BRPI0611765A2

BRPI0611765A2 - anticorpos estáveis e solúveis que inibem tnfalfa

Info

Publication number: BRPI0611765A2
Application number: BRPI0611765-1A
Authority: BR
Inventors: Stefan Ewert; Alcide Barberis; David M Urech; Der Maur Adrian Auf; Peter Lichtlen
Original assignee: Esbatech Ag
Priority date: 2005-06-07
Filing date: 2006-06-06
Publication date: 2011-12-20
Also published as: KR101457223B1; RU2415151C2; NZ563580A; KR20140071450A; US9683034B2; MX2007015280A; US9315572B2; CN105153306A; US20140171634A1; AU2006255415A1; RS52861B; JP5645890B2; EP1891110A2; JP2008545433A; JP2013027390A; CA2609999C; IL187503A0; DK2390267T3; HK1164891A1; EP2390267B1

Abstract

ANTICORPOS ESTáVEIS E SOLúVEIS QUE INIBEM TNFALFA. A presente invenção refere-se a anticorpos scFv e fragmentos Fab particularmente estáveis e solúveis, específicos para TNF<244>, que compreendem sequências com cadeia leve e cadeia pesada específicas, que são otimizadas quanto à estabilidade, solubilidade ligação in vitro e in vivo, e baixa imunogenicidade. Os ditos anticorpos são desenhados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios relacionados a TNF<244>. Os ácidos nucléicos, vetores e células hospedeiras para a expressão dos anticorpos recombinantes da invenção, os métodos para isolá-los e o uso dos ditos anticorpos em medicina, também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ESTÁVEIS E SOLÚVEIS QUE INIBEM TNFALFA".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a anticorpos otimizados e deriva- dos de anticorpos otimizados que se ligam ao fator alfa de necrose tumoral (TNFa) e bloqueiam sua função, e são úteis para o diagnóstico e/ou trata- mento, prevenção ou melhora de doenças associadas a TNFa; suas se- qüências codifiçadoras, produção e uso em composições farmacologicamen- te apropriadas.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

O fator de necrose tumoral alfa (TNFa, também conhecido como caquectina) é uma citocina de ocorrência natural em mamíferos, produzida por inúmeros tipos de células, incluindo monócitos e macrófagos, em respos- ta a endotoxinas ou outros estímulos. TNFa é um mediador importante de reações inflamatórias, imunológicas e patofisiológicas (Grell, M. et aí., Cell 83:793-802 (1995)).

O TNFa solúvel é formado pela clivagem de uma proteína transmembrana precursora (Kriegler et ai, Cell 53:45-53 (1988)), e os poli- peptídeos de 17 kDa secretados montam complexos homotriméricos solú- veis (Smith et ai, J. Bioi Chem. 262:6951-6954 (1987); para obter revisões vide Butler et al., Nature 320:584 (1986); Old, Science 230:630 (1986)). Es- tes complexos, então, se ligam a receptores encontrados em uma série de células. A ligação produz um arranjo de efeitos pró-inflamatórios, incluindo (i) liberação de outras citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucina IL-6, IL-8 e IL-1, (ii) liberação de metaloproteinases de matriz, e (iii) regulação as- cendente da expressão de moléculas de adesão endotelial, ampliando ainda mais a cascata inflamatória e imunológica por atrair leucócitos para dentro de tecidos extravasculares.

Inúmeros distúrbios estão associados a níveis elevados de TNFa, muitos deles de importância médica significativa. TNFa demonstrou estar regulado de forma ascendente em inúmeras doenças humanas, inclu- indo doenças crônicas tais como artrite reumatóide, distúrbios inflamatórios dos intestinos, incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa, sépsis, insufici- ência cardíaca congestiva, asma brônquica, e esclerose múltipla. Os ca- mundongos transgênicos quanto a TNFa humano produzem altos níveis de TNFa construtivamente e desenvolvem uma poliartrite espontânea destruti- va semelhante à artrite reumatóide (Keffer et ai, EMBO J.10:4025-4031 (1991)). TNFa é, portanto, referido como uma citocina pró-inflamatória.

TNFa está agora bem estabelecido como um fator importante na patogênese de artrite reumatóide, que é uma doença crônica, progressiva e incapacitante, distinguida por inflamação e destruição poliarticular, com sin- tomas sistêmicos de febre, mal-estar e fadiga. A artrite reumatóide leva tam- bém à inflamação sinovial crônica, com freqüente progressão para destrui- ção das cartilagens e ossos articulares. Níveis aumentados de TNFa são encontrados no líquido sinovial e no sangue periférico de pacientes que so- frem de artrite reumatóide. Quando agentes bloqueadores de TNFa são ad- ministrados a pacientes que sofrem de artrite reumatóide, eles reduzem a inflamação, melhorar os sintomas e retardam a danificação das articulações (McKown et al., Arthritis Rheum. 42:1204-1208 (1999)).

Fisiologicamente, TNFa está associado também à proteção con- tra infecções específicas (Cerami et ai, tmmunol. Today 9:28 (1988)). TNFa é liberado por macrófagos que foram ativados por lipopolissacarídeos de bactérias gram-negativas. Assim sendo, TNFa parece ser um mediador en- dógeno de importância fundamental, envolvido no desenvolvimento e pato- gênese de choque endotóxico associado com sépsis bacteriana (Michie et ai, Br. J. Surg. 76:670-671 (1989); Debets et ai, "Second Vienna Shock Fo- rum", páginas 463-466 (1989); Simpson et ai, Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989); Waage et ai., Lancet 1:355-357 (1987); Hammerle et ai, "Second Vienna Shock Fórum", páginas 715-718 (1989); Debets et ai, Crit. Care Med. 17:489-497 (1989); Calandra et ai, J. Infect. Dis. 161:982-987 (1990); Revhaug et al. Arch. Surg. 123:162-170 (1988)).

Da mesma forma que em outros sistemas orgânicos, TNFa de- monstrou também desempenhar um papel importante no sistema nervoso central, particularmente em distúrbios inflamatórios e auto-imunes do siste- ma nervoso, incluindo esclerose múltipla, síndrome de Guillan-Barre e mias- tenia grave, e em distúrbios neurodegenerativos do sistema nervoso, inclu- indo doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington. TNFa está envolvido também em distúrbios de sistemas afins da retina e do músculo, incluindo neurite óptica, degeneração macular, retinopatia diabéti- ca, dermatomiosite, esclerose lateral amiotrófica, bem como em lesões ao sistema nervoso, incluindo lesão cerebral traumática, lesão aguda do cordão espinhal, e acidente vascular cerebral.

A hepatite é outro distúrbio inflamatório relacionado a TNFa, que, dentre outros disparadores, pode ser causada por infecções virais, in- cluindo Epstein-Barr, citomegalovírus, e vírus das hepatites Α-E. A hepatite causa inflamação aguda do fígado na região portal e lobular, e em seguida, fibrose e progressão de tumores.

TNFa pode mediar a caquexia em câncer, que causa a maior parte da morbidade e morbidez de câncer (Tisdale, M.J., Langenbecks Arch. Surg. 389:299-305 (2004)).

O papel importante desempenhado por TNFa em inflamação, em respostas celulares imunes e na patologia de muitas doenças, levou à busca por antagonistas de TNFa.

TNFa é uma citocina importante, cujo bloqueio sistêmico porta o risco de maior freqüência e gravidade de infecções clinicamente manifes- tadas, particularmente a reativação de tuberculose latente e possivelmente outros riscos que incluem indução de linfomas, doenças desmielinizantes e insuficiência cardíaca.

Uma classe de antagonistas de TNFa, desenhada para o trata- mento de doenças mediadas por TNFa, são anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente a TNFa, e desta forma, bloqueiam sua função. O uso de anticorpos anti-TNFa demonstrou que um bloqueio de TNFa pode reverter efeitos atribuídos a TNFa, incluindo decréscimos em IL- 1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adesão e destruição tecidual (Feldmann etal. Adv. Immunol. 1997:283-350 (1997)).

Os anticorpos direcionados contra TNFa foram propostos para a profilaxia e tratamento de choque endotóxico (Beutler et al., Science 234:470-474 (1985)). O uso de anticorpos anti-TNFa no tratamento de cho- que séptico está discutido em Bodmer et al., Crit. Care Med. 21:441-446 (1993); Wherry et al., Crit. Care Med. 21:436-440 (1993); e Kirschenbaum et al., Crit. Care Med. 26:1625-1626 (1998).

Um método para tratar uma doença neurodegenerativa em um humano administrando um anticorpo monoclonal anti-TNFa ou um seu frag- mento Iigante de TNFa foi descrito no documento n2 US 2003/147.891.

O documento n2 WO 0149321 enuncia o uso de bloqueadores de TNFa1 incluindo anticorpos anti-TNFa, para tratar distúrbios neurológicos e afins causados por TNFa. O documento fornece um método para tratar os ditos distúrbios administrando um antagonista de TNFa.

O documento n2 WO 03047510 descreve vários tipos de anti- corpos monoclonais e manipulados, direcionados contra TNFa, sua produ- ção, compostos que os compreendem e o uso em medicina.

Os anticorpos úteis para terapias de doenças mediadas por TNFa são usualmente anticorpos monoclonais (mAb) produzidos por tecno- logia com hibridomas a partir de uma fonte natural, usualmente um camun- dongo, ou anticorpos obtidos por bioengenharia. Estes últimos correspon- dem a anticorpos de ocorrência natural pelo fato de que eles compreendem cadeias pesadas e leves de comprimento inteiro, ou aos fragmentos Fab que também podem ser gerados a partir de anticorpos naturais por clivagem pro- teolítica, ou a anticorpos scFv de cadeia única, onde os fragmentos das re- giões variáveis das cadeias pesadas e leves são ligadas por um Iigante peptídico.

As cadeias pesadas e leves de um anticorpo compreendem domínios constantes e variáveis. Como os anticorpos não-humanos são i- munogênicos, a quantidade de seqüências semelhantes às humanas em um anticorpo é freqüentemente aumentada em um anticorpo assim denominado "híbrido", que compreende regiões constantes de uma IgG humana, e regi- ões variáveis equivalentes às seqüências de um anticorpo de animal, na maioria dos casos anticorpos murinos com a especificidade desejada. Estas regiões variáveis podem ser então adaptadas adicionalmente para se torna- rem mais similares a a um anticorpo humano típico por mutagênese, levando a um anticorpo "humanizado". Em ainda mais uma modalidade alternativa, apenas as partes Iigantes de antígenos, isto é, as regiões determinantes complementares (CDRs) das regiões variáveis de um anticorpo de camun- dongo são combinadas com a estrutura de um anticorpo humano, resultando em um anticorpo "enxertado com CDR".

Os anticorpos monoclonais contra TNFa foram descritos nas técnicas anteriores. Meager et a!., Hybridoma 6:305-311 (1987), descrevem anticorpos monoclonais murinos contra TNFa recombinante. Shimamoto et al., Immunol. Lett. 17:311-318 (1988), descrevem o uso de anticorpos mono- clonais murinos contra TNFa na prevenção de choque endotóxico em ca- mundongos.

A patente n2 US 5.919.452 descreve anticorpos quiméricos anti- TNFa e seu uso no tratamento de patologias associadas à presença de TN Fa.

O uso de anticorpos anti-TNFa no tratamento de artrite reuma- tóide e doença de Crohn está discutido em Feldman et al., Transplantation Proceedings 30:4126-4127 (1998); Adorini et al., Trends in Immunology To- day 18:209-211 (1997); e Feldman et al., Advanced Immunology 64:283-350 (1997). Os anticorpos para TNFa usados nesses tratamentos são geralmen- te anticorpos quiméricos, tais como aqueles descritos na patente n- US 5.919.452.

O documento n2 US 2003/3187231 descreve anticorpos anti- TNFa humanizados com pelo menos uma região CDR não-humana que tem melhores características de ligação. Além disso, no pedido de patente inter- nacional n2 WO 92/11383, estão descritos anticorpos recombinantes, inclu- indo anticorpos enxertados com CDR1 específicos para TNFa. Rankin et al., Br. J. Rheumatol. 34:334-342 (1995), descrevem o uso desses anticorpos enxertados com CDR no tratamento de artrite reumatóide.

O documento n2 WO 9211383 descreve um anticorpo recombi- nante humanizado enxertado com CDR específico para TNFa, que é deriva- do a partir de um anticorpo monoclonal murino 61E7, hTNF1, hTNF3 ou 101.4, e ele enuncia a produção e uso dos ditos anticorpos no diagnóstico e/ou terapia de distúrbios associados a TNFoc.

Dentre os inibidores de TNFa específicos que se tornaram co- mercialmente disponíveis apenas recentemente, um anticorpo monoclonal, quimérico murino-humano, direcionado contra TNFa (infliximab, Remicade®; Centocor Corporation/Johnson & Johnson), demonstrou eficácia clínica no tratamento do distúrbio inflamatório do intestino, doença de Crohn (Baert et ai, Gastroenterology 116:22-28 (1999)).

O documento n2 US 22002037934 descreve o tratamento de hepatite pela administração de um anticorpo anti-TNFa, tal como in inflixi- mab.

A patente n- US 6.428.787 enuncia o tratamento de doenças neurológicas e associadas a TNF com anticorpos anti-TNFa, incluindo infli- ximab, CDP571 e D2E7.

D2E7 (adalimumab), um anticorpo monoclonal humano anti- TNFa (Abbott), foi desenvolvido para tratar artrite reumatóide e doença de Crohn (documento n2 WO 9729131). Celltech está desenvolvendo CDP571 (documento n2 EP 0626389), um anticorpo de lgG4 monoclonal anti-TNFa humanizado, para tratar doença de Crohn, e CDP870, um fragmento de anti- corpo monoclonal anti-TNFa humanizado, para tratar artrite reumatóide. A administração local dos ditos anticorpos está descrita no documento n2 US 20033185826.

Muitos anticorpos de cadeia única (scFv's) foram gerados con- tra uma série de antígenos diferentes, particularmente porque eles podem ser selecionados facilmente quanto a uma alta capacidade de ligação, usan- do técnicas tais como, por exemplo, apresentação de fagos ou apresentação de ribossomas. Além disso, podem ser produzidos anticorpos scFv podem em sistemas microbianos, que estão associados com menores custos em comparação com a produção de anticorpos terapêuticos de comprimento inteiro.

Além de aplicações convencionais extracelulares e in vitro, os ScFv1S têm sido usados também exitosamente para aplicações intracelulares (Wõrn et ai, JBC 28;275(4):2795-2803 (2000); Auf der Maur et ai, JBC 22;277(47):45075-45085 (2002); Stocks, M.R., Drug Discovery Today 15;9(22):960-966 (2004)); assim sendo, foram desenvolvidos scFv's direcio- nados contra antígenos intracelulares. Geralmente, a expressão intracelular de scFv's funcional está limitada por sua instabilidade, insolubilidade, e ten- dência a formar agregados. Por esta razão, sistemas de triagem in vivo para anticorpos scFv's, que são particularmente solúveis e estáveis sob condi- ções redutoras típicas para o ambiente intracelular (por exemplo, núcleo, citoplasma), foram desenvolvidos exitosamente usando uma assim denomi- nada triagem por "Controle de Qualidade" (documento n2 WO 03097697). Além disso, essas estruturas apresentam níveis de expressão convencionais e melhores propriedades de estabilidade e solubilidade também sob condi- ções naturais oxidantes no ambiente extracelular. Assim sendo, proprieda- des biofísicas e bioquímicas favoráveis se traduzem em altos volumes de produção favoráveis e permitem que esses fragmentos de anticorpos, uma vez direcionados contra antígenos específicos, sejam aplicados localmente e/ou por via sistêmica como terapias protéicas em áreas terapêuticas espe- cíficas. Como os anticorpos scFv e fragmentos Fab, em contraste com anti- corpos de comprimento inteiro, carecem da parte Fc que é reconhecida pelo receptor de Fc de monócitos, tais como, por exemplo, células exterminado- ras naturais, eles não evocam citotoxicidade mediada por células, dependen- te de anticorpos (ADCC), e assim sendo, não provocam toxicidade inespecí- fica devido à ligação a receptores de Fc em células não-alvo.

Assim sendo, há uma necessidade de se obter novas formas e- ficazes de anticorpos para o tratamento de distúrbios associados a TNFa, tais como artrite reumatóide, particularmente tratamentos que podem pro- porcionar terapia prolongada controlada por administração local com um bai- xo grau de efeitos colaterais. A presente invenção fornece anticorpos, com- posições e métodos para o tratamento eficaz e contínuo de processos infla- matórios de artrite e outros distúrbios ou mecanismos patofisiológicos medi- ados por TNFa, particularmente várias formas de dor. Todas publicações e referências aqui citadas são aqui incorpo- radas como referência em sua totalidade.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Assim sendo, é um objetivo geral da invenção fornecer um anti- corpo ou derivado de anticorpo estável e solúvel, que se liga especificamen- te a TNFa in vivo. Em uma modalidade preferida, o dito derivado de anticor- po é um anticorpo scFv ou um fragmento Fab.

