PT2390267E

PT2390267E - Anticorpos estáveis e solúveis que inibem tnf(alfa)

Info

Publication number: PT2390267E
Application number: PT110029063T
Authority: PT
Inventors: Stefan Ewert; David Urech; Peter Lichtlen; Alcide Barberis; Adrian Auf Der Maur
Original assignee: Esbatech A Novartis Co Llc
Priority date: 2005-06-07
Filing date: 2006-06-06
Publication date: 2013-07-16
Also published as: KR101457223B1; RU2415151C2; NZ563580A; KR20140071450A; US9683034B2; MX2007015280A; US9315572B2; CN105153306A; US20140171634A1; AU2006255415A1; RS52861B; JP5645890B2; EP1891110A2; JP2008545433A; JP2013027390A; CA2609999C; IL187503A0; DK2390267T3; HK1164891A1; EP2390267B1

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ESTÁVEIS E SOLÚVEIS QUE INIBEM TNF(ALFA)"

Campo Técnico A presente invenção está relacionada com anticorpos otimizados e derivados de anticorpo que se ligam ao fator alfa (TNFa) de necrose tumoral, bloqueiando a sua função, e que são úteis para o diagnóstico e/ou tratamento, prevenção ou melhoria de doenças associadas a TNFa; as suas sequências codificantes, produção, e utilização em composições adequadas farmacologicamente.

Arte Antecedente 0 fator alfa de necrose tumoral (TNFa, também conhecido por caquetina), é uma citocina de mamífero que ocorre naturalmente produzida por numerosos tipos de células, incluindo monócitos e macrófagos em resposta a endotoxina ou outros estímulos. 0 TNFa é um mediador importante de reações inflamatórias, imunológicas, e patofisiológicas (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802) . O TNFa solúvel é formado pela divisão de uma proteína transmembranar precursora (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53), e os polipeptídeos segregados com 17 kDa reúnem-se em complexos homotrímeros solúveis (Smith, et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para artigos de revisão sobre TNF, ver Butler, et al. (1986), Nature 320:584; Old (1986), Science 230: 630). Estes complexos ligam-se depois a recetores encontrados numa variedade de células. A ligação produz um conjunto de efeitos pró-inflamatórios, incluindo (i) libertação de outras citocinas pró-inflamatórias tais como interleucina (IL)-6, IL-8, e IL-1, (ii) libertação de metaloproteinases da matriz e (iii) regulação a montante da expressão de moléculas de adesão endoteliais, amplificando ainda mais a cascata imune e 2 inflamatória ao atrair leucócitos para os tecidos extravasculares.

Um grande número de distúrbios está associado a niveis elevados de TNFa, muitos dos quais de importância médica significativa. Foi demonstrado que o TNFa é regulado a montante num número de doenças humanas, incluindo doenças crónicas, tais como artrite reumatóide (AR), distúrbios inflamatórios intestinais incluindo doença de Crohn e colite ulcerosa, sepsia, insuficiência cardíaca congestiva, asma e esclerose múltipla. Ratinhos transgénicos para TNFa humano produzem níveis elevados de TNFa constitutivamente e desenvolvem uma poliartrite espontânea, destrutiva que se parece a AR (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10,4025-4031). O TNFa é, por isso, referido como uma citocina pró-inflamatória .

Agora está bem estabelecido que o TNFa é uma peça chave na patogénese da AR, que é uma doença crónica, progressiva e debilitante caracterizada pela inflamação da articulação poliarticular e destruição, com sintomas sistémicos de febre e mal-estar e fadiga. A AR também conduz a inflamação sinuvial crónica, com progressão frequente à destruição da cartilagem articular e do osso. Níveis aumentados de TNFa são encontrados tanto no fluído sinuvial e como no sangue periférico de pacientes que sofrem de AR. Quando os agentes bloqueadores de TNFa são administrados a pacientes que sofrem de AR, eles reduzem a inflamação, melhoram os sintomas e retardam o dano das articulações (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42 :1204-1208) .

Fisiologicamente, o TNFa também está associado à proteção de infeções particulares (Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28). O TNFa é libertado por macrófagos que foram ativados por lipopolissacarídeos de bactérias Gram-negativas. Como tal, o TNFa parece ser um mediador endógeno de importância fundamental envolvido no desenvolvimento e 3 patogénese de choque endotóxico associado à sepsia bacteriana (Michie, et al. (1989), Br. J.Surg.76: 670-671.; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1981). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. et al. (1989) , Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. et al. (1990) , J. Infect. Dis. 161:982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-176).

Como com outros sistemas de orgãos, também foi demonstrado que o TNFa desempenha um papel fundamental no sistema nervoso central, em particular em distúrbios inflamatórios e autoimunes do sistema nervoso, incluindo esclerose múltipla, sindrome de Guillain-Barre e miastenia grave, e em distúrbios degenerativos do sistema nervoso, incluindo doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington. 0 TNFa também está envolvido em distúrbios de sistemas relacionados da retina e do músculo, incluindo neurite ótica, degeneração macular, retinopatia diabética, dermatomiosite, esclerose lateral amiotrófica, e distrofia muscular, bem como em lesões ao sistema nervoso, incluindo lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal aguda, e acidente vascular cerebral. A hepatite é outro distúrbio inflamatório relacionado com o TNFa que, entre outros despoletantes, pode ser causada por infeções virais, incluindo virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, e virus das hepatites A-E. A hepatite causa inflamação hepática aguda na região portal e lobular, seguido de fibrose e progressão de tumor. O TNFa pode mediar caquexia no cancro, que causa a maioria da morbidez e mortalidade de cancro (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305). O papel fundamental desempenhado por TNFa na inflamação, respostas imunes celulares e na patologia de muitas doenças conduziu à busca por antagonistas do TNFa. 4 0 TNFoí é uma citocina importante cujo bloqueio sistémico acarreta o risco de frequência e severidade aumentadas de infeções manifestadas clinicamente, em particular a re-ativação de tuberculose latente e possivelmente outros riscos, incluindo indução de linfomas, doenças desmielinizantes e insuficiência cardíaca.

Uma classe de antagonistas do TNFoí desenhada para o tratamento de doenças mediadas pelo TNFoí são anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente ao TNFoí e bloqueiam, assim, a sua função. A utilização de anticorpos anti-TNFoí mostrou que um bloqueio de TNFoí pode reverter os efeitos atribuídos a TNFoí, incluindo reduções em IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adesão e destruição do tecido (Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350).

Os anticorpos dirigidos contra o TNFoí têm sido propostos para a profilaxia e tratamento de choque endotóxico (Beutler et al. (1985) Science: 234,470-474). A utilização de anticorpos anti-TNFoí no tratamento de choque sético é discutida por Bodmer et al., 1993, (Criticai Care Medicine, 21:441-446,1993), Wherry et al.,1993, (Criticai Care Medicine, 21: 436-440) e Kirschenbaum et al. , 1998, (Criticai Care Medicine, 26:1625-1626).

Foi revelado no documento US2003147891um método para tratar uma doença neurodegenerativa num humano administrando um anticorpo monoclonal anti-TNFoí ou um fragmento de ligação ao TNFoí do mesmo. O documento WO0149321 ensina a utilização de bloqueadores de TNFoí incluindo anticorpos anti-TNFa para tratar distúrbios neurológicos e distúrbios relacionados causados pelo TNFoí. Providencia um método para tratar os ditos distúrbios administrando um antagonista de TNFoí. O documento W003047510 revela vários tipos de anticorpos monoclonais e fabricados por engenharia genética dirigidos contra TNFoí, a sua produção, compostos que os 5 compreendem e utilização em medicina.

Os anticorpos úteis para terapêuticas de doenças mediadas pelo TNFa são normalmente ou anticorpos monoclonais (mAB) produzidos por tecnologia de hibridoma a partir de uma fonte natural, normalmente um ratinho, ou anticorpos fabricados por engenharia genética. Estes últimos correspondem a anticorpos que ocorrem naturalmente, no sentido que compreendem cadeias leve e pesada de comprimento inteiro, ou aos fragmentos Fab que também podem ser gerados a partir de anticorpos naturais por divisão proteolitica, ou a anticorpos scFv de cadeia simples em que os fragmentos das regiões de cadeia leve e pesada variáveis estão ligados por um linker peptídico.

Ambas, cadeias leve e pesada de um anticorpo, compreendem domínios constantes e variáveis. Como os anticorpos não-humanos são imunogénicos, a quantidade de sequências tipo humanas num anticorpo é, com frequência, aumentada num anticorpo designado "híbrido", que compreende regiões constantes de uma IgG humana, e regiões variáveis que correspondem às sequências de um anticorpo animal, na maioria dos casos anticorpos murinos com a especificidade desejada. Estas regiões variáveis podem ainda ser depois adaptadas para se tornarem mais semelhantes a um anticorpo humano típico por mutagénese, conduzindo a um anticorpo "humanizado". Ainda numa outra abordagem alternativa, apenas as porções de ligação ao antígeno, isto é, as regiões determinantes complementares (CDRs) das regiões variáveis de um anticorpo de ratinho são combinadas com uma estrutura de um anticorpo humano, resultando num anticorpo "CDR-enxertado".

Foram descritos anticorpos monoclonais contra o TNFa na arte antecedente. Meager et al., 1087 (Hybridoma 6:305-311) descrevem anticorpos monoclonais murinos contra TNFa recombinante. Shimamoto et al., 1988(Immunology Letters 17:311-318) descrevem a utilização de anticorpos 6 monoclonais murinos contra TNFa na prevenção de choque endotóxico em ratinhos. 0 documento US591942 revela anticorpos quiméricos anti-TNFa e a sua utilização no tratamento de patologias associadas com a presença de TNFa. A utilização de anticorpos anti-TNFa no tratamento de AR e de doença de Crohn é discutida em Feldman et al. (1998), (Transplantation Proceedings 30:4126-4127), Adorini et al., 1997, (Trends in Immunology Today 18:209-211) e em Feldmann et al., 1997, (Advanced Immunology 64:283-350). Os anticorpos para TNFa utilizados em tais tratamentos são geralmente anticorpos quiméricos, tais como aqueles descritos no documento US5919452. O documento US20003187231 revela anticorpos anti-TNFa humanizados com, pelo menos, uma região CDR não-humana que melhoraram as caracteristicas de ligação. Além disso, no Pedido de Patente Internacional N.° WO 92/11383, são revelados anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos enxertados em CDR, específicos para TNFa. Rankin et al. (1995), (British J. Rheumatology 34:334-342) descrevem a utilização de tais anticorpos enxertados em CDR no tratamento de AR. O documento W09211383 revela um anticorpo enxertado em CDR humanizado recombinante, específico para TNFa, que é derivado do anticorpo monoclonal murino 61E7, hTNFI, hTNF3 ou 101.4, e ensina a produção e utilização de ditos anticorpos no diagnóstico e/ou terapêutica de distúrbios associados com TNFa.

Entre os inibidores específicos de TNFa que se tornaram disponíveis comercialmente apenas recentemente, um anticorpo monoclonal, quimérico ratinho-humano dirigido contra o TNFa (infliximab, Remicade”; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) demonstrou eficácia clínica no tratamento de AR (Elliott et al.1994, Lancet 344:1105-1110; Mani et al. (1998), Arthritis & Rheumatism 41: 1552- 7 1563) . Infliximab também demonstrou eficácia clinica no tratamento de distúrbio inflamatório intestinal e doença de Crohn (Baert et al. 1999, Gastroenterology 116: 22-28.) 0 documento US22002037934 revela o tratamento de hepatite por administração de um anticorpo anti-TNFa, tal como infliximab. 0 documento US6428787 ensina o tratamento de doenças neurológicas e de doenças associadas com o TNFa com anticorpos anti-TNFa incluindo infliximab, CDP571 e D2E7. 0 D2E7 (Adalimumab), um anticorpo monoclonal anti-TNFa humano (Abbott) foi desenvolvido para tratar AR e doença de Crohn (documento W09729131). A Celltech está a desenvolver o CDP571 (EP0626389), um anticorpo IgG4 anti-TNFa monoclonal humanizado para tratar doença de Crohn e o CDP870, um fragmento de anticorpo anti-TNFa monoclonal humanizado para tratar AR. A administração local de ditos anticorpos para o tratamento de distúrbios localizados é revelada no documento US2003185826.

Muitos anticorpos de cadeia simples (scFvs) foram gerados contra uma multiplicidade de antigenos diferentes, em particular porque podem ser facilmente selecionados para elevada capacidade de ligação utilizando técnicas tais como, por exemplo, exibição de fago ou exibição de ribossoma. Além disso, os anticorpos scFv podem ser produzidos em sistemas microbianos que estão associados a custos inferiores comparados com a produção de anticorpos de comprimento inteiro terapêuticos.

Além das aplicações extracelular e in vitro convencionais, os scFvs também têm sido utilizados com sucesso em aplicações intracelulares (Wõrn et al. 2000, JBC, 28; 275 (9) :2795-2803; Auf der Maur et al. 2002, JBC, 22;277(47): 45075-45085; Stocks MR, 2004, Drug Discov Today. 15; 9 (22) :960-966); assim, foram desenvolvidos scFvs dirigidos contra antigenos intracelulares. Em geral, a expressão intracelular de scFvs funcionais está limitada pela sua instabilidade, insolubilidade, e tendência para formarem agregados. Por este motivo, os sistemas de classificação in vivo para anticorpos scFv, que são particularmente solúveis e estáveis em condições redutoras típicas para o ambiente intracelular (por exemplo, núcleo, citoplasma), foram desenvolvidos com sucesso utilizando um designado ecrã de "Controlo da Qualidade" (documento WO0148017; Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224) e levaram à identificação de sequências de estrutura de scFv particularmente estáveis e solúveis para tais fins (documento WO03097697). Além disso, estas estruturas exibem níveis de expressão excecionais e propriedades aumentadas de estabilidade e solubilidade, também em condições naturais, oxidantes no ambiente extracelular. Assim, estas propriedades biofísicas e bioquímicas favoráveis traduzem-se em rendimentos de produção elevados favoráveis e permitem que estes fragmentos de anticorpo, antes dirigidos contra antígenos específicos, sejam aplicados localmente e/ou sistematicamente como terapêutica proteica, em particular áreas terapêuticas. Como ambos anticorpos scFv e fragmentos Fab, em contraste com os anticorpos de comprimento inteiro, carecem da parte Fc que é reconhecida pelo recetor Fc de monócitos, tal como, por exemplo, células exterminadoras naturais, estas não evocam citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC) e, por isso, não provocam toxicidade inespecífica devido à ligação a recetores Fc em células não alvo.

Assim, existe uma necessidade para novas formas eficazes de anticorpos para o tratamento de distúrbios associados com o TNFa, tais como AR, particularmente tratamentos que podem providenciar terapêutica controlada, prolongada pela administração local com um baixo grau de efeitos secundários. A presente invenção providencia anticorpos, composições e métodos para o tratamento eficaz 9 e continuo de processos inflamatórios de artrite e outros distúrbios mediados pelo TNFa ou mecanismos patofisiológicos, em particular várias formas de dor. Revelação da Invenção

Assim, é um objeto geral da invenção providenciar um anticorpo estável e solúvel ou derivado de anticorpo, que se liga especificamente a TNFoí in vitro e in vivo. Numa modalidade preferida, dito derivado de anticorpo é um anticorpo scFv ou fragmento Fab.

Agora, de modo a implementar estes, e ainda outros, objetos da invenção, que se tornarão mais prontamente aparentes à medida que a descrição decorre, dito anticorpo ou derivado de anticorpo é manifestado pelas caracteristicas que compreendem um domínio variável de cadeia leve da SEQ ID N°1 que é combinado com um domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID N°2.

Numa outra modalidade preferida, o anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção tem especificidade por TNFa humano. Preferencialmente, a ligação ao antígeno é caracterizada por um Kd de « 100 nM ou inferior. Mais preferido é um anticorpo com um Kd de 10 nM ou inferior, e o mais preferido de 1 nM e inferior.

Derivados de anticorpos de acordo com a presente invenção são, pr exemplo, fusões Fc, fusões de toxina, fusões a atividades enzimáticas, diferentes formatos, tais como minicorpos, diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de anticorpo biespecíficos, em particular scFv e fragmentos Fab.

Outro objeto preferido da presente invenção é um anticorpo scFv cujos domínios VL e VH estão ligados por um linker, preferencialmente num arranjo de sequência VL-linker-VH. Mais preferencialmente, dito linker tem a sequência SEQ ID N° 10.

Outro objeto preferido da presente invenção é o fragmento Fab que compreende um domínio VL que é fundido 10 com a região constante de uma cadeia kapa Ig humana, e um domínio VH gue é fundido com o domínio CHI de uma IgG humana, em que os dois polipeptídeos de fusão estão ligados por uma ponte dissulfido inter-cadeia.

Ainda num outro aspeto, o anticorpo ou derivado de anticorpo, por exemplo, o fragmento de anticorpo, da presente invenção é marcado ou quimicamente modificado. A presente invenção também providencia uma sequência de ADN que codifica qualquer dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção, bem como um vetor de clonagem ou expressão que contém dita sequência de ADN. Além disso, é providenciada uma célula hospedeira adequada transformada com dita sequência de ADN, que preferencialmente é E. coli, uma levedura ou célula de mamífero.

