ES2603399T3

ES2603399T3 - Anticuerpos scFv que atraviesan capas epiteliales y/o endoteliales

Info

Publication number: ES2603399T3
Application number: ES07763939.1T
Authority: ES
Inventors: Adrian Auf Der Maur; Alcide Barberis; David Urech; Peter Lichtlen
Original assignee: Esbatech An Alcon Biomedical Research Unit LLC
Current assignee: Esbatech a Novartis Co LLC
Priority date: 2006-07-10
Filing date: 2007-07-10
Publication date: 2017-02-27
Anticipated expiration: 2027-07-10
Also published as: DK2046382T3; JP2014176392A; JP6226824B2; RU2438708C2; US20090311251A1; EP2046382B1; WO2008006235A2; ES2820837T3; RU2015130221A3; JP2017209114A; JP6230195B2; US8936785B2; WO2008006235A3; RU2009104318A; HUE032654T2; AU2007272224B2; EP3093026A1; CA2658241C; PL2046382T3; RU2015130221A

Abstract

Composición farmacéutica formulada para la aplicación local a una superficie de una barrera de tejido epitelial, comprendiendo dicha composición un polipéptido de unión a antígeno soluble y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que dicho polipéptido de unión a antígeno puede cruzar una córnea de mamífero intacta en menos de 8 horas en ausencia de un potenciador de la penetración, y en la que dicho polipéptido de unión a antígeno es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y comprende: (a) una región de entramado de dominio variable de cadena ligera (VL) de una similitud de al menos el 85% con una región de entramado de VL seleccionada del grupo que consiste en las SEQ. ID. NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y una región de entramado de dominio variable de cadena pesada (VH) de una similitud de al menos el 85% con una región de entramado de VH seleccionada del grupo que comprende SEQ. ID. NO: 8, 9, 10 y 11; o (b) la secuencia de SEQ. ID. NO: 13.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos scFv que atraviesan capas epiteliales y/o endoteliales Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un anticuerpo scFv con caracterlsticas mejoradas para la penetracion en tejidos y su aplicacion topica en el diagnostico y tratamiento de una enfermedad que depende de la sobreexpresion de un antlgeno seleccionado. En particular, la invencion se refiere a un anticuerpo que se une especlficamente a e inactiva dicho antlgeno seleccionado.

Antecedentes de la invencion

El tratamiento local de muchas enfermedades puede producirse mediante la aplicacion topica de un farmaco que debe penetrar en el tejido epitelial. Las celulas epiteliales adyacentes se sellan mediante uniones estrechas, impidiendo el paso de la mayor parte de moleculas disueltas de un lado de la lamina epitelial al otro (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2a ed.). Las uniones estrechas son cruciales para la formacion y el mantenimiento de la barrera paracelular y para la polaridad celular en epitelios y endotelios simples. Tambien desempenan un papel importante en la barrera hematoencefalica, donde controlan las sustancias que abandonan o entran en el cerebro. Es necesario que farmacos de alto peso molecular atraviesen estas barreras tisulares para alcanzar sus sitios de accion. En general, los anticuerpos son demasiado grandes como para cruzar las uniones estrechas de las capas de celulas epiteliales.

Como parte de la actividad normal del organismo, las uniones estrechas se abren y cierran selectivamente en respuesta a diversas senales tanto en el interior como en el exterior de las celulas. Esto permite el paso de grandes moleculas o incluso de celulas completas a traves de la barrera de union estrecha.

La administracion mucosa de compuestos terapeuticos puede ofrecer determinadas ventajas con respecto a la inyeccion y otros modos de administracion, por ejemplo, en cuanto a la conveniencia y velocidad de administracion, as! como al reducir o eliminar problemas de cumplimiento y los efectos secundarios que acompanan a la administracion mediante inyeccion. Sin embargo, la administracion mucosa de agentes biologicamente activos esta limitada por las funciones de la barrera mucosa y otros factores. Por estos motivos, la administracion mucosa de farmacos requiere normalmente mayores cantidades de farmaco que la administracion mediante inyeccion. Otros compuestos terapeuticos, incluyendo farmacos de molecula grande, peptidos y protelnas, son a menudo resistentes a la administracion mucosa.

La capacidad de los farmacos para permear superficies mucosas, sin asistencia por parte de agentes de potenciacion de la administracion, parece estar relacionada con varios factores, incluyendo el tamano molecular, la liposolubilidad y la ionizacion. Las moleculas pequenas, de menos de aproximadamente 300-1.000 Dalton, a menudo pueden penetrar en las barreras mucosas, sin embargo, a medida que aumenta el tamano molecular, la permeabilidad disminuye rapidamente. Los compuestos liposolubles son generalmente mas permeables a traves de superficies mucosas que las moleculas no liposolubles. Los peptidos y las protelnas son escasamente liposolubles, y as! presentan escasas caracterlsticas de absorcion a traves de superficies mucosas.

El documento US2006062758 proporciona composiciones y metodos que incluyen un agente biologicamente activo y un peptido de permeabilizacion eficaz para potenciar la administracion mucosa del agente biologicamente activo en un sujeto mamlfero. El peptido de permeabilizacion potencia reversiblemente el transporte paracelular epitelial mucoso, normalmente modulando la estructura y/o fisiologla de la union epitelial en una superficie epitelial mucosa en el sujeto.

Se han descrito previamente peptidos que pueden modular la funcion de uniones estrechas epiteliales (Johnson, P. H. y Quay, S. C., 2000). El documento CA2379661 proporciona un sistema de administracion paracelular de farmacos que comprende un peptido derivado de claudina 6. Las claudinas representan una superfamilia de protelnas integrales de membrana ubicadas en las uniones estrechas y que proporcionan la funcion de barrera.

Los anticuerpos son poderosas herramientas para la investigacion en biologla molecular y bioqulmica y se aplican ampliamente en terapia y diagnostico medicos debido a su capacidad para unirse especlficamente a su antlgeno con alta afinidad. Normalmente, los anticuerpos consisten en dos cadenas pesadas y dos ligeras, que se unen covalentemente entre si mediante enlaces disulfuro. Un dominio altamente variable que comprende tres regiones complementarias (CDR) esta situado en el extremo N-terminal de cada cadena. De manera concertada, las regiones variables de la cadena pesada y ligera determinan la especificidad de antlgeno del anticuerpo. Se han modificado mediante ingenierla anticuerpos de cadena sencilla (scFv) mediante la union de las secuencias de ADN que codifican para dominios variables de cadena pesada (VH) y variables de cadena ligera (VL) con una secuencia espaciadora que codifica para un ligador de aminoacidos flexible (Bird et al., 1988).

Este formato tiene las ventajas con respecto a anticuerpos de longitud completa convencionales que un scFv esta codificado por un unico gen, pueden introducirse facilmente mutaciones y el scFv resultante puede expresarse en sistemas de levaduras y procariotas, que permiten una rapida seleccion de agentes de union de alta afinidad especlficos practicamente a cualquier epltopo mediante simple biologla molecular. Debido a su falta de funcion 5 efectora, los anticuerpos scFv no ejercen efectos toxicos mediante citotoxicidad mediada por celulas dependiente del complemento o dependiente de anticuerpos (ADCC o CDCC, respectivamente), y a diferencia de los anticuerpos de longitud completa, los anticuerpos scFv muestran buenas capacidades de penetracion en tejidos.