Agora, para implementar estes e ainda outros objetos da inven- ção, que tornar-se-ão mais facilmente evidentes à medida que a descrição prossegue, o dito anticorpo ou derivado de anticorpo se manifesta pelas ca- racterísticas que ele compreende um domínio variável de cadeia leve ou é derivado da seqüência SEQ ID NO: 1 que é combinada com um domínio variável de cadeia pesada sendo ou não derivado da seqüência SEQ ID NO: 2, onde no caso de uma seqüência derivada, a dita seqüência tem no máxi- mo até 5 mudanças dentro da estrutura do dito domínio VL (variável leve) e/ou no máximo até 9 mudanças dentro da estrutura do dito VH (variável pesado).

Uma modalidade preferida da presente invenção é o dito anti- corpo ou derivado de anticorpo, onde uma ou mais mudanças de aminoáci- dos são introduzidas em qualquer uma das posições selecionadas no grupo das posições 4, 46, 65, 67, 70 e 83 do domínio VL, e/ou em uma ou mais das posições selecionadas no grupo das posições 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 e 112 do domínio VH. Mais preferivelmente, pelo menos uma das conversões leva a um aminoácido presente em SEQ ID NO: 3 para VL e/ou SEQ ID NO: 4 para VH, e ainda mais preferivelmente, no máximo 13 conversões no total estão presentes.

Mais preferivelmente, a dito anticorpo ou derivado de anticorpo compreende um domínio VL da seqüência SEQ ID NO: 1 e/ou um domínio VH da seqüência ou derivado da seqüência SEQ ID NO: 2, ou um domínio VL da seqüência SEQ ID NO: 11 e um domínio VH da seqüência SEQ ID NO: 4. Caso o domínio VH do anticorpo da presente invenção compreenda um domínio VL de SEQ ID NO: 1, em uma modalidade preferida, a seqüên- cia VH é derivada de SEQ ID NO: 2, de tal modo que a fenilalanina na posi- ção 68 seja mudada para alanina, leucina, isoleucina, ou valina. Mudanças adicionais dentro de VH são opcionais. Os anticorpos scFv deste tipo estão fornecidos em SEO ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, o dito an- ticorpo ou derivado de anticorpo é derivado do anticorpo com a seqüência VL de SEQ ID NO: 1 e a seqüência VH de SEQ ID NO: 2 e compreende pelo menos um resíduo de aminoácido que é convertido, em pelo menos uma das CDRs, em um resíduo presente na CDR correspondente da seqüência VL de SEQ ID NO: 5 e/ou da seqüência VH de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade mais preferida da presente invenção, no dito anticorpo ou derivado de anticorpo pelo menos uma das CDRs do grupo CDR2 de VL, CDR3 de VL, CDR2 de VH ou CDR3 de VH é convertida na CDR correspon- dente da seqüência VL de SEQ ID NO: 5 e/ou da seqüência VH de SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 6.

Mais preferivelmente, o dito anticorpo ou derivado de anticorpo compreende as seguintes combinações de seqüências VL/VH:

SEQ ID NO: 7 de VUSEQ ID NO: 2 de VH,

SEQ ID NO: 8 de VUSEQ ID NO: 2 de VH,

SEQ ID NO: 1 de VUSEQ ID NO: 9 de VH,

SEQ ID NO: 1 de VUSEQ ID NO: 25 de VH,

SEQ ID NO: 1 de VUSEQ ID NO: 28 de VH,

SEQ ID NO: 1 de VUSEQ ID NO: 29 de VH,

SEQ ID NO: 26 de VUSEQ ID NO: 30 de VH,

SEQ ID NO: 27 de VUSEQ ID NO: 30 de VH.

Em outra modalidade preferida, o anticorpo ou derivado de anti- corpo da presente invenção tem especificidade para TNFa humano. De pre- ferência, a ligação do antígeno se distingue por uma Kd =100 nM ou menos.

Mais preferivelmente, é um anticorpo com uma Kd 10 nM ou menos, e mais preferivelmente ainda, é um anticorpo com uma Kd 1 nM ou menos.

Os derivados de anticorpos de acordo com a presente invenção são, por exemplo, fusões de Fc's, fusões de toxinas, fusões a atividades en- zimáticas, diferentes formatos tais como anticorpos, diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única, fragmentos de anticorpos biespecíficos, particularmente fragmentos scFv e Fab.

Outro objeto preferido da presente invenção é um anticorpo scFv cujos domínio VL e VH estão ligados por um ligante, de preferência em um arranjo de seqüências VL-ligante-VH. Mais preferivelmente, o dito ligante tem a seqüência SEQ ID NO: 10.

Outro objeto preferido da presente invenção é um anticorpo scFv derivado de SEQ ID NO: 40 (TB-A). Esse anticorpo pode ser obtido por mutagênese, e compreende três ou menos mutações na estrutura, na CDR e/ou nas seqüências ligantes. De preferência, o anticorpo tem a seqüência SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, ou SEQ ID NO: 38.

Outro objeto preferido da presente invenção é o fragmento Fab que compreende um domínio VL que é fundido à região constante de uma cadeia kapa de Ig humana, e um domínio VH que é fundido ao domínio CH1 de IgG humana, com o que dois polipeptídeos de fusão estão ligados por uma ponte dissulfeto entre cadeias.

Em ainda outro aspecto, o anticorpo ou derivado de anticorpo, por exemplo, o fragmento de anticorpo da presente invenção é marcado ou quimicamente modificado.

A presente invenção fornece também uma seqüência de DNA que codifica qualquer um dos anticorpos ou derivados de anticorpos da pre- sente invenção, bem como um vetor de clonagem ou de expressão que con- tém a dita seqüência de DNA. Além disso, fornece-se uma célula hospedeira apropriada transformada com a dita seqüência de DNA, que de preferência é uma célula de E. coli, de levedura ou de mamífero.

Além disso, fornece-se um método para a produção dos anti- corpos ou derivados de anticorpos da presente invenção, compreendendo cultivar a célula hospedeira transformada com o DNA que codifica qualquer um dos ditos anticorpos ou derivados de anticorpos, sob condições que permitem a síntese do dito anticorpo ou derivado de anticorpo, e recuperar a dita molécula a partir da dita cultura. De preferência, o dito método fornece um anticorpo scFv ou fragmento Fab purificado a partir de E. coli.

Outro aspecto da presente invenção é o uso dos anticorpos ou derivados de anticorpos fornecidos pela presente invenção como uma ferra- menta diagnostica para diagnósticos in vitro, e/ou como um produto farma- cêutico. Este uso é particularmente preferido no contexto de qualquer condi- ção relacionada a TNFoc.

A presente invenção engloba também uma composição que compreende um anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, a dita composição a ser usada como um medicamento para o tra- tamento de doenças associadas a TNFa.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma prepa- ração combinada que compreende um anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção, de preferência com um segundo composto que não é um anticorpo ou derivado de anticorpo específico para TNFa.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, o vetor que compreende a seqüência de DNA que codifica um anticorpo scFv da presen- te invenção é usado para terapia gênica.

O tratamento de doenças associadas a TNFa é realizado blo- queando TNFa devido a uma forte interação de TNFa com o anticorpo ou derivado de anticorpo. De preferência, visa-se um tratamento de doenças auto-imunes, condições agudas ou crônicas de inflamação, doenças relacio- nadas a câncer, dor, distúrbios neurológicas e neurodegenerativas, doenças infecciosas e doenças cardiovasculares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção será mais bem entendida e os objetos diferentes da- queles enunciados acima tornar-se-ão evidentes ao se considerar a sua descrição detalhada que se segue. Esta descrição faz referência aos dese- nhos anexos, onde: A Figura 1 ilustra um esquema dos anticorpos scFv com as se- qüências de TB-A e TB-B delimitando a faixa das variações mais freqüentes. Os asteriscos designam as posições nas quais mudanças de aminoácidos na estrutura dos anticorpos da presente invenção são toleradas. Os aminoá- cidos indicados embaixo das CDRs (estando as CDRs enfatizadas com um fundo cinza) podem ser usados nas respectivas CDRs;

A Figura 2 ilustra um esquema exemplificativo para a expressão de um fragmento Fab;

A Figura 3 ilustra o rendimento da produção de scFv's quando expressados em E. coli. (A) Eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida de proteínas expressadas. (B) Filtração analítica em gel de TB-A e TB-wt, ilus- trando a excelente solubilidade de TB-A;

A Figura 4 ilustra uma compração da afinidade de diferentes an- ticorpos scFv por TNFa1 determinada por ELISA;

A Figura 5 ilustra a inibição da citotoxicidade induzida por TNFa humano em fibroblastos L929 do camundongo. (A) Inibição dependente da concentração de TB-A em comparação com TB-wt e infliximab com valores de CI5O- (B) Comparação de derivados de TB-A para bloquear a citotoxicida- de induzida por TNFa. (C) Comparação de formatos scFv e Fab de TB-A.

A Figura 6 ilustra o efeito do tratamento com anticorpo do in- chaço das articulações induzido por TNFa humano no rato (Experimento: 5.3, Experimento 1).

A Figura 7 ilustra o esquema de pontuações para pontuação de inflamação histopatológica.

A Figura 8 ilustra o efeito do tratamento com anticorpo sobre a inflamação de articulações induzida por TNFa humano no rato Experimento 5.3, Experimento 1).

A Figura 9 ilustra o efeito do tratamento com anticorpo sobre o inchaço de articulações induzido por TNFa humano no rato Experimento 5.3, Experimento 2).

A Figura 10 ilustra o efeito do tratamento com anticorpo sobre a inflamação de articulações induzida por TNFa humano no rato Experimento 5.3, Experimento 2).

A Figura 11 ilustra a estabilidade de TB-A em diferentes fluidos corporais.

MODOS PARA CONDUZIR A INVENÇÃO

Descobriu-se que os anticorpos ou derivados de anticorpos que compreendem as estruturas identificadas na assim denominada triagem com "controle de qualidade" (documento n2 WO 0148017) distinguem-se por uma estabilidade e/ou solubilidade geralmente alta, e assim sendo, podem ser úteis também no contexto de aplicações extraceIulares tais como a neutrali- zação de TNFoc. A presente invenção fornece anticorpos ou derivados de anticorpos distinguidos por maior estabilidade e solubilidade, que reconhe- cem e se ligam especificamente a TNFa, e assim sendo, são apropriados para bloquear a função de TNFa in vivo. Os ditos anticorpos ou derivados de anticorpos distinguem-se por uma estrutura especial derivada a partir de tri- agem com "controle de qualidade" para anticorpos com estruturas particu- larmente estáveis e solúveis independentemente do seu sítio de ligação a antígeno que foi descrito no documento n2 EP 1479694. Caso as estruturas usadas na triagem sejam estruturas de anticorpos humanos, elas podem ser consideradas como estruturas não-imunogênicas para aplicações humanas. As CDRs dos anticorpos da presente invenção são idênticas ou derivadas das CDRs do anticorpo monoclonal murino Di62 (Dõring et ai, 1994) que se liga especificamente ao TNFa humano com uma alta afinidade (Kd = 0,4 nM) e pode bloquear a ligação de TNFa ao seu receptor. Além disso, Di62 inibe a citotoxicidade induzido por TNFa humano em células L929 do camundon- go. A etapa óbvia de enxertar CDRs do anticorpo do camundongo na estru- tura do aceptor humano aparentemente mais apropriado com propriedades indefinidas de ligação de antígeno, a dita estrutura tendo a seqüência de VL SEQ ID NO: 5 e a seqüência de VH SEQ ID NO: 6, as ditas seqüências sen- do ligadas por um Iigante (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 10), resultou em um anti- corpo scFv da seqüência

DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKRLIYSA FNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQG TKLEVRRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVS CTASGYSFTHYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTL TRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3 + SEQ ID NO: 10 + SEQ ID NO: 4) o dito anticorpo sendo denominado TB-B. TB-B deu bons rendimentos na expressão de proteínas (Figura 3a), mas foi incapaz de se ligar especificamente a TNFa (Figura 4a).

Assim sendo, para obter um anticorpo ou derivado de anticorpo que é (i) suficientemente específico para se ligar a TNFa, (ii) suficientemente solúvel para permitir a produção e purificação eficientes e para bloquear TNFa in vivo, (iii) suficientemente estável para ser útil como um produto far- macêutico sem sofrer uma degradação rápida, e (iv) suficientemente não- imunogênico, buscou-se um compromisso entre a melhor solubilidade e as melhores características de ligação a antígenos, variando a estrutura e as CDRs. A presente invenção fornece um seqüência para VL e VH que é oti- mizada para combinação dos critérios (i-iv). Um anticorpo scFv que compre- ende o dito VL (SEQ ID NO: 1 ligada por um Iigante (GGGGS)4 ao dito VH (SEQ ID NO: 2) é denominado TB-A. A seqüência de TB-A é fornecida por SEQ ID NO: 40. Este anticorpo é ainda razoavelmente estável e solúvel para da rendimentos satisfatórios quando expressado e purificado a partir de E. coli (Figura 3A), e ele não se agrega (Figura 3B). Suas características de ligação a TNFa são excelentes, com uma Kd 0,8 nM.

A presente invenção descreve também seqüências de VL e VH derivadas da seqüência presente em TB-A de várias maneiras. Primeiramen- te, mutações pontuais em até cinco posições na estrutura de VL e/ou em até nove posições na estrutura de VH demonstraram ser aceitáveis, especial- mente as mutações pontuais que tornam as estruturas mais semelhantes a TB-B, isto é, mais semelhante a SEQ ID NO: 3 para VL ou SEQ ID NO: 4 para VH. Um anticorpo scFv qe compreende um domínio VL com a seqüên- cia SEQ ID NO: 11 e um domínio VH com a seqüência SEQ ID NO: 4, Iiga- das pelo Iigante (GGGGS)4, é denominado TB-B R46L porque ele difere de TB-B apenas na posição 46 de VL. Em contraste com TB-B, este anticorpo ainda tem boas propriedades de ligação a TNFa (Kd = 100 nM). Isto sugere que o número de mudanças em TB-B R46L em relação a TB-A representa aproximadamente o limite superior para mudanças na estrutura do domínio variável.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, apenas mutações pontuais singulares ou duplas são introduzidas nas estruturas de VL e/ou VH de TB-A. Os resíduos preferidos das estruturas para mutações são nas posições 4, 46, 65, 67, 70 e/ou 83 para VL, e nas posições 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 e/ou 112 para VH. As posições são numeradas de acordo com a numeração nas listagens de seqüências. As substituições de aminoácidos são, de preferência, "conservativas", ou de tal modo que os aminoácidos substituintes sejam mais similares ou de prefe- rência mesmo idênticos aos aminoácidos correspondentes presentes na se- qüência de TB-B. Por exemplo, A76 de VH em TB-A pode ser mudado para I76 como ele está presente em TB-B, mas ele pode ser trocado também por outro aminoácido com uma cadeia lateral similar, isto é, uma cadeia lateral apoiar, tal como V ou L. Este é um exemplo de uma substituição "conserva- tiva" de aminoácido. As famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadei- as laterais similares apropriadas para substituições "conservativas", como aqui utilizadas, foram definidas nessas técnicas, incluindo cadeias laterais básicas (K, R, H), cadeias laterais ácidas (D, E), cadeias laterais polares sem carga (Q, N, S1 Τ, Y, C), cadeias laterais apolares (G, A, V, L, I, P, F, M, W), cadeias laterais ramificadas em beta (Τ, V, I) e cadeias laterais aromáti- cas (Y, F, W, H). Uma mudança conservativa preferida é aquela de VL na posição 83, pelo fato de que V é mudada para F (SEQ ID NO 26) ou para A (SEQ ID NO: 27). Entretanto, em SEQ ID NO: 32, uma mudança não- conservativa em VL é V83E, que é combinada com uma mudança em C- DR1, isto é, N31 D, e em VH com V79A. Outra variante extraordinária de TB- A é aquela de SEQ ID NO: 33, com uma troca conservativa de F68L em VH ligada a VL por um Iigante que porta um R na posição 2, substituindo G.