Além disso, é providenciado um método para a produção dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção, compreendendo cultivar a célula hospedeira transformada com ADN que codifica qualquer de ditos anticorpos ou derivados de anticorpo em condições que permitem a síntese de dito anticorpo ou derivado de anticorpo, e recuperar dita molécula de dita cultura. Preferencialmente, dito método providecia um anticorpo scFv ou fragmento Fab purificado a partir de E. coli.

Outro aspeto da presente invenção é a utilização dos anticorpos ou derivados de anticorpos providenciados pela presente invenção como uma ferramenta de diagnóstico para diagnósticos in vitro, e/ou como um produto farmacêutico. Esta utilização é particularmente preferida no contexto de qualquer condição patológica relacionada com o TNFa. A presente invenção também abrange uma composição que compreende um anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, dita composição para ser utilizada como um medicamento para o tratamento de 11 doenças associadas ao TNFa.

Num aspeto adicional a presente invenção providencia uma preparação de combinação que compreende um anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção, preferencialmente com um segundo composto que não é um anticorpo ou derivado de anticorpo especifico para o TNFa.

Ainda num outro aspeto da presente invenção o vetor que compreende a sequência de ADN que codifica um anticorpo scFv da presente invenção é utilizado para terapêutica génica. 0 tratamento de doenças associadas com o TNFa é conseguido bloqueando o TNFa devido a uma forte interação do TNFa com o anticorpo ou o derivado de anticorpo. Preferencialmente, é contemplado um tratamento de condições de inflamação agudas ou crónicas, autoimunes, doenças relacionadas com cancro, dor, distúrbios neurológicos e neurodegenerativos, doenças infeciosas e doenças cardiovasculares.

Breve descrição dos desenhos A invenção será melhor entendida e os objetos além dos expostos anteriormente tornar-se-ão aparentes quando for dada consideração à seguinte descrição detalhada dos mesmos. Tal descrição faz referência aos desenhos em anexo, em que: A Figura 1 mostra um esquema dos anticorpos scFv com as sequências de TB-A e TB-B a delimitarem o intervalo das variações mais frequentes. Os asteriscos designam posições nas quais alterações de aminoácidos na estrutura dos anticorpos são toleradas. Os aminoácidos indicados por baixo das CDRs (sendo as CDRs enfatizadas com um fundo cinzento) podem ser utilizados nas respetivas CDRs. A Figura 2 mostra um esquema exemplar para a expressão de um fragmento Fab. A Figura 3 mostra o rendimento de produção de scFvs quando expressos em E. coli. A. Eletroforese em gel de SDS- 12 poliacrilamida das proteínas expressas. B. Filtração por gel analítica de TB-A e TB-wt que mostram a solubilidade superior de TB-A. A Figura 4 mostra uma comparação de afinidade de diferentes anticorpos scFv para TNFa determinado por ELISA. A Figura 5 mostra a inibição de citotoxicidade induzida por TNFa humano em fibroblastos L929 de ratinho. A. Inibição dependente de concentração de TB-A em comparação com TB-wt e infliximab com valores IC50. B. Comparação de derivados de TB-A para bloquearem citotoxicidade induzida por TNFa. C. Comparação de formatos scFv e Fab de TB-A. A Figura 6 mostra o efeito do tratamento com anticorpo de inchaço de articulação induzido por TNFa humano em ratazana (Experiência: 5.3., Experiência 1). A Figura 7 mostra o esquema de classificação para classificação de inflamação histopatológica. A Figura 8 mostra o efeito do tratamento com anticorpo na inflamação da articulação induzida por TNFa humano em ratazana (Experiência: 5.3., Experiência 1). A Figura 9 mostra o efeito do tratamento com anticorpo de inchaço de articulação induzido por TNFa humano em ratazana (Experiência: 5.3., Experiência 2). A Figura 10 mostra o efeito do tratamento com anticorpo na inflamação da articulação induzida por TNFa humano em ratazana. (Experiência: 5.3., Experiência 2). A Figura 11 mostra a estabilidade de TB-A em diferentes fluídos corporais.

Modos para realizar a Invenção

Foi observado que os anticorpos ou derivados de anticorpos que compreendem as estruturas identificadas no designado ecrã de "controlo de qualidade" (documento W00148017) são caracterizados por uma geralmente elevada estabilidade e/ou solubilidade e podem, assim, ser também úteis no contexto de aplicações extracelulares tais como neutralizar TNFa. A presente invenção providencia 13 anticorpos ou derivados de anticorpos caracterizados por potenciar a estabilidade e solubilidade que reconhecem especificamente e ligam TNFa e, por isso, são adequados para bloquear a função de TNFa in vivo. Ditos anticorpos ou derivados de anticorpos são caracterizados por uma estrutura especial derivada a partir do ecrã de "controlo de qualidade" para anticorpos com estruturas particularmente estáveis e solúveis independentes do seu local de ligação ao antigeno que foi revelado no documento EP1479694. Se as estruturas utilizadas na classificação são estruturas de anticorpo humano, elas podem ser consideradas como estruturas não imunogénicas para aplicações humanas. As CDRs dos anticorpos da presente invenção são idênticas a, ou derivadas de, CDRs do anticorpo monoclonal murino Di62 (Dõring et al., 1994) que se liga especif icamente ao TNFa humano com uma elevada afinidade (Kd = 0,4 nM) e podem bloquear a ligação do TNFa ao seu recetor. Além disso, Di 62 inibe a citotoxicidade induzida por TNFa humano em células L929 de ratinho. A etapa óbvia de enxertar as CDRs do anticorpo de ratinho na aparentemente melhor adequada estrutura aceitadora humana com propriedades de ligação ao antigeno indefinidas, tendo dita estrutura a sequência VL SEQ ID N° 5 e a sequência VH SEQ ID N°6, estando ditas sequências ligadas por um (GGGGS)4 linker (SEQ ID N°10), resultou num anticorpo scFv da sequência

DIVLTQSPSSLSASVGÒRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKRLIYSAFNRYTG

VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSG

GGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCT ASGY S FTH YGMNWVROAPGQ glewmgwintytgeptyadkfkdrvtltrdtsigtvymeltsltsddtavyycarer GDAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N°:3+SEQ IDN°:10+ SEQ IDn°:4) sendo dito anticorpo scFv designado TB-B. O TB-B produziu bons rendimentos na expressão proteica (Fig. 3a), mas foi incapaz de se ligar especificamente a TNFa (Fig. 4a) .

Assim, para obter um anticorpo ou derivado de 14 anticorpo que é (i) suficientemente especifico para ligar TNFa, (ii) suficientemente solúvel para permitir produção e purificação eficientes e para bloquear TNFa in vivo, (iii) suficientemente estável para ser útil como um produto farmacêutico sem sofrer uma degradação rápida e (iv) suficientemente não imunogénico, foi procurado um compromisso entre a melhor solubilidade e as lhores caracteristicas de ligação ao antigeno variando a estrutura e as CDRs. A presente invenção providencia uma sequência para VL e VH que está otimizada para a combinação dos critérios (i-iv). Um anticorpo scFv que compreende dita VL (SEQ ID N° 1 ligada por um linker (GGGGS)4 a dita VH (SEQ ID N° 2) é designado TB - A. A sequência de TB-A é dada pela SEQ ID N° 40. Este anticorpo ainda é razoavelmente estável e solúvel para proporcionar rendimentos satisfatórios quando expresso e purificado a partir de E. coli (Fig. 3A) , e não agrega (Fig. 3B) . As suas caracteristicas de ligação a TNFa são excelentes, com uma Kd de 0,8 nM. São reveladas sequências VL e VH derivadas a partir de sequências presentes em TB-A de várias maneiras. Em primeiro lugar, verificou-se que mutações pontuais até cinco posições na estrutura de VL e/ou até nove posições na estrutura de VH são aceitáveis, especialmente mutações pontuais que reproduzem estruturas mais do tipo TB-B, isto é, mais como a SEQ ID N° 3 para VL ou SEQ ID N° 4 para VH. Um anticorpo scFv que compreende um dominio VL da sequência SEQ ID N° 11 e um dominio VH da sequência SEQ ID N° 4, ligado pelo (GGGGS)4 linker, é designado TB-B R46L porque difere apenas na posição 46 de VL do TB-B. Ao contrário do TB-B, este anticorpo ainda tem boas propriedades de ligação ao TNFa (Kd * 100 nM) . Isto sugere que o número de alterações em TB-B R46L em relação a TB-A representa aproximadamente o limite superior para alerações na estrutura do dominio variável. 15

Apenas mutações pontuais simples ou duplas são introduzidas em estruturas VL e/ou VH de TB-A. Os resíduos de estrutura preferidos para mutações estão nas posições 4, 46, 65, 67, 70 e 83 para VL, e nas posições 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 e 112 para VH. As posições estão numeradas de acordo com a numeração nas listagem de sequências. As substituições de aminoácidos são preferencialmente ou "conservadoras", ou de tal modo que substituindo aminoácidos são mais semelhantes, ou preferencialmente mesmo idênticas, aos aminoácidos correspondentes presentes na sequência TB-B. Por exemplo, A76 de VH em TB-A pode ser alterada para 17 6 já que está presente em TB-B, mas também pode ser alterada para outro aminoácido com cadeia lateral semelhante, isto é, uma não polar como V ou L. Este é um exemplo de uma substituição de aminoácido "conservadora". Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes adequados para substituições "conservadoras", como utilizado aqui, foram definidas na arte, incluindo cadeias laterais básicas (K, R, H) , cadeias laterais acídicas (D, E) , cadeias laterais polares não carregadas (Q, N, S, T, Y, C), cadeias laterais não polares (G, A, V, L, I, P, F, M, W) , cadeias laterais ramificadas beta (T, V, I) e cadeias laterais aromáticas (Y, F, W, H) . Uma alteração conservadora preferida é a de VL na posição 83, na qual V é alterada ou para F (SEQ ID N° 26) ou para A (SEQ ID N° 27). Contudo, na SEQ ID N° 32 uma alteração não conservadora em VL é V83E, que é combinada com uma alteração em CDR1, isto é, N31D, e em VH com V79A. Outra variante TB-A extraordinária é a da SEQ ID N° 33, com uma troca de F68L conservadora em VH ligada a VL por um linker que transporta um R na posição 2, substituindo G.

Muitas trocas de aminoácidos simples preferidas são R65S ou Y67S em VL e K43Q ou F68 para V, L, ou A em VH. Muitas trocas duplas preferidas são F70L/L72R ou A761/S77G em VH. Os anticorpos ScFv que compreendem sequências TB-A 16 com ditas alterações mostram inibição de citotoxicidade induzida por TNFa em células L929. Os resultados de alguns deles são mostrados na Fig. 5B. As suas sequências são como se segue: SEQ ID N° 18 SEQ ID N° 19 SEQ ID N° 20 SEQ ID N° 21 SEQ ID N° 22 SEQ ID N° 23 SEQ ID N° 24 TB-A H_K43Q (TB-A H43) TB-A H_F68V (TB-A H68) TB-A H F70L/L72R (TB-A H70/72) TB-A H_A7 61/S 7 7 G (TB-A H76/77) TB-A L_L46R (TB-A L46) TB-A L_R65S (TB-A L65) TB-A L Y67S (TB-A L67)

Qualquer um dos anteriormente mencionados dominios VH podem ser combinados com qualquer um dos dominios VL anteriormente mencionados.

Os dominios VL e VH de TB-A e TB-B são misturados de tal forma que o dominio VL de TB-A (SEQ ID N° 1 é combinada com o dominio VH de TB-B (SEQ ID N° 4), ou o dominio VL de TB-B (SEQ ID N° 4) é combinado com o dominio VH de TB-A (SEQ ID N° 2) . As versões misturadas obtidas num scFv são ligadas com o (GGGGS)4 linker da sequência SEQ ID N° 10, resultando nos anticorpos scFv TB-AB (SEQ ID N° 12) ou TB-BA (SEQ ID N° 13), respetivamente. Dito (GGGGS)4 linker pode ter uma troca de aminoácido de uma glicina para um aminoácido mais hidrofilico, isto é, polar, ou mesmo carregado, o que pode fazer com o que anticorpo se torne mais solúvel. Entre estas variações, a que inclui a sequência GRGGS-(GGGGS)3 (SEQ ID N° 39) é preferida. É também revelada a combinação dos dominios VL ou VH de sequências tipo TB-B com dominios VH ou VL de sequências tipo TB-A, em que tipo TB-B/TB-A significa que as sequências estão mais próximas a uma do que à outra.

Um ou mais aminoácidos são alterados nas regiões CDR das sequências TB-A VL e/ou VH para corresponderem aos aminoácidos correspondentes presentes nas sequências selecionadas SEQ ID N° 5 de VL e/ou SEQ ID N° 6 ou SEQ ID 17 Ν° 25 de VH. Muitas alterações preferidas são aquelas numa das CDRs de VL (VL CDR2 ou VL CDR3) e/ou CDRs de VH (CDR2 ou CDR3), com as alterações mais preferidas a conduzirem às sequências VL SEQ ID N° 7 ou SEQ ID N° 8 e/ou às sequências VH SEQ ID N° 25 ou SEQ ID N° 9, respetivamente.

As sequências VL SEQ ID N° 26 ou SEQ ID N° 27 é combinada com a sequência VH SEQ ID N°30. A sequência VL SEQ ID N°1 é combinada com as sequências VH SEQ ID N°28 ou SEQ ID N°29.

Em geral, qualquer uma das sequências VL reveladas pode ser combinada com reveladas. qualquer uma das sequências VH Obj etos da presente revelação são anticorpos e fragmentos de anticorpo, em particular polipeptideos VL ou VH, anticorpos de cadeia simples (scFv) ou fragmentos Fab. No caso dos anticorpos scFv, um dominio VL selecionado pode ser ligado a um dominio VH selecionado em qualquer orientação por um linker flexivel. Um estado adequado do linker da arte consiste em sequências de aminoácidos GGGGS repetidas ou variantes das mesmas. Numa modalidade preferida da presente invenção é utilizado um (GGGGS)4 linker da sequência ID N.° 10 ou a sua derivada SEQ ID N° 39, mas as variantes de repetições 1-3 também são possíveis (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6999-6998). Outros linkers que podem ser utilizados para a presente invenção são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Câncer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 e Roovers et al. (2001), Câncer Immunol. Immunother. 50:51-59. O arranjo pode ser ou VL-línAer-VH ou VH-linAer-VL, com a orientação precedente a ser a orientação preferida.

No caso dos fragmentos Fab, dominios variáveis de cadeias leves VL selecionados são fundidos com a região constante de uma cadeia kapa de um Ig humana, enquanto os 18 domínios variáveis de cadeias pesadas VH adequados são fundidos com o primeiro domínio constante (N-terminal) CHI de uma IgG humana. Numa modalidade exemplar da presente invenção, o domínio Ck humano tem a sequência SEQ ID N° 14 e o domínio CHI utilizado para construir os fragmentos Fab tem a sequência SEQ ID N° 15. A Fig. 2 mostra um exemplo de um fragmento Fab em que os domínios VL e VH de TB-A são utilizados de tal forma que o domínio VL está ligado diretamente com o domínio constante kapa humano, resultando na sequência DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTG VPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N°:1+SEQ ID N°:14) e o domínio VH é fundido com o primeiro domínio constante (CHI), resultando na sequência QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGE PTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFSEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCTS (SEQ ID N°:2+SEQ ID N°:15) .

No terminal C, é formada uma ponte dissulfido inter-cadeia entre os dois domínios constantes.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ter afinidades com o TNFa humano com constantes de dissociação Kd num intervalo de 0,8-10,000 nM. Numa modalidade preferida da presente invenção a Kd é <10 nM. A afinidade de um anticorpo por um antígeno pode ser determinada experimentalmente utilizando um método adequado (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", em Fundamental Immunology, Paul, W.E., Editores, Raven Press: Nova Iorque, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: Nova Iorque, NY) e métodos neles descritos.

Num aspeto da presente invenção, os anticorpos ou 19 derivados de anticorpos, especialmente os scFv ou fragmentos Fab, são marcados. A rotulagem detetável de um anticorpo especifico de TNFa ou derivado de anticorpo pode ser conseguida ligando-o a uma enzima para utilização num imunoensaio de enzima (EIA) ou ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA), que são métodos bem conhecidos da pessoa habilitada na arte (por exemplo, Current Protocols in Immunology, Coligan et al. Editores, John Wiley & Sons, 2005).

Ao rotular radioativamente os anticorpos específicos de TNFa ou derivados de anticorpos, é possível detetar TNF-α através da utilização de radioimunoensaios (RIA) (ver, por exemplo, Work et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, Nova Iorque (1978). O radioisótopo pode ser detetado através da utilização de um contador gama ou de um contador de cintilação ou por autoradiografia. Isótopos particularmente úteis são 3H, 131I, 35S, 14C, e preferencialmente 125I.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção também podem ser marcados com compostos de rotulagem fluorescente, tais como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, oftaldeído e fluorescamina, ou com compostos quimioluminescentes tais como luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, sal de acridinio imidazol e éster de oxalato.

Os protocolos de rotulagem e deteção são bem conhecidos da pessoa habilitada na arte. Por exemplo, eles estão disponíveis em Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO.I (Harlow, E. e Lane, D., 1998).

