ES2321485T3 - Proteinas de fusion para tratamiento especifico de cancer y de enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión que comprende un polipéptido que proporciona citotoxicidad, quedando fusionado dicho polipéptido a una fracción que dota a la proteína de fusión de disponibilidad funcional en células aberrantes de falta de disponibilidad funcional en células no aberrantes, en la que dicha fracción es apoptina y en la que dicho polipéptido proporciona actividad enzimática que convierte un promedicamento en un medicamento.

Description

Proteínas de fusión para tratamiento específico de cáncer y de enfermedades autoinmunes.

Sector

La presente invención se refiere al sector de las terapias basadas en la biología molecular. La presente invención también se refiere al campo del cáncer y/o las enfermedades autoinmunes. Allí donde en la presente especificación se hace referencia a cualquiera de ellas, la otra debe ser considerada incluida salvo que se excluya expresamente. La invención también se refiere a la inducción de apoptosis en células asociadas al cáncer o a enfermedades autoinmunes.

Antecedentes

La apoptosis es un proceso fisiológico activo y programado para la eliminación de células superfluas, alteradas o malignas (Earnshaw, 1995, Duke y otros, 1996). La apoptosis se caracteriza por encogimiento de las células, segmentación del núcleo, condensación y escisión del ADN en fragmentos del tamaño de dominios, seguido en la mayor parte de las células por degradación internucleosomal. Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos recubiertos por membrana. Finalmente, las células vecinas y/o los macrófagos fagocitarán rápidamente estas células que mueren (Wyllie y otros, 1980, White 1996). El proceso apoptótico puede ser iniciado por una variedad de estímulos reguladores (Whllie, 1995, White, 1996, Levine, 1997).

Los cambios en la velocidad de supervivencia de las células juegan un importante papel en la patogénesis humana, por ejemplo, en el desarrollo del cáncer y de las enfermedades autoinmunes, que son causados por un aumento de la proliferación pero también por una disminución de la muerte celular (Kerr y otros, 1994, Paulovich, 1997). Se ha demostrado que una variedad de compuestos quimioterapéuticos y la radiación inducen la apoptosis en células tumorales, en muchos casos mediante la forma no transformada de la proteína p53 (Thompson, 1995, Bellamyn y otros, 1995, Steller, 1995, McDonell y otros, 1995).

Sin embargo, numerosos tumores adquieren una mutación en p53 durante su desarrollo, correlacionando a menudo con una respuesta baja a la terapia del cáncer. Determinados genes transformantes de virus con ADN tumorigénicos pueden inactivar a p53 enlazándose directamente a él. Ejemplos de tales agentes son la proteína E6 de subtipos oncogénicos del Virus del Papiloma Humano y el antígeno grande T del virus ADN tumoral SV40 (Teodoro, 1997). Otro ejemplo de la aparición de una fuerte resistencia a los diferentes agentes hemoterapéuticos que inducen la apoptosis en tumores (leucémicos) es la asociación de un nivel de expresión alto del proto-oncogén Bcl-2 o Bcr-abl con la sensibilidad reducida de estos tumores a la terapia (Hockenberry 1994, Sachs y Lotem, 1997).

Las enfermedades autoinmunes son un grupo de enfermedades graves, que se caracterizan por trastornos inflamatorios, tales como la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide (RA). Recientemente, se ha dado a conocer una evidencia de que la prueba ha sido a condición de que los sinoviocitos similares a fibroblastos relacionados con RA exhiben características de células transformadas/tumorigénicas. Por ejemplo, la adherencia al plástico o a la matriz extracelular requerida generalmente para que los fibroblastos normales proliferen y resistan en el cultivo por períodos prolongados de tiempo. Las células transformadas, sin embargo, pueden crecer en la suspensión en un medio semisólido sin contacto con una superficie sólida. Mientras que los FLS crecen y prosperan habitualmente bajo condiciones que permiten la adherencia, en algunas circunstancias, pueden proliferar en una manera independiente del anclaje (Lafyatis y otros., 1989). Además, se ha informado la expresión de diferentes oncogenes, tales como c-myc, para el cultivo de FLS (Gay y Gay, 1989). Una liberación endógena más elevada de factores de crecimiento tales como factor beta del crecimiento tumoral y otras citocinas también han sido descritas para FLS (Bucala y otros., 1991; Remmers y otros., 1990; Geiler, 1994; Firestein, 1995 y 1995a). También, en algunos casos el supresor de tumor no funcional p53 se ha relacionado con RA (Aupperle y otros., 1998). Aunque el p53 mutante no es un oncogén, previene la inducción de apoptosis mediante agentes endógenos o exógenos. Todos estos datos indican que FLS es alterado irreversiblemente en RA y que un procedimiento autónomo permite que permanezcan activados incluso después de la eliminación del entorno inflamatorio articular (Firestein, 1995).

Por lo tanto, se necesita desarrollar terapias para el cáncer y enfermedades autoinmunes tales como RA, que puedan restaurar el proceso de muerte celular en las células relacionadas con la enfermedad. Entre la amplia gama de genes que se han evaluado para la terapia tumoral, son especialmente atractivos aquellos que codifican enzimas para la activación de profármacos ya que complementan directamente regímenes quimioterapéuticos clínicos en curso. Estas enzimas pueden activar profármacos que tienen una toxicidad inherente baja utilizando tanto enzimas bacterianas como enzimas de levadura, o mejoran la activación del promedicamento mediante enzimas de mamíferos. La activación de ganciclovir por la timidina cinasa viral actualmente está siendo evaluado en ensayos clínicos.

Por ejemplo, en la terapia génica del cáncer, los vectores fijan como objetivo de inserción de genes terapéuticos a las células tumorales mediante inyección directa en la masa tumoral o en tejidos circundantes. El medicamento activado es capaz de actuar en las células tumorales sin transducir. Este "efecto espectador" incluso puede actuar en sitios distantes y se cree que está mediado por el sistema inmunitario (Aghi y otros., 2000). Sin embargo, se han informado diversos inconvenientes de esta aproximación. Por ejemplo, Van der Eb y otros (1998) informaron que tratamiento de ratas con un adenovirus que sintetiza a la timidina cinasa del Virus del Herpes Simple (HSV TK) y la administración de ganciclovir dieron como resultado una grave disfunción hepática. Estos estudios mostraron claramente que el tejidos no mitótico normal (sin transformar) puede ser afectado por la transferencia de HSV TK mediada por adenovirus y el posterior tratamiento con ganciclovir. Dada la naturaleza hepatrópica de naturaleza sistémica de los vectores derivados de adenovirus administrados por vía sistémica, será esencial vigilar las funciones del hígado de los pacientes incluidos en todas los ensayos de terapia génica que implican vectores adenovirales con el gen HSV-TK. Además, la sobreexpresión del protooncogén Bcl-2, que tiene actividad antiapoptótica, aumenta de manera significativa la resistencia de las células tumorales contra un gran panel de fármacos citotóxicos y también contra la terapia génica mediada por HSV-TK/ganciclovir (Fels y otros., 2000). Por lo tanto, se necesitan enfoques, que hagan que el enfoque HSV-TK basado en la terapia génica adenoviral sea menos tóxico. Además, las estrategias tienen que ser desarrolladas evitando la resistencia contra profármacos activados.