As trocas de aminoácidos singulares mais preferidas são R65S ou Y67L em VL e K43Q ou F68 por V, L ou A em VH. As mudanças duplas muito mais preferidas são F70L/L72R ou A76I/S77G em VH. Os anticorpos scFv que compreendem seqüências de TB-A com as ditas alterações apre- sentam inibição da toxicidade induzida por TNFa em células L929. Os resul- tados de algumas delas estão indicados na Figura 5B. Suas seqüências são as seguintes:

SEQ ID NO: 18 = TB-A H_K43Q (TB-A H43)

SEQ ID NO: 19 = TB-A H_F68V (TB-A H68)

SEQ ID NO: 20 = TB-A H_F70L/L72R (TB-A H70/72)

SEQ ID NO: 21 = TB-A H_A76I/S77G (TB-A H 76/77)

SEQ ID NO: 22 = TB-A L_46R (TB-A L46)

SEQ ID NO: 23 = TB-A L_R65S (TB-A L65)

SEQ ID NO: 24 = TB-A L_Y67S (TB-A L67)

Em uma modalidade preferida, qualquer um dos domínios VH supramencionados pode ser combinado com qualquer um dos domínios VL supramencionados.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, os domí- nios VL e VH de TB-A e TB-B são embaralhados, de tal modo que o domínio VL de TB-A (SEQ ID NO: 1) seja combinado com o domínio VH de TB-B (SEQ ID NO: 4), ou o domínio VL de TB-B (SEQ ID NO: 4) é combinado com o domínio VH de TB-A (SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade muito mais pre- ferida, as versões embaralhadas obtidas em um scFv estão ligadas com o Iigante (GGGGS)4 da seqüência SEQ ID NO: 10, resultando nos anticorpos scFv TB-AB (SEQ ID NO: 12) ou TB-BA (SEQ ID NO: 13), respectivamente. O dito Iigante (GGGGS)4 pode ter uma troca de aminoácidos de uma glicina por um aminoácido mais hidrofílico, isto é, polar ou mesmo carregado, que pode tornar o anticorpo mais solúvel. Dentre estas variações, aquela com a seqüência GRGGS-(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 39) é preferida.

Está também dentro do âmbito da presente invenção combinar os domínios VL ou VH de seqüências semelhantes a TB-B com os domínios VH ou VL de seqüências semelhantes a TB-A, onde semelhante a TB-B/TB- A significa que as seqüências são mais iguais a uma do que à outra.

Em ainda outra modalidade preferida da presente invenção, um ou mais aminoácidos são mudados nas regiões CDR das seqüências de VL e/ou VH de TB-A para eqüivaler aos aminoácidos correspondentes presen- tes nas seqüências selecionadas SEQ ID NO: 5 de VL e/ou SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 25 de VH. São mais preferidas as mudanças em uma das CDRs de VL (CDR2 de VL ou CDR3 de VL) e/ou das CDRs de VH (CDR2 ou CDR3), sendo que as mudanças mais preferidas levam às seqüências de VL SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 e/ou às seqüências de VH SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 9, respectivamente.

Em outra modalidade preferida da presente invenção, as se- qüências de VL SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27 são combinadas com a seqüência de VH SEQ ID NO: 30. Em ainda outra modalidade preferida da presente invenção, a seqüência de VL SEQ ID NO: 1 é combinada com as seqüências de VH SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29.

Geralmente, qualquer uma das seqüências de VL descritas po- de ser combinada com qualquer uma das seqüências de VH descritas.

Os objetos da presente invenção são anticorpos e fragmentos de anticorpos, particularmente polipeptídeos VL ou VH, anticorpos de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fab. No caso de anticorpos scFv, um domínio VL selecionado pode ser ligado a um domínio VH selecionado na orientação por um Iigante flexível. Um Iigante apropriado do estado da técnica consiste em seqüências de aminoácidos GGGGS repetidas ou suas variantes. Em uma modalidade preferida da presente invenção, usa-se um Iigante (GGGGS)4 com a seqüência SEQ ID NO: 10 ou seu derivado SEQ ID NO: 39, mas as variantes com 1 a 3 repetições também são possíveis (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993)). Outros Iigantes que podem ser usados na presente invenção estão descritos por Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731 (2001); Choi et al. Eur. J. Immunol. 31:94-106 (2001); Hu et ai, CancerRes. 56:3055-3061 (1996); Kipriyanov et ai, J. Mol. Biol. 293:41-56 (1999); e Roovers et al., Câncer Immunol. Immunother. 50:51-59 (2001). O arranjo pode ser VL-Iigante-VH ou VH-ligante-VL, sendo preferida a primeira orientação.

No caso de fragmentos Fab, os domínios variáveis com cadeia leve VL selecionados são fundidos à região constante de uma cadeia kapa de Ig humana, enquanto que os domínios variáveis com cadeia pesada VH apropriados são fundidos ao primeiro domínio constante (terminal N) CH1 de uma IgG humana. Em uma modalidade exemplificativa da presente inven- ção, o domínio Ck humano tem a seqüência SEQ ID NO: 14 e o domínio CH1 usado para construir os fragmentos Fab tem a seqüência SEQ ID NO: 15. A Figura 2 ilustra um exemplo de um fragmento Fab no qual os domínios VL e VH de TB-A são usados de tal modo que o domínio VL esteja ligado diretamente ao domínio constante kapa humano, resultando na seqüência DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSA FNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWVDNAL QSGNSQESVTEEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 14) e o domínio VH está fun- dido ao primeiro domínio constante (CH1), resultando na seqüência QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAAPGKGLEW MGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTA VYYCAR ERGDAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFSEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCTS (SEQ ID NO: 2 + SEQ ID NO: 15).

No terminal C, uma ponte dissulfeto entre cadeias é formada entre os dois domínios constantes.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ter afinidades por TNFa humano com constantes de dissociação em uma faixa entre 0,8-10.000 nM. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a Kd é < 10 nM. A afinidade de um anticorpo por um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando um método apropriado (Ber- zofsky et ai, "Antibody-Antigen Interactions", em "Fundamental Immuno- logy", Paul, W.E., editor, Raven Press, New York, NY (1992); Ruby, J., "Im- munology", W.H. Freeman and Company, New York, NY), e os métodos lá descritos.

Em um aspecto da presente invenção, os anticorpos ou deriva- dos de anticorpos, especialmente os fragmentos scFv ou Fab, são marca- dos. A marcação detectável de um anticorpo ou derivado de anticorpo espe- cífico de TNFa pode ser realizada ligando-o a uma enzima para uso em um imunoensaio de enzima (EIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), que são métodos bem conhecidos pelos versados nessas técnicas (por exemplo, "Current Protocols in Immunology", Coligan et al., editores, John Wiley & Sons, 2005).

Marcando de forma radioativa os anticorpos ou derivados de anticorpos específicos de TNFa, é possível detectar TNFa através do uso de rádio-imunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Work et al., "Laboratory Techni- ques and Biochemistry in Molecular Biology", North Holland Publishing Com- pany, NY (1978). O radioisótopo pode ser detectado pelo uso de um conta- dor gama ou um contador de cintilação ou por auto-radiografia. Os isótopos particularmente úteis são 3H, 131I, 35S, 14C, e de preferência, 125I.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser marcados também com compostos fluorescentes de marcação, tais como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, alofi- cocianina, o-ftaldeído e fluorescamina, ou com compostos quimiolumines- centes tais como luminol, éster teromático de acridínio, sal de imidazol- acridínio e éster oxalato.

Os protocolos de marcação e detecção são bem conhecidos pelos versados nessas técnicas. Por exemplo, eles estão disponíveis em "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. 1 (Harlow, E. e Lane, D., 1998).

Os anticorpos ou derivados de anticorpos marcados da presen- te invenção são úteis para propósitos diagnósticos, particularmente a detec- ção de TNFa em uma amostra biológica removida de um paciente. Qualquer amostra que contém TNFa pode ser usada, como por exemplo, fluidos bio- lógicos tais como sangue, soro, linfa, urina, exsudato inflamatório, líquido cerebroespinhal, líquido amniótico, extrato ou homogeneizado tecidual, e similares, ou espécimes histológicos para detecção in situ. Preparações Farmacêuticas

Definições:

O termo "formulação farmacêutica" refere-se a preparações que estão em uma forma tal que permite a atividade biológica do anticorpo ou derivado de anticorpo seja inequivocamente eficaz, e que não contêm quais- quer componentes adicionais que são tóxicos para os indivíduos aos quais a formulação seria administrada. Excipientes (veículos, diluentes) "farmaceuti- camente aceitáveis" são aqueles que podem ser administrados razoavel- mente a um indivíduo mamífero para fornecer uma dose eficaz do ingredien- te ativo a ser empregado.

Uma formulação "estável" é uma na qual o anticorpo ou derivado de anticorpo dentro dela retém essencialmente sua estabilidade física e/ou sua estabilidade química e/ou atividade biológica depois da estocagem. Vá- rias técnicas analíticas para medir a estabilidade de proteínas estão disponí- veis nessas técnicas e estão revisadas em "Peptide and Protein Drug Deli- very", 247-301, Vincent Lee, editor, Mareei Dekker, Inc., New York, NY1 edi- tora (1991); e Jones, A., Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993), por e- xemplo. A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. De preferência, a formulação é está- vel à temperatura ambiente (cerca de 30°C) ou a 40°C por pelo menos 1 mês e/ou estável a cerca de 2-8 °C por pelo menos 1 ano ou pelo menos 2 anos. Além disso, a formulação é, de preferência, estável após congelamen- to (até, por exemplo, -70°C) e descongelamento da formulação.

Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém sua estabilidade física" em uma formulação farmacêutica, caso ele não apresente quaisquer sinais de agregação, precipitação e/ou desnaturação após exame visual de cor e/ou limpidez, ou como medida por dispersão de luz UV ou por cromato- grafia por exclusão de tamanho.

Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém sua estabilidade química" em uma formulação farmacêutica, caso a estabilidade química em um dado tempo seja tal que a proteína seja considerada como ainda retendo sua atividade biológica, como definido abaixo. As estabilidade química pode ser avaliada detectando e quantificando formas quimicamente alteradas da proteína. A alteração química pode envolver modificação de tamanho (por exemplo, recorte) que pode ser avaliada usando SDS-PAGE e/ou espectro- metria de massas por ionização/tempo de vôo e dessorção a laser auxiliada com matriz (MS MALDI/TOF), por exemplo. Outros tipos de alterações quí- micas incluem alteração de carga elétrica (por exemplo, ocorrendo como resultado de desamidação) que pode ser avaliada por cromatografia por tro- ca iônica, por exemplo.

Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém sua atividade bio- lógica" em uma formulação farmacêutica, caso a atividade biológica do anti- corpo em um dado tempo fique dentro de cerca de 10% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica apresentada na hora em que a formulação farmacêutica foi preparada, determinada em m ensaio de ligação de antíge- no, por exemplo. Outros ensaios de "atividade biológica" para anticorpos estão elaborados abaixo neste relatório descritivo.

O termo "isotônica" significa que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. As for- mulações isotônicas devem ter geralmente uma pressão osmótica entre cer- ca de 250 e 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida usando um osmô- metro do tipo pressão de vapor ou congelamento em gelo, por exemplo.

Um "poliol" é uma substância com múltiplos grupos hidroxila, e inclui açúcares (açúcares redutores e não-redutores), álcoois de açúcares e ácidos de açúcares. Os polióis preferidos neste caso têm um peso molecular menor do que cerca de 600 kD (por exmeplo, na faixa entre cerca de 120 e cerca de 400 kD). Um "açúcar redutor" é um que contém um grupo hemiace- tal que pode reduzir íons metálicos ou reagir de forma covalente com Iisina ou outros grupos amínicos em proteínas, e um "açúcar não-redutor" é um que não tem estas propriedades de um açúcar redutor. Os exemplos de a- çúcares redutores são frutose, manose, maltose, lactose, arabinose, xilose, ribose, ramnose, galactose e glicose. Os açúcares não-redutores incluem sacarose, trealose, sorbose, melezitose e rafinose. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol e glicerina são exemplos de álcoois de açúcares. Quanto aos ácidos de açúcares, eles incluem L-gliconato e seus sais metálicos. Quando for desejado que a formulação seja estável após congelamen- to/descongelamento, o poliol é, de preferência, um que não cristalize nas temperaturas de congelamento (por exemplo, -20°C), de tal modo que ele desestabilize o anticorpo na formulação. Os açúcares não-redutores tais como sacarose e trealose são os polióis preferidos neste caso, sendo que a trealose é preferida em detrimento de sacarose por causa da estabilidade excelente em solução da trealose.

Como aqui utilizado, o termo "tampão" refere-se a uma solução tamponada que resiste a mudanças no pH pela ação dos seus componentes conjugados ácidos/básicos. O tampão desta invenção tem um pH na faixa entre cerca de 4,5 e cerca de 6,; de preferência, entre cerca de 4,8 e cerca de 5,5; e mais preferivelmente, tem um pH de cerca de 5,0. Os exemplos de tampões que controlarão o pH nesta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (tal como succinato de sódio), gliconato, histidi- na, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos. Quando uma formulação estável após congelamento/descongelamento for desejada, o tampão não é de preferência fosfato.

Em um sentido farmacológico, no contexto da presente inven- ção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um anticorpo ou derivado de anticorpo refere-se a uma quantidade eficaz na prevenção ou tratamento de um distúrbio para cujo tratamento o anticorpo ou derivado de anticorpo é eficaz. Uma "doença/distúrbio é qualquer condição que se beneficiará do tratamento com o anticorpo ou derivado de anticorpo. Isto inclui distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.

Um "conservante" é um composto que pode ser incluído na formulação para reduzir essencialmente a ação bacteriana nela, possibilitando assim a pro- dução de uma formulação para múltiplos usos, por exemplo. Os exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de octadecil-dimetil-benzil- amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos de alquil-benzil-dimetil-amônio na qual os grupos alquila são com- postos de cadeia longa), e cloreto de benzetônio. Outros tipos de conservan- tes incluem álcoois aromáticos, tais como fenol, álcool butílico e benzílico, alquil-parabens tais como metil- ou propil-parabeno, catecol, resorcinol, ci- clo-hexanol, 3-pentanol, e m-cresol. O conservante mais preferido neste ca- so é álcool benzílico.

A presente invenção fornece também composições farmacêuti- cas que compreendem um ou mais anticorpos ou compostos derivados de anticorpos, junto com pelo menos um veículo ou excipiente fisiologicamente aceitável. As composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, uma ou mais entre água, tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), etanol, óleo mineral, óleo vegetal, sulfóxido de dimetila, carboidratos (por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, adjuvantes, polipeptídeos ou aminoácidos tais com glicina, antioxidantes agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa e/ou conservantes. Como assinalado acima, outros in- gredientes ativos podem, porém não necessariamente, ser incluídos nas composições farmacêuticas aqui fornecidas.

Um veículo é uma substância que pode ser associada com um anticorpo ou derivado de anticorpo antes da administração a um paciente, freqüentemente com o propósito de controlar a estabilidade ou biodisponibi- lidade do composto. Os veículos para uso em tais formulações são geral- mente biocompatíveis, e podem ser também biodegradáveis. Os veículos incluem, por exemplo, moléculas monovalentes ou multivalentes tais como albumina sérica (por exemplo, humana ou bovina), albumina do ovo, peptí- deos, polilisina, e polissacarídeos tais como aminodextrano e poliamidoami- nas. Os veículos incluem também materiais de suporte sólidos tais como pérolas e micropartículas que compreendem, por exemplo, polilactato, poli- glicolato, poli(lactídeo-co-glicolídeo), poliacrilato, látex, amido, celulose ou dextrano. Um veículo pode portar os compostos de uma série de maneiras, incluindo ligação covalente (diretamente ou por intermédio de um grupo Ii- gante), interação não-covalente, ou mistura.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer maneira de administração, incluindo, por exemplo, administração tópica, oral, nasal, retal ou parenteral. Em certas modalidades, as composi- ções em uma forma apropriada para uso oral são preferidas. Essas formas incluem, por exemplo, pílulas, comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersáveis, emulsões, cápsulas de gelatina duras ou moles, ou xaropes ou elixires. Em ainda outras modalida- des, as composições aqui fornecidas podem ser formuladas como um liofili- zado. O termo "parenteral", como aqui utilizado, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espi- nhal, intracraniana, intratecal e intraperitoneal, bem como qualquer injeção similar ou técnica de infusão.

As composições pretendidas para uso oral podem ser prepara- das de acordo com qualquer método conhecido para a fabricação de com- posições farmacêuticas e podem conter um ou mais agentes, tais como a- gentes edulcorantes, sabores, agente colorante, e agentes conservantes, para produzir preparações atraentes e palatáveis. Os comprimidos contêm o ingrediente ativo em mistura com excipientes fisiologicamente aceitáveis a- propriados para a fabricação de comprimidos. Tais excipientes incluem, por exemplo, diluentes inertes (por exemplo, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio), agentes granuladores e desintegradores (por exemplo, amido de milho ou ácido algínico), agentes aglutinantes (por exemplo, amido, gelatina ou acácia) e agentes lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco). Os compri- midos podem ser não-revestidos ou eles podem ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointesti- nal, e desta forma, proporcionar uma ação prolongada durante um período mais longo. Por exemplo, um material retardador, tais como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila, podem ser empregados.

