FR2741631A1 - Adn recombinant codant pour les proteines de capside du parvovirus du canard - Google Patents

Abstract

Sous un premier aspect, l'invention réside dans des molécules d'ADN recombinant comprenant les séquences d'ADN codant pour les protéines VP2 et VP3 du parvovirus du canard, ou de fragments ou des dérivés de ces séquences codant pour des polypeptides pouvant induire une réponse immunitaire. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne les molécules d'ADN recombinant nu ou constituant un vecteur d'expression ou un microorganisme ou une cellule ainsi transformés. Sous d'autres aspects, la présente invention comprend les protéines de capside VP2 et VP3 préparées par génie génétique. Les produits mentionnés et les préparations les contenant trouvent des applications comme vaccins, sérums et réactifs de diagnostic.

Description

Domaine dc 1'inveuaon
La présente invention concerne des séquences d'ADN, les molécules d'ADN recombinant et les procédés pour la production des ADNs recombinants et des protéines de capside du parvovirus du canard ou de polypeptides équivalents, les produits obtenus et les préparations les contenant, plus particulièrement pour des buts de diagnostic, de vaccination, d'immunothérapie ou de thérapie génique.

Amére-plan technolog c
Le parvovirus du canard DPV est l'agent causal (Jestin, 1990, Fournier, 1991, Jestin et coll., 1991) d'une maladie apparue en France en 1988-1989 (Jestin, 1990, Drouin et coll., 1991), dénommée successivement "syndrome de malabsorption, mortalité, déplumement, reptation: SMMDR", puis "maladie de Derzsy", en raison d'une part des nombreuses analogies avec cette maladie décrite depuis 196s1965 chez l'oie (Derzsy, 1967) et depuis 1972 chez le canard (Gaudry et Tetkoff, 1973) et d'autre part de l'importance des communautés antigéniques entre le parvovirus de la maladie de Derzsy dénommé parvovirus de l'oie (GPV) et le parvovirus de canard.(Jestin, 1990, Jestin et coll., 1991), enfin désignée parvovirose du canard" pour insister sur les critères la différenciant de la maladie de Derzsy. En effet, l'évolution de ces deux maladies est liée à la fois à l'âge où les animaux la contractent et à leur immunité: les canetons de moins de 2 semaines sans immunité ou présentant une immunité médiocre sont pleinement sensibles et manifestent une forme aiguë conduisant à une mortalité élevée, alors que les animaux plus âgés présentent, selon les différentes combinaisons des 2 paramètres précités, tout un gradient de manifestations plus ou moins sévères alliant de la forme chronique caractérisée par de la prostration, un arret de croissanc;, des défauts d'emplumement, une mortalité plus ou moins faible, à l'absence de symptômes en passant par une seule perte de poids (Coudert et coll., 1972, Coudert et coll., 1973, Jestin, 1990, Jestin et coll., 1993).

Mais la parvovirose diffère de la maladie de Derzsy par le fait qu'elle ne touche pas l'oie (Fournier, 1991) et qu'elle induit des manifestations nerveuses d'une part (Plassiart, 1991), des formes aigus d'une sévérité accrue d'autre part (Jestin, 1990, Fournier, 1991, Jestin et coll.,1991). De plus le parvovirus du canard présente quelques différences antigéniques avec le
GPV et son niveau de réplication en culture et dans les organes est beaucoup plus élevé (Fournier, 1991, Jestin et coll., 1991, Jestin et coll., 1995a).

Pour prévenir la parvovirose du canard, des moyens de prophylaxie médicale ont été mis en place sur le terrain. lls consistent à administrer par voie sous-cutanée au caneton d'1 jour un vaccin associant extemporanément une valence correspondant au virus atténué GPV et ur > e valence correspondant au virus inactivé DPV en adjuvant aqueux La rime intervention est réalisée entre 14 et 21 jours d'âge (préférentiellement à 14 jours) (Recommandations du fabricant). Par ailleurs, afin que le caneton bénéficie d'une immunité maternelle dans les premiers jours de sa vie, les reproducteurs reçoivent un rappel avant l'entrée en ponte consistant en l'administration par voie sous-cutanée d'un vaccin bivalent (associant les valences
GPV et DPV) en adjuvant huileux (Fournier et Gaudry, 1992, Jestin et coll., 1992, Jestin et coll., 1993). Bien que ce protocole vise à procurer une immunité maternelle protégeant le caneton dans sa première semaine de vie et à l'immuniser activement en relais, la qualité de la protection apportée aux canetons de 2 à 3 semaines est incertaine (Jestin et coll., 1993). De plus l'immunité acquise peut ne pas se maintenir à un niveau suffisant pendant toute la période de réceptivité du caneton qui est d'environ 35 jours (Jestin et Coll., 1993). Ces failles peuvent expliquer les formes chroniques qui sont toujours observées sur le terrain dans un certain nombre de cas et qui sont responsables de pertes économiques (Balloy, 1995).

Il y a donc besoin d'améliorer la stratégie vaccinale. Le recours aux techniques de génie génétique peut apporter une solution à condition de disposer de données sur la structure moléculaire de ce virus. Une étude biochimique et génomique de ce virus réalisée récemment (Le Gall - Reculé et Jestin, 1994) apporte les éléments suivants.

Le virus DPV est classé dans les parvovirus autonomes ; il a une taille de 22-23 nm et une densité de 1.39 à 1.42 en CsCI. Les particules virales sont constituées de 3 protéines de capside de 91, 78 et 58 kDa en SDS-PAGE et d'un ADN sirnple brin de 5 300 bases présentant des extrémités palindromiques en forme d'épingles à cheveux La moitié des virions présentent un brin d'ADN de polarité positive, l'autre moitié un brin d'ADN de polarité négative. Une carte de restriction du génome a été aussi établie.

Alors que le génome de la plupart des parvovirus de mammifères a été séquencé, il n'existe aucune publication concernant la séquence nucléotidique du parvovirus du canard.