La apoptina (también llamada "vp3"; los términos pueden ser intercambiables en el presente documento) es una pequeña proteína derivada del virus de la anemia aviar ("CAV"; Noteborn y De Boer, 1996, Noteborn y otros., 1991, Noteborn y otros., 1994; 1998a) que induce apoptosis en líneas celulares humanas malignas y transformadas. La apoptina no induce la muerte celular programada in vitro e in vivo en células normales linfoides, dérmicas, epidérmicas, endoteliales y del músculo liso. Sin embargo, cuando las células normales se transforman son susceptibles a la apoptosis inducida por apoptina. En células normales, la apoptina se encontró de manera predominante en el citoplasma, mientras que en células transformadas o malignas, es decir, caracterizadas por hiperplasia, metaplasia o displasia, se localizó en el núcleo (Danen-van Oorschot, 1997 y Noteborn, 1996).

La expresión a largo plazo de apoptina en fibroblastos humanos normales reveló que la apoptina al parecer no tiene actividad tóxica o transformante en estas células (Danen-van Oorschot, 1997 y Noteborn, 1996). Noteborn y Pietersen (1998) y Pietersen y otros (1999) han dado a conocer una prueba de que la apoptina expresada por adenovirus no tiene un efecto tóxico agudo in vivo, mientras que en ratones desnudos tiene una fuerte actividad antitumoral. La prueba adicional de una falta de toxicidad in vivo viene de ratones transgénicos que expresan apoptina de un promotor MHC-I y que tienen anormalidades no observables (Noteborn y Zhang, 1998). De importancia en el tratamiento de tumores que se han hecho resistentes a la quimioterapia o a la terapia por radiación es el hecho de que la apoptosis inducida por apoptina ocurre en ausencia de p53 funcional (Zhuang y otros, 1995a), y no pueden ser bloqueados por Bcl-2, Bcr-abl (Zhuang y otros, 1995), o la proteína BAG-1 asociada a Bcl-2 (Danen van Oorschot, 1997a, Noteborn, 1996). Además, parece que incluso las células pre-malignas transformadas de manera mínima, pueden ser sensibles al efecto que induce muerte de la apoptina (Noteborn y Zhang, 1998). Recientemente, Noteborn y Pietersen (2000) dieron a conocer una prueba de que la apoptina puede reconocer las condiciones autoinmunes similares a las transformadas (por ejemplo RA), que resulta en apoptosis inducida por apoptina en sinoviocitos similares a fibroblastos afectados por RA.

Descripción de la invención

Para aumentar el conjunto de compuestos terapéuticos anticáncer o antienfermedades autoinmunes disponibles en la técnica, son deseables herramientas terapéuticas adicionales. La presente invención da a conocer nuevas sustancias terapéuticas, por ejemplo, nuevos compuestos proteínicos terapéuticos que pueden contener apoptina junto con otra proteína citotóxica proteínica o fragmentos de proteína tales como HSV TK, o sistemas de vectores (no) virales que expresan estas proteínas de fusión, especialmente en casos en los que las células son descarriladas tales como las células derivadas de cáncer o derivadas de enfermedades autoinmunes. Particularmente, la presente invención describe compuestos para usar en una terapia basada en la activación de compuestos citotóxicos y/o hacer los compuestos citotóxicos más específicos para células tumorales y células relacionadas con enfermedades autoinmunes mediante el enlace de éstos a la proteína apoptina.

En una primera realización, la invención da a conocer una proteína de fusión que consiste en HSV TK y apoptina, que induce apoptosis en un modo específico de tumor. La proteína de fusión TK-apoptina ejerce su citotoxicidad específica de tumor cuando se administra a las células.

La invención comprende un vehículo de inserción de genes (o vector) que permite el uso de las particularidades de la apoptina específica de tumor y una enzima que puede activar profármacos citotóxicos, para el tratamiento de cáncer y de enfermedades autoinmunes a través del uso de la terapia génica. Dicho vehículo de inserción del gen, que es un vector independientemente infeccioso puede ser por ejemplo un virus, o un liposoma, o un polímero, o similares, que por sí mismo puede infectar o de cualquier otra manera insertar información genética por ejemplo a células tumorales que se traten. La información genética comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una actividad similar a apoptina-TK.

Además, la invención incluye un sistema de inserción de genes que en sí mismo es un virus defectuoso en la replicación pero que puede replicarse en células ayudantes o empaquetadoras para generar vehículos de inserción de genes de la progenie. Por lo tanto, el vehículo de inserción de genes que da a conocer la presente invención, por ejemplo, puede ser un adenovirus, parvovirus, o un retrovirus u otros virus recombinantes ADN o ARN que pueden ser utilizados como vehículos de inserción o un plasmovirus.

Además, la invención da a conocer un vehículo de inserción de genes que se ha suplementado adicionalmente con un ligando específico o una molécula diana o moléculas dianas, mediante las que el vehículo de inserción de genes puede ser dirigido específicamente a insertar su información genética en una célula diana de elección. Dicha molécula diana, o anticuerpo, es reactivo con un receptor de superficie o proteína de células tumorales.

La invención además incluye todas las etapas necesarias para la construcción de un adenovirus recombinante defectuoso en la replicación que expresa el producto de fusión TK-apoptina. Se pueden producir altos títulos del adenovirus recombinante TK-apoptina mediante líneas celulares empaquetadoras de adenovirus, tales como 293.911 y PER.C6. (Noteborn y Pietersen, 1998.). TK-apoptina no exhibe un efecto negativo detectable sobre todas las etapas necesarias para la replicación del adenovirus y en otros eventos del ciclo de vida del adenovirus bajo las condiciones del cultivo celular.

El adenovirus recombinante defectuoso en la replicación expresa TK-apoptina en grandes cantidades en varios tumores y/o células relacionados con enfermedades autoinmunes dando como resultado la inducción del apoptosis. En cambio, la expresión de TK-apoptin -con o sin tratamiento con ganciclovir- en células humanas normales no transformadas por medio de un adenovirus recombinante no resulta en la inducción de muerte celular inducida por TK-apoptin.

Particularmente, la presente invención se refiere a la utilización de los compuestos de la presente invención en la fabricación de medicamentos para su uso en terapias contra tumores y contra enfermedades autoinmunes. El tratamiento de células tumorales y/o células relacionadas con enfermedades autoinmunes se llevará a cabo mediante la expresión de la proteína de fusión TK-apoptina a través de infectar células con los vehículos de inserción de genes tales como vectores de adenovirus que contienen una secuencia de codificación para una proteína con actividad similar a TK-apoptina

Por lo tanto, la presente invención da a conocer vehículos de inserción de genes tales como adenovirus que expresa apoptina, que es un agente muy potencial contra tumores o contra enfermedades autoinmunes. La regulación de TK-apoptina del adenovirus después del tratamiento con ganciclovir no induce apoptosis de manera detectable en células humanas normales no transformadas, indicando que la toxicidad del tratamiento in vivo con el adenovirus recombinante TK-apoptina es baja.