As formulações para uso oral podem ser apresentadas também com cápsulas de gelatina duras, onde o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim), ou como cápsulas de gelatina moles, onde o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso (por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva). As suspensões aquosas contêm o anticor- po ou derivado de anticorpo em mistura com excipientes apropriados para a fabricação de suspensões aquosas. Tais excipientes incluem auxiliares de suspensão (por exemplo, carbóxi-metil-celulose sódica, metil-celulose, hi- dróxi-propil-metil-celulose, alginato de sódio, poli(vinil-pirrolidona), goma de tragacanto, e goma de acácia); e agentes dispersantes ou umectantes (por exemplo, fosfatídeos de ocorrência natural tais como lecitina, produtos da condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, tais como estea- rato de polioxietileno, produtos da condensação de óxido de etileno com ál- coois alifáticos de cadeia longa, tais como heptadecaetilenóxi-cetanol, pro- dutos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e hexitol, tais como monooleato de sorbitol com polioxietileno, ou produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais deri- vados de ácidos graxos e anidridos de hexitol tais como monooleato de sor- bitano com polietileno). As suspensões aquosas podem compreender tam- bém um ou mais conservantes, como por exemplo, p-hidróxi-benzoato de etila ou n-propila, um ou mais agentes adoçantes um ou mais sabores, e um ou mais agentes edulcorantes tais como sacarose ou sacarina. Os xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçantes, tais como glicerol, propilenoglicol, sorbitol ou sacarose. Tais formulações podem compreender também um ou mais demulcentes, conservantes, aromatizantes e/ou colo- rantes.

As suspensões oleosas podem ser formuladas colocando os in- gredientes ativos em suspensão em um óleo vegetal (por exemplo, óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco), ou em um óleo mineral tal como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, tal como cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Agentes adoçantes, tais como aqueles enunciados acima, e/ou aromatizan- tes podem ser adicionados para produzir preparações orais palatáveis. Tais suspensões podem ser conservadas pela adição de um antioxidante tal co- mo ácido ascórbico. Os pós e grânulos dispersáveis apropriados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água proporcionam o ingrediente ativo em mistura com um agente dispersante ou umectante, um agente auxi- liar de suspensão e um ou mais conservantes. Os agentes dispersantes ou umectantes e os agentes auxiliares de suspensão são exemplificados pelos já mencionados acima. Excipientes adicionais, por exemplo, sabores e colo- rantes, também podem estar presentes.

As composições farmacêuticas podem estar também na forma de emulsões de óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal (por exemplo, óleo de oliva ou óleo de amendoim), um óleo mineral (por exemplo, parafina líquida), ou uma mistura deles. Os agentes emulsificantes apropria- dos incluem gomas de ocorrência natural (por exemplo, goma de acácia ou goma de tragacanto), fosfatídeos de ocorrência natural (por exemplo, soja, lecitina e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e hexitol), anidridos (por exemplo, monooleato de sorbitano), e produtos da condensa- ção de ésteres parciais derivados de ácidos graxos e hexitol com óxido de etileno (por exemplo, monooleato de sorbitano com polioxietileno). Uma e- mulsão pode compreender também um ou mais adoçantes e/ou sabores.

A composição farmacêutica pode ser preparada como uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril na qual o modulador, de- pendendo do veículo e da concentração usada, está em suspensão ou dis- solvido no veículo. Tal composição pode ser formulada de acordo com as técnicas conhecidas, usando agentes dispersantes, umectantes apropriados e/ou auxiliares de suspensão tais como aqueles mencionados acima. Dentre os veículos e solventes aceitáveis, que podem ser empregados, estão a á- gua, 1,3-butanodiol, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de só- dio. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser empregados como um sol- vente ou meio de suspensão. Com este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado, incluindo monoglicerídeos ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tal como ácido oléico, podem ser usados na pre- paração de composições injetáveis, e adjuvantes tais como anestésicos lo- cais, conservantes e/ou tampões podem ser dissolvidos no veículo. As composições farmacêuticas podem ser formuladas como formulações com liberação prolongada (isto é, uma formulação tal como uma cápsula que efetua a liberação lenta do modulador após a administração). Tais formulações podem ser preparadas geralmente usando tecnologia co- nhecida e administradas, por exemplo, por administração oral, retal ou im- plante subcutâneo, ou por implante no local-alvo desejado. Os veículos para uso nessas formulações são biocompatíveis, e podem ser também biode- gradáveis; de preferência, a formulação proporciona um nível relativamente constante de liberação do modulador. A quantidade de um anticorpo ou deri- vado de anticorpo contida dentro de uma formulação com liberação prolon- gada depende, por exemplo, do local do implante, da taxa e da duração es- perada da liberação e da natureza da doença/distúrbio a ser tratado ou pre- venido.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos aqui fornecidos são administrados geralmente em uma quantidade que atinge uma concentração em um fluido corporal (por exemplo, sangue, plasma, soro, líquido cerebros- pinal, líquido sinovial, linfa, líquido intersticial celular, lágrimas ou urina), que é suficiente para se ligar de forma detectável ao TNFα e prevenir ou inibir doenças/distúrbios associados a TNFα. Uma dose é considerada como sen- do eficaz se ela resulta em benefício discernível para o paciente, como aqui descrito. As doses sistêmicas preferidas ficam na faixa entre cerca de 0,1 mg e cerca de 140 mg por quilograma de peso corporal por dia (cerca de 0,5 mg a cerca de 7 g por paciente por dia), sendo as doses orais cerca de 5-20 vezes mais altas do que as doses intravenosas. A quantidade de anticorpo ou derivado de anticorpo, que pode ser combinada com os materiais veícu- los para produzir uma forma de dosagem unitária, pode variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo específico de administração. As formas de dosagem unitárias devem conter geralmente entre cerca de 1 mg e cerca de 500 mg de um ingrediente ativo.

As composições farmacêuticas podem ser embaladas para tra- tar condições responsivas a um anticorpo ou derivado de anticorpo direcio- nado para TNFα. As composições farmacêuticas embaladas podem incluir um recipiente para conter uma quantidade eficaz de pelo menos um anticor- po ou derivado de anticorpo como aqui descrito e instruções (por exemplo, um rótulo) indicando que a composição contida é para ser usada para tratar uma doença/distúrbio responsivo a um anticorpo ou derivado de anticorpo após administração ao paciente.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser também quimicamente modificados. Os grupos modificadores preferidos são polímeros, por exemplo, um polímero de polialqueno, polial- quenileno, ou polioxialquileno com cadeia linear ou ramificada, opcionalmen- te substituída, ou um polissacarídeo ramificado ou não-ramificado. Tal grupo efetor pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo. Os exemplos especí- ficos de polímeros sintéticos incluem polietilenoglicol (PEG) com cadeia line- ar ou ramificada opcionalmente substituída, polipropilenoglicol, poli(álcool vinílico), ou derivados deles. Os polímeros de ocorrência natural específicos incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados deles. O tama- nho do polímero pode ser variado conforme desejado, mas geralmente deve ficar na faixa de peso molecular entre 500 Da e 50.000 Da. Para aplicação local, quando o anticorpo é projetado para penetrar no tecido, um peso mo- lecular preferido do polímero é de cerca de 5.000 Da. A molécula do políme- ro pode ser afixada ao anticorpo, particularmente à extremidade do terminal C da cadeia pesada do fragmento Fab por intermédio de um peptídeo articu- lador ligado de forma covalente, como descrito no documento n2 WO 0194585. Quanto à anexação de grupamentos PEG, faz-se referência a "Poly(ethyleneglycoi) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applicati- ons", 1992, J. Milton Harris (editor), Plenum Press, New York; e "Bioconjuga- tion Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. As- lam e A. Dent, Grove Publishers, New York.

Preparação da Formulação

Depois da preparação do anticorpo ou derivado de anticorpo, como descrito acima, a formulação farmacêutica que o compreende é prepa- rada. O anticorpo a ser formulado não foi submetido a uma prévia liofiliza- ção, e a formulação de interesse neste caso é uma formulação aquosa. De preferência, o anticorpo ou derivado de anticorpo na formulação é um frag- mento de anticorpo, tal como um scFv. A quantidade terapeuticamente efi- caz do anticorpo, presente na formulação, é determinada levando em consi- deração os volumes desejados da dose e o(s) modo(s) de administração, por exemplo. Entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 50 mg/mL, de preferência entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 25 mg/mL, e mais preferivelmente, en- tre cerca de 2 mg/mL e cerca de 10 mg/mL, é uma concentração exemplifi- cativa do anticorpo na formulação.

É preparada uma formulação aquosa que compreende o anti- corpo ou derivado de anticorpo em uma solução com pH tamponado. O tam- pão desta invenção tem um pH na faixa entre cerca de 4,5 e cerca de 6,0, de preferência entre cerca de 4,8 e cerca de 5,5, e mais preferivelmente, a for- mulação tem um pH de cerca de 5,0. Os exemplos de tampões que controla- rão o pH dentro desta faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (por exemplo, succinato de sódio), gliconato, histidina, citrato e outros tampões ácidos orgânicos. A concentração do tampão pode ficar en- tre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM, de preferência entre cerca de 5 mM e cerca de 30 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da isotonicidade desejada da formulação. O tampão preferido é acetato de sódio (cerca de 10 mM), pH 5,0.

Um poliol que atua como um agente para tonicidade é incluído na formulação. Em modalidades preferidas, a formulação não contém uma quantidade para tonicidade de um sal tal como cloreto de sódio, pois isto pode fazer com que o anticorpo ou derivado de anticorpo precipite e/ou pode resultar na oxidação em pH baixo. Em modalidades preferidas, o poliol é um açúcar não-redutor, tal como sacarose ou trealose. O poliol é adicionado à formulação em uma quantidade que pode variar com relação à isotonicidade desejada da formulação. De preferência, a formulação aquosa é isotônica, em cujo caso as concentrações apropriadas do poliol na formulação ficam na faixa entre cerca de 1% e cerca de 15% p/v, de preferência na faixa entre cerca de 2% e cerca de 10% p/v, por exemplo. Entretanto, formulações hi- pertônicas ou hipotônicas também podem ser apropriadas. A quantidade de poliol adicionada pode se alterar também com relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade mais baixa de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada em comparação com um dissacarí- deo (tal como trealose).

Um tensoativo também é adicionado à formulação do anticorpo ou derivado de anticorpo. Os tensoativos exemplificativos incluem tensoati- vos não-iônicos tais como Polissorbatos (por exmeplo, Polissorbatos 20, 80, etc.) ou Poloxâmeros (por exemplo, Poloxâmero 188). A quantidade de ten- soativo adicionada é tal que ele reduza a agregação do anticorpo/derivado de anticorpo formulado e/ou minimize a formação de particulados na formu- lação e/ou reduza a adsorção. Por exemplo, o tensoativo pode estar presen- te na formulação em uma quantidade entre cerca de 0,001% e cerca de 0,5%, de preferência entre cerca de 0,005% e cerca de 0,2%, e mais preferi- velmente, entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1%.

Em uma modalidade, a formulação contém os agentes identifi- cados acima (isto é, anticorpo ou derivado de anticorpo, tampão, poliol, e tensoativo) e é essencialmente isenta de um ou mais conservantes, tais co- mo álcool benzílico, fenol, m-cresol, cloro-butanol e cloreto de benzetônio. Em outra modalidade, um conservante pode ser incluído na formulação, par- ticularmente quando a formulação é uma formulação para múltiplas doses. A concentração do conservante pode ficar na faixa entre cerca de 0,1 % e cer- ca de 2%, mais preferivelmente entre cerca de 0,5% e cerca de 1%. Um ou mais outros veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente acei- táveis, tais como aqueles descritos em "Remington's Pharmaceutical Scien- ces", 21â edição (2006), Osol, A. (editor), podem ser incluídos na formula- ção, desde que eles não afetem adversamente as características desejadas da formulação. Os veículos, excipientes, ou estabilizadores apropriados são atóxicos para os recebedores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem: tampões adicionais; co-solventes; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes tais como EDTA; complexos metá- licos (por exemplo, complexos Zn/proteína), polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; e/ou contra-íons formadores de sais, tal como sódio. As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isso é realizado facilmente por filtração através de mem- branas de filtração estéreis, antes ou depois da preparação da formulação.

Administração da Formulação

A formulação é administrada a um mamífero que necessita de tratamento com o anticorpo, de preferência um ser humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como uma inje- ção maciça ou por infusão contínua durante um período de tempo, por inje- ção intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra- articular, intra-sinovial, intratecal, por via oral, tópica ou inalação. Em moda- lidades preferidas, a formulação é administrada a um mamífero por adminis- tração intravenosa. Com este propósito, a formulação pode ser injetada u- sando uma seringa ou por intermédio de uma linha IV, por exemplo.

A dosagem apropriada ("quantidade terapeuticamente eficaz") do anticorpo dependerá, por exemplo, da condição a ser tratada, da gravida- de e curso da condição, se o anticorpo é administrado com propósitos pre- ventivos ou terapêuticos, terapia anterior, história clínica do paciente e res- posta ao anticorpo, do tipo de anticorpo usado, e do julgamento do médico atendente. O anticorpo ou derivado de anticorpo é administrado adequada- mente ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos e pode ser administrado ao paciente em qualquer hora a partir do diagnóstico em diante. O anticorpo ou derivado de anticorpo pode ser administrado como o único tratamento ou em conjunto com outros fármacos ou terapias úteis no tratamento da condição em questão.

Como uma proposta geral, a quantidade terapeuticamente efi- caz do anticorpo ou derivado de anticorpo administrada deve ficar na faixa entre cerca de 0,1 e cerca de 50 mg/kg do peso corporal do paciente, seja em uma ou mais administrações, sendo que a faixa típica da quantidade do anticorpo fica entre cerca de 0,3 e cerca de 20 mg/kg, mais preferivelmente entre cerca de 0,3 e cerca de 15 mg/kg, administrada diariamente, por e- xemplo. Entretanto, outros esquemas de dosagem podem ser úteis. A pro- gressão desta terapia é monitorada facilmente por técnicas convencionais. Artigos Fabricados

Em outra modalidade da invenção, fornece-se um artigo fabrica- do que compreende um recipiente que mantém a formulação farmacêutica aquosa da presente invenção e, opcionalmente, fornece instruções para seu uso. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, vidros, frascos e se- ringas. O recipiente pode ser formado a partir de uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. Um recipiente exemplificativo é um frasco de vidro de 3-20 cm3 para uso único. Alternativamente, para uma formulação com múlti- plas doses, o recipiente pode ser um frasco de vidro de 3-100 cm3. O recipi- ente mantém a formulação, e o rótulo sobre ele ou associado com o recipi- ente pode indicar orientações para uso. O artigo fabricado pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso.

Geração dos Anticorpos da Presente Invenção

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser gerados usando técnicas de rotina no campo da genética recom- binante. Conhecendo as seqüências dos polipeptídeos, os DNAc1S que as codificam pode ser gerados por síntese gênica (WWW.qenscript.com). Estes DNAc1S podem ser clonados em vetores plasmídicos apropriados. Uma vez obtido o DNA que codifica um domínio VL e/ou VH, uma mutagênese dire- cionada a sítio, por exemplo, por PCR, usando iniciadores mutagênicos, po- de ser realizada para obter vários derivados. A melhor seqüência "de parti- da" pode ser escolhida dependendo do número de alterações desejado nas seqüência de VL e/ou VH. Uma seqüência preferida é a seqüência de TB-A e seus derivados, por exemplo, seqüências de scFv ou seqüências do peptí- deo de fusão, podem ser escolhidas como modelos para a mutagênese a- cionada por PCR e/ou clonagem.

As técnicas usuais de clonagem e mutagênese bem conhecidas pelos versados nessas técnicas podem ser usadas para anexar ligantes, domínios embaralhados ou fusões de constructos para a produção de frag- mentos Fab. Os protocolos básicos que descrevem os métodos genéricos desta invenção estão descritos em "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (Sambrook & Russell, 3â edição, 2001) e em "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et ai, 1999).

