KR100244601B1 - 재조합형 아비폭스 바이러스,이 바이러스에 의하여 감염된 세포의 배양,이 바이러스로부터 유도된 가금용 왁찐 - Google Patents

Abstract

본발명은 게놈의 비필수 부분에 아비폭스 바이러스에 대하여 이종인 단백질의 모두 또는 부분을 기호화하는 최소한 하나의 DNA 배열을 함유하고, 아비폭스 바이러스의 독성 약화된 균주로부터 유도된 재조합형 바이폭스 바이러스에 관한 것이며, 여기서 게놈의 비필수 부분은 TIRs(말단 역방향 반복영역)의 유전자간 영역으로 구성된다.

또한 본발명은 이러한 바이러스로 감염된 세포의 배양, 이러한 재조합형 아비폭스 바이러스를 함유하는 왁찐과, 바이러스에 대하여 이종인 단백질의 모두 또는 부분을 표현할 수 있는 벡터로서의 이러한 바이러스의 용도에 관한 것이다.

Description

재조합형 아비폭스 바이러스, 이 바이러스에 의하여 감염된 세포의 배양, 이 바이러스로부터 유도된 가금용 왁찐

제1도는 재조합형 아비폭스 바이러스의 구조도.

제2도는 장방형으로 기호화된 우측 TIR (TIR-R)과 좌측 TIR (TIR-L)을 갖고 선으로 기호화된 독특 배열을 갖는 가금폭스 게놈의 말단의 계통도.

제3도는 몇몇 독특 부위와 ORFs 의 위치에 대한 플라스미드 pTIRB1(PTIRB1)의 제한 효소지도.

제4도는 제3도와 유사한 플라스미드 pTIRB2(PTIRB2)의 제한 효소지도.

제5도는 플라스미드 p11Lac(P11LAC)의 제한 효소지도.

제6도는 Lacz 유전자를 TIRs 에 접합전달한 벡터의 예시도.

제7도는 Lacz 유전자(음영장방형으로표시)를 CNP 게놈 내부에 삽입함을 나타낸 계통도.

제8도는 IBDV로부터의 분절A, 프라이머의 위치와 에드갈 균주로부터 분절A의 RNA 의 증폭에 의해서와 역전사에 의하여 얻은 각종 단편을 나타내는 도면.

제9도(제9a도 내지 제9e도)는 에드갈 균주로부터의 분절 A의 RNA 에 해당하는 증폭된 DNA 의 누클레오티드 배열과 ORFs 1,2와 3의 아미노산으로의 번역을 나타낸 도면.

제10도는 역전사와 증폭에 의하여 얻은 단편을 사용하여 에드갈 균주로 부터의 분절A에 해당하는 DNA 분절의 재구성을 나타낸 계통도.

제11도는 플라스미트 pTIR75E1LAC (PTIR75E1LAC)의 제한 효소지도.

제12(a와 b)도는 ELISA 시험에 의하여 FPV/IBDV 재조합으로 표현된 IBDV 단백질의 특성을 나타낸 그래프.

제13도는 FPV/IBDV 재조합으로 표현된 IBDV 단백질의 서부블롯 분석에 의한 특성을 나타낸 도면.

본 발명은 아비폭스 바이러스로부터 특히 통상 가금폭스라 불리우는 가금두창에 있는 바이러스로부터 유도된 재조합형 바이러스에 관한 것이다. 또한 본발명은 세포 배양에 의한 이들 바이러스의 제조방법, 왁찐을 제조하기 위한 이들 바이러스의 용도와 이들 바이러스를 함유하는 왁찐에 관한 것이다. 그리고, 본 발명은 이들 재조합형 바이러스를 게놈에 삽입하는 접합 전달 배열및 이들 배열을 갖는 플라스미드에 관한 것이다.

가금 두창 또는 가금 폭스 바이러스(FPV)에 있는 바이러스는 폭스바이러스과의 아비폭스 속에 속한다.

가금 폭스 바이러스는 폭스 바이러스의 전형적인 특성을 갖는다. 이들은 게놈이 약 300kb의 선형 이중-가닥의 DNA 이고, 단일-가닥의 말단이 공유 결합된 대형 바이러스이다. 약 20kb의 게놈은 특히 말단 역방향 중복(TIR)배열(1989, 캄프벨등., 1988, 톰리 등.,)로 배열된다. 말단 역방향 중복 배열은 역방향으로 게놈의 각 말단에 존재하는 두 동일한 긴 배열이다.

우두 바이러스 또는 우두는 이질 단백질을 나타낼 수 있는 생재조합형 바이러스로서 발육되는 첫번째 폭스이다. 표현된 단백질의 리스트는 매우 깊다. 특히 많은 이질 항원의 표현은 각종 질병에 대하여 면역을 얻을 수 있게 한다.

왁찐을 제조하기 위한 이종 단백질을 표현하기 위한 벡터로서 가금 폭스 바이러스의 사용, 다시 말해서 게놈의 비 암호 유전자간 영역내부에서 이종 단백질을 기호화한 DNA 배열을 총합한 재조합형 바이러스의 사용은 유럽특허 출원 제 0,314,569호에 기재되어 있으며; 이 영역은 개방형 판독틀(ORF) ORF 7 과 ORF 9사이에 위치하고 있는 32누클레오티드의 짧은 배열이며 유전적으로 비필수적 부위에 배열되어 있다. 이와같은 짧은 유전자간 영역에 있어서는 이러한 유전자로부터 전사신호를 분리하고 그 결과, 이러한 유전자를 비활성화 하는 돌연변이를 도입하는 삽입의 큰 위험이 있다. 이것은 다음과 같은 경우로 나타낼 수 있다: 이러한 32-누클레오티드 배열은 ORF 9의 프로모터와 0RF 7의 3' 암호 배열사이의 중첩을 가능한 피하기 위하여 55누클레오티드로 확장되어 하기 때문에 실제 필수 영역으로 나타난다. ORF 7과 ORF 9를 분리하는 영역의 경우에, 자연 배열로 삽입은 더욱 불안정하고(스페너등., 1990) 짧은 유전자간 영역을 배열하는 제안된 방법은 보편화될 수없다.

더우기 재조합형 가금 폭스 바이러스와 이질 DNA 을 티미딘 키나아제 유전자로 삽입하므로서 특성을 나타내는 기타 재조합형 가금 폭스 바이러스의 구조는 국제 특허출원 제 WO88/02022호에 제안되어 있다. 이러한 삽입은 바이러스 감염을 약화시킬 수 있는 유전자에 돌연변이를 창출시킬 수 있다. 이것은 균주의 과대한 독성감소와 재조합형 바이러스로부터 유도된 왁찐의 면역성 감소의 위험을 가져온다.

또한, 이종 단백질의 표현을 위한 벡터로서 재조합형 가금 폭스 바이러스의 사용은 유럽측허출원 제 0,353,851호에 기재되어 있다. 바이러스 게놈으로 이질 유전자의 삽입은 말단 역방향 중복배열(TIR) 내부에 위치하고 있는 개방형 판독틀 내에서 행한다. 개방형 판독틀에 하나 또는 그 이상의 이질 유전자의 삽입은 기능이 알려져 있지 않는 유전자의 돌연변이를 일으킬 위험이 있다.

본 발명은 하나 또는 그 이상의 이질 유전자를 바이러스 게놈으로 삽압하기 위한 다른 영역을 제공하는데 있으며, 이는 상술한 삽입 영역의 결함을 갖지 않는다.

이러한 점에서, 본 발명은 아비폭스 바이러스의 독성 약화된 균주에서 유도되고, 재조합형 바이러스에 의하여 감염된 세포 내부에서 이러한 단백질의 표현을 확보할 수 있는 요소는 물론 아비폭스 바이러스에 대하여 이질인 모든 또는 부분적 단백질을 기호화하는 최소한 하나의 DNA 배열을 이러한 게놈의 비필수적 부분으로 함유하는 재조합형 아비폭스 바이러스에 관한 것이며, 여기서 비필수적 부분의 게놈은 영역이 이들의 표현 신호를 포함하는 두 개방형 판독틀 사이에 위치하는, 아비폭스 바이러스의 비암호화 유전자간 영역으로 구성된다.

아비폭스 바이러스 게놈의 비필수적 부분은 생체외 및 생체내에서 바이러스의 발육에 포함되는 기능에는 영향을 받지 않고 변경될 수 있는 영역을 의미한다. 즉 이들의 표현 신호를 포함하는 두 ORFs 사이에 위치하고 있는 게놈의 비암호화 유전자간 영역은 비필수적 부분으로 선택된다.

본 발명에 따른 유전자간 영역은 크므로, 이들 각 유전자의 전사용 신호를 분리시키는 삽입의 위험은 적고 또한 이들을 배열하는 것도 필수치 않다. 더우기, 이들 유전자간 영역의 배열은 비암호화되므로 ORF 내부에서의 돌연변이의 위험은 없다. 큰 영역이란 60 이상의 누클레오티드의 배열을 갖는 영역을 의미한다. 일반적으로 100이상의 누클레오티드의 배열을 갖는 영역을 선택하며, 바람직하기로는 200이상의 누클레오티드의 배열을 갖는 영역을 선택하는 것이다. 특히 바람직한 방법으로는, 400이상의 누클레오티드의 배열을 갖는 영역을 선택하는 것이다.

더우기, 최소한 하나의 배열을 클론화한, 아비폭스 바이러스의 두 TIR 영역중 하나의 내부에 위치하는 유전자간 영역을 일반적으로 선택한다. 통상, 최소한 하나의 DNA 배열은 아비폭스 바이러스의 두 TIR 영역중 최소한 하나로 클론화된다. 바람직하기로는 최소한 하나의 DNA 배열을 바이러스의 두 TIR 영역으로 클론화하는 것이다. 특히 바람직한 것은, β1영역이라고 하는 유전자간 영역과/ 또는 β2영역이라고 하는 유전자간 영역을 선택하는 것이며; TIRs 내에 존재하는 BamH1 제한 효소 부위를 출발 투클레오티드로 취하여, β1영역이라고 하는 유전자간 영역은 누클레오티드 1675와 2165사이에 위치하고 β2영역이라고 하는 유전자간 영역은 누클레오티드 2672와 3605사이에 위치한다. 유전자간 영역을 위치시키기 위하여 여기서 선택된 이 BamH1 제한효소 부위는 1988, 톰리등에 의하여 발표된 배열의 첫번째 누클레오티드이다. 또한 본 발명에 따른 이러한 영역은 다음과 같이 정의될 수 있다: β₁영역이라 불리우는 유전자간 영역은 개방형 판독틀 ORF 1과 ORF 2사이에 위치하며, TIRs 내의 BamH1 제한효소 부위를 출발 클레오티드로 취하여, 개방형 판독틀 ORF 2 는 누클레오티드 2166-ATG 의 누클레오티드-와 2671-종지 암호의 누클레오티드 A-사이에 위치되며, β2영역이라 불리우는 유전자간 영역은 개방형 판독틀 ORF 2와 ORF 3사이에 위치하며, TIRs 내의 BamH1 제한 효소 부위를 출발 누클레오티드로 취하여, 개방형 판독틀 ORF2는 누클레오티드 2166-ATG 의 누클레오티드 A-와 2671-종지암호의 세번째 누클레오티드-사이에 위치하고, 개방형 판독틀 ORF3 는 누클레오티드 3606-종지암호의 세번째 누클레오티드-와 4055-ATG 의 누클레오티드 A-사이에 위치한다. 특히 바람직한 방법으로는 β1영역내에서는 누클레오티드 1775와 2065사이에 위치하는 부분을 β2영역내에서는 누클레오티드 2772과 3505사이에 위치하는 부분을 선택하는 것이다. 좋은 결과는 β1영역내에 위치하는 B1 삽입 부위라 불리우는 누클레오티드 1842의 수준에서, 와/또는 2영역내에 위치하는 B2 삽입 부위라 불리우는 누클레오티드 3062의 수준에서 클론화하여 얻는다.

최소한 하나의 DNA 배열을 β2영역으로 클론화할 때 좋은 결과는 아비폭스 바이러스의 두 TIR 영역중 하나 내에서 얻는다. 또한 DNA배열은 β1영역으로 클론화할 때, 두 TIRs 의 각각의 내에서도 좋은 결과를 얻는다. 이것은 게놈 당이종 DNA 배열의 두 복제를 얻을 수 있기 때문에 본발명의 또 다른 장점을 나타낸다.

감쇠된 이비폭스 바이러스 균주로부터 유도된 재조합형 아비폭스 바이러스는 아비폭스속에 속하는 바이러스를 의미하며, 이로서 독성이 약화되고 이의 게놈이 표현신호에 따르는 이종 배열을 함유한다. 일반적으로 가금폭스, 비둘기폭스 또는 카나리아 폭스와 같은 아비폭스 속의 바이러스가 바이러스로서 사용된다. 통상, 가금폭스가 바이러스로서 사용된다. 바람직하기로는 상표 POXINE 으로 솔베이 회사에서 제조판매하고 있는 왁찐 또는 상표 CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE 와 POULVAC P로 솔베이 회사에서 제조판매하고 있는 왁찐과 같은 수두 바이러스 또는 가금 폭스의 왁찐 균주는 가금 폭스바이러스로 사용된다. 특히 바람직한 방법으로는, 상표 CHICK-N-POX, POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, POULVAC POXINE 과 POULVAC P 약칭 CNP 로 솔베이 회사에서 판매하고 있는 왁찐을 가금폭스 바이러스로 사용하는 것이다.

바이러스가 배양된 세포에 적응하면 독성약화는 배에 계속 통과시켜서 또는 세포배지에 통과시켜서 얻는다.

상기 재조합형 바이러스에 의하여 감염된 세포에 이종 단백질을 기호화한 유전자의 표현을 확보할 수 있는 요소는 유전자 표현의 신호를 의미하여, 이는 바이러스, 특히 포로모터와 터미네이터, 예를들면 1990, 모스에 의하여 특히 서술된 본분야의 전문가에 알려져 있는 요소에 의하여 인식된다. 일반적으로 폭스 프로모터를 사용하며, 통상, 우두 또는 가금폭스 프로모터를 사용한다.

바람직하기로는, 1981, 벤카테산 등, 1985, 코크란등과 1985, 버톨릿에 의하여 서술된 바와 같은 우두에서 나온 프로모터 P11 과 프로모터 P7.5를 사용하는 것이다.

이비폭스 바이러스에 대하여 이종인 단백질의 모두 또는 부분을 기호화한 최소한 하나의 DNA 배열은 표현 신호에 따른 게놈, 또는 cDNA복제 또는 선택적인 합성 DNA 에서 추출한 DNA단편을 의미하며, 이의 배열은 아비폭스에 대하여 이질인 단백질의 모두 또는 부분을 기호화한다.

제 1 도 내지 제 11도는 본 발명의 이해를 더 좋게하기 위하여 제작되었다.

