CN110090309B - 功能基化红细胞膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种功能基化红细胞膜的制备方法，是一种红细胞膜载体功能化新方法。通过将本身没有生物活性的多肽‑磷脂偶联物，采取脂质插入的策略修饰在红细胞膜上，即得到功能基化的红细胞膜。该自由状态的多肽本身不具备生物活性，利用红细胞膜表面磷脂的流动性、多肽两头磷脂插入红细胞膜限制多肽的自由转动，使多肽在红细胞膜表面处于最恰当的跨度来形成正确的构象，从而赋予多肽特殊的功能，成功构建了具有靶向性的功能基化红细胞膜。本发明方法丰富了红细胞膜配体修饰种类以及应用领域，合成方法简单，靶向效果明显。

Description

功能基化红细胞膜的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物材料的修饰方法，特别是涉及一种红细胞膜载体的修饰方法，应用于生物仿生纳米医药技术领域。
背景技术
红细胞作为一种天然的氧气运输载体，在纳米医药领域有较为广泛的应用，作为自体细胞，红细胞具有良好的生物相容性，抗免疫能力，这与其表面的跨膜蛋白有着密切的关系，去除细胞内含物，即得到红细胞膜载体，红细胞膜载体继承了天然红细胞的性质，可用于包覆纳米材料，在生物医药领域有着较为广泛的应用。
红细胞膜载体应用于纳米医药领域，对其进行功能化修饰具有重要意义。迄今为止的研究中，研究者们利用脂质插入的策略进行红细胞膜表面配体修饰，使用的靶向配体大多数都是本身具有功能的，但它们种类较少，因此，如何通过对红细胞膜载体的修饰，使其处于恰当的构象从而赋予其生物医学功能，成为急需解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种功能基化红细胞膜的制备方法，赋予红细胞膜新的功能，能够为红细胞膜载体功能化修饰提供新的策略，将本身不具备功能的多肽修饰到红细胞膜载体上，通过两头磷脂插入到红细胞膜表面来限制多肽的自由转动，使其处于恰当的构象从而赋予其功能。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种功能基化红细胞膜的制备方法，将多肽两端同时偶联上磷脂，合成多肽-磷脂偶联物；然后将多肽-磷脂偶联物与红细胞膜混合，制备得到功能基化红细胞膜，使所述多肽-磷脂偶联物通过两端磷脂插入到红细胞膜表面，来限制多肽的自由转动，使多肽处于设定的构象，从而赋予功能基化红细胞膜形成具有主动靶向功能的载体囊泡结构。
优选上述使多肽处于设定的构象为，使多肽在红细胞膜表面处于相应的跨度来形成设定的构象。
作为本发明优选的技术方案，功能基化红细胞膜的制备方法，步骤包括：先将磷脂去盐酸化，然后通过置换反应和偶联反应，制备形成磷脂-多肽-磷脂结构的多肽-磷脂偶联物；然后将合成的多肽-磷脂偶联物与红细胞膜混合，放置摇床孵育，利用磷脂的流动性，使多肽-磷脂偶联物与红细胞膜融合，制备得到功能基化红细胞膜，所述多肽-磷脂偶联物通过两头磷脂插入到红细胞膜表面，来限制多肽的自由转动，使多肽处于设定的构象，从而赋予功能基化红细胞膜形成具有主动靶向功能的载体囊泡结构。
作为本发明优选的技术方案，功能基化红细胞膜的制备方法，包括如下步骤：
a.多肽-磷脂偶联物的合成：
按照磷脂、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯和多肽的摩尔比为2：2：1的比例，或者按照未进行脱盐处理的磷脂、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯和多肽的质量比为60：26：75的比例，并按照三氯甲烷、无水甲醇和去离子水体积比为65：35：8的比例，用三乙胺，将磷脂进行脱盐处理，得到去盐酸化的磷脂，然后将去盐酸化的磷脂和氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯进行混合，并加入到三氯甲烷中，使混合反应物进行搅拌反应至少3天，在反应结束后，向产物混合液中加入无水甲醇和去离子水，并称多肽加入产物混合液，得到混合液体系，然后使混合液体系在氮气保护条件下，在进行反应至少3天，然后对反应产物进行旋蒸、冻干，从而得到白色粉末状多肽-磷脂偶联物；优选上述多肽序列为CSAWYGTLYEYDGC或CGSTIYASYYESGHGC；
b.红细胞膜载体的制备：
将全血经过离心、洗涤、低渗、超声以及过膜处理后，而得到红细胞膜载体；
c.功能基化红细胞膜的组装制备：