Cette absence de données bloquait toute mise au point de molécules d'ADN recombinantes comprenant des séquences codant pour des protéines immunogènes à intérêt diagnostique et vaccinal.

Résumé dc I'inveniion
Sous un premier aspect, I'invention réside dans des molécules d'ADN recombinant comprenant les séquences d'ADN codant pour les protéines VP2 et VP3 du parvovirus du canard, ou de fragments ou des dérivés de ces séquences codant pour des polypeptides pouvant induire une réponse immunitaire.

Selon un deuxième aspect, l'invention concerne les molécules d'ADN recombinant nu ou constituant un vecteur d'expression ou un microorganisme ou une cellule ainsi transformés.

Sous d'autres aspects, la présente invention comprend les protéines de capside VP2 et
VP3 préparées par génie génétique.

Les produits mentionnés et les préparations les contenant trouvent des applications comme vaccins, sérums et réactifs de diagnostic.

Descnption des figures d des tableaux
Figure 1: Stratégie de clonage de fragments d'ADN bicaténaire du virus DPV dans le vecteur pBluescript (pBS SK). Le clone pDPV2 a été construit par ligation du fragment de 2950 bp généré par la digestion de l'ADN du DPV par BgE, dans le pBS SK digéré par BoenIll et
EcoRV. Les abréviations utilisées pour désigner les sites de restriction sont : BH > BamHt ; B, Bgm; E, EiBoRV; H; HinalII; K, nmI.

Figure 2: Séquence nucléotidique de la partie d'intérêt du fragment cloné du génome du DPV.

Ce fragment inclut la totalité de la fenêtre de lecture droite. La séquence en acides aminés déduite pour le premier cadre de lecture est indiquée sous la séquence nucléotidique. Le codon d'initiation de la VP2 (ACG) est en position 670, celui de la VP3 (G) est en position 829.

Le premier codon stop (TAA) se termine au nucléotide 2433.

Figure 3 : Organisation du génome (brin de polarité positive) dans les 3 cadres de lecture, dans la portion correspondant environ aux unités 44 à 91 de la carte de restriction.

Figure 4 : Alignement des séquences en acides aminés des protéines de capside du DPV et de parvovirus de mammiferes.

Les séquences suivantes étaient disponibles dans la banque de données SWISS-PROT 26 (08- 93):
COAT PAVBO (Parvovirus bovin BPV, souche non mentionnée)
COAT PAVHB (Parvovirus humain B19, souche AU)
COAT ADVG (Parvovirus de la maladie aléoutienne du vison ADV, souche G)
COAT PAVPN (Parvovirus porcin PPV, souche NADL-2)
COAT PAVC7 (Parvovirus canin CPV, souche 780929)
COAT MUMIV (Parvovirus murin MVM, souche prototype)
Les références de la séquence AAV2 utilisée sont mentionnées dans la description détaillée de l'invention, en matériel et méthode.

Les séquences ADV-G, MVM (p) ont été modifiées comme décrit en matériel et méthode. Les acides aminés figurant en caractères gras montrent une identité avec ceux du DPV. Les motifs d'aa très conservés au sein des parvovirus sont encadrés, de même que la région riche en glycine chez les parvovirus des mammiferes.

Figure 5 : Alignement de la séquence en acides aminés des protéines de capside du DPV et du parvovirus de l'oie
Ce dernier représenté sous rabrévation "GOOSEPAR", correspond à la souche SHM 319 (ATCC). La séquence prise en compte est celle publiée par Brown et coll.(1995), arrêtée à acide aminé 674. Celui précède un signal d'arrêt dont l'existence est remise en cause par ces mêmes auteurs. La séquence du DPV est désignée dans cette figure sous l'abréviation "DPVlP".

Figure 6 : Analyse par Western-blot des protéines recombinantes de DPV à l'aide d'un antisérum spécifique du DPV
A) Lysat total de cellules 519 infectées par le baculovirus sauvage AcMNPV (ligne 2) et le baculovirus recombinant AcDPVl 14 (ligne 3); marqueur de poids moléculaire (ligne 1)
B) Virions purifiés sur gradient de CsCI (ligne 2); marqueur de poids moléculaire (ligne 1).

Figure 7 : Etude en immunofluorescence : (A) de cellules Sf9 infectées par le baculovirus recombinant (AcDPV114), (B) de cellules infectées par du baculovirus sauvage (AcMNPV).

Figure 8 : Morphologie en microscopie électronique des capsides vides recombinantes de DPV (A) et des particules virales de DPV purifiées sur gradient de chlorure de césium (B).

L'échelle représente 100 nm.

Tableau 1 : Anticorps spécifiques du DPV chez des canards inoculés avec le baculovirus recombinant (AcDPV1 14) en adjuvant huileux.

ll n'a pas été détecté d'anticorps, que ce soit par ELISA ou par séroneutralisation (SN), chez les canards ayant reçu le baculovirus sauvage en adjuvant huileux.

Les canards contact ne présentaient pas d'anticorps ELISA (SN non réalisée).

Il n'a pas été retrouvé d'anticorps ELISA (SN non réalisée) lors du contrôle pratiqué juste avant la 1 ère inoculation (contrôle A).

(1) moyenne d'au moins 3 répétitions; (écart-type).

(2) moyenne statistique de 3 répétitions exprimée en log2 par la méthode de Spearman-Karber (Finney, 1964).

(3) cet individu a reçu 1/5, 1/4 et 3/4 de la dose reçue par les autres sujets, respectivement à la être, 2 de et 3ème inoculation.

B, C, D = contrôles réalisés respectivement juste avant la 3ème inoculation ; puis 2 et 3 semaines après.

Tableau 2 : Anticorps spécifiques du DPV chez des canards vaccinés avec le vaccin Parvol
Il n'a pas été retrouvé d'anticorps juste avant la 1ère inoculation (contrôle A).

B, C, D : contrôles réalisés juste avant le rappel, puis 2 et 3 semaines après.

SN: séroneutralisation (résultats exprimés en log2) m: moyenne de 12 résultats individuels.