La expresión de TK-apoptina en células tumorales/relacionadas con enfermedades autoinmunes puede también ocurrir infectando células con otros vectores virales de ADN y/o ARN, además de los vectores de adenovirus, que contienen una secuencia de codificación para TK-apoptina. Además, los sistemas de vectores derivados de virus, tales como plasmoviruses pueden ser utilizados para la inducción de apoptosis inducida por TK-apoptina en células tumorales.

Además, la proteína de fusión TK-apoptina o los derivados de esta también serán eficaces contra tumores que tienen resistencia a la inducción (quimio)terapéutica de la apoptosis, debido a la falta de p53 funcional y/o (sobre)expresión de Bcl-2 y otros agentes que inhiben la apoptosis.

Para extirpar un tumor, es imperativo que todas las células del tumor, incluyendo sus minimetástasis potenciales, sean eliminadas con el tratamiento. Debido al efecto espectador observado en la infección de las células tumorales humanas con adenovirus recombinante que sintetizaba la proteína TK-apoptina, las células tumorales in vivo sufren muerte celular a pesar de que no eran transducidas y capaces de producir ellas mismas la proteína TK-apoptina. Esto trae como resultado la regresión completa del tumor tratado y muy probablemente también de tumores distales.

La presente invención también se refiere a que la actividad y el comportamiento de las proteínas recombinantes son similares a la actividad de la proteína TK-apoptina producida por la trascripción y la traducción del ADN de TK-apoptina. Particularmente, la descripción detallada da a conocer una evidencia de que la microinyección de la proteína de fusión TK-apoptina, producida en células de E.coli y purificada, dio como resultado la inducción de la apoptosis en tumor humano y/o células derivadas de RA pero no en células primarias humanas normales.

La presente invención también tiene la capacidad de diferenciar entre las células normales y células transformadas que poseen la actividad potencial de la proteína recombinante TK-apoptina para la destrucción de células tumorales, u otra hiperplasia, metaplasia o displasia, con una toxicidad mínima o ninguna sobre el tejido normal. Esta invención también se refiere a otro ejemplo de una terapia contra tumores eficaz basada en sustancias proteínicas derivadas de la apoptina.

La introducción directa de la proteína TK-apoptina en las células se puede realizar in vitro e in vivo mediante el acoplamiento de esta proteína efectora (en adelante designada como la carga) a un dominio de transducción de la proteína. La primera descripción de la capacidad de determinadas proteínas de atravesar las membranas celulares fue dada de manera independiente por Green y Loewenstein (1988) y Frankel y Pabo (1988), para la proteína del VIH TAT. En adelante se demostró que péptidos sintéticos que contenían los aminoácidos 48 a 60 derivados de la proteína del VIH TAT podrían transducir a las células (Vives y otros., 1997). Esta capacidad puede ser conferida en el transporte por reticulación química del dominio de la transducción de la proteína derivada de TAT a la proteína carga, posibilitando que proteínas tan grandes como 120 kDa sen insertadas intracelularmente, in vitro así como in vivo (Fawell y otros., 1994). Otros dominios de transducción han sido descritos en la proteína Antennapedia de Drosophila melanogaster (Derossi y otros., 1998), y varios péptidos sintéticos (Lindgren y otros., 2000). El proceso mediado por VIH-TAT no depende de la endocitosis y no es mediado a través de un receptor celular. Esto explica la notable universalidad que se muestra; las proteínas pueden ser transducidas en todas las células ensayadas hasta el momento (Schwarze y Dowdy, 2000). Un método eficaz basado en el péptido de VIH TAT se ha desarrollado para hacer que las proteínas recombinantes puedan ser transducidas tanto in vitro como in vivo.

De manera significativa, cuando se administra in vivo, todos los tejidos, incluyendo el cerebro, pueden ser fijados como diana con una proteína recombinante (Schwarze, 1999) usando este sistema. Otra clase de método de inserción se basa en la región del núcleo hidrofóbica de péptidos señal (Hawiger, 1999). La introducción celular de fusiones o de conjugaciones entre estos dominios de transducción y una carga son sensibles a la concentración y a la temperatura. Sin embargo, es independiente del tipo de células y un conjunto de células han mostrados ser susceptibles a la internalización mediada por la carga en esta clase de dominios de transducción.

En general, en la tecnología de transducción de proteínas el inconveniente es que todavía no ha sido posible fijar como diana a un compartimiento de una célula específica (tumoral) con este sistema. La falta de una diana específica del tumor hasta el momento ha impedido el desarrollo de una terapia contra tumor eficaz, que utilice la transducción de proteínas.

En una realización preferente, la presente invención se refiere a compuestos que permiten evitar este inconveniente. Las células transducidas, que incorporan la proteína derivada de TK-apoptina solamente sufren muerte celular cuando son de naturaleza transformada o maligna y permanecen vivas cuando son normales. Esto significa que el uso de TK-apoptina como parte de una sustancia proteínica con capacidad de transducción lo hace un agente potencial contra tumores.

La presente invención se refiere a otro modo de introducir la proteína de fusión TK-apoptina (recombinante) en las células, que es mediante la fusión de la proteína con un ligando. La internalización mediada por un receptor resulta entonces en la absorción de la proteína de fusión. Un ejemplo de dichas proteínas de fusión de apoptina se basa en el Factor de Crecimiento Epidérmico ("EGF"). Todos estos métodos se basan en la actividad de la proteína carga recombinante o purificada en la célula diana.

Particularmente, la presente invención muestra que la proteína TK-apoptina producida de diferentes maneras retiene su capacidad de destrucción de tumores específicos, y abre así la posibilidad de combinar la inserción generalizada de transducción de proteínas con la actividad específica contra tumores de la apoptina y con el efecto espectador del ganciclovir-HSV-TK, que resulta en un método nuevo mediante el que células malignas o transformadas pueden ser extirpadas. De esta manera, la invención describe distintos ejemplos de sustancias proteínicas derivadas de TK-apoptina reticuladas a un dominio de transducción tal como se puede aplicar a TAT.

Además, la presente invención describe otros dominios de transducción como se mencionó anteriormente se pueden prever, donde todos comparten la capacidad de introducir la proteína TK-apoptina en las células tumorales y las células normales igualmente. La fusión a un ligando puede fijar específicamente como diana la TK-apoptina a un tipo de células, pero la especificidad tumoral de la TK-apoptina será fundamental para las aplicaciones terapéuticas con un daño colateral mínimo a las células normales. Como ejemplo, EGF fijado como diana TK-apoptina se podría introducir en todas las células que expresan el receptor de EGF. Sin embargo, la TK-apoptina, sin embargo, destruye solamente las células tumorales. Además, debido al efecto espectador de la TK-apoptina también las células tumorales que no contienen la proteína de fusión TK-apoptina sufrirán muerte celular.

La presente invención da a conocer la aplicación de proteína permeable a células como medicamento siendo mucho más seguro a largo plazo que las aproximaciones de la terapia génica provocando posiblemente alteraciones genéticas que dan como resultado enfermedades tal como cáncer.

La presente invención será explicada más detalladamente en la siguiente descripción, que no está limitando la invención.