将在所述步骤b中制备的红细胞膜以及在所述步骤a中制备的多肽-磷脂偶联物进行混合，放入摇床进行孵育，而得到功能基化红细胞膜。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤a中，用50μL的三乙胺，将12mg的磷脂进行脱盐处理，得到去盐酸化的磷脂，然后将去盐酸化的磷脂和5.2mg的氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯进行混合，并加入到2.6mL的三氯甲烷中，使混合反应物进行搅拌反应至少3天，在反应结束后，向产物混合液中加入1.4mL无水甲醇和320μL去离子水，并称15mg的多肽加入产物混合液，得到混合液体系，然后使混合液体系在氮气保护条件下，再进行反应至少3天，然后对反应产物进行旋蒸、冻干，从而得到白色粉末状多肽-磷脂偶联物。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，取全血在4～8℃，800×g转速下离心得到红细胞，用10mM且pH为7.4的PBS洗涤至少3次，再按照红细胞与2.5mM的PBS低渗溶液的质量比为1：40的比例，机械能低渗处理，去除红细胞内含物，在3000×g转速下进行离心洗涤，得到红细胞囊泡；然后在功率不低于100W，频率不低于40KHz下进行超声至少10min后，最后挤压过400nm膜10次，200nm膜10次，即得到尺寸均匀的红细胞膜载体。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤c中，取30μL红细胞膜和1mg多肽-磷脂偶联物混合于1mL的10mM且pH为7.4PBS中，在不高于37℃下进行孵育至少30min，从而得到功能化的红细胞膜。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明通过将本身没有生物活性的多肽-磷脂偶联物，采取脂质插入的策略修饰在红细胞膜上，即得到功能基化的红细胞膜；该自由状态的多肽本身不具备生物活性，利用红细胞膜表面磷脂的流动性、多肽两头磷脂插入红细胞膜限制多肽的自由转动，使多肽在红细胞膜表面处于最恰当的跨度来形成正确的构象，从而赋予多肽特殊的功能，成功构建了具有靶向性的功能基化红细胞膜；本发明丰富了红细胞膜配体修饰种类以及应用领域，合成方法简单，靶向效果明显，为红细胞膜靶向应用领域提供新的思路；
2.本发明方法简单，易于实现，具有广泛的生物医学价值。
附图说明
图1为本发明实施例一方法红细胞膜与两头功能化磷脂的多肽结合制备功能基化红细胞膜示意图。
图2为本发明实施例一合成的多肽-磷脂偶联物成功修饰上红细胞膜的荧光共定位图像。
图3为本发明实施例一方法制备的功能基化红细胞膜靶向EGFR蛋白电镜图。
图4为本发明实施例二方法制备的功能基化红细胞膜特异性结合溶菌酶图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，分别以靶向EGFR的功能基化红细胞膜和靶向溶菌酶的功能基化红细胞膜为例。本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施例中，一种功能基化红细胞膜的制备方法，包括如下步骤：
a.多肽-磷脂偶联物的合成：
用50μL的三乙胺，将12mg的磷脂进行脱盐处理，得到去盐酸化的磷脂，然后将去盐酸化的磷脂和5.2mg的氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯进行混合，并加入到2.6mL的三氯甲烷中，使混合反应物进行搅拌反应3天，在反应结束后，向产物混合液中加入1.4mL无水甲醇和320μL去离子水，并称15mg的多肽加入产物混合液，得到混合液体系，然后使混合液体系在氮气保护条件下，在进行反应3天，然后对反应产物进行旋蒸、冻干，从而得到白色粉末状多肽-磷脂偶联物；本实施例采用的多肽的序列为CSAWYGTLYEYDGC；
b.红细胞膜载体的制备：
取全血在4～8℃，800×g转速下离心得到红细胞，用10mM且pH为7.4的PBS洗涤3次，再按照红细胞与2.5mM的PBS低渗溶液的质量比为1：40的比例，机械能低渗处理，去除红细胞内含物，在3000×g转速下进行离心洗涤，得到红细胞囊泡；然后在功率100W，频率40KHz下进行超声10min后，最后挤压过400nm膜10次，200nm膜10次，即得到尺寸均匀的红细胞膜载体；本实施例将全血经过离心、洗涤、低渗、超声以及过膜处理后，而得到红细胞膜载体；
c.功能基化红细胞膜的组装制备：