Os anticorpos ou derivados de anticorpos marcados da presente invenção são úteis para fins diagnósticos, em particular deteção de TNFa numa amostra biológica removida de uma paciente. Qualquer amostra que contenha TNFa pode 20 ser utilizada, por exemplo, fluidos biológicos como sangue, soro, linfa, urina, exudato inflamatório, fluido cerebrospinal, fluido amniótico, um extrato ou homogeneizado de tecido, e afins, ou espécimes histológicos para deteção in situ.

PREPARAÇÕES FARMACÊUTICAS

Definições: O termo "formulação farmacêutica" refere-se a preparações gue estão em tal forma que permitem que a atividade biológica do anticorpo ou derivado de anticorpo seja inequivocamente eficaz, e que não contêm componentes adicionais que são tóxicas para os indivíduos aos quais a formulação seria administrada. Excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" (veículos, aditivos) são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um sujeito mamífero para providenciar uma dose eficaz do ingrediente ativo empregue.

Uma formulação "estável" é uma na qual o anticorpo ou derivado de anticorpo da mesma retém essencialmente a sua estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica no momento do armazenamento. Estão disponíveis na arte várias técnicas analíticas para medir a estabilidade proteica e são revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Editor, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug

Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por exemplo. A estabilidade pode ser medida a uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Preferencialmente, a formulação é estável à temperatura ambiente (cerca de 30° C) ou a 40° C por, pelo menos, 1 mês e/ou estável a cerca de 2-8° C por, pelo menos, 1 ano por, pelo menos, 2 anos. Além disso, uma formulação é preferencialmente estável após congelamento (a, por exemplo, -70° C) e descongelamento da formulação.

Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém a sua estabilidade física" numa formulação farmacêutica se não 21 mostrar sinais de agregação, precipitação e/ou desnaturação no momento do exame visual da cor e/ou claridade, ou como medido por dispersão de luz UV ou por cromatograf ia por exclusão de tamanho.

Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém a sua estabilidade quimica" numa formulação farmacêutica, se a estabilidade quimica num momento dado é tal que a proteína é considerada ainda reter a sua atividade biológica, conforme definido a seguir. A estabilidade química pode ser avaliada detetando e quantificando formas quimicamente alteradas da proteína. A alteração química pode envolver modificação de tamanho (por exemplo, recorte) que pode ser avaliada utilizando cromatografia por exclusão de tamanho, SDS-PAGE e/ou ionização e dessorção a laser assistida por matriz/espetrometria de massa por tempo de vôo (MALDI/TOF MS), por exemplo. Outros tipos de alteração química incluem alteração da carga (por exemplo ocorrendo como resultado da desamidação) que pode ser avaliada por cromatografia de troca de iões, por exemplo.

Um anticorpo ou derivado de anticorpo "retém a sua atividade biológica" numa formulação farmacêutica, se a atividade biológica do anticorpo num momento dado está dentro de cerca de 10% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica exibida no momento em que a formulação farmacêutica foi preparada, conforme determinado num ensaio de ligação ao antígeno, por exemplo. Outros ensaios de "atividade biológica" para anticorpos são elaborados aqui a seguir.

Por "isotónico" entende-se que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. As formulações isotónicas terão geralmente uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida utilizando uma pressão a vapor ou osmómetro tipo congelamento, por exemplo.

Um "poliol" é uma substância com múltiplos grupos 22 hidroxilo, e inclui açúcares (açúcares redutores e não redutores), álcoois de açúcar e ácidos de açúcar. Polióis preferidos aqui têm um peso molecular que é inferior a cerca de 600 kD (por exemplo, no intervalo de cerca de 120 a cerca de 400 kD). Um "açúcar redutor" é um que contém um grupo hemiacetal que pode reduzir iões de metal ou reagir covalentemente com lisina e outros grupos de aminoácidos em proteínas e um "açúcar não redutor" é um que não tem estas propriedades de um açúcar redutor. Exemplos de açúcares redutores são frutose, manose, maltose, lactose, arabinose, xilose, ribose, ramnose, galactose e glicose. Os açúcares não redutores incluem sacarose, trealose, sorbose, melezitose e rafinose. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol e glicerol são exemplos de álcoois de açúcar. Em relação aos ácidos de açúcar, estes incluem L-gluconato e sais metálicos do mesmo. Onde é desejado que a formulação seja estável a congelamento-decongelamento, o poliol é preferencialmente um que não cristaliza a temperaturas de congelamento (por exemplo -20° C) de tal modo que destabiliza o anticorpo na formulação. Os açúcares não redutores, tais como sacarose e trealose, são os polióis preferidos aqui, com a trealose a ser preferida sobre a sacarose, por causa da estabilidade em solução superior da trealose.

Como utilizado aqui, "tampão" refere-se a uma solução tamponada que resiste a alterações no pH pela ação dos seus componentes conjugados ácido-base. O tampão desta invenção tem um pH no intervalo de cerca de 4,5 a cerca de 6,0; preferencialmente de cerca de 4,8 a cerca de 5,5; e mais preferencialmente tem um pH de cerca de 5,0. Exemplos de tampões que controlarão o pH neste intervalo incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), sucinato (tal como, sucinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões ácidos orgânicos: Onde uma formulação estável congelada-descongelada é desejada, o tampão é 23 preferencialmente não fosfato.

Num sentido farmacológico, no contexto da presente invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um anticorpo ou derivado de anticorpo refere-se a uma quantidade eficaz na prevenção ou tratamento de um distúrbio para o tratamento do qual o anticorpo ou derivado de anticorpo é eficaz. Uma "doença/distúrbio" é qualquer condição patológica que beneficiaria do tratamento com o anticorpo ou derivado de anticorpo. Isto inclui distúrbios ou doenças crónicas e agudas incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamifero ao distúrbio em questão.

Um "conservante" é um composto que pode ser incluido na formulação para essencialmente reduzir ação bacteriana na mesma, facilitando, assim, a produção de uma formulação multi-usos, por exemplo. Exemplos de conservantes potenciais incluem cloreto de amónio octadecildimetilbenzil, cloreto de hexametónio, cloreto de benzalcónio (uma mistura de cloretos de alquilbenzildimetilamónio na qual os grupos alquilo são compostos de cadeia longa), e cloreto de benzetónio. Outros tipos de conservantes incluem álcoois aromáticos, tais como álcool fenólico, butilico e benzilico, parabenos de alquilo tais como parabeno de metil ou de propil, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, e m-cresol. 0 conservante mais preferido aqui é o álcool benzilico. A presente invenção também providencia composições farmacêuticas que compreendem um ou mais anticorpos ou compostos derivados de anticorpo, juntamente com, pelo menos, um veiculo ou excipiente fisiologicamente aceitável. As composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, um ou mais de água, tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), etanol, óleo mineral, óleo vegetal, dimetilsulfóxido, carboidratos (por exemplo, glicose, 24 manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, adjuvantes, polipeptídeos ou aminoácidos tais como glicina, antioxidantes, agentes quelantes como EDTA ou glutationa e/ou conservantes. Conforme indicado anteriormente, outros ingredientes ativos podem (mas não precisam) ser incluídos nas composições farmacêuticas providenciadas aqui.

Um veiculo é uma substância que pode estar associada com um anticorpo ou derivado de anticorpo antes da administração ao paciente, frequentemente com o propósito de controlar a estabilidade ou biodisponibilidade do composto. Os veiculos para utilização dentro de tais formulações são geralmente biocompativeis, e também podem ser biodegradáveis. Os veiculos incluem, por exemplo, moléculas monovalentes ou multivalentes tais como albumina do soro (por exemplo, humana ou bovina) , albumina do ovo, péptidos, polilisina e polissacarideos tais como aminodextrano e poliamidoaminas. Os veiculos também incluem materiais de suporte sólidos tais como contas e microparticulas que compreendem, por exemplo, polilactato poliglicolato, poli(lactido-co-glicolido) , poliacrilato, látex, amido, celulose ou dextrano. Um veiculo pode transportar os compostos numa variedade de formas, incluindo ligação covalente (seja diretamente ou através de um grupo linker), interação não covalente ou mistura.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer maneira apropriada de administração, incluindo, por exemplo, administração tópica, oral, nasal, retal ou parentérica. Em certas modalidades, as composições numa forma adequada para utilização oral são preferidas. Tais formas incluem, por exemplo, pilulas, comprimidos, pastilhas, lozangos, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersantes, emulsão, cápsulas duras ou macias, ou xaropes ou elixires. Dentro de ainda outras modalidades, as composições providenciadas aqui podem ser formuladas como um liofilizado. 0 termo parentérico, como utilizado 25 aqui, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracranial, intratecal e intraperitoneal, bem como qualquer técnica de injeção ou infusão semelhante.

As composições pretendidas para utilização oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na arte para o fabrico de composições farmacêuticas e podem conter um ou mais agentes, tais como agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes, e agentes conservantes de modo a providenciar preparações apelativas e palatáveis. Os comprimidos contêm o ingrediente ativo em mistura com excipientes fisiologicamente aceitáveis que são adequados para o fabrico de comprimidos. Tais excipientes incluem, por exemplo, diluentes inertes (por exemplo, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio), agentes granulantes e desintegrantes (por exemplo, amido de milho ou ácido alginico), agentes de ligação (por exemplo, amido, gelatina ou acácia) e agentes lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco). Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e providenciar, assim, uma ação prolongada durante um período de tempo mais longo. Por exemplo, pode ser empregue um material retardador do tempo, tal como o monosterato de gliceril ou distearato de gliceril.

As formulações para utilização oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo está misturado com um diluente inerte sólido (por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caolina), ou como cápsulas de gelatina macias em que o ingrediente ativo está misturado com água ou um meio oleoso (por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite). As suspensões aquosas contêm o anticorpo ou 26 derivado de anticorpo em mistura com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas. Tais excipientes incluem agentes de suspensão (por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidropropilmetilcelulose, alginate de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia); e agentes de dispersão ou humidificantes (por exemplo, fosfatideos que ocorrem naturalmente tais como a lecitina, produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos tais como estearato de polioxietileno, produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa tal como heptadecaetileneoxicetanol, produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados a partir de ácidos gordos e um hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados a partir de ácidos gordos e anidridos de hexitol tais como monooleato de polietileno sorbitan). As suspensões aquosas também podem compreender um ou mais conservantes, por exemplo p-hidroxibenzoato de etilo ou n-propilo, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes, e um ou mais agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina. Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçantes, tais como glicerol, propilenoglicol, sorbitol, ou sacarose. Tais formulações também podem compreeder um ou mais demulcentes, conservantes, agentes aromatizantes, e/ou agentes corantes.

As suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo os ingredientes ativos num óleo vegetal (por exemplo, óleo de aráquida, azeite, óleo de sésamo, ou óleo de coco) ou num óleo mineral tal como parafina liquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante tal como cera de abelha, parafina dura, ou álcool cetilico. Agentes adoçantes, tais como aqueles mencionados anteriormente, e/ou agentes aromatizantes podem ser adicionados para 27 providenciar preparações orais palatáveis. Tais suspensões podem ser preservadas pela adição de um anti-oxidante tal como ácido ascórbico. Pós ou grânulos de dispersão adequados para a preparação de suspensões aquosas pela adição de água providenciam o ingrediente ativo na mistura com um agente de dispersão ou humidificante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes de dispersão ou humidificantes adequados e agentes de suspensão são exemplificados por aqueles mencionados anteriormente. Excipientes adicionais, por exemplo, agentes adoçantes, aromatizantes e corantes, também podem estar presentes.

As composições farmacêuticas também podem estar na forma de emulsões óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal (por exemplo, azeite ou óleo de aráquida), um óleo mineral (por exemplo, parafina liquida) , ou uma mistura dos mesmos. Agentes emulsionantes adequados incluem gomas que ocorrem naturalmente (por exemplo, goma acácia ou goma tragacanto), fosfatideos que ocorrem naturalmente (por exemplo, soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais derivados a partir de ácidos gordos e hexitol), anidridos (por exemplo, monoleato de sorbitan), e produtos de condensação de ésteres parciais derivados a partir de ácidos gordos e hexitol com óxido de etileno (por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbitan). Uma emulsão pode também compreender um ou mais agentes adoçantes e/ou aromatizantes. A composição farmacêutica pode ser preparada como uma suspensão oleaginosa ou aquosa injetável estéril na qual o modulador, dependendo do veiculo e concentração utilizados, ou é suspensa ou dissolvida no veiculo. Tal composição pode ser formulada de acordo com a arte conhecida utilizando agentes de dispersão, humidificantes e/ou de suspensão adequados, tais como aqueles mencionados anteriormente. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser 28 empregues estão água, 1,3-butanediol, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Além disso, óleos estéreis, fixos podem ser empregues como um solvente ou meio de suspensão. Para este fim, qualquer oleo fixo insosso pode ser empregue, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos gordos tais como o ácido oleico podem ser utilizados na preparação de composições injetáveis, e adjuvantes tais como anestésicos locais, conservantes e/ou agentes tamponantes podem ser dissolvidos no veiculo.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas como formulações de libertação prolongada (isto é, uma formulação tal como uma cápsula que produz uma libertação lenta do modulador após a administração) . Tais formulações podem ser, geralmente, preparadas utilizando tecnologia bem conhecida e administradas por, por exemplo, implantação oral, retal, ou subcutânea, ou por implantação no local alvo desejado. Os veiculos para utilização dentro de tais formulações são biocompativeis, e podem também ser biodegradáveis; preferencialmente a formulação providencia um nivel relativamente constante de libertação do modulador. A quantidade de um anticorpo ou derivado de anticorpo contida numa formulação de libertação prolongada depende de, por exemplo, o local de implantação, a taxa e duração esperada de libertação e a natureza da doença/distúrbio a ser tratado ou prevenido.

Anticorpo ou derivados de anticorpos providenciados aqui são geralmente administrados numa quantidade que atinge uma concentração num fluido corporal (por exemplo, sangue, plasma, soro, CSF, fluido sinuvial, linfa, fluido intersticial celular, lágrimas ou urina) que é suficiente para se ligar de forma detetável a TNFa e prevenir ou inibir doenças/distúrbios associados com o TNFa. Uma dose é considerada eficaz se resulta num beneficio para o paciente discernivel, conforme descrito aqui. Doses sistémicas 29 preferidas oscilam entre cerca de 0,1 mg a cerca de 140 mg por quilograma de peso corporal por dia (cerca de 0,5 mg a cerca de 7 g por paciente por dia) , com doses orais sendo geralmente cerca de 5-20 vezes superiores às doses intravenosas. A quantidade de anticorpo ou derivado de anticorpo que pode ser combinada com os materiais veículos para produzir uma forma de dosagem única variarão dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. As formas unitárias de dosagem conterão geralmente entre cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de um ingrediente ativo.

As composições farmacêuticas podem ser embaladas para tratar condições patológicas recetivas a um anticorpo ou derivado de anticorpo dirigido a TNF-cx. As composições farmacêuticas embaladas podem incluir um recipiente que contém uma quantidade eficaz de, pelo menos, um anticorpo ou derivado de anticorpo, conforme descrito aqui e as instruções (por exemplo, rotulagem) indicando que a composição contida é para ser utilizada para tratar uma doença/distúrbio recetivo a um anticorpo ou derivado de anticorpo após a administração no paciente.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção também podem ser quimicamente modificados. Grupos modificadores preferidos são polímeros, por exemplo, um polímero de polialqueno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia simples ou ramificada opcionalmente substituído, ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado. Tal grupo efetor pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo. Exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem poli (etilenoglicol) (PEG), poli (propilenoglicol), poli(vinilálcool) de cadeia simples ou ramificada opcionalmente substituídos ou derivados dos mesmos. Polímeros que ocorrem naturalmente particulares incluem lactose, amilose, dextrano, glicogénio ou derivados dos mesmos. O tamanho do polímero pode ser variado conforme 30 desejado, mas estará normalmente num intervalo de peso molecular médio de 500Da a 50000Da. Para aplicação local, onde o anticorpo é desenhado para penetrar tecido, um peso molecular preferido do polimero é aproximadamente 5000Da. A colécula de polimero pode ser anexa ao anticorpo, em particular à extremidade do terminal C da cadeia pesada do fragmento Fab através de um péptido de dobradiça covalentemente ligado, conforme descrito no documento WO0194585. Em relação à anexação de frações PEG, é feita referência a "Poli(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova Iorque e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova Iorque.

Preparação da Formulação

Após a preparação do anticorpo ou derivado de anticorpo de interesse, conforme descrito anteriormente, a formulação farmacêutica que o compreende é preparada. O anticorpo a ser formulado não foi sujeito a liofilização prévia e a formulação de interesse aqui é uma formulação aquosa. Preferencialmente o anticorpo ou derivado de anticorpo na formulação é um fragmento de anticorpo, tal como um scFv. A quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo presente na formulação é determinada tomando em consideração os volumes de dose desejados e modo(s) de administração, por exemplo. De cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, preferencialmente de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 25 mg/ml e mais preferencialmente de cerca de 2 mg/ml a cerca de 10 mg/ml é uma concentração de anticorpo exemplar na formulação. E preparada uma formulação aquosa que compreende o anticorpo ou derivado de anticorpo numa solução com o pH tamponado. O tampão desta invenção tem um pH no intervalo de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, preferencialmente de cerca 31 de 4,8 a cerca de 5,5, e mais preferencialmente tem um pH de cerca de 5,0. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro deste intervalo incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), sucinato (tal como sucinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões ácidos orgânicos. A concentração de tampão pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, preferencialmente de cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e da isotonicidade desejada da formulação. 0 tampão preferido é acetato de sódio (cerca de 10 mM) , pH 5,0.