제 1 도에서 가금폭스 바이러스(FPV)로 감염된 세포는 접합전달 플라스미드로 트란스펙트[T:트란스펙션(Transfection)]된다. 이 플라스미드는 배향된 프로모터(Pr)를 가지므로 바이러스 DNA 배열에 의하여 어느 한쪽에 근접되어 있는 인접한 이종 유전자(g)의 표현을 허용한다. 동질 재조합(R)은 유전자에 근접한 배열과 바이러스 게놈에 존재하는 배열사이의 세포(C)의 세포질내에서 일어난다. 이것은 바이러스 게놈으로 이종 유전자의 삽입을 가져온다. 이 게놈은 패키지 될 수 있고 재조합형 바이러스 입자를 생성시킬 수 있다. N는 세포(C)의 핵을 나타낸다.

제 2 도에 있어서, 대시는 게놈의 중앙 영역을 기호화한 것이다. TIR-L 의 EcoR1 제한 효소 단편은 6.2kb인데 반하여 TIR-R 의 것은 9.6kb이다. 이러한 대표적 게통도는 이들 두 단편이 통상의 배열과 독특 배열을 가짐을 나타낸다. TIRs내의 EcoR1 하류에 위치하고 있는 BamH1 부위를 나타낸다.

제 3 도에 있어서, 독특 BamH1 부위는 이종 유전자를 클론화하는데 사용된다. ori(0RI) : 에스케리키아 콜리(이.콜리)내의 플라스미드의 복제의 원종;

Ap : 암피실린에 대하여 내성을 갖는 유전자; ORF1 내지 ORF6 : 가금폭스 개방형 판독틀.

제 4 도는 도면의 간단한 설명에 기재된 바와 같다.

제 5 도에 있어서, 이 플라스미드는 우두 프로모터 P11의 억제하에 이.콜리 LacZ유전자를 갖는다. P11: 우두 프로모터 P11; LACZ:β-갈락토시다제-기호화 유전자; ori: 이.콜리복제의 원종; 가닥 +:파아지 M13 내에서 패키지된 가닥; Ap : 암피실린에 대하여 내성을 갖는 유전자.

제 6 도에 있어서, 이 벡터는 pTIRB1P75Lac (PTIRB1P75LAC)이다. 카셋트 P7.5-LacZ는 시침 방향에서 pTIRB1 의 BamH1 부위로 클론화된다.

제 7 도에 있어서, 카셋트 P7.5-LacZ와 P11-LacZ는 어느 한 방향에서 말단영역(TIR)으로 삽입된다. 우측 TIR 영역은 나타나지 않는다. 화살표는 장방형으로 표시되는 유전자의 전사방향을 나타낸다. 척도는 정확하지 않다.

제 8 도에 있어서,

A : ORFs 의 조직

P : 분절 A의 증폭을 행하는데 사용된 "프라이머"

〉,〈 : 분절 A의 암호 배열에 관한 "프라이머"의 방향

fgt PCR : 분절 A의 RNA 의 증폭에 의하여 발생되는 단편

pb : 염기쌍

제 9 도(제9a도 내지 제9e도)에 있어서, 프라이머 0, 1, 1b, 2, 3, 4, 5와 6 : 에드갈 균주로부터 분절 A에 해당하는 DNA 단편을, 역전사에 의해서와 증폭에 의하여, 발생시키는데 사용되는 프라이머 제 10 도는 도면의 간단한 설명에 기재된 바와 같고, * : 부위-방향 돌연변이 유발.

제 11 도는 도면의 간단한 설명에 기재된 바와 같다.

굵은 선으로 표시된 플라스미드 부분은 FPV 게놈에 대하여 동종인 배열에 해당한다. ori(ORF) : 이.콜리 내의 플라스미드 복제의 원종:Ap : 암피실린에 대하여 내성을 갖는 유전자;P7.5 : 우두 프로모터 P7.5; ORF1-IBDV : 에드갈 균주로 부터의 분절A의 ORF1 ; P11:우두 프로모터 P11 ; LACZ:β-갈락토시다제-기호화 유전자; pb:염기쌍; ORF1내지 ORF6: 가금폭스의 개방형 판독틀.

제 12 도에 있어서, 특성화는 다음과 같이 행한다: 50㎕의 세포성 현탁액과 계단 희석법에 의한 이들 현탁액의 2배의 희석액을 웰마다 주입한다. 두번째 항-IBDV항체(단클론 항-VP3 또는 항-VP2)를 배양시킨 후, 알카리 포스포타아제에 접합된 바이오틴 + 스트렙타비딘으로 표시된 마우스 항-IgG 시스템에 의하여 신호를 증폭시킨다.

제 12a 도는 항-VP3단클론 항체에 의한 검출에 해당하고, 제 12b 도는 항-VP2단클론 항체에 의한 검출에 해당한다.

이들 도면에서, X-축은 로그단위로 2-배로 단계 희석한 세포성 추출물을 나타내고 Y-축은 690nm과 405nm에서 측정한 흡수율을 나타낸다.

제 13 도에 있어서, 이러한 특성화는 다음과 같이 행한다: 세포성 현탁액을 3,000g에서 원심분리하고 얻은 상청액을 185,000g에서 초원심분리한다; 두 원심분리에서 나온 펠릿을 푸울에 넣고 PBS 완충제(인산염 완충염, 지브코)에 재 현탁시킨다.

FPV/IBDV 재조합체용 20-40㎍의 단백질과 IBDV 감염세포(정의 억제)용 5㎍의 주입물을 웰 마다 SDS-아크릴아미드 겔에 주입한다. 막에 접합 전달한 다음, 제13a도의 IBDV 단백질 모두를 인식하는 다클론 혈청에 의하여 또는 제 13b 도의 항-VP3 단클론 항체에 의하여 IBDV단백질을 검출한다. 신호의 증폭은 바이오틴과 접합 스트렙타비딘-알카리 포스파타아제로 표지된 항-IgG 시스템으로 행한다. PM:분자량 표지단백질

본 발명을 이행하는데 사용되는 방법은 제1도에 개략적으로 표시되어 있다(1984, 맥킷 등에 의하여 변경).

아비폭스 또는 가금폭스로 감염된 세포는 접합 전달 플라스미드로 트란스펙트된다. 이러한 플라스미드는 적당히 방향을 갖는 프로모터를 가지므로 바이러스 DNA 배열에 의하여 어느 한쪽에 근접된 인접한 이종 유전자의 표현을 허용한다. 동종 재조합은 유전자가 근접한 배열과 바이러스 게놈에 존재하는 배열 사이의 세포의 세포질 내에서 일어난다. 이로부터 이종 유전자가 바이러스 게놈으로 삽입된다. 이 게놈은 패키지 될 수 있고 재조합형 바이러스 입자를 생성할 수 있다. 폭스로 세포를 감염시켜서 삽입한 다음 플라스미드를 통하여 접합 전달하는 이러한 방법은 우두에서 개발되어 있고 재조합형 폭스 바이러스(1985, 맥킷 등)의 구조를 위한 많은 실험에 통상 사용되고 있다.

본 발명에 따른 방법은 다음과 같은 단계로 통상 이루어진다:

-첫째 단계는 스크리닝을 허용하는 접합전달 플라스미드를 구성하는 것으로 이루어지고,

-둘째 단계는 이종 항원을 기호화한 유전자를 접합 전달 플라스미드로 클론화 하는 것으로 이루어지고,

-셋째 단계는 재조합형 아비폭스 바이러스를 구성하는 것으로 이루어지고,

-넷째 단계는 재조합형 바이러스를 상요하여 예방접종 시험을 행하는 것으로 이루어진다.

바람직하기로는 본 방법이 다음 단계를 포함하는 것이다:

a. 스크리닝을 허용하는 접합 전달 플라스미드의 구성:

-TIR-함유 단편의 클론화

-TIRs로 클론 부위의 삽입

-LacZ 유전자를 갖는 카셋트와 P11 또는 P7.5의 이의 클론 하류의 구성

-TIR-접합전달 플라스미드로 요소 P11LacZ 또는 P7.5LacZ 의 클론화

b. 재조합형 CNP 바이러스(예비 시험을 행하기 위한 LacZ 유전자)의 구성:

-CNP 바이러스와 접합전달 플라스미드를 갖는 QT35 세포의 트란스펙션

-LacZ 유전자의 표현력에 의하여 재조합체의 스크리닝후 정제

-재조합체의 게놈과 LacZ 표현의 분석

c. 예방접종 시험:

-재조합형 바이러스를 갖는 닭의 예방접종과 가금 두창에 대하여 LacZ 재조합형 바이러스에 의하여 주어지는 보호

d. 접합 전달 플라스미드로 이종항원(이종단백질)을 기호화한 유전자의 클론화:

-P11 또는 P7.5의 이종 항원 하류를 기호화한 유전자의 클론화

-플라스미드 TIR 로 카셋트 P11-항원과 P7.5-LacZ 또는 P7.5-항원과 P11-LacZ의 클론화

e. 재조합형 CNP 바이러스의 구성:

-CNP 바이러스와 접합 전달 플라스미드를 갖는 QT35 의 트란스펙션

-LacZ 유전자의 표현력에 의한 재조합형 바이러스의 스크리닝후 정제

-세포 배양에서 항원 표현의 분석과 재조합형 바이러스의 게놈의 분석

f. 예방 접종:

-재조합형 CNP 바이러스로 예방접종

-이종 항원의 표현력에 의하여 CNP 에 주어진 보호 수준의 평가

또한 본 발명은 상술한 바와 같은 아비폭스 바이러스의 게놈에 특히 부위B1 또는 B2에서 이종 DNA 가 삽입될 수 있는 접합전달 배열에 관한 것이다. 그리고 본 발명은 이들 배열을 갖는 플라스미드에 관한 것이다. 접합 전달 플라스미드는 부위 B1의 어느 한 쪽 또는 부위 B2의 어느 한쪽에 위치하고 있는 배열에 의하여 근접되어 있는 아비폭스로 인식되는 프로모터의 영향하에 이종 유전자를 함유하는 플라스미드를 의미한다. FPV 에 대하여 동종이고 이종 유전자와 근접하고 있는 이들 배열의 길이는 이종 유전자의 좌측 및 우측에서 재조합하도록 충분히 길어야 한다.

일반적으로 1kb 이상의 배열을 선택한다. 결과는 약 1850 누클레오티드 상류와 4321누클레오티드 하류의 배열에 의하여 근접되는 B1에서와 약 3070 누클레오티드 상류와 3100 누클레오티드 하류에 근접된 B2에서 양호하게 얻는다. 접합 전달 플라스미드는 재조합형 아비폭스 바이러스를 단리시키는 방법에서 역활을 이행하고, 사전에 아비폭스 바이러스로 감염된 메추라기 세포 QT35의 트란스펙션을 방법에서 행위로 부른다.

또한 본 발명은 감쇠된 아비폭스 바이러스 균주로부터 유도된 재조합형 아비폭스 비이러스로 감염되고, 이의 게놈의 비 필수 부분에 이비폭스 비이러스에 대하여 이종인 단백질의 모두 또는 부분을 기호화한 최소한 하나의 DNA 배열및 상기 재조합형 바이러스로 감염된 세포에 이러한 단백질의 표현을 확보할 수 있는 요소를 함유하는 진핵 세포의 배양에 관한 것이며, 비필수 부분은 이들의 표현 신호를 함유하는 두 ORF 사이에 위치하는 아비폭스 비이러스의 비암호 유전자간 영역으로 구성된다.

바람직하기로는 가금 세포의 배양물을 사용하는 것이다. 결과는 죠(1981)에 의하여 서술된 메추라기 세포 QT35의 배양으로 우수하게 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 재조합형 아비폭스 바이러스는 이종 단백질의 모두 또는 부분을 표현할 수 있는 벡터로서 발육된다. 그러므로 본 발명은 특별한 항원과 같은 이종 단백질의 모두 또는 부분을 표현할 수 있는 백터로서 본 발명에 따른 바이러스를 사용하는 것도 포함한다.

또한 본 발명은 감쇠된 아비폭스 바이러스 균주로부터 유도된 재조합형 아비폭스 바이러스를 함유하고, 이의 게놈의 비필수 부분에 아비폭스 바이러스에 대하여 이종인 단백질의 모두 또는 부분을 기고한 최소한 하나의 DNA 배열 및 상기 재조합형 바이러스로 감염된 세포에서 이 단백질의 표현을 확보할 수 있는 요소를 함유하는 왁찐에 관한 것이며, 게놈의 비필수 부분은 이들의 표현 신호를 함유하는 두 ORF 사이에 위치하고 있는 아비폭스 바이러스의 비암호 유전자간 용역으로 구성된다.

이종 단백질은 이비폭스 바이러스 또는 천연이나 변경된 단백질에 대하여 이질인 어떠한 단백질 또는 단백질의 부분을 의미한다. 일반적으로 이러한 단백질은 왁찐이 병원성 유기체에 대하여 발육할 수 있는 항원을 뜻한다. 통상, 항원은 가금, 바이러스, 박테리아, 클라미디아, 마이코플라스마, 원생동물, 균과 기생충에 감염되는 매체의 특별한 단백질에 있다.

특히 이들은 무력성 빈혈(AA)을 일으키는 바이러스와 알 점적 증후군(EDS)을 일으키는 바이러스와 같은 아데노바이러스과, 전염성 활액낭병 바이러스(IBDV)와 같은 비르나바이러스과, 전염성 기관지염 바이러스(IBV)와 같은 코로나 바이러스과, 마렉스병 바이러스(MDV)와 전염성 후두기관지염을 일으키는 바이러스와 같은 허페스바이러스과, 인플루엔자를 일으키는 바이러스와 같은 오르소믹스 바이러스과, 뉴카슬병 바이러스와 같은 파라믹스 바이러스과, 뇌척수염(AE)을 일으키는 바이러스와 같은 피코르나 바이러스과, 후두 활막염을 일으키는 레오바이러스과, 림파성 백혈병(LL)을 일으키는 바이러스, 닭 빈혈증(CAN)을 일으키는 바이러스와 같은 레트로바이러스가 있다.

더우기 이들에는 앵무병 클라미디아와 같은 클라미디아가 있다.

또한 이들에는 마이코플라스마 갈리셉티컴과 엠.시노비에와 같은 마이코 플라스마가 있다.

특히, 이들에는 에스커리키아 콜리, 코감기를 일으키는 에이취.파라갈리나룸을 포함하는 헤모필러스, 콜레라를 일으키는 피.물토디다를 포함하는 파스토우렐라, 발진티프스를 일으키는 에스.갈리나륨과 에스.풀로룸, 부툴리우스 중독증을 일으키는 독소를 생성시키는 시.보툴리눔을 포함하는 클로스트리듐 피부병을 일으키는 시.퍼프린겐스와 시.셉티쿰, 시.콜리눔, 캄피로박터 제주니, 스트렙코커스 아우로우스와 같은, 박테리아가 있다.

더우기, 이들에는 콕시디움증을 일으키는 에이머리아와 크립토스포리디오스증을 일으키는 크립토스포리오시스 바일리이와 같은 원생동물이 있다.

특히 이들에는 촌충류와 아스카리디아 갈리를 포함하는 선충류와 같은 기생충이 있다.

또한 이들에는 아스퍼길러스 푸미가투스와 같은 균류가 있다.

바람직한 항원에는 전염성 활액낭병 바이러스(IBDV), 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 닭 빈혈증을 일으키는 바이러스(CAV), 콕시디움증을 일으키는 원생동물 에머리아, 뉴카슬병 바이러스(NDV)와 마렉스병 바이러스(MDV)의 항원이 있다.

