phénol/chloroforme et 1 fois au chloroforme, puis il est précipité à l'éthanol à -20 C.
Aprés 2 cycles de congelation/décongelation, la culture d'ILTV (2 flacons de 75 cm2) est récoltée et centrifugée à basse vitesse (5000 tr/min dans un rotor 20, centrifugeuse
Beckman JA21, pendant 5 minutes) pour éliminer les gros débris celIulaires. Le surnageant est ensuite ultracentrifugé (100000 tr/min rotor TLA100.3, centrifugeuse
Beckman TL100, pendant 1 heure). Le culot est alors repris dans 1,6 ml de TEN-SDS (Tris pH 8,0 lOmM; EDTA lmM; NaCl 0,5M; sodium dodecyl sulfate 0,5%), et 35 ,ul d'une solution de protéinase K à 20 mg/ml sont ensuite ajoutés; la solution est incubée 3 à 4 heures au bain marie à 37"C, et l'ADN est ensuite extrait 3 fois au phénol/chloroforme et 1 fois au chloroforme, puis il est précipité à l'éthanol à -20 C.
Après centrifugation, le culot est rincé à l'éthanol 70%, séché et resuspendu dans 200 Cll TE (Tris pH8.0 10mu; EDTA lmM). La concentration en acide nucléique est ensuite dosée au spectrophotomètre (DO260). Cette solution d'ADN peut directement servir de matrice pour les expériences d'amplification en chaîne par la polymérase (PCR, polymerase chain reaction); de même, elle pourra également être utilisé dans les expériences de transfection pour l'obtention d'un virus recombinant.
Exemple 3: Isolement et purification de virus recombinant ILTV
Le plasmide donneur composé d'une cassette d'expression d'un polypeptide inséré entre deux régions flanquantes du locus d'insertion est digéré par une enzyme de restriction permettant la linéarisation du plasmide, puis il est extrait avec un mélange phénol/chloroforme, précipité avec de l'éthanol absolu, et repris dans de l'eau stérile.
Le plasmide donneur composé d'une cassette d'expression d'un polypeptide inséré entre deux régions flanquantes du locus d'insertion est digéré par une enzyme de restriction permettant la linéarisation du plasmide, puis il est extrait avec un mélange phénol/chloroforme, précipité avec de l'éthanol absolu, et repris dans de l'eau stérile.
Des cellules CRP primaires de 24 heures sont ensuite transfectées avec le mélange suivant: 0,2 à 1 g de plasmide donneur linéarisé + 2 à 5 g d'ADN viral d'ILTV (préparé comme dans l'exemple 2) dans 300 ,ul de milieu OptiMEM (Gibco BRL Cat# 041-01985H) et 100 g de LipofectAMINE dilués dans 300 Ccl de milieu (volume final du mélange = 600 Hl). Ces 600y1 sont ensuite dilués dans 3 ml (volume final) de milieu et étalés sur 5.106 CRP. Le mélange est laissé en contact avec les cellules pendant 5 heures, puis éliminé et remplacé par 5 ml de milieu de culture. Les cellules sont alors laissées en culture pendant 3 à 8 jours à + 37"C, puis, lorsque l'effet cytopathogène est apparu, elles sont congelées à -70 C. Après décongelation et éventuellement sonication, cette population virale est clonée en dilution limite en microplaques (96 puits) afin d'isoler une population homogène de virus recombinant.
Ces plaques sont laissées en culture pendant 1 à 3 jours, puis le surnageant est récolté dans une plaque 96 puits vide et la plaque contenant les surnageants est placée à 40C ou à -70 C. Les cellules restant dans les autres plaques sont ensuite fixées à l'acétone 95 % pendant 20 à 30 minutes à -20 C, ou pendant 5 minutes à température ambiante.
Une réaction d'immunofluorescence indirecte (IFI) est réalisée avec un anticorps monoclonal dirigé contre le polypeptide exprimé pour rechercher les plages exprimant ce polypeptide. Un nouveau clonage est ensuite effectué de la même manière (en dilution limite en plaques 96 puits) à partir du surnageant présent dans les cupules des plaques mises à 4"C ou à -70 C et correspondant aux cupules présentant des plages positives en IFI. En général, 4 cycles d'isolement successifs (dilution limite, récolte du surnageant, contrôle des cellules par IFI, dilution limite à partir du surnageant...) suffisent pour obtenir des virus recombinants dont la totalité de la progénie présente une fluorescence spécifique. L'ADN génomique de ces virus recombinants est caractérisé au niveau moléculaire par des techniques classiques de PCR et de Southern blot en utilisant les oligonucléotides et les sondes d'ADN appropriés.
L'isolement de virus recombinant peut également se faire par hybridation avec une sonde spécifique de la cassette d'expression insérée. Pour cela, la population virale récoltée après transfection est diluée et déposée sur des cellules CRP (cultivées en boîte de Petri) de manière à obtenir des plages isolées. Après un contact d' 1 heure à 37"C, le milieu d'infection est éliminé et remplacé par 5 ml de milieu MEM à 1 % d'agarose, maintenu en surfusion à 42"C. Lorsque l'agarose est solidifié, les boîtes sont incubées 48 à 72 heures à 37"C en étuve CO2 jusqu'à apparition de plages. La couche d'agarose est alors éliminée et un transfert des plages virales est réalisé sur une membrane stérile de nitrocellulose de même diamètre que la boîte de Petri ayant servi à la culture. Cette membrane est elle-même transférée sur une autre membrane de nitrocellulose de manière à obtenir une "copie" inversée du premier transfert. Les plages transférées sur cette dernière copie sont alors hybridées, selon les techniques usuelles connues de l'homme de l'art, avec un fragment d'ADN de la cassette d'expression marqué à la digoxigénine (DNA Labelling Kit, Boehringer Mannheim, CAT # 1175033). Après hybridation, lavages et mise en contact avec le substrat de révélation, la membrane de nitrocellulose est mise en contact avec un film autoradiographique. Les images d'hybridation positive sur cette membrane indiquent quelles sont les plages qui contiennent des virus ILTV recombinants ayant inséré la cassette d'expression. Les plages correspondant à ces plages positives sont découpées stérilement sur la première membrane de nitrocellulose, placées dans un tube Eppendorf contenant 0,5 ml de milieu
MEM et soniquées pour libérer les virions de la membrane. Le milieu contenu dans le tube Eppendorf est ensuite dilué en milieu MEM et les dilutions ainsi obtenues servent à infecter de nouvelles cultures de cellules CRP.
MEM et soniquées pour libérer les virions de la membrane. Le milieu contenu dans le tube Eppendorf est ensuite dilué en milieu MEM et les dilutions ainsi obtenues servent à infecter de nouvelles cultures de cellules CRP.
Exemple 4: Amplification d'une région génomique de l'ILTV
Les oligonucléotides EL207 (SEQ ID NO:1) et EL208 (SEQ ID NO:2) ont servi d'amorces pour une première amplification en chaîne par la polymérase (PCR).
Les oligonucléotides EL207 (SEQ ID NO:1) et EL208 (SEQ ID NO:2) ont servi d'amorces pour une première amplification en chaîne par la polymérase (PCR).