Um poliol, que age como um tonificante e pode estabilizar o anticorpo, é incluido na formulação. Em modalidades preferidas, a formulação não contém uma quantidade tonificante de um sal tal como cloreto de sódio, já que isto pode causar a precipitação do anticorpo ou derivado de anticorpo e/ou pode resultar na oxidação a baixo pH. Em modalidades preferidas, o poliol é um açúcar não redutor, tal como sacarose ou trealose. O poliol é adicionado à formulação numa quantidade que pode variar com respeito à isotonicidade desejada da formulação. Preferencialmente a formulação aquosa é isotónica, em cujo caso as concentrações adequadas do poliol na formulação estão no intervalo de cerca de 1% a cerca de 15% p/v, preferencialmente no intervalo de cerca de 2% a cerca de 10% p/v, por exemplo. Contudo, formulações hipertónicas ou hipotónicas também podem ser adequadas. A quantidade de poliol adicionado também pode adicionar em relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, pode ser adicionada uma quantidade inferior de um monossacarideo (por exemplo, manitol), comparada com um dissacarideo (tal como trealose).

Um tensoativo também é adicionado à formulação do anticorpo ou derivado de anticorpo. Tensoativos exemplares incluem tensoativos não iónicos tais como polissorbatos (por exemplo polissorbatos 20, 80, etc.) ou poloxâmeros 32 (por exemplo poloxâmero 188) . A quantidade de tensoativo adicionada é tal que reduz a aqregação do anticorpo /derivado de anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de particulados na formulação e/ou reduz a absorção. Por exemplo, o tensoativo pode estar presente na formulação numa quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, preferencialmente de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, e mais preferencialmente de cerca de 0,01% a cerca de 0,1%.

Numa modalidade, a formulação contém os agentes anteriormente identificados (isto é, anticorpo ou derivado de anticorpo, tampão, poliol e tensoativo) e é essencialmente livre de um ou mais conservantes, tais como álcool benzílico, fenol, m-cresol, clorobutanol e Cl de benzetónio. Noutra modalidade, pode ser incluído um conservante na formulação, particularmente onde a formulação é uma formulação multidose. A concentração do conservante pode estar no intervalo de cerca de 0,1% a cerca de 2%, mais preferencialmente de cerca de 0,5% a cerca de 1%. Um ou mais outros veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis tais como aqueles descritos em Pharmaceutical Sciences de Remington 21a edição, Osol, A. Editor (2006) podem ser incluídos na formulação desde que não afetem de forma adversa as características desejadas da formulação. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para recetores a dosagens e concentrações empregues e incluem; agentes tamponantes adicionais; co-solventes; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes tais como EDTA; complexos de metal (por exemplo complexos de proteína-Zn) ; polímeros biodegradáveis tais como poliésteres; e/ou contra-iões formadores de sal tais como sódio.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo têm de ser estéreis. Isto é rapidamente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis, 33 antes de, ou após, a preparação da formulação.

Administração da formulação A formulação é administrada a um mamífero em necessidade do tratamento com o anticorpo, preferencialmente um humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bólus ou por infusão continua ao longo de um periodo de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intrasinuvial, intratecal, oral, tópica, ou inalação. Em modalidades preferidas, a formulação é administrada ao mamifero por administração intravenosa. Para tais fins, a formulação pode ser injetada utilizando uma seringa ou através de uma linha IV, por exemplo. A dosagem apropriada ("quantidade terapeuticamente eficaz") do anticorpo dependerá, por exemplo, da condição patológica a ser tratada, da severidade e curso da condição patológica, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapêutica prévia, do historial clinico do paciente e da resposta ao anticorpo, de tipo de anticorpo utilizado, e da descrição do médico clinico que trata do caso. 0 anticorpo ou derivado de anticorpo é administrado adequadamente ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos e pode ser administrado ao paciente em qualquer altura a partir do momento de diagnóstico para a frente. 0 anticorpo ou derivado de anticorpo pode ser administrado como o único tratamento ou em conjunto com outros fármacos ou terapêuticas úteis em tratar a condição patológica em questão.

Como um proposição geral, a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou derivado de anticorpo administrada estará no intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal do paciente seja por uma ou mais administrações, com o intervalo tipico de 34 anticorpo utilizado a ser cerca de 0,3 a cerca de 20 mg/kg, mais preferencialmente cerca de 0,3 a cerca de 15 mg/kg, administrado diariamente, por exemplo. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapêutica é facilmente monitorizado por técnicas convencionais.

Artigos de fabrico

Numa outra modalidade da invenção, é providenciado um artigo de fabrico que compreende um recipiente que contém a formulação farmacêutica aquosa da presente invenção e opcionalmente providencia instruções para a sua utilização. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos e seringas. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. Um recipiente exemplar é um frasco de vidro de utilização única com 3-20 cc. Em alternativa, para uma formulação multidose, o recipiente pode ser um frasco de vidro com 3-100 cc. O recipiente contém a formulação e o rótulo no, ou associado com, o recipiente pode indicar instruções para utilização. O artigo de fabrico pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista commercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e inserções de embalagem com instruções para uso.

Geração dos anticorpos da presente invenção

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser gerados utilizando técnicas de rotina no campo da genética recombinante. Conhecendo as sequências dos polipeptideos, os ADNc que as codificam podem ser geradas por sintese génica (www.genscript.com) . Estes ADNc podem ser clonados em plasmídeos vetores adequados. Assim que são obtidos os ADNc que codificam um dominio VL e/ou VH, pode ser realizada mutagénese sitio-dirigida, por exemplo por PCR utilizando iniciadores mutagénicos, para obter vários derivados. A melhor sequência de "partida" 35 pode ser escolhida dependendo do número de alterações desejadas nas sequências VL e/ou VH. Uma sequência preferida é a sequência TB-A e os seus derivados, por exemplo, sequências scFv ou sequências de péptidos de fusão Fab, podem ser escolhidas como moldes para mutagénese movida por PCR e/ou clonagem. Técnicas convencionais de clonagem e mutagénese bem conhecidas de alguém habilitado na arte podem ser utilizadas para anexar linkers, misturar domínios ou construir fusões para a produção de fragmentos Fab. São descritos protocolos básicos que revelam métodos gerais desta invenção em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook e Russell, 3a edição 2001) e em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999). A sequência de ADN que alberga um gene que codifica um polipeptídeo scFv, ou no caso de fragmentos Fab, que codificam dois genes separados ou um operão bicistrónico que compreende os dois genes para as fusões VL-Ck e VH-CH1 fusions (Fig. 2) são clonados num vetor de expressão adequado, preferencialmente um com um promotor induzivel. É preciso ter em atenção que diante de cada gene está presente um local de ligação ao ribossoma apropriado (RBS em Fig. 2) que assegura a tradução. É para ser entendido que os anticorpos da presente invenção compreendem as sequências reveladas em vez de consistirem nelas. Por exemplo, as estratégias de clonagem podem requerer que uma construção é feita a partir de um anticorpo que com um ou uns poucos resíduos adicionais na extremidade do terminal N estão presentes. Especificamente, a metionina derivada a partir do codão de iniciação pode estar presente na proteína final em casos onde não foi dividido pós-traducionalmente. A maioria das construções para anticorpos scFv originam uma alanina adicional na extremidade do terminal N. Numa modalidade preferida da presente invenção, é escolhido um vetor de expressão para expressão 36 periplasmática em E. coli (Krebber, 1997) . Dito vetor compreende um promotor diante de uma sequência sinal de divisivel. A sequência codificante para o péptido anticorpo é depois fundida em moldura com uma sequência sinal de divisivel. Isto permite dirigir o polipeptideo expresso em direção ao periplasma bacteriano onde a sequência sinal é dividida. 0 anticorpo é depois dobrado. No caso dos fragmentos Fab, abos peptides de fusão VL-Ck e VH-CH1 têm de ser ligados com um sinal exportador. A ligação covalente S-S é formada nas cisternas do C-terminal depois dos péptidos terem atingido o periplasma. Se a expressão citoplasmática dos anticorpos é preferida, ditos anticorpos podem ser normalmente obtidos a altos rendimentos a partir de corpos de inclusão, que podem ser facilmente separados a partir de outros fragmentos celulares e proteina. Neste caso os corpos de inclusão são solubilizados num agente desnaturante, tal como, por exemplo, cloridrato de guaridina (GndHCl) e depois redobrado por procedimentos de renaturação bem conhecidos daqueles habilitados na arte.

Os plasmideos que expressam os polipeptídeos scFv ou Fab são introduzidos num hospedeiro adequado, preferencialmente uma célula bacteriana, levedura ou de mamifero, mais preferencialmente uma estirpe adequada de E. coli como, por exemplo, JM83 para expressão periplasmática ou BL21 para expressão em corpos de inclusão. 0 polipeptideo pode ser colhido ou do periplasma ou dos corpos de inclusão e purificado utilizando técnicas convencionais, tais como cromatografia de troca de iões, cromtografia de fase reversa, cromatografia por afinidade e/ou filtração por gel conhecidos da pessoa habilitada na arte.

Os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados em relação ao rendimento, solubilidade e estabilidade in vitro. As capacidades de ligação em relação ao TNFa, preferencialmente em relação ao 37 TNFa humano, podem ser testadas in vitro por ELISA ou ressonância de plasmon de superfície (BIACore), utilizando TNFa humano recombinante, conforme descrito no documento W09729131, permitindo também o último método determinar a constante da taxa koff, que deveria preferencialmente ser inferior a 10“3s_1. Valores de Kd de <10 nM são preferidos. A atividade neutralizadora in vivo de um anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção pode ser estimada utilizando o ensaio de citotoxicidade L929. O TNFa humano recombinante exerce um efeito citotóxico em direção a células de fibroblasto L929 de ratinho cultivadas de uma forma dependente da concentração. Esta citotoxicidade induzida por TNFa pode ser inibida por anticorpos neutralizadores de TNFa (Dõring, 1994) . Um valor de IC50 preferido correspondente a uma concentração inibidora meia-máxima é <100 ng ml-1.

Como o TNFa provou ter um papel patofisiológico em várias doenças humanas, em particular distúrbios inflamatórios, distúrbios imunes e imuno-regulados, infeções que causam choque sético, endotóxico e cardiovascular, doenças neurodegenerativas e doenças malignas. Como se suspeita que o TNFa desempenha um papel relevante na doença num número gradualmente crescente de doenças humanas adicionais, é difícil fornecer uma lista exaustiva de indicações que também assegure uma representação completa do espetro de aplicações clínicas para inibidores de TNFa no futuro. Por isso, os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção podem ser aplicados para tratar as doenças listadas no catálogo seguinte, que não é para ser considerado como uma lista completa ou exclusiva. Outras doenças não mencionadas especificamente, que direta ou indiretamente são influenciadas por TNFa, também são incluídas.

Inflamação autoimune ou crónica:

Estados crónicos e/ou autoimunes de inflamação em 38 geral, distúrbios inflamatórios mediados imunes em geral, doença CNS inflamatória, doenças inflamatórias gue afetam o olho, articulação, pele, membranas mucosas, sistema nervoso central, trato gastrointestinal, trato urinário ou pulmão, estados de uveite em geral, retinite, uveite HLA-B27+, doença de Behcet, sindrome do olho seco, glaucoma, sindrome de Sjõgren, diabetes mellitus (incluindo neuropatia diabética), resistência à insulina, estados de artrite em geral, artrite reumatóide, osteoartrite, artrite reativa e sindrome de Reiter, artrite juvenil, espondilite anquilosante, esclerose múltipla, sindrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerose lateral amiotrófica, sarcoidose, glomerulonefrite, doença renal crónica, cistite, psoriase (incluindo artrite psoriática), hidrosadenite, paniculite, pioderma gangrenoso, sindrome de SAPHO (sinovite, acne, pustulose, hiperostose e osteite), acne, sindrome de Sweet, pênfigo, doença de Crohn (incluindo manifestações extraintestinais), colite ulcerativa, asma bronquial, alveolite alérgica extrínseca, alergias gerais, rinite alérgica, sinusite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), fibrose do pulmão, granulomatose de Wegener, sindrome de Kawasaki, artrite das células gigantes, vasculite de Churg-Strauss, poliartrite nodosa, queimaduras, doença enxerto versus hospedeiro, reações hospedeiro versus enxerto, episódios de rejeição seguidos de transplante de orgão ou da medula óssea, estados sistémicos e locais de vasculite em geral, lúpus eritematoso sistémico e discoidal, polimiosite e dermatomiosite, esclerodermia, pré-eclâmpsia, pancreatite aguda e crónica, hepatite virai, hepatite alcoólica. Inflamação aguda e/ou prevenção de inflamação e dor pós-cirúrgica ou pós-traumática; A prevenção de inflamação pós-cirúrgica em geral, cirurgia ocular (por exemplo, cataratas (substituição da lente ocular) ou cirurgia do glaucoma), cirurgia à 39 articulação (incluindo cirurgia artroscópica), cirurgia a estruturas relacionadas com a articulação (por exemplo, ligamentos), cirurgia oral e/ou dentária, procedimentos cardiovasculares minimamente invasivos (por exemplo, PTCA, aterectomia, colocação de endoprótese expansível), procedimentos ginecológicos e intra-abdominais laparoscópicos e/ou endoseópicos, procedimentos urológicos endoscópicos (por exemplo, cirurgia à próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistite intersticial), inflamação perioperativa (prevenção) em geral.

Doenças neurológicas e neurodegenerativas:

Doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, paralisia de Bell, doença de Creutzfeld-Jakob. Cancro:

Osteolise relacionada com cancro, inflamação relacionada com cancro, dor relacionada com cancro, caquexia relacionada com cancro, metástases da medula.

Dor;

Formas de dor aguda e crónica, independentemente se estas são causadas por efeitos centrais ou periféricos do TNFoí e se são classificados como formas de dor inflamatórias, nocicetivas ou neuropáticas, ciática, lumbago, sindrome do túnel carpal, sindrome de dor regional complexo (CRPS), gota, neuralgia posterpética, fibromialgia, estados de dor local, sindromes de dor crónica devido a tumor metastático, dismenorreia.

Infeção:

Sepsia bacteriana, virai ou fúngica, tuberculose, SIDA.

Doença Cardiovascular:

Aterosclerose, doença arterial coronariana, hipertensão, dislipidemia, insuficiência cardiaca e insuficiência cardiaca crónica.

Numa modalidade preferida da presente invenção, o tratamento de osteoartrite ou uveite ou doença inflamatória 40 intestinal pode ser atingida com os anticorpos, ou derivados de anticorpos da presente invenção. A presente invenção também providencia uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou molécula derivada de anticorpo da presente invenção em combinação com um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica deveria, preferencialmente, compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da presente invenção, isto é, uma quantidade de dito anticorpo que é necessária para tratar, melhorar ou prevenir a doença ou condição patológica relacionada com o TNFa, ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detetável. A dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada seja em ensaios de cultivo celular ou em modelos animais, normalmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo animal também podem ser utilizados para determinar o intervalo de concentração apropriado e via de administração. Um modelo animal adequado para observar um efeito do anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção é um modelo de ratazana para monoartrite aguda (Bolon et al. (2004), Vet. Pathol.41:235-243. O TNFa humano é injetado intra-articularmente na articulação do joelho de uma ratazana, conduzindo a uma monoartrite aguda, auto-limitante na articulação injetada. A bioatividade de um anticorpo anti-TNFa (derivado) pode ser quantificada por redução do inchaço da articulação do joelho induzida por TNFa e/ou redução dos parâmetros histológicos de inflamação.

Como os anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção são altamente solúveis, elevadas concentrações de anticorpo (60 mg ml-1 ou mais) permitem a utilização de pequenos volumes de aplicação. O anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção pode ser utilizado em qualquer terapêutica onde é 41 desejado reduzir o nível de TNFa ativo biológico presente no corpo humano ou animal. 0 TNFa pode ser circulante no corpo ou estar presente a um nível indesejavelmente alto localizado num local particular no corpo. A presente invenção providencia modos para aplicações sistémicas bem como locais em geral, que incluem, mas não se limitam às seguintes: aplicação perorai, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra-articular, intravitreal, intradérmica, ou injeção intraparenquimal, inalação de aerosol, aplicação tópica na pele, a membranas mucosas ou no olho, libertação sistémica ou local através de uma mini-bomba implantável ou libertação local através de formulação/dispositivo implantável permitindo a libertação prolongada, aplicação tópica a superfícies serosais, aplicação intratecal ou intraventricular, aplicação oral em formulações permitindo a libertação intralumenal controlada em partes selecionadas do trato gastrointestinal, libertação intravasal localizada a partir de formulação/dispositivos adequados (por exemplo, endopróteses expansíveis), entrega local a quisto urinário, libertação intralumenal localizada (por exemplo, a trato biliar, uretér), ou entrega local através de dispositivos endoscópicos, ou libertação a partir de lentes de contacto (lentes de contacto). Uma aplicação preferida é uma local, tal como injeção intra-articular ou aplicação tópica, por exemplo, no olho. Para ambas aplicações preferidas, o anticorpo da presente invenção precisa de estar em solução. A presente invenção também revela a utilização do anticorpo ou derivado de anticorpo da presente invenção para a produção de um medicamento para o tratamento de doenças associadas com o TNFa. Neste caso, o anticorpo ou derivado de anticorpo está compreendido numa composição terapêutica. Dita composição é utilizada como um medicamento, mais preferencialmente para a prevenção ou terapêutica de doenças relacionadas com o TNFa.