특히 바람직한 항원에는 전염성 활액낭병 바이러스(IBDV), 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 닭 빈혈증을 일으키는 바이러스(CAV) 와 콕시디움증을 일으키는 원생동물 에이머리아의 항원이 있다. 결과는 다음과 같은 조건하에서 좋게 얻을 수 있다:

-IBDV 에서 : 다단백질과 다단백질의 부분을 함유하는 개방형 판독틀의 모두 또는 부분, 특히 이와같은 단백질은 VP2, VP3 와 VP4이다. 또한, 이의 모든 조합물 또는 변경물을 포함한다. 예를들면, 이들 변경물은 전단부위의 삽입으로 이루어진다.

-IBV에서 : 항원 E₂

-에어머리아에서 : 단백질 분해 전단부위가 변경되는 천연 표면항원 TA4와 표면 항원

-CAV 에서 : 단백질 50

결과는 IBDV 로 우수하게 얻게되며, 이질 단백질은 제9도에 표시된 바와 같이 단백질 VP2가 포함되는 아미노산 1-493 다음 아미노산 1010-1012를 함유하는 다단백질의 부분이다.

DNA 배열은 완전한 단백질 또는 선택적으로 단백질의 단편을 기호화 할 수 있고, 동물에서 적당한 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 항원이외의 다른 분자는 성장인자와 내부 백혈소와 같은 면역인자조절제를 포함하는 것으로 고려될 수 있다. 또한 본 발명은 예를들어 성장 호르몬 또는 성장 호르몬-유도 인자와 같은 동물의 대사물질 역활을 하는 인자를 가금의 생체내에 생성시키는 것이다. 그리고, 본 발명은 동물의 생체외 또는 생체내의 세포배양에서 단백질 또는 펩티드의 제조에 관한 것이다. 특히, 주입된 이종 단백질에 따라 이는 효소로서 영양성분으로서 또는 사람이나 동물건강 분야에서, 인체 또는 수의용 의약품으로 적합하다.

더우기, 몇몇 이종 유전자를 갖는 다수의 재조합형 바이러스는 몇몇 유전자를 클론화하므로서 동일한 부위로 또는 다른 영역이나 부위에 발생될 수 있다. 또한 다가 생성물도 다른 재조합형 바이러스를 조합시켜서 항생시킬 수 있다

본 발명에 따른 아비폭스 바이러스의 동물 표적은 새, 특히 가금이다. 또한, 재조합형 바이러스는 가금이외의 종에서도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 왁찐은 본분야의 전문가에게 알려져 있는 각종 형태로 투여될 수 있다. 통상, 왁찐은 음식물 또는 음료수의 경구법, 코내투여법, 피하주사, 에이러솔, 근육내 주사 또는 소위 날개 웨브법에 따른 날개 관통에 의하여 투여된다.

바람직하기로는 왁찐을 소위 날개 웨브법에 따른 날개막 관통에 의하여, 또는 근육내 주사나 피하주사에 의하여 투여한다.

본 발명에 따른 왁찐은 본분야의 전문가에게 잘 알려져 있는 방법으로 제제된다. 통상, 왁찐 조성물은 왁찐 투여 방법에 적당한 안정화제를 함유한다. 이는 동결-건조 형태로 보존시킨다.

본 발명을 실시예를 들어 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1-CNP 바이러스와 이의 DNA의 정제]

가금폭스 바이러스로서, 상표 POULVAC CHICK-N-POX, CHICK-N-POX, CHICK-N-POX TC, POULVAC CHICK-N-POX TC, (CNP)하에 솔베이 회사에서 판매하고 있는 왁찐 균주를 감쇠된 생왁찐으로 사용한다. 계판에 몇시간 통과시킨 포지 균주로부터 최초의 원종을 얻고 CEF(닭씨눈 섬유아세포)에 2회 통과 시키고, 죠(1981)에 의하여 서술된 메추라기 세포선 QT35에 5회 통과시켜서 생체외의 세포에 적응시킨다. 메추라기 세포선 QT35는 이를 단리시키고 이를 분배한 닥터, 모스코비시(미국 플로리다 32605, 게인스빌리, 6816노스웨스트 18번가)로부터 얻을 수 있다.

CNP는 배지가 E199(지브코, 500ml), F12(지브코, 500ml), LAH(지브코, 락트알부민 가수분해물, 25ml) FCS(지브코, 태아 송아지 혈청, 25ml)과 과당(200g/1로 5ml 의용액)으로 구성된다: 38℃, 38%의 CO₂에서 항온처리.

정상 감염 다중도(moi)는 세포당 0.01 바이러스이고, 세포는 80%융합된다. 바이러스 원종을 다음과 같이 정제한다: CNP 가금 폭스 바이러스로 감염되고 PBS인산염 완충제(인산염 완충염, 지브코)에 포집한, 세포를 6000g(15분)으로 원심분리한다. 펠릿을 트리스(pH 9, 1mM)에 재현탁시키고, 트립신화하고 (0.25mg/ml 최종농도의 트립신; 지브코)음파 분쇄한다. 이 물질을 36% (중량/체적)서크로오스층에 침적시키고 30,000g으로 45분동안 원심분리한다. 펠릿을 pH9.0의 1mM 트리스에 포집시킨다. 끝으로 바이러스를 40,000g으로 30분동안 원심분리한다. 페릿을 다음 용균 완충제 포집하고: 10mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 1% SDS(나트륨 도덱실 술페이트), 500ug/ml 의 단백질 분해효소(보에링거), 0.1mg/ml RNase(보에링거), 37℃에서 2시간동안 배양한다. 페놀-추출 DNA를 에탄올에 침전시킨다. 20mg의 DNA을 얻기 위하여 감염된 40 150㎠ 플라스크에서 정제한다.

[실시예 2-CNP의 EcoR1 게놈 라이브러리와 BamH1 게놈 라이브러리]

사용된 유전자 기술은 1982, 마니아티스 등에 의하여 서술되어 있다. 제한 효소, 중합효소, 리가아제와 포스파타아제는 보에링거, 파마시아 회사 생물 연구소에 의하여 공급된다.

바이러스 DNA의 EcoR1 또는 BamH1 제한효소 단편을 메싱(1983)에 의하여 기술된 벡터 pUC18 내에 결합시키고 박테리아 이.콜리 MC1061 [araD139,(ara leu) 7697, lacX74, galU, galK, hadR, strA, 파마시아 회사에서 판매)에 주입시킨다. 두 게놈 라이브러리를 형질 전환된 세포의 두 현탁액 형태로 글리세롤에 -70℃에서 저장한다. 24%의 플라스미드를 삽입물로 함유한다. 70 BamH1 단편과 45 EcoR1 단편을 Bg12 또는 HinFl 에 의하여 제한효소의 크기와 모양을 기초로하여 분화시킨다.

삽입물은 0.5-15kb 크기를 갖는다; 따라서 특성을 갖는BamH1 삽입의 총합은 EcoRl 단편에 대하여 82kb 와 210kb이다. 가금폭스 게놈의 크기는 300kb에 가깝다(1990, 코우파르 등). 그러므로 단리된 단편은 전체 게놈에 비하여 BamH1 에 있어서는 25% EcoR1 에 있어서는 70%를 나타낸다.

[실시예 3-TIR-함유 단편의 클론화]

말단역방향 중복 배열(TIR)은 반대방향의 폭스 게놈의 말단에 존재하는 두 동일한 배열을 뜻한다. 가름 폭스의 균주의 HP의 게놈의 한 말단에서 17kb 이상의 배열은 발표되어 있다(캄벨등, 1989와 톰리등, 1988). 이는 10kb의 중복 배열과 이에 인접한 7.0kb의 배열을 갖는다. TIR EcoR1 단편의 클론화를 행한다. 반복 배열은 EcoR1 부위를 함유한다. 제2도에 도시된 바와 같이, 두 EcoR1 을 클론화한다: TIR 의 각 매개 부분과 인접한 독특 배열, 독특 배열은 TIRs에 가장 가까운 EcoR1 부위에 의하여 범위가 정해진다. 반복부분에 위치하고 있는 배열에 보충되는 올리고누클레오티드에 의하여 이들 두 단편을 단리시킨다. 첫번째 단편은 크기가 6.2kb 이고 일반적으로 TIR-L 로 나타내고, 두번째 것은 크기가 9.0 kb이고 일반적으로 TIR-R로 나타낸다. CNP의 TIR-L EcoR1 단편의 배열은 발표된 것과 동일하다.

TIR-L 과 TIR-R 배열과 비교하여 유도된 TIR과 독특 배열사이의 접합은 누클레오티드 번호 1로서 취한 톰리 등(1988)에 의하여 발표된 배열의 누클레오E1드 4007, BamH1 부위에 위치한다. 접합은 이들 저자들에 의하여 ORF3로 표시된 개방형 판독틀에 위치 시킨다.

[실시예 4-TIR 내의 BamH1 부위의 부위-방향 돌연변이 유발에 의한 창생]

개방형 판독틀(ORF)을 TIRs의 누클레오티드 배열의 분석으로 유도한다. 특히 ORF1은 누클레오티드 416과 1674 사이에 위치하고, ORF2는 누클레오티드 2166과 2671사이에 위치하며, 끝으로 ORF3는 누클레오티드 3606과 4055 사이에 위치하고 보충 가닥에서 암호를 갖는다. TIRs 의 BamH1 부위의 첫번째 누클레오티드 G는 누클레로티드 번호 1로 한다. 이들 ORFs는 한편으로는 ORF1과 0RF2 사이의 영역 β1으로 나타나고, 다른 한편으로는 ORF2와 ORF3사이의 영역 β2로 나타나는, 두 큰 비암호 유전자간 배열로 한정된다. 이들은 삽입 영역으로 선택된 두 유전자간 영역이다.

독특 클론 부위는 β1와 β2에 부위-방향 돌연변이 유발(바이오래트 돌연변이 유발 키트)에 의하여 도입시킨다. BamH1 부위는 Bc11 과 Bg12의 다른 제한효소 부위과 상화할 수 있기 때문에 이를 클론 부위로서 선택한다. 클론 부위의 위치는 대개 각 유전자간 영역의 중간에서 선택하여 이들의 각 유전자로 부터 전사신호를 분리시키는 위험을 피하도록 한다. 즉:

- 영역 β1에서 : 부위 B1은 누클레오티드 1842에서 배열 5'GATC 3'이고, 이는 5'에서 G와 3'에서 C의 삽입에 의하여 BamH1 GGATTCC 로 변환된다.

- 영역 β2에서 : 부위 B2는 누클레오티드 3062에서 배열 5'GGATT3'이고, 이는 두번째 T가 CC로 돌연변이 하므로서 BamH1 으로 변환된다.

두 BamH1부위는 TIR-L단편을 갖는 플라스미드내에 있다(실시예3). 한부위는 벡터 pUC18 로부터 유도하고, 두번째 부위는 TIR 에서 유도하고 클론화를 위해 선택된 EcoR1 부이(캄벨등, 1989; 제2도)의 71누클레오티드 하류에 위치한다. 이들 두 BamH1 부위는 BamH1 제한효소에 의하여 TIR-L을 갖는 플라스미드에서 제거한 다음, 클레노의 중합효소와 결합물을 충전한다. 여기서 나온 플라스미드는 pTIR1이다.

B1에서 BamH1을 발생시키기 위하여, pTIR1의 0.9kb HindII 단편을 스트라타겐 회사에서 판매하고 있는 벡터 pBSPlus 로 클론화한다. 돌연변이 유발 프라이머는 5'TTTCGAAAGACTTTGGATCCGATAGTATAATATTATA3'이다. 다시말해서 GGATCC 에서 누클레오티드는 BamH1에 의하여 인식되는 배열이다.

B2에서 BamH1 부위를 발생시키기 위하여 pTIR1 의 1.7kb XbaI 단편을 pBPlus 로 클론화한다. 플라이머는 다음과 같다: 5'TATATCACGGGATCCAAAGGTTATTAGTAGTC 3'다시말해서 GGATCC의 누클레오티드는 BamH1에 의하여 인식되는 배열이다.

각 돌연변이 단편의 pTIR 1으로의 재삽입은 다음과 같은 결합을 가져온다:

- B1 에 있어서 : pTIR1(1491bp)의 Hind3-Scal + 돌연변이 유발(485bp) 후 pBSPLus 의 Scal-Aat2+pTIR1(2635bp)의 EcoR1-Hind3;;

- B2에 있어서 : pTIR1 (8512bp)의 Xhol-Sp11 + 돌연변이(318bp)후 pBSPlus 의 Sp11-Xhol

이들 두 결합물은 pTIRB1과 pTIRB2를 발생시킨다. 이들의 제한효소지도는 제3도와 제4도에 있다.

플라스미드 pTIRB1D 는 이의 2657-bp EcoR1-Hpal 단편을 제거하므로서 플라스미드 pTIR1 으로부터 발생시킨다.

[실시예 5-우드 프로모터 P11 과 P7.5의 클론화]

P11과 P7.5는 공지의 우두 프로모터이며, P11은 바이러스 감염의 늦은 상에서 전사된 단백질 P11을 기호화한 유전자의 프로모터이고, P7.5는 즉시 및 늦은 상에서 둘다 전사된 단백질 P7.5를 기고화한 유전자의 프로모터이다. 독특 Bg12와 Bc11부위를 갖는 백터의 구조

독특 Bg12, Bc11 과 BamH1 부위를 함유하는 두 클론 벡터를 구성하여 BamH1과 상화성을 갖는 카셋트가 계속적으로 클론화되도록 한다. Bg12 와 Bc11 부위의 배열을 다음 합성 DNA을 클론화하여 pBSPlus의 BamH1 부위로 주입한다:

Bg12 Bc11 BamH1

5' GATCGAGATCTTGATCAG 3'

3' CTCTAGAACTAGTCCTAG 5'

벡터는 pBSLK1 과 pBSLK2이다. 링커는 그 방향에 있다.

pBSLK1 ...Ava1/Sma1-BamH1-Bc11-Ba12-Xbal ...

pBSLK2 ...Ava1/Sma1-Bg12-Bc11-BamH1-Xbal ...

[프로모터 P7.5의 클론화]

플라스미드 pGS20 의 길이 143bp 의 Bc11-BamH1 단편은 P7.5프로모터 배열(맥킷등. 1984)을 갖는다. 배열은 아래에 존재한다(벤카테산등, 1981; 코크란 등, 1985). 늦은 및 즉시 프로모터는 밑줄을 친다. 최후 BamH1 염기는 유전자의 개시인자 ATG 로부터 10bp에 있다.

Bc11-BamH1 단편을 각각 플라스미드 p1P75와 p2P75를 발생시키는, 플라스미드 pBSLKI 과 pBSLK2의 Bcll과 BamHl 부위로 클론화한다. Bcll 소화를 위하여, pBSLKl과 pBSLS2를 기준 ATT47013하에 ATCC(아메리칸형 배열 수집)로 얻을 수 있는 균주 JM110에서 추출한다.

[프로모터 P11의 클론화]

1985, 버톨리트등에서 나온 배열 자료를 이용하여 프로모터 P11의 배열을 합성 DNA의 형태로 클론화한다. 항기 등(1986)은 mRNA 의 첫번째 누클레오티드의 30-누클레오티드 단편 상류가 프로모터를 함유하는 것을 나타낸다.