Se han generado muchos anticuerpos de cadena sencilla (scFv) contra una multitud de diferentes antlgenos, en particular porque pueden seleccionarse facilmente por su alta capacidad de union usando tecnicas tales como 10 presentacion en fago o presentacion en ribosoma. Ademas, pueden producirse anticuerpos scFv en sistemas microbianos que se asocian con menores costes en comparacion con la produccion de anticuerpos terapeuticos de longitud completa.

Ademas de las aplicaciones in vitro y extracelulares convencionales, los scFv tambien se han usado satisfactoriamente para aplicaciones intracelulares (Worn et al. 2000; Auf der Maur et al. 2002; Stocks MR, 2004); 15 por tanto, se han desarrollado scFv dirigidos contra antlgenos intracelulares. En general, la expresion intracelular de scFv funcionales esta limitada por su inestabilidad, insolubilidad y tendencia a formar agregados. Por este motivo, se han desarrollado satisfactoriamente sistemas de examen in vivo para anticuerpos scFv, que son particularmente solubles y estables en las condiciones reductoras tlpicas para el entorno intracelular (por ejemplo, nucleo, citoplasma) usando un denominado examen de “control de calidad” (documento WO0148017; Auf der Maur et al. 20 (2001); Auf der Maur et al., 2004) y han conducido a la identificacion de secuencias de entramado de scFv

particularmente estables y solubles para tales fines (documento WO03097697). Ademas, estas secuencias de entramado muestran niveles de expresion excepcionales y propiedades potenciadas de estabilidad y solubilidad tambien en las condiciones oxidantes naturales en el entorno extracelular. Asl, estas propiedades bioflsicas y bioqulmicas favorables se traducen en altos rendimientos de produccion favorables y permiten que estos fragmentos 25 de anticuerpo, una vez dirigidos contra antlgenos especlficos, se apliquen localmente y/o de manera sistemica como productos terapeuticos proteicos en areas terapeuticas particulares.

Para el uso de anticuerpos en muchas aplicaciones terapeuticas, en particular aplicaciones locales, un factor importante es la capacidad del anticuerpo para penetrar en tejidos, y en particular barreras de tejido epitelial.

La aplicacion local es particularmente deseable para el tratamiento de trastornos que se manifiestan en un lugar 30 particular y no requieren un tratamiento sistemico, por ejemplo, enfermedades oculares.

Uveitis anterior

La uveitis es una inflamacion aguda o cronica de la uvea con una prevalencia de 30 - 40 por 100.000 (Lightman y Kok 2002). La uveitis se subdivide segun la ubicacion en uveitis anterior, intermedia o posterior. La uveitis anterior evoluciona a uveitis posterior seguido por complicaciones tales como cataratas, retinitis e incluso ceguera, si no se 35 trata (Kok y Lightman 2004). En personas de <65 anos de edad, existen muchos individuos legalmente ciegos como resultado de uveitis como retinopatia diabetica (Kok y Lightman 2004). La uveitis anterior, como la forma mas comun de enfermedades inflamatorias intraoculares, se asocia con el alelo de locus A de histocompatibilidad B27 (HLA- B27) en el 50% de los casos (Power et al. 1998). De estos pacientes, solo aproximadamente la mitad padecen una enfermedad sistemica adicional tal como espondilitis anquilosante o enfermedad inflamatoria cronica del intestino 40 (El-Shabrawi y Hermann 2002). El tratamiento de uveitis tiene como objetivo principalmente el control del proceso inflamatorio (Kok y Lightman 2004). Actualmente, los corticosteroides son el pilar para la terapia de uveitis (Kok y Lightman 2004). De manera importante, el tratamiento local y sistemico con corticosteroides aumenta significativamente el riesgo de glaucoma y cataratas, limitando por tanto su uso repetido (El-Shabrawi y Hermann 2002). Otros tratamientos que incluyen metotrexato, ciclosporina o azatioprina requieren un minimo de tratamiento 45 de 6 semanas para producir un efecto, dejando a los pacientes con una enorme restriccion de su calidad de vida durante un periodo prolongado (El-Shabrawi y Hermann 2002, Dick et al. 1997).

A partir de lo anterior, es obvia una necesidad medica claramente definida. Los corticosteroides topicos como la opcion terapeutica mas comun tienen efectos secundarios significativos que, de hecho, agravan el riesgo a largo plazo de ceguera.

50 Recientemente, se han encontrado concentraciones de TNFa de 15 pg/ml en el humor acuoso de pacientes con uveitis, mientras que los niveles correspondientes en individuos sanos fueron de 0,56 pg/ml (Perez-Guijo et al. 2004). Varios pequenos estudios clinicos realizados con inhibidores de TNFa aplicados de manera sistemica notifican “una mejora inmediata” (El-Shabrawi y Hermann 2002) o “una mejora clinica notable en el plazo de dias” (Murphy et al. 2004) o “en el plazo de 2 semanas” (Joseph 2003) o “una mejora inmediata significativa despues de la 55 primera dosis de infliximab” (Benitez Del Castillo et al. 2004).

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Por tanto, el concepto de seleccionar TNFa como diana esta bien validado cllnicamente. Sin embargo, sigue habiendo preocupaciones de seguridad relacionadas con la aplicacion sistemica de inhibidores de TNFa y no justificarlan su uso en la fraccion significativa de pacientes con uveitis que carecen de manifestaciones adicionales de enfermedad sistemica.

Por tanto, un inhibidor de TNFa topico atendera una necesidad medica bien definida, especialmente en pacientes con uveitis anterior. Debido a su alto peso molecular, los inhibidores de TNFa comercializados no son aplicables de manera topica (vease Thiel et al. 2002).

Enfermedad de Behcet

La enfermedad de Behcet es una enfermedad idiopatica, multisistemica, cronica y recurrente, caracterizada de manera clasica por crisis inflamatorias oculares agresivas, ulceras bucogenitales y lesiones de la piel. En casos graves, poco frecuentes de la enfermedad de Behcet, ademas puede observarse afectacion articular, audiovestibular, toracica, gastrointestinal, cardiovascular, renal o del SNC. El ojo es el organo interno mas comunmente implicado en la enfermedad de Behcet y es la causa principal de morbilidad cronica en pacientes. La enfermedad ocular consiste en iridociclitis unilateral (20%) o bilateral (80%), hipopion o panuveitis que discurren con un transcurso cronico y con recidivas. En general, las reagudizaciones iniciales tienden a ser mas anteriores y unilaterales, mientras que las crisis posteriores implican la cavidad vitrea y el segmento posterior del ojo, volviendose bilateral (Evereklioglu 2005). Se observa mas comunmente uveitis grave entre pacientes de regiones endemicas tales como pacientes japoneses y turcos, afectando al 70-90% de esta poblacion (Ozen 1999; Tursen et al., 2003; Tugal-Tutkun et al., 2004; Yurdakul et al., 2004; Evereklioglu 2005). El riesgo de perdida visual aumenta progresivamente, alcanzando una cuarta parte de los casos a los 10 anos. Ademas, la ceguera legal es significativa y eventualmente se deriva en mas del 50% de los casos en paises con alta prevalencia y gravedad de la enfermedad, tal como Japon (Boyd et al., 2001; Evereklioglu 2005).