Num outro aspeto, os anticorpos scFv da presente 42 invenção são utilizados na terapêutica génica, em particular na terapêutica génica celular adotiva. Os distúrbios autoimunes representam respostas imunes inapropriadas dirigidas ao próprio tecido. Células T CD4+ especificas de antigen e células dendriticas apresentadoras de antigeno (DCs) são mediadores importantes na patogénese da doença autoimune e são, por isso, candidatos ideais para a terapêutica génica celular adotiva, uma abordagem ex vivo à transferência génica terapêutica. Utilizar células transduzidas retroviralmente e bioluminescência luciferase, Tarner et al. (2003, Ann. N. Y. Acad. Sei. 998:512-519) demonstraram que as células T primárias, hibridomas de células T, e DCs rapidamente e preferencialmente voltam a casa em locais da inflamação em modelos animais de esclerose múltipla, artrite, e diabetes. Estas células, transduzidas com vetores retrovirais que impulsionam a expressão de várias "proteínas reguladoras" tais como interleucinas e scFv anti-TNF, entregam estas proteínas imuno-reguladoras às lesões inflamadas, providenciando terapêutica para encefalite autoimune experimental, artrite induzida por colagénio, e ratinhos não-obesos diabéticos. As estruturas estáveis e solúveis dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invençãos são particularmente adequadas para entrega intracelular do antigeno, por exemplo, quando o anticorpo ou derivado de anticorpo é expresso a partir de um transgene transportado por um vetor retroviral adequado. A terapêutica génica celular adotiva conduz a expressão localizada e secreção do scFv anti-TNFa. Smith et al. (2003) demonstraram que os scFvs derivados de um anticorpo monoclonal neutralizador de TNFa (i) pode neutralizar TNFa in vitro e (ii) alterar o padrão de expressão da citocina em ratinhos que sofrem de artrite induzida por colagénio localmente nas articulações, mas não sistemicamente. Em alternativa, a injeção sistémica direta ou local de vetores adequados (por exemplo, vírus) 43 que permite a expressão contínua de um anticorpo scFv anti-TNFa, é considerada como outra abordagem de terapêutica génica possível.

As sequências reveladas são as seguintes:

SEQ ID N°: 1 VL de TB-A

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKR

SEQ ID N°: 2 VH de TB-A

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGL EWMGWI NT YTGEPTYADKFK DR FT FSLETSASTVYME LT SLT S DDTAVY YCARERG D AMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 3 VL de TB-B

Dl VLTQS PSSLSAS VG DRVTLTCTASQSVSN DWW YQQRPGKAPK RLIY S AFNRYTGV PSRFSG SG SGTE FTLTISSLQPE DVAVYYCQQDYN S PRT FGQGT KLEVKR

SEQ ID N°: 4 VH de TB-B

QVQLVQSGAEVKKPGAS VKVSCTASG Y S FTHYGMNW V RQA PGQG L EWMGW I NT YTGE PT YA ÒKFK DRVT LTRDT SIGT V Y MELT S LTS DDTAVY YCARERG D AMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 5 VL de FW2.3

Dl VLTQS PSSLSASVGDRVTLTCRASQGXRNELAW YQQRPGKAPK RLIYAGSILOSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGT KLEVKR SEQ ID N°: 6 VH de FW2.3

QVQLVQSG AEVKKPGAS VKVSCTASG YSFTGYFLHWVRQAPGQGL EWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRG TYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 7 VL de TB_L2

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK

LLIYAGSILQSGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT

KLEVKR SEQ ID N°: 8 VL de TB_L3

Dl VMTQS PS SLSAS VG DRVTLTCTASQS VSN DWW YQQR PGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGT KLEVKR 44 SEQ ID N°: 9 VH de TB_H2

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGL EWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGD AMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 10 Linker GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID N°: 11 VL de TB-B R46L

DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRT FGQGT KLEVKR

SEQ ID N°: 12 TB-AB

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAFK LLI YSÀFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLn S SLQPEDVAVYYCQQDYNSPRT FGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQIVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTH YGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADK FKDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTS DDTAVYYCARE RG DAMD Y WGQGTLVTVS S

SEQ ID N°: 13 TB-BA

DIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK RLIYSAFNRYTG.VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVY YCARERG DAM DYWGQGT LVTVS S SEQ ID N°: 14 Ck de Fab

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC SEQ ID N: 15 CHI de Fab

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFSEPVTVSWNSGA

LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS

CTS SEQ ID N°: 16 VL de TB-wt

Dl VMTQT PKFLLVS AGDRVTITCTASQSVSN DWWYQQKPGQS PK MLMYSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGT KLEIKR

SEQ ID N°: 17 VH de TB-wt QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMNWVKQAPGKGL KWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVFLQINNLKNEDTATYFCARERGD AMDYWGQGTSVTVSS 45

SEQ ID N°: 18 TB-A H_K43Q, também designado TB-A H43 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK

LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERG DAMD YWGQGT LVTVS S SEQ ID N°: 19 TB-A H_F68V, também designado TB-A H68

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK

LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT

KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH

YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRVTFSLETSASTVYMELTSLTS

DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 20 TB-A H_F70L/L72R, também designado TB-A H70/72

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK

LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT

KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH

YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTLSRETSASTVYMELTSLTS

DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 21, TB-A H_A7 61/S77G, também designado TB-A H76/77

Dl VMTQS P S S LSAS VG DRVTLTCTASQS VS N DVVW YQQRPGKAPK LLIYSAFHRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNW VRQAPGKGLEWMGWINT YTGE PT YADKFKDRFTFS LET SIGTVYME LT S LTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 22 TB-A L L46R, também designado TB- A L46

DX VMTQS PS SLS ASVG DRVTLTCTASQSVSNDWW YQQRPGKAPK RLIY S AFM RYTGV PSRFS GRGYGT DFTLTISSLQPE DVAVY YCQQDYNS PRT FGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS 46

SEQ ID N°: 23 TB-A L_R65S, também designado TB A L65

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLrYSAFNRYTGVPSRFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGE PT YADKFKDRFT FSLETSASTVYMELT SLTS DDTAVY YCARERGDAM DYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 24 TB-A L_Y67S, também designado TB A L67

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIY SAFNRYTGVPSR FSGRGSGT DFTLTISSLQPE DVAVYYCQQDYN SPRT FGQGT KLEVKRGGGGSGGGG SGGGGSGGGG SQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASG YT FTH YGMNWVRQAPGKGLEWMGW INTYTGE PTYADK FKDRFT FSLET SASTVYME LTS LTS DDTAVY YCARERGDAM DYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 25 VH de TB-A com D66G QVQLVQSGAEVKKPGASVKV5CTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGL

EWMGWINTYTGEPTYADKFKGRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGD

AMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 26 VL de TB-A com V83F DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDAAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKR

SEQ ID N°: 27 VL de TB-A com V83A DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDAAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKR

SEQ ID N°: 28 VH de TB-A H43/70/71/73/77 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGQGL EWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTLTLDTSAGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGD AMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 29 VH de TB-A H43/70/71 QVQLVQSGAE VKKPGAS VKVSCT AS G YT FT H YGMNWVRQAPGQGL

EWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTLTLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGD

AMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 30 VH de TB-A

Hl1/16/43/66/70/71/73/77/93/112

QVQLVQSGAE DKKPGGS VKVSCTASGYT FTH YGMNWVRQAPGQGL

EWMGWI NTYTGE PTYADK FKGR FTLT LDTSAGTVYMELTS LTS DDTAT Y YCARERG D AMDYWGQGTSVTVSS 47

SEQ ID N°: 31 TB-A Η M4 8L/F68I

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK

LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT

KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH

YGMNWVRQAPGKGLEWLGWINTYTGEPTYADKFKDRITFSLETSASTVYMELTSLTS

DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 32 TB-A L_V83E H_V7 9A

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIY SAFNRYTGVPSR FSGRGY GT DFTLTIS S LQ PE DEAVY YCQQDYNS PRT FGQGT KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNWVRQA PGKGLEWMGWINTYTGE PTYA DKFK DRFT FS LETSASTAYME LTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 33 TB-A Linker_G2R H_F68L DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK

LLI YSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVY YCQQDYNS PRTFGQGT KLEVKRGRGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH

YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRLTFSLETSASTVYMELTSLTS

DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 34 TB-A H_K43R/F68I

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK

LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT

KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH

YGMNWVRQAPGRGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRITFSLETSASTVYMELTSLTS

DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 35 TB-A H_F68L

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTOFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT KLEVKRGGGGSGGGG S GGGG SGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGAS VKVSCTASG YT FTH YGMNW VRQAPGKGLE WMGWINTYTGE PT YADK FKDRLT FS LETSASTVYMELT S LTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID N°: 36 TB-A H_F68A

DIVMTQS PS S L SAS VG DRVTLTCTASQSV SNDWWYQQR PG KAPK LLI YS AFNRYTGVPS R FSGRGYGTDFTLTIS S LQPE DVAVY YCQQDYNS PRT FGQGT KLEVKRGGGGS GGGG SGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYT FTH YGMNWVRQAPGKGLE WMGWINT YTGE PT YADK FKDRAT FS LET SASTVYMELT S LTS DDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSS 48

SEQ ID N°: 37 TB-A H_F68V/F70L

DIVMTQSPSSLSASVGDHVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAFK

LIIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGT

KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH ygmnwvrqapgkglewmgwintytgeptyadkfkdrvtlsletsastvymeltslts

DDTAVY YCARERG DAM DYWGQGTLVTVS S

SEQ ID N°: 38 TB-A H_F70L

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDWWYQQRPGKAPK LLIYSA FNRYTGVPS R FSGRG YGT DFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQG1 KLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYTFTH YGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTLSLETSASTVYMELTSLTS DDTAVYYCARERGDAMDYMGQGTLVTVSS SEQ ID N°: 39 Linker G2R GRGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID N°: 40 TB-A

Dl VMTQS PS S L SAS VGDRVTLTCTASQSVSN D WW YQQRPGKAPK lliysafnrytgvpsrfsgrgygtdftltisslqpedvavyycqqdynsprtfgqgt

klevkrggggsggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsctasgytfth Y GMNWVRQA PGKGLEWMGWINTYTGE PTYADKFKDRFTFS LETSASTVYMELTSLTS DDTA VY Y C AR ERGDAMD Y WGQGTLVT V S S A invenção será melhor entendida por referência aos exemplos seguintes. Estes não devem, contudo, ser interpretados como limitantes do âmbito da invenção. Experiência 1: Construção de anticorpos scFv O material de partida para a geração de anticorpos anti-TNFa humano humanizados ou derivados de anticorpos, tais como fragmentos de cadeia simples (scFv) ou fragmentos Fab, foi o anticorpo monoclonal murino Di62. As sequências da região variável da cadeia leve e da cadeia pesada são reveladas em Dõring et al. (1994, Mol. Immunol. 31:1059- 1067j_. As propriedades deste anticorpo monoclonal também são discutidas na mesma publicação. Resumindo, Di62 liga-se especificamente ao TNFa humano numa maneira dependente da concentração. É um anticorpo de alta afinidade (Kd = 0,4nM) e pode bloquear a ligação de TNFa ao seu recetor. Além disso, Di62 inibe a citotoxicidade induzida por TNFa humano 49 em células L929 de ratinho.

Com base na sua sequência publicada Di62 foi construído na forma de um derivado de anticorpo de cadeia simples (scFv) na orientação VL-Iinker-VH, na qual a sequência do linker é composta por quatro repetições de quatro resíduos de glicina e um de serina (Gly4Ser)4. Aqui, este scFv é referido como TB-wt, com uma VL de SEQ ID N° 16 e uma VH de SEQ ID N° 17.

Para humanizer este derivado de anticorpo com o fim de а) torná-lo mais semelhante às sequências humanas de modo a minimizar a imunogenicidade potencial, e b) torná-lo mais estável e solúvel, as sequências CDR TB-wt foram enxertadas em estruturas humanas estáveis e solúveis (Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224). O subgrupo I VL-kapa humano e subgrupo I VH foram identificados como os mais próximos da subfamília humana. A estrutura acetora apropriada foi escolhida a partir de um grupo de sequências VL e VH humanas, selecionadas pelas propriedades bioquímicas e biofísicas vantajosas, tais como, por exemplo, propriedades de estabilidade, solubilidade, e expressão (Auf der Maur, et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Auf der Maur, et al. (2004), Methods 34:215-224). O isolamento e propriedades destas estruturas de anticorpo são descritas nos documentos WO03097697/EP1506236. Deste grupo, foi identificada uma estrutura de anticorpo de cadeia simples com propriedades de ligação ao antígeno indefinidas como o acetor adequado. Este acetor consiste num domínio VL-kapa I humano (SEQ ID N° 5) em combinação com um domínio VHI humano (SEQ ID N° б) . Aqui, esta estrutura acetora é referida como FW2.3. Entre os resíduos da estrutura VL 81, TB-wt e FW2.3 partilham 55 resíduos de aminoácidos idênticos, que constitui até 67% de identidade. Entre os resíduos da estrutura VH 87, TB-wt e FW2.3 têm 55 resíduos idênticos, correspondendo a 63% de identidade. Ambos derivados de 50 anticorpos de cadeia simples têm comprimentos de CDR idênticos, com exceção de VH-CDR3, que é mais comprida em FW2.3.. A composição de aminoácidos dentro dos residuos de CDR é diferente para ambos scFvs. São descritos vários métodos para a humanização dos domínios variáveis do anticorpo (Riechmann et al. (1998), Nature 332:323-327; Padlan, E. A. (1991). Mol. Immunol. 28:489-498; Roguska et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 969-973;

Gonzales et al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43; Ewert, S., et al. (2004), Methods 34:184-199). A abordagem mínima, nomeadamente a transferência conservadora de todos os laços CDR de ratinho a partir de TB-wt para FW2.3 foi realizada primeiro. O scFv resultante é referido como TB-B e tem a sequência VL de SEQ ID N° 3 e a sequência VH de SEQ ID N° 4. Os laços CDR em TB-wt foram definidos de acordo com o esquema de numeração de Kabat (Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, Natl. Inst. Health, Bethesda, MD) e confinam os seguintes resíduos (ver Figura 1):

VL CDR1: L24-L39 (mesma numeração Kabat) CDR2: L50-L56 (mesma numeração Kabat) CDR3: L89-L97 (mesma numeração Kabat)

VH CDRl: H31-H35 (mesma numeração Kabat) CDR2: H50-H66 (numeração Kabat H50-H65) CDR3: H99-H106 (numeração Kabat H95-H102).

Este anticorpo foi incapaz de se ligar eficientemente a TNFa (Fig. 4A) . A etapa seguinte foi determiner que resíduo ou resíduos destes componentes deveriam ser substituídos para otimizar as propriedades do anticorpo humanizado resultante.

Uma vez que a substituição dos resíduos de aminoácidos humanos com outros aminoácidos deveria ser minimizada, por causa da introdução de sequências de aminoácidos 51 estrangeiras, aumenta o risco de imunogenicidade do anticorpo ou derivado de anticorpo em humanos (Gonzales et al. (2005), Tumor-Biol. 26:31-43), foram construídas diversas variantes. Uma dessas variantes - aqui referida como TB-B L46 (VL SEQ ID N° 11; VH SEQ ID N° 4) foi construída com o objetivo de minimizar o risco de ser imunogénica mas ainda mostrar atividade de ligação suficiente. Esta variante é baseada em TB-B e contém uma única alteração de aminoácido na posição 46 em VL, nomeadamente R->L. Este aminoácido está localizado no núcleo superior da cadeia leve e faz parte da interface do dimero. Está envolvido na definição da conformação de L-CDR1 e tem uma influência no empacotamento de VH/VL. Foi reportado que um resíduo de leucina é favorecido nesta posição particular (documento PCT/US03/19333). Ao contrário de TB-B, o scFv TB-B L46 retém alguma ligação específica ao TNFa (Fig. 4A; Kd « 100 nM) .

De modo a melhorar ainda mais a atividade de ligação ao TNFa, foram feitas uma ou mais alterações adicionais em um ou mais resíduos de VL 4, 46, 65, 67, 70, e/ou resíduos de VH 28, 43, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77. Aqui, a variante com alterações em todas as posições é referida como TB-A (VL SEQ ID N° 1; VH SEQ ID N° 2).

Além disso, em relação a anticorpos anti-TNFa particulars da presente invenção, os ensaios de competição com péptidos derivados a partir de L-CDR1 e L-CDR2 mostraram que ambos laços CDR são importantes para a ligação do scFv ao antígeno (Dõring et al. (1994), Mol. Immunol. 31:1059-1067).