取30μL在所述步骤b中制备的红细胞膜和1mg在所述步骤a中制备的多肽-磷脂偶联物混合于1mL的10mM且pH为7.4PBS中，在37℃下进行孵育30min，从而得到功能化的红细胞膜。本实施例将红细胞膜以及多肽-磷脂偶联物进行混合，放入摇床进行孵育，而得到功能基化红细胞膜。参见图1，是红细胞膜与两头功能化磷脂的多肽结合制备功能基化红细胞膜示意图。
本实施例制备方法是利用二硫键将磷脂偶联在多肽上，合成两头接有磷脂的多肽，多肽能利用脂质插入的策略通过简单的混合孵育就能修饰到红细胞膜上，多肽本身不具有靶向功能，区别于现阶段使用的其他本身具有功能的靶向配体，通过两头磷脂插入到红细胞膜表面，来限制多肽的自由转动使其处于恰当的构象从而赋予其主动靶向功能，本实施例方法丰富了红细胞膜靶向配体修饰的种类，合成方法简单，靶向作用效果强。
实验测试分析
为了进一步验证本申请功能基化红细胞膜的制备方法的可实施性，在制备过程中，当分别制备出红细胞膜以及多肽-磷脂偶联物后，在红细胞膜上修饰DiI红色荧光，在多肽-磷脂偶联物上修饰FITC绿色荧光，两者混合后，37℃恒温箱孵育30min，取样品于载玻片上，利用荧光显微镜观察荧光定位情况。通过观察荧光共定位图像，如图2所示，红细胞膜上修饰的DiI红色荧光能够与多肽-磷脂偶联物上的FITC绿色荧光完美的重合，说明红细胞膜上成功的修饰上了多肽-磷脂偶联物。
为了验证功能基化红细胞膜靶向EGFR的可实施性，制备出靶向EGFR的功能基化红细胞膜后，将所述功能基化红细胞膜包覆上聚乳酸-羟基乙酸聚合物合成的纳米球并与EGFR蛋白混合，室温下孵育2小时，利用透射电子显微镜观察功能基化红细胞膜与EGFR蛋白结合情况，如图3所示，50nm物质颗粒为功能基化红细胞膜包覆的纳米球，20nm物质颗粒为EGFR蛋白，能明显看出功能基化红细胞膜包覆的纳米球能很好的靶向EGFR蛋白，说明红细胞膜功能基化后具有靶向EGFR的能力。本实施例功能基化红细胞膜包覆着所述纳米球还起到便于观察的效果。
实施例二：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种功能基化红细胞膜的制备方法，包括如下步骤：
a.多肽-磷脂偶联物的合成：
用50μL的三乙胺，将12mg的磷脂进行脱盐处理，得到去盐酸化的磷脂，然后将去盐酸化的磷脂和5.2mg的氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯进行混合，并加入到2.6mL的三氯甲烷中，使混合反应物进行搅拌反应3天，在反应结束后，向产物混合液中加入1.4mL无水甲醇和320μL去离子水，并称15mg的多肽加入产物混合液，得到混合液体系，然后使混合液体系在氮气保护条件下，在进行反应3天，然后对反应产物进行旋蒸、冻干，从而得到白色粉末状多肽-磷脂偶联物；本实施例采用的多肽的序列为CGSTIYASYYESGHGC；
b.本步骤与实施例一相同；
c.本步骤与实施例一相同。本实施例合成红细胞膜和多肽-磷脂偶联物后，将红细胞膜以及多肽-磷脂偶联物进行混合，放入摇床进行孵育，而得到功能基化红细胞膜。
实验测试分析
为了验证功能基化红细胞膜靶向溶菌酶的可实施性，制备靶向溶菌酶的功能基化红细胞膜后，利用酶活实验，溶壁微球菌底物悬浊液每10mg溶解于30mL的PB缓冲溶液(0.1M，pH＝6)中，配置2.2μg/mL溶菌酶溶液。取1mL的功能基化红细胞膜，加入0.5mL的上述溶菌酶溶液，震荡混合10s，水浴30min，之后取1mL的溶壁微球菌底物悬浊液加入到混合物中，剧烈震荡后迅速转移至比色皿中，用紫外分光光度计测量在150s内，450nm处吸光度的变化。上述所有的测量过程均在25℃恒温条件下进行。如图4显示，纯的红细胞膜RBCm没有经过修饰的不能抑制溶菌酶活性，所述多肽单头磷脂修饰的简称p1m制备的功能基化红细胞膜p1m-RBCm也几乎没有抑制溶菌酶活性，两头磷脂修饰的多肽p1修饰的功能基化红细胞膜p1-RBCm很好的抑制了溶菌酶活性，说明实现功能基化红细胞膜靶向功能需要两个条件：同溶菌酶特异性结合的正确的多肽序列和正确的构象，所述多肽单头磷脂修饰的多肽不能处于正确的构象所以不具备靶向溶菌酶的能力。本实施例合成红细胞膜和多肽-磷脂偶联物后，混合孵育制备功能基化红细胞膜，可以得到一种新的靶向溶菌酶的功能基化红细胞膜。