La enfermedad de Behcet presenta una clara variacion geografica y es de manera endemica mayor particularmente en Japon, Corea, Arabia Saudi, Iran y Turquia asi como en los paises a lo largo de la antigua “ruta de la seda”, incluyendo China e Israel (Bonfioli y Orefice 2005; Evereklioglu 2005). Por ejemplo, la enfermedad de Behcet representa el 20% de los casos de uveitis en Japon y Turquia en comparacion con solo el 0,2% en los EE.UU. En paises en los que la enfermedad es endemica, es mas grave, con una mayor frecuencia de manifestaciones y complicaciones oculares y es mas comun en los hombres, especialmente adultos jovenes de sexo masculino (Evereklioglu 2005). Esta epidemiologia peculiar parece estar mediada por una combinacion de genetica (tal como asociacion con el alelo HLA-B51 (Sakane et al., 1999; Verity et al., 1999; Evereklioglu 2005), agentes infecciosos (Direskeneli 2001; Evereklioglu 2005) y factores ambientales. La prevalencia estimada de la enfermedad de Behcet es de entre 1:10.000 y 1:1000 en los paises mediterraneos, Oriente Medio y Extremo Oriente. En Japon y los paises asiaticos a lo largo de la ruta de la seda, la prevalencia es de 13-30 por 100.000 y tiene su mayor valor en las zonas septentrionales de Japon; la mayor prevalencia global con hasta 400 por cada 100.000 se observa en determinadas partes de Turquia. Hay aproximadamente 15.000 personas con enfermedad de Behcet en los EE.UU. (Zierhut et al., 2003; Evereklioglu 2005).

Las consecuencias de las crisis inflamatorias oftalmicas son la principal causa de morbilidad cronica en pacientes con enfermedad de Behcet (Evereklioglu 2005). El tratamiento de la enfermedad de Behcet es sintomatico y empirico. Como en otras formas de uveitis, los corticosteroides topicos, perioculares y sistemicos representan el pilar de la terapia en la enfermedad de Behcet ocular. Sin embargo, el uso de modalidades de tratamiento basadas en corticosteroides en los pacientes esta limitado por su perfil significativo de efectos secundarios. Ademas, los corticosteroides rara vez inducen remisiones completas en la enfermedad de Behcet ocular y una fraccion significativa de pacientes desarrolla enfermedad resistente a esteroides con el tiempo (Evereklioglu 2005). En el transcurso de la enfermedad, los tratamientos comprenden frecuentemente agentes inmunosupresores tales como azatioprina, metotrexato y ciclosporina A. Sin embargo, como estos agentes tambien se asocian con preocupaciones de seguridad criticas, existe una necesidad medica bien expresada de una modalidad de tratamiento novedosa eficaz y segura en esta indicacion.

Ademas de los recientes hallazgos epidemiologicos que sugieren variaciones polimorficas en TNFa que se asocian con la gravedad de la enfermedad de Behcet (Verity et al., 1999b), existe una amplia variedad de casos clinicos y pequenos ensayos clinicos que describen el uso de infliximab en la enfermedad de Behcet ocular (Ohno et al., 2004; Wechsler et al., 2004; Giansanti et al., 2004; Lanthier et al., 2005; Tugal-Tutkun et al., 2005; Lindstedt et al., 2005). De hecho, todos estos estudios notifican una remision rapida y completa de la enfermedad de Behcet ocular, incluso en pacientes resistentes a la terapia convencional (Tugal-Tutkun et al., 2005). Sin embargo, la frecuencia y gravedad de los acontecimientos adversos en pacientes con uveitis tratados con infliximab son inesperadamente altas en algunos estudios, limitando, por tanto, el potencial de antagonistas de TNFa aplicados de manera sistemica para el tratamiento de esta enfermedad (Rosenbaum 2004; Suhler et al., 2005).

La validacion clinica de TNFa como diana farmacologica altamente atractiva en la enfermedad de Behcet ocular

(Ohno et al., 2004; Wechsler et al., 2004; Giansanti et al., 2004; Lanthier et al., 2005; Tugal-Tutkun et al., 2005; Lindstedt et al., 2005) y las aparentes preocupaciones de seguridad con la supresion de TNFa sistemica en pacientes con uveitis (Rosenbaum 2004; Suhler et al., 2005), revela que existe la necesidad del desarrollo de un antagonista de TNFa aplicable de manera topica para la enfermedad de Behpet ocular, especialmente para 5 pacientes con slntomas predominantemente oculares.

Debido a sus buenas capacidades de penetracion en tejidos y su rapido aclaramiento renal, se prefieren anticuerpos scFv para aplicaciones locales. Ademas de la carga, hidropaticidad y peso molecular, propiedades tales como solubilidad, tendencia a la agregacion y estabilidad influyen en la capacidad de una molecula para penetrar a traves de barreras tisulares. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo altamente soluble puede no ser capaz de penetrar en 10 barreras epiteliales si forma agregados a temperatura fisiologica de aproximadamente 37°C. La mutacion de un unico residuo de aminoacido en una region de entramado de scFv puede mejorar por otro lado su solubilidad a temperatura ambiental, y esta mutacion puede alterar la estabilidad termica y conducir por tanto a desplegamiento parcial y agregacion a 37°C. Tales agregados, debido a su mayor peso molecular, ya no pueden atravesar barreras tisulares.

15 Debido a que la penetracion en tejidos es un factor importante para la administracion eficaz de farmacos, en particular en aplicaciones locales, existe la necesidad de anticuerpos terapeuticos, en particular anticuerpos scFv con capacidades mejoradas de penetracion en tejidos ademas de las caracterlsticas deseables por lo demas de alta estabilidad y baja antigenicidad. El documento WO0040262 da a conocer fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, scFv, como productos farmaceuticos o herramientas de diagnostico para tratar o diagnosticar, respectivamente, 20 trastornos oculares. Los experimentos de penetracion ocular se realizan a concentraciones de 0,2 a 0,25 mg/ml de scFv. Se mostro que un scFv podia penetrar en la barrera epitelial de la cornea a una tasa muy baja en ausencia, y a mayores tasas en presencia de potenciadores de la penetracion. Puesto que los potenciadores de la penetracion pueden tener efectos citotoxicos o provocar alteraciones epiteliales, existe la necesidad de metodos alternativos y/o mejorados para el tratamiento de enfermedades oculares mediante scFv y fragmentos de los mismos. En particular, 25 son necesarios anticuerpos para terapia controlada mediante administracion local con un bajo grado de efectos secundarios, que puedan administrarse a una concentracion relativamente alta.

Sumario de la invencion

Por tanto, es un objeto general de la invencion proporcionar un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo scFv, que se une especificamente a un antigeno seleccionado y tiene capacidad mejorada de penetracion en tejidos.