합성 DNA는 이미 말단에 Bg12 부위와 BamHl 부위를 갖는 40-mer 단편이다. 이 DNA는 pBSLK1 로 클론화하여 p1P11을 발생시키고 pBSLK2로 클론화하여 p2P11을 발생시킨다. 다음 p2PII의 Bgi2-BamH1 단편은 pACYC184의 Xho2-BamH1 부위로 클론화하고, pACYCI84는 장과 코헨(1978)에 의하여 설명된 벡터이다. Xho2(GGATCT)와 Bg12(AGATCT) 사이의 결합물은 Bg12를 회복시킨다.

P11-함유 합성 DNA의 배열은 다음과 같다:

[실시예 6-BamH1 제한효소 부위와 상화할 수 있는 LacZ 유전자-함유카셋트의 구조]

LacZ 유전자의 표현은 재조합형 바이러스의 스크리닝을 허용하게 한다.

LacZ 유전자를 갖는 Bg12-BamH1 카셋트를 부위-방향 돌연변이 유발에 의하여 구성한다. 이 카셋트를 단편 LacZα 에서 제거된 플라스미드 pBSPlus(스트라타겐)으로 클론화하고 이것으로 두 동종 배열, 하나는 LacZ 를 갖는 것, 다른 하나는 LacZα 를 갖는 것, 사이의 재조합을 피하도록 한다. 돌연변이 유발 후, LacZ 유전자의 말단 배열은 하기에 표시했다. 숫자는 천연 단백질의 아미노산의 숫자에 해당한다.

[실시예 7-프로모터 P7.5 또는 P11 뒤의 LacZ 유전자의 클론화]

LacZ, Bg12-BamHl, pBSMutLacZl 의 카셋트를 p2P75 와 p2P11의 Bg12-BamHl 부위로 클론화 하여 p75Lac 와 p11Lac 를 각각 발생시킨다. LacZ 유전자의 표현을 프로모터 P7.5 또는 P11 뒤에 놓일 때 이는 이.콜리에서 얻게된다. 형질 전환 콜로니는 β-랄락토시다아제의 작용하에 청색화를 일으키는 X-Gal 함유 매체(클로모겐 기질): 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노시드)에서 청색을 갖는다. 이 시험은 유전자가 기능을 갖는 것을 입증한다. 또한 플라스미드 p11Lac 의 Bg12-Hind3 단편 형태의 p11Lac 카셋트를 pACYC184 의 Xho2 와 Hind3로 클론화하여, pACP11Lac를 발생시킨다. p11Lac 의 지도에 제5도에 표시되어 있다.

[실시예 8-카셋트 P75Lac 와 P11Lac의 플라스미드 pTIRB1 과 pTIRB2로 클론화]

p11Lac(또는 pACP11Lac)의 Big12-BamH1단편과 P75Lac 의 Bg12-BamH1은 카셋트', 프로모터 P7.5 또는 P11을 갖는 다음 LacZ 유전자'(실시예7)를 갖는다. 이들 단편을 두 가능한 방향에서, pTIRB1과 pTIRB2 의 BamH1 부위로, 스크리닝을 위한 LacZ 표현형을 사용하여 클론화한다. 여섯 플라스미드를 여덟의 가능한 제조합체 중에서 단리한다. 이들의 수는 다음에 표기했다. '+' 방향은 ORF1 내지 ORF2 또는 ORF2 내지 ORF3 방향에서 LacZ 유전자의 전사를 일으키는 것이고, '-' 방향은 그 역방향에 해당하는 것으로 가정할 수 있다. 플라스미드 명칭에서, 'P75Lac' 와 'P11Lac'는 이들 카셋트가 '+'방향에 있는 것을 의미하고 반면에 'LacP75'와 LacP11'은 이들 카셋트가 '-'방향에 있는 것을 의미한다. 예로서 플라스미드 pTIRB1P75Lac의 지도는 제6도에 표시되어 있다.

번호 =플라스미드에 주어진 번호

부위 B1 또는 B2=TIR 로 주입된 BamH1 클론부위

방향 =방향은 LacZ 의 전사방향이 ORF1 내지 ORF2 또는 ORF2 내지 ORF3 방향에 있을 때는 +이고 그 역방향이 -이다.

명칭 =접합전달 플라스미드의 명칭

[실시예 9-CNP-LacZ 재조합형 바이러스의 단리와 접합 전달 및 스크리닝 조건의 최적화]

재조합형 CNP 바이러스를 구성하기 위한 원리는 제1도에 표시되어 있다.

접합전달 공정은 다음과 같다:

D=1 일에 25-Cm²플라스크당, 2.5×10⁶QT35세포를 5ml 의 성장매체(실시예 1에 기재된 조성물)에 접종시킨다.

D=2 일에 다음과 같이 접합전달을 행한다:

바이러스 : 1ml 바이알의 동결-건조된 CNP 왁찐을 3ml의 살균 밀리 Q 물로 재수화하고 -70℃에서 저장한다. 이 바이러스 원종을 융해 시키고 1분동안 부드럽게 음파 파쇄한다. 다음 E119-F12로 표시되고 실시예 1에 기재된 배지 E119에 해당하는 배지에서 LAH 나 혈청 또는 과당 없이 이를 희석하여 2ml의 배지에서 세포당 0.05 바이러스의 감염을 갖는 다중도를 성취시킨다. 다음 배지를 바이러스 현탁액으로 대치한 다음 배양물을 38℃에서 2시간동안 배양시킨다.

플라스미드 : 20ug 의 플라스미드를 400㎕의 물과 혼합하고 이에 100㎕의 1.25M CaCl₂500㎕의 2×BBS 완충제(BES 완충염)[50mM 의 BES(시그마), 280mM NaCl, 1.5mM Na₂HPO₄; pH 7.0]을 적하하고 혼합물을 25℃에서 15-30분간 배양한다. 배지를 제거한 후, 1ml 의 플라스미드 제제를 세포에 첨가한 다음 혼합물을 38℃에서 30분동안 배양한 후, 5%FCS와 15mM Hepes(시그마) pH7.2로 보충된 4ml 의 LAH-유리 배지를 가한다. 혼합물을 다시 38℃에서 4시간동안 배양한 다음 배지를 E199로 표시된 5ml의 성장 배지 실시예 1에 서술된 조성물)로 대치한다.

D=0 일에, 바이러스 세포를 실시예 1에 서술된 바와 같이 수확한다.

스크리닝을 페트리접시에서 "플래크측정" 시험에 의하여 검출되는 β-갈락토시다아제의 생성을 기초로 한다.

6-Cm 페트리 접시에서의 공정은 다음과 같다:

D=1 일에 2.5C 10⁶세포를 5ml의 성장 배지에 접종시킨다.

D=2 일에 이 배양물을 1:10 과 1:100으로 희석된 1ml 의 바이러스로 감염시키고, 혼합물을 38℃에서 4시간동안 배양시킨 다음 4ml 의 성장 배지(실시예1에 서술된 조성물)를 가한다.

D=3 일에, 배지를 1체적의 2% 아가로우즈 [물에 용해된 플라크 아가로우즈(FMC)참조]와 1체적의 다음 혼합물: 9ml의 2C 199 배지(지브코), 0.5ml의 LAH(지브코) 및 0.1ml의 Heps(pH 7.2 15mM 최종)과 1.0ml의 FCS로 구성된 5ml의 아가로우즈층으로 대치한다. 용융된 아가로우즈와 혼합물은 혼합하기전에 38℃에서 유지한다. 아가로우즈를 실온에서 30분동안 겔로 유지한 다음 혼합물을 38℃에서 배양한다.

D=6 일에, 배양물은 0.3mg/ml 의 X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노시드, 보에링거)을 함유하는 PBS(지브코)에서 2ml 의 1% 아가로우즈와 층을 이룬다. X-Gal 을 DMSO(디메틸 술폭시드, 플루카)에 30mg/ml로 용해 시킨다.

D=7 일에, 무색 플래크의 수에 대한 청색 플랙크의 수와 비율을 계산한다. 다섯 플래크를 파스퇴르 피페트로 개별적으로 제거한 다음 바이러스 세포를 -70℃에서 500㎕의 생장 배지에 저장한다.

각 플라스미드의 재조합 빈도수는 다음 도표에 표시했다. 재조합형 바이러스의 기호는 접합전달 플라스미드의 수(실시예 8에 언급되었음)에 따라 "V"로 나타낸다. 재조합체의 퍼센트는 0.1%-0.5%이고, 이는 폭스 바이러스에 대한 문헌 자료에 해당한다. 재조합체 게놈의 표시는 제7도에 개략적으로 나타냈다.

청색 전체 = 청색 플래크의 수/플래크 전체 수

% = 청색 플래크의 퍼센트.

[실시예 10-CNP/LacZ 재조합형 바이러스의 정제]

페트리 접시에서 청색 플래크를 계속 정제(실시예9에 기재된 것과 같음)하여 클론을 얻는다. 원칙적으로, 모든 플래크가 청색일 때, 모든 바이러스는 LacZ 유전자로 표현하고 야생 바이러스로 더이상 오염되지 않는다. 이러한 균질성을 얻기 위하여는 3 내지 4회의 통과가 필요한다. 한 예로서, 통과하는 동안 청색 플래크 배율의 변화는 다음과 같다:

청색/전체 = 청색 플래크의 수/플래크의 전체 수

% = 청색 플래크의 퍼셋트

폭스 바이러스의 전형적인 구조, 특히 견골 형태를 갖는 구조는 재조합형 바이러스 V8로 감염된 QT35세포 구간의 전자 현미경 사진에서 선명하게 볼 수 있다.

[실시예 11-대향의 각 재조합체의 제조]

여섯의 재조합체를 플라스크에 3회 게속 통과시켜서 증폭 시킨다. 2차 통과의 역가는 ml당 4c 10⁵내지 1.1×10⁷TCID5050(조직 배양물 감염 분량)이다. 단 V10은 10⁴이하의 역가를 갖는다. 역가가 통상 10⁵와 10⁷사이에 있는 다른 재조합체는 야생 균주는 물론 실제로 증가한다.

[실시예 12-TIR 로 삽입된 LacZ 유전자의 안정성의 "플래크 측정" 분석]

바이러스 게놈으로 삽입된 LacZ 유전자는 발생되는 재조합형에 따라 안정 또는 불안정하다(이것은 1989, 슈만등에 의하여 명쾌하게 설명되었다). 따라서 삽입 어느 한 쪽에 두 재조합이 있으면, 삽입된 LacZ 유전자는 안정하다. 한편, 간단한 재조합은 완전한 접합 전달 플라스미드와 LacZ의 삽입을 가져온다. 이러한 바이러스는 청색 플래크를 나타낸다. 그러나, 바이러스 게놈은 직방향으로 동종 배열을 가지며, 이의 재조합은 비-청색 플래크의 외양과 삽입의 손실을 가져온다.

더우기, 폭스 바이러스에 있어서, TIR 배열의 변화는, 바이러스 감염과 복제 주기동안 다른 TIR 에 접합전달될 수 있다. 이중 재조합은 TIR-L 로 LacZ를 삽입한다; 이러한 바이러스의 플래크 청색을 나타낸다. 다음 감염이 일어나는 동안 이 재조합형 TIR-L 과 야생 TIR-R사이의 재조합으로 TIR-L/LacZ, TIR-L/LacZ -TIR-R/LacZ 와 WT(야생)바이러스의 혼합된 개체군이 발생한다. 또한 다른 재조합은 TIR-R/LacZ 인 최종가능한 형을 발생시킨다. 따라서 플래크는 세가지 형의 바이러스를 함유한다: LacZ 유전자를 잃는 바이러스, LacZ 유전자의 단일 복제를 갖는 바이러스와 LacZ 유전자의 두 복제를 갖는 바이러스

바이러스 제제의 균질성은 액체 배지에서 몇회 계속 감염시킨후, "플래크 측정법"을 사용하여 시험한다(실시예9). 바이러스 V3, V4, V5, V8, V9와 V10의 3차 통과한 "플래크측정"은 다음 비율의 청색을 가져온다:

P3 과 P6=바이러스의 3차와 6차 통과

청색/전체= 청색 플래크의 수/플래크 전체 수

% = 청색플래크의 퍼센트

- = 실행하지 않음

결과적으로, 재조합형 바이러스 V8 과 V9의 제제는 동동질성을 갖는다. 재조합형 V8은 6차 통과까지 안정하다.

한편, 제제 V3, V4와 V5는 동질성을 갖지 않는다. 이들은 5-20% 비율의 야생형 바이러스를 함유한다. 이러한 비율은 V10보다 더 높다.

[실시예 13-남부 플로팅에 의한 CNP/LacZ 게놈의 분석]

바이러스 제제의 균질성을 남부 블로팅에 의하여 시험한다(1982, 마니아티스등). 재조합형 바이러스와 비-재조합형 바이러스의 게놈의 제한 효소 단편을 이들의 크기를 기초로하여 분화시킨다.

바이러스 DNA의 제조공정은 다음과 같다:

D=1 일에, 5ml의 성장 배지를 함유하는 25-C㎡ 플라크를 2×10⁶QT35세포로 접종시킨다.

D=2 일에, 세포를 0.01의 감염 다중도로 감염시킨다.

D=5 일에, 세포를 스크레이퍼(코스타르)를 사용하여 분리시킨다. 혼합물을 6,000g으로 10분동안 원심 분리한다. 10mM Tris-HCl, pH8.0 10mM EDTA, 0.1% SDS, 0.1mg/ml RNase, 0.1mg/ml 단백질 분해효소 K로 이루어지는 500㎕의 용균 완충제를 원심분리 펠릿에 가한다. 세포를 이펜도르프관에 접합 전달하고, 얻은 현탁액을 교반한 다음 50℃에서 1시간동안 배양한다. 수성층을 페놀 클로로포름으로 3회 추출한다. DNA를 0.3M 초산 나트륨과 2체적의 에탄올에 -20℃에서 15분동안 침전시킨다. 혼합물을 18,300g으로 10분동안 원심분리한다. 원심분리 펠릿을 500㎕의 물에 현탁시킨다. 여기서 얻은 5㎕의 전체 DNA 현탁액은 남부 블로팅하는데 충분하다

[B1 부위에 대하여]

게놈을 EcoR1로 소화시킨다. 탐침은 EcoR1로 소화된 플라스미드 pTIRB1LacP75로 한다. 이 탐침은 재조합형과 양친형 TIR-L 과 TIR-R단편을 분화한다. 단편의 크기는 야생 바이러스에 대하여는 9.3과 6.2kb이고 V3에 대하여는 7.4, 5.1(이중선)과 4.4이고, V8에 대하여는 7.4, 4.9와 4.4kb이고 끝으로 Vp 에 있어서는 10.4, 7.3과 2.0kb(이중선)이다. 바이러스 V8과 V9는 LzcZ 유전자의 두 복제, 각 TIR 에서 하나를 얻고, 어떠한 양친형 TIR 단편도 함유하지 않는다. 한편, 이것은 바이러스 V3에 대한 경우이다.

LacZ의 복제는 각 TIR로 클론화될 수 있게 때문에 삽입 부위 B1은 바이러스의 발육에 대해서와 배양된 세포에서 이의 성장에 대하여 비필수적인 것이다. 더우기, LacZ유전자는 약 3kb크기임을 나타내고, 이들 이중 재조합체의 단리는 CNP 바이러스의 게놈당 6kb가 삽입될 수 있음을 입증한다.