EL207 (SEQ ID NO: 1): 5' AAGTATACTCGAAACTAGCGCAGTACTCTG 3'
EL208 (SEQ ID NO:2): 5' AGATGCGATACCATTTTTACTGCCATTTGG 3'
La première PCR a été effectuée en présence des oligonucléotides EL207 et EL208, de tampon PCR, de dNTP, d'ADN ILTV, de Taq polymérase, et d'un anticorps anti-Taq (TaqStart Antibody, Clontech Lab., Palo Alto, CA, USA) pour restreindre les amplifications non spécifiques. 35 cycles ont été effectués (30 secondes à 94"C, 30 secondes à 60"C et 8 minutes à 72"C). La mise sur gel d'électrophorèse d'un aliquot du produit de la réaction a permis de détecter une bande d'ADN amplifié d'environ 7 kb.
EL208 (SEQ ID NO:2): 5' AGATGCGATACCATTTTTACTGCCATTTGG 3'
La première PCR a été effectuée en présence des oligonucléotides EL207 et EL208, de tampon PCR, de dNTP, d'ADN ILTV, de Taq polymérase, et d'un anticorps anti-Taq (TaqStart Antibody, Clontech Lab., Palo Alto, CA, USA) pour restreindre les amplifications non spécifiques. 35 cycles ont été effectués (30 secondes à 94"C, 30 secondes à 60"C et 8 minutes à 72"C). La mise sur gel d'électrophorèse d'un aliquot du produit de la réaction a permis de détecter une bande d'ADN amplifié d'environ 7 kb.
Une deuxième PCR effectuée avec les oligonucléotides LP018 (SEQ ID NO:3) (position de 2677 à 2696 sur la séquence SEQ ID NO:5) et LP020 (SEQ ID NO:4) a permis d'amplifier un fragment de 1190 pb.
LP018 (SEQ ID NO:3): 5' TCGTGTCTCTGCTATCACTG 3'
LP020 (SEQ ID NO:4): 5' AGCTCTCCATGGATCTAGCG 3'
Exemple 5: Clonage et caracténsation de cette région génomique de 1'ILTV
Le produit de la première réaction d'amplification génique a été purifié par une extraction au phénol/chloroforme, et ensuite digéré par les enzymes de restriction
EcoRI et SacI pendant 2 heures à 37"C. Les enzymes de restriction ont ensuite été inactivés par un chauffage des tubes à 65"C pendant 20 minutes. Les fragments résultant de cette digestion ont ensuite été ligaturés (une nuit à 140 14 C) avec te plasmide pBlueScriptIt SK (pBS SK+; Stratagene) digéré par EcoRI et SacI; l'analyse des clones obtenus après transformation de bactéries E. coli DHSa et culture sur boîtes de milieu complémenté en ampiciline a permis d'identifier 3 inserts EcoRI-SacI de taille différente présents dans 3 plasmides différents: un fragment d'environ 0,6 kb (plasmide pLP001), de 2,8 kb (plasmide pLP002) et de 1,8 kb (plasmide pLP003).
LP020 (SEQ ID NO:4): 5' AGCTCTCCATGGATCTAGCG 3'
Exemple 5: Clonage et caracténsation de cette région génomique de 1'ILTV
Le produit de la première réaction d'amplification génique a été purifié par une extraction au phénol/chloroforme, et ensuite digéré par les enzymes de restriction
EcoRI et SacI pendant 2 heures à 37"C. Les enzymes de restriction ont ensuite été inactivés par un chauffage des tubes à 65"C pendant 20 minutes. Les fragments résultant de cette digestion ont ensuite été ligaturés (une nuit à 140 14 C) avec te plasmide pBlueScriptIt SK (pBS SK+; Stratagene) digéré par EcoRI et SacI; l'analyse des clones obtenus après transformation de bactéries E. coli DHSa et culture sur boîtes de milieu complémenté en ampiciline a permis d'identifier 3 inserts EcoRI-SacI de taille différente présents dans 3 plasmides différents: un fragment d'environ 0,6 kb (plasmide pLP001), de 2,8 kb (plasmide pLP002) et de 1,8 kb (plasmide pLP003).
Le produit d'amplification de la deuxième réaction PCR a été purifié comme ci-dessus, digéré par les enzymes EcoRI et BamHI et cloné dans le plasmide pBS SK+ préalablement digéré par EcoRI et BamHI pour obtenir le clone pLP011.
Le séquençage partiel de l'insert présent dans pLP002 (à droite du site SalI, voir figure 1) et complet de celui présent dans pLP003 et dans pLP011 a permis de mettre en évidence deux cadres ouverts de lecture (COLs) complets (COL A et COL B), et la partie N-terminale d'un autre COL (COL C). La carte de restriction de cette région génomique clonée et de la région séquencée, ainsi que la position sur cette carte des inserts des clones pLP001,</ plasmide digéré a ensuite été traité à l'ADN polymérase (fragment de Klenow) en présence de dNTP pour rendre les bouts francs; après ligature et transformation de bactéries E. coli, le clone pMB034 (4636 pb) a été obtenu; cette étape de clonage a permis de déléter les sites de clonages compris entre EcoRI et xhof dans le plasmide pLP003.
Le plasmide pMB034 a ensuite été digéré par les enzymes HindIII et SphI; le fragment de 4,0 kpb a ensuite été élué et ligaturé aux oligonucléotides MB088 (SEQ ID NO:6) et MB089 (SEQ ID NO:7) préalablement hybridés. Le plasmide pMB035 (3990 pb) a ainsi été obtenu après transformation de bactéries E. coli (voir schéma d'obtention de pMB035 à la figure 3).
MB088 (SEQ ID NO:6): 5' AGCTGAATTCAAGCTTCCCGGGGTCGACATG 3'
MB089 (SEQ ID NO:7): 5' TCGACCCCGGGAAGCTTGAA1TC 3'
Ce plasmide pMB035 contient donc: (1) une séquence homologue en 5' du COL B, (2) une séquence oligonucléotidique insérée contenant les sites uniques EcoRS, SmQI,
HindIII et Sali, et (3) une séquence homologue en 3' du COL B. Ce plasmide permet donc d'introduire une cassette d'expression dans les sites uniques cités en (2) placés entre les 2 régions flanquantes (1) et (3). Les virus recombinants ILTV obtenus auront une délétion dans le COL B (entre les sites HindIII et SphI; acides aminés 56 à 279 du
COL B délétés).
MB089 (SEQ ID NO:7): 5' TCGACCCCGGGAAGCTTGAA1TC 3'
Ce plasmide pMB035 contient donc: (1) une séquence homologue en 5' du COL B, (2) une séquence oligonucléotidique insérée contenant les sites uniques EcoRS, SmQI,
HindIII et Sali, et (3) une séquence homologue en 3' du COL B. Ce plasmide permet donc d'introduire une cassette d'expression dans les sites uniques cités en (2) placés entre les 2 régions flanquantes (1) et (3). Les virus recombinants ILTV obtenus auront une délétion dans le COL B (entre les sites HindIII et SphI; acides aminés 56 à 279 du
COL B délétés).