Descripción de las Figuras

Figura 1. Representación esquemática de la fusión Apoptina-TK.

Figura 2. Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión TK-apoptina.

Figura 3. Secuencia de ADN de la proteína de fusión TK-apoptina.

Figura 4. Descripción de la estrategia de la clonación y los enlazadores utilizados para dar como resultado la construcción final TK-apoptina.

Descripción detallada de la invención

La invención comprende una proteína de fusión que comprende un polipéptido que proporciona citotoxicidad, estando el polipéptido fusionado a una fracción, denominada apoptina, que hacen que la proteína de fusión esté disponible funcionalmente en células aberrantes y no esté disponible funcionalmente en células no aberrantes. El polipéptido proporciona una actividad enzimática que convertirá un promedicamento en un medicamento.

En una realización preferente, el polipéptido es TK y la fracción es apoptina.

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La proteína de fusión puede estar conjugada a una molécula diana para la inserción preferencial a las células cancerosas. Por ejemplo, la molécula diana puede ser un liposoma, ácido fólico, un derivado del ácido fólico, vitamina B-12, un derivada de la vitamina B-12, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o un ligando para un receptor.

En un método in vitro preferente según la presente invención, incluye administrar una proteína de fusión que tiene una fracción que hace que la proteína de fusión esté funcionalmente disponible en células aberrantes y funcionalmente no disponible en células no aberrantes, siendo dicha fracción apoptina.

En otra realización, la presente invención incluye un vehículo de inserción de genes que codifican una proteína de fusión que comprende la fracción que hace que la proteína de fusión esté funcionalmente disponible en células aberrantes y funcionalmente no disponible en células no aberrantes. Por ejemplo, el gen que codifica la proteína de fusión puede codificar un polipéptido que se fija como diana. También, el polipéptido que se fija como diana comprende un dominio de transducción tal como TAT.

El polipéptido que se fija como diana también puede comprender un miembro de pares de unión específica o de un scFv.

La presente invención también comprende un método in vitro para proporcionar células aberrantes de manera predominantemente sobre células normales con una proteína de fusión deseada que comprende administrar una proteína de fusión que tiene una fracción que hace que la proteína de fusión esté funcionalmente disponible en células aberrantes y no funcionalmente disponible en células no aberrantes.

Los vehículos de inserción comprenden adenovirus, retro, AAV, plasmovirus, polifosfosinas no virales, liposomas, etc.

La presente invención además da a conocer o describe todas las etapas necesarias para la construcción de un adenovirus recombinante defectuoso en la replicación que expresa el producto de fusión TK-apoptina. Se pueden producir altos títulos de adenovirus recombinante TKapoptina por medio de líneas celulares de empaquetamiento del adenovirus, tales como 293.911 y PER.C6. El hecho de que los vectores de adenovirus TK-apoptina recombinantes puedan ser producidos por el sistema descrito en el presente documento, implica que los sistemas de vectores de adenovirus replicativos (condicional) pueden ser producidos y utilizados para tratar el cáncer y enfermedades autoinmunes.

La presente invención da a conocer un sistema para producir e insertar sustancias proteínicas recombinantes intracelularmente que comprende TK-apoptina o un equivalente funcional o los fragmentos funcionales de la misma, o sustancias proteínicas recombinantes con actividad similar a TK-apoptina. La presente invención además da a conocer la adición de péptidos modulares opcionales adicionales. Este puede incluir un epítope etiqueta, permitiendo la detección fácil y la inmunoprecipitación sin el impedimento estérico directo de las asociaciones de TK-apoptina con las proteínas celulares.

La presente invención da a conocer o describe todas las etapas necesarias para la producción del agente recombinante de inducción de apoptosis TK-apoptina, o derivados de TK-apoptina que tienen una especificidad tumoral similar. La proteína recombinante se puede producir en E. coli, células de insecto por medio de un vector basado en baculovirus, o en cepas de levadura (tal como Pichia pastoris). La invención da a conocer evidencias de que la sustancia proteínica similar a TK-apoptina no necesita plegarse correctamente en la célula productora, posibilitando la producción de TK-apoptina o sustancias proteínicas similares a TK-apoptina recombinantes en células de plantas transgénicas, para la producción en masa.

La presente invención propone una etiqueta de afinidad a metales modificada para la purificación óptima de la proteína recombinante. Usando una etiqueta de doble His próxima al dominio de transducción, se consigue una unión significativamente mejor a las perlas del níquel, dando como resultado la posibilidad de lavar la TK-apoptina recombinante o las sustancias proteínicas similares a TK-apoptina bajo condiciones severas resultando en una purificación óptima de TK-apoptina o de las sustancias proteínicas similares a TK-apoptina.

La presente invención describe el uso de un dominio de transducción fusionado a la proteína recombinante TK-apoptina. Este dominio permite que la proteína recombinante pase a través de la membrana celular. Este dominio puede comprender un dominio de transducción derivado de VIH TAT, o cualquier otro dominio de transducción conocido.

La presente invención también da a conocer composiciones para utilizar en una terapia para el cáncer, las enfermedades autoinmunes o enfermedades relacionadas, que se basa en la TK-apoptina o en las sustancias proteínicas similares a la apoptina o los sistemas vectores virales, que contienen el gen que expresa TK-apoptina o las proteínas similares a TK-apoptina.

La presente invención también da a conocer composiciones para eliminar células aberrantes en sus primeras etapas de transformación y lesiones premalignas. Especialmente tumores resistentes a la quimioterapia.

La presente invención será explicada a continuación mediante el uso de los ejemplos ilustrativos siguientes.

Ejemplos Construcción del casete de fusión TK-Apoptin

Una proteína de fusión se construyó de manera que la proteína Apoptina se fusionara a través de un enlazador flexible al extremo N de la proteína Timidina Cinasa. La figura 1 muestra una representación esquemática de esta construcción. Las figuras 2 y 3 muestran la secuencia de aminoácidos, así como la secuencia de ADN del producto fusión TK-Apoptin, respectivamente.

Esta construcción posee varias particularidades además de la presencia de las regiones de codificación de Apoptina y de HSV TK. Aguas arriba desde el iniciador ATG de la proteína de fusión se construyó un sitio de restricción BamHI para posibilitar la clonación en varios vectores de expresión.

Para acelerar la clonación de esta construcción en un vector de transducción de proteínas, se insertó un único sitio SalI que permite la clonación en marco en el vector pMV TAT tal como se describe en la solicitud de patente presentada recientemente por Noteborn y otros en 2000, que se titula "Un método de inserción para la actividad que induce apoptosis específica de tumor de la apoptina" EP 1186665. Dicha clonación podría resultar en la adición de un dominio de transducción en el extremo N de Apoptina, y la posibilidad posterior de la producción y purificación de la proteína de fusión Apoptina-TK.

A efectos de minimizar el riesgo de interferencia estérica de la Apoptina con la proteína TK, se insertó un oligonucleótido que codifica un enlazador de 26 aminoácidos entre la Apoptina que codifica ORF y TK que codifica ORF. Este enlazador se basa en una publicación científica en la que se demostró que la fusión GFP-TK es funcional con este enlazador (Paquin y otros., 2001). Este enlazador también reducirá la posibilidad de interferencia negativa de la proteína TK con la función de la Apoptina. La secuencia del enlazador se muestra en la figura 2.