[B2 부위에 대하여]

남부 블로트는 제조합형 TIR-L과 TIR-R 단편의 존재 뿐아니라, V4, V5와 V10에서 양친형 단편의 존재를 나타낸다. 그러므로 이들 세 제제는 동질성을 갖지 않는다.

[실시예 14-B1 삽입 부위에서 이중 재조합체를 단리하기 위한 방법]

TIRs에서 재조합체의 발육은 야생 TIR 과 재조합형 TIR 을 갖는 바이러스의 후대에서 안정한 이중 재조합체의 외양을 예견하게 한다. 페트리 접시 "플래크측정법"을 사용하여, 또는 새로운 "플래크측정법"의 의하거나, 96-웰마이크로타이터 판에서 바이러스 플래크를 청색 플래크로부터 재단리시킨다. 각 새로운 플래크의 게놈을 남부 블로팅에 의하여 아니면 PCR에 의하여 분석한다. 이러한 다른 가능성을 개발한다.

남부 블로팅은 V3의 3차 통과한 "플래크측정"으로 얻은 10의 다른 청색플래크의 바이러스 게놈에서 행하고, 10플래크중 한 제제는 동질성이고 각 TIR에 삽입된 LacZ을 함유함을 나타낸다.

마이크로타이터 판에서, 웰 당 영 또는 하나의 바이러스 플래크가 되도록 희석한다. 이러한 최적은 희석의 종전 적장에 의하여 판단한다. 양호한 결과는 1ml에서 포집하여 페트리 접시"플래크측정법"으로 얻은 50㎕의 바이러스 현탁액으로 마이크로타이터 판(웰 당 200㎕, 판당 20ml)을 감염시켜서 얻는다. 플래크를 선명하게 볼 수 있을때, 플래크를 함유하는 웰을 알 수 있다. 동결 및 융해시킨 후, 웰 당 100㎕의 배지를 취한다.

PCR에 있어서는 전체 DNA를 다음 조건하에서 신속하게 추출한다: 혼합물을 10,000g으로 10분동안 원심분리하고, 필릿을 RNase (0.1mg/ml)과 단백질 분해효소(0.1mg/ml)로 보충된, 200㎕의 용균완충제(10mM Tirs-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 0.1% SDS)에 포집시키고, 여기서 얻은 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 배양한다. 수성층을 페놀/클로로포름으로 3회 추출한 다음, 수성층에서 나온 DNA을 에탄올에 침전시킨다. 얻은 펠릿을 50㎕의 물에 포집시키고, 10㎕의 이 현탁액을 PCR당 사용한다. 사용된 PCR 조건은 퍼킨스 엘머에 의하여 추천된 것이다(GeneAmp DNA 증폭 시약 키트). 증폭된 단편을 아가로우즈 겔에서 분석한다.

프라이머 5168과 5169는 B1 삽입부위의 어느 한쪽, 부위의 각 하류와 상류에서 잡종형성한다. 이들의 배열은 다음과 같다:

LacZ유전자를 함유하는 재조합형 TIR의 3kb 이상의 단편과 야생 TIRs에서 220-bp 단편을 증폭시킨다. LacZ 유전자를 검출하기 위하여, 두번째 증폭에는 B1 부위의 하류에 위치하는 프라이머 5168과 LacZ 유전자 내에 위치하는 프라이머 3254를 사용한다. 674-bp 단편을 증폭시킨다. 여기서는 재조합형 TIRs와 비-재조합형 TIRs를 분화시킬 수 있는 프라이머를 선택하는 것이 현명하다. 바이러스 현탁액은 WT(야생)단편이 증폭되지 않으면, 균질성, 이중재조합체인 것이다. 비교물은 WT 바이러스의 게놈, 플라스미드 pTIRB1과 pTIRB1Lac이다.

-- = 증폭되지 않은 단편

[실시예 15-CNP/LacZ 재조합형 바이러스에 의한 조직 배양물에서 LacZ유전자의 표현]

기질로서 0-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(ONPG)를 사용하여 β-갈락토시다아제(β-gal)활성을 측정한다. 효소는 ONPG를 420nm 에서 흡수에 의하여 측정된 양과 황색인 0-니트로페놀과 갈락토오스로 변환시킨다. 이러한 흡수는 "1βgal 단위=1umol 의 생성된 ONP 3×10⁶세포/60분의 28℃에서 추출물 배양" 규칙에 따라 눈금측정 곡선을 사용하여β-gal 단위로 변환시킨다.

이러한 "β-gal" 시험은 25C㎡ 의 표면적을 갖는 플라스크에서 다음과 같이 행한다. 감염의 즉시 및 차후 층을 폭스 바이러스로 분화시킬 수 있다. 즉시 층이 가장 짧으며; 이는 약 6시간동안 지속한다. 이는 게놈의 복제 시간에 끝난다. 차후 층은 복제에서 시작하여 바이러스 입자를 방출하는 감염주기 말에 즉 3일 후에 끝난다. 즉시 층에서 LacZ의 충분한 표현에 있어서, 즉시 층을 복제 개시인자인 시토신-D-아라비노푸라노시드(ArcC)를 사용하여 인공적으로 연장시킨다.

a. 세포

D=1 일에, 플라스크 당 3×10⁶QT35세포를 5ml 의 성장 배지에 접종시킨다.

D=2 일에, 세포당 3 바이러스의 감염 다중도로 세포를 감염시킨다. 혼합물을 38℃에서 1시간 동안 배양시킨다. 바이러스 접종원을 피페트로 제거한 다음 40 ug/ml 으로 AraC(시그마)가 보충되거나 또는 보충되지 않은 5ml 보존 배지를 플라스크마다 첨가한다. 배양물을 38℃에서 16시간동안 배양한다.

b. D=3 일에 수확

세포를 플라스크에서 긁어낸다.

배양물을 6,000g으로 10분동안 원심분리한다. 원심분리 펠릿을 500㎕ 의 PBS에 재현탁시키고, 이 현탁액을 혼합하고 이를 1.4ml 이펜도르프 관으로 옮긴다.

세포에 50㎕의 CHCl₃를 첨가하여 용균시킨 다음, 세포 현탁액을 간단하게 혼합한다. 다음 이 현탁액을 9,000g으로 5분동안 원심분리한다.

c. 효소작용

25 시료용 ONPG 기질을 다음과 같이 제조한다: 27.7mg의 ONPG(시그마)와 최종 체적의 10ml 완충제에서 1ml 의 0.1M MgSO₄와 1ml 의 2-머캅토에탄올(머크)로 구성된 50ml의 희석제(90ml의 0.1M NaHPO₄, pH7.0, 0.1M MgSO₄, 1ml 의 머캅토에탄올).

1.95ml 의 ONPG용액과 50㎕의 세포현탁액을 혼합하고 혼합물을 28℃에서 1시간동안 배양한다. 2ml의 1M Na₂CO₃를 이 현탁액에 가하고 흡수된 이 현탁액을 420nm 에서 측정한다.

재조합형 바이러스의 β-gal활성을 비교하여 β-gal 단위로 하기와 같이 표시한다.

wt = 비-재조합체의 야생형

즉시(AraC) = AraC 에 의하여 16시간동안 인위적으로 연장된 즉시 성장층

즉시 + 차후(-AraC)=AraC 가 없는 천연 즉시 및 늦은 층

Abs = 흡수

u -gal = 측정된 -갈락토시다아제 단위.

1:5 와 1:10 =추출물의 사전 5-배와 10-배 희석

우드 프로모너 P5.7 이 감염(V3. V4와 V5)된 즉시 및 차후 층에서 작용한다; 프로모터 P11은 차후 활성만 갖는다(V8과 V9); 프로모터 P11은 우두에서와 같이 프로머너 P7.5보다 더 강한다. 그러므로 두 프로머터의 상대 강도는 물론 일시적 조절은 B1 또는 B2로 삽입이 되든지 그렇지 않든 간에 또는 이것이 LacZ 방향을 갖든지 그렇지 않든간에 CNP 바이러스에서 보존된다.

[실시예 16-CNP/LacZ 재조합형 바이러스로 닭에 접종, 가금 두창에 대한 보호, β-gal 에 대한 면역반응]

CNP/LacZ 재조합체의 접종력을 시험한다. 선택된 두 기준으로 가금 두창에 대한 보호와 β-갈락토시다아제에 대한 면역 반응을 행한다.

a. 날개 관통에 의한 투여

재조합형 바이러스 V4와 V8의 현탁액 또는 왁찐 CNP 균주의 현탁액을 날개막 관통 (소위 "날개 웨브"법) (WW)에 의하여 특수-병원균-유리(SPF)로 보증된 1-일-나이의 닭에 주사한다.

V4 또는 V8로 또는 CNP 로 접종된 세 그룹의 28-30마리의 닭으로 시험을 행하고,부의 억제로서, 15마리의 비-접종된 닭 그룹에 시험을 행한다.

각 접종 닭은 5C 10⁵TCID50 (조직 배양감염 분량)에서 10ml의 현탁액/ml의 바이러스를 수용하고, 이는 새 당 5 × 10³TCID50 에 해당한다. 29일에, 닭을 악성 바이러스와 접촉시킨다(미국, 아피스에서 얻은 가금 폭스 공격 바이러스 군주).

10일후, 병반이 없음이 평가되므로서 가금 두창에 대하여 접종된 모든 닭이 보호됨을 나타낸다. 또한, 비-좁종된 닭의 반은 병반을 가졌다. 직접 ELISA 로 β-갈락토시다아제에 대하여 항체역가를 분석하면, V4 바이러스로 접종된 29마리의 21마리(71%)와 V8 바이러스로 접종된 28마리의 닭중 20마리가 혈청 변화를 나타내고, 즉 혈청 양성이었음을 나타낸다.

ELISA 역가가 100이상의 흡광도를 나타내는 최종 희석물을 뜻하면, 이들 닭의 혈청에 평균 항-β-갈락토시다아제 ELISA 역가는 1:800이다.

b. 근육내와 피하방법에 의한 투여

1-일-나이의 닭에 근육내 방법(1M, 29마리 닭) 또는 피하 방법(SC 34마리의 닭)에 의하여 바이러스 V8의 10^4.4TCID50 으로 첫날에 접종한다. 이들을 27일후 공격을 받게한다. 이들은 가금 두창에 대하여 보호를 받는다(100%). β-갈락토시다아제에 대한 혈청 변환은 IM 방법에 의하여 접종된 27마리의 닭중 24마리(88%)와 SC 방법에 의하여 접종된 34마리의 닭중 24마리(88%)가 관찰되었다.

최종적으로 면역 결과는 다음과 같이 나타난다:

- B1 또는 B2 부위에, 이들의 게놈의 TIR 영역에서 LacZ 유전자를 함유하는재조합형 바이러스는 이들의 면역성이 보존된다;

- P7.5 와 P11 프로모터가 동물에서 작용한다;

- 항체 반응은 β-갈락토시다아제에 대하여 일어나고, 이는 여기서 CNP재조합체에 의하여 표현되는 이종 단백질로서 생각된다;

- 근육내(IM), 피하(SC)와 날개막 관통(WW) 방법은 가금 두창에 대한 보호와 β-갈락토시다아제에 대한 혈청 변환 퍼센트의 한계가 같다.

[실시예 17-가금 기관지염 바이러스의 글리코-단백질 E2를 접합전달 벡터로 기호한 유전자의 삽입]

전염성 가금 기관지염(IBV)을 일으키는 바이러스는 코로나바이러스이다. 이 바이러스의 가장 중요한 표면 항원은 두 서브-단위 S1 과 S2 (카바나그, 1983, 카나바그등, 1988)로 이루어지는 단백질 E2 이다. 각종 혈청형은 매사츄세츠의 M41을 포함하여, 네델란드 혈청형, 특히 D1466과 D274(쿠스터등, 1987)가 있다.

IBV 의 E2 단백질을 표현하는 재조합형 CNP 왁찐을 개량하여 전염성 가금 기관지염(IBV)을 일으키는 바이러스에 대하여 효과적인 왁찐을 얻는다.

혈청형 M41의 단백질 E2용 유전자는 물론 혈청형 D1466, D207과 D274의 E2 유전자의 큰 단편은 우트레취(NL)대학의 쿠스터스 박사로부터 얻는다.

혈청형 M41 의 E2 유전자의 BamH1 카셋트는 부위-방향 돌연변이 유발에 의하여 이루어진다. 균주 D1466 의 완전한 유전자와 완전한 잡종 유전자 D207/D274는 BamH1 과 상화성을 갖는 카셋트에서 단편으로 이루어진다. 이들 세 카셋트는 프로모터 P7.5의 하류를 클로화하므로, 세 플라스미드 p75M41, p75D1466과 p75D207을 발생시킨다.

카셋트 P7.5-E2를 접합 전달 벡터 pTIRB1의 BamH1 부위로 클로화한 다음, 카셋트 P11Lac 를 BamH1 부위로 E2 의 하류에서 클론화 한다. 이들 접합 전달 플라스미드는 OTIRB1P75M41Lac, pTIRB1P75D1466Lac 와 pTIRB1P75D2071Lac이다. 재조합형 바이러스를 접합전달에 의하여 구성하고 실시예 9, 10과 11에 서술된 바와 같이 정제 한다. 게놈은 실시예 13에 서술된 바와 같이 남부 블로팅으로 분석한다. E2 항원의 로헌을 다음 면역 방법에 의하여 검출한다: 특수 항체를 사용한, ELISA, 서부 블로팅 또는 면역형광법, 재조합형 바이러스 원종을 제조한다. 왁찐의 효능은 통상의 방법을 사용하여 병원성 바이러스로 감염시킨 후, 전염성 기관지염으로 평가하고 바이러스에 대한 항체의 수준으로 평가한다.

[실시예 18-접합전달 플라스미드에 에이머리아 유전자의 삽입-CNP/TA⁴재조합체의 구성]

에이머리아 유전자는 콕시디움증을 일으키는 가금의 기생체를 뜻한다. 표면 항원은 이.테텔라, 이.네카트릭스, 이.맥시마 종에 서술되어 있다(유럽특허 출원 제0,164,176호와 제0,231,537호).

콕시디움증에 대하여 유효한 재조합형 왁찐을 개발한다.

TA4 또는 A4로 표시되는 이.테넬라 항원은 디슬피드 가교결합에 의하여 결합된 Mkd와 8kd의 두 서브-단위로 구성된 25-kd 단백질이다. 유전자를 게놈 라이브러리와 단리하고 또한 mRNA 와 단리시킨다. 유전자의 완전한 설명은 상기 서술한 특허출원에 기재되어 있다.

TA4 유전자의 BamH1 카셋트는 서브클론화에 의하여 구성하며, 플라스미드 pTA406 은 TA4의 암호 배열을 갖는다. 플라스미드 pTA410은 두 서브-단위를 분리하는 단백질 분해 배열로 변경하여 TA4 유전자를 갖는다. 천연 배열 Arg-Arg-Leu 는 부위-방향 돌연변이 유발에 의하여 배열 Arg-Glu-Lys-Arg(1988, 키니등에 의하여 설명)로 대치된다. 이들 두 BamH1 카셋트를, P7.5의 억제하에 TA4유전자를 놓은 방향으로 플라스미드 p1P7.5의 프로모터 07.5의 하류에서 클론화한다.

