CN104109703A - 一种多肽-磷脂衍生物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽-磷脂衍生物的制备方法，其特征在于：该多肽-磷脂衍生物是将磷脂和多肽在磷脂酶D作用下生成，多肽的氨基酸组成中至少含有丝氨酸或苏氨酸中一种，制备时将多肽溶解，添加钙盐，调节pH到4.0～6.0；将磷脂酰胆碱溶解；将磷酯酶D和多肽加到磷脂酰胆碱溶液中，在35～50℃下搅拌1～6小时；所得反应液加入饱和食盐水分层，收集油相，水相萃取后合并油相干燥后过滤，滤液减压蒸去溶剂，冷冻干燥得到成品。本发明采用磷脂对多肽进行修饰，工艺简单易操作，制得多肽-磷脂衍生物能增加被修饰药物透过细胞的能力，具有靶向性，并可提高药物的吸收利用率、避免被组织内的水解酶水解、减少药物用量，使药物具有缓释控释作用，适合于生物体内降解。

Description

一种多肽-磷脂衍生物的制备方法

技术领域

本发明属于生物活性药物技术领域，具体是一种多肽-磷脂衍生物的制备方法。

背景技术

多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由一种或多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。多肽是构成蛋白质的结构片段，也是蛋白质发挥作用的活性基团，是人体进行代谢、调控活动的重要物质，现已作为医药产品的重要组成部分进行大量生产。但多肽类药物在临床实践中也暴露出一些问题，主要表现为稳定性差、循环半衰期短及存在免疫原性。因此防止其在体内迅速降解，延长其半衰期，降低其免疫原性已经成为蛋白质工程药物改造的重要课题。

为了解决多肽类药物在临床中表现出的这些问题，人们进行了大量的研究，并取得许多有效的方法。而多肽的化学修饰在改变肽类化合物的物理化学性质，解决其在体内的有效利用方面发挥着越来越重要的作用。多肽的化学修饰是利用化学方法在分子水平上对多肽进行改造，即在体外将多肽通过化学方法与一些化合物特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，形成复合物，从而改变多肽的性质。经过修饰后的多肽药物可以显著降低免疫原性、减少毒副作用、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况等等，明显改善了药物的疗效。

然而，化学修饰在给蛋白质及多肽药物带来一系列好处的同时也存在一些问题，最主要的就是会造成被修饰药物生物活性降低。首先，化学修饰改变了蛋白质的分子结构，这可能会造成其性能发生改变。另外，修饰剂分子在阻碍蛋白酶及抗体靠近的同时也会阻碍反应底物的靠近，从而影响其生物活性。并且，过量的修饰剂在药物里面的残留也是一个难以解决的难题。

因此目前需要研发出一种新型的多肽药物化学修饰方法来解决上述问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种多肽-磷脂衍生物的制备方法，采用磷脂对多肽进行修饰，工艺简单易操作，制得的多肽-磷脂衍生物能增加被修饰药物透过细胞的能力，具有靶向性，并可提高药物的吸收利用率、避免被组织内的水解酶水解、减少药物用量，使药物具有缓释和控释作用，且适合于生物体内降解。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种多肽-磷脂衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

所述步骤1）中的多肽溶解是采用有机溶剂与水的混合溶剂进行的，其中有机溶剂与水的体积比例是5:1～10:1，有机溶剂为C₁～C₄的醇或C₃～C₅的酮中的一种或几种，形成的多肽溶液浓度为0.05-0.5g/mL。

作为改进，所述步骤1）的pH调节是采用乙酸、磷酸、乙酸/乙酸盐缓冲液或者磷酸盐缓冲液进行调节的。

作为优选，所述钙盐是指硫酸钙、氯化钙、磷酸钙、磷酸二氢钙、磷酸氢二钙、碳酸钙或硝酸钙的一种或者几种，所述钙盐的量为磷脂酰胆碱重量的0.2～1%。

作为优选，所述磷脂酰胆碱的来源包括大豆、葵花籽、鸡蛋、鱼油或磷虾油。

再改进，所述磷脂酰胆碱中的磷与多肽中丝氨酸和苏氨酸的摩尔比为2:1～5:1。

作为优选，所述步骤2）中磷脂酰胆碱溶解的溶剂是正庚烷、正己烷、环己烷和石油醚的一种或几种，形成的磷脂酰胆碱溶液的浓度为0.1-0.5g/mL。

再改进，所述步骤3）中的磷酯酶D的加入量为磷脂酰胆碱重量的5-20%。

作为优选，所述步骤4）中的干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁。

最后，所述多肽为下列的至少一种：

多肽一：丝氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，酪氨酸（分子量610.66）；

多肽二：苏氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，天冬氨酸（分子量657.71）；

多肽三：丙氨酸，缬氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，苏氨酸（分子量532.58）；

多肽四：赖氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，苏氨酸，酪氨酸（分子量612.62）；

多肽五：苯丙氨酸，苏氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，苏氨酸（分子量610.65）。

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用磷脂对多肽进行修饰，将磷脂和多肽在磷脂酶D的作用下，生成磷脂-多肽衍生物，磷脂相对于其它修饰方法具有许多优点：1、磷脂对机体无毒，其双分子层与生物膜有较大的相似性以及组织相容性，从而易于被组织吸收，提高了药物的吸收利用率；2、磷脂本身是一种表面活性剂，可以将所修饰的多肽包裹在磷脂中，被包裹的多肽可以避免被组织内的水解酶水解；3、多肽被包裹后可以降低其对机体特定部位的毒性，减少药物用量，使药物具有缓释和控释作用；4、磷脂本身无毒和免疫原性，适合于生物体内降解。本发明的磷脂-多肽衍生物进入人体后，随着血液循环在体内与细胞相互作用而将药物输送入细胞内，由于磷脂是细胞膜的主要成分，与细胞的亲和力强，能增加被修饰药物透过细胞的能力。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