Em experiências adicionais dirigidas a minimizar o número de resíduos não-humanos necessaries para reter a ligação e para otimizar as propriedades biofísicas (estabilidade e solubilidade), foi aplicada mutagénese sistemática e mistura de domínio permitindo elucidar as diferenças funcionais entre os domínios VL e VH humanizados 52 e de ratinho.

Foram obtidas duas variantes por mistura de domínios. A primeira variante é composta pelo domínio VL a partir de TB-A ligado através de um linker de glicina serina (SEQ ID N° 10) com o domínio VH de TB-B, resultando em TB-AB (SEQ ID N° 12) . A segunda variante, TB-BA, é o reverso da primeira variante, nomeadamente, o domínio VL de TB-B em combinação com o domínio VH de TB-A (SEQ ID N° 13).

Foram geradas variantes adicionais por mutagénese sistemática de TB-A. A Fig. 1 mostra uma comparação de sequência das sequências de VL e VH de TB-A e TB-B. Um total de 14 resíduos de estrutura diferem entre TB-A e TB-B (asteriscos). Apenas cinco deles, os resíduos VL 4 e 70, e resíduos VH 28, 71, e 73 mostram apenas diferenças menores em tamanho e propriedade e, por isso, não foram considerados para mutagénese, neste ponto. As seguintes posições de estrutura foram substituídas com os aminoácidos correspondentes de TB-B. Estes mutantes simples ou duplos de TB-TB-A A são como se H43 K->Q segue interface (SEQ ID N° 18) TB-A H68 F->V VH laço externo (SEQ ID N° 19) TB-A H70/72 F-»L, L->R VH laço externo (SEQ ID N° 20) TB-A H76/77 A-»I, S->G VH laço externo (SEQ ID N° 21) TB-A L46 L->R interface (SEQ ID N° 22) TB-A L65 R->S VL laço externo (SEQ ID N° 23) TB-A L67 Y->S VL laço externo (SEQ ID N° 24)

Muitos fatores podem influenciar a imunogenicidade de um anticorpo ou derivado de anticorpo (Gonzales et al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43). Para reduzir ainda mais o conteúdo não-humano das regiões variáveis do scFv TB-A humanizado, os laços CDR2 e CDR3 murinos de VL e o laço CDR2 murino de VH foram trocados com os laços CDR humanos correspondentes de FW2.3. As construções resultantes aqui são referidas como TB_L2 (SEQ ID N° 7), TB_L3 (SEQ ID N° 8), e TB H2 (SEQ ID N° 9), respetivamente. 53

Os ADNc que codificam a versão de cadeia simples murina do anticorpo monoclonal Di62, e as duas versões humanizadas TB-B e TB-A foram gerados por sintese génica (www.genscript.com). Todas as mutações pontuais nas outras variantes (TB-B L46, TB-A H43, TB-A H67, TB-A H69/71, TB-A H75/76, TB-A L46, TB-A L65, TB-A L67, TB-A V83F, TB-A V83A, TB-A D66G) foram introduzidas por mutagénese sitio-dirigida motivada por PCR seguida de procedimentos de clonagem convencionais. A troca dos laços CDR murinos de TB-A com os laços CDR humanos de FW2.3 foi conseguida utilizando PCR e procedimentos de clonagem de topo da arte. 0 ADNc que codifica todas as variações TB-A de VH, conforme revelado na SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 29, e SEQ ID N° 30, foi realizado por sintese génica completa.

Alguns TB-A adicionais preferidos são revelados nas SEQ ID N° 31 à SEQ ID N° 38. Verificou-se que estes anticorpos são particularmente estáveis e solúveis, conforme mostrado a seguir no Quadro I.

Todos os fragmentos scFv foram clonados num vetor de expressão para produção periplasmática em E. coli (Krebber et al. (1997), J. Immunol. Methods 201:35-55).

Além dos derivados de anticorpos de cadeia simples (scFvs) descritos anteriormente, os fragmentos Fab correspondentes foram gerados como se segue. Os domínios variáveis de cadeia leve (VL) selecionados foram fundidos com a região constante de uma cadeia kapa de Ig humana, enquanto os domínios variáveis de cadeia pesada (VH) adequados foram fundidos com o primeiro (N-terminal) domínio constante (CHI) de uma IgG humana. Ambos domínios constantes humanos foram amplificados por PCR a partir de uma biblioteca de ADNc de baço humano e resultaram na sequência SEQ ID N° 14 para CK- e SEQ ID N° 15 para CHI. Experiência 2: Expressão, produção e estabilidade de anticorpos scFv ou Fab humanizados

Os plasmídeos que codificam TB-wt, os seus derivados 54 humanizados, ou fragmentos Fab foram introduzidos numa estirpe adequada de E. coli (por exemplo, JM83) para expressão periplasmática. As variantes scFv também foram expressas como corpos de inclusão, por exemplo, na estirpe BL21 de E. coli. Anticorpos de cadeia simples funcionais foram obtidos por redobragem de corpos de inclusão e subsequente purificação por, por exemplo, filtração por gel.

Os rendimentos da expressão no momento da expressão periplasmática dos scFvs oscilaram entre 0,5 mg até 12 mg por litro de cultura em condições de cultivo de laboratório padrão (dYT médium, com aproximadamente 3 horas de tempo de indução a 30°C, agitação a 200 rpm) com frascos de agitação convencionais. Em geral, observámos que, como esperado da nossa análise prévia de estruturas selecionadas para estabilidade e solubilidade (Auf der Maur, et al. (2004), Methods 34:215-224), quanto mais próxima uma sequência de um derivado humanizado está da sequência da estrutura acetora (FW2.3), maior o rendimento obtido no momento da expressão em bactérias. Por exemplo, o rendimento obtido da expressão de TB-B é substancialmente superior ao obtido da expressão de TB-A. De acordo com estes resultados, reduzir o número de residuos de aminoácidos diferentes presentes em TB-A teve um efeito positivo nos rendimentos de expressão (Fig. 3A) . Outra caracteristica importante dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção é a sua solubilidade. A Fig. 3B mostra a superioridade da estrutura TB-A sobre a estrutura dadora (TB-wt) em termos de solubilidade em solução salina tamponada com fosfato. Na filtração por gel analítica, TB-A migra predominantemente num estado monómero (pico a 70 ml), ao passo que TB-wt mostra uma forte tendência para formar agregados (pico a 50 ml) . Além disso, a solubilidade máxima de TB-A e certos derivados do mesmo foi avaliada por precipitação PEG (Athat DH. et al. JBC. 1981, 256; 23. 12108-12117). Resumindo, a 55 solubilidade aparente das proteínas teste foi medida na presença de polietilenoglicol 3000 (PEG3000). As curvas de solubilidade foram determinadas medindo a concentração de proteína no sobrenadante de misturas proteína-PEG300 centrifugadas. Todas as curvas mostraram uma dependência linear do log S (mg/ml) na concentração de PEG3000 (%, p/v) . A solubilidade máxima (Smax) de uma proteína teste foi estimada por extrapolação da regressão linear em direção a towards 0% PEG (Quadro I) . Para TB-A foi Smax calculada como sendo cerca de 70 mg/ml. Todas as proteínas teste mostraram solubilidade excecionalmente boa. Numa segunda abordagem, foi aplicado um método designado cromatografia de auto-interação (SIC) para avaliar a atração/repulsão intermolecular de TB-A (SEQ ID N° 40), TB-A Linker_ G2R H_F68L (SEQ ID N° 33), TB-A H_K43R/F68I (SEQ ID N° 34) e TB-A H_F68L (SEQ ID N° 35) a uma concentração de 1 mg/ml em PBS (50 mM fosfato pH 6,5, 150 mM NaCl) . Neste método a proteína de interesse é imobilizada numa fase estacionária porosa e embalada numa coluna. As interações entre a proteína livre (fase móvel) e imobilizada são detetadas como alterações no volume de retenção. O coeficiente de segundo virião osmótico da proteína B22, gue é uma medida para a atração/repulsão intermolecular, foi calculado de acordo com Tessier, PM et al.. Biophys. J. 2002, 82: 1620- 1632 (Quadro I) . Quanto mais positivo B22, menor a atração intermolecular da proteína teste e, por isso, maior a sua solubilidade. Devido à alta semelhança das sequências da proteína teste foi assumido que os valores de B22 das diferentes proteínas podem ser diretamente comparados uns com os outros.

Quadro I: Características de solubilidade de derivados de TB-A

Sequência pi LOÇ Smax Valor B22 (SIC) TB-A 7,8 1,84 ± 0,13 -24,5xl0~4 ± 3, 8xl0"4 TB-A H M48L/F68I 7,8 nd nd 56

Sequência pi LOÇT Smax Valor B22 (SIC) TB-A L V83E H V79A 6, 58 nd nd TB-A Linker G2R H F68L CM V 00 1,91 ± 0,09 l,59xlO~J ± 5,9x10" 5 TB-A H_K43R/F68I 7,8 1,86± 0,02 1,28x10~J ± 3,0x10" 4 TB-A H_F68L 7,8 1,88 ± 0,07 1, 06xl0"4 ± 2, 9x10" 5 TB-A H F68A 7,8 nd nd TB-A H F68V/F70L 7,8 nd nd TB-A H F70L 7,8 nd nd

Ainda outra característica relevante dos anticorpos ou derivados de anticorpos da presente invenção é a sua alta estabilidade. A estabilidade proteica de TB-A, TB-A H_M48L/F681 (SEQ ID N° 31), TB-A Linker_G2R HF68L (SEQ ID N° 33), TB-A EMK43R/F68I (SEQ ID N° 34) e TB-A H_F68L (SEQ ID N° 35) foi avaliada determinando a temperatura para inicio da desdobragem por dicroismo circular e dispersão de luz a 218 e 292 nm (Quadro II) . Nesta experiência TB-A começar por desdobrar a uma temperatura de 53°C, enquanto os seus derivados TB-A HM48L/F68I (SEQ ID N° 31) , TB-A Linker_ G2R H_F68L (SEQ ID N° 33), TB-A HK43R/F6BI (SEQ ID N° 34) e TB-A H_F68L (SEQ ID N° 35) mostraram estabilidade térmica aumentada (56 e 58°C). Todas as proteínas teste mostraram desnaturação irreversível precipitaram no momento da desdobragem, tornando impossível determinar a temperatura de fusão. De modo a determinar o ponto médio da transição num processo reversível, a desdobragem foi induzida com cloridrato de guanidina (GdnHCl) , mas manter as proteínas desdobradas em solução. Nesta abordagem, os máximos de emissão de fluorescência forma determinados por fluorimetria para seguir o desdobramento. Neste cenário, TB-A mostrou de novo boa estabilidade com um ponto médio de transição a 2,07 M GdnHCl. Na linha dos resultados obtidos com o desdobramento térmico os derivados TB-A Linker_G2R H_F 6 8 L (SEQ ID N° 33) e TB-A H_K43R/F68I (SEQ ID N° 34) mostraram estabilidade aumentada, conforme exibido com 57 pontos médios de transição superiores, 2,33 e 2,3 M GdnHCl, respetivamente.

Quadro II: Caracteristicas de estabilidade de derivados de TB-A SEQ Inicio da desnaturação [°C] [GdnHCl] no ponto médio da transição TB-A 53 2,07 M TB-A H M48L/F68I 58 nd TB-A L V83E H V7 9A nd nd TB-A Linker G2R H F68L 58 2,33 M TB-A-QC15,2 56 2,30 M TB-A-QC23,2 58 nd TB-A-H F68A nd nd TB-A H F68V/F70L nd nd TB-A H F70L nd nd A estabilidade de TB-A no soro humano, urina humana, fluido corporal vitreo de porco e fluido da câmara anterior de porco foi ensaiada medindo a atividade de ligação ao TNFa de TB-A pós incubação durante 3 dias a 37°C no fluido corporal respetivo ou num tampão de ensaio (TBSTM) como um controlo positivo. 0 TB-A foi diluido em fluidos corporais para uma concentração final de 10 mM. Após o periodo de incubação, foram ensaiadas séries de diluições das amostras por ELISA de modo a determinar a constante de ligação Kd de TB-A (Fig. 11) . Quando se comparam amostras de fluidos corporais com as amostras de controlo positivo TBSTM, uma alteração da Kd em direção a concentrações superiores indicaria uma diminuição da proteina ativa durante o periodo de incubação. Nas nossas experiências, contudo, não foi detetada qualquer alteração, indicando que a quantidade de TB-A completamente ativa permaneceu constante em cada ensaio de fluido corporal devido a uma alta estabilidade do anticorpo. 58

Experiência 3: Caracteristicas de ligação de derivados de anticorpos humanizados

As propriedades de ligação de todas as variantes scFv humanizadas foram testadas em ELISA em TNFa humano recombinante. As constantes de dissociação (Kd) para todas as variantes cairam num intervalo de 0,8 ta mais de ΙΟ,ΟΟΟηΜ. Parece existir uma correlação reversa entre o grau de homologia com a estrutura acetora humana e a afinidade do linker respetivo (Fig. 4A). Ainda assim, algumas variantes TB-A contendo mutações em direção à sequência TB-B mostram niveis de afinidade em relação ao TNFa humano qu são comparáveis com as de TB-A. A Fig. 4B mostra dois derivados melhorados de rendimento de expressão de Tb-a (comparar com Fig. 3A) que exibem afinidades semelhantes que o TB-A quando comparados em ELISA. TB-A representa um bom compromisso entre a troca aparente do rendimento de expressão e afinidade. Em termos de afinidade, não foi detetada qualquer diferença significativa entre o formato cadeia simples e fragmento Fab do TB-A (dados não mostrados). A afinidade por TNFa e cinética de ligação também foram determinados para TB-A por ressonância de plasmon de superfície (BIACore), resultando numa constante de dissociação Kd = 0,8 nM, uma taxa off de koff = 4,4 x 10~4s_1 e uma taxa on de kon = 5 x 105s_1M_1.

Experiência 4: Ensaio de citotoxicidade de L929 A função dos anticorpos ou derivados de anticorpos em neutralizar TNFa in vivo pode ser testada medindo a inibição da cytotoxicidade do TNFa em relação a fibroblastos L929 de ratinho cultivados ou, em alternativa, em relação a células de mielossarcoma de KYM-1 humano (Quadro III). Os derivados scFv humanizados de Di62 exibem diferentes eficácias no ensaio L929 conforme mostrado na Fig. 5B. Alguns derivados scFv mostram valores de IC50 (concentração inibidora para atingir 50% de inibição) no 59 intervalo de 5 ng/ml, ao passo que outros não tiveram efeito nos ensaios L929. Os dados e resultados de ELISA do ensaio L929 nem sempre se correlacionam. Os dados KYM-1 e resultados L929, contudo, correlacionam-se muito bem com a única diferença de que concentrações muito mais elevadas de TNF humano recombinante e, consequentemente também do antagonista, eram necessárias para observar um efeito. KYM-1 foi, por isso, principalmente utilizado para confirmar os resultados L929. Para comparação direta das proteínas teste, a potência é expressa como um valor relativo normalizado para TB-A (EC5oX / EC50TB-A) . Em geral, contudo, os valores de IC50 tornam-se de novo mais altos quanto mais próxima a sequência de um linker estiver da estrutura acetora humana (FW2.3). A Fig. 5 compara a potência de diferentes derivados de TB-A para bloquear a citotoxicidade induzida por TNFa em relação a células de fibroblasto L929 de ratinho. A absorção a 450nm está correlacionada com a sobrevivência das células. TB-A e a IgG anti-hTNFa Infliximab® mostram um valor de IC50 semelhante no ensaio L929, ao passo que a potência de TB-wt para bloquear a citotoxicidade induzida por TNFa humano é significativamente inferior (Fig. 5A) . Quando os derivados de TB-A são comparados com TB-A pelo seu potencial em bloquear a citotoxicidade induzida por TNFa, a maioria dos derivados exceto TB-H43 têm uma eficácia reduzida no L929 (Fig. 5B).

Quadro III; Propriedades funcionais de derivados de TB-A SEQ Potência relativa: EC50X / EC50TB-A Células L929 Células KYM-1 TB-A 1,0 1,0 TB-A H M48L/F68I 1,1 1,6 TB-A L V83E H V7 9A nd nd 60 SEQ Potência relativa: EC50X / EC50TB-A Células L929 Células KYM-1 TB-A Linker G2R H F68L ~~ 0,8 1,3 TB-A-QC15,2 1,37 1,5 TB-A-QC23,2 1,32 1,5 TB-A-H F68A 1,14 nd TB-A H F68V/F70L 1,28 nd TB-A H F70L 2,7 nd

Na linha com os dados de ELISA, não existe uma diferença significativa na capacidade para bloquear a citotoxicidade induzida por TNFa entre o formato scFv e Fab de TB-A (Fig. 5C) . O valor de IC50 do formato TB-A Fab cai cerca de um fator de dois acima do valor de IC50 do formato TB-A scFv (Fig. 5C), muito provavelmente como resultado da massa molecular superior do fragmento Fab.