카셋트 P7.5-TA406 과 P7.5-TA410을 접합전달 벡터 pTIRBlD 의 BamH1 부위로 클론화한다. 다음 카셋트 P11-Lac를 TA4 유전자의 BamH1 부위하류로 클론화한다. 접합전달 플라스미드는 pTIRTA406Lac 와 pTIRTA410Lac이다.

재조합형 바이러스는 실시예 9,10과 11에 서술된 바와 같이 접합전달에 의하여 얻으며, 청색 플래크를 얻는다. TA406유전자를 갖는 재조합체는 V20이고; TA410을 갖는 재조합체는 V21이다.

각 TIR 에서 TA410과 LacZ의 복제를 갖는 이중 재조합형 V21 바이러스는 실시예 14에 서술된 바와 같이 PCR 에 의하여 분석된 이의 게놈과 각 마이크로타이터 판에서 정제한다. 사용된 프라이머와 증폭된 단편의 크기는 다음 표에 표시했다. 프라이머 1871는 LacZ 유전자로 보충된다.

TA4 항원의 표현은 다음 면역방법에 의하여 검출한다: 특수 항체를 사용한, ELISA, 서부블로팅 또는 면역형광법.

재조합형 바이러스의 원종을 생성시킨다. 이러한 재조합체의 분량으로 가금을 접종한다. 왁찐의 효능은 혈청, 증체량의 비율과 임상 신호의 분석을 포함한 콕시디움증에 대한 일반적 방법을 사용하여 바이러스 에이머리아로 공격한 후, 평가한다.

[실시예 19-접합전달 벡터로 전염성 활액낭병 바이러스의 다단백 유전자의 삽입]

전염성 활액낭병 바이러스의 병원체는 비르나바이러스과의 바이러스이다. IBDV (전염성 활액낭병 바이러스)라 불리우는 바이러스는 영계에 영향을 주고 파보리커우스의 활액낭의 림파구 세포 파괴의 특성을 갖는 높은 전염병(전염성 활액낭병)을 일으킨다. 바이러스는 분절 A(약3,400염기쌍; bp)와 분절 B (약 2,900bp)로 불리우는 이중-가닥 RNA의 2분절로 구성된 게놈을 갖는다. 바이러스 입자는 외막을 갖지 않고 약 60나노미터의 직경을 갖는 정이십면체 형태이다. 4가지 바이러스 단백질은 다음과 같이 명맥하게 확인된다: 90K(K: 킬로달톤)의 분자량(MW)을 갖는 VP1; VP2, 37K - 40K 의 MW; VP3, 32K-35K 의 MW와 VP4, 24K-29K의 MW(1979, 도보스, 1985, 파히등). VP2는 41K-54K의 MW을 갖는 전구물질 VPX에서 유도된다.

분절 B는 바이러스 중합 효소인 VP1을 기호화한다. 분절 A는 세 다른 단백질을 기호화한다. 이들 단백질은 분절 A의 큰 개방형 판독틀에 해당하는 약 110K 의 MW을 갖는 전구 물질로부터 단백질 분해절단에 의하여 발생된다. 단백질 VP4는 단백질 분해 절단에 포함된다(자가디쉬등, 1988). 단백질 VP2와 VP3은 바이러스 캅시드를 구성한다. VP2는 바이러스를 중화하는 항체의 합성을 유도할 수 있는 항원 결정기를 함유한다(베취등, 1988; 파히 등, 1989).

전염성 활액낭 병에 대한 재조합형 가금폭스 왁찐을 개발한다.

이러한 개발 단계는 다음과 같다:

1. 선택된 IBDV균주의 유전자 물질의 단리, EDGAR 바이러스 균주는 미국 농산부에서 얻을 수 있다(미국, MD20782, 하이야트빌리, APHIS 6505 벨크레스트 로ㄷ, USDA).

2. 분절 A에 해당하는 cDNA 의 누클레오티드 배열의 합성, 클론화와 결정.

3. 가금폭스로 감염된 동물 세포에서 이러한 유전자 물질의 표현에 필요한 배열은 물론 cDNA의 삽입과, 실시예 4에 서술된 접합 전달 플라스미드 pTIRB1에 재조합형 가금폭스 바이러스의 스크리닝을 허용하는 배열.

4. 재조합형 바이러스의 단리와 정제.

5. 재조합형 바이러스의 유전자 분석.

6. 이들 재조합형 바이러스에 의하여 보균되는 IBDV유전자의 세포 배양에서 생체외 표현의 분석.

7. 전염성 활액낭 병에 대한 보호 분석과 재조합형 바이러스로 닭에 접종

[단계 1]

EDGAR의 바이러스 RNA을 바이러스로 감염된 닭에 활액낭에서 단리시킨다.

바이러스로 감염시킨 7일 후, 수확된 약 40g의 활액낭을 40ml의 TNE 완충제(TNE: 10mM Tirs-HC1, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH8)에서 분쇄한다. 분쇄된 생성물을 17,000g으로 원심분리하고 얻은 수성층을 40%와 60%의 수크로오스 (TNE완충제에서 중량% 체적)를 함유하는 두 층으로된 예비 수크로오스 균배물에 침적시킨다. 균배물을 2시간 30분 동안 134,000g으로 원심분리한다. 수크로오스의 40%-60% 중간층을 수확하며 이는 부분적으로 정제된 바이러스를 함유한다. 5ml의 이층을 10mM Tris-HCL, 100mM NaCl 0.5% SDS, 10mM EDTA, 2 mg/ml 단백질 효소 K, pH7.5를 함유하는 5ml의 완충제에 가한다. 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양한다. 수성층을 페놀/클로로포름으로 추출한 다음, 수성층의 헥산을 0.8M LiCl 의 존재하에 에탄올에 침전시키고 50㎕의 물에 포집시킨다.

[단계 2]

분절 A에 해당하는 cDNA의 합성과 증폭은 "GENEAMP RNA PCR KIT, PERKIN ELMER CETUS "에 서술된 방법에 따라 행하고, 역전사 효소에 의한 첫번째 DNA 가닥의 합성용 프라이머로서, 분절 A의 배열에 보충되는 합성 올리고누클레오티드 또는 프라이머를 사용하여 행한다. 이들 합성 올리고누클레오티드의 선택은 다음의 다른 IBDV 균주 분절 A의 발표된 배열의 분석에 의하여 결정한다: 오스트랄리아의 균주 002-73(후드선 등, 1986), 독일 균주 CU-1(스피스등, 1989)와 영국 균주 52/70(베이리스등, 1990). 프라이머의 배열과 EDGAR 균주의 분절 A에 관한 이들의 위치는 제8도와 제9도에 표시했다.

IBDV의 발표된 배열을 분석하면, 두 다른 개방형 판독틀은 단백질 VP2, VP4와 VP3을 기호화하는 큰 개방형 판독틀과 더불어 분절 A의 동일한 암호 가닥상에 존재함을 나타낸다. 이들 중 ORF1의 ATG 의 개시된 34bp 상류인 0RF2는 길이가 43p인 후자에 중첩한다. 기타, ORF3는 ORF2 의 개시된 32bp상류이고, 길이가 31bp이다. 바이러스의 생물학에서 이들 ORFs의 가능한 역활은 현재로서는 불확실하다.

각 프라이머, 0-1(585bp), 1-2(1129bp), 3-4(670bp), 5-6(1301bp)의 쌍에 의하여 한정된 네 이중-가닥 단편과 분절 A의 전폭 ORF1과 ORF2가 발생된다.

이들 단편은 플라스미드 pBSPLus 또는 pBSLK1으로 콜론화되고; 따라서 여섯 플라스미드가 구성된다(제8도와 제10도 참조).

이들 플라스미드의 IBDV단편의 누클레오티드 배열을 결정하고 정렬하여 EDGAR 의 분절 A의 배열을 재구성하고, 이는 PCR에 의하여 증폭된다(제9도 참조) 다른 IBDV 균주의 발표된 배열을 기초로하여 이루어진 플라이머를 사용하여 대치시킨 EDGAR 균주의 원배열은 이들 외측에 위치하는 플라이머를 사용하여 이들 영역의 증폭 생성물로부터 측정한다.

얻은 클론에서 나온 분절 A의 재구조는 제10도에 개략적으로 표시했다.

단계는 다음과 같다:

1. pEDGAR 12의 구조

pBS1A2(EcoR1+T4DNA 중합효소, Sac1+pBSIB (Sph1+T4DNA 중합효소, Sac1)

2. pEDGAR12 에서 부위-방향 돌연변이 유발에 의한 pEDGARM12의 구조

a. IBDV 배열의 하류에 위치하는 pEDGAR12의 Sph1 부위의 삭제:

돌연변이 유발

b. pEDGAR12 의 EcoR1 부위의 삭제와 IBDV 배열의 Sph1 부위 하류의 도입;

원 배열:

돌연변이 유발

3. pACEDGARM 12의 구조:

pACYC184 의 Bc11-Sph1 에 pEDGARM12 의 Bc11-Sph1 단편의 삽입

4. pEDGAR34i 에서 부위-방향 돌연변이 유발에 의한 pEDGARM34i 의 구조 Nai1부위로 Sph1 부위의 대치

돌연변이 유발

5. pEDGAR 45의 구조:

pBS3A(Hinc2+Pst1) + pEDGAR34i 의 Hinc2-Pst1 단편

6. pACEDGAR14의 구조:

pACEDGARM12(Sph1 +T4 DNA 중합효소, BamH1) + pEDGARM34I (Nsi1 + DNA 중합효소, BamH1)

7. pACEDGAR15 의 구조:

pACEDGAR14 (BamH1 + T4 DNA 중합효소, Sall) + pEDGAR45 (Pvu2-Sa11)

8. pACEDGAR1 의 구조:

pACEDGAR15(Sph1 + EcoRV) + pBS3B (Sph1 +Pvu2)

9. pBSIBDVO 의 부위-방향 돌연변이 유발에 의한 pBSIBDVOb 의 구조:

ORF1 과 개시를 갖는 pBSIBDVO 에 ORF3의 도입;

원 배열:

돌연변이 유발:

10. pACEDGAR2 와 pACEDGAR3 의 구조:

플라스미드 pACEDGAR2 와 pACEDGAR3 는 각 플라스미드 pBSIBDVD 와 pBSIBDVOb의 Bc11-Rsr2 단편으로 플라스미드 pACEDGAR1 의 Bc11-Rsr2 영역을 대치하므로서 얻는다.

그러므로 세 플라스미드 pACEDGAR1, pACEDGAR2 와 pACEDGAR3는 EDGAR 균주의 분절 A의 각, ORF1, ORF1-ORF2 와 ORF1-ORF2-ORF3를 Bc11-BamH1 단편에서 단리시킬 수 있다.

ORFs 의 ATG 쪽에서 이들 세 플라스미드의 배열은 다음과 같이 표시된다:

[단계 3]

이들 Bc11-BamH1을 플라스미드 p2P75 의 BamH1 부위로 클론화하므로서, 플라스미드 p75EDGAR1, p75EDGAR2 와 p75EDGAR3 가 발생하고 프로모터 P7.5의 억제하에 분절 A의 암호 배열이 위치한다.

또한 이들 암호 배열은 프로모터 P11의 조절하에 위치하게 된다. 프로모터 P11을 갖는 플라스미드의 Bc11-BamH1 단편은 플라스미드 pACEDGAR1, pACEDGAR2 와 pACEDGAR3의 BamH1 부위에 삽입되어 각 플라스미 p11EDGAR1, p11EDGAR2와 p11EDGAR3을 발생시킨다.

Bc11-BamH1 카셋트, P75-EDGAR 또는 P11-EDGAR 를 이들 다른 플라스미드와 단리하여 플라스미드 pTIRB1의 BamH1 부위에 삽입하므로서 플라스미드 pTIR75EDGAR1, pTIR75EDGAR2, pTIR11EDGAR3, pTIR11EDGAR1, pTIR11EDGAR2 와 pTIR75EDGAR3 이 생성한다. 보존되는 플라스미드 pTIRB1 내의 이들 Bc11-BamH1 의 방향은 프로모터 P7.5와 P11에서 시작된 전사방향이 플라스미드 내에 존재하는 ORF1 과 ORF2의 방향과 일치하도록 한다.

P11-LACZ 카셋트를 갖는 플라스미 pACP11LAC 의 Bg12-BamH1 단편을 플라스미드 pTIR75EDGAR1 과 pTIR75EDGAR2 의 BamH1 부위에 삽입하여 각 플라스미드 pTIR75E1LAC 와 pTIR75E2LAC 가 발생되도록 한다. 이들 플라스미드 내의 P11-LACZ 의 방향은 LACZ 유전자의 전사방향이 ORF1 과 ORF2의 방향과 일치하도록 한다.

유사한 방법으로 플라스미드 pTIR11E1LAC, pTIR11E2LAC 와 pTIR11E3LAC 은 플라스미드 p75LAC 의 Bg12-BamH1 단편의 형태로 단리된 P75-LACZ 카셋트를 각 플라스미 pTIR11EDGAR1, pTIR11EDGAR2 와 pTIR11EDGAR3의 BamH1 부위에 삽입하므로서 발생된다.

끝으로, 플라스미드 pTIR11VP2LAC 는 Xhol(T4 DNA 중합효소로 처리된 것)- 플라스미드 p11EDGAR1 의 BG12 단편을 PpuM1(T4 DNA 중합효소로 처리된 것)과 플라스미드 pTIR11ELAC 의 Bg12 부위에 삽입하므로서 발생된다. 접합전달 플라스미드 pTIR11VP2LAC 는 프로모티 P11의 억제하에서, 단백질 VP2의 완전한 배열 및 단백질 VP4의 아미노-말단부를 함유하며; 구조에 의하여, 최종 세아미노산(ASP, Leu 와 Glu ; VP3의 카르복시-말단부)과 다단백질의 번역용 종지암호(TGA)는 층에서 용해된다. 그러므로 이러한 이종 단백질은 아미노 1 내지 493, 다음 단백질 VP2를 함유하는 아미산 1010 내지 1012를 함유하는 다단백질의 일부분에 해당함을 제9도에서 볼 수 있다.

예를들어, 플라스미드 pTIR7ElLAC 는 제11도에 표시되어 있다.

[단계 4와 단계 5]

EDGAR 균주의 ORFs 가 함유되어 있는 재조합형 가금 폭스 바이러스를 실시예 9, 10, 11, 12, 13 과 14에 서술된 방법에 따라 단리하고, 정제하고 특성을 표시한다.

제조합형 바이러스의 기호는 다음과 같다:

V11 = P7.5E1 V12 = P7.5E2

V14 = P11E1 V15 = P11E2

V17 = P11VP2 V16 = P11E3

PCR에 의하여 이중 재조합형 TIRs를 선택하는데 사용된 프라이머는 WT TIRs와 LacZ, E1, E2, E3 또는 VP2를 함유하는 VP2를 분화시킨다. 프라이머의 조합물과 증폭된 단편의 크기는 다음 표에 표시했다.