以下实施例中的多肽化合物是自制的，但本发明的保护范围不限于下述的多肽化合物以及实施例。

下列五种多肽被用于实施例的反应：

多肽一：丝氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，酪氨酸（分子量610.66）；

多肽二：苏氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，天冬氨酸（分子量657.71）；

多肽三：丙氨酸，缬氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，苏氨酸（分子量532.58）；

多肽四：赖氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，苏氨酸，酪氨酸（分子量612.62）；

多肽五：苯丙氨酸，苏氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，苏氨酸（分子量610.65）。

实施例1

将多肽一30g加到丁醇50mL，水10mL中搅拌，加入硫酸钙0.5g，用醋酸调节pH值到4.0，加入磷脂酶D4mL，在氮气保护下将磷脂酰胆碱75g溶于200mL正己烷中加入体系，在45℃下搅拌3小时后加入饱和食盐水分层，水相用100mL正己烷萃取，合并油相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂，再冷冻干燥得到多肽一的磷脂修饰产物。

实施例2

将多肽二33g加到异丙醇70mL，水10mL中搅拌，加入氯化钙0.3g，用磷酸调节pH值到5.0，加入磷脂酶D8mL，在氮气保护下将磷脂酰胆碱150g溶于400mL正庚烷中加入体系，在30℃下搅拌6小时后加入饱和食盐水分层，水相用100mL正庚烷萃取，合并油相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂，再冷冻干燥得到多肽二的磷脂修饰产物。

实施例3

将多肽三27g加到丙酮80mL，水10mL中搅拌，加入磷酸钙1.0g，用磷酸盐缓冲液调节pH值到6.0，加入磷脂酶D6mL，在氮气保护下将磷脂酰胆碱100g溶于300mL石油醚中加入体系，在30℃下搅拌6小时后加入饱和食盐水分层，水相用100mL石油醚萃取，合并油相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂，再冷冻干燥得到多肽三的磷脂修饰产物。

实施例4

将多肽四30g加到乙醇100mL，水10mL中搅拌，加入磷酸二氢钙0.45g，用磷酸调节pH值到5.0，加入磷脂酶D10mL，在氮气保护下将磷脂酰胆碱150g溶于400mL正辛烷中加入体系，在30℃下搅拌6小时后加入饱和食盐水分层，水相用100mL正辛烷萃取，合并油相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，再冷冻干燥得到多肽四的磷脂修饰产物。

实施例5

将多肽五30g加到甲醇100mL，水10mL中搅拌，加入硝酸钙1.5g，用醋酸/醋酸钠调节pH值到5.5，加入磷脂酶D14mL，在氮气保护下将磷脂酰胆碱180g溶于600mL正庚烷中加入体系，在30℃下搅拌6小时后加入饱和食盐水分层，水相用100mL正庚烷萃取，合并油相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，再冷冻干燥得到多肽五的磷脂修饰产物。

Claims (10)

1.一种多肽-磷脂衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将多肽溶解，添加钙盐，调节pH到4.0～6.0；

2）在氮气环境中将磷脂酰胆碱溶解；

3）将磷酯酶D和步骤1）所得的多肽溶液加到步骤2）的磷脂酰胆碱溶液中，在35～50℃下搅拌1～6小时；

4）将步骤3）所得反应液加入饱和食盐水分层，收集油相，水相萃取2～3次，合并油相用干燥剂干燥后过滤；

5）将步骤4）所得的滤液减压蒸去溶剂，最后冷冻干燥得到多肽-磷脂衍生物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中的多肽溶解是采用有机溶剂与水的混合溶剂进行的，其中有机溶剂与水的体积比例是5:1～10:1，有机溶剂为C₁～C₄的醇或C₃～C₅的酮中的一种或几种，形成的多肽溶液浓度为0.05-0.5g/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1）的pH调节是采用乙酸、磷酸、乙酸/乙酸盐缓冲液或者磷酸盐缓冲液进行调节的。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述钙盐是指硫酸钙、氯化钙、磷酸钙、磷酸二氢钙、磷酸氢二钙、碳酸钙或硝酸钙的一种或者几种，所述钙盐的量为磷脂酰胆碱重量的0.2～1%。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磷脂酰胆碱的来源包括大豆、葵花籽、鸡蛋、鱼油或磷虾油。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磷脂酰胆碱中的磷与多肽中丝氨酸和苏氨酸的摩尔比为2:1～5:1。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中磷脂酰胆碱溶解的溶剂是正庚烷、正己烷、环己烷和石油醚的一种或几种，形成的磷脂酰胆碱溶液的浓度为0.1-0.5g/mL。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中的磷酯酶D的加入量为磷脂酰胆碱重量的5-20%。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中的干燥剂为无水硫酸钠或无水硫酸镁。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多肽为下列的至少一种：

多肽一：丝氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，酪氨酸（分子量610.66）；

多肽二：苏氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，天冬氨酸（分子量657.71）；

多肽三：丙氨酸，缬氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，苏氨酸（分子量532.58）；

多肽四：赖氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，苏氨酸，酪氨酸（分子量612.62）；

多肽五：苯丙氨酸，苏氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，苏氨酸（分子量610.65）。