综上所述，本发明上述实施例先将磷脂去盐酸化，然后通过置换反应和偶联反应，制备形成磷脂-多肽-磷脂结构的多肽-磷脂偶联物，将合成的多肽-磷脂偶联物与红细胞膜混合，放置摇床孵育，利用磷脂的流动性多肽-磷脂偶联物就能与红细胞膜融合制备得到功能基化红细胞膜，所述多肽-磷脂偶联物通过两头磷脂插入到红细胞膜表面，来限制多肽的自由转动使其处于恰当的构象从而赋予其主动靶向功能，成功构建了具有靶向性的功能基化红细胞膜。本发明丰富了红细胞膜配体修饰种类以及应用领域，合成方法简单，靶向效果明显。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明功能基化红细胞膜的制备方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种功能基化红细胞膜的制备方法，其特征在于：将多肽两端同时偶联上磷脂，合成多肽-磷脂偶联物；然后将多肽-磷脂偶联物与红细胞膜混合，制备得到功能基化红细胞膜，使所述多肽-磷脂偶联物通过两端磷脂插入到红细胞膜表面，来限制多肽的自由转动，使多肽处于设定的构象，从而赋予功能基化红细胞膜形成具有主动靶向功能的载体囊泡结构；所述多肽序列为CSAWYGTLYEYDGC或CGSTIYASYYESGHGC。
2.根据权利要求1所述功能基化红细胞膜的制备方法，其特征在于：所述使多肽处于设定的构象为，使多肽在红细胞膜表面处于相应的跨度来形成设定的构象。
3.根据权利要求1所述功能基化红细胞膜的制备方法，其特征在于：先将磷脂去盐酸化，然后通过置换反应和偶联反应，制备形成磷脂-多肽-磷脂结构的多肽-磷脂偶联物；然后将合成的多肽-磷脂偶联物与红细胞膜混合，放置摇床孵育，利用磷脂的流动性，使多肽-磷脂偶联物与红细胞膜融合，制备得到功能基化红细胞膜，所述多肽-磷脂偶联物通过两头磷脂插入到红细胞膜表面，来限制多肽的自由转动，使多肽处于设定的构象，从而赋予功能基化红细胞膜形成具有主动靶向功能的载体囊泡结构。
4.根据权利要求3所述功能基化红细胞膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a.多肽-磷脂偶联物的合成：
按照未进行脱盐处理的磷脂、氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯和多肽的质量比为60：26：75的比例，并按照三氯甲烷、无水甲醇和去离子水体积比为65：35：8的比例，用三乙胺，将磷脂进行脱盐处理，得到去盐酸化的磷脂，然后将去盐酸化的磷脂和氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯进行混合，并加入到三氯甲烷中，使混合反应物进行搅拌反应至少3天，在反应结束后，向产物混合液中加入无水甲醇和去离子水，并称多肽加入产物混合液，得到混合液体系，然后使混合液体系在氮气保护条件下，在进行反应至少3天，然后对反应产物进行旋蒸、冻干，从而得到白色粉末状多肽-磷脂偶联物；
b.红细胞膜载体的制备：
将全血经过离心、洗涤、低渗、超声以及过膜处理后，而得到红细胞膜载体；
c.功能基化红细胞膜的组装制备：
将在所述步骤b中制备的红细胞膜以及在所述步骤a中制备的多肽-磷脂偶联物进行混合，放入摇床进行孵育，而得到功能基化红细胞膜。
5.根据权利要求4所述功能基化红细胞膜的制备方法，其特征在于：在所述步骤a中，用50μL的三乙胺，将12mg的磷脂进行脱盐处理，得到去盐酸化的磷脂，然后将去盐酸化的磷脂和5.2mg的氮-琥珀星氩氨-3(2-吡啶二硫代)-酸酯进行混合，并加入到2.6mL的三氯甲烷中，使混合反应物进行搅拌反应至少3天，在反应结束后，向产物混合液中加入1.4mL无水甲醇和320μL去离子水，并称15mg的多肽加入产物混合液，得到混合液体系，然后使混合液体系在氮气保护条件下，在进行反应至少3天，然后对反应产物进行旋蒸、冻干，从而得到白色粉末状多肽-磷脂偶联物。
6.根据权利要求4所述功能基化红细胞膜的制备方法，其特征在于：在所述步骤b中，取全血在4～8℃，800×g转速下离心得到红细胞，用10mM且pH为7.4的PBS洗涤至少3次，再按照红细胞与2.5mM的PBS低渗溶液的体积比为1：40的比例，机械能低渗处理，去除红细胞内含物，在3000×g转速下进行离心洗涤，得到红细胞囊泡；然后在功率不低于100W，频率不低于40KHz下进行超声至少10min后，最后挤压过400nm膜10次，200nm膜10次，即得到尺寸均匀的红细胞膜载体。
7.根据权利要求4所述功能基化红细胞膜的制备方法，其特征在于：在所述步骤c中，取30μL红细胞膜和1mg多肽-磷脂偶联物混合于1mL的10mM且pH为7.4PBS中，在不高于37℃下进行孵育至少30min，从而得到功能化的红细胞膜。
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