30 A continuacion, para implementar estos y todavia otros objetos de la invencion, que resultaran mas facilmente evidentes a medida que avance la descripcion, dicho anticuerpo se manifiesta por la caracteristica de que puede obtenerse mediante un metodo que comprende

(i) seleccionar de una reserva de regiones de entramado solubles y estables, la region de entramado que concuerde mejor con la region de entramado de un anticuerpo no humano de una especificidad de union a antigeno

35 seleccionada,

(ii) o bien proporcionar a dicha region de entramado CDR que se unen a dicho antigeno o bien mutar la region de entramado de dicho anticuerpo no humano a la secuencia de dicha region de entramado soluble y estable,

(iii) someter a prueba el anticuerpo generado para determinar su solubilidad y estabilidad, y

(iv) someter a prueba el anticuerpo generado para determinar su union a antigeno.

40 Opcionalmente, entre las etapas (ii) y (iii) se anade la siguiente etapa:

- mutar dicho anticuerpo scFv mediante mutagenesis dirigida al sitio o al azar de una o mas CDR seleccionadas y/o la region de entramado.

La invencion se refiere a una composition que comprende un polipeptido de union a antigeno soluble, en la que el polipeptido de union a antigeno puede cruzar una o mas capas epiteliales, por ejemplo, una capa endotelial o capa 45 mesotelial, en menos de aproximadamente 8 horas. La invencion esta definida por las reivindicaciones. En particular, la invencion proporciona una composicion farmaceutica formulada para la aplicacion local a una superficie de una barrera de tejido epitelial, comprendiendo dicha composicion un polipeptido de union a antigeno soluble y un portador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable, en la que dicho polipeptido de union a antigeno puede cruzar una cornea de mamifero intacta en menos de 8 horas en ausencia de un potenciador de la penetracion, y en 50 la que dicho polipeptido de union a antigeno es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y comprende: (a) una region de entramado de dominio variable de cadena ligera (VL) de una similitud de al menos el 85% con una region de entramado de VL seleccionada del grupo que consiste en las SEQ. ID. NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y una region de

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entramado de dominio variable de cadena pesada (VH) de una similitud de al menos el 85% con una region de entramado de VH seleccionada del grupo que comprende SEQ. ID. NO: 8, 9, 10 y 11; o (b) la secuencia de SEQ. ID. NO: 13.

Por ejemplo, el polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una o mas capas epiteliales en menos de aproximadamente 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o menos horas. En una realizacion, el polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una capa o capas epiteliales en menos de aproximadamente 4 horas. Ha de entenderse que todos los valores e intervalos entre estos valores e intervalos pretenden estar englobados por la presente invencion.

La capa epitelial es del ojo, en particular de la cornea, por ejemplo, el epitelio y/o endotelio de la cornea.

El polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una cornea de mamlfero intacta en menos de aproximadamente 8 horas en ausencia de un potenciador de la penetracion. Por ejemplo, el polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una cornea de mamlfero intacta en menos de aproximadamente 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o menos horas. En una realizacion, el polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una cornea humana intacta. En una realizacion, el polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una cornea de cerdo o conejo intacta.

En todavla otras realizaciones, la composicion comprende ademas un potenciador de la penetracion. En determinadas realizaciones, el potenciador de la penetracion se selecciona del grupo que consiste en Azone®, cloruro de benzalconio (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, polioxietileno-polioxipropileno 1800, caprato de sodio, acido caprllico, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, colato, aceite de ricino, aceite de malz, Cremophor-EL, ciclodextrinas, DMSO, bromuro de decametonio, desoxicolato, sulfato de dextrano, EDTA, edetato de disodio, etanol, fusidato, glicocolato, laurilsulfato, L-a-lisofosfatidilcolina, metazolamida, N-lauroilsarcosina, NMP, acido oleico, peptido Pz, fosfollpidos, lauril eter de polioxietileno-9, saponina, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, taurocolato y taurodesoxicolato. En otra realizacion, el potenciador de la penetracion es caprato de sodio. En aun otra realizacion, el potenciador de la penetracion incluye sistemas coloidales, poliacrilatos y pollmero bioadhesivo.

Las moleculas de la invencion pueden cruzar una capa epitelial, por ejemplo, una capa epitelial del ojo (cornea) en ausencia de un potenciador de la penetracion.

En algunas realizaciones, el polipeptido tiene una afinidad de union por un antlgeno diana de una kD de al menos 10E-6 M o mejor.

En algunos aspectos, la composicion proporcionada por la invencion tiene un pH de menos de aproximadamente 8, en la que el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una cornea intacta. En algunas realizaciones, la composicion tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. En otras realizaciones, la composicion tiene un pH de aproximadamente 6, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 o cualquier valor incremental del mismo. Se entiende que cualquier valor e intervalo entre estos valores e intervalos pretende estar englobado por la presente invencion.

En algunos aspectos, la composicion proporcionada por la presente invencion se formula a aproximadamente pH 8 o menos y el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una cornea intacta en menos de aproximadamente 8 horas. En algunas realizaciones, el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una cornea intacta en menos de aproximadamente 4 horas. En otras realizaciones, la composicion comprende ademas un agente de potenciacion de la penetracion. En algunas realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion se selecciona del grupo que consiste en Azone, cloruro de benzalconio (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, polioxietileno-polioxipropileno 1800, caprato de sodio, acido caprllico, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, colato, aceite de ricino, aceite de malz, Cremophor-EL, DMSO, bromuro de decametonio, desoxicolato, sulfato de dextrano, EDTA, edetato de disodio, etanol, fusidato, glicocolato, laurilsulfato, L-a-lisofosfatidilcolina, N-lauroilsarcosina, NMP, acido oleico, fosfollpidos, lauril eter de polioxietileno-9, saponina, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, taurocolato y taurodesoxicolato. En algunas realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion es caprato de sodio. En algunas realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion es clorhexidina.

En algunos aspectos, el polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una o mas capas de una cornea intacta en menos de aproximadamente 8 horas. En otros aspectos, la composicion proporcionada por la presente invencion comprende el polipeptido de union a antlgeno (es decir, anticuerpo de cadena sencilla) a una concentracion mayor de aproximadamente 2,5 mg/ml, en la que el polipeptido es suficientemente soluble como para transitar por una cornea intacta en menos de aproximadamente 8 horas. La composicion puede comprender el polipeptido de union a antlgeno a una concentracion en el intervalo de desde mayor de aproximadamente 2,5 mg/ml hasta mayor de aproximadamente 10,0 mg/ml. Por ejemplo, la composicion puede comprender el polipeptido de union a antlgeno a una concentracion de aproximadamente 2,5 mg/ml, 3,0 mg/ml, 3,5 mg/ml, 4,0 mg/ml, 4,5 mg/ml, 5,0 mg/ml, 5,5 mg/ml, 6,0 mg/ml, 6,5 mg/ml, 7,0 mg/ml, 7,5 mg/ml, 8,0 mg/ml, 8,5 mg/ml, 9,0 mg/ml, 9,5 mg/ml, a mayor de

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aproximadamente 10,0 mg/ml, o cualquier valor incremental del mismo. Ha de entenderse que todos los valores e intervalos entre estos valores e intervalos pretenden estar englobados por la presente invencion. En algunas realizaciones, el polipeptido de union a antlgeno esta a una concentration mayor de aproximadamente 4,0 mg/ml. En otras realizaciones, el polipeptido de union a antlgeno esta a una concentracion mayor de aproximadamente 10,0 mg/ml.