Experiência 5. Experiências animais com derivados de anticorpos anti-TNFa 5.1. Descrição da experiência

De modo a testar a eficácia dos derivados de anticorpos anti-TNFa de ESBATech (scFv e Fab) em neutralizar funcionalmente a bioatividade do TNFa humano nuam situação in vivo, foi utilizado um modelo de ratazana recentemente publicado para monoartrite aguda. Este modelo foi descrito exaustivamente por Bolon e colaboradores (ver Bolon et al. (2004), Vet. Pathol. 41: 235-243). Resumindo, neste modelo animal de artrite, o TNFa humano é injetado intra-articularmente na articulação dos joelhos de ratazanas macho Lewis. A injeção de TNFa humano conduz a uma monoartrite aguda, auto-limitante na articulação injetada. A artrite pode ser quantificada medindo o inchaço da articulação e por classificação histológica. Consequentemente, a bioatividade dos respetivos antagonistas de TNFa pode ser quantificada por redução do 61 inchaço da articulação induzido por TNFa e/ou redução dos parâmetros histológicos da inflamação. 5.2. Materiais e Métodos Desenho Experimental

Os estudos atuais foram desenhados para examinar o potencial respetivo de um anticorpo scFv representativo e de um anticorpo Fab representativo da série descrita anteriormente com o anticorpo comercializado Infliximab (Remicade®) para inibir a bioatividade do TNFa humano num modelo animal de artrite apropriado. Bolon e colaboradores tinham mostrado previamente que a aplicação intra-articular de 10 microgramas de TNFa humano recombinante na articulação do joelho da ratazana provoca uma monoartrite aguda, auto-limitante que pode ser quantificada por análise macroscópica e microscópica padrão. Assim, este modelo animal serviu como um sistema ideal para avaliar o efeito terapêutico de derivados de anticorpos localmente aplicados. Duas experiências foram completadas em série (Quadros IV e V) . 1) Um estudo de eficácia básico que avalia o potencial global dos anticorpos para bloquearem a monoartrite induzida pelo TNFa humano; e 2) Um estudo de dose resposta que avalia a eficácia relativa dos derivados de anticorpos uns em relação aos outros. Ambos, citocinas e derivados de anticorpos, foram dados uma vez por injeções separadas, conforme descrito a seguir. A dose de citocina utilizada foi baseada na publicação por Bolon e colaboradores, ao passo que o intervalo de doses dos derivados de anticorpos foi baseado nos dados de cultura de células disponíveis e suposições fundamentadas. As experiências foram conduzidas de acordo com as diretivas de bem-estar animal gerais.

Animais e maneio

Ratazanas Lewis macho, jovens e adultas, (6-7 semanas e 175-200g) foram atribuídas aleatoriamente a grupos de tratamento (n=3/cohorte) e alojadas de acordo com Bolon et 62 al. (2004), Vet. Pathol. 41:235-243.

Citocina e instilação de anticorpo A anestesia e injeções de citocina foram realizadas conforme descrito por Bolon e colaboradores. De modo a não exceeder um volume total injetado intra-articularmente de 50 microlitros, as citocinas e derivados de anticorpos foram instilados em duas injeções intra-articulares separadas em que 10 microgramas de TNFa humano recombinante foi injetado em 10 microlitros de solução salina tamponada com fosfato esterilizada filtrada (PBS) e a dose respetiva do anticorpo respetivo foi injetada em 40 microlitros de solução salina tamponada com fosfato esterilizada filtrada. Os animais tratados com Infliximab/Remicade® aplicado intraperitonealmente foram injetados por via i.p. com os derivados de anticorpos 3 horas antes da injeção intra-articular do TNFa humano. Em todos os animais tratados com tratamentos de anticorpo aplicados intra-articularmente, a dose do respetivo anticorpo foi injetada 5 minutos antes da injeção do TNFa humano. Os animais controlo foram injetados com 10 microlitros de PBS sem TNFa humano. O Infliximab/Remicade® utilizado nas experiências foi comprado numa farmácia Suiça oficial. Anticorpos scFv e Fab específicos de anti-TNFa humano (TB-A) bem como uma estrutura de anticorpo scFv ingénua utilizada como anticorpo controlo inespecífico na experiência de dose resposta foram expressos em E. coli e purificados por métodos convencionais. A contaminação por endotoxina foi mantida abaixo dos 10 EU por miligrama de proteina em todas as preparações porque a componente lipopolissacarídica é um indutor potente de TNFa. O TNFa humano recombinante foi comprador da PeproTech EC Ltd.

Medição do diâmetro da articulação

Imediatamente antes da injeção do respetivo derivado de anticorpo aplicado intraperitonealmente ou intra- 63 articularmente ou, nos caso dos animais controlo, antes da injeção de PBS ou TNFa, o diâmetro da articulação do joelho a ser injetado foi determinado através de um calibre padrão. 48 horas após a injeção de TNFa (ou PBS nos animais controlo) e imediatamente antes da eutanásia dos animais, o diâmetro da articulação do joelho injetado foi determinado de novo e o inchaço da articulação foi calculado subtraindo o valor da segunda medida do diâmetro do valor da primeira medida do diâmetro (Fig. 6 e 9).

Processamento do tecido 48 horas após a injeção de TNFa (ou PBS no caso dos animais controlo) os animais foram eutanasiados. Na necropsia, os joelhos injetados foram separados do pé e coxa, fixados intactos por imersão em etanol a 70% e processados para coloração padrão por hematoxilina e eosina (HE), conforme descrito por Bolon e colaboradores.

Análise morfológica A análise de classificação histológica para medição da inflamação da articulação foi realizada conforme descrito por Bolon e colaboradores. Os critérios de classificação histológica para avaliação da inflamação da articulação foram aplicados de acordo com Bolon e colaboradores (Fig. 7, 8 e 10) . 5.3. Resultados

Num primeiro conjunto de experiências um anticorpo scFv de ESBATech representativo aplicado intra-articularmente, TB-A, e o anticorpo Fab de ESBATech correspondente aplicado intra-articularmente foram comparados pela sua capacidade em bloguear a indução de monoartrite aguda com Infliximab/Remicade® aplicado intra-articularmente e intraperitonealmente de acordo com o Quadro IV: 64

Quadro IV: Esquema de injeção da experiência 1 GRUPO TNFa (mg) em PBS INIBIDOR DOSE (mg) 1 (n=3) 0 nenhum 2 (n=3) 10 nenhum 3 (n=3) 0 TB-A scFv 180 4 (n=3) 10 TB-A scFv 180 5 (n=3) 0 Anticorpo TB-A Fab 450 6 (n=3) 10 Anticorpo TB-A Fab 450 7 (n=3) 10 Anticorpo TB-A Fab 180 8 (n=3) 0 Infliximab (i.a.) 450 9 (n=3) 10 Infliximab (i.a.) 450 10 (n=3) 10 Infliximab (i.a.) 180 11 (n=3) 10 Infliximab (i.p.) 450 12 (n=3) 10 Infliximab (i.p.) 180

Os resultados obtidos em relação aos efeitos do tratamento na alteração do diâmetro do joelho (como um indicador dos efeitos no inchaço na articulação induzido por TNFa) estão representados na Fig. 6. Todos os anticorpos bloquearam completamente o inchaço na articulação induzido por TNFa.

Para avaliação dos efeitos dos tratamentos na inflamação da articulação, foi realizada a classificação histológica de lâminas de tecido tingidas com HE. A inflamação da articulação foi classificada de acordo com os critérios seguintes (ver Fig. 7 para exemplos de classificação representativos):

Classificação 0: normal

Classificação 1: espessamento leve do revestimento sinuvial Classificação 2: espessamento do revestimento sinuvial e inflamação leve do subrevestimento

Classificação 3: espessamento do revestimento sinuvial e e inflamação moderada do subrevestimento

Os resultados obtidos em relação aos efeitos do tratamento nas classificações da inflamação histopatológica são mostrados na Fig. 8.

Foram observados efeitos comparáveis de todos os tratamentos nas classificações da inflamação 65 histopatológica.

Num segundo conjunto de experiências, foi avaliada a dose resposta relativa aos derivados de anticorpos avaliados. 0 anticorpo scFv de ESBATech representativo aplicado intra-articularmente, TB-A, e o anticorpo Fab correspondente aplicado intra-articularmente da experiência 1 foram comparados com Infliximab/Remicade® intra-articularmente e um anticorpo scFv não relacionado que carecia de qualquer atividade de ligação ao TNFa humano ao longo de um amplo e diferente intervalo de dosagem como comparado com a experiência 1, de acordo com o Quadro V. Quadro V: Esquema de injeção da experiência 2_ GRUPO TNFa (mg) em PBS INIBIDOR DOSE (mg) 1 (n=3) 0 Nenhum 2 (n=3) 10 Nenhum 3 (n=3) 10 anticorpo scFv não relacionado 180 4 (n=3) 10 anticorpo TB-A scFv 156 5 (n=3) 10 anticorpo TB-A scFv 45 6 (n=3) 10 anticorpo TB-A scFv 11 7 (n=3) 10 anticorpo TB-A Fab 156 8 (n=3) 10 anticorpo TB-A Fab 45 9 (n=3) 10 anticorpo TB-A Fab 11 10 (n=3) 10 Infliximab (i.a.) 156 11 (n=3) 10 Infliximab (i.a.) 45 12 (n=3) 10 Infliximab (i.a.) 11 13 (n=3) 10 Infliximab (i.p.) 156 14 (n=3) 10 Infliximab (i.p.) 45 15 (n=3) 10 Infliximab (i.p.) 11

Os resultados obtidos em relação aos efeitos do tratamento na alteração do diâmetro do joelho (como um indicador dos efeitos no inchaço da articulação induzido por TNFa) são mostrados na Fig. 9.

Os resultados obtidos em relação aos efeitos do tratamento nas classificações de inflamação histopatológica são apresentados na Fig. 10.

Resumindo, ambos anticorpos scFv anti-TNFa de ESBATech 66 representativo e Fab anti-TNFa de ESBATech representativo foram altamente eficientes em bloquear monoartrite induzida pelo TNFa humano no momento da administração local (intra-articular).

Enquanto são mostradas e descritas presentemente modalidades preferidas da invenção, é para ser entendido claramente que a invenção não está limitada às mesmas mas pode ser, de outra forma, modificada e praticada de várias formas dentro do âmbito das reivindicações seguintes. 67

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ESBATech AG <120> Anticorpos estáveis e solúveis que inibem TNFalfa <130> 12013PC <160> 40 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> derivado de TB-B <22 0> <221> VL/TB-A <222> (1)..(108) <4 0 0> 1 68

ASp 1 Ile Vai Met Thr 5 Gin ser pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala ser vai 15 Gly ASp Arg vai Thr 20 Leu Thr cys Thr Ala 25 Ser Gin Ser vai ser 30 Asn ASp val vai Trp Tyr Gin Gin Arg Pro 6iy Lys Ala ΡΓΟ Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ara 65 Giy Tyr 61 y Thr ASp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser ser Leu Gin pro 80 Glu ASP vai Ala vai 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 ASP Tyr Asn ser Pro 95 Arg Thr phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu vai Lys Arg 100 10S <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> artif icial <220> <223> derivado de <22 0> <221> VH/TB -A <222> (1) ·. (117) <4Ο0> 2 69 -ia Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala Gin vai Gin Leu vai Gin ser Gly Ala ip 15

15 A „ , , caí* Gly Tyr ThΓ Phé Thr His Tyr

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Gly Met Asn Trp vai Arg Gin Ala pro Gly tys dy Leu 45 Glu Trp Met 35 40 Gly Trp ile Asn Thr Tyr Thr dy Glu p.ro Thr w Ala Asp Lys Phe 50 55 Lys 65 Asp Arg phe Thr Phe 70 Ser Leu Glu Thr Ser 75 Ala Ser Thr vai ar Met Glu Leu Thr ser 85 Leu Thr ser Asp ASP 90 Thr Ala vai Tyr IV cys Ala Arg Glu Arg 100 Gly Asp Ala· Met ASP 105 Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu vai Thr vai ser Ser 115

<210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> humano-murino <22 0> <221> VL/TB-B <222> (1) .. (108) <400> 3 70 70 Α$ρ 1 ASp val Tyr ser 65 Glu lie val Leu Thr Gin ser Pro ser ser Leu ser 5 10

Arg val Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gin ser 20 25 val Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro 35 4°

Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro ser 50 55 60

Gly ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser

Asp val Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin Asp Tyr 85 90

Thr Phe Gly Gin Gly Thr lys Leu Glu val 100 105

Ala Ser val Gly 15 val ser Asn ASP 30 Lys 45 Arg Leu lie Arg Phe ser Gly Ser Leu Gin pro 80 Asn Ser pro Arg 95 Lys Arg <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> humano-murino <22 0> <221> VH/TB-B <222> (1) .. (117) <400> 4 71

Gin 1 vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 val Lys Lys pro Gly 15 Ala Ser vai Lys vai 20 Ser cys Thr Ala Ser 25 ciy Tyr Ser Phe Thr 30 HÍS Tyr Gly Met Asn 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Met Gly Trp 50 Ile Asn Thr Tyr Thr 55 Gly Glu pro Thr ar Ala ASP Lys phe 8* ASp Arg Vai Thr Leu 70 Thr Arg ASP Thr Ser 75 Ile Gly Thr val Tyr 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp A$p Thr Ala val Tyr ΪΓ cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg 100 Gly Asp Ala Met Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu vai Thr vai Ser Ser 115 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> humano <220> <221> VL/FW2.3 <222> (1)..(108) <400> 5

Asp ile vai Leu Thr Gin ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr leu Thr cys Arg Ala Ser Gin Gly ile Arg Asn Glu 20 25 30 72

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro 35 40 Tyr Ala 50 Gly Ser Ile Leu Gin 55 Ser ser 65 Gly Ser Gly Thr Glu 70 Phe Thr Glu Asp vai Ala vai 85 Tyr Tyr Cys Met phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 100 <210> 6 <211> 124 <212> PRT <213> humano

Gly Lys Ala Pro «P Arg Leu Ile Gly val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Leu Thr Ile 75 Ser ser Leu Gin Pro 80 Gin Gin 90 Tyr Tyr Ser Leu Pro 95 Tyr Glu 105 val Lys Arg <22 0> <221> VH/FW2.3 <222> (1)..(124) <400> 6 73

Gin 1 vai Gin Leu val 5 Gin ser Giy Ala GlU 10 val lys Lys Pro Gly 15 Ala ser val Lys Val 20 Ser cys Thr Ala ser 25 Gly Tyr Ser phe Thr 30 Gly Tyr phe Leu His 35 Trp val Arg Gin Ala 40 pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Met Gly Arg 50 lie Asn pro Asp ser 55 Gly ASP Thr lie Tyr Ala 60 Gin Lys Phe Gin 65 Asp Arg val Thr Leu 70 Thr Arg ASP Thr ser 75 Ile Gly Thr val Tyr 80 Met Glu Leu Thr ser 65 Leu Thr ser ASP ASP 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg vai pro 100 Arg Gly Thr Tyr Leu 105 Asp Pro Trp Asp Tyr 110 Phe Asp Tyr Trp Gly 115 Gin Gly Thr Leu val 120 Thr val Ser Ser <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivado de ΤΒ-Α <22 0> <221> VL/TB__L2 <222> (1).·(10δ) <400> 7 74 ASp 1 ile vai Met Thr 5 Gin Ser Pro ser ser 10 Leu Ser Ala Ser val 15 Gly ASP Arg vai Thr 20 Leu Thr Cys Thr Ala 25 Ser Gin ser val Ser 30 Asn ASP val vai Trp 35 Tyr Gin Gin Arg pro 40 Gly Lys Ala Pro ΪΫ Leu Leu ile Tyr Ala Gly 50 ser lie Leu Gin 55 Ser dy val Pro ser 60 Arg Phe Ser Gly Arg 65 Gly Tyr Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr He 75 ser ser Leu Gin pro 80 Glu Asp Vai Ala val 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 ASp Tyr Asn Ser Pro 95 Arg Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 val Lys Arg <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> artifi ciai <22 0> <223> derivado a . partir de TB- -A <22 0> <221> VL/TB_: L3 <222> d)..( 108) <4 0 0> 8 ASp Ile val Met Thr Gin Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 IS ASP Arg val Thr Leu Thr Cys Thr Ala ser Gin Ser val Ser Asn Asp 20 25 30 vai val Trp Tyr Gin Gin Arg pro Gly Lys Ala Pro L y$ Leu Leu Ile 35 40 45 75

Tyr ser 50 Ala Phe Asn Arg ST Thr Aro 65 Gly Tyr Gly Thr Asp 70 Phe Thr Glu Asp vai Ala vai 85 Tyr Tyr cys Met Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 100 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> artificial

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Gin Asp Arg Phe Thr Phe ser Leu Glu Thr ser 65 70 75

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V11D/A16G/K43Q/D66G/F70L/S71T/E73D/S77G/V93T/L112S <400> 30

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Glu Asp val Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gin val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 W0 ser val Lys val Ser c^s Thr Ala Ser Gly T^r Thr Phe Thr His Tgr Gly Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Glg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala asp Lys Ph< T 180 185

Lys ASP Ar 19 200

Ile Thr phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala |er Thr val Tyi