Exemple 7: Construction du plasmide donneur pMB039 pour l'insertion dans la région intergénigne entre les COLs B et C
Le plasmide pLP011 (3883 pb) a été digéré par les enzymes EcoRI et HindIII et ligaturé au fragment de restriction de 1021 pb obtenu par digestion du plasmide pLP003 (4665 pb) avec les enzymes EcoRI et Hindili; le plasmide ainsi obtenu (pMB036) a une taille de 4892 pb. Le plasmide pMB036 a été digéré par les enzymes Hindili et ApaI; le plasmide digéré a ensuite été traité à l'ADN polymérase (fragment de Klenow) en présence de dNTP pour rendre les bouts francs; après ligature et transformation de bactéries E. coli, le clone pMB037 (4862 pb) a été obtenu; cette étape de clonage a permis de déléter les sites de clonages compris entre Hindili et Apal dans le plasmide pMB036.
Le plasmide pLP011 (3883 pb) a été digéré par les enzymes EcoRI et HindIII et ligaturé au fragment de restriction de 1021 pb obtenu par digestion du plasmide pLP003 (4665 pb) avec les enzymes EcoRI et Hindili; le plasmide ainsi obtenu (pMB036) a une taille de 4892 pb. Le plasmide pMB036 a été digéré par les enzymes Hindili et ApaI; le plasmide digéré a ensuite été traité à l'ADN polymérase (fragment de Klenow) en présence de dNTP pour rendre les bouts francs; après ligature et transformation de bactéries E. coli, le clone pMB037 (4862 pb) a été obtenu; cette étape de clonage a permis de déléter les sites de clonages compris entre Hindili et Apal dans le plasmide pMB036.
Le plasmide pMB037 a été digéré par les enzymes NotI et BamHI; le plasmide digéré a ensuite été traité à l'ADN polymérase (fragment de Klenow} en présence de dNTP pour rendre les bouts francs; après ligature et transformation de bactéries E. cati, le clone pMB038 (pb) a été obtenu; cette étape de clonage a permis de déléter les sites de clonages compris entre NotI et BamHI dans le plasmide pMB037.
Le plasmide pMB038 a ensuite été digéré par les enzymes BglII et EcoRI; le fragment de 4,5 kpb a ensuite été élué et ligaturé aux oligonucléotides MB090 (SEQ ID NO:8) et MB091 (SEQ ID NO:9) préalablement hybridés. Le plasmide pMB039 (pub) a ainsi été obtenu après transformation de bactéries E. coli (voir schéma d'obtention de pMB039 à la figure 4).
MB090 (SEQ ID NO: 8): 5' GATCGTCGACCCCGGGAAGCTFG 3' MB091 (SEQ ID NO:9): 5' AATTCAAGCTTCCCGGGGTCGAC 3'
Ce plasmide pMB039 contient donc: (1) une séquence homologue en 5' dans le COL
B, (2) une séquence oligonucléotidique insérée contenant les sites uniques EcoRS, SmaI, HindIII et SalI, et (3) une séquence homologue en 3' de la région intergénique entre les COLs B et C. Ce plasmide permet donc d'introduire une cassette d'expression dans les sites uniques cités en (2) placés entre les 2 régions flanquantes (1) et (3). Les virus recombinants ILTV obtenus auront une délétion de 344 pb dans la région intergénique entre les COLs B et C (entre les sites EcoRI et BgllT).
Ce plasmide pMB039 contient donc: (1) une séquence homologue en 5' dans le COL
B, (2) une séquence oligonucléotidique insérée contenant les sites uniques EcoRS, SmaI, HindIII et SalI, et (3) une séquence homologue en 3' de la région intergénique entre les COLs B et C. Ce plasmide permet donc d'introduire une cassette d'expression dans les sites uniques cités en (2) placés entre les 2 régions flanquantes (1) et (3). Les virus recombinants ILTV obtenus auront une délétion de 344 pb dans la région intergénique entre les COLs B et C (entre les sites EcoRI et BgllT).
Exemple 8: Construction du plasmide donneur pMB042 pour l'insertion dans la région génomique à cheval sur le COL B et la région intergénique entre les COLs
B et C
Le fragment de 940 pb obtenu par digestion du plasmide pLP011 (3883 pb) avec les enzymes BamHI et EcoRI, et le fragment de 1754 pb obtenu par digestion du plasmide pLP003 (4665 pb) avec les enzymes EcoRI et SacI, ont été ligaturés au plasmide pBS
SK+ digéré avec les enzymes BamHI et SacI; le plasmide ainsi obtenu (pMB040) a une taille de 5623 pb. Le plasmide pMB039 a été digéré par les enzymes BamHI et XhoI; le plasmide digéré a ensuite été traité à l'ADN polymérase (fragment de Klenow) en présence de dNTP pour rendre les bouts francs; après ligature et transformation de bactéries E. coli, le clone pMB041 (5576 pb) a été obtenu; cette étape de clonage a permis de déléter les sites de clonages compris entra BamIlI et Xhol dans le plasmide pMB040.
B et C
Le fragment de 940 pb obtenu par digestion du plasmide pLP011 (3883 pb) avec les enzymes BamHI et EcoRI, et le fragment de 1754 pb obtenu par digestion du plasmide pLP003 (4665 pb) avec les enzymes EcoRI et SacI, ont été ligaturés au plasmide pBS
SK+ digéré avec les enzymes BamHI et SacI; le plasmide ainsi obtenu (pMB040) a une taille de 5623 pb. Le plasmide pMB039 a été digéré par les enzymes BamHI et XhoI; le plasmide digéré a ensuite été traité à l'ADN polymérase (fragment de Klenow) en présence de dNTP pour rendre les bouts francs; après ligature et transformation de bactéries E. coli, le clone pMB041 (5576 pb) a été obtenu; cette étape de clonage a permis de déléter les sites de clonages compris entra BamIlI et Xhol dans le plasmide pMB040.
Le plasmide pMB041 a ensuite été digéré par les enzymes HindIII et BglII; le fragment de 4,2 kpb a ensuite été élué et ligaturé aux oligonucléotides MB092 (SEQ ID NO: 10) et MB093 (SEQ ID NO: 11) préalablement hybridés. Le plasmide pMB042 (4234 pb) a ainsi été obtenu après transformation de bactéries E. coli (voir schéma d'obtention de pMB042 à la figure 5).
MB092 (SEQ ID NO: 10): 5' AGCTGAAlFCAAGClTCCCGGGGTCGAC 3'
MB093 (SEQ ID NO: 11): 5' GATCGTCGACCCCGGGAAGCN GAAUC 3'
Ce plasmide pMB042 contient donc: (1) une séquence homologue en 5' du COL B, (2) une séquence oligonucléotidique insérée contenant les sites uniques EcoRI, SmaI, HindIII et Salol, et (3) une séquence homologue en 3' de la région intergénique entre les COLs B et C. Ce plasmide permet donc d'introduire une cassette d'expression dans les sites uniques cités en (2) placés entre les 2 régions flanquantes (1) et (3). Les virus recombinants ILTV obtenus auront une délétion de 1366 pb couvrant la partie Cterminale du COL B (les 339 acides aminés C-terminaux du COL B) et la partie 5 de la région intergénique entre les COLs B et C (entre les sites HindIII et BglII, notés à la figure 1).