Description détaillée de l 'invention
Matériel et méthode
La souche 89384 de parvovirus du canard (DPV) a été isolée par Jestin et col!.(1991) à partir d'un mélange de foie, rate, coeur provenant de canards de Barbarie atteints de parvovirose. Le virus a été purifié sur gradient de CsCl et l'ADN viral extrait comme décrit par
Le Gall - Reculé et Jestin(1994). L'ADN ainsi obtenu était bicaténaire en raison du réappariement des brins positifs et négatifs (Le Gall-Reculé et Jestin, 1994).

Clonage moléculoirc du gène codant pour les protéines de capside du parvovirus
Pour obtenir les clones pDPV2 (figure 1) contenant le gène entier codant pour les protéines de capside de DPV, les extrémités de l'ADN bicaténaire réhybridé comme mentionné, ont été réparées avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase de E. cofi comme décrit antérieurement (Le Gall - Reculé et Jestin, 1994), puis l'ADN a été digéré avec la mung bean nucléase pour obtenir des extrémités à bouts francs. Cet ADN ainsi préparé a été digéré avec BgIII (en raison de l'existence d'un site de restriction situé en position 44 de la carte de restriction établie par Le Gall - Reculé et Jestin, 1994). Le fragment résultant de 2 950 bp de l'ADN du DPV, a été cloné dans le vecteur pBluescript préalablement digéré avec BamHI et
EcoRV. La ligation a été réalisée à 16 C pendant la nuit.

Des bactéries XL1-Blue rendues compétentes ont été transformées avec les plasmides selon le protocole de Sambrook et coll. (1989). L'ADN des plasmides recombinants a été extrait selon la méthode de lyse par ébullition (Sambrook et coll., 1989) et identifié par électrophosèse sur gel d'agarose après digestion avec les enzymes KpnI, BstXI, EcoRI, selon la carte de restriction établie antérieurement (le Gall - Reculé et Jestin, 1994), de manière à sélectionner les fragments d'ADN les plus longs.

Séquençage dc l'ADN codant pour les protéines de capside
La séquence nucléotidique des 2 brins a été déterminée par la méthode de Sanger et coîl. (1977), appliquée à des matrices plasmidiques circulaires fermées double brin. Une amorce universelle M13-20, puis des oligonucléotides de synthèse, complémentaires de la séquence du DPV, ont été utilisés. Certaines portions de la séquence ont été confirmées ultérieurement à l'aide d'un séquenceur automatique d'ADN.

Analyse des séquences
La séquence protéique du DPV, déduite de la séquence nucléique présentée en figure 2, a été alignée avec 7 séquences de parvovirus de mammifères (Fig 4). Celles-ci provenaient de la banque de données SWISS-PROT Release 26 (08/93) actualisée en fonction de la bibliographie. Ainsi les séquences des parvovirus de la maladie aléoutienne du vison (ADV) et du virus MVM ont été modifiées de manière à prendre en compte les processus d'épissage décrits respectivement par Alexandersen et coll.(1988) ; Astell et coll.(1986). En ce qui concerne le virus AAV2, la séquence entière du gène codant pour les trois protéines de capside a été traduite après l'avoir modifiée en fonction des corrections apportées par Cassinotti et coll.(1988), Trempe et Carter (1988), Ruffing et coll.(1994).

Les séquences des parvovirus du chat (FPV), du raton laveur (RPV), de l'entérite du vison (MEV), n'ont pas été prises en compte dans l'alignement car elles montrent une homologie de plus de 98 % avec le parvovirus canin (CPV) inclus dans l'étude, sur la portion de génome codant pour les protéines de capside (Parrish et coll., 1988). De même le parvovirus (Lu m), le parvovirus du hamster (H1) n'ont pas été intégrés car ils présentent 80 % d'homologies de séquence avec le parvovirus de la souris (MVM) pris en compte dans l'alignement (Diffoot et coll., 1993).

De plus, pendant le temps de rédaction de ce brevet, la séquence partielle du gène codant pour les protéines de capside d'un parvovirus de l'oie (souche SHM 319 provenant de l'ATCC), a été publiée (Brown et coll.,1995). C'est pourquoi un alignement des séquences en acides aminés du DPV et du parvovirus de l'oie a été réalisé séparément (figure 5).

Construction drun plasmide recombinant navette
Le gène codant pour les protéines VP2 et VP3 a été amplifié par la technique de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant comme matrice d'ADN, le plasmide purifié pDPV2 décrit précédemment et comme amorces, l' oligonucléotide 5'CCCCATGGATGGC
TCCTGCTAA3' et l'oligonucléotide reverse 5'CCCCATGGAAAACAAAAGAA3'.

Ces oligonucléotides correspondaient dans leur partie soulignée spécifique du virus DPV, aux nucléotides 670 à 683 et 2455 à 2443 selon la numérotation de la fig 2. Ce procédé a permis de muter le codon ACG d'initiation de la traduction de la VP2 en un codon ATG et d'introduire un site de restriction NcoI utile pour le clonage ultérieur. L'amplification a été réalisée selon les conditions détaillées par Jestin et coîl. (1995) à la différence qu'après l'étape de dénaturation de S minutes à 950 C, il a été effectué 5 cycles de 20 s à 950 C, 30 s à 500 C, 30 s à 750 C, puis 30 cycles supplémentaires de 20 s à 95" C, 30 s à 55,5 C et 30 s à 750 C. L'étape d'élongation finale était de 6 min à 75" C. L'ADN amplifié ayant la taille attendue sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium, a été élué, digéré par NcoI et cloné au niveau du site NcoI du plasmide navette pGmAc3MR (donné par G. Devauchelle : INFRA, CNRS UA N84, St Christol - les
Ales, France) préalablement déphosphorylé. Les plasmides recombinants possédant un seul insert dans l'orientation correcte ont été sélectionnés après analyse de leurs sites de restriction.