En aun otras realizaciones, el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una cornea intacta en menos de aproximadamente 4 horas en ausencia de un potenciador de la penetration. En otras realizaciones, la composition comprende ademas un agente de potenciacion de la penetracion. En algunas realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion se selecciona del grupo que consiste en Azone, cloruro de benzalconio (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, polioxietileno-polioxipropileno 1800, caprato de sodio, acido caprllico, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, colato, aceite de ricino, aceite de malz, Cremophor-EL, DMSO, bromuro de decametonio, desoxicolato, sulfato de dextrano, EDTA, edetato de disodio, etanol, fusidato, glicocolato, laurilsulfato, L-a-lisofosfatidilcolina, N-lauroilsarcosina, NMP, acido oleico, fosfollpidos, lauril eter de polioxietileno-9, saponina, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, taurocolato y taurodesoxicolato. En algunas realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion es caprato de sodio. En otras realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion es clorhexidina.

En algunos aspectos, el polipeptido de union a antlgeno (es decir, anticuerpo de cadena sencilla), tiene una afinidad de union por un antlgeno diana de una kD de al menos 10E-6 M y es suficientemente soluble como para transitar por una union estrecha epitelial, y en la que el polipeptido sigue estando en forma monomerica en condiciones fisiologicas.

En otros aspectos, el polipeptido de union a antlgeno es estable a una temperatura de desde aproximadamente -80 grados centlgrados hasta aproximadamente 37 grados centlgrados. Por ejemplo, la composicion puede ser estable a una temperatura de -80 grados centlgrados, -70 grados centlgrados, -60 grados centlgrados, -50 grados centlgrados, -40 grados centlgrados, -30 grados centlgrados, -20 grados centlgrados, -10 grados centlgrados, 0 grados centlgrados, 10 grados centlgrados, 20 grados centlgrados, o 30 grados centlgrados, o cualquier valor incremental del mismo. Ha de entenderse que todos los valores e intervalos entre estos valores e intervalos pretenden estar englobados por la presente invencion. En algunas realizaciones, el polipeptido de union a antlgeno sigue siendo estable durante al menos aproximadamente ocho semanas. En otras realizaciones, el polipeptido de union a antlgeno sigue siendo estable durante al menos seis semanas a 4 grados centlgrados.

En algunos aspectos, el polipeptido de union a antlgeno tiene las caracterlsticas farmacodinamicas o farmacocineticas mostradas experimentalmente en la totalidad de cualquiera de las figuras dadas a conocer en el presente documento.

En otros aspectos, el polipeptido de union a antlgeno tiene una afinidad de union por un antlgeno diana de una kD de al menos 10E-6 M o mejor y es suficientemente soluble como para transitar por una union estrecha epitelial en menos de aproximadamente 8 horas. En algunas realizaciones, el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una union estrecha epitelial en aproximadamente 4 horas o menos.

En todavla aun otros aspectos, el polipeptido de union a antlgeno tiene una afinidad de union por un antlgeno diana de una kD de al menos 10E-6 M o mejor y tiene un valor de ^ Vmax correspondiente a la cinetica de transito de un polipeptido de union a antlgeno que puede cruzar una union estrecha epitelial en menos de aproximadamente 8 horas.

En otros aspectos, el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una union estrecha epitelial tal como se mide en un ensayo de monocapa de celulas epiteliales Caco-2 (adenocarcinoma de colon humano) convencional, de modo que sea adecuado para su uso en terapia. En diversos aspectos, el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una union estrecha epitelial tal como se mide en un ensayo de permeabilidad con yeyuno de raton convencional, de modo que sea adecuado para su uso en terapia. En aun otros aspectos, el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una union estrecha epitelial tal como se predice mediante ensayos de solubilidad de un hlbrido o doble hlbrido intracelulares convencionales, de modo que sea adecuado para su uso en terapia. En todavla aun otros aspectos, el polipeptido de union a antlgeno es suficientemente soluble como para transitar por una union estrecha epitelial tal como se predice mediante un ensayo de precipitation con PEG convencional o un ensayo de cromatografla de autointeraccion (SIC), de modo que sea adecuado para su uso en terapia.

Tambien se describe en el presente documento un metodo para identificar un polipeptido de union a antlgeno que tiene un valor de ^ Vmax correspondiente al transito del polipeptido de union a antlgeno a traves de una union estrecha epitelial en menos de aproximadamente 8 horas. El metodo comprende: expresar de manera intracelular polipeptidos de union a antlgeno candidatos en celulas huesped que tienen un sistema de gen indicador inducible, en el que el sistema de gen indicador produce una senal registrable cuando esta en presencia de un polipeptido de

union a antlgeno que tiene dicha cinetica de transito; y examinar dichas celulas para detectar una senal registrable, en el que la presencia de dicha senal identifica un polipeptido candidato como polipeptido de union a antlgeno que tiene dicha cinetica de transito. Un polipeptido de union a antlgeno identificado mediante este metodo se describe en el presente documento. Tambien se describe en el presente documento un kit para llevar a cabo este metodo.

5 Se describe ademas en el presente documento el tratamiento de un paciente con un estado ocular administrando de manera topica una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido de union a antlgeno dado a conocer en el presente documento, de tal manera que se logra el tratamiento. El estado ocular puede ser uveitis, o degeneracion macular asociada a la edad.

Se describe ademas en el presente documento un polipeptido de union a antlgeno que comprende una region de 10 polipeptido que tiene al menos un motivo de union a antlgeno flanqueado por al menos una region de armazon y en el que el polipeptido tiene una cinetica de transito suficiente como para cruzar una union estrecha epitelial en menos de aproximadamente 8 horas. El polipeptido puede comprender un motivo de union a antlgeno flanqueado por dos regiones de armazon, dos motivos de union a antlgeno flanqueados por tres regiones de armazon, tres motivos de union a antlgeno flanqueados por cuatro regiones de armazon, o seis motivos de union a antlgeno flanqueados por 15 ocho regiones de armazon con una region de ligador intermedio entre las regiones de armazon cuarta y quinta. El motivo de union a antlgeno tambien puede ser una CDR y la region de armazon puede ser una region de entramado de inmunoglobulina. El polipeptido tambien puede comprender tres CDR y cuatro regiones de entramado intermedias o seis CDR y ocho regiones de entramado y una region de ligador intermedio.

Se describe ademas en el presente documento un polipeptido de union a antlgeno que puede unirse 20 especlficamente a un antlgeno diana y que tiene una cinetica de transito suficiente como para cruzar una union estrecha epitelial en menos de aproximadamente 8 horas y en el que el polipeptido esta representado por la formula:

Y; o

Z; o

Y-L-Z; o 25 Z-L-Y;

siendo Y [F1-CDR1-F2-CDR2-F3-CDR3 F4] y siendo Z [F5-CDR1-F6-CDR2-F7-CDR3 F8];

en la que las regiones de entramado (F1-F4) de Y se derivan de una o mas regiones de entramado de cadena sencilla humanas; las regiones de entramado (F5-F6) de Z se derivan de una o mas regiones de entramado de cadena sencilla humanas; las CDR (CDR 1-3) de Y se derivan de una o mas CDR donadoras que pueden unirse al 30 antlgeno diana; las CDR (CDR 4-6) de Z se derivan de una o mas CDR donadoras que pueden unirse al antlgeno diana; y L es un ligador polipeptldico flexible. Y y Z pueden estar representadas por cualquiera de las secuencias dadas a conocer en el presente documento, o secuencias consenso de las mismas.