MB093 (SEQ ID NO: 11): 5' GATCGTCGACCCCGGGAAGCN GAAUC 3'
Ce plasmide pMB042 contient donc: (1) une séquence homologue en 5' du COL B, (2) une séquence oligonucléotidique insérée contenant les sites uniques EcoRI, SmaI, HindIII et Salol, et (3) une séquence homologue en 3' de la région intergénique entre les COLs B et C. Ce plasmide permet donc d'introduire une cassette d'expression dans les sites uniques cités en (2) placés entre les 2 régions flanquantes (1) et (3). Les virus recombinants ILTV obtenus auront une délétion de 1366 pb couvrant la partie Cterminale du COL B (les 339 acides aminés C-terminaux du COL B) et la partie 5 de la région intergénique entre les COLs B et C (entre les sites HindIII et BglII, notés à la figure 1).
Exemple 9: Construction du plasmide donneur pMB043 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène VP2 de l'IBDV sous controle du promoteur HCMV
IE dans le site COL B et isolement de vILTV1: 9.1 - Clonage du gène VP2 du virus de la maladie de Gumboro (IBDV) et construction d'une cassette d'expression de VP2 sous controle du promoteur HCMV IE
Le plasmide pEL004 (voir figure 6; = plasmide pGH004 décrit dans la demande de brevet français 92.13109) contenant le gène IBDV VP2 sous forme d'une cassette
BamHI-HindIII a été digéré par BamHI et XbaI pour isoler le fragment BamHI-XbaI (gène VP2 tronqué) de 1104 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS SK+, préalablement digéré avec XbaI et BamHI pour donner le plasmide pEL022 de 4052 pb (figure 6). Le vecteur pBS-SK+ a été digéré par EcoRV et XbaI, puis ligaturé sur luimême pour donner pBS-SK* (modifié) Le plasmide pELQ04 a été digéré par Kpnl et HindIII pour isoler le fragment KpnI-HindIII de 1387 pb contenant le gène IBDV VP2 complet. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS-SK*, préalablement digéré par
KpnI et HindITI, pour donner le plasmide pEL023 de 4292 pb (figure 6). Le plasmide pEL022 a été digéré par BamHI et NotI pour isoler le fragment BamHI-NotI de 1122 pb (fragment A). Le plasmide pEL023 a été digéré par BamHI et NotI pour isoler le fragment BamHI-NotI de 333 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par NotI et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pEL024 de 4369 pb (figure 6).
IE dans le site COL B et isolement de vILTV1: 9.1 - Clonage du gène VP2 du virus de la maladie de Gumboro (IBDV) et construction d'une cassette d'expression de VP2 sous controle du promoteur HCMV IE
Le plasmide pEL004 (voir figure 6; = plasmide pGH004 décrit dans la demande de brevet français 92.13109) contenant le gène IBDV VP2 sous forme d'une cassette
BamHI-HindIII a été digéré par BamHI et XbaI pour isoler le fragment BamHI-XbaI (gène VP2 tronqué) de 1104 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS SK+, préalablement digéré avec XbaI et BamHI pour donner le plasmide pEL022 de 4052 pb (figure 6). Le vecteur pBS-SK+ a été digéré par EcoRV et XbaI, puis ligaturé sur luimême pour donner pBS-SK* (modifié) Le plasmide pELQ04 a été digéré par Kpnl et HindIII pour isoler le fragment KpnI-HindIII de 1387 pb contenant le gène IBDV VP2 complet. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS-SK*, préalablement digéré par
KpnI et HindITI, pour donner le plasmide pEL023 de 4292 pb (figure 6). Le plasmide pEL022 a été digéré par BamHI et NotI pour isoler le fragment BamHI-NotI de 1122 pb (fragment A). Le plasmide pEL023 a été digéré par BamHI et NotI pour isoler le fragment BamHI-NotI de 333 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par NotI et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pEL024 de 4369 pb (figure 6).
Le plasmide pEL024 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1445 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pCMVB (Clontech Cat# 6177-1, figure 7), préalablement digéré par NotI, pour donner le plasmide pEL026 de 5095 pb (figure 7).
Le plasmide pEL026 a été digéré par EcoRI, SalI et XmnI pour isoler le fragment
EcoRI-SalI de 2428 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pEL027 de 5379 pb (figure 7).
EcoRI-SalI de 2428 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pEL027 de 5379 pb (figure 7).
9.2 - Construction du plasmide donneur pMB043
Le plasmide pEL027 a été digéré par EcoRI, SalI et XmnI pour isoler le fragment
EcoRI-SalI de 2428 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB035 (voir exemple 6 et figure 3), préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pMB043 de 6414 pb (figure 8).
Le plasmide pEL027 a été digéré par EcoRI, SalI et XmnI pour isoler le fragment
EcoRI-SalI de 2428 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB035 (voir exemple 6 et figure 3), préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pMB043 de 6414 pb (figure 8).
9.3 - Isolement et purification du virus recombinant vILTVI
Le virus vILTVl a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB036 préalablement linéarisé par l'enzyme KpnI et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette HCMV-IE/IBDV VP2 dans le
COL B du virus ILTV partiellement délété (voir exemples 5 et 6).
Le virus vILTVl a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB036 préalablement linéarisé par l'enzyme KpnI et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette HCMV-IE/IBDV VP2 dans le
COL B du virus ILTV partiellement délété (voir exemples 5 et 6).
Exemple 10: Construction du plasmide donneur pMB044 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène VP2 de l'IBDV sous controle du promoteur MCMV 'E dans le site COL B et isolement de vILTV2: 10.1 - Construction de pEL070 contenant une cassette d'expression du gène VP2 de t 'IBD V sous controle du promoteur immediate early (IE) du MCMV (Mouse CytoMegalo Virus)
Le plasmide pCMVB (Clontech Cat# 6177-1, figure 9) a été digéré par SalI et SmaI pour isoler le fragment Sall-SmaI de 3679 pb contenant le gène lacZ ainsi que le signal de poly-adénylation du gène tardif du virus SV40. Ce fragment a été inséré dans le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par SalI et EcoRV, pour donner le plasmide pCD002 de 6625 pb (figure 9). Ce plasmide contient le gène reporter lacZ mais aucun promoteur n'est situé en amont de ce gène.
Le plasmide pCMVB (Clontech Cat# 6177-1, figure 9) a été digéré par SalI et SmaI pour isoler le fragment Sall-SmaI de 3679 pb contenant le gène lacZ ainsi que le signal de poly-adénylation du gène tardif du virus SV40. Ce fragment a été inséré dans le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par SalI et EcoRV, pour donner le plasmide pCD002 de 6625 pb (figure 9). Ce plasmide contient le gène reporter lacZ mais aucun promoteur n'est situé en amont de ce gène.
Le virus MCMV souche Smith a été obtenu de l'American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, USA (ATCC N" VR-194). Ce virus a été cultivé sur cellules d'embryon de souris Balb/C et l'ADN viral de ce virus a été préparé comme décrit par
Ebeling A. et al. (J. Virol. 1983. 47. 421-433). Cet ADN génomique viral a été digéré par PstI pour isoler le fragment PstI-PstI de 2285 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par PstI et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pCD004 (figure 9). Le plasmide pCD004 a été digéré par HpaI et PstI pour isoler le fragment HpaI-PstI de 1389 pb qui contient la région promotrice/activatrice du gène Immediate-Early du cytomégalovirus murin (Murine
CytoMegaloVirus = MCMV) (Dorsch-Hàsler K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1985.