A seqüência de DNA portadora de um gene que codifica um po- lipeptídeo scFv, ou no caso de fragmentos Fab1 que codificam dois genes separados ou um operon bicistrônico, compreendendo dois genes para as fusões VL-Ck e VH-CH1 (Figura 2), são clonados em um vetor de expressão apropriado, de preferência um com um promotor induzível. Deve-se tomar cuidado para que esteja na frente de cada gene um sítio de ligação de ribos- soma (RBS na Figura 2) que assegura a tradução. Deve-se entender que os anticorpos da presente invenção compreendem as seqüências descritas em vez de eles consistirem nelas. Por exemplo, as estratégias de clonagem po- dem requerer que seja produzida um construto a partir da qual um anticorpo com um ou alguns resíduos adicionais na extremidade do terminal N estejam presentes. Especificamente, a metionina derivada do códon de iniciação po- de estar presente na proteína final nos casos em que ela foi clivada depois da tradução. A maioria dos construtos para anticorpos scFv gera uma alani- na adicional na extremidade do terminal N. Em uma modalidade preferida da presente invenção, um vetor de expressão para a expressão periplasmática em E. colié escolhido (Krebber, 1997). O dito vetor compreende um vetor na frente de uma seqüência de sinais clivável. A seqüência codificadora para o peptídeo do anticorpo é então fundida à seqüência de sinais clivável. Isto permite o assestar o polipeptídeo expressado para o periplasma bacteriano, onde a seqüência de sinais é clivada. O anticorpo é então dobrado. No caso dos fragmentos Fab, os peptídeos de fusão VL-Ck e VH-CH1 devem ser li- gados a um sinal de exportação. A ligação S-S covalente é formada nas cis- teínas do terminal C depois que os peptídeos atingiram o periplasma. Caso a expressão citoplasmática de anticorpos seja preferida, os ditos anticorpos usualmente podem ser obtidos com altos rendimentos a partir de corpos de inclusão, que podem ser separados facilmente a partir de outros fragmentos celulares e proteínas. Neste caso, os corpos de inclusão são solubilizados em um agente desnaturador, tal como, por exemplo, cloridrato de guaridina (GndHCI), e depois redobrados por procedimentos de renaturação bem co- nhecidos pelos versados nessas técnicas.

Os plasmídeos que expressam os polipeptídeos de scFv ou Fab são introduzidos em um hospedeiro apropriado, de preferência uma célula bacteriana, de levedura ou de mamífero, mais preferivelmente uma cepa de E. coli apropriada, tal como, por exemplo, JM83, para a expressão periplas- mática de BL21 para expressão em corpos de inclusão. O polipeptídeo pode ser colhido a partir do periplasma ou a partir de corpos de inclusão, e purifi- cado usando técnicas usuais, tais como cromatografia de troca iônica, cro- matografia em fase reversa, cromatografia de afinidade e/ou filtração em gel, conhecidas pelos versados nessas técnicas.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser distinguidos com relação ao rendimento, solubilidade e estabili- dade in vitro. As capacidades de ligação a TNFa, preferência TNFa humano, podem ser testadas in vitro por ELISA ou ressonância de plasmônio superifi- cial (BIACore)1 usando TNFa humano recombinante, como descrito no do- cumento n2 WO 9729131, sendo que este último método permite também determinar a constante da taxa kotf, que deveria ser de preferência menor do que 10"3 s"1. Os valores de Kd < 10 nM são preferidos.

A atividade neutralizadora in vivo de um anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção pode ser estimada usando o ensaio de citotoxicidade em L929. O TNFa humano recombinante exerce um efeito citotóxico contra células de fibroblastos L929 do camundongo cultivadas, de uma maneira dependente da concentração. Esta citotoxicidade induzida por TNFa pode ser inibida por anticorpos neutralizadores de TNFa (Dõring, 1994). Um valor de CI5o preferido correspondente à concentração meia- máxima do inibidor é ≤ 100 mg/mL.

Como TNFα tem um papel patofisiológico comprovado em vá- rias doenças humanas, particularmente distúrbios inflamatórios, distúrbio auto-imunes regulados imunologicamente, infecções causadoras de choque séptico, endotóxico e cardiovascular, doenças neurodegenerativas, e doen- ças malignas. Como TNFα é suspeito de desempenhar um papel relevante para doenças de um número constantemente crescente de doenças huma- nas adicionais, é difícil fornecer uma lista abrangente de indicações que as- segure também uma representação completa do espectro de aplicações clí- nicas para inibidores de TNFa no futuro. Portanto, os anticorpos ou deriva- dos de anticorpos da presente invenção podem ser aplicados para tratar as doenças listadas no catálogo que se segue, que não é considerado como uma lista completa ou excludente. Outras doenças não mencionadas especi- ficamente, que sejam direta ou indiretamente influenciadas por TNFa, tam- bém estão incluídas.

Inflamação Auto-imune ou Crônica

Os estados crônicos e/ou auto-imunes de inflamação em geral, distúrbios inflamatórios regulados imunologicamente em geral, doenças in- flamatórias do sistema nervoso central, que afetam os olhos, articulações, pele, membranas mucosas, sistema nervoso central, trato gastrointestinal, trato urinário ou pulmões, estados de uveíte em geral, retinite, uveíte HLA- B27+, doença de Behcet, síndrome do olho seco, glaucoma, síndrome de Sjõgren, diabetes melito (incluindo neuropatia diabética), resistência à insuli- na, estados de artrite em geral, artrite reumatóide, osteoartrite, artrite reativa e síndrome de Reiter, artrite juvenil, espondilite ancilosante, esclerose múlti- pia, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerose lateral amiotrófi- ca, sarcoidose, glomerulonefrite, doença crônica dos rins, cistite, psoríase (incluindo artrite psoríaca), hidradenite supurativa, paniculite, piodermia gan- grenosa, síndrome SAPHO (sinovite, acne, pustulose, hiperosteose, e osteí- te), acne, síndrome de Sweet, pênfigo, doença de Crohn (incluindo manifes- tações extra-intestinais), colite ulcerativa, asma brônquica, pneumonite de hipersensibilidade, alergias gerais, rinite alérgica, sinusite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fibrose pulmonar, granulomatose de Wegener, síndrome de Kawasaki, arterite de células gigantes, vasculite de Churg-Strauss, poliarterite nodosa, queimaduras, doença de enxerto versus hospedeiro, reações de hospedeiro versus enxerto, episódios de rejeição após transplante de órgão ou medula óssea, estados sistêmicos e locais de vasculite em geral, lúpus eritematoso sistêmico ou discóide, polimiosite e dermatomiosite, esclerodermia, pré-eclampse, pancreatite aguda e crônica, hepatite viral, hepatite alcoólica.

Inflamação Aguda e/ou Prevenção de Inflamação de Dor Pós-cirúrgica ou Pós-traumática

Prevenção de inflamação pós-cirúrgica em geral, cirurgia ocular (por exemplo, catarata (substituição de lente ocular) ou cirurgia de glauco- ma), cirurgia das articulações (incluindo cirurgia artroscópica), cirurgia em estruturas relacionadas a articulações (por exemplo, ligamentos), cirurgia oral e/ou dental, procedimentos cardiovasculares minimamente invasivos (por exemplo, PTCA, aterectomia, colocação de sondas), procedimentos laparoscópicos e/ou endoscópicos intra-abdominais e ginecológicos, proce- dimentos urológicos endoscópicos (por exemplo, cirurgia da próstata, urete- roscopia, cistoscopia, cistite intersticial), inflamação perioperatória (preven- ção) em geral.

Doenças Neurológicas e Neurodegenerativas

Doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Hunting- ton, paralisia de Bell, doença de Creutzfeldt-Jakob. Câncer

Osteólise relacionada a câncer, inflamação relacionada a cân- cer, dor relacionada a câncer, caquexia relacionada a câncer, metástases ósseas. Dor

Formas agudas e crônicas de dor, independentemente se elas são causadas por efeitos centrais ou periféricos de TNFa e se elas são clas- sificadas como inflamatórias, formas nociceptivas ou neuropáticas de dor, ciática, dor do dorso inferior, síndrome do túnel do carpo, síndrome de dor regional complexa (CRPS), gota, neuralgia pós-herpética, fibromialgia, esta- dos de dor local, síndromes de dor crônica devido a tumor metastático, dis- menorréia.

Infecção

Sépsis bacteriana, viral ou fúngica, tuberculose, AIDS. Doença Cardiovascular Ateroselerose, doença de artéria coronária, hipertensão, dislipi- demia, insuficiência cardíaca e insuficiência cardíaca crônica.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o tratamen- to de osteoartrite ou uveíte ou doença inflamatória do intestino, pode ser rea- lizado com os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção.

A presente invenção fornece também uma composição farma- cêutica que compreende uma molécula de anticorpo ou derivado de anticor- po da presente invenção em combinação com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

A composição farmacêutica deve compreender, de preferência, uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da presente invenção, isto é, uma quantidade do dito anticorpo, que é necessária para tratar, me- lhorar ou prevenir a doença ou condição relacionada a TNFoc, ou para apre- sentar um efeito terapêutico ou preventivo detectável. A dose terapeutíca- mente eficaz pode ser estimada em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, usualmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou prima- tas. O modelo animal pode ser usado também para determinar a faixa de concentração e a via de administração apropriadas. Um modelo animal a- propriado para observar um efeito do anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção é um modelo com ratos para monoartrite aguda (Bolon et ai, Vet. Pathol. 41:235-243 (2004). O TNFa humano é injetado por via intra- articular dentro da articulação do joelho de um rato, levando a uma monoar- trite aguda autolimitativa na articulação que recebeu a injeção. A bioativida- de de um anticorpo (ou derivado) anti-TNFa pode ser quantificada pela re- dução do inchaço da articulação do joelho, induzido por TNFoc, ou pela redu- ção dos parâmetros histológicos da inflamação.

Como os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente in- venção são altamente solúveis, as altas concentrações do anticorpo (60 mg/mL ou mais) permitem o uso de pequenos volumes de aplicação.

O anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção pode ser utilizado em qualquer terapia na qual se deseja reduzir o nível de TNFa biológico ativo no corpo humano ou animal. O TNFa pode estar circulando no corpo ou estar presente em um nível indesejavelmente alto localizado em um local específico do corpo. A presente invenção fornece modos para apli- cações sistêmicas, bem como locais, em geral, que incluem, porém sem limi- tações, os seguintes: aplicação peroral, injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra-articular, intravítrea, intradérmica ou intraparenquimato- sa, inalação de aerossol, aplicação tópica sobre a pele, membranas muco- sas ou sobre os olhos, liberação sistêmica ou local por intermédio de mini- bomba implantável, ou liberação local por intermédio de formula- ção/dispositivo implantável para liberação retardada, aplicação tópica sobre superfícies serosas, aplicação intratecal ou intraventricular, aplicação oral em formulações que permitem a liberação controlada dentro do lúmen em partes selecionadas do trato gastrointestinal, liberação localizada dentro de vasos a partir de formulações/dispositivos adequados (por exemplo, son- das), distribuição local para cisto urinário liberação localizada dentro do lú- men (por exemplo, trato biliar, ureter), ou liberação a partir de lentes de con- tato. Uma aplicação preferida é uma local, tal como injeção intra-articular ou aplicação tópica, por exemplo, dentro do olho. Para ambas aplicações prefe- ridas, o anticorpo da presente invenção precisa estar em solução.

A presente invenção revela também o uso do anticorpo ou deri- vado de anticorpo da presente invenção para a produção de um medicamen- to para o tratamento de doenças associadas a TNFα. Neste caso, o anticor- po ou derivado de anticorpo está incluído em uma composição terapêutica. A dita composição é usada como um medicamento, de preferência ara a pre- venção ou terapia de doenças relacionadas a TNFα.

Em outro aspecto, os anticorpos scFv da presente invenção são usados em terapia gênica, particularmente em terapia gênica celular adotiva. Os distúrbios auto-imunes representam respostas imunes inadequadas dire- cionadas em próprio tecido. As células T CD4+ específicas de antígeno e as células dendríticas apresentadoras de antígenos (DCs) são mediadores im- portantes na patogênese de doenças auto-imunes, e assim sendo, são can- didatos ideais para terapia gênica celular adotiva, uma abordagem ex vivo para transferência de genes terapêuticos. Usando células transduzidas de forma retroviral e bioluminescência com luciferase, Tarner et ai, Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 998:512-519 (2003), demonstraram que células T primárias, hibri- domas de células T, e DCs se alojam rapidamente e preferencialmente em sítios de inflamação em modelos animais de esclerose múltipla, artrite e dia- betes. Estas células, transduzidas com vetores retrovirais que acionam a expressão de várias "proteínas reguladoras", tais como interleucinas e scFv anti-TNF, distribuem essas proteínas imunorreguladoras para lesões infla- madas, proporcionando terapia para encefalite auto-imune experimental, artrite induzida por colágeno, e camundongos diabéticos não-obsesos. As estruturas estáveis e solúveis dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção são particularmente apropriadas para a distribuição intra- celular do antígeno, por exemplo, quando o anticorpo ou derivado de anti- corpo é expressado a partir de um transgene transportado por um vetor re- troviral apropriado. A terapia gênica celular adotiva leva à expressão e se- creção localizada do scFv anti-TNFa. Smith et ai (2003) demonstraram que os scFv's derivados de um anticorpo monoclonal neutralizador de TNFa (i) podem neutralizar TNFa in vitro e (ii) mudar o padrão de expressão de cito- cinas em camundongos que sofrem de artrite induzida por colágeno local- mente nas articulações, mas não de forma sistêmica. Alternativamente, a injeção sistêmica ou local direta de vetores apropriados (por exemplo, vírus), que permite a expressão contínua de um anticorpo scFv anti-TNFa, é consi- derada como outra abordagem de terapia gênica possível.

As seqüências da presente invenção são as seguintes:

SEQ XD NO:1 VL Of TB-A

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIY SAFNRYTGVP SRFS GRGYGT DFTLTIS SLQPEDVAVYYCQQDYNS PRT FGQGT KLEVKR

SEQ ID NO:2 VH of TB-A

QVQLVQ S GAEVKKPGASVKVSCTAS GYT FTHYGMNWVRQAPGKGL EWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGD

AMDYWGQGTLVTVSS

SEQ XD NO:3 VL of TB-B

DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK RLIYSAFNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKR SEQ ID NO:4 VH of TB-B

QVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCTAS GY S FTHYGMNWVRQAPGQGL EWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGD AMDYWGQGTLVTVSS

SEQ XD NO:5 VL of FW2.3

DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPK RLIYAGSILQSGVPSRFSGSGSGTE-FTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGT KLEVKR

SEQ XD NO:6 VH of FW2.3

QVQL VQSGAE VKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGL EWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRG TYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:7 VL of TB_L2

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYÀGSILQSGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKR

SEQ ID NO:8 VL of TB_L3

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPK ILIYSAFNR YTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQ YYSLP YMFGQGT KLEVKR

SEQ ID NO:9 VH of TB_H2

QVQLVQS GAE'VKKPG AS VKVS CTAS GYT FTH YGMNWVRQAPGKGL EWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGD AMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 10 Linker

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:11 VL of TB-B R4 6L

DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKR

SEQ ID NO:12 TB-AB

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSÀFNRYTGVPSRFSGRGY-GTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTH YGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS SEQ XD NO:13 TB-BA

DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPK RLIYSAFNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAE VKKPGASVKVSCTASGYT FTH YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVS S

SEQ XD NO:14 Ck of Fab

TVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC

SEQ ID NO:15 CHl Of Fab

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFSEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CTS

SEQ ID- NO : 1-6 VL" of TB-Wt

DIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDWWYQQKPGQSPK MLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGT KLEIKR

SEQ ID NO:17 VH of TB-wt

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGL KWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGD AMDYWGQGT SVTVS S

SEQ ID NOrl8 TB-A H_K43Qr also named TB-A H43

DIVMTQS PS SLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFáGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGÈPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:19 TB-A H_F68V, also named TB-A H68

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLE VKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQL VQSGAE VKKPGASVKVSCTASGYT FTH YGMNW VRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTFSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQL VQSGAE VKKPGASVKVSCTASGYT FTH YGMWWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

Legenda: Of = de Linker = Iigante

Also named = nomeado também

A invenção será mais plenamente entendida fazendo referência aos exemplos que se seguem. Entretanto, eles não devem ser interpretados como Iimitativos do âmbito da invenção. Todas citações de literaturas e pa- tentes são aqui incorporadas como referência.

Experimento 1: Construção de Anticorpos scFv

O material de partida para a geração de anticorpos ou derivados de anticorpos anti-TNFa humano, humanizados, tais como fragmentos de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fab, foi o anticorpo monoclonal murino Di62. As seqüências da região variável da cadeia leve e da cadeia pesada estão descritas em Dõring et ai, Moi Immunol. 31:1059-1067 (1994). As propriedades deste anticorpo monoclonal também estão discutidas na mes- ma publicação. Resumidamente, Di62 se liga especificamente ao TNFa hu- mano de uma maneira dependente da concentração. Ele é um anticorpo de alta afinidade (Kd = 0,4 nM) e pode bloquear a ligação de TNFa ao seu re- ceptor. Além disso, Di62 inibe a citotoxicidade induzida por TNFa humano em células L929 do camundongo.

Baseado na sua seqüência publicada, Di62 foi construído na forma de um derivado de anticorpo de cadeia única (scFv) na orientação VL- ligante-VH, na qual a seqüência do Iigante é constituída de quatro repetições de quatro resíduos de glicina e um de serina (GIy4Ser)4. Neste caso, este scFv é referido como TB-wt, com uma VL de SEQ ID NO: 16 e uma VH de SEQ ID NO: 17.