Un des plasmides recombinants, dénommé p1 14, a été retenu après que sa séquence nucléotidique ait été vérifiée à l'aide d'un séquenceur automatique d'ADN Cotransfedion ct identificcion des bacrtlovirus recombinants
Les modalités utilisées ont été adaptées du procédé décrit par Summers et Smith, 1987.

500 ng de l'ADN purifié du baculovirus sauvage d'Altographa californica (AcMNPV) et 5 g de l'ADN du plasmide recombinant pi 14 ont été mélangés avec 1,5 ml de milieu de culture TC 100 et laissés en contact pendant Ih. 40 Cll de réactif de transfection DOTAP N-[1-(2,3 Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamonium methylsulfate dilués dans 1,5 ml de milieu de culture, ont été ensuite ajoutés au mélange précédent et laissés en contact pendant 15 min à température ambiante. A l'issue de ce temps, cette préparation a servi à transfecter 2 x 106 cellules de la lignée cellulaire d'insecte Spodoptera ftiigiperda 9 (su9), préalablement maintenues Ih à température ambiante. Les cellules ont alors été incubées à 28 C pendant 6 h, puis le milieu de culture a été renouvelé avec du Toc 100 supplémenté avec 5 % de sérum de veau foetal. Les cellules ont été incubées pendant 5 jours supplémentaires. Après ce délai, les plages de cellules infectées par des baculovirus recombinants ont été sélectionnées sur la base de l'absence de polyèdre, puis purifiées 2 fois. La pureté des populations recombinantes a été vérifiée en examinant des tapis de cellules Sf9 infectées colorées au rouge neutre et en recherchant l'absence d'inclusions protéiques nucléaires. Les clones obtenus ont été amplifiés de manière à confirmer la présence de l'insert par analyse de leur carte de restriction. A cette fin, 1'ADN des baculovirus sauvages et recombinants a été digéré avec EcoRI et les fragments générés ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose.

Expression et identif cefion des protéines recombinantes de DPV
Des cellules S19 ont été infectées à une m.o.i de 10 PFU/cellule avec les baculovirus recombinants ou sauvages. Les cellules ont été récoltées 48 ou 65 h après l'infection, lavées avec du PBS froid et mises au culot. Les protéines totales correspondant à 2 x 105 cellules mises au culot, ont été lysées par chauffage à 95" C pendant 5 min dans un tampon de dénaturation et soumises à une électrophorèse SDS-PAGE sur un gel à 10 %. En vue d'être analysées par Western-Blot, les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose qui a été ensuite bloquée pendant 30 min à température ambiante avec une solution de TBS (200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH7.4), additionnée de 3 % de lait en poudre écrémé et de 0,05 % de tween 20. Un ante sérum de canard, spécifique du parvovirus du canard et dilué au 1/100 dans la solution de blocage précitée renouvelée, a été ensuite incubé pendant une nuit à température ambiante avec la membrane ainsi traitée. Après 3 lavages en
TBS, la membrane a été incubée avec un conjugué anti-immunoglobuline IgG(H + L) de canard marqué à la peroxydase et dilué au 1/200 en TBS. Après 3 nouveaux lavages, la membrane a été révélée avec une solution de TBS contenant 0,5 mg/ml de 4-chloro-1-naphtol, 17 % (v/v) méthanol et 0,015 % d'eau oxygénée.

immunofluorescence indirecte
2 x 104 cellules Sf9 infectées par les baculovirus sauvages ou recombinants et diluées dans un tampon PBS, ont été dispensées dans chacun des puits d'une lame spéciale pour immunofluorescence et séchées à l'air. Après fixation, les cellules ont été incubées pendant 1 h à 37 C soit avec un antisérum de canard spécifique des parvovirus du canard, soit avec un antisérum provenant de canards exempts d'organismes pathogènes spécifiés (E.O.P.S.).

Chacun de ces sérums était dilué au 1/50 dans du Tris-HCl 20 mM, pH 8,6. Après lavage au
PBS, les cellules ont été incubées pendant 1h à 37 OC avec un sérum de lapin antiimmunoglobuline IgG (H + L) de canard marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine, dilué au 1/100 dans le Tris-HCl précédent additionné de 0,01 iO de bleu d'Evans.

Purif cotion des particules vides de DPV d microscopie électronique
Les cellules Sf9 infectées par les baculovirus recombinants comme précédemment mentionné, ont été lavées en PBS froid, suspendues dans un tampon Tris-HCl 10mM pH 8 contenant 1 % déoxycholate, 0,1 % SDS, 0,1 mM EDTA. Les cellules ont été alors incubées dans la glace pendant 30 min et centrifugées 12000 g, 10 min, à 40 C. Le surnageant obtenu a été déposé sur un double coussin de saccharose de respectivement 50 et 30 % (poids/vol) et ultracentrifugé à '90 000 g pendant 2 h à 4" C. L'interface a été ensuite diluée en PBS t centrifugée à 200 000 g pendant 2 h à 4" C.

Après reprise du culot en PBS et coloration à l'acide phosphotungstique, la préparation a été examinée au microscope électronique.

A titre de comparaison des virions de DPV sauvage, purifiés sur gradient de CsCl comme décrit antérieurement (Le Gall - Reculé et Jestin, 1994) ont été colorés et examinés de la même façon.

Immunisation de candons avec les haculovirus sauvages et recombincnts
Dix-neuf canards de Barbarie de 3 semaines d'âge, exempts d'organismes pathogènes spécifiés, ont été répartis en 3 groupes comme suit. Huit et cinq de ces canards appartenant aux 2 premiers groupes ont reçu 3 injections à 2 semaines d'intervalle de cellules Sf9 infectées respectivement soit avec un baculovirus recombinant (RB), soit avec du baculovirus sauvage (WB) et mélangés avec l'adjuvant P (adjuvant huileux inclus dans le vaccin Parvol Rhône
Mérieux, France, contre la parvovirose du canard). Les cellules avaient été infectées à une m.o.i de 15 à 30 PFU/cellule, récoltées 48 à 60 h après et lavées 3 fois dans du PBS froid. La réalisation de l'émulsion avec l'adjuvant était conforme aux recommandations du fabricant.