Rockville, Maryland, USA (ATCC N" VR-194). Ce virus a été cultivé sur cellules d'embryon de souris Balb/C et l'ADN viral de ce virus a été préparé comme décrit par
Ebeling A. et al. (J. Virol. 1983. 47. 421-433). Cet ADN génomique viral a été digéré par PstI pour isoler le fragment PstI-PstI de 2285 pb. Ce fragment a été cloné dans le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par PstI et traité avec la phosphatase alcaline, pour donner le plasmide pCD004 (figure 9). Le plasmide pCD004 a été digéré par HpaI et PstI pour isoler le fragment HpaI-PstI de 1389 pb qui contient la région promotrice/activatrice du gène Immediate-Early du cytomégalovirus murin (Murine
CytoMegaloVirus = MCMV) (Dorsch-Hàsler K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1985.
82. 8325-8329, et demande de brevet WO-A-87/03905). Ce fragment a été cloné dans le plasmide pCD002, préalablement digéré par PstI et SmaI, pour donner le plasmide pCD009 de 8007 pb (figure 9).
Un oligonucléotide double brin a été obtenu par hybridation des deux oligonucléotides suivants:
MB070 (SEQ ID NO:12) 5' CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGTCGACGGTAC 3' MB071 (SEQ ID NO: 13) 5'CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGAGCT 3'
Cet oligonucléotide double brin a été ligaturé avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par KpnI et SacI, pour donner le plasmide pEL067 (figure 10).
MB070 (SEQ ID NO:12) 5' CGAATTCACTAGTGTGTGTCTGCAGGCGGCCGCGTGTGTGTCGACGGTAC 3' MB071 (SEQ ID NO: 13) 5'CGTCGACACACACGCGGCCGCCTGCAGACACACACTAGTGAATTCGAGCT 3'
Cet oligonucléotide double brin a été ligaturé avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par KpnI et SacI, pour donner le plasmide pEL067 (figure 10).
Le plasmide pCD009 a été digéré par Pstl et SpeI pour isoler le fragment PstI-SpeI de 1396 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le plasmide pEL067, préalablement digéré par
PstI et SpeI, pour donner le plasmide pEL068 de 4297 pb (figure 10). Le plasmide pEL024 (voir exemple 9, paragraphe 9.1 et figure 6) a été digéré par HindIII et NotI pour isoler le fragment HindIII-NotI de 1390 pb (fragment A). Le plasmide pEL027 (voir exemple 9, paragraphe 9.1 et figure 7) a été digéré par HindIII et SalI pour isoler le fragment HindIII-SalI de 235 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le plasmide pEL068, préalablement digéré par NotI et SalI, pour donner le plasmide pEL070 de 5908 pb (figure 10). Ce plasmide contient donc une cassette d'expression constituée du promoteur IE du MCMV, du gène VP2 et du signal polyA de SV40.
PstI et SpeI, pour donner le plasmide pEL068 de 4297 pb (figure 10). Le plasmide pEL024 (voir exemple 9, paragraphe 9.1 et figure 6) a été digéré par HindIII et NotI pour isoler le fragment HindIII-NotI de 1390 pb (fragment A). Le plasmide pEL027 (voir exemple 9, paragraphe 9.1 et figure 7) a été digéré par HindIII et SalI pour isoler le fragment HindIII-SalI de 235 pb (fragment B). Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le plasmide pEL068, préalablement digéré par NotI et SalI, pour donner le plasmide pEL070 de 5908 pb (figure 10). Ce plasmide contient donc une cassette d'expression constituée du promoteur IE du MCMV, du gène VP2 et du signal polyA de SV40.
10.2 - Construction du plasmide donneur pMB044
Le plasmide pEL070 a été digéré par EcoRI, SalI et XmnI pour isoler le fragment
EcoRI-SalI de 3035 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB035 (voir exemple 6 et figure 3), préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pMB044 de 7009 pb (figure 11). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/IBDV-VP2 dans le COL B partiellement délété du virus ILTV.
Le plasmide pEL070 a été digéré par EcoRI, SalI et XmnI pour isoler le fragment
EcoRI-SalI de 3035 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB035 (voir exemple 6 et figure 3), préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pMB044 de 7009 pb (figure 11). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/IBDV-VP2 dans le COL B partiellement délété du virus ILTV.
10.3 - Isolement et purification du virus recombinant vILTV2
Le virus vILTV2 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB044 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/IBDV VP2 dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Le virus vILTV2 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB044 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/IBDV VP2 dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Exemple 11: Construction du plasmide donneur pMB045 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène VP2 de l'IBDV sous controle du promoteur MCMV
IE dans le site intergénique entre les COLs B et C. et isolement de vILTV3:
Le plasmide pEL070 (voir exemple 10 et figure 10) a été digéré par EcoRI, SalI et
XmnI pour isoler le fragment EcoRI-SalI de 3035 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB039 (voir exemple 7 et figure 4), préalablement digéré par EcoRl et
SalI, pour donner le plasmide pMB045 de 7540 pb (figure 12). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/IBDV-VP2 dans la région intergénique partiellement délétée entre les COLs B et C du virus ILTV.
IE dans le site intergénique entre les COLs B et C. et isolement de vILTV3:
Le plasmide pEL070 (voir exemple 10 et figure 10) a été digéré par EcoRI, SalI et
XmnI pour isoler le fragment EcoRI-SalI de 3035 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB039 (voir exemple 7 et figure 4), préalablement digéré par EcoRl et
SalI, pour donner le plasmide pMB045 de 7540 pb (figure 12). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/IBDV-VP2 dans la région intergénique partiellement délétée entre les COLs B et C du virus ILTV.
Le virus vlLTV3 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB045 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/IBDV VP2 insérée dans la région intergénique partiellement délétée entre les COLs B et C du virus ILTV (voir exemples 5 et 7).
Exemple 12: Construction du plasmide donneur pMB046 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène VP2 de l'IBDV sous controle du promoteur MCMV 1E dans la région génomique à cheval sur le COL B et le site intergénique entre les
COLs B et C. et isolement de vILTV4:
Le plasmide pEL070 (voir exemple 10 et figure 10) a été digéré par EcoRI, SalI et
XmnI pour isoler le fragment EcoRI-SalI de 3035 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB042 (voir exemple 8 et figure 5), préalablement digéré par EcoRI et
SalI, pour donner le plasmide pMB046 de 7253 pb (figure 13). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/IBDV-VP2 dans la région génomique à cheval sur le COL B et la région génomique intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV.
COLs B et C. et isolement de vILTV4:
Le plasmide pEL070 (voir exemple 10 et figure 10) a été digéré par EcoRI, SalI et
XmnI pour isoler le fragment EcoRI-SalI de 3035 pb. Ce fragment a été ligaturé dans le plasmide pMB042 (voir exemple 8 et figure 5), préalablement digéré par EcoRI et
SalI, pour donner le plasmide pMB046 de 7253 pb (figure 13). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/IBDV-VP2 dans la région génomique à cheval sur le COL B et la région génomique intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV.