Para humanizar este derivado de anticorpo com o propósito de (a) torná-lo mais similar às seqüências humanas a fim de minimizar a imu- nogenicidade potencial, e (b) torná-lo mais estável e mais solúvel, as se- qüências da CDR de TB-wt foram enxertadas em estruturas humanas está- veis e solúveis (Auf der Maur et al.,FEBS Lett. 508:407-412 (2001); Auf der Maur et ai, Methods 34:215-224 (2004)). O subgrupo I de VL-kapa e o sub- grupo I de VH humanos foram identificados como a subfamília mais próxima da humana. A estrutura apropriada do aceptor foi escolhida a partir de uma coleção de seqüências de VL e VH humanas, selecionadas quanto às pro- priedades bioquímicas e biofísicas vantajosas, tais como, por exemplo, as propriedades de estabilidade, solubilidade, e expressão (Auf der Maur et al.,FEBS Lett. 508:407-412 (2001); Auf der Maur et ai, Methods 34:215-224 (2004)). O isolamento e as propriedades destas estruturas de anticorpo es- tão descritas nos documentos n- WO 03097697 e EP 1506236. A partir des- ta coleção, uma estrutura de anticorpo de cadeia única com propriedades indefinidas de ligação a antígeno foi identificada com um aceptor apropriado. Este aceptor consiste em um domínio V-kapa I humano (SEQ ID NO: 14) em combinação com um domínio VH I humano (SEQ ID NO: 15). Dentre 81 re- síduos de estruturas VH, TB-wt e FW2.3 têm 55 resíduos idênticos, corres- pondendo a 63% de identidade. Ambos derivados de anticorpos de cadeia única têm comprimentos de CDRs idênticos, além da VH-CDR3, que é mais longa em FW2.3. A composição de aminoácidos dentro dos resíduos de CDRs é diferente para ambos scFv's. Vários métodos para a humanização de domínios variáveis de anticorpos são descritos (Riechmann et a!., Nature 332:323-327 (1998); Padlan, E.A., MoL Immunol. 28:489-498 (1991); Rogus- ka et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:969-973 (1994); Gonzales et ai, Tu- mor Biol. 26:31-43 (2005); Ewert, S. et ai., Methods 34:184-199 (2004). A abordagem mínima, a saber, a transferência conservativa de todas alças de CDRs do camundongo de YB-wt para FW2.3 foi conduzida em primeiro lu- gar. O scFv resultante é referido como TB-B e tem a seqüência de VL SEQ ID NO: 3 e a seqüência de VH SEQ ID NO: 4. As alças de CDRs em TB-wt foram definidas de acordo com o esquema de numeração de Kabat (Kabat et AL., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5â Edição (1991), National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) e confinam os seguintes resíduos (vide Figura 1): VL

CDR1: L24-L34 (mesma numeração Kabat) CDR2: L50-L56 (mesma numeração Kabat) CDR3: L89-L97 (mesma numeração Kabat) VH CDR1: Η31-Η35 (mesma numeração Kabat) CDR2: H50-H66 (mesma numeração Kabat) CDR3: H99-H106 (mesma numeração Kabat)

Este anticorpo foi incapaz de se ligar a TNFa eficientemente (Fi- gura 4â). A próxima etapa foi determinar qual resíduo ou quais resíduos en- tre estes componentes devem ser substituídos para otimizar as propriedades do anticorpo humanizado resultante.

Como a substituição de resíduos de aminoácidos humanos por outros aminoácidos deve ser minimizada porque a introdução de seqüências de aminoácidos estranhas aumenta o risco de imunogenicidade do anticorpo ou derivado de anticorpo em humanos (Gonzales etal., Tumor Biol. 26:31-43 (2005)), várias variantes foram construídas. Uma das ditas variantes - aqui referida como TB-B L46 (VL SEQ ID NO: 11; VH SEQ ID NO: 4) - foi cons- truída com a meta de minimizar o risco de ser imunogênica, mas ainda apre- sentando atividade de ligação suficiente. Esta variante baseia-se em TB-B e contém uma única mudança de aminoácido na posição 46 em VL, a saber R->L. Este aminoácido fica localizado dentro do núcleo superior da cadeia leve e faz parte da interface dimérica. Ele está envolvido na definição da conformação de L-CDR1 e tem uma influência sobre o empacotamento de VH/VL. Relatou-se que um resíduo de Ieucina é favorecido nesta posição específica (documento n2 PCT/US03/19333). Em contraste com TB-B, o scFv L46 retém alguma ligação de TNFa (Figura 4A; Kd = 100 nM).

Para melhorar ainda mais a atividade de ligação a TNFa, uma ou mais trocas adicionais foram feitas em um ou mais dos resíduos de VL 4, 46, 65, 67, 70 e/ou dos resíduos de VH 28, 43, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77. Neste caso, a variante com mudanças em todas posições é referido como TB-A (VL SEQ ID NO: 1; VH SEQ ID NO: 2).

Além disso, quanto aos anticorpos anti-TNFa específicos da presente invenção, ensaios de competição com peptídeos derivados de L- CDR1 e L-CDR2 indicaram que ambas alças de CDRs são importantes para a ligação do scFv ao antígeno (Dôring et ai, Mol. Immunol. 31:1059-1067 (1994)). Em outros experimentos que visavam a minimizar o número de resíduos não-humanos necessários para reter a ligação e a otimizar as pro- priedades biofísicas (estabilidade e solubilidade), aplicou-se mutagênese sistemática e embaralhamento de domínios, permitindo elucidar as diferen- ças funcionais entre os domínios VL e VH murinos e humanizados.

Duas variantes foram obtidas pelo embaralhamento de domí- nios. A primeira variante é composta do domínio VL de TB-A ligado por in- termédio de um Iigante de glicina serina (SEQ ID NO: 10) com o domínio VH de TB-B1 resultando em TB-AB (SEQ ID NO: 12). A segunda variante, TB- BA, é o inverso da primeira variante, a saber, o domínio VL de TB-B em combinação com o domínio VH de TB-A (SEQ ID NO: 13).

Variantes adicionais foram geradas por mutagênese sistemática de TB-A. A Figura 1 ilustra uma comparação de seqüências das seqüências de VL e VH de TB-A e TB-B. Um total de 14 resíduos de estruturas difere entre TB-A e TB-B (asteriscos). Apenas cinco deles, resíduos de VL 4 e 70, e os resíduos de VH 28, 71 e 73 apresentam apenas diferenças mínimas em tamanho e propriedade, e portanto, não foram considerados para mutagêne- se neste ponto. As seguintes posições nas estruturas foram trocadas pelo aminoácido correspondente de TB-B. Estes mutantes singulares e duplos de TB-A são os seguintes:

TB-A H43 K->Q interface (SEQ ID NO: 18)

TB-A H68 F—>V alça externa VH (SEQ ID NO: 19)

TB-A H70/72 F->L, L->R alça externa VH (SEQ ID NO: 20)

TB-A H76/77A—>l, S->G alça externa VH (SEQ ID NO: 21)

TB-A L46 L->R interface (SEQ ID NO: 22)

TB-A L65 R—>S alça externa VL (SEQ ID NO: 23)

TB-A L67 Y->S alça externa VL (SEQ ID NO: 24)

Muitos fatores podem influenciar a imunogenicidade de um anti- corpo ou derivado de anticorpo (Gonzales et al, Tumor Biol. 26:31-43 (2005)). Para reduzir ainda mais o teor não-humano das regiões variáveis do scFv de TB-A humanizado, as alças de CDR2 e CDR3 murinas de VL e a alça de CDR2 murina de VH foram trocadas pelas alças de CDRs humanas correspondentes de FW2.3. Os constructos resultantes neste caso são refe- ridos como TB_L2 (SEQ ID NO: 7), TB_L3 (SEQ ID NO: 8), e TB_H2 (SEQ ID NO: 9), respectivamente.

Os DNAc's que codificam a versão de cadeia única murina do anticorpo monoclonal Di62, e as duas versões humanizadas TB-B e TB-A, foram geradas por síntese gênica (www.qenscript.cm). Todas mutações pon- tuais nas outras variantes (TB-B L46, TB-A H43, TB-A H67, TB-A H69/71, TB-A H75/76, TB-A L46, TB-A L65, TB-A L67, TB-A V83F, TB-A V83A, TB-A D66G) foram introduzidas por mutagênese direcionada a sódios acionada por PCR, após procedimentos de clonagem usuais. A troca das alças de CDRs murinas de TB-A pelas alças de CDRs humanas de FW2.3 foi realiza- da usando PCR procedimentos de clonagem do estado da arte. O DNAc que codifica todas as variações de VH TB-A, como descritas em SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30, foram realizadas por síntese gênica com- pleta.

Alguns outros TB-A preferidos estão descritos em SEQ ID NO: 31 a SEQ ID NO: 38. Estes anticorpos demonstraram ser particularmente estáveis e solúveis, como indicado abaixo na Tabela I.

Todos os fragmentos scFv foram clonados em um vetor de ex- pressão para a produção periplasmática em E. coli (Krebber et al., J. Immu- nol. MethodsZO-IttSS (1997)).

Além dos derivados de anticorpos de cadeia única (scFv's) des- critos acima, os fragmentos Fab correspondentes foram gerados como se segue. Os domínios variáveis de cadeia leve (VL) selecionados foram fundi- dos à região constante de uma cadeia kapa de Ig humana, enquanto que os domínios variáveis de cadeia pesada (VH) apropriados foram fundidos ao primeiro domínio constante (CH1) (terminal N) de uma IgG humana. Ambos domínios constantes humanos foram ampliados por PCR a partir de uma biblioteca de DNAc do baço humano e resultou na seqüência SEQ ID NO: 14 para CKe SEQ ID NO: 15 para CH1.

Experimento 2: Expressão, Produção e Estabilidade de Anticorpos scFv ou Fab Humanizados Os plasmídeos que codificam TB-wt, seus derivados humaniza- dos, ou fragmentos Fab foram introduzidos em uma cepa de E. coli apropri- ada (por exemplo, JM83) para expressão periplasmática. As variantes de scFv também foram expressadas como corpos de inclusão, por exemplo, na cepa BL21 de E. coli. Os anticorpos de cadeia única funcionais foram obti- dos por redobra de corpos de inclusão e subseqüente purificação, por e- xemplo, por filtração em gel.

Os rendimentos da expressão após a expressão periplasmática dos scFv's ficaram na faixa entre 0,5 mg até 12 mg por litro de cultura sob condições de cultura laboratoriais usuais (meio dYT, com aproximadamente 3 horas de tempo de indução a 30 0C, vascolejando a 200 rpm) com frascos de vascolejamento convencionais. Geralmente, observou-se que, conforme esperado a partir de análise anterior das estruturas selecionadas quanto à estabilidade e solubilidade (Auf der Maur et ai, Methods 34:215-224 (2004)), quanto mais parecida a seqüência de um derivado humanizado for com a seqüência da estrutura do aceptor (FW2.3), mais alto é o rendimento obtido após a expressão em bactérias. Por exemplo, o rendimento obtido a partir de TB-B é muito melhor do que aquele obtido a partir da expressão de TB-A. De acordo com estas descobertas, reduzir o número de resíduos de aminoáci- dos diferentes presentes em TB-A teve um efeito positivo sobre os rendi- mentos da expressão (Figura 3A).

Outra característica importante dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção é sua solubilidade. A Figura 3B ilustra a superioridade da estrutura TB-A sobre a estrutura do doador (TB-wt) em termos de solubilidade em solução salina tamponada com fosfato. Na filtra- ção em gel analítica, TB-A migra predominantemente em um estado mono- mérico (pico em 70 mL), enquanto que TB-wt apresente uma forte tendência a formar agregados (pico em 50 mL). Além disso, a solubilidade máxima de TB-A e certos derivados dele foi avaliada por precipitação em PEG (Athat, D.H. et al., JBC 256(23): 12108-12117 (1981). Resumidamente, a solubilida- de aparente de proteínas em teste foi medida na presença de polietilenogli- col 3000 (PEG 3000). As curvas de solubilidade foram determinadas medin- do a concentração de proteína no sobrenadante de misturas de proteí- na/PEG300 centrifugadas. Todas curvas apresentaram uma dependência linear de Iog S (mg/mL) em concentração de PEG 3000 (%, p/v). A solubili- dade máxima (Smax) de uma proteína em teste foi estimada por extrapolação da regressão linear até 0% de PEG (Tabela I). Para TB-A1 a Smax foi calcula- da como sendo 70 mg/mL. Todas proteínas em teste apresentaram solubili- dade excepcionalmente boa. Em uma segunda abordagem, foi aplicado um método denominado cromatografia de auto-interação (SIC) para avaliar a atração e a repulsão intermolecular de TB-A (SEQ ID NO: 40), TB-A Ligante _G2R H_F68L (SEQ ID NO: 33), TB-A H_K43R/F68I (SEQ ID NO: 34) e TB- A H_F68L (SEQ ID NO: 35) em uma concentração de 1 mg/mL em PBS (fos- fato 50 mm, pH 6,5, NaCI 150 mM). Neste método, a proteína de interesse é imobilizada sobre uma fase estacionária porosa e recheada em uma coluna. As interações entre a proteína livre (fase móvel) e imobilizada são detecta- das como deslocamentos no volume de retenção. O segundo coeficiente de vírion osmótico da proteína, B22, que é uma medida da atração/repulsão in- termolecular, foi calculado de acordo com Tessier, P.M. et al., Biophys. J. 82:1620-1632 (2002) (Tabela I). Quanto mais positivo o B22, mais baixa é a atração intermolecular da proteína em teste, e portanto, mais alta é a sua solubilidade. Devido à alta similaridade das seqüências das proteínas em teste, presumiu-se que os valores de B22 das diferentes proteínas podem ser comparados diretamente entre si.

Tabela I

<table>table see original document page 49</column></row><table> Ainda outra característica relevante dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção é sua alta estabilidade. A estabilidade de proteínas de TB-A, TB-A H_M48LF681 (SEQ ID NO: 31), TB-A Ligante _G2R H_F68L (SEQ ID NO: 33), TB-A H_K43R/F68I (SEQ ID NO: 34) e TB- A H_F68L (SEQ ID NO: 35) foi avaliado determinando a temperatura para o início da desdobra por dicroísmo circular e dispersão da luz a 218 e 292 nm (Tabela II). Neste experimento, TB-A iniciou a desdobrar em uma temperatu- ra de 53 0C, enquanto que seus derivados TB-A H_M48LF681 (SEQ ID NO: 31), TB-A Ligante _G2R H_F68L (SEQ ID NO: 33), TB-A H_K43R/F68I (SEQ ID NO: 34) e TB-A H_F68L (SEQ ID NO: 35) apresentaram estabilidade tér- mica aumentada (56 e 58 0C). Todas proteínas em teste apresentaram des- naturação irreversível e precipitaram depois de desdobrar, tornando impos- sível determinar o ponto mediano de transição em um processo reversível, a desdobra foi induzida com cloridrato de guanidina (GdnHCI), para manter as proteínas desdobradas em solução. Nesta abordagem, as máximas de e- missões de fluorescência foram determinadas por fluorimetria após a desdo- bra. Nesta instalação, TB-A apresentou novamente boa estabilidade com um ponto mediano de transição a 2,07 M de GdnHCI. Em linha com os resulta- dos a partir da desdobra térmica, os derivados TB-A Ligante _G2R H_F68L (SEQ ID NO: 33) e TB-A H_K43R/F68I (SEQ ID NO: 34) apresentaram esta- bilidade aumentada conforme exibida com pontos medianos de transição mais altos, 2,33 e 2,3 M de GdnHCI, respectivamente.

Tabela II

<table>table see original document page 50</column></row><table> A estabilidade de TB-A no soro humano, na urina humana, no líquido corporal vítreo suíno, e no líquido da câmara anterior suína, foi avali- ada medindo a atividade de ligação a TNFa de TB-A depois da incubação por 3 dias a 37 0C no fluido corporal respectivo ou em tampão de ensaio (TBSTM) como um controle positivo. TB-A foi diluído em fluidos corporais até uma concentração final 10 μΜ. Depois do período de incubação, diluições seriais das amostras foram testadas por ELISA para determinar a constante de ligação Kd de TB-A (Figura 11). Quando se compara as amostras de flui- dos corporais com as amostras de TBDTM do controle, um deslocamento da Kd na direção de concentrações mais altas indicaria um decréscimo de pro- teína ativa durante o período de incubação. Nestes experimentos, entretan- to, nenhum deslocamento foi detectável, indicando que a quantidade de TB- A completamente ativo permaneceu constante em cada ensaio com fluido corporal devido a uma alta estabilidade do anticorpo. Experimento 3: Características de Ligação de Derivados de Anticorpos Hu- manizados

As propriedades de ligação de todas variantes de scFv humani- zadas foram testadas por ELISA em TNFa humano recombinante. As cons- tantes de dissociação Kd para todas variantes ficam dentro de uma faixa en- tre 0,8 e mais do que 10.000 nM. Parece existir uma correlação inversa entre o grau de homologia à estrutura do aceptor humano e a afinidade do respec- tivo Iigante (Figura 4A). Contudo, algumas variantes de TB-A que contêm mutações na direção da seqüência de TB-B apresentam níveis de afinidade por TNFa, que são comparáveis àqueles de TB-A. A Figura 4B ilustra dois derivados com melhor rendimento de expressão de TB-A (comparar com Figura 3A) que apresentam afinidades similares a TB-A quando se compara em ELISA.