La metionina inicial de TK fue reemplazada con la sustitución conservadora del leucina para minimizar el riesgo de iniciación interna en el ARNm de la fusión, y así la producción de TK sin la fracción de Apoptina. Para asegurar la producción de una proteína de fusión completa se suprimió el codón de parada de TK-apoptin.

Directamente después del codón de parada de TK que codifica ORF se insertaron un sitio de restricción EcoRI y uno BamHI para permitir la clonación en un vector de expresión o en el pMV TAT.

Construcción del vector de transferencia AdApt/TK-Apoptina

El vector adenoviral AdApt® contiene el promotor del citomegalovirus (CMV), que también ha sido adaptado de manera óptima a la línea celular PER.C6. A efectos de examinar si es posible producir TK-apoptina por medio de un vector de adenovirus, se construyó AdApt-Apoptin. Para este fin, se clonó el casete TK-apoptina descrito anteriormente en el sitio BamHI del vector de transferencia AdApt de 6,1 kb, que fue obtenido de Crucell Holanda, bv, Leiden, Países Bajos. Se determinó mediante análisis de secuencias y digestiones con enzima de restricción la orientación correcta del gen TK-apoptina bajo la regulación del CMV. Este vector de transferencia ha sido denominado pAdApt/TK-Apoptina. Como control negativo del vector de transferencia de adenovirus se seleccionaron los plásmidos, que contienen el gen de TK-apoptina en la orientación equivocada opuesta al promotor CMV y fue denominada AdApt/TKAAS.

Construcción y caracterización del vector de adenovirus AdApt/TK-Apoptina

A continuación, se generaron los vectores de adenovirus recombinantes que expresaban el gen TK-apoptina bajo regulación del promotor CMV. Además, se preparó el adenovirus de control que tenía el casete del gen de TK-apoptina en orientación opuesta en relación con el promotor CMV. A tal efecto, se cotransfectaron las células PER.C6 (Crucell Holland, bv, Leiden, Países Bajos) con el plásmido del vector de adenovirus pAdSAIfII-ITR (E1-, E3+) y con los plásmidos de transferencia pAdApt/TK-Apoptina o pAdApt/TKAAS. Después de la observación de los efectos citopatógenos de las PER.C6 transfectadas, se cosechó el medio que contenía los vectores de adenovirus recombinantes y se purificó en placas (Noteborn y Pietersen, 1998).

Los diferentes lotes de adenovirus recombinantes AdApt/TK-Apoptina purificados en placas que codifican la TK-Apoptina y el vector de control AdApt/TKAAS se examinaron mediante un análisis PCR para determinar la presencia del gen de la TK-Apoptina en la orientación "correcta" contra la orientación "incorrecta", respectivamente (Pietersen y otros, 1999). Todos los lotes de adenovirus recombinantes analizados (en total para cada vector, como mínimo, 10) contenían el gen esperado de TK-apoptina.

El análisis de adenovirus de replicación competente ("RCA") mediante PCR (Pietersen y otros. 1999) reveló que en todos los lotes analizados no se generó RCA.

Finalmente, se examinó la producción de la proteína TK-apoptina por las células HepG2 humanas infectadas con AdApt mediante inmunofluorescencia indirecta usando el anticuerpo monoclonal 111.3 (Noteborn y Pietersen, 1998). Casi todas las células mostraron producir la proteína TK-apoptina y se convirtieron en apoptóticas muy pronto después de la infección. Esto fue analizado con tinción DAPI así como mediante un ensayo TUNEL (Pietersen, 1999). Este hallazgo es indicativo del hecho de que la TK-apoptina producida es totalmente activa como inductora apoptótica. Según lo esperado, todas las células infectadas con AdApt/TKAAS no se tiñeron con el anticuerpo monoclonal y no resultaron apoptóticas. Además, por medio de un ensayo de inmunoprecipitación y de un análisis de transferencia Western usando el anticuerpo 111.3, se demostró que el producto de fusión esperado TK-Apoptina de aproximadamente 50 kDa era detectable en el caso de las células HepG2 infectadas con AdApt/TK-apoptina y no visibles en HepG2 infectadas con AdApt/TKAAS o no infectadas.

En conclusión, la producción de TK-apoptina por medio del sistema del vector de adenovirus recombinante descrito anteriormente, indica que la TK-apoptina puede ser producida en cualquier vector adenoviral sin limitar la producción del adenovirus.

Tratamiento in vitro de células tumorales humanas con AdApt/TK-Apoptina y Ganciclovir

A continuación, se examinó si la infección de las células tumorales humanas con AdApt/TK-apoptina y el tratamiento con ganciclovir da como resultado una muerte celular masiva. A tal efecto, se utilizaron hepatoma humano HepG2, células de osteosarcoma U2OS, células SCC-15, derivadas de carcinoma de células escamosas y células de la línea celular del queratinocito espontáneamente transformadas HaCAT (Noteborn y Pietersen, 1998).

Primero, las diferentes líneas celulares tumorales fueron transducidas con AdLacZ a efectos de determinar la dosis infectiva por línea celular para obtener 10, 30 o 50% de transducibilidad. Posteriormente, las diferentes líneas celulares fueron infectadas con AdApt/TK-apoptina o AdApt/TKAAS. Como controles positivos, se infectaron las células tumorales con AdApt-Apoptina (Noteborn y Pietersen, 2000), y como controles negativos, las células se infectaron también con un vector de adenovirus que expresa TK (van der Eb y otros, 1998) o no infectadas. Un día después de la infección, la mitad de los cultivos celulares se trató con ganciclovir (5 \mug por ml; refrescado un día si y uno no).

Seis días después de la infección, los cultivos celulares tumorales se tiñeron con Giemsa tal como se describió por Noteborn y Pietersen (1999). Todos los cultivos celulares tumorales que no fueron infectados o infectados con AdTKAAS eran algo viables, así como los cultivos celulares tumorales infectados con AdTK que expresa timidina cinasa de HSV. En la mayoría se observó un ligero efecto del tratamiento con ganciclovir sobre la viabilidad celular en las células infectadas con AdTKAAS o AdTK. Los cultivos celulares que fueron transducidos/infectados en un 50% con AdApt-apoptina o AdApt/TK-apoptina mostraron claramente un efecto de muerte, que no fue visto en los cultivos celulares transducidos en un 50% con AdTK. Estos resultados muestran que tanto la Apoptina (según lo esperado) como la TK-Apoptina poseen un efecto citotóxico en ausencia de ganciclovir.

Después del tratamiento con ganciclovir, se redujo fuertemente la cantidad de células de los cuatro cultivos celulares tumorales analizados transducidos en un 10% con AdTK o AdTK-apoptina. Estos datos indican que tanto TK como TK-apoptina tienen un efecto citotóxico, que es mediado principalmente por un efecto espectador. Las células HepG2 mostraron el efecto espectador mejor luego del tratamiento con TK-apoptin. A una velocidad de transducción del 10%, casi todas las células HepG2 murieron.