Le virus vILTV4 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB046 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/IBDV VP2 insérée dans la région génomique à cheval sur le COL B et la région génomique intergénique entre les COLs B et C du virus ILTV (voir exemples 5 et 8).
Exemple 13: Construction du plasmide donneur pM1M > 47 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène HN du NDV dans le COL B et isolement de vILTV5: 13.1 - Clonage du gène HN du virus de la maladie de Newcastle (NDV)
La constitution d'une banque d'ADN complémentaire du génome du virus de la maladie de Newcastle (NDV), souche Texas, a été réalisee comme décrit par Taylor J. et al.
La constitution d'une banque d'ADN complémentaire du génome du virus de la maladie de Newcastle (NDV), souche Texas, a été réalisee comme décrit par Taylor J. et al.
(J. Virol. 1990. 64. 1441-1450). Un clone pBR322 contenant la fin du gène fusion (F), la totalité du gène hémagglutinine-neuraminidase (HN) et le début du gène de la polymérase a été identifié pHN01. La séquence du gène NDV HN contenue sur ce clone est présentée sur la figure 14 (SEQ ID NO: 14). Le plasmide pHN01 a été digéré par SphI et XbaI pour isoler le fragment SphI-XbaI de 2520 pb. Ce fragment a été ligaturé avec le vecteur pUC19, préalablement digéré par SphI et Xbal, pour donner le plasmide pHN02 de 5192 pb. Le plasmide pHN02 a été digéré par ClaI et PstI pour isoler le fragment ClaI-PstI de 700 pb (fragment A). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants:
EL071 (SEQ ID NO:15) 5' CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC 3'
EL073 (SEQ ID NO:16) 5' GTATTCGGGACAATGC 3' et la matrice pHN02 pour produire un fragment PCR de 270 pb. Ce fragment a été digéré par HindIII et Pstl pour isoler un fragment HindIII-PstI de 220 pb (fragment B).
EL071 (SEQ ID NO:15) 5' CAGACCAAGCTTCTTAAATCCC 3'
EL073 (SEQ ID NO:16) 5' GTATTCGGGACAATGC 3' et la matrice pHN02 pour produire un fragment PCR de 270 pb. Ce fragment a été digéré par HindIII et Pstl pour isoler un fragment HindIII-PstI de 220 pb (fragment B).
Les fragments A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par ClaI et HindITI, pour donner le plasmide pEL028 de 3872 pb (figure 15). Le plasmide pHN02 a été digéré par BsphI et ClaI pour isoler le fragment
BsphI-ClaI de 425 pb (fragment C). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants:
EL074 (SEQ ID NO:17) 5' GTGACATCACTAGCGTCATCC 3'
EL075 (SEQ ID NO:18) 5' CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3' et la matrice pHN02 pour produire un fragment PCR de 465 pb. Ce fragment a été digéré par BsphI et NotI pour isoler le fragment BsphI-NotI de 390 pb (fragment D).
BsphI-ClaI de 425 pb (fragment C). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants:
EL074 (SEQ ID NO:17) 5' GTGACATCACTAGCGTCATCC 3'
EL075 (SEQ ID NO:18) 5' CCGCATCATCAGCGGCCGCGATCGGTCATGGACAGT 3' et la matrice pHN02 pour produire un fragment PCR de 465 pb. Ce fragment a été digéré par BsphI et NotI pour isoler le fragment BsphI-NotI de 390 pb (fragment D).
Les fragments C et D ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par ClaI et NotI, pour donner le plasmide pEL029bis de 3727 pb (figure 15). Le plasmide pEL028 a été digéré par ClaI et SacII pour isoler le fragment Clal-Sacîl de 960 pb (fragment E). Le plasmide pELO29bis a été digéré par ClaI et
NotI pour isoler le fragment ClaI-Notl de 820 pb (fragment F). Les fragments E et F ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par NotI et
SaclI, pour donner le plasmide pEL030 de 4745 pb (figure 15).
NotI pour isoler le fragment ClaI-Notl de 820 pb (fragment F). Les fragments E et F ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par NotI et
SaclI, pour donner le plasmide pEL030 de 4745 pb (figure 15).
13.2 - Construction du plasmide pMBQ47 contenant une cassette d'expression de HN du NDV dans le COL B
Le plasmide pEL030 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1780 pb (gène NDV HN entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pMB044 (exemple 10, figure 11) à la place du fragment NotI-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pMB047 de 7385 pb (figure 16). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/NDV-HN dans le COL B partiellement délété du virus
ILTV.
Le plasmide pEL030 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1780 pb (gène NDV HN entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pMB044 (exemple 10, figure 11) à la place du fragment NotI-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pMB047 de 7385 pb (figure 16). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/NDV-HN dans le COL B partiellement délété du virus
ILTV.
13.3 - Isolement et punfication du virus recombinant vILTV5
Le virus vILTV5 a été isolé et purifié après cotransfection de i 'ADN du plasmide pMB047 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/NDV HN dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Le virus vILTV5 a été isolé et purifié après cotransfection de i 'ADN du plasmide pMB047 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/NDV HN dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Exemple 14: Isolement d'autres virus recombinants ILTV exprimant le gène HN du virus NDV:
D'une manière similaire à celle décrite dans l'exemple 13 (paragraphes 13.2 et 13.3), le gène HN flanqué de sites NotI (isolé de pEL030, figure 15) peut remplacer le gène
VP2 dans les plasmides pMB045 (figure 12) et pMB046 (figure 13) pour donner des plasmides permettant l'isolement de virus recombinants possédant une cassette d'expression du gène HN du NDV dans la partie intergénique entre les COLs B et C, ou à cheval sur le COL B et la partie intergénique entre les COLs B et C.
D'une manière similaire à celle décrite dans l'exemple 13 (paragraphes 13.2 et 13.3), le gène HN flanqué de sites NotI (isolé de pEL030, figure 15) peut remplacer le gène
VP2 dans les plasmides pMB045 (figure 12) et pMB046 (figure 13) pour donner des plasmides permettant l'isolement de virus recombinants possédant une cassette d'expression du gène HN du NDV dans la partie intergénique entre les COLs B et C, ou à cheval sur le COL B et la partie intergénique entre les COLs B et C.
Exemple 15: Construction du plasmide donneur pMB048 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène F du NDV dans le COL B et isolement de vILTV6: 15.1 - Clonage du gène F du virus de la maladie de Newcastle (NDV
Un clone provenant de la banque d'ADN complémentaire du génome du virus de la maladie de Newcastle (voir exemple 13, paragraphe 13.1) et contenant le gène fusion (F) en entier a été appelé pNDV8 1. Ce plasmide a été décrit précédemment et la séquence du gène NDV F présent sur ce clone a été publiée (Taylor J. et al. J. Virol.
Un clone provenant de la banque d'ADN complémentaire du génome du virus de la maladie de Newcastle (voir exemple 13, paragraphe 13.1) et contenant le gène fusion (F) en entier a été appelé pNDV8 1. Ce plasmide a été décrit précédemment et la séquence du gène NDV F présent sur ce clone a été publiée (Taylor J. et al. J. Virol.