TB-A representa um bom compromisso entre as opções de ren- dimento da expressão e afinidade. Em termos de afinidade, nenhuma dife- rença significativa entre cadeia única e formato de fragmento Fab e TB-A foi detectável (dados não ilustrados).

A afinidade por TNFa e a cinética de ligação também foram de- terminada para TB-A por ressonância de plasmônio de superfície (BIACore), resultando em uma constante de dissociação Kd = 0,8 nM, uma taxa "off" de koft = 4,4 χ 10"4/s e uma taxa "on" kon = 5 χ 10'5 s"1 M"1. Experimento 4: Ensaio de Citotoxicidade de L929

A função dos anticorpos ou derivados de anticorpos em neutrali- zar TNFa in vivo pode ser testada medindo a inibição da citotoxicidade de TNFa contra fibroblastos L929 do camundongo cultivados ou alternativa- mente contra células de mielossarcoma KYM-1 humano (Tabela III). Os deri- vados scFv humanizados de Di62 apresentam diferentes eficácias no ensaio com L929, como ilustrado na Figura 5B. Alguns derivados de scFv apresen- tam valores de CI5o (concentração inibitória para atingir 50% de inibição) na faixa de 5 ng/mL, enquanto que outros não tiveram qualquer efeito nos en- saios com L929. Os dados de ELISA e os resultados do ensaio com L929 nem sempre se correlacionam. Os dados com KYM-1 e os resultados com L929, entretanto, se correlacionaram muito bem, sendo a única diferença que concentrações muito mais altas de TNF humano recombinante e conse- qüentemente também do antagonista foram necessárias para observar um efeito. KYM-1 foi, portanto, usado principalmente para confirmar os resulta- dos com L929. Para uma comparação direta das proteínas em teste, a po- tência é expressa como um valor relativo normalizado para TB-A (CE50X/CE50TB-A). Em geral, entretanto, os valores de CI5o tornam-se no- vamente mais altos quanto mais a seqüência de um Iigante é semelhante à estrutura do aceptor humano (FW2.3). A Figura 5 compara a potência de diferentes derivados de TB-A para bloquear a citoxicidade induzida por TNFα contra células de fibroblastos do camundongo L929. A absorção a 450 nm se correlaciona com a sobrevivência das células.

TB-A e a IgG anti-hTNFa Infliximab® apresentam um valor de CI50 similar no ensaio com L929, enquanto que a potência de TB-wt para bloquear a citotoxicidade induzida por TNFα humano é significativamente mais baixa (Figura 5A). Quando os derivados de TB-A são comparados com TB-A quanto ao seu potencial para bloquear a citotoxicidade induzida por TNFα, a maioria destes derivados, exceto TB-H43, têm uma eficácia reduzi- da em L929 (Figura 9B).

Tabela III

Propriedades Funcionais de Derivados de TB-A

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Em linha com os dados de ELISA, não há qualquer diferença significativa na capacidade de bloquear a citotoxicidade induzida por TNFα entre scFv e o formato Fab de TB-A (Figura 5C). O valor de CI50 do formato Fab de TB-A fica quase um fator de dois acima do valor de Cl50 do formato scFv de TB-A (Figura 5B), muito provavelmente como resultado da massa molecular mais ata do fragmento Fab.

Experimento 5: Experimentos Animais com Derivados do Anticorpo Anti- TNFα

5.1 Descrição do Experimento

Para testar a eficácia dos derivados de anticorpos da ESBATech (scFv e Fab) na bioatividade de TNFa humano funcionalmente neutralizado- ra em uma situação in vivo, foi usado um modelo de rato recém-publicado para monoartrite. Este modelo foi descrito extensivamente por Bolon e ou- tros (vide Bolon et al., Vet. Pathol. 41:235-243 (2004)). Resumidamente, neste modelo animal de artrite, TNFα humano é injetado por via intra- articular dentro da articulação do joelho de ratos Lewis machos. A injeção de TNFα humano leva a uma monoartrite aguda autolimitativa na articulação do joelho. A artrite pode ser quantificada medindo o inchaço da articulação e a pontuação histológica. Conseqüentemente, a bioatividade dos respectivos antagonistas de TNFα pode ser quantificada pela redução do inchaço da articulação induzido por TNFa e/ou pela redução de parâmetros histológicos da inflamação.

5.2 Materiais e Métodos

Desenho Experimental

Os atuais estudos foram desenhados para examinar o respectivo potencial de um anticorpo scFv representativo e de um anticorpo Fab repre- sentativo da série descrita acima em comparação com o anticorpo comercia- lizado Infliximab (Remicade®) para inibir a bioatividade do TNFa humano em um modelo animal de artrite apropriado. Bolon e outros tinham demons- trado anteriormente que a aplicação intra-articular de 10 microgramas de TNFa humano recombinante dentro da articulação do joelho do rato provoca uma monoartrite aguda autolimitativa que pode ser quantificada por análise macroscópica e microscópica padronizada. Assim sendo, este modelo ani- mal serviu como um sistema ideal para avaliar o efeito terapêutico de deri- vados de anticorpos aplicados localmente. Dois experimentos foram comple- tados em série (Tabelas IV e V). (1) um estudo básico de eficácia para avali- ar o potencial global dos anticorpos para bloquear a monoartrite induzida por TNFa humano; e (2) um estudo de resposta à dose para avaliar a eficácia relativa dos derivados de anticorpos entre si. As citocinas e os derivados de anticorpos foram aplicados uma vez por injeções separadas, como descrito abaixo. A dose de citocina usada baseou-se na publicação de Bolon e ou- tros, enquanto que a faixa das doses dos derivados de anticorpos baseou-se em dados de cultura de células disponíveis e em conjectura criteriosa. Os experimentos foram conduzidos de acordo com as orientações gerais de cuidados com cobaias.

Animais e Criação

Ratos Lewis machos adultos jovens (6-7 semanas de idade e 175-200 g) foram designados aleatoriamente a grupos de tratamento (n = 3/coorte) e alojados de acordo com Bolon et ai, l/et. Pathol. 41:235-243 (2004).

Instilação de Citocina e Anticorpo

As injeções de anestesia e citocina foram realizadas como des- crito por Bolon e outros. Para não exceder um volume total injetado por via intra-articular de 50 microlitros, as citocinas e os derivados de anticorpos foram instilados em duas injeções intra-articulares separadas, com o que os 10 microgramas de TNFa humano recombinante foram injetados em 10 mi- crolitros de solução salina tamponada com fosfato (PBS) esterilizada por filtração, e a respectiva dose do respectivo anticorpo foi injetada em 40 mi- crolitros de solução salina tamponada com fosfato (PBS) esterilizada por filtração. Os animais tratados por via intraperitoneal com Infliximab (Remica- de®) receberam injeção intraperitoneal com os derivados de anticorpos 3 horas antes da injeção intra-articular de TNFa humano. Em todos animais tratados com anticorpo aplicado por via intra-articular, a respectiva dose de anticorpo foi injetada 5 minutos antes da injeção de TNFa humano. Os ani- mais do controle receberam injeção de 10 microlitros de PBS sem TNFa humano.

Infliximab (Remicade® usado nos experimentos foi adquirido em uma farmácia suíça oficial. Os anticorpos scFv e Fab (TB-A) específicos pa- ra TNFa anti-humano, bem como uma estrutura de anticorpo scFv nulo usa- da como anticorpo de controle inespecífico no experimento de resposta à dose, foram expressados em E. coli e purificados por métodos usuais. A contaminação com endotoxinas foi mantida abaixo de 10 UE por miligrama de proteína em todas as preparações porque o componente lipossacarídeo é um indutor potente de TNFa.

O TNFa humano recombinante foi adquirido na PeproTech EC Ltd.

Medição do Diâmetro da Articulação

Momentos antes da injeção do respectivo derivado de anticorpo aplicado por via intraperitoneal ou intra-articular, ou, no caso dos animais de controle, antes da injeção de PBS ou TNFa, o diâmetro da articulação do joelho a receber a injeção foi determinado por meio de um paquímetro- padrão. 48 horas depois da injeção de TNFa (ou PBS nos animais do con- trole) e momentos antes do sacrifício dos animais, o diâmetro da articulação do joelho que recebeu a injeção foi determinado novamente e o inchaço da articulação foi calculado subtraindo o valor da segunda medição do diâmetro do valor da primeira medição do diâmetro (Figuras 6 e 9). Processamento do Tecido

48 horas depois da injeção de TNFa (ou PBS no caso dos ani- mais do controle), os animais foram sacrificados. Na necropsia, os joelhos que receberam a injeção foram separados da pata e da coxa, fixados por imersão em etanol a 70% e prosseguiram para coloração-padrão com hema- toxilina e eosina (HE), como descrito por Bolon e outros. Análise Morfológica

A análise de pontuação histológica para edição da inflamação da articulação foi realizada como descrito por Bolon e outros. Os critérios da pontuação histológica para avaliação da inflamação da articulação foram aplicados de acordo com Bolon e outros (Figuras 7, 8 e 9). 5.3 Resultados

Em um primeiro conjunto de experimentos, um anticorpo scFv ESBATech representativo aplicado por via intra-articular, TB-A1 e o anticorpo Fab ESBATech aplicado por via intra-articular correspondente, foram compa- rados quanto à sua capacidade de bloquear a indução da monoartrite aguda com Infliximab (Remicade®) aplicado por via intra-articular e intraperitoneal, de acordo com a Tabela IV:

Tabela IV

<table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table>

Os resultados obtidos quanto aos efeitos do tratamento sobre a mudança do diâmetro do joelho (como um indicador dos efeitos sobre o in- chaço da articulação induzido por TNFot) estão representados na Figura 6. Todos anticorpos bloquearam completamente o inchaço da articulação indu- zidoporTN Fa.

Para avaliação dos efeitos do tratamento sobre a inflamação da articulação, a pontuação histológica das lâminas de tecido corado com HE foi realizada. A inflamação da articulação foi pontuada pelos seguintes crité- rios (vide Figura 7 para obter exemplos de pontuação representativos):

Pontuação 0: normal

Pontuação 1: Espessamento brando do revestimento sinovial

Pontuação 2: Espessamento do revestimento sinovial e inflamação branda do subrevestimento

Pontuação 3: Espessamento do revestimento sinovial e inflamação modera- da do subrevestimento

Os resultados obtidos quanto aos efeitos do tratamento sobre as pontuações de inflamação histopatológica estão ilustrados na Figura 8.

Foram observados efeitos comparáveis de todos tratamentos sobre as pontuações da inflamação histopatológica.

Em um segundo conjunto de experimentos, a resposta à dose relativa para os derivados de anticorpos avaliados foi comparada. O anticor- po TB-A scFv ESBATech representativo aplicado por via intra-articular e o anticorpo Fab correspondente do Experimento 1 aplicado por via intra- articular foram comparados com Infliximab (Remicade®) aplicado por via intra-articular e intraperitoneal e um anticorpo scFv não-relacionado carente de qualquer atividade de ligação ao TNFα humano em uma faixa de dose mais ampla e diferente, em comparação com o Experimento 1, de acordo com a Tabela V. Tabela V

Esquema de Injeção do Experimento 2

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Os resultados obtidos quanto aos efeitos do tratamento sobre a mudança do diâmetro do joelho (como um indicador dos efeitos sobre o in- chaço da articulação induzido por TNFα estão representados na Figura 9. Os resultados obtidos quanto aos efeitos do tratamento sobre as pontuações de inflamação histopatológica estão ilustrados na Figura 10.

Resumindo, o scFv ESBATech anti-TNFα representativo e o an- ticorpo Fab ESBATech anti-TNFα representativo foram altamente eficientes em bloquear a monoartrite induzida pelo TNFα humano após administração local (intra-articular).

Embora as modalidades atualmente preferidas da invenção te- nham sido ilustradas e descritas, deve-se entender distintamente que a in- venção não está limitada a elas, mas pode ter várias modalidades diferentes e praticadas dentro do âmbito as reivindicações que se seguem. Listagem de Seqüência

<110> ESBATech AG

<120> Anticorpos estáveis e solúveis que inibem TNFaIfa

<130> 12013PC <160> 40

<170> PatentIn versiori 3.3

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Derivativo de TB-B <220>

<221> vl/tb-a <222> (1)..(108)

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 15 10 15

Asd Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asr1 Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105

<210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> artificial

<223> DerivativodeTB-B

<220> <221> <222>

VH/TB-A Cl) ..(117) <400> 2

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu vai Lvs Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cvs Thr Ala Ser Glv Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr vai Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala1Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val ser Ser 115

<210> 3

<211> 108

<212> PRT

<213> human-murine

<220>

<221> VL/TB-B

<222> CD .. (108) <400> 3

Asp Xle vai Leu Thr Gln ser Pro ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

vai Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Tnr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tvr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> human-murine

<220>

<221> VH/TB-B <222> (1)..(117)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala ser Gly Tyr ser Phe Thr His Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr ser Ile Gly Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

vai Thr Val Ser Ser 115

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> human

<220>

<221> VL/FW2.3 <222> (1)..(108)

<400> 5

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Arg Ala ser Gln Gly Ile Arg Asn Glu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Glri Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 5er Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Tyr 85 90 95

Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105

<210> 6 <Z11> 124 <212> PRT <213> human

<220>

<221> VH/FW2.3 <222> Cl)(124)

<400> 6

Gln vai Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Phe Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Asp ser Gly Asp Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Asp Arg vai Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Gly Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 85 90 95

Ala Arg Val Pro Arg Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Trp Asp Tyr Phe Asp 100 105 110

Tyr Trp Glv Gln Gly Thr Leu Val Thr Val ser Ser 115 120

<210> 7 <211> 10B <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> derivative of TB-A <220>

<221> VL/TB_L2

<222> (1) · · (108) <400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle 35 40 45

Tyr Ala Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105

<210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> derived from TB-A <220>

<221> VL/TE_L3

<222> (l)..(108)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr cys Thr Ala ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arq Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp vai Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Tyr 85 90 95

Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105

<210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> a rti fi ci al

<220>

<223> derivative of TB-A <220>

<221> VH/TB_H2

<222> (1)..C117)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

ser vai Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Asp ser Gly Asp Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Asp Arg Phe Thr Phe ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cvs 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asd Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr vai Ser Ser 115

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial linker <220>

<223> artificial IinIcer sequence

<220>

<221> Glycine-Serine Linker <222> Cl)..C20)

<400> 10

Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15

Gly Gly Gly ser 20

<210> 11

<211> 108

<212> PRT

<213> arti fi ci al

<220>

<223> derivative of TB-B

<220>

<221> VL/TB-B R46L <222> Cl)..C108)

<400> 11

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro ser ser Leu ser Ala ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala ser Gln ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val vai Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp vai Ala vai Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu vai Lys Arg 100 105

<210> 12

<211> 245

<212> PRT

<213 > artificial

<220>

<223> scFV human-murine with artificial linker <220>

<221> TB-AB

<222> Cl)..(245)

<223> VL(TB-A)-Iinker-VH(TB-B)

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 . 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Gly Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr vai Ser ser 245

<2Ί0> 13 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> scFv, human-murine with artificial linker <220>

<221> TB-BA

<222> Cl) (245)

<223> VLCtb-b)-Iinker-VH (tb-a)

<400> IB

Asp Ile Val Leu Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

ser vai Lys vai Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190 Lys Asp Arg Phe Thr Phe ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr vai ser ser 245

<210> 14 <211> 106 <212> PRT <213> human

<220>

<221> c-kappa of human Ig <222> CD .. CIO5)

<400> 14

Thr vai Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro ser Asp Glu Gln 1 5 10 15

Leu Lys ser Gly Thr Ala ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln ser 35 40 45

Gly A5n ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60

Tyr ser Leu ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu ser Ser Pro 85 90 95

vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 100 105

<210> 15 <211> 105 <212> PRT <213> human

<220>

<221> CHl of human IgG <222> CD..C105)

<400> 15 Ala 5er Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Ser Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

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Leu ser Ser vai vai Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Thr Ser 100 105

<210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> murine

<220>

<221> VL/TBWt

<222> CD .. ClO8) <400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Met Leu Met 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser ser Val Gln Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 17

<211> 117

<212> PRT

<213> murine

<220>

<221> VH/TBWt <222> (1) .. CH7)

<400> 17

GTn ITe GTn Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60

Lys Glu His Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Phe 65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 18

<211> 245

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> scFV, human-raurine with artificial linker <220>

<221> TB-A H43 <222> (1)..(245)

<223> scFv VL(TB-A)-linker-VH(TB-A K43Q) <400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly

1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 VaT Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arq Tyr Thr Gly VaT Pro ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr vai Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr Val ser Ser 245