프라이머 IBDV16, 3, 1b 와 22는 IBDV 에 혼성되고, 프라이머 IBDV16, 1b 와 3은 VP2의 암호부에 혼성된다. 프라이머 IBDV22는 VP3의 암호부에 혼성되므로 V17 게놈에 혼성되지 않는다. 프라이머 5168 과 5169는 EPV에 혼성되고, 프라이머 1871는 β-갈락토시다아제에 혼성된다. 이들 프라이머의 배열은 다음표 "프라이머의 리스트와 배열"에서 언급한다.

[단계 6]

QT35 세포내의 재조합형 바이러스의 IBDV 항원의 표현을 비교한다.

IBDV 균주 Cu-1 에 대하여 일어나는 사용항체는 독일, 기에센의 유스투스-리에비그 대학, 바이러스학회, 에이취. 뮬러 교수에 의하여 공급된다. 이들은 다음과 같다:

1. Cu-1 균주에 대하여 중복 면역화되는 토끼의 다클론 혈청(번호 B22)

2. 천연의 단백질 VP3와 변성형태를 인식하는 항-VP3 마우스 단클론 항체 (번호I/A10)

3. 단백질 VP2의 확인된 에피토프를 인식하는 항-VP2 마우스 단클론 항체(번호 B1); B1 항체는 바이러스 균주 Cu-1을 중화할 수 있는 항체이다.

a. 감염의 실험 조건

D=1 일에, 25-Cm²-플라스크당 2.5×10⁶QT35 세포를 5ml 의 성장 배지(실시예 1에 서술된 조성물)에 접종시킨다. 여덟개의 플라스크를 제조한다.

D=2 일에, 세포를 세포당 0.01 바이러스의 감염 다중도로, 각 재조합형 바이러스 V11, V12, V14, V15, V16, V17, V18 (부의 억제)과 IBDV (버신 균주2, 정의 억제)로 감염시킨다.

D=5 일에, 감염된 세포를 수확하고 다음 동결 후 라쿠나[lacuna] 배지를 융해시킨다.

b. 샌드위치형 ELISA 에 의한 표현 생성물의 분석

ELISA 시험은 제1항체로서 다클론 항체 B22 를 사용하고, 제2항체로서, 항-VP3 단클론 항체(번호I/A1O) 아니면 항-VP2 중화 단클론 항체(번호 B1)를 사용하여 행한다. ELISA 곡선은 항-VP3에 대한 제12a도와 항-VP2에 대한 제12b도에 표시했다.

이들 분석 결과는 다음과 같이 나타난다:

1-제12a도 : 단백질 VP3는 모든 재조합형 (V11, V12, V14, V15 와 V16)으로 표현되고, 이는 다단백질(ORF1, VP2-VP4-VP3 단백질)을 기호화하는 최소한의 배열을 함유하며, 그러나, 이는 VP2와, VP4의 아미노-말단부를 기호화하는 영역만을 함유하기 때문에 재조합형 V17로도 표현되지 않을 뿐만 아니라, 이는 IBDV 배열을 함유하지 않기 때문에 재조합형 V8로 표현되지 않는다.

단백질 VP3의 표현 수준은 재조합형 V14, V15와 V16에서 보다 재조합형 V11과 V12에서 더 낮으며, 이는 각종 재조합체에 존재하는 프로모터의 강도와 서로 연관된다: 프로모터 P7.5(재조합형 V11과 V12)의 활성을 프로모터 P11(재조합형 V14, V15와 V16)보다 강하지 못하다(실시예 15참조). 각종 재조합체에 도입된 분절A의 판독틀의 기능으로서 VP3의 표현수준에 차이가 관찰되지 않는다: 재조합형 재조합형 V11과 V14에 대한 ORF1 V12와 V15에 대한 ORF1 + ORF 2와 재조합형 V16용 ORF1 + ORF2 + ORF3.

2 - 제 12b 도 : 단백질 VP2는 IBDV 배열을 함유하지 않는 V8을 제외하고 모든 재조합형으로 표현된다.

표현의 수준은 재조합형 V17이 가장 높다; 이 경우에 이는 IBDV 바이러스에 의하여 감염된 세포에서 표현되는 단백질 VP2의 수준과 가깝다.

상관은 각종 재조합체에 존재하는 프로모트의 강도와 단백질 VP2의 표현수준사이에서 다시 관찰된다.

이러한 결과는 한편으로 균주 Cu-1에 대하여 일어나는 항체 B1 을 중화 시키므로서 인식되는 단백질 VP2의 에피토프가 아메리칸 균주 에드갈의 단백질 VP2에 존재하고, 다른 한편으로는 단백질 VP2의 최초 형태가 모든 재조합형으로 이 영역에 보존됨을 나타낸다.

c. 서부 블로팅에 의한 표현 생성물의 분석

각종 재조합체에 의하여 생성된 단백질의 서부 블로트 분석은 한편으로는 IBDV단백질 모두를 인식하는 다클론 혈청(B22)을 사용하여 행하고, 다른 한편으로는 항-VP3 단클론 항체(I/A10)를 사용하여 행한다.

제13a도에 예시된 결과로, 다클론 혈청이 IBDV 에 의하여 감염된 세포의 추출물에서, 필수적으로 VP2(~40kd), VP3(~32kd)와 VP4(~28kd)에 해당하는 세 단백질을 인식함을 알 수 있다. 또한 약 46kd 의 단백질도 관찰할 수 있고 이는 VP2 전구물질(VPX~48~49kd)을 구성한다.

다단백질(ORF1, VP2-VP3-VP4)를 기호화하는 배열을 최소한 함유하는 모든 재조합체(V11, V12, V14, V15와 V16)에 있어서, VP3, VP4와 VPX에 해당하는 분자량(MW)을 갖는 단백질을 항-IBDV 다클론 혈청(제13a도)에 검출된다. 재조합형 V17에 있어서는 분자량이 융해 단백질 VP2 + VP4(~52kd)의 아미노-말단영역의 것에 가까운 하나의 단백질만이 검출된다.

항-VP3 단클론 항체(제13b도)는 IBDV 에 의하여 감염된 세포에서, 두 단백질, VP3와 VP3의 분해 생성물 및 다단백질을 표현하는 모든 재조합체를 필히 인식한다. IBDV 단백질은 융해 단백질 VP2-VP4를 표현하는 재조합형 V17에서 인식되지 않는다.

이러한 모든 결과는 다단백질(ORF1)을 기호화하는 판독틀이 부가적 판독틀 ORF2(재조합형 V12와 V15) 또는 ORF2 와 ORF3(재조합형 V16)의 존재에 관계없이 모든 재조합체로 번역됨을 나타낸다. 전구물질 다단백질의 분해는 정확하게 일어나나 VP2의 경우에는 불완전하게 나타난다; 이는 전구물질 VPX의 완전한 성숙은 IBDV 바이러스 입자가 세포표면으로 운반된 후 또는 그 동안 일어남을 나타낸다(뮬러등, 1982).

[단계 7]

재조합형 FPV/IBDV 의 접종력을 시험한다.

a. Vll을 갖는 혈청 변환

첫 예방좁종은 β-갈락토시다아제에 대하여와 IBDV 바이러스에 대하여 혈청변화가 비교되는 재조합형 FPV/IBDV로 다음 세 다른 방법: 근육내 투여법(IM), 피하투여법(SC)와 날개 관통법(WW 또는 날개 웨브)으로 행한다.

1-일-나이의 닭에 세가지 투여방법, IM, SC 또는 WW을 사용하여 10^4.4V11 재조합형 바이러스를 접종한다. 이들은 11일 후 안락사로 죽는다.

직접 ELISA 에 의한 혈청을 분석하면, 근육내 투여법에 의하여 접종한 닭의 2/14(14%), 피하투여법에 의하여 접종한 닭의 3/6(50%)와 날개 관통법에 의하여 접종한 닭의 8/15(53%)는 β-갈락토시다아제에 대하여 항체를 가지는 반면에 근육내 투여법에 의하여 접종한 닭의 5/14(36%), 피하 투여법에 의하여 접종한 닭의 1/6(17%)와 날개 관통에 의하여 접종한 닭의 1/15(7%)는 IBDV 바이러스에 대하여 항체를 가짐을 알 수 있다.

결론적으로 IBDV 단백질은 접종된 닭에서 재조합형 FPV/IBDV11 로 표현되고 이들은 몇몇 닭에서 항체 반응을 일으킨다. 세 투여 방법중 근육내 투여법은 다른 두 방법보다 더 높은 반응을 일으킨다.

b, V11, V15와 V16으로 초기 보호

1-일-나이 닭에 근육내 투여법에 의하여 10^4.4V8(부의 억제), V11, V15 또는 V16바이러스의 분량을 투여하고, 10일후, 접안 투여법에 의하여 투여된 100(100배의 치사량)의 바이러스 849VB로 공격한다. 849VB균주는 1991, 반 덴버그등에 의하여 발표되었다.

닭은 20일후 안락사하여 죽는다.

확액낭의 중량과 전체 중량 사이에서, 100으로 곱한 비율은 보호 지수이다.

V8로 접종하고 IBDV 공격을 받지 않은 비교 그룹에서, 이 비율은 0.57(10마리 닭의 편균)이었다.

공격을 받은 V8 그룹에서, 이 비율은 0.11이 되었다(9마리 닭).

V11, V15와 V16으로 좁종한 닭에서, 이들 비율은 각각 0.11(20마리 닭), 0.12(18마리 닭)과 0.12(18마리 닭)이었다.

이러한 표준을 기초로할 때, 재조합형 V11, V15와 V16에 의하여 IBDV 바이러스에 대한 초기 보호는 없었다.

c. V11, V15와 V16로 후기 보호

전술한 섹션에서 서술한 바와 같이, V8, V11, V15와 V16으로 접종한 닭에 주사 42일 후에 IBDV 공격을 한다.

공격전에 수집된 혈청을 ELISA 방법으로 분석하여 β-갈락토시다아제와 IBDV 바이러스에 대한 항체 반응을 평가한다.

항-β-갈락토시다아제 반응은 100% 혈청 변환을 모든 접종 닭에서, 즉 전체 70마리 닭에서 얻음을 나타낸다. 역가는 1:200 내지 1:51, 200의 범위이다. LacZ 유전자가 P7.5의 억제하에 있는 V11과, LacZ 유전자가 프로모터 P11의 억제하에 있는 V8, V15와 V16으로 얻은 역가 사이에서는 현저한 차이는 없다.

V8로 접종된 10마리의 닭에서 항-IBDV반응은 영이다; 이는 V11, V15와 V16으로 접종된 모든 닭에서 양성을 나타낸다. 더우기 V11로 접종된 20마리의 닭에서 반응역가는 1:800 내지 1:51, 200이고, 평균적으로 1:6, 400이다.

이들은 V15로 접종된 20마리 닭에 있어서는 1:6, 400 내지 1:102, 400이고, 평균적으로 1:25, 600이다. 이들은 V16으로 접종된 20마리에서 1:6, 400 내지 1:204,800이고, 평균적으로 1:25, 600이다. 항체 수준은 V11로 접종된 그룹보다 V15 또는 V16으로 접종된 그룹이 실제 더 높다.

배양된 세포에 적응하는 왁찐 균주 PBG68의 혈청중화 역가는 부의 억제로서 V11에 대하여 1:10 이고; V15에 대한 20중의 네 혈청과 V16에 대한 20중의 한 혈청은 1:20의 혈청중희 역가를 갖는다. 그러므로 이러한 역가는 낮고 몇몇 동물에서만 관찰된다.

비율(활액낭의 중량/전체중량)X100은 공격받지 않은 V8 비교그룹(10마리 닭)에서 평균 0.66을 갖는다.

이는 공격받은 그룹 V8에서 0.1이 된다(1생존). 이는 세그룹 V11(3마리 닭), V15(11마리 닭)과 V16(8마리 닭)에 대하여 각각 0.1, 0.11, 0.11이다. 여기서 활액낭의 위축성에 대한 보호는 없다.

4일동안 공격에 따른 사망율은 비교 그룹에 있어서는 거의 모두었다(10마리중 9마리 닭) 그룹 V11에서는 20마리중 3마리 닭이 생존했는데 반하여 V15로 접종된 것은 20마리중 11마리 닭이 생존했고, V16으로 접종된 것은 20마리중 8마리 닭이 생존했다. 그러므로 V15 또는 V16으로 접종된 동물의 50%가 보호됨을 관찰할 수 있다.

d. V14, V15와 V17로 보호

삼주 나이의 가금의 네 그룹에 0.2ml 의 재조합형 V8(부의 억제), V14, V15 또는 V17를 접종한다. 닭 당 바이러스의 양은 10^6.4TCID50 이다. 투여방법은 근육내 투여법으로 한다.

21일후, 혈청을 각 동물에서 수집하여 항-IBDV 항체 역가를 평가한다. 백배 IBDV의 치사량을 그룹 V14, V15와 V17의 동물에 주사하고 그룹 V8(재조합형 바이러스 V8을 접종받은 가금그룹)의 몇몇 동물에 주사한다.

11일 후, 즉 예방접종 32일 후, 그룹 V8의 비교동물과 공격으로 생존한 것을 안락사로 죽이고, 비율(활액낭의 중량/가금의 중량) × 100을 측정한다.

그 결과는 다음과 같다:

- 사망율 : 공격으로 죽은 가금 동물의 수는 다음과 같이 나눌 수 있다: V8에 있어서: 12 가금동물/14(85%), V14에 있어서: 21/24(87%), V15에 있어서: 17/25(68%)와 V17에 있어서: 0/25(0%).

다시 말해서, 재조합형 V17로 접종한 모든 가금은 공격에 견디며, 이 그룹 모두가 보호되었다. 더우기, 아무 가금도 질병의 가장 가벼운 임상 신호를 나타내지 않았다. 재조합형 V15로 얻은 32%보호는 상기 실험에서 얻은 50% 보호에 가깝다.

- ELISA : 바이러스에 대하여 평가한 평균역가는 다음과 같다:

V8에 있어서, 역가는 1:100이하이고 부도 예상된다; V14에 있어서, 역가는 1:12800(1:6400 내지 1:51200), V15 에 있어서, 역가는 1:6400(1:800 내지 1:25600), V17에 있어서, 역가는 세 가금동물(1:800, 1:6400 과 1:51200)을 제외하고 1:100이하.

따라서, 재조합형 FPV/IBDV 의 다단백질의 표현에 의하여 일어나는, IBDV에 대한 항체 반응은 매우 높다. 대조적으로 V17에 의하여 일어나는 완전한 바이러스에 대한 반응은 낮다.

- 혈청중화 : PBG68 에 대한 혈청중화 역가는 다음과 같은 평균치를 갖는다: V8, V14와 V15에 있어서, 역가는 1:10이하로 부로 예상된다; V17에 있어서, 20마리중 5마리 가금동물이 1:20 이상의 역가를 가지며, 상세히 말하면 1:20(두번), 1:40, 1:80과 1:320.

따라서, 혈청중화는 V17로 접종한 가금의 혈청에서만 관찰된다.

- 활액낭 : 비율(활액낭의 중량/전체중량)의 평균 ×100은 다음과 같다:

공격받지 않은 V8에 있어서는 비율 0.68(±0.13), 공격받은 V8에 있어서는 비율 0.09(±0.01), V14에 있어서는 비율 0.10(±0.02), V15에 있어서는, 비율 0.13(±0.04)와 V17에 있어서는 비율 0.34(±0.23).