1990. 64. 1441-1450). Le plasmide pNDV81 a été digéré par NarI et PstI pour isoler le fragment NarI-PstI de 1870 pb (fragment A). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants:
EL076 (SEQ ID N" 19) 5' TGACCCTGTCTGGGATGA 3'
EL077 (SEQ ID N" 20) 5' GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC 3' et la matrice pNDV81 pour produire un fragment de 160 pb. Ce fragment a été digéré par PstI et SalI pour isoler le fragment PstI-SalI de 130 pb (fragment B). Les fragments
A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par
Clal et SalI, pour donner le plasmide pEL033 de 4846 pb (figure 17).
EL076 (SEQ ID N" 19) 5' TGACCCTGTCTGGGATGA 3'
EL077 (SEQ ID N" 20) 5' GGATCCCGGTCGACACATTGCGGCCGCAAGATGGGC 3' et la matrice pNDV81 pour produire un fragment de 160 pb. Ce fragment a été digéré par PstI et SalI pour isoler le fragment PstI-SalI de 130 pb (fragment B). Les fragments
A et B ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par
Clal et SalI, pour donner le plasmide pEL033 de 4846 pb (figure 17).
15.2 - Construction du plasmide pMB048 contenant une cassette d'expression du gène
F du NDV dans le COL B
Le plasmide pEL033 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1935 pb (gène F entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pMB044 (exemple 10, figure 11) à la place du fragment Notl-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pMB048 de 7538 pb (figure 18). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/NDV-F dans le COL B partiellement délété du virus ILTV.
F du NDV dans le COL B
Le plasmide pEL033 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 1935 pb (gène F entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pMB044 (exemple 10, figure 11) à la place du fragment Notl-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pMB048 de 7538 pb (figure 18). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/NDV-F dans le COL B partiellement délété du virus ILTV.
15.3 - Isolement et purification du virus recombinant vlLTV6
Le virus vILTV6 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB048 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/NDV F dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Le virus vILTV6 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB048 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/NDV F dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Exemple 16: Construction d'un plasmide donneur pour l'insertion d'une double cassette d'expression des gènes HN et F du NDV dans le site COL B et isolement d'un virus recombinant ILTV:
Une double cassette d'expression de deux gènes, par exemple les gènes HN et F du virus NDV, peut être construite. Une telle construction est schématisée à la figure 19.
Une double cassette d'expression de deux gènes, par exemple les gènes HN et F du virus NDV, peut être construite. Une telle construction est schématisée à la figure 19.
Dans cette construction, l'extrémité 5' des deux promoteurs sont adjacentes de manière que la transcription des deux gènes se fasse en sens opposés. Un des deux promoteurs est de préférence un promoteur CMV lE et l'autre promoteur (appelé promoteur associé) est n'importe quel promoteur actif en cellules eukaryotes d'origine virale (et notamment d'herpèsvirus) ou non. Dans cette configuration, le promoteur associé est activé par la région activatrice du promoteur CMV IE.
Cette double cassette d'expression peut ensuite être insérée dans un des 3 plasmides donneurs décrits ci-dessus (pMB035, pMB039 et pMB042 décrits dans les exemples 6, 7 et 8 et représentés dans les figures 3, 4 et 5 respectivement).
L'isolement des virus recombinants se fait de la même manière que ci-dessus (voir exemple 3).
Exemple 17: Construction du plasmide donneur pMB049 pour l'insertion d'une cassette d'expression du gène 9B du MDV dans le COL B et isolement de vILTV7: 17.1 - Clonage du gène gB du virus de la maladie de Marek
Le fragment EcoRI-SalI de 3,9 kpb de l'ADN génomique du virus MDV souche RB1B contenant le gène MDV gB (séquence publiée par Ross N. et al. J. Gen. Virol. 1989.
Le fragment EcoRI-SalI de 3,9 kpb de l'ADN génomique du virus MDV souche RB1B contenant le gène MDV gB (séquence publiée par Ross N. et al. J. Gen. Virol. 1989.
70. 1789-1804) a été ligaturé avec le vecteur pUC13, préalablement digéré par EcoRI et SalI, pour donner le plasmide pCD007 de 6543 pb (figure 20). Ce plasmide a été digéré par SacI et XbaI pour isoler le fragment SacI-XbaI de 2260 pb (partie centrale du gène gB = fragment A). Une PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants: CDOOl (SEQ ID NO:21) 5' GACTGGTACCGCGGCCGCATGCACTTTTTAGGCGGAATTG 3'
CD002 (SEQ ID NO:22) 5' TTCGGGACATTTTCGCGG 3' et la matrice pCD007 pour produire un fragment PCR de 222 pb. Ce fragment a été digéré par KpnI et XbaI pour isoler un fragment KpnI-XbaI de 190 pb (extrémité 5' du gène gB = fragment B). Une autre PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants:
CD003 (SEQ ID NO:23) 5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3'
CD004 (SEQ ID NO:24) 5' TTGCGAGCTCGCGGCCGCTTATTACACAGCATCATCTTCTG 3' et la matrice pCD007 pour produire un fragment PCR de 195 pb. Ce fragment a été digéré par SacI et SacII pour isoler le fragment SacI-SacII de 162 pb (extrémité 3' du gène gB = fragment C). Les fragments A, B et C ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par KpnI et SacI, pour donner le plasmide pCD011 de 5485 pb (figure 20).
CD002 (SEQ ID NO:22) 5' TTCGGGACATTTTCGCGG 3' et la matrice pCD007 pour produire un fragment PCR de 222 pb. Ce fragment a été digéré par KpnI et XbaI pour isoler un fragment KpnI-XbaI de 190 pb (extrémité 5' du gène gB = fragment B). Une autre PCR a été réalisée avec les oligonucléotides suivants:
CD003 (SEQ ID NO:23) 5' TATATGGCGTTAGTCTCC 3'
CD004 (SEQ ID NO:24) 5' TTGCGAGCTCGCGGCCGCTTATTACACAGCATCATCTTCTG 3' et la matrice pCD007 pour produire un fragment PCR de 195 pb. Ce fragment a été digéré par SacI et SacII pour isoler le fragment SacI-SacII de 162 pb (extrémité 3' du gène gB = fragment C). Les fragments A, B et C ont été ligaturés ensemble avec le vecteur pBS-SK+, préalablement digéré par KpnI et SacI, pour donner le plasmide pCD011 de 5485 pb (figure 20).
17.2 - Construction du plasmide pMB049 contenant une cassette d'expression du gène gB du MDV dans le COL B
Le plasmide pCD011 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 2608 pb (gène gB MDV entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pMB044 (exemple 10, figure 11) à la place du fragment NotI-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pMB049 de 8213 pb (figure 21). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/MDV-gB dans le COL B partiellement délété du virus
ILTV.