Chaque injection était constituée de 107 cellules infectées adjuvées sous un volume de 1 ml.

Les 6 canards restants constituaient le 3ème groupe et ont été placés en contact étroit avec les canards précédents (CT).

Afin de vérifier l'absence d'anticorps spécifiques avant l'essai, des sérums ont été récoltés juste avant la première inoculation à partir de 10 canetons pris au hasard. Ensuite des sérums ont été récoltés à partir de chacun des canards avant la 3ème injection, puis 2 et 3 semaines après celle, et traités par les tests ELISA et de séroneutralisation.

Immrtnrration dc cantons avec Ic vaccin du commerce Parvol
Douze canetons de Barbarie EOPS de 16 jours d'âge ont reçu par voie sous-cutanée 1 dose/0,3 ml du vaccin bivalent (associant la souche GM du parvovirus du canard avec la souche Hoekstra du parvovirus de l'oie), inactivé, en adjuvant huileux Parvol (Rhône
Merieux, France). Ils ont subi un rappel dans les mêmes conditions 4 semaines plus tard. Des sérums ont été récoltés individuellement à partir des prises de sang pratiquées juste avant chacune des vaccinations, puis 2 et 3 semaines après le rappel. Ils ont été analysés selon les techniques ELISA et de séroneutralisation décrites ci-dessous.

Test ELISA Parvovirus
Le test de référence mis au point dans notre laboratoire et diffùsé aux laboratoires de diagnostic, a été utilisé (technique ELISA pour la détection des anticorps vis-à-vis des parvovirus du canard (virus de la maladie Derzsy inclus) : version mise à jour Septembre 1993,
CNEVA Ploufragan). En bref, des plaques pour essai immunoentymatique sont sensibilisées avec les antigènes positifs et négatifs du commerce ajustés aux dilutions recommandées dans un tampon carbonate pH 9,6. Une fois les sérums incubés, la présence d'anticorps liés à l'antigène positif permet la fixation du conjugué à la peroxydase mentionné au paragraphe "Expression et identification des protéines recombinantes de DPV" La réaction est révélée par de Vorthophenylènediamine diluée dans un tampon phosphate/acide citrique pH5 classique, additionné de H202 Les résultats sont ajustés à une valeur de référence (= 0,880) du sérum positif qui est sa densité optique (DO) à 490 nm et exprimés sous la forme d'un rapport:
DO échantillon - 0,190 x 10
0,880 - 0,190 0,190 correspondant à la valeur du seuil de positivité.

Chacun des sérums mentionnés au paragraphe précédent a été testé au moins 3 fois.

Séroneutralisation
Les sérums provenant des canards appartenant aux groupes RB et WB ont été traités.

Après avoir été décomplémentés, ils ont été dilués de 1/4 en 1/4 à partir de la dilution initiale 1/10 dans du milieu Eagle modifié McPherson- Stocker BHK 21, supplémenté avec 2 % de sérum de canard de Barbarie EOPS et d'antibiotiques. lis ont été mélangés à raison de 75 i1 de chacune des dilutions de sérum répétées 3 fois, avec 32 DICC50 (dose infectieuse 50% en culture cellulaire) de la souche de parvovirus (GM22 Rhône Mérieux - France) et incubés pendant 30 min., à 37 C. Ensuite, 150 il d'une suspension cellulaire de fibroblastes d'embryon de canard de Barbarie EOPS (5 x 105 cellules/ml) dans le même milieu que précédemment, ont été ajoutés et incubés à 37 C avec 1% C02.

Après 2 renouvellements des milieux de culture, 24 h et 5 jours après la mise en culture, les cellules ont été observées 8 jours après l'inoculation. Le titre de chaque sérum a été calculé selon la méthode de Spearman-Kärber (Finney, 1964).

Résultats
Clonage d siqrrence du gène codant pour les protéines de capside
A partir do clone pDPV2, une séquence nucléotidique de 2487 nt a pu être établie sur les 2 brins. Elle est représentée dans la figure 2. Les fenêtres de lecture (ORF) de cette séquence sont indiquées sur la figure 3. Dans le premier cadre de lecture, une grande ORF est présente se situant entre les nucléotides 223 et 2430 et correspondant environ aux unités 48 à 90 de

L'alignement de la séquence protéique du DPV avec la séquence partielle du parvovirus de l'oie (GPV), révèle une homologie de 87.5% (figure 5). Plusieurs grandes régions sont similaires entre les 2 séquences (notamment dans des zones où chacune des séquences est très homologue avec l'AAV2). Mais l'extrémité aminée de la VP2 (acides aminés 174 à 188) montre des différences importantes.

Expression des protéines de capside VP2 et VP3 du DPV
Le gène codant pour la VP2 qui comporte le codon d'initiation de la traduction de la
VP3, a été amplifié par PCR à partir du plasmide pDPV2 précité. L'amplifiat digéré par NcoI a été cloné avec succès dans le vecteur navette pGmAc3MR et le séquençage de l'insert d'un plasmide recombinant (p1 14) ne montrait pas de différence par rapport à la séquence correspondante préalablement établie. Ce plasmide a donc été utilisé avec l'ADN du baculovirus sauvage AcMNPV pour cotransfecter des cellules Sf9. L'analyse du profil de restriction généré par EcoRI à partir de l'ADN de 3 baculovirus recombinants, a prouvé qu'un fragment de la taille attendue avait bien été inséré dans le gène de la polyédrine de chaque baculovirus sauvage. L'un des 3 clones a été utilisé pour exprimer les protéines recombinantes et a été nommé AcDPV114.

L'analyse par Western-blot des protéines d'un extrait cellulaire total a montré 2 bandes d'intensité approximativement semblables qui correspondaient à 2 protéines exprimées et reconnues par le sérum spécifique anti-DPV (Fig. 6). Leur poids moléculaire relatif de 73 et 59 kDa correspondait à celui respectivement de la VP2 et de la VP3 du DPV établi par SDS
PAGE (Le Gall - Reculé et Jestin, 1994). Aucune bande de ces mêmes tailles n'a été observée à partir d'extraits cellulaires Sf9 infectés par le baculovirus sauvage.