Met Glu Leu Thr ser Leu Thr Ser asp asp Thr Ala val Tyr Tyr cy. 210 215

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trç Gly Gin Gly Thr Lei 225 230 val Thr val ser ser 245 106 <210> 32 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Derivado de ΤΒ-Α <22 0> <221> ΤΒ-Α L_V83E H_V79A <222> (1)··(245) <223> ΤΒ-Α com VL V83E e VH_V79A ligado pela SEQ ID N° 10 <400> 32

Asp ile vai Met Thr cln ser Pro Ser ser Leu ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr Leu Thr cys Thr Ala*ser Gin ser vai ser Asn Asp 20 25 30 val vai Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly 1 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser ser Leu Gin pro 85

Glu Asp Glu Ala val Tyr Tyr cys Gin Gin Asp Tyr Asn ser pro Arg

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys leu Glu val Lys Arg Gly Gl£ Gly Gly 100

Ser 120

Gly Gl| Gly Gly ser Gly Glj; Gly Gly Ser Gly Gl| Gly Gly Ser 107

Gin vai Gin Leu vai Gin ser Gly Ala Glu vai Lys Lys pro ciy Ala 130 135 140 Ser 145 Vai Lys Vai ser cys 150 Thr Ala Ser Gly s; Thr Phe Thr HÍS Tyr 160 Gly Met Asn Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Met 16S 170 175 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr cly Glu Pro Thr Tyr Ala ASp tys phe 180 18S 190 Lys ASp 19? Phe Thr Phe Ser Leu 200 Glu Thr ser Ala Ser 20S Thr Ala Tyr Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser A5P ASp Thr Ala Vai Tyr Tyr cys 210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASP Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 225 230 235 240

Vai Thr vai Ser ser 245 <210> 33 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Derivado de TB-A <22 0> <221> TB-A Linker__G2R H_F68L <222> (1)..(245) <223> TB-A com VL de TB-A e VH F68L ligado pela SEQ ID N°39 <400> 33 108 ASP Ile val Met Thr Gin ser pro ser ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 15 ASp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gin Ser val ser Asn ASP 20 25 30 val val Trp 35 Tyr Gin Gin Arg pro 40 Gly Lys Ala Pro 8* Leu Leu lie Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60 Arg 65 Gly Tyr Gly Thr ASp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin pro 80 Glu ASp val Ala val 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 ASp Tyr A$n Ser pro 95 Arg Thr phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Sí Gly Gly Ser Gly lll Gly Gly Ser Gly Gly 125 Gly Gly ser Gin val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser 145 Val Lys val ser ss Thr Ala Ser Gly Tyr 155 Thr Phe Thr Mis Tyr 160 Gly Met Asn Trp val 165 Arg Gin Ala pro Gly 170 Lys Gly Leu Glu Trp 175 Met Gly Trp ile Asn 180 Thr Tyr Thr Gly Glu 185 Pro Thr Tyr Ala ASP 190 Lys Phe Lys ASP 19? Leu Thr Phe Ser Leu 200 Glu Thr Ser Ala ser 205 Thr val Tyr Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser ASp ASp Thr Ala val Tyr Tyr cys 210 215 220 Ala 225 Arg Glu Arg Gly ASp 230 Ala Met ASP Tyr Trp 235 Gly Gin Gly Thr Leu 240 val Thr vai Ser ser 245 <210> 34 109 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> Derivado de ΤΒ-Α <22 0> <221> ΤΒ-Α H_K43R/F68I <222> (1)..(245) <223> ΤΒ-Α com VL de ΤΒ-Α e VH_K34R_F68I ligado pela SEQ ID N° 10 <400> 34

Asp lie vai Met Thr Gin Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 15 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gin ser vai Ser Asn Asp 20 25 30 110 val vai 35P Tyr Gin Gin Arg Pro 40 Gly Lys Ala ΡΓΟ Lys 45 Leu Leu Ile Tyr ser 50 Ala Phe Asn Arg ΪΓ Thr Gly val Pró Ser 60 Arg Phe Ser Gly Arg 6$ Gly Tyr dy Thr ASP 70 phe Thr Leu Thr ile 75 Ser Ser Leu Gin pro 80 Glu Asp val Ala val 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 ASP Tyr Asn Ser ΡΓΟ 95 Arg Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 val Lys Arg Gly Gly 110 Gly Gly ser Gly Gly 115 Gly Gly ser Gly 1¾ Gly Gly Ser Gly Gly 125 Gly Gly Ser Gin vai 130 Gin ueu val Gin Ser 135 Gly Ala Glu val Lys 140 Lys pro Gly Ala Ser 145 val Lys val ser SS Thr Ala ser Gly Tyr 155 Thr Phe Thr Hl S Tyr 160 Gly Met Α$Π Trp val 165 Arg Gin Ala Pro Gly 170 Arg Gly Leu GlU 17? Met Gly Trp ile Asn 180 Thr Tyr Thr Gly Glu 185 Pro Thr Tyr Ala ASP 190 Lys Phe Lys ASp Arg He Thr Phe ser teu Glu Thr ser Ala ser Thr val Tyr 195 200 205 Met GlU Leu Thr ser Leu Thr Ser ASp Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gin dy Thr Leu 225 230 235 240 vai Thr val Ser Ser 245 <210> 35 <211> 245 <212> PRT <213> artificial 111 <22 0> <223> Derivado de ΤΒ-Α <22 0> <221> ΤΒ-Α H_F68L <222> (1)..(245) <223> ΤΒ-Α com VL de ΤΒ-Α e VH_F68L ligado pela SEQ ID N°10 <400> 35 112

Asp ile vai Met Thr Gin ser ργο ser Ser Leu ser Ala ser gl Gly Asp Arg vai Thr Leu Thr cys Thr Ala Ser Gin Ser vai Ser Asn Asp vai vai Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly <-ys Ala ργο gs Leu Leu Ile

Tyr ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr xle ser ser Leu Gin Pro 65 70

Glu Asp val Ala vai Tyr Tyr cys Gin Gin Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 8 S

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu val Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 liU

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gin val Gin Leu val Gin ser cly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 1*0 ser val Lys Val ser gs Thr Ala Ser Gly gr Thr Phe Thr His gr

Gly Trp ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 . 185 ISO

Lys ASp ΑΓ|

Leu Thr Phe ser Leu Glu Thr Ser Ala ser Thr val Tyr 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly A|p Ala Met Asp Tyr Trç Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val Ser ser 245 <210> 36 113 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> Derivado de ΤΒ-Α <22 0> <221> ΤΒ-Α H_F68A <222> (1)..(245) <223> ΤΒ-Α com VL de ΤΒ-Α e VH_F68A ligado pela SEQ ID N°10 <400> 36 114 ASP 1 lie vai Met Thr 5 Gin Ser pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser val IS Gly Asp Arg val Thr 20 Leu Thr Cys Thr Ala 25 Ser Gin Ser val ser 30 Asn ASp vai vai Trp 35 Tyr Gin Gin Arg Pro 40 Gly Lys Ala Pro H* Leu Leu lie Tyr Ser 50 Ala Phe Asn Arg SF Thr cly val ΡΓΟ ser 60 Arg Phe ser Gly Arg 65 cly Tyr Gly Thr A$p 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin pro 80 Glu Asp val Ala val 8S Tyr Tyr cys Gin Gin 90 ASp Tyr Asn Ser Pro 95 Arg Thr phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 val Lys Arg Gly Gly 110 cly Gly Ser Gly Gly 115 Gly Gly ser Gly Gly 120 Gly Gly Ser Gly ílí Gly Gly Ser Gin vai Gin Leu val Gin ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser 145 vai Lys val ser Thr Ala ser Gly ϊξξ Thr Phe Thr His Tyr 160 6iy Met Asn Trp val 165 Arg Gin Ala pro Gly 170 Lys Gly Leu Glu Trp 175 Met Giy Trp ile Asn 180 Thr Tyr Thr Gly Glu 185 pro Thr Tyr Ala Asp 190 Lys Phe cys ASp 19? Ala Thr phe ser Leu 200 Glu Thr Ser Ala ser 205 Thr val Tyr Met GlU 210 Leu Thr ser Leu Thr 215 ser ASp ASp Thr Ala 220 val Tyr Tyr Cys Ala 225 Arg Glu Arg Gly Asp 230 Ala Met Asp Tyr Trp 235 Gly Gin Gly Thr Leu 240 vai Thr val ser ser 245 <210> 37 <211> 245 115 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Derivado de ΤΒ-Α <22 0> <221> ΤΒ-Α H_F68V/F70L <222> (1)..(245) <223> ΤΒ-Α com VL de ΤΒ-Α e VH_F68V/F7OL ligado pela SEQ ID N° 10 <400> 37 ASp 1 Ile Vai Met Thr 5 Gin Ser Pro ser ser 10 Leu ser Ala Ser vai 15 Gly ASP Arg Vai Thr 20 Leu Thr cys Thr Ala 25 Ser Gin Ser vai ser 30 Asn Asp vai vai Trp 35 Tyr Gin Gin Arg pro 40 Gly tys Ala pro Lys 45 Leu Leu ile Tyr Ser 50 Ala Phe Asn Arg 3P Thr Gly vai Pro ser 60 Arg Phe Ser Gly Arg 65 Gly Tyr dy Thr Asp 70 phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser ser Leu Gin pro 80 Glu Asp vai Ala vai 8S Tyr Tyr cys Gin Gin 90 ASp Tyr Asn Ser Pro 9S Arg Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 vai Lys Arg Gly Gly 110 Gly Giy Ser Gly aϊ Gly Gly ser Gly 3* Gly Gly Ser Gly Gly 125 Gly Gly ser Gin vai Gin Leu vai Gin Ser «iy Ala Glu vai Lys Lys pro Gly Ala 130 135 140 ser 14 5 vai Lys vai Ser Cys 150 Thr Ala ser Gly Tyr 155 Thr Phe Thr HÍS Tyr 160 116

Gly Met Asn Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190

Lys Asp Arg vai Thr Leu ser Leu Glu Thr ser Ala Ser Thr vai Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 225 230 235 240 val Thr vai ser ser 245 <210> 38 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> Derivado de TB-A <22 0> <221> TB-A H_F70L <222> (1)..(245) <223> TB-A com VL de TB-A e VH_F70L ligado pela SEQ ID N°10 <400> 38 117

Asp ile vai Met Thr Gin Ser Pro ser Ser Leu ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15

Asp Arg vai Thr Leu Thr cys Thr Ala ser Gin· ser vai Ser Asn asp

20 25 áU vai vai Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ala pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly vai Pro ser Arg Phe ser Gly 50 S5 60

Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser ser Leu Gin Pro 65 70 75

Glu Asp vai Ala vai Tyr Tyr cys Gin Gin Asp Tyr Asn ser Pro Arg 85 90 105 100

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Vai Lys Arg Gly Gljj Gly Gly

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser 115 120 125

Gin vai Gin Leu vai Gin ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 130 135

Ser vai Lys vai ser cys Thr Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155

Gly Met Asn Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 l70 A

Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala ASp Lys Phe 180 1“

Lys Asp Arg Phe Thr Leu ser Leu Glu Thr Ser Ala ser Thr vai Tyr 195 200 205

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 210 215 220

Ala Arg Glu Arg Gly A|g Ala Met Asp Tyr Trç Gly Gin Gly Thr Leu vai Thr vai Ser Ser 245 <210> 39 <211> 20 118 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> linker <22 0>

<221> Linker G2R <222> (D · · (20) <4 0 0> 39

Gly Arg Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly X 5 10 IS

Gly Gly Gly Ser 20 <210> 40 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <22 0> <223> anticorpo scFv TB-A <220> <221> TB-A <222> (D · · (245) <223> ESBA105 <400> 40 119 ASp 1 lie val Met Thr 5 Gin Ser pro Ser ser 10 Leu Ser Ala ser Val 15 Gly ASP Arg val Thr 20 Leu Thr cys Thr Ala 25 Ser Gin ser val Ser 30 Asn ASP val val Trp Tyr Gin Gin Arg pro Gly Lys Ala Pro !γΓ Leu teu lie f' 35 40 45 Tyr Ser Ala phe Asn Arg Tyr Thr cly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg 65 Gly Tyr Gly Thr A$p 70 Phe Thr Leu Thr ile 75 Ser ser Leu Gin pro 80 Glu ASp val Ala Val 85 Tyr Tyr cys Gin Gin 90 Asp Tyr Asn Ser pro 95 Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 ser dy Gly 115 Gly Gly Ser Gly & Gly Gly ser Gly & Gly Gly ser Gin val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 ser 145 val Lys val Ser SS Thr Ala Ser Gly IV, Thr Phe Thr HiS Tyr 160 Gly Met asr Trp Val 16 S Arg Gin Ala Pro Gly 170 Lys Gly Leu Glu Trp 175 Met oly Trp He Asn 180 Thr Tyr Thr Gly Glu 185 pro Thr Tyr Ala Asp 190 Lys phe Lys Asp íSf Phe Thr Phe Ser Leu 200 Glu Thr Ser Ala ser 205 Thr val Tyr Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr ser ASp Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 210 215 220 Ale Arg Glu Arg Gly ASp Ala Met ASp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 240 225 230 235 val Thr vai ser ser 245 120

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • US 2003147891 A [0014] • WO 0149321 A [0015] • WO 03047510 A [0016] • US 591942 A [0020] • US 5919452 A [0021] • US 20003187231 A [0022] • WO 9211383 A [0022] [0023] • US 22002037934 A [0025] • US 6428787 B [0026] • WO 9729131 A [0027] [0103] • EP 0626389 A [0027] • US 2003185826 A [0027] • WO 0148017 A [0029] [0046] • WO 03097697 A [0029] [0124] • EP 1479694 A [0046] • WO 0194585 A [0088] • EP 1506236 A [0124] • US 0319333 W [0126]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1 · Um anticorpo estável e solúvel ou derivado de anticorpo que se liga especificamente TNFoí, sendo que o dito anticorpo ou derivado de anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID N° 1 que é combinada com o domínio variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID N° 2. 2. 0 derivado de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, sendo um anticorpo scFv, em que os domínios VL e VH são ligados por um linker. 3. 0 anticorpo scFv de acordo com a reivindicação 2, compreendendo um arranjo de sequência VL-linker-VH. 4. 0 anticorpo scFv de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que o linker tem a sequência SEQ ID N° 10 ou é derivado da dita sequência.

5. O anticorpo scFv da reivindicação 4, em que, pelo menos um, G do dito linker é alterado para um aminácido mais polar ou carregado.

6. O derivado de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que é um fragmento Fab em que o domínio VL é fundido com a região constante de uma cadeia kappa de Ig humana, o domínio VH é fundido com o domínio CHI de uma IgG humana, e os dois polipeptídeos de fusão são ligados por uma ponte dissulfido entre cadeias.

7. O anticorpo ou derivado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, que é marcado ou quimicamente modificado. 2

8. Uma sequência de ADN que codifica o anticorpo ou derivado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6.

9. Um vetor de clonagem ou expressão contendo a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 8.

10. Uma célula hospedeira adequada transformada com um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 9.

11. A célula hospedeira da reivindicação 10, sendo uma célula de levedura, E. coli, planta, inseto ou mamífero.

12. Um método para a produção de anticorpo ou derivado de molécula de anticorpo e de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que compreende cultivar a célula hospedeira das reivindicações 10 ou 11 em condições que permitem a síntese de dita molécula de anticorpo e recuperá-la da dita cultura.

13. O anticorpo ou derivado de anticorpo de qualquer das reivindicações 1-7 como um produto farmacêutico.

14. O anticorpo ou derivado de anticorpo de qualquer das reivindicações 1-7 para utilização num método de tratamento de uma doença relacionada com o TNFa.

15. O anticorpo ou derivado de anticorpo de qualquer das reivindicações 1-7 para utilização num método de tratamento de uma doença relacionada com o TNFa de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a doença relacionada com o TNFa ser osteoartrite, síndrome do olho seco, uveíte, doenças inflamatórias que afetam a pele, psoríase ou doença inflamatória intestinal. 3 16. 0 anticorpo ou derivado de anticorpo de qualquer das reivindicações 1-7 para utilização num método de tratamento de uma doença relacionada com o TNFa em que o anticorpo ou derivado de anticorpo é administrado local ou topicamente.

17. A utilização de um anticorpo ou derivado de anticorpo de qualquer das reivindicações 1-7 para a produção de um medicamento para o tratamento de doenças associadas a TNFa ou como um diaqnóstico in vitro para a sua deteção.

18. A utilização da reivindicação 17, em que o medicamento é para tratamento de uma doença associada a TNFa e em que o anticorpo ou derivado de anticorpo é administrado local ou topicamente.

19. A utilização da reivindicação 17 ou 18, em que a doença associada a TNFa é osteoartrite, uveite, doença inflamatória intestinal, sindrome do olho seco, doenças inflamatórias que afetam a pele, ou psoriase.

20. Uma composição de diagnóstico ou para terapêutica que compreende um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-7 em combinação com um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

21. Uma preparação combinada que compreende o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-7 juntamente com, pelo menos, um segundo composto.

22. A preparação combinada da reivindicação 21 em que o segundo composto não é um anticorpo especifico para TNFa.

23. A preparação combinada da reivindicação 21 ou 22 para utilização como um medicamento. 4 24. 0 vetor da reivindicação 9 como farmacêutico para aplicações terapêuticas humanos e/ou em animais. 4 um produto génicas em