Alternativamente, pueden introducirse aleatoriamente mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o de parte de la secuencia codificante del polipeptido de union a antlgeno, tal como mediante mutagenesis por saturacion. Una 35 “secuencia consenso” es una secuencia formada a partir de los aminoacidos (o nucleotidos) que se producen de la manera mas frecuente en una familia de secuencias relacionadas (vease por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania 1987). En una familia de protelnas, cada posicion en la secuencia consenso esta ocupada por el aminoacido que se produce de la manera mas frecuente en esa posicion en la familia. Si dos aminoacidos se producen de manera igual de frecuente, puede incluirse cualquiera en la secuencia 40 consenso.

En algunos aspectos, el polipeptido de union a antlgeno se formula para obtener una concentracion intraocular de al menos aproximadamente 100 ng/ml o mas. En aun otros aspectos, el anticuerpo de cadena sencilla se formula para la administracion topica para producir una concentracion intraocular de 100 ng/ml o mas basandose en un sistema de modelo celular o animal tal como se da a conocer en el presente documento.

45 En otros aspectos, el polipeptido de union a antlgeno se formula para la aplicacion topica al ojo y puede atravesar la cornea y pasar a un espacio intraocular en ausencia de potenciador de la penetracion. Se describe en el presente documento el tratamiento, la prevention o el diagnostico de una enfermedad o un trastorno ocular usando un polipeptido de union a antlgeno dado a conocer en el presente documento.

Breve description de los dibujos

50 Los aspectos, realizaciones, objetos, caracterlsticas y ventajas anteriores y otros de la invention pueden entenderse

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con mas detalle a partir de la siguiente descripcion junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos, los caracteres de referenda similares se refieren generalmente a caracteristicas y elementos estructurales similares en la totalidad de las diversas figuras. Los dibujos no son necesariamente a escala, poniendose enfasis mas bien en ilustrar los principios de la invencion.

La figura 1 muestra los perfiles de elucion de ESBA105 (figura 1A), TB-WT (figura 1B) y scFv de Lucentis (figura 1C) de una cromatografia de exclusion molecular preparativa (filtracion en gel) tras la etapa de replegamiento. mUA: miliunidades de absorbancia.

La figura 2 muestra el perfil de elucion de una filtracion en gel analitica de las fracciones de picos recogidas de ESBA105 despues de filtracion en gel preparativa.

La figura 3 muestra la solubilidad de ESBA105 en polietilenglicol (PEG).

La figura 4 muestra la estabilidad de los anticuerpos scFv ESBA105 y QC 15.2 cuando se almacenan durante dos semanas a diferentes temperaturas y concentraciones. Se separaron los anticuerpos mediante SDS PAGE y se tineron con azul brillante de Coomassie.

La figura 5 muestra la actividad de ESBA105 determinada mediante un ensayo de L929 despues de 8 semanas de almacenamiento o bien a 37°C o bien a -80°C, ambos a pH 7,4. Los triangulos indican ESBA105 almacenado a 37°C y los cuadrados ESBA105 almacenado a -80°C.

La figura 6 muestra esquematicamente jeringas que retiran liquido de la cavidad vitrea y la camara anterior, respectivamente. 1 liquido de la cavidad vitrea, 2 liquido ocular de la camara anterior, 3 iris, 4 cornea, 13 jeringa.

La figura 7 muestra la penetracion de ESBA105 en la camara anterior de ojos de conejo intactos despues de 4 horas.

La figura 8 muestra la penetracion de ESBA105 en la cavidad vitrea de ojos de conejo intactos despues de 4 horas. La figura 9 muestra la penetracion de ESBA105 a traves de una capa de celulas Caco-2.

La figura 10 muestra una comparacion de eficacias de penetracion de un anticuerpo de formato de IgG de longitud completa (infliximab) y un fragmento de anticuerpo de formato de cadena sencilla (ESBA105) a traves de yeyuno de rata en el modelo de saco no evertido para la absorcion intestinal de farmaco. Los cuadrados negros indican la concentracion de ESBA105 en nM, los circulos blancos la concentracion de infliximab en nM.

La figura 11a es una representacion grafica de la cantidad de ESBA105 en ng/ml hallada en el humor acuoso de los ojos de conejo de los que se tomaron muestras a lo largo del transcurso del estudio descrito en el ejemplo 7.

La figura 11b es una representacion grafica de la cantidad de ESBA105 en ng/ml hallada en el humor vitreo de los ojos de conejo de los que se tomaron muestras a lo largo del transcurso del estudio descrito en el ejemplo 7.

La figura 11c es una representacion grafica de la cantidad de ESBA105 en ng/ml hallada en la neurorretina de los ojos de conejo de los que se tomaron muestras a lo largo del transcurso del estudio descrito en el ejemplo 7.

La figura 11d es una representacion grafica de la cantidad de ESBA105 en ng/ml hallada en el suero de los ojos de conejo de los que se tomaron muestras a lo largo del transcurso del estudio descrito en el ejemplo 7.

La figura 12 es una representacion grafica del pK local in vitro de ESBA105 en ojos de conejo. Extracto de retina - 500 ng/ml. ELISA de retina 060721 (de ojo de conejo completo n.° 060718).

La figura 13 es una representacion grafica del tiempo medio local de ESBA105 tras la inyeccion vitrea en ojos de conejo.

La figura 14 representa graficamente el modelado de acumulacion local de farmaco despues de la administracion de ESBA105 (5 gotas/dia, ESBA105 10 mg/ml, Pef = 2,9x10-5).

La figura 15 es una representacion grafica del pK del ojo. 4 cornea, 5 pelicula lacrimal, 6 camara anterior, 7 cristalino, 8 cuerpo vitreo, 9 retina, 10 esclerotica.

La figura 16 es una representacion grafica de rutas de absorcion y eliminacion para ESBA105. 11 farmacos hidrofilos, 12 farmacos lipofilos.

La figura 17 muestra datos de dosis-respuesta en un modelo de monoartritis aguda in vivo relevante (rata). n= 3, TNFa: 10 mg entre otros.

La figura 18 A muestra una representacion grafica de los resultados in vivo de la aplicacion topica a ojos de conejo. Cada punto de datos representa el promedio de dos conejos (cuatro ojos), que recibieron una gota (30 mcl) de 5 disolucion de ESBA105 10 mg/ml en PBS pH 6,5 cada 20 minutos a lo largo de un periodo de tratamiento maximo de 10 horas.

Se aplicaron las gotas encima de la pupila y se apretaron posteriormente los parpados para retirar el fluido en exceso (7 mcl restantes). Se determinaron las concentraciones de ESBA105 en humor acuoso, vltreo y suero mediante ELISA.

10 La figura 19 muestra una representacion grafica de los resultados in vivo de la aplicacion topica a ojos de conejo. Se aplico una gota de disolucion de ESBA105 10 mg/ml al saco ocular inferior de ambos ojos de cada animal cinco veces al dla durante hasta 6 dlas.