Tratamiento de hepatocitos normales de rata

El inconveniente más importante del sistema TK/ganciclovir de adenoviruses es el efecto espectacular en la viabilidad de hepatocitos normales, por ejemplo, como el informado por van der Eb y otros, 1998. Por lo tanto, se ensayó el efecto de AdApt/TK-apoptina en comparación con AdTK sobre hepatocitos de rata. A tal efecto, los cultivos con hepatocitos de rata recientemente aislados fueron infectados con AdTk o AdApt/TK-apoptina y tratados con ganciclovir. Por medio de ensayos indirectos de inmunofluorescencia, que fueron realizados en paralelo se determinó que cerca del 5-10% de las células normales del hígado de rata producían TK o TK-apoptin, respectivamente. Como control negativo, los hepatocitos de rata no fueron infectados.

Un día después de la infección, se añadió ganciclovir tal como se describió anteriormente para las líneas celulares tumorales humanas. Cuatro días después de la infección, las células se tiñeron con Giemsa. La cantidad de hepatocitos infectados con AdTK o AdApt/TK-apoptina era similar a aquellas que no fueron infectadas. Los cultivos de hepatocitos que fueron infectados con AdTK y tratados con ganciclovir, sin embargo, se redujeron fuertemente en la cantidad de hepatocitos. En cambio, los hepatocitos infectados con AdApt/TK-Apoptina y tratados con ganciclovir mostraron solamente una ligera reducción de la cantidad de hepatocitos.

Estos datos muestran claramente que TK-apoptina puede inducir muerte celular en las células tumorales, que contienen el producto TK-apoptina y también en las células tumorales que no fueron transducidas, mediante del efecto espectador. De manera más importante, los hepatocitos normales (de rata), que murieron con el tratamiento de AdTK/ganciclovir fueron viables luego del tratamiento con AdApt/TK-apoptina y ganciclovir. Las características de apoptosis específica de tumor de la apoptina parece que también se mantienen en el ajuste de la proteína de fusión TK-apoptina, insertada por un vector adenoviral.

Muy probablemente, la Apoptina posee una actividad que puede secuestrar los productos de fusión TK-Apoptina en las estructuras citoplásmicas de células humanas normales, que también ha sido descrita para el producto de fusión de MBP-apoptina en una solicitud de patente estadounidense previa de Noteborn y otros (titulada "Un método de inserción de aportina con actividad que induce apoptosis específica de tumor", copropietario número provisional US 60/236.117, ahora solicitud de patente estadounidense número de serie 09/949.780).

Tratamiento de Sinoviocitos humanos similares a fibroblastos derivados de RA y Sinoviocitos normales de fibroblastos con AdApt/TK-apoptina

A continuación, se ensayó la actividad de AdApt/TK-apoptina en sinoviocitos de fibroblastos derivados de RA contra unos derivados de personas sanas (el material se obtuvo del Departamento de Reumatología, del Centro Médico de la Universidad de Leiden, Leiden, Países Bajos). Como control positivo, se infectaron las células con AdApt-apoptina o AdTk y como control negativo las células no se infectaron. En el análisis de inmunofluorescencia paralelo, se mostró que aproximadamente 5-10% de las células fueron infectadas. La cosecha de las células y la tinción con Giemsa se realizó como se describió anteriormente.

Después del tratamiento con ganciclovir, tanto las células normales como las derivadas de RA tratadas con AdTK sufrieron perceptiblemente de muerte celular, que sólo fue el caso para las células derivadas de RA tratadas con AdApt/TK-apoptina y no para las células derivadas de personas sanas. Todos los otros cultivos celulares no revelaron una reducción visible de la cantidad de células.

Estos datos implican que TK-apoptina también tiene una actividad específica de destrucción celular en células relacionadas con RA, que, como mínimo, se reduce dramáticamente en las células normales derivadas de individuos sanos.

Producción de la proteína recombinante TK-apoptina

La producción y purificación de la proteína recombinante MBP-TK-apoptina se realizó en un sistema de E. coli tal como se describió para MBP-apoptina por Noteborn y otros (EP 1186665).

Inducción de apoptosis específica de tumor

Para ensayar la capacidad de la proteína MBP-TK-apoptinade de inducir apoptosis específicamente en células tumorales se estableció un sistema de microinyección. Las células de osteosarcoma humanas Saos-2 y fibroblasts humanos normales VH10 se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio. Las células se microinyectaron en el citoplasma con la proteína MBP-TK-apoptina o MBP-apoptina o MBP como control positivo utilizando un microinyector Eppendorf con presión de inyección de 0,5 psi. Las células se coinyectaron con dextrano-rodamina para ser capaces de identificar más tarde las células microinyectadas.

Las células se fijaron y se analizaron mediante la utilización de procedimientos descritos por Noteborn y otros (EP 1186665).

Los resultados muestran que tanto MBP-apoptina como MBP-TK-apoptina eran capaces de inducir apoptosis rápida en células tumorales humanas (dentro de 3-6 horas), pero no indujeron apoptosis en células humanas normales. La proteína de control MBP no indujo apoptosis en ninguna de las preparaciones de celulares ensayadas bajo estas condiciones. De manera notable, las proteínas de fusión de apoptina estaban presentes en el núcleo de células tumorales, pero secuestradas en las estructuras citoplásmicas dentro de las células VH10.

Las observaciones siguientes pueden ayuda explicar más la actividad específica de tumor de MBP-apoptina y MBP-TK-apoptin. Veinticuatro horas después de la microinyección, casi todas las células tumorales (apoptóticas en ese punto de tiempo) contenían MBP-apoptina o MBP-TK-apoptina. Las células tumorales (viables) fueron positivas a MBP después de la microinyección de la proteína de MBP. Sin embargo, las células VH10 microinyectadas con MBP-apoptina o MBP-TK-apoptina fueron negativas cuando se tiñeron para MBP o apoptina, pero aún contenían dextrano-rodamina. En cambio, las células VH10 microinyectadas con la proteína MBP que aún contenían MBP y la señal de MBP no se redujo en comparación las células microinyectadas con MBP que se cosecharon después de 1 ó 3 horas.

Estos datos muestran que la sustancia proteínica recombinante TK-apoptina puede inducir apoptosis en células tumorales, y no en células normales no transformadas. Esto implica que TK no interfiere con la inducción específica de tumor de apoptosis de la apoptina y se inactiva por la degradación proteolítica o blindaje.

Para explorar más esta cuestión, se decidió utilizar una aproximación bioquímica. Se había notado ya que la apoptina transfectada podría ser fácilmente immunoprecipitada con el tampón severo RIPA, pero en absoluto en un tampón suave (Noteborn y Rohn, observaciones inéditas), sugiriendo que la posibilidad más probable era el blindaje normal del epítope específico. Con esta consideración, se decidió evaluar el blindaje del epítope mediante inmunoprecipitación comparada con la cantidad de proteína realmente presente en el lisado sin inmunoprecipitación.