L'immunofluorescence a confirmé l'expression des protéines par le baculovirus recombinant (AcDPV114) et a révélé une expression au moins transitoire dans le noyau (Fig.

7).

Formation de capsides videspar le baculovinrs recombinant
L'observation en microscopie électronique par coloration négative, de préparations purifiées obtenues à partir de cellules Sf9 infectées avec le baculovirus recombinant (AcDPV1 14), a montré la présence d'aggrégats constitués de capsides vides de 22 nm ayant une morphologie et une taille identiques celle des particules virales natives (Fig. 8).

Immunité induite par le baculovirus recombinant
Par ELISA, des taux d'anticorps (Ac) moyens à élevés ont été observés chez tous les canards immunisés avec les cellules infectées par le baculovirus recombinant (RB) alors que les canards immunisés avec les cellules infectées par le baculovirus sauvage (WB) n'ont pas répondu, de même que les canards placés en contact (tableau 1). Il n'a pas été constaté d'effet rappel chez les canards RB à l'exception d'un canard ayant reçu des doses inférieures comme mentionné dans le tableau 1. Trois semaines après la 3ème inoculation, les taux d'Ac étaient décroissants chez les canards RB.

Par séroneutralisation, tous les canards RB ont également répondu à l'immunisation, avec des taux d'anticorps moyens comparés au titre de 12.9 (log 2) du sérum positif de référence (résultat non présenté), excepté le canard 86-87 qui présentait, 2 semaines après la 3ème inoculation (temps C), un titre très élevé (tableau 1).

Immunit induitc par le vaccin Parvol
Les taux d'Ac présentés par les canards immunisés avec le vaccin Parvol sont mentionnés dans le tableau 2. Le rappel accroît les taux d'anticorps qui sont maximaux 3 semaines après celui-ci.

Analyse des résultats
Clonage et séquence du ge codant pour les protéines de capside du DPV
Il est établi (Berns, 1990) que le génome des parvovirus de mammifères présente le même type d'organisation : les séquences codantes sont situées dans deux grandes fenêtres de lecture (ORF dont celle de droite (correspondant à l'extrémité 3' du brin de polarité positive) code pour les protéines de capside. Nous avons cherché a cloner un grand fragment d'ADN supposé contenir le gène codant pour les protéines de capside. Un premier clonage avait consisté à cloner le fragment HinalII - Kpnl de 3500 bp qui s'était révélé correspondre à la bonne ORF sur la base des homologies de séquences constatées avec le gène de l'AAV2 codant pour les protéines de capside. Néanmoins le précédent fragment ne comportait pas le gène entier à qui il manquait l'extrémité 3', aucun codon stop n'ayant été observé. C'est pourquoi il a été procédé au clonage présentement décrit utilisant l'enzyme de restriction BglII. Celuici a permis de cloner un fiagment de 2950 bp incluant toute la fenêtre de lecture escomptée.

Cependant il manque la fin du génome en 3', étant donné que les séquences terminales inversées répétées correspondant à l'extrémité palindromique, n'ont pas été observées.

L'analyse des 2487 paires de bases séquencées a mis en évidence une organisation du génome du DPV similaire à celle des parvovirus de mammiferes. En effet seul le brin de polarité positive de la partie de génome étudiée du DPV contient des fenêtres de lecture conséquentes, dont une grande, correspondant à une région codante, située dans le premier cadre de lecture. D'autre part la plupart des motifs d'acides aminés hautement conservés chez les parvovirus, est présente chez le DPV.

L'analyse du degré homologie entre les séquences en acides aminés des protéines de capside des parvovirus du canard et de l'oie (DPV et GPV respectivement) a montré que les deux virus étaient les plus proches parmi les virus considérés. Alors que le DPV fait partie du groupe des parvovirus autonomes puisqu'il n'a pas été mis en évidence de virus helper tels que adenovirus et herpès virus (Jestin et coll., 1991), la séquence de son gène codant pour les protéines de capside a montré une plus forte homologie avec le dependovirus AAV2 qu'avec les parvovirus autonomes de mammifères. Ce résultat confirme les conclusions de Brown et coll., 1995, concernant les parentés entre le parvovirus de l'oie et les adeno-associated virus.

Les différences observées entre les séquences protéiques des parvovirus de l'oie et du canard peuvent constituer, au moins pour partie d'entre elles, le support moléculaire des différences antigéniques déjà mentionnées entre ces deux virus. Elles ont des implications importantes aux plans des applications que ce soit à des fins vaccinales, diagnostiques ou d'immunothérapie.

De la recherche des régions codantes potentielles du DPV, il est ressorti que
- le second codon ATG en phase (nucléotide 829) pouvait initier une protéine de 534 aa avec un poids moléculaire estimé à 60 kDa proche du poids moléculaire de 58 kDa établi par SDS-PAGE pour la protéine VP3 du DPV (Le Gall - Reculé et Jestin, 1994).