<210> 19 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> scFv, human-murine with artificial linker <220>

<221> TB-A H70/72 <222> CD .. (245)

<223> SCFV VL(TB-A)-1inker-VH(TB-A F70L/L72R) <400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser vai Ser Asn Asp 20 25 30

Val vai Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala vai Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu vai Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Val Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr vai Ser Ser 245 <210> 20

<211> 245 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> SCFv1 human-murine with artificial linker <220>

<221> TB-A H/0/72 <222> Cl)..(245)

<22B> scFv VLCTB-A)-Iinker-VHCTB-A F70L/L72R) <400> 20

Asp lie VaT Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val vai Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg GTy Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala vai Tyr Tyr cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

ser vai Lys Val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Leu Ser Arg Glu Thr Ser Ala ser Thr Val Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr vai ser ser 245

<210> 21 <211> 245 <212> PRT <213> arti fi ci al

<220>

<223> scFv, human-murine with artificial linker <220>

<221> TB-A H76/77 <222> CD - . (245)

<223> SCFV VL(TB-A)-IiΠker-VH(TB-A A76I/S77G) <400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp vai Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys -Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Tnr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ile Gly Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser 245

<210> 22 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> scFv, human-murine with artificial linker <220>

<221> TB-A L46

<222> CD . . C245)

<223> SCFV VLCTB-A L46R)-linker-VHCTB-A)

<400> 22

Asp Ile Val Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 50

Val vai Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gln Pro 55 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala IBO 135 140

Ser vai Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Glv Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Phe ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr vai Ser Ser 245

<210> 23

<211> 245

<212> PRT <213> artificial

<220>

<223> scFv, human-murine witb artificial liriker <220>

<221> TB-A L65

<222> (1) .. (245)

<223> SCFv VHCTB-A R65S)-Iinker-VH(TB-A)

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu ser Ala Ser vai Gly

1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala ser Gln Ser vai Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro ser Arg Phe ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser'Ser Leii Gln Pro 65 70 75 80

Glu A5p vai Ala vai Tyr Tyr cys Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Phe ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr vai ser Ser 245

<210> 24 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> scFv, human-murine with artificial linker <220>

<221> TB-A L67

<222> CD..(245)

<223> scFv VL(TB-A Y67S)-Iinker-VH(TB-A)

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala ser vai Gly

1 5 10 15 Asp Arg vai Thr Leu Thr cvs Thr Ala ser Gln Ser vai Ser Asn asd 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys PrD Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Phe ser Leu Glu Thr ser Ala ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp GlyiSSin Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser 245

<210> 25 <211> 117 <212> PRT <213> artificial

<220>

<22E> derived froro TB-A <220>

<221> VH/TB-A D66G <222> (1) . . CU7)

<400> 25

GTn Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr vai ser Ser 115

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> dríved from TB-A <220>

<221> VL/TB-A V83F

<222> Cl)..(108) <400> 26

Asp lie vai Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Tnr Ala ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tvr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105

<210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> arti fici al

<220>

<223> derived from TB-A <220>

<223> vl/tb-a v83a

<222> CD . . C108)

<400> 27

Asp Ile vai Met Thr Gln ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg 100 105

<210> 28 <211> 117 <212> PRT <213> arti fi ci al

<220>

<2z3> derived from tb-a

<220> <221> VH/TB-AH43/70/71/73/77 <222> (1)..(117)

<223> VH of TB-A With K43Q/F70L/S71T/E73D/577G <220>

<221> VH/TB-A Η43/70/71/73/77 <222> (1)..(117)

<223> VH of TB-A with K43Q/F70L/S71T/E73D/S77G <400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ala Gly Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr vai ser ser

115

<210> 29

<211> 117

<212> PRT

<213> arti fi ci al

<220>

<223> derived from TB-A <220>

<221> VH/TB-A H43/70/71 <222> (1) · · (117)

<223> VH of TB-A with K43Q/F70L/S71T <400> 29

Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tvr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

GTy Trp He Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60

Lvs Asp Arg Phe Thr Leti Thr Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr TrD Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr vai ser Ser 115

<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> derived from TB-A <Z20>

<221> VH/TB-A Hll/16/43/66/70/73/77/93/112

<222> Cl) . . (117)

<223> VH of TB-A Wlth V11D/A16GI<43Q/D66G/F70L/S71T/E73D/S77G/V93T/L112S <220>

<221> VH/TB-A Hll/16/43/66/70/73/77/93/112

<222> CD . · CH7)

<223> VH of TB-A With

V11D/A16G/K43Q/D66G/F70L/S71T/E73D/S77G/V93T/L112S

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Asp Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser vai Lys Val Ser cys Thr Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Thr Leu Asp Thr ser Ala Gly Thr Val Tyr 65 70 75 BO

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr ser 100 105 110

vai Thr Val Ser ser 115

<210> 31

<211> 245

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> TB-A H_M48L/FS8I

<222> CD (245}

<223> TB-A with VL of TB-A and VH M48L and F68I linked by SEQ ID NO: 10

<400> 31

Asp Ile vai Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val vai Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp vai Ala vai Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cvs Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 165 170 175 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Ile Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr vai Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr Val ser Ser 245

<210> 32 <211> 245 <212> PRT <213> a rti fi ci al

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> TB-A I_V83E H_V79A

<222> CD . . (245)

<223> TB-A with VL V83E and VH_V79A linked by SEQ ID NO: 10

<400> 32

Asp Ile vai Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val vai Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln vai Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr Val Ser ser 245

<210> 33 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> TB-a Linker_G2R H_f68l <222> Cl)..(245)

<223> TB-A with vl of TB-A and vh_f68l linked by SEQ XD NO:39 <400> 33

Asp Ile Val Met Tnr Gln ser pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser vai Ser Asn Asp 20 25 30

vai Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Glv 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu asρ Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Arg Gly Gly 100 105 110

ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys vai Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Leu Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser 245

<210> 34 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> TB-A H_K43R/F68l

<222> (1) .. (245)

<223> TB-A with VL of TB-A and VH_K34R_F68l linked by SEQ ID NO: 10

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln ser vai ser Asn Asd 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro 5er Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Tnr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Glv Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Pne 180 185 190

Lys Asp Arg Ile Tnr Phe ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr vai Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

vai Thr vai ser Ser 245

<210> 35 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> TB-A H_f:68L <222> CD .. (245) <223> TB-a with VL of TB-a and VH_f68l "linked by SEQ ID NO: 10

<400> 35

Asp Ile Val Met Thr GTn ser Pro Ser ser Leu ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val vai Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu vai Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Leu Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ala ser Thr vai Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

vai Thr vai Ser ser 245 <210> 36

<211> 245

<212> prt

<2Ί3> artificial

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> tb-a h_f68a <222> CD · . (245)

<223> tb-A with VL of tb-A and -VH_f6SA Iinked fay seq ID no: 10 <400> 36

Asp Ile vai Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 15 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

vai Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro ser Arg Phe Ser Glv 50 55 60 '

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp vai Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95

Thr phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu vai Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lvs Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser vai Lys Val ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Ala Thr Phe Ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

Val Thr vai ser Ser 245

<210> 37 <211> 245 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> TB-A H_F68V/F70L <222> Cl) .(245)

<223> TB-A with VL of TB-A and VH_F68V/F70L linked by SEQ XD NO: 10 <400> 37

Asp Ile vai Met Thr Gln ser Pro Ser ser Leu Ser Ala ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro ser Arg Phe ser Gly 50 55 .60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp vai Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu vai Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys vai Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tvr 145 150 155 160 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Xle Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg vai Thr Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

vai Thr Val ser Ser 245

<210> 38 <211> 245 <212> PRT <213> arti fici al

<220>

<223> Derivative of TB-A <220>

<221> TB-A H_F70L

<222> (1)..(245)

<223> TB-A with VL of TB-A and VH_F70L linked by SEQ ID No:10

<400> 38

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala ser Gln-Ser Val ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly. Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 .60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cvs Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 "90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu vai Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 UO Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu Val Gln ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala IBO 135 140

Ser Val Lys Val ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Leu ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240

vai Thr Val ser ser 245

<210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> linker <220>

<221> G2RLinker <222> (1) . . (20)

<400> 39

Gly Arg Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly 1 5 10 15

Gly Gly Gly ser 20

<210> 40 <21i> 245 <212> PRT <213> arti f i ci al

<220>

<223> TB-A scFv antibody <220>

<Ζ21> TB-A

<222> (X)..(245)

<223> ESBAlO5

<400> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser ATa Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gln ser vai Ser Asn Asp 20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Val Ala vai Tyr Tyr cys Gln Gln Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125

Gln Val Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140

Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160

Gly Met Asn Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg Phe Thr Phe ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr vai Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 210 215 220

Legenda:

Derivative of = Derivado de Human-murine = humano-murino Human = humano Derived from = derivar a partir Artificial linker = ligante artificial

Artificial linker sequence = Seqüência de ligante artificial Glycine-serine linker = Ligante serina-glicina

Human-murine with artificial linker = ligante artificial om humano-murino

Linker = ligânte

Of human IG = de Ig humana

Murine = murino

Claims

1. Anticorpo ou derivado de anticorpo estável e solúvel, que se liga especificamente a TNFa1 sendo que o dito anticorpo ou derivado de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve (VL) derivado da seqüência SEQ ID NO: 1 que é combinada com um domínio variável de ca- deia pesada (VH) que é SEQ ID NO: 2 ou derivado dela, onde no caso de uma seqüência derivada, a dita seqüência tem no máximo até 5 mudanças dentro da estrutura do dito domínio VL e/ou no máximo até 9 mudanças den- tro da estrutura do dito domínio VH.

2. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 1, onde as mudanças de VL são em uma ou mais das posições 4, -46, 65, 67, 70 e/ou 83, e as mudanças de VH são em uma das posições 11, -16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 e/ou 112.

3. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 1, onde as mudanças de VL são em uma ou mais das posições 4, -46, 65, 67, 70 e/ou 83, e as mudanças de VH são em uma ou mais das posi- ções 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 e/ou 112.

4. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações precedentes, onde pelo menos uma das con- versões leva a um aminoácido presente em SEQ ID NO: 3 para VL e/ou SEQ ID NO: 4 para VH.

5. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações precedentes, onde o domínio VL compreende a seqüência SEQ ID NO: 1.

6. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 5, compreendendo o domínio VH da seqüência SEQ ID NO: 2.

7. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 5, compreendendo um domínio VH derivado da seqüência SEQ ID NO: 2, onde F68 é mudado para A, L, I ou V.

8. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 1, compreendendo o domínio VL da seqüência SEQ ID NO: 11, e o domínio VH da seqüência SEQ ID NO: 4.

9. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações precedentes, onde pelo menos um resíduo de aminoácido é convertido, em pelo menos uma das CDRs1 em um resíduo presente na CDR correspondente da seqüência de VL SEQ ID NO: 5 e/ou da seqüência de VH SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 25.

10. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 9, onde pelo menos uma das CDRs do grupo VL CDR2, VL C- DR3, VH CDR2 ou VH CDR3 é convertida na CDR correspondente da se- qüência de VL SEQ ID NO: 5 e/ou da seqüência de VH SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 6.

11. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 10, com a seqüência de VL SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, e a seqüência de VH SEQ ID NO: 2.

12. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 10, com a seqüência de VL SEQ ID NO: 1 e a seqüência de VH SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 9, ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29.

13. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com a rei- vindicação 10, com a seqüência de VL SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27 e a seqüência de VH SEQ ID NO: 30.

14. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações precedentes, tendo um especificidade para TNFa humano.

15. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com qual- quer uma das reivindicações precedentes, que é um anticorpo scFv, onde os domínios VL e VH são conectados por um ligante.

16. Anticorpo scFv, de acordo com a reivindicação 15, com- preendendo um arranjo de seqüências VL-ligante-VH.

17. Anticorpo scFv, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, onde o ligante tem a seqüência SEQ ID NO: 10 ou é derivado da dita se- qüência.

18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, onde pelo menos uma G do dito ligante é mudado para um aminoácido mais polar ou carregado.

19. Anticorpo scFv, de acordo com a reivindicação 18, onde o Iigante tem a seqüência SEQ ID NO: 39.

20. Derivado de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, que é um fragmento Fab, onde o domínio VL está fundido à região constante de uma cadeia kapa de Ig humana, o domínio VH está fundido ao domínio CH1 de uma IgG humana, e os dois polipeptídeos de fusão estão ligados por uma ponte dissulfeto entre as cadeias.

21. Anticorpo scFv ou fragmento Fab, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, que é marcado ou quimicamente modificado.

22. Seqüência de DNA que codifica o anticorpo ou derivado de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

23. Vetor de clonagem ou expressão, que contém a seqüência de DNA como definido na reivindicação 22.

24. Célula hospedeira apropriada, transformada com um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 23,

25. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 24, sen- do uma célula procariótica ou eucariótica, particularmente uma célula de E. coli, levedura, planta, inseto ou mamífero.

26. Método para a produção de uma molécula de anticorpo ou derivado de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, compreendendo cultivar a célula hospedeira como definida na reivindi- cação 24 ou 25, sob condições que permitem a síntese da dita molécula de anticorpo e recuperá-la a partir da dita cultura.

27. Anticorpo ou derivado de anticorpo, de acordo com qual- quer um das reivindicações 1 a 21, com um produto farmacêutico.

28. Uso de um anticorpo ou derivado de anticorpo como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, para a produção de um medicamento para o tratamento de doenças associadas a TNFa ou como diagnóstico in vitro para detecção de doenças associadas a TNFoc, particu- larmente osteoartrite, uveíte, doença inflamatória do intestino.

29. Composição diagnostica ou terapêutica, que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente acei- tável.

30. Preparação combinada que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, junto com pelo menos um segundo composto.

31. Preparação combinada, de acordo com a reivindicação 30, onde o segundo composto não é um anticorpo específico para TNFoc.

32. Preparação combinada, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, para uso como um medicamento.

33. Vetor, de acordo com a reivindicação 23, como um produto farmacêutico para aplicações terapêuticas gênicas em seres humanos e/ou em animais.

34. Método para o tratamento de uma doença relacionada a TNFoc, onde um anticorpo ou derivado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 é administrado localmente ou por via tópica.

35. Uso de qualquer uma das seqüências de VL e/ou VH es- pecificadas como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 em um vetor de expressão.

36. Formulação farmacêutica aquosa estável que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou derivado de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, não submetida a uma liofilização prévia, um tampão de acetato com pH entre cerca de 4,8 e cerca de 5,5, um tensoativo e um poliol, onde a formulação não tem uma quantidade de cloreto de sódio capaz de produzir tonicidade.

37. Formulação, de acordo com a reivindicação 36, que é iso- tônica.

38. Formulação, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, que é estável em uma temperatura de cerca de 2-8 0C por pelo menos um ano.

39. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 38, que é estável após congelamento e descongelamento da for- mulação.

40. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 39, que é estável a cerca de 30°C por pelo menos um mês.

41. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 40, onde o poliol é um açúcar não-redutor.

42. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 41, onde o açúcar não-redutor é trealose.

43. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 42, onde o açúcar não-redutor é sacarose.

44. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 43, onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo.

45. Formulação, de acordo com a reivindicação 44, onde o fragmento de anticorpo é scFv.

46. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 45, onde o anticorpo se liga a TNFα.

47. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 46, que é estável em uma temperatura de cerca de 2-8°C por pe- lo menos dois anos.

48. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 47, onde a concentração do anticorpo na formulação é entre cerca de 0,1 e cerca de 50 mg/mL.

49. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 48, onde o tensoativo é Polissorbato.

50. Formulação, de acordo com a reivindicação 45, onde scFv se liga a TNFα.

51. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 36 a 50, onde o acetato está presente em ma quantidade de cerca de 5-30 mM.

52. Formulação, de acordo com a reivindicação 51, onde o a- cetato está presente em uma quantidade de 10-30 mM.

53. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 50 a 52, compreendendo um conservante.

54. Formulação, de acordo com a reivindicação 53, onde o conservante é álcool benzílico.

55. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 50 a 54, onde o anticorpo está presente em uma quantidade de cerca de 30-5 mg/mL.

56. Formulação, de acordo com a reivindicação 55, onde o tampão é acetato de sódio 1030 mM em pH 5, o poliol é trealose em uma quantidade de cerca de 2-10% p/v, o tensoativo é Polissorbato em uma quantidade de cerca de 0,01-0,1% v/v, onde a formulação compreende ainda álcool benzílico como um conservante, e onde a formulação é estável em uma temperatura de cerca de 2-8 0C por pelo menos dois anos.

57. Artigo fabricado que compreende um recipiente que para manter uma formulação farmacêutica aquosa estável que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, não submetida a uma liofilização prévia, um tampão de acetato em pH de cerca de 4,8 a cerca de -5,5, um tensoativo e um poliol, onde a formulação não em uma quantidade de cloreto de sódio capaz de produzir tonicidade.

58. Artigo, de acordo com a reivindicação 57, onde o anticorpo é um anticorpo ou derivado de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.