Primero, se sembraron células VH10 y células Saos-2 y el día siguiente, se microinyectó la proteína MBP-apoptina o la proteína MBP-TK-apoptina en el citoplasma de 500 células por placa. En 1, 6 y 24 horas posteriores a la microinyección, se realizaron los lisados celulares con un tampón de lisis suave. El sobrenadante de cada lisado clarificado se dividió en dos alícuotas iguales, se resuspendieron en tampón de muestra, se resolvieron en SDS-PAGE, y se sometieron a análisis de transferencia Western. Se detectaron MBP-apoptina recombinante y MBP-TK-apoptina en una alícuota mediante anticuerpos contra la región del extremo C de apoptina (VP3-C) y en la otra mediante anticuerpos dirigidos contra MBP. El lisado celular no inyectado se analizó en paralelo de control negativo.

Mientras que MBP-apoptina o MBP-TK-apoptina podrían ser fácilmente immunoprecipitadas de las células tumorales inyectadas en ambos puntos de tiempo, según lo evaluado mediante teñido de VP3-C en la transferencia Western. Sin embargo, en células normales MBP-TK-apoptina o MBP-apoptina no no se redujeron de manera eficiente incluso una hora después de la microinyección y después de 6 horas que no pudieron ser immunoprecipitadas del todo. Este fenómeno se vio también cuando la transferencia Western fue resondeada con un anticuerpo contra MBP, aunque el blindaje no fue tan marcado en este caso.

Este resultado sugiere que la molécula completa no pudiera estar fácilmente disponible bajo condiciones nativas, quizás debido a su capacidad de agregación.

A continuación, las células VH10 se microinyectaron con la proteína de MBP-apoptina o la proteína MBP-TK-apoptina (de cada 500 células por placa), y se lisaron a las 3 h (hora temprana) y a las 24 h (hora tardía) después de la microinyección con el tampón de lisis suave contra el tampón de lisis RIPA fuertemente desnaturalizante. Cada sobrenadante del lisado de células idénticas fue dividido en dos alícuotas iguales. Una alícuota se immunoprecipitó con anticuerpos VP3C. Otra alícuota se añadió directamente en el tampón de muestra para la transferencia Western sin inmunoprecipitación. Al mismo tiempo, se les hizo a los lisados celulares no inyectados con ambos tampones de lisis como controles. Todas las muestras se separaron en SDS-PAGE al 12,5% y se electrotransfirieron. Las transferencias se incubaron con la sonda de anticuerpo MBP y se sondearon con ProtA-HRP para las muestras immunoprecipitadas y con G\alphaR-HRP para las muestras no immunoprecipitadas. Sin la inmunoprecipitación, la MBP-apoptina o la MBP-TK-apoptina del lisado hecho tanto con el tampón de lisis suave como con el tampón de lisis RIPA se detectaron igualmente por los anticuerpos dirigidos contra MBP tanto en los puntos de tiempo temprano (3 h) y tardío (24 h). Sin embargo, el anticuerpo específico de apoptin no immunoprecipitó fuertemente a MBP-apoptina o MBP-TK-apoptina del lisado hecho con el tampón de lisis suave, permitiendo solamente una detección muy débil de MBP-apoptina o de MBP-TK-apoptina en el punto de tiempo temprano (3 h) y fallo completo de detectar en el punto del momento posterior (24 h). En cambio, los anticuerpos de VP3C immunoprecipitaron de manera eficiente a MBP-apoptina o el MBP-TK-apoptina del lisado hecho con el tampón de lisis RIPA tanto en los puntos de tiempo temprano (3 h) y tardío (24 h).

Estos resultados indican claramente que la detección negativa de MBP-apoptina en células normales es debida al epítope de blindaje en la fracción de Apoptina de la proteína, un blindaje que se intensifica más con el tiempo posterior a la inyección.

Para determinar el destino a largo plazo de MBP-apoptina y de MBP-TK-apoptina en las células humanas normales, se microinyectaron otra vez las células VH10 con la proteína MBP-apoptina o la proteína MBP-TK-apoptina, la proteína MBP o Rho-Dex como se describió anteriormente. Las células se lisaron en el tampón severo RIPA en los días 1, 2, 3, 4 y 5 después de la microinyección y se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos dirigidos contra apoptina o MBP como se mencionó anteriormente. Tanto MBP como Rho-Dex teñidos aún permanecían después de 5 días, mientras que MBP-apoptina o MBP-TK-apoptina desaparecieron ya totalmente después de 2
días.

Estos datos muestran claramente que MBP-TK-apoptina y MBP-apoptina, debido a particularidades específicas normales, se degradaron.

El hecho que el apoptina posibilita la degradación de la proteína de fusión de la que es parte, se muestra a continuación mediante experimentos de microinyección y microscopía de fluorescencia. Se marcó MBP-apoptina con fluorescina (un presente de Rutger Leliveld, Universidad de Leiden, Países Bajos). La microinyección de las células Saos-2 con la proteína MBP-apoptina marcada con fluorescina dio como resultado la inducción de apoptosis con una velocidad similar a la que fue descrita para MBP-apoptina, que no estaba marcada con fluorescina. Además, la apoptina marcada con fluorescina era detectable en estas células tumorales, como mínimo, 2 días después de la micro-
inyección.

La microinyección de MBP-apoptina marcada con fluorescina en células VH 10 dio como resultado el secuestro de MBP-apoptina marcada en las mismas estructuras citoplásmicas que en las observadas para MBP-apoptina. Después de 24 horas, el análisis de microscopío de fluorescencia mostró que casi todas las células VH10 microinyectadas a no contenían cantidades detectables de MBP-apoptina arcada con fluorescina.

Estos datos muestran claramente que en células normales la apoptina (proteína de fusión) será secuestrada en estructuras citoplásmicas, y, posteriormente degradada y de esta manera inactivada funcionalmente. Estos datos también se confirmaron por observaciones en el laboratorio de que el nivel de proteína apoptina en esplenocitos normales derivados de ratones transgénicos con apoptina aumentó dramáticamente con la adición de inhibidores proteasomales (Pietersen y Noteborn, comunicación personal).

MBP-apoptina y el MBP-TK-apoptina no inducen apoptosis en otras células primarias humanas.

Debido a que se conoce que determinados tipos células primarias humanas son más sensibles que los fibroblastos a efectos de la terapia tumoral estándar, tales como regímenes de quimio- o radiación, se decidió explotar la utilidad de la técnica de microinyección a fin de evitar los problemas de la pobre eficacia de transfección y determinar si la apoptina era tóxic en estas células más inusuales. Con este fin, se microinyectaron hepatocitos primarios humanos y células madre mesenquimales primarias humanas con proteína de MBP-apoptina, proteína MBP-TK-apoptina y proteína MBP. Como control positivo para confirmar que las células eran competentes para sufrir apoptosis, también se microinyectó un plásmido que codifica el efector de muerte FADD (Chinnaiyan y Dixit, 1996) en el núcleo de estas células en un punto en el tiempo.