Toma de muestras: Despues de aplicar la segunda gota en el punto de tiempo indicado (despues de 1, 3 o 6 dlas) se sacrificaron dos animales y se sometieron ambos ojos, as! como el suero a analisis mediante ELISA cuantitativo. 15 Se determinaron los niveles de ESBA105 en el humor acuoso (figura 19A), en el vltreo (figura 19 B), en la neurorretina (figura 19 C), en la coroides (figura 19 D) y en el suero (figura 19 E) tal como se indica.

“Carr” significa portador (carrier), lo que significa disolucion tampon sin ESBA105. Las barras de datos representan las concentraciones de ESBA105 maxima, la minima y la mediana medidas en los compartimentos indicados y se facilitan junto con las desviaciones estandar respectivas.

20 Descripcion detallada de la invencion

Para proporcionar un entendimiento claro de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se proporcionan a continuacion de manera conveniente las siguientes definiciones.

Definiciones

El termino “anticuerpo” se refiere a anticuerpos completos y a cualquier fragmento de union a antigeno (es decir, 25 “parte de union a antigeno”, “polipeptido de union a antigeno” o “agente de union inmunologico”) o de cadena sencilla de los mismos. Un “anticuerpo” se refiere a una glicoprotelna que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, o una parte de union a antigeno del mismo. Cada cadena pesada se compone de una region variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada se 30 compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una region variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones de entramado (FR). Cada VH y VL se compone de 35 tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino-terminal hasta el extremo carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de union que interacciona con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a factores o tejidos del huesped, incluyendo diversas celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento 40 clasico.

El termino “union a antigeno” se refiere a la capacidad para unirse especificamente a un antigeno. Se ha mostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union englobados dentro del termino “parte de union a antigeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y 45 CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de un solo dominio o dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de la complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinacion de dos o mas CDR aisladas que pueden unirse 50 opcionalmente mediante un ligador sintetico. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento de Fv, VL y VH, estan codificados por genes independientes, pueden unirse, usando metodos recombinantes, mediante un ligador sintetico que permite que se preparen como una sola cadena proteica en la que se aparean las regiones VL y VH para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); veanse por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de

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anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y se examinan los fragmentos para determinar su utilidad de la misma manera que se hace con los anticuerpos intactos.

Tal como se usa, “inmunoglobulina” puede referirse a cualquier clase o subclase reconocida de inmunoglobulinas tales como IgG, IgA, IgM, IgD o IgE. La inmunoglobulina puede derivarse de cualquier especie, tales como de origen humano, murino o de conejo. Ademas, la inmunoglobulina puede ser policlonal, monoclonal o fragmentos. Tales fragmentos de inmunoglobulina pueden incluir, por ejemplo, los fragmentos Fab', F(ab')2, Fv o Fab, u otros fragmentos de inmunoglobulina que reconozcan antlgenos. Tales de fragmentos de inmunoglobulina pueden prepararse, por ejemplo, mediante digestion enzimatica proteolltica, por ejemplo, mediante digestion con pepsina o papalna, alquilacion reductora o tecnicas recombinantes. Los materiales y metodos para preparar tales fragmentos de inmunoglobulina los conocen bien los expertos en la tecnica (Parham, (1983) J. Immunology, 131:2895; Lamoyi et al., (1983) J. Immunological Methods, 56:235; Parham, (1982) J. Immunological Methods, 53:133; y Matthew et al., (1982) J. Immunological Methods, 50:239).

Ademas, la inmunoglobulina puede ser un anticuerpo de cadena sencilla (“SCA”). Estos pueden consistir en fragmentos Fv de cadena sencilla (“scFv”) en los que los dominios variables de cadena ligera (“VL”) y variables de cadena pesada (“VH”) se unen mediante un puente peptldico o mediante enlaces disulfuro. Ademas, la inmunoglobulina puede consistir en dominios VH individuales (dab) que presentan actividad de union a antlgeno. Veanse, por ejemplo, G. Winter y C. Milstein, Nature, 349, 295 (1991); R. Glockshuber et al., Biochemistry 29, 1362 (1990); y E. S. Ward et al., Nature 341, 544 (1989).

Tal como se usa en el presente documento, el termino “polipeptido” se refiere a un pollmero de dos o mas de los aminoacidos naturales o aminoacidos no naturales. Los polipeptidos de la invencion comprenden al menos una secuencia de aminoacidos derivada de una molecula de inmunoglobulina (Ig). En una realizacion, un polipeptido de la invencion comprende una secuencia de aminoacidos o uno o mas restos no derivados de una molecula de inmunoglobulina. Se describen modificaciones a modo de ejemplo en mas detalle a continuacion. Por ejemplo, en una realizacion, un polipeptido de la invencion puede comprender una secuencia de ligador flexible. En otra realizacion, puede modificarse un polipeptido para anadir un resto funcional (por ejemplo, PEG, un farmaco o un marcador).

Los polipeptidos preferidos de la invencion comprenden una secuencia de aminoacidos derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana. Sin embargo, los polipeptidos pueden comprender uno o mas aminoacidos de otra especie de mamlfero. Por ejemplo, puede incluirse una parte de cadena pesada de primate, una parte de region de bisagra o un sitio de union en los polipeptidos objeto. Alternativamente, pueden estar presentes uno o mas aminoacidos murinos en un polipeptido. Polipeptidos preferidos de la invencion son no inmunogenicos.

Un experto habitual en la tecnica tambien entendera que los polipeptidos de la invencion pueden alterarse de tal manera que varlen en la secuencia de aminoacidos con respecto al polipeptido que se produce de manera natural o nativo del que se derivaron, mientras que conservan la actividad deseada del polipeptido nativo. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleotidos o aminoacidos que conducen a sustituciones conservativas o cambios en residuos de aminoacido “no esenciales”. Una molecula de acido nucleico aislada que codifica para una variante no natural de un polipeptido derivado de una inmunoglobulina (por ejemplo, una parte de cadena pesada o parte de cadena ligera de inmunoglobulina) puede crearse introduciendo una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de nucleotidos en la secuencia de nucleotidos de la inmunoglobulina de tal manera que se introduzcan una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos en la protelna codificada. Pueden introducirse mutaciones mediante tecnicas convencionales, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR.

Los polipeptidos de la invencion pueden comprender sustituciones de aminoacidos conservativas en uno o mas residuos de aminoacido no esenciales. Una “sustitucion de aminoacidos conservativa” es una en la que el residuo de aminoacido se sustituye por un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la tecnica familias de residuos de aminoacido que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales basicas (lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales con ramificacion beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Asl, un residuo de aminoacido no esencial en el polipeptido se sustituye preferiblemente por otro residuo de aminoacido de la misma familia de cadenas laterales. En otra realizacion, puede sustituirse una serie de aminoacidos por otra serie estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composicion de los miembros de la familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realizacion, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de la secuencia codificante de la inmunoglobulina, tal como mediante mutagenesis por saturacion, y pueden incorporarse los mutantes resultantes a polipeptidos de la invencion y examinarse para determinar su capacidad para unirse a la diana deseada. Los terminos “union especlfica”, “union selectiva”, “se une selectivamente a”, y “se une especlficamente a”, se refieren a la union del anticuerpo a un epltopo en un antlgeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una

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afinidad (KD) de aproximadamente menos de 10'6 M, tal como aproximadamente menos de 10-7 M, 10-8 M o 10-9 M o incluso inferior. El termino “KD” se refiere a la constante de equilibrio de disociacion de una interaccion anticuerpo- antlgeno particular. Normalmente, los anticuerpos de la invencion se unen a su antlgeno diana con una constante de equilibrio de disociacion (KD) de menos de aproximadamente 10-6 M, tal como menos de aproximadamente 10-7 M, 10-8 M o 10-9 M o incluso inferior, por ejemplo, tal como se determina usando la tecnologla de resonancia de plasmon superficial (SPR) en un instrumento BIACORE.