따라서, 파브리시우스의 활액낭의 부분 보호는 그룹 V17에서만 관찰된다. 실제 24마리중 8마리 가금동물이 공격받지 않은 비교물과 유사한 비율을 갖는다. 다른 열 여섯 마리는 공격받은 비교물보다 비율이 더 높다.

[결론]

이들 예방접종 행위의 주요 결론은 다음과 같다:

- IBDV 다단백질 표현하는 재조합체는 바이러스에 대하여 높은 역가를 갖는, 가금에서 강한 ELISA반응을 일으킨다.

- 다단백질의 VP2부분을 표현하는 재조합체가 사망에 대하여 가금을 완전히 보호하고 활액낭의 위축에 대하여 이들을 부분적으로 보호한다.

[플라스미드의 리스트]

명칭 특성

이.콜리로 클론화한 벡터

pUC18 클론 벡터(메싱 1983)

pBSPlus 클론 벡터(스트라타겐)

pBSLK1 다결합체 내에 Bc11과 Bg12 부위를 갖는 pBSPlus

pBSLK2 pBSLK1과 동일하나 Bc11과 Bg12가 역순서로 있다

pACYC184 클론 벡터(장, 1978)

우두 프로모터

pGS20 우두용 접합전달 벡터(맥키트, 1984)

p1P75 Bc11-BamH1내에 우두 프로모터 P7.5를 갖는 pGS20

의 pBSLK1 + Bc11-BamH1 단편

p2P75 p1P75와 동일하나 pBSLK2 내에 있다

p1P11 Bg12-BamH1 내에 우두프로모터 Pll을 갖는 pBSLK1+

40-mer 합성 DNA

p2P11 p1Pll과 동일하나 pBSLK2 내에 있다.

pACP11 p1P11과 동일하나 pACYC184의 Xho2-BamH1 내에 있

다.

LacZ 유전자

pBSMutLacZ1 Bg12-BamH1 카셋트에 LacZ를 갖는 pBSPlus

p75lac Bg12-BamH1에 LacZ를 갖는 p2P75+Bg12-BamH1 카셋

트

p11Lac p75Lac과 동일하나 p2P11에 있다.

pACP11Lac Xho2-HInd3 내 p11Lac의 Bg12-Hind3 단편의

pACYC184+P11-Lac 카셋트

CNP 용 접합전달 벡터

pTIRB1 ORF1과 ORF2 사이의 pTIR1에 BamH1의 삽입

pTIRB2 pTIRB1과 동일하나 ORF2와 ORF3사이에 있다

pTIRB1D pTIRB1과 동일하나, EcoRl-Hpal 단편은 삭제

LacZ 와의 접합전달 벡터

pTIRB1P75Lac BamH1로 클론화된 Bg12-BamH1 단편에 p75Lac의

pTIRB1+P75-Lac 카셋트

pTIRB2P75Lac 상기와 같으나 pTIRB2 내에 있다

pTIRB2LacP75 상기와 같으나 반대 방향에 있다.

pTIRB1P11Lac BamH1로 클론화된 Bg12-BamH1 단편에 p11Lac의

pTIRB1+P11-Lac 카셋트

pTIRB1LacP11 상기와 같으나 반대 방향에 있다

pTIRB2LacP11 상기와 같으나 pTIRB2 내에 있다

IBV의 E2를 갖는 플라스미드

p75M41 P7.5의 하류에 클론화된 혈청형 M41의 E2 유전자

p75D1466 상기와 같으나 혈청형 D1466이다

p75D707 상기와 같으나 혈청형 D207/D274이다

IBV의 E2와의 접합전달 벡터

pTIRB1P75M41Lac TIRB1의 BamH1 부위에 클론화된 M4l과 Pll-Lac의

P7.5-E2 카셋트

pTIRB1P75D1466Lac 상기와 같으나 D1466의 E2이다

pTIRB1P75D206Lac 상기와 같으나 D207/D274의 E2이다

에이머리아의 TA4를 갖는 플라스미드

pTA406 BamH1 카셋트로 클론화된 에이머리아테넬라의

TA4 항원의 cDNA

pTA410 상기와 같으나 단백질 분해 부위가 다르다

p75TA406 P7.5의 하류에 클론화된 TA406유전자

p75TA410 상기와 같으나 TA410 유전자이다

pTIRTA406 pTIRB1D의 BamH1로 클론화된 P7.5-TA406 카셋트

pTIRTA410 상기와 같으나 P7.5-TA410 유전자이다

에이머리아의 TA4와 접합전달 벡터

pTIRTA406Lac TIRB1의 BamH1 부위에 클론화된 M4l과 P11-Lac의

pTIRTA410Lac P7.5-E2 카셋트

상기와 같으나 pTIRTA410 내에 있다.

IBDV을 클론화한 플라스미드

pBSIBDVO pBSPlus(Pstl-Hinc2), 이 삽입물+PCR에 의하여

얻은 단편 EDGAR 0-1b 예 277-bp Pstl 단편

pBSIBDVOb 부위-방향 돌연변이 유발에 의하여 pBSIBDVO로부터

유도

pBS1A2 pBSLK1(Pstl+T4,DNA 중합효소, Sacl)+PCR에

의하여 얻은 단편 EDGAR1-2의 760-bp Sac1 단편

pBS1B pBSLK1(Pstl+T4 DNA 중합효소, Sacl)+PCR에 의하여

얻는 단편 EDGAR1-2의 369-bp Sac1 단편

pEDGAR34i pBSLK1(Pstl+T4 DNA 중합효소, Hinc 2)+PCR에 의하여

얻은 670-bp EDGAR3-4단편

pEDGAR34i 부위-방향 돌연변이 유발에 의하여 pEDGAR34i로 부터

유도

pBS3A pBSLK1(Pstl+T4 DNA 중합효소, Sph1)+PCR에

의하여 얻은 단편 EDGAR 5-6의 345-bp Sphl 단편

pBS3B pBSLK1(Pstl+T4 DNA 중합효소, Sph1)+PCR에

의하여 얻은 단편 EDGAR 5-6의 345-bp Sphl 단편

pEDGAR12 부위-방향 돌연변이 유발에 의하여 pEDGAR12로부터

유도

pEDGAR12 pBSIA2(EcoRl+T4 DNA 중합요소, sacl)+pBSlB

단편(Sph1+T4 DNA 중합요소, sacl)

pACEDGARM12 pACYC184의 Bc11-Sph1 부위에 pEDGARM12의 Bc11-Sph1

단편의 삽입

pEDGAR45 pBS3A(Hinc2-Pstl)+pEDGAR34i의 Hinc2-Pstl 단편

pACEDGAR14 pACEDGARM12(Sphl+T4 DNA 중합효소, BamH1)

+pEDGARM34i 단편(Nsil+TA4 DNA 중합효소, BamH1)

pACEDGAR15 pACEDGAR14(BamH1+T4 DNA중합효소, Sa11)+

pEDGAR45 단편 (Pvu2-Sa11)

pACEDGAR pACEDGAR15(Sph1-EcoRV)+pBS3B 단편 (Sph1-Pvu2)

pACEDGAR2 pBSIBDVO의 Bc11-Rsr2 단편으로 pACEDGAR1의

Bc11-Rsr2 단편의 대치

pACEDGAR3 pBSIBDVOb의 Bc11-Rsr2 단편과 같다

IBDV와 우두 프로모터를 갖는 플라스미드

p75EDGAR1 p2P75의 BamH1 부위에 삽입된 pACEDGARl의

Bc11-BamH1단편

p75EDGAR2 pACEGAR2의 Bc11-BamH1 단편과 동일하다

p75EDGAR3 pACEDGAR3의 Bc11-BamH1 단편과 동일하다

p11EDGAR1 pACEDGAR1의 BamH1 부위에 삽입된 pACP11의 P11을 갖

는 Bc11-BamH1

p11EDGAR2 상기와 같으나 플라스미드 pACEDGAR2 내에 있다

p11EDGAR3 상기와 같어나 플라스미드 pACEDGAR3내에 있다

IBDV 단독과의 접합전달 벡터

pTIR75EDGAR1 pTIRB1의 BamH1 위치에 삽입된 p75EDGAR1의

Bc11-BamH1 단편

pTIR75EDGAR2 플라스미드 p75EDGAR2와 동일한다

pTIR75EDGAR3 플라스미드 p75EDGAR3와 동일하다

pTIR75EDGAR1 플라스미드 p11EDGAR1와 동일하다

pTIR75EDGAR2 플라스미드 p11EDGAR2와 동일하다

pTIR75EDGAR3 플라스미드 p11EDGAR3와 동일하다

pTIR11E1LAC pTIR11EDGAR1의 BamH1로 삽입된 p75LAC의

Bg12-BamH1 단편

pTIR11E2LAC 플라스미드 pTIR11EDGAR2와 동일한다

pTIR11E3LAC 플라스미드 pTIR11EDGAR3와 동일한다

pTIR11VP2LAC pTIR11E1LAC의 PpuM1(T4 DAN 중합효소)-Bg12

부위에 클론화된 p11EDGAR1의 Xho1(T4 DNA 중합효소)-

Bg12 단편과 동일하다

[참고문헌]

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유기물의 리스트

명칭 특성

1. 이.콜리 박테리아

MC1061 araD139, (ara, leu)7697, lacX74, galU,

galK, strA (파마시아)

JM1110 이의 Dam-표현형(N3837 dam4)에 사용

2. CNP 바이러스

LVCO USDA의 표준 가금폭스 공격 균주

CNP 가금폭스 왁찐 균주(솔베이)

V3 TIRB1에서 P7.5-LacZ 카셋트를 갖는 재조합형

CNP바이러스

V4 V3와 동일하나, 카셋트가 TIRB2에 있다

V5 V4와 동일하나, 카셋트가 반대방향에 있다

V8 V3와 동일하나, 카셋트가 P11-Lac이다

V9 V8과 동일하나, 카셋트가 반대방향에 있다

V10 V9와 동일하나 카셋트가 TIRB2에 있다

3. IBDV 바이러스

EDGAR EDGAR 균주, 닭에 3회와 초기 계란에 1회

번식시킨 오우번 대학의 S.A. EDGAR로부터

미국인이 단리시킨 것. USDA표준공격

849VB 반 덴 버그등, 1991에 의하여 서술된 병원 균주

PBG98 CEF 세포에 적응된 균주

Bursine2 QT35 세포에 적응된 왁찐 균주

4. 세포

QT35 메추라기 세포선

CEF 닭 배 섬유아세포

5. CNP 바이러스

V11 카셋트 P11Lac와 P7.5E1 보균

V12 카셋트 PllLac와 P7.5E2 보균

V14 카셋트 P7.5E1과 P11Lac보균

V15 카셋트 P7.5E2와 P11Lac보균

V16 카셋트 P7.5E3와 P11Lac 보균

V17 카셋트 P7.5VP2와 P11Lac 보균

6. CNP/TA4바이러스

V21 카셋트 P11Lac와 P7.5TA410 보균

프라이머의 배열과 리스트

번호 5' 내지 3' 배열 보체

5169 5'CCTTTACTGTTAGTTCTACAATCGAAATTATGC 3' FPV

5168 5' CATGTAGATTTTAATCCGTTAACACGCGCAG 3' FPV

3254 5' GCCGGAAAACCTACCGGATTGATGG 3' Lac

1871 5' GAAACCAGGCAAAGCGCC 3' Lac

IBDV16 5' CCAGGGTGTCGTCCGGAATGG 3' IBDV

IBDV1b 5' CCCAAGATCATATGATGTGGGTAAGCTGAGG 3' IBDV

IBDV3 5' TGAGCAACTTCGAGCTGATCCCAAATCCTG 3' IBDV

IBDV22 5' CTGCTCTTGACTGCGATGGAG 3' IBDV

Claims (13)

1. 게놈의 비필수 부분에 아비폭스 바이러스에 대하여 이종인 단백질의 모두 또는 일부분을 기호화 하는 최소한 하나의 DNA 배열과 재조합형 바이러스에 의하여 감염된 세포 내에서 이 단백질을 표현할 수 있는 요소를 함유하고, 아비폭스 바이러스의 독성 약화된 균주에서 유도된 재조합형 아비폭스 바이러스에 있어서, 게놈의 비필수 부분이 60 이상의 누클레오티드 배열을 갖고, 이들의 표현신호를 포함하는 두 개방형 판독틀(ORF) 사이에 위치하는 비암호 유전자간 영역으로 구성되고, 이 유전자간 영역을 TIR(말단 역방향 중복)영역의 ORF 1과 ORF2 사이에 위치하는 β1 영역 이라 불리우는 영역과 TIR 영역의 ORF 2와 ORF 3 사이에 위치하는 β2 영역이라 불리우는 영역에서 선택함을 특징으로 하는 재조합형 아비폭스 바이러스.
2. 제1항에 있어서, 가금폭스 바이러스의 독성 약화된 균주로부터 유도함을 특징으로 하는 바이러스.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 최소한 하나의 DNA 배열이 바이러스의 두 TIR영역으로 클론화 됨을 특징으로 하는 바이러스.
4. 제3항에 있어서, DNA 배열이 두 TIR 각 내부의 β1영역으로 클론화 됨을 특징으로 하는 바이러스
5. 제1항에 있어서, 이종 단백질을 전염성 활액낭병 바이러스(IBDV), 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 닭 빈혈증을 일으키는 바이러스(CAV), 콕시디움증을 일으키는 원생동물 에이머리아, 뉴카슬병 바이러스(NDV)와 마렉스병 바이러스(MDV)의 항원에서 선택함을 특징으로 하는 바이러스.
6. 제5항에 있어서, 이종 단백질을 전염성 활액낭병 바이러스(IBDV), 전염성 기관지염 바이러스(IBV), 닭 빈혈증을 일으키는 바이러스(CAV)와 원생동물 에이머리아에서 선택함을 특징으로 하는 바이러스.
7. 제6항에 있어서, 이종 단백질을 다단백질과 IBDV의 다단백질의 부분으로 이루어지는 개방형 판독틀의 모두 또는 일부분, IBV의 항원 E2, 에이머리아의 표면 항원 TA4와 CAV의 단백질 P50에서 선택함을 특징으로 하는 바이러스.
8. 제7항에 있어서, 이종 단백질이 아미노산 1 내지 493 다음 아미노산 1010 내지 1012를 함유하는 다단백질의 부분임을 특징으로 하는 바이러스.
9. 제1항, 제2항, 제3항과 제4항 내지 제8항중 어느 하나에 따른 제조합형 아비폭스 바이러스로 감염된 진핵세포의 배양물.
10. 제9항에 있어서, 배양물이 가금세포에 관한 것임을 특징으로 하는 배양물.
11. 제1항, 제2항, 제3항과 제4항 내지 제8항중 어느 하나에 따른 바이폭스 바이러스를 함유함을 특징으로 하는 왁찐.
12. 이종 단백질의 모든 또는 일부분을 기호화 한 DNA 배열을 제1항, 제2항, 제3항과 제4 내지 제8항중 어느 하나에 따른 아비폭스 바이러스의 게놈에 삽입할 수 있는 접합전달 배열.
13. 제12항에 따른 배열을 갖는 풀라스미드.