Ambos tipos de células, aunque exquisitamente sensibles a la apoptosis inducida por FADD, permanecieron resistentes a los efectos de MBP-apoptina y MBP-TK-apoptin. En cambio, MBP-apoptina y MBP-TK-apoptina permanecieron de manera inofensivo en el citoplasma y formaron estructuras de agregación citoplásmicas tal como fue observado para las células VH 10 (véase arriba). Veinticuatro horas después de la microinyección con MBP-apoptina o MBP-TK-apoptin, casi todos los hepatocitos humanos y las células madre mesenquimales eran negativas cuando se tiñeron para MBP o apoptina, pero aún contenían dextrano-rodamina como había sido visto también para las células VH10. Por el contrario, los hepatocitos humanos y las células madre mesenquimales microinyectadas con proteína MBP todavía contenían cantidades claramente detectables de MBP.

A continuación, se decidió evaluar uno de los tipos de células más sensibles de todos los tipos celulares, las células madre de la médula ósea CD34+. Debido a que estas células crecen en suspensión, primero se fijaron a la placa de microinyección usando un revestimiento de aglutinina del germen del trigo, porque se conoce que este tipo de células posee numerosos receptores para esta lectina. Las células se cultivaron durante toda la noche en un medio adaptado para retener sus características primitivas. El área citoplasmática limitada este tipo de células pequeñas fue imposible de microinyectar con las agujas más pequeñas disponibles comercialmente, así que se utilizó un plásmido que codifica apoptina o TK-apoptina sin modificar para realizar el ensayo, comparado con un plásmido que codifica el gen no apoptótico de desmina como control negativo, y FADD como control positivo. Aunque FADD fue altamente tóxico en este experimento, la apoptina o la TK-apoptina no indujeron niveles del apoptosis por encima del nivel
base.

De esta manera la terapia génica o proteica con (TK)-apoptina es probable que tenga una ventana terapéutica más grande debido a los efectos secundarios bajos en tejido normal, incluso en los especialmente sensibles.

Prevención del crecimiento celular tumoral in vitro mediante TAT-TK-Apoptina

La producción de la proteína MBP-TK-apoptina-TAT se llevó a cabo en los mismos vectores, sistemas de producción y métodos de purificación que han sido descritos para MBP-apoptina(vp3)-proteína TAT (EP 1186665).

Para examinar si MBP-TK-apoptina-TAT puede causar apoptosis específica en células tumorales humanas, células Saos-2 y U2OS (tumorales) y VH10 (normales) se dividieron 1:10 y se cultivaron durante 1 semana en presencia de 1 microgramo/ml de proteína de MBP-TK-apoptina-TAT o MBP-apoptina-TAT, o en medio normal. La mitad de los cultivos se trató con ganciclovir como se describió anteriormente del día 2 hacia adelante. Posteriormente, las células se fijaron con ácido metanol-acético y se tiñeron con Azul de Coomassie. Aunque las células en el medio de control crecieron todas hasta la confluencia, las células Saos2 y U2OS tratadas con MBP-TK-apoptina-TAT o MBP-apoptina-TAT habían sufrido apoptosis significativamente. Las células tratadas con la proteína MBP-TK-apoptina-TAT y ganciclovir desaparecieron completamente de la placa. Las células VH10 tratadas con MBP-apoptina-TAT o MBP-TK-apoptina-TAT en la proximidad de ganciclovir o no también habían crecido todas hasta la misma densidad que las células VH10 tratadas de control, mostrando que MBP-TK-apoptina-TAT no afecta el crecimiento de las células no transformadas.

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<110> Noteborn, Mathieu H. M

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Renes, Johan

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Zhang, Ying-Hui

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<120> Fusion proteins for specific treatment of cancer and auto-immune diseases

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<130> P55985PC00

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<140> PCT/NL02/00204

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<141> 2002-03-28

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<150> us 10/113,790

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<151> 2002-03-29

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<150> US 60/280,229

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<151> 2001-03-30

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<160> 6

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 523

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<212> PRT

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Apoptin-TK fusion protein

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<400> 1

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\hskip0,8cm

1

\hskip0,8cm

2

\hskip0,8cm

3

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<210> 2

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<211> 1594

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Encoding sequence for Apoptin-TK fusion protein

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<400> 2

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\hskip0,8cm

4

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<210> 3

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> primer 1

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccgt cgaccatgaa cgctctccaa gaag

\hfill

34

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<210> 4

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<211> 65

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> primer 2

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<400> 4

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\hskip0,8cm

5

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<210> 5

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<211> 67

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> primer 3

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<400> 5

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\hskip0,8cm

6

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<210> 6

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> primer 4

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccga attctcagtt agcctccccc atc

\hfill

33

Claims (14)

1. Proteína de fusión que comprende un polipéptido que proporciona citotoxicidad, quedando fusionado dicho polipéptido a una fracción que dota a la proteína de fusión de disponibilidad funcional en células aberrantes de falta de disponibilidad funcional en células no aberrantes, en la que dicha fracción es apoptina y en la que dicho polipéptido proporciona actividad enzimática que convierte un promedicamento en un medicamento.

2. Proteína de fusión, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido es TK.

3. Proteína de fusión, según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión se conjuga con una molécula diana.

4. Proteína de fusión, según la reivindicación 3, en la que la molécula diana se selecciona del grupo que consiste en liposomas, ácido fólico o derivados del ácido fólico, vitamina B-12 y derivados de la vitamina B-12, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, y un ligando para un receptor.

5. Método in vitro para inducir muerte celular en células aberrantes, comprendiendo dicho método: administrar una proteína de fusión que presenta una fracción que otorga a la proteína de fusión disponibilidad funcional en células aberrantes y falta de disponibilidad funcional en células no aberrantes, en la que dicha fracción es apoptina y en la que dicho polipéptido proporciona actividad enzimática que convierte un promedicamento en un medicamento.

6. Vehículo de inserción de genes que codifica una proteína de fusión que comprende una fracción que otorga a la proteína de fusión disponibilidad funcional en células aberrantes y falta de disponibilidad funcional en células no aberrantes, en la que dicha fracción es apoptina y en la que dicho polipéptido proporciona actividad enzimática que convierte un promedicamento en un medicamento.

7. Vehículo de inserción de genes, según la reivindicación 6, en el que el gen que codifica la proteína de fusión codifica un polipéptido diana.

8. Vehículo de inserción de genes, según la reivindicación 7, en el que el polipéptido diana comprende un dominio de transducción.

9. Vehículo de inserción de genes, según la reivindicación 8, en el que dicho dominio de transducción comprende TAT.

10. Vehículo de inserción de genes, según la reivindicación 7, en el que el polipéptido diana comprende un miembro de un par de unión específico.

11. Vehículo de inserción de genes, según la reivindicación 7, en el que el polipéptido diana comprende un scFv.

12. Vehículo de inserción de genes, según la reivindicación 6, en el que el gen que codifica la proteína de fusión codifica dos proteínas.

13. Método in vitro para suministrar células aberrantes de manera predominante sobre células normales con una proteína de fusión deseada que comprende administrar una proteína de fusión que presenta una fracción que otorga a la proteína de fusión disponibilidad funcional en células aberrantes y falta de disponibilidad funcional en células no aberrantes, en el que dicha fracción es apoptina y en la que dicho polipéptido proporciona actividad enzimática que convierte un promedicamento en un medicamento.

14. Utilización de una proteína de fusión, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un vehículo de inserción de un gen según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer y/o una enfermedad autoinmune.