Le plasmide pCD011 a été digéré par NotI pour isoler le fragment NotI-NotI de 2608 pb (gène gB MDV entier). Ce fragment a été inséré dans les sites NotI du plasmide pMB044 (exemple 10, figure 11) à la place du fragment NotI-NotI de 1405 pb contenant le gène codant pour la protéine VP2 de l'IBDV; ce clonage a permis d'isoler le plasmide pMB049 de 8213 pb (figure 21). Ce plasmide permet l'insertion de la cassette d'expression MCMV-IE/MDV-gB dans le COL B partiellement délété du virus
ILTV.
17.3 - Isolement et purification du virus recombinant v1LTV7
Le virus vILTV7 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB049 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/MDV gB dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Le virus vILTV7 a été isolé et purifié après cotransfection de l'ADN du plasmide pMB049 préalablement linéarisé par l'enzyme BssHII et de l'ADN viral, comme décrit dans l'exemple 3. Ce recombinant contient une cassette MCMV-IE/MDV gB dans le
COL B partiellement délété du virus ILTV (voir exemples 5 et 6).
Exemple 18: Construction d'un plasmide donneur pour l'insertion d'une cassette d'expression de gènes de l'IBV dans le COL B et isolement de virus recombinant
ILTV:
Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de simples cassettes (exemples 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 et 17) ou pour l'insertion de doubles cassettes (exemple 18), dans les trois sites décrits ci-dessus (exemples 6, 7 et 8), il est possible de réaliser des virus ILTV recombinants exprimant à un niveau élevé sous controle du promoteur associé.
ILTV:
Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de simples cassettes (exemples 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 et 17) ou pour l'insertion de doubles cassettes (exemple 18), dans les trois sites décrits ci-dessus (exemples 6, 7 et 8), il est possible de réaliser des virus ILTV recombinants exprimant à un niveau élevé sous controle du promoteur associé.
Exemple 19: Construction de plasmides donneurs pour l'insertion de cassettes d'expression de gène(s) d'autres agents pathogènes aviaires ou de peptide immunomodulateur dans les trois sites décrits et isolement de virus recombinants
ILTV:
Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de simples cassettes (exemptes 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 et 17) ou pour l'insertion de doubles cassettes (exemple 18), dans les trois sites décrits ci-dessus (exemples 6, 7 et 8), il est possible de réaliser des virus ILTV recombinants exprimant à un niveau élevé des immunogènes du CAV (et notamment une double cassette d'expression des gènes codant pour VP1 et pour VP2), du virus de la pneumovirose du poulet, ou d'autres agents pathogènes aviaires, ou encore des peptides immunomodulateurs et notamment des cytokines.
ILTV:
Selon la même stratégie que celle décrite plus haut pour l'insertion de simples cassettes (exemptes 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 et 17) ou pour l'insertion de doubles cassettes (exemple 18), dans les trois sites décrits ci-dessus (exemples 6, 7 et 8), il est possible de réaliser des virus ILTV recombinants exprimant à un niveau élevé des immunogènes du CAV (et notamment une double cassette d'expression des gènes codant pour VP1 et pour VP2), du virus de la pneumovirose du poulet, ou d'autres agents pathogènes aviaires, ou encore des peptides immunomodulateurs et notamment des cytokines.
Exemple 20: Production de vaccins:
Les virus recombinants obtenus selon l'invention sont produits sur oeufs embryonnés.
Les virus recombinants obtenus selon l'invention sont produits sur oeufs embryonnés.
La solution virale récoltée est ensuite diluée dans une solution stabilisatrice pour la lyophilisation, répartie à raison de 1000 doses vaccinales par flacon, et enfm lyophilisée.
Claims (19)
1 - Vaccin vivant recombinant aviaire comprenant, comme vecteur, .virus
ILTV comprenant et exprimant au moins une séquence nucléotidique hétérologue, cette séquence nucléotidique étant insérée dans le locus d'insertion défini entre les nucléotides 1624 et 3606 à la SEQ ID NO:5.
2 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les séquences nucléotidiques sont insérées par insertion simple, ou après délétion totale ou partielle du locus d'insertion.
3 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la ou les séquences nucléotidiques sont insérées dans le COL B apparaissant entre les nucléotides 1713 et 2897 à la SEQ ID NO:5.
4 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la ou les séquences nucléotidiques sont insérées dans la région intergénique définie entre les nucléotides 2898 et 3606 à la SEQ ID NO:5.
5 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, pour exprimer la séquence nucléotidique insérée, le vecteur comprend un promoteur eucaryote fort.
6 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que le promoteur fort est choisi parmi le groupe consistant en: promoteur CMV immediateearly, de préférence le promoteur CMV immediate-early murin ou humain, promoteur
LTR du virus du Sarcome de Rous (RSV), promoteur précoce du virus SV40.
7 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux séquences nucléotidiques insérées dans le locus d'insertion sous le contrôle de promoteurs eucaryotes différents.
8 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que les promoteurs eucaryotes sont des promoteurs CMV immediate-early d'origines animales différentes.
9 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend une première séquence nucléotidique associée au promoteur CMV immediate early et un autre promoteur sous la dépendance duquel se trouve une autre séquence nucléotidique, ces deux promoteurs étant disposés de manière que leurs extrémités 5' soient adjacentes.
10 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide antigénique d'un agent pathogène aviaire, cette séquence étant insérée dans le locus d'insertion.
11 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence codant pour un antigène d'un agent pathogène aviaire choisi parmi le groupe consistant en le virus de la maladie de Newcastle (NDV), le virus de la maladie de Gumboro (IBDV), le virus de la maladie de Marek (MDV), le virus de la bronchite infectieuse (IBV), le virus de l'anémie du poulet (CAV), le virus de la pneumovirose du poulet.
12 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique, choisie parmi les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides F et HN du virus NDV.
13 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique, choisie parmi les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides gB, gD, gH+gL du virus MDV.
14 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique choisie parmi le groupe des séquences correspondant aux antigènes VP2 de l'IBDV, aux antigènes S, ou partie de S, M et N du virus IBV, aux antigènes VP1 et VP2 du CAV, aux antigènes G et F du virus de la pneumovirose du poulet.
15 - Vaccin vivant recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide immunomodulateur, cette séquence étant insérée dans le locus d'insertion.
16 - Vaccin vivant recombinant selon la revendication 15, caractérisé en ce que cette séquence nucléotidique est choisie parmi le groupe des séquences codant pour des cytokines.
17 - Formule de vaccin multivalent comprenant, en mélange ou à mélanger, au moins deux vaccins vivants recombinants tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 16, ces vaccins comprenant des séquences insérées différentes.
18 - Fragment d'ADN comprenant tout ou partie de la séquence définie par les positions 1 à 3841 sur la séquence SEQ ID NO:5.
19 - Un virus ILTV comprenant au moins un séquence nucléotidique hétérologue insérée dans le locus d'insertion défini entre les nucléotides 1624 et 3606 à la SEQ ID
NO:5.
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| TNTNSN97109A TNSN97109A1 (fr) | 1996-06-27 | 1997-06-25 | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire |
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| EP97930591A EP0914458A1 (fr) | 1996-06-27 | 1997-06-25 | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire |
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| PE1997000548A PE52599A1 (es) | 1996-06-27 | 1997-06-27 | Vacuna viva recombinante aviaria, que comprende como vector el virus de la laringotraqueitis infecciosa |
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