- le codon ACG (nucléotide 670) qui est un codon inusuel d'initiation de la traduction mais est utilisé pour coder la protéine VP2 de l'AAV2 (Beccerra et coll, 1985), pouvait initier la traduction d'une protéine de 587 aa avec un poids estimé de 65,2 kDa compatible avec la valeur expérimentale de 78 kDa correspondant à la protéine VP3 (Le Gall
Reculé et Jestin, 1994). En outre la séquence protéique située à proximité du codon ACG du
DPV révélait une forte homologie avec celle entourant le codon ACG de l'AAV2. Enfin, en l'absence de codons méthionine dans cette région, il était très vraisemblable que ce codon fut le codon d'initiation de la VP2 construdion retenue
La construction retenue utilise la séquence du gène codant pour la VP2 et la VP3 et démarrant å partir de la position la plus probable (nt 670) du codon d'initiation (ACG) de la VP2. De plus, dans notre construction, le codon d'initiation de la traduction ACG précité, a été muté en un codon ATG plus favorable pour initier la traduction (Kozak, 1986), en vue d'augmenter les rendements d'expression de la VP2 En effet, dans les particules virales matures d'AAV2, le codon d'initiation de la VP2 est naturellement un codon ACG (Beccerra et coll. 1988), or il est observé de faibles niveaux de VP2
Toute variation dans la séquence placée dans l'environnement du codon ATG muté, consistant à s'approcher de la séquence consensus de Kozak (1986) A/GCCATGG, est envisageable et ne diverge pas de l'esprit ni de l'objet de la présente invention
En outre, des constructions utilisant des fragments de la séquence décrite peuvent aboutir à l'expression de polypeptides immunogènes et sont dérivées de la présente invention
Par ailleurs, sur la base des résultats de séroneutralisation croisée (Fournier, 1991), les souches de parvovirus du canard testées constituent un groupe homogène. De plus, les acides nucléiques extraits de 4 souches de parvovirus de canard, montrent des profils de restriction identiques (Jestin, 1995b). Le fait que la souche DPV (GM), utilisée comme antigène dans les tests sérologiques, soit capable de détecter des anticorps induits par notre baculovirus recombinant, obtenu à partir de la séquence de la souche DPV 89834, apporte un nouvel argument aux communautés antigéniques déjà mentionnées Par conséquent, des constructions moléculaires similaires à celles précitées, réalisées à partir d'ADN extrait d'autres souches de parvovirus du canard, sont considérées découler de la présente invention
Obtention de baculovirus tecombinants et expression de protéines de capside recombinantes
II est établi que les protéines de capside de parvovirus obtenues avec le système d'expression en baculovirus, s'autoassemblent pour former des particules vides ressemblant aux particules virales (Brown et coll., 1991 , Saliki et cou., 1992 Christensen et co11.,1993). Ces particules recombinantes sont antigéniquement et immunologiquement identiques aux particules virales natives (Kajigaya et coll 1991 , Lopez de Turiso et coll, 1992 , Martinez et coil., 1992 , Saliki et coll 1992 , Christensen et coll, 1994 , M'u et coll , 1994). C'est pourquoi ce système d'expression a été choisi.

De plus le fait que Ruffing et coil. (1992) aient montré, après avoir construit plusieurs baculovirus recombinants exprimant séparément les 3 protéines de capside de l'AAV2, que des capsides vides étaient produites à chaque fois que la protéine VP2 était exprimée ou coexprimée avec la VPI ou la VP3 alors qu'elles n'étaient pas observées quand l'une ou l'autre de ces protéines (VP1 ou VP3) était produite seule, confirmait notre choix de la séquence à insérer. Par ailleurs, les deux protéines de capside VPI et VP2 de l'.ALleutian mink disease parvovirus (ADV) ont été coexprimées par un seul baculovirus recombinant généré à partir du cDNA contenant les deux codons d'iniation (Christensen et col , 199; , NVu et coll., 1994).

L'analyse par Western-blot de cellules Sf9 Infectées par le baculovirus recombinant AcDPVl 14 a montré que l'expression des 2 protéines VP2 et VP3 a été réussie, puisque les produits d'expression étaient reconnus par le sérum monospécifique anti-DPV et présentaient les tailles correspondant à Ges protéines L'expression de protéines de DPV a été confirmée par immunofluorescence et la microscopie électronique a montré que des capsides vides qui avaient la morphologie des virus DPV, étaient produites
Cependant nous avons détecté peu de capsides vides, malgré l'utilisation d'un protocole associant 0,1 % SDS et l % DOC, recommandé pour solubiliser les protéines de capsides d'AAV2 accumulées dans les cellules Sf9 sous la forme d'aggrégats difficilement solubles. Chez 1'AAV2, il n'est pas établi que la VP2 seule, sans la VP3, puisse sautoassembler puisque la présence d'une protéine VP3-like a été observée dans les lysats de cellules Sf9 cotransfectées par un baculovirus recombinant exprimant théoriquement seulement la VP2, après mutation du codon d'iniation de la VP3 (Ruffing et coll., 1992). Chez le DPx, s'il est démontré par western-blot, à l'aide d'un sérum de canard spécifique du DPV, que la VP3 est nécessaire à la formation de capsides, il n'est pas exclu que les quantités de protéines \rP3 constituent un facteur limitant. Alors les rendements en capsides pourraient être améliorés en optimisant le rapport des protéines VP2/VP3 exprimées, en effet les protéines VP 1, VP2 et VP3 sont dans les proportions respectives de l, 1, 10, chez les virions matures d'AAV2 (Buller et Rose, 1978). Pour y parvenir, il est possible d'utiliser deux baculovirus recombinants dont l'un contiendrait la construction présentement utilisée (ou une construction modifiée comme explicité ci-après et permettant de n'exprimer que la VP2) et l'autre contiendrait uniquement la séquence codant pour le gène de la VP3, c'est-à-dire nt 829 à 2430. Selon cet exemple des cellules SP) pourraient être coinfectées avec chacun des deux baculovirus recombinants en concentrations différentes Dans le cas ou la VP3 ne serait pas nécessaire à la formation de
capsides, il est possible d'améliorer les rendements en capsides en augmentant le niveau
d'expression de la VP2. A cette fin, il conviendrait d'envisager de placer le codon muté
d'initiation de la VP2 dans une configuration respectant mieux la séquence de Kozak (1986)
déjà décrite. En effet dans la construction testée le codon ATG muté d'initiation de la VP2 était
placé, selon la séquence consensus de Kozak, dans un contexte moins favorable (TGGATGG)
que le codon ATG d'initiation de la VP3. Avec le même objectif, le codon d'iniation de la VP3 pourrait être muté ainsi que l'ATG en phase immédiatement suivant (nt 853), afin de n'exprimer que la VP2. Toute modification de la construction initiale dans cet esprit relève de la présente invention
Par ailleurs, des constructions dérivées de la présente séquence et codant pour des protéines VP2 (et si nécessaire VP3) tronquées, permettront de définir quelle est la partie de la séquence minimale indispensable à l'expression de capsides vides recombinantes. Ce point étant établi, il sera possible d'envisager d'associer la séquence minimale précédente avec une (ou des) séquence(s) codant pour une (ou des) protéine(s) hétérologue(s) dans le but d'obtenir des capsides chimères. De telles constructions sont dérivées de la présente invention
Immunité induite par le haculovirus recombinant
L'immunisation de canards avec le baculovirus recombinant adjuvé a induit la synthèse d'anticorps anti-DPV détectés par ELISA et séroneutralisation, alors que des témoins immunisés avec le baculovirus sauvage adjuvé selon les mêmes modalités restaient négatifs.

Afin de pouvoir apprécier l'immunité humorale induite par le baculovirus recombinant, il convenait de pouvoir la comparer à celle induite par un vaccin de commerce. Le vaccin du commerce choisi comme référence a donc été le Parvol qui est le seul vaccin prescrit pour stimuler la réponse humorale des canards reproducteurs contre la parvovirose du canard. Afin de contrôler l'activité de chaque lot libéré, un test a été mis au point par le fabricant consistant à apprécier les réponses induites 2 et 3 semaines après immunisation de canetons de 2 semaines à raison de 2 injections (1 dose / canard) à 4 semaines d'intervalle. C'est pourquoi présentement des canetons ont été vaccinés selon ce protocole, les données ainsi obtenues servant de référence pour interpréter les résultats de l'essai d'immunisation avec le baculovirus recombinant.

De fait les résultats obtenus avec le baculovirus recombinant adjuvé sont au moins aussi bons que ceux obtenus dans le cadre de l'essai d'activité du Parvol. Le type d'adjuvant utilisé est important, en effet des essais d'immunisation avec un autre adjuvant ont été infructueux.

Cependant d'autres adjuvants differents de celui incorporé dans le Parvol pourraient conférer une immunité équivalente sinon meilleure.

Applications
En vue d'une application pratique pour immuniser les reproducteurs, des capsides vides purifiées adjuvées pourraient être administrées après avoir amélioré le rendement de production. En ce qui concerne l'immunisation des canetons, l'insertion des constructions décrites dans un vecteur vivant apparaît plus riche de promesses.

Quel que soit l'âge des canards, l'ADN nu correspondant aux séquences décrites (codant pour le gène de la VP2 et/ou de la VP3) insérées dans un plasmide, peut présenter un très grand intérêt comme vaccin.

Des capsides chimères utilisant les capsides vides de parvovirus du canard pourraient servir à la présentation de protéines hétérologues dans un but de vaccination des espèces animales, des palmipèdes en particulier qui seraient alors immunisés à la fois contre les parvovirus et contre d'autres agents infectieux
Les anticorps dirigés contre tout ou partie des protéines VP2 et VP3, qu'ils soient monoclonaux ou polyclonaux, qu'ils soient obtenus à partir d'animaux immunisés avec des peptides synthétiques ou avec les protéines recombinantes purifiées ou avec des vecteurs recombinants ou avec de l'ADN nu, peuvent trouver des applications en sérothérapie ou immunothérapie ainsi qu'en diagnostic.

De plus, l'antigénicité des protéines recombinantes obtenues ayant été démontrée en
Western-blot, ces protéines ou des sous-fragments possédant des propriétés équivalentes, peuvent trouver des applications à des fins diagnostiques.

Aussi, les capsides vides mentionnées précédemment pourraient être utilisées comme des auxiliaires de transfert d'ADN à des finsde thérapie génique animale ou humaine.

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Claims (10)

Re-. & aaons

1- ADNs recombînants caractérisés en ce qu'ils codent pour au moins une des protéines entières VP2 et VP3 du parvovirus du canard ou pour au moins une des protéines précitées tronquée, capable ou non de former des capsides, ou pour des peptides, ces protéines ou ces peptides ayant au moins des propriétés antigéniques et/ou immunogéniques.

2- Séquence d'ADN codant pour les protéines de capside VP2 et VP3 du parvovirus du canard telle que mentionnée en figure 2 ou séquences dérivées ou sous-séquences de celle ci codant pour tout ou partie de ces mêmes protéines, que ces séquence soient seule(s) ou associée(s) à au moins une autre séquence codant pour au moins une protéine hétérologue.

3- Vecteur comprenant une séquence d'ADN selon les revendications 1 ou 2, en aval d'une région de régulation.

4- Microorganisme hôte ou cellule transformés avec au moins une molécule d'ADN recombinant suivant les revendications 1 et/ou 2, ou avec le vecteur revendiqué en 3.

5- Procédé de préparation de RADON recombinant revendiqué en 1 caractérisé en ce que les microorganismes transformés sont cultivés selon la revendication 4 et que RADON revendiqué en 1 ou 2, ou des plasmides recombinants intégrant la molécule d'ADN revendiquée en 1 ou 2, sont récupérés.

6 Protéine(s) exprimée(s) par un microorganisme ou une cellule selon la revendication 4, capable(s) ou non de former des capsides vides, peptides déduits de la séquence revendiquée en 2 et procédé de préparation des dites protéines, Caractérisé en ce que les microorganismes ou cellules sont cultivés selon la revendication 4 et que les protéines sont récupérées.

7- Véhicule de transfert d'ADN pour la thérapie génique caractérisé en ce qu'il contient au moins une des protéines revendiquées en 6, susceptible de former des capsides et de protéger l'intégré de l'ADN à transférer.

8- Vaccin caractérisé en ce qu'il contient de RADON selon les revendications 1 ou 2 et/ou un vecteur selon la revendication 3 et/ou un microorganisme ou un cellule transformés selon la revendication 4 et/ou des protéines ou des peptides selon la revendication 6.

9- Anticorps dirigés contre les protéines ou les peptides revendiqués en 6.

10- Réactifs de diagnostic utilisant tout ou partie des protéines ou peptides revendiqués en 6 et/ou les anticorps revendiqués en 9.