El termino “cinetica de transito” o “farmacocinetica” tal como se usa en el presente documento, se refiere a todos los factores relacionados con la dinamica de absorcion del farmaco, su distribucion en tejidos o llquidos corporales y su metabolismo y/o elimination. Esto implica los factores fisicoqulmicos que regulan la transferencia del polipeptido a traves de membranas debido a que la absorcion, distribucion, biotransformacion y excretion de un polipeptido implican todas el paso del polipeptido a traves de membranas celulares.

Presenta un gran interes para el medico cllnico la biodisponibilidad de un polipeptido. Este termino, tal como se usa en el presente documento, indica la extension con que un polipeptido alcanza su sitio de action o un llquido biologico desde el que el polipeptido tiene acceso a su sitio de accion. Los factores que afectan a la biodisponibilidad incluyen la tasa de absorcion y el metabolismo o la eliminacion del polipeptido desde el sujeto. Muchos factores afectan la absorcion, estos incluyen los numerosos factores fisicoqulmicos que afectan el transporte a traves de membranas tales como la solubilidad de un polipeptido y mecanismos de captation as! como factores tales como el sitio de administration y la formulation (concentration) y composition del polipeptido. Las diversas vlas de administration de polipeptidos tienen caracterlsticas de absorcion notablemente diferentes. Estas vlas incluyen ingestion oral, absorcion pulmonar, inyeccion parenteral, incluyendo; inyeccion intramuscular, subcutanea, intravenosa, intraarterial, intratecal o intraperitoneal y aplicacion topica a las membranas mucosas, la piel o los ojos. En una realization preferida, un polipeptido de la invencion para tratar una enfermedad ocular se administra de manera topica a la superficie del ojo, por ejemplo, en forma de colirio. La cinetica de transito de un polipeptido de la invencion puede determinarse usando, por ejemplo, cualquiera de las moleculas de base celular o animal dadas a conocer en el presente documento, y se seleccionan normalmente para que sean adecuadas para el transito cllnicamente relevante a traves de las uniones estrechas de la barrera hematoencefalica, el intestino o el ojo.

El termino “sujeto” se conoce en la tecnica y, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal de sangre caliente, mas preferiblemente un mamlfero, incluyendo, por ejemplo, animales no humanos tales como ratas, ratones, conejos, gatos, perros, ovejas, ganado, ademas de seres humanos. En una realizacion preferida, el sujeto es un ser humano. Los sujetos son aquellos susceptibles de tratamiento con un polipeptido de union a antlgeno soluble de la presente invencion.

Un “agente de potenciacion de la penetration” o “potenciador de la penetration” tal como se usa en el presente documento, se refiere a moleculas o compuestos que fomentan el transito a traves de una union epitelial. Los agentes de potenciacion de la penetracion para su uso con la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, Azone, cloruro de benzalconio (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, polioxietileno-polioxipropileno 1800, caprato de sodio, acido caprllico, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, colato, aceite de ricino, aceite de malz, Cremophor-EL, DMSO, bromuro de decametonio, desoxicolato, sulfato de dextrano, EDTA, edetato de disodio, etanol, fusidato, glicocolato, laurilsulfato, L-a-lisofosfatidilcolina, N-lauroilsarcosina, NMP, acido oleico, fosfollpidos, lauril eter de polioxietileno-9, saponina, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, taurocolato y taurodesoxicolato. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion es caprato de sodio. En otras realizaciones, el agente de potenciacion de la penetracion es clorhexidina.

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo scFv que se une especlficamente a un antlgeno seleccionado y tiene capacidad mejorada de penetracion en tejidos. Dicho anticuerpo se caracteriza porque puede obtenerse mediante un metodo que comprende

(i) seleccionar de una reserva de regiones de entramado solubles y estables, la region de entramado que concuerde

mejor con la region de entramado con un anticuerpo no humano de una especificidad de union a antlgeno

seleccionada,

(ii) o bien proporcionar a dicha region de entramado CDR que se unen a dicho antlgeno o bien mutar la region de entramado de dicho anticuerpo no humano a la secuencia de dicha region de entramado soluble y estable,

(iv) someter a prueba el anticuerpo generado para determinar su union a antlgeno.

El termino “que concuerde mejor” significa que sea lo mas proxima posible con respecto a la estructura primaria o terciaria.

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En general, el anticuerpo de la presente invencion comprende una region de entramado con un dominio VL y/o uno VH, seleccionandose dicha region de entramado de al menos parte de un repertorio de anticuerpos humanos naturales mediante un metodo independiente de antlgeno para una alta estabilidad y solubilidad intracelular en una celula de levadura. Dicho metodo tambien se conoce como examen de “control de calidad” de regiones de entramado de anticuerpo y ha dado como resultado una seleccion de regiones de entramado de anticuerpo particularmente estables y solubles que se caracterizan por una alta estabilidad y solubilidad intracelular. Estas regiones de entramado pueden usarse, por ejemplo, en un segundo sistema de examen basado en levadura para determinar la especificidad de antlgeno. En este caso, las CDR de un anticuerpo particularmente estable y soluble pueden aleatorizarse y los anticuerpos resultantes pueden examinarse para determinar el mejor reconocimiento antigenico posible. Alternativamente, pueden injertarse CDR de anticuerpos conocidos con fuerte afinidad de union a un antlgeno de eleccion sobre dichas regiones de entramado particularmente estables y solubles. Opcionalmente, dicho anticuerpo puede mejorarse adicionalmente mediante mutagenesis de CDR y/o region/regiones de entramado seleccionada(s), seleccionando clones mejorados en el “sistema de control de calidad” (documento WO0148017, Auf der Maur et al. 2004), es decir, mutando dicho anticuerpo scFv mediante mutagenesis dirigida al sitio o al azar de uno o mas CDR seleccionadas y/o la region de entramado y seleccionando anticuerpos estables y solubles en condiciones iguales o mas rigurosas. La seleccion puede realizarse in vivo en el sistema de control de calidad de levadura.

El termino “residuos de region de entramado” se refiere a residuos de aminoacido de unidades de polipeptido de union a antlgeno, o los residuos de aminoacido de polipeptido correspondientes de modulos de union a antlgeno, que contribuyen a la topologla de plegamiento, es decir, que contribuyen al plegamiento de dicha unidad (o modulo) o que contribuyen a la interaccion con una unidad vecina (o modulo). Tal contribucion podrla ser la interaccion con otros residuos en la unidad (o modulo), o la influencia sobre la conformacion de la estructura principal del polipeptido tal como se encuentra en helices a o laminas b, o tramos de aminoacidos que forman bucles o polipeptidos lineales. El termino “residuos de interaccion con la diana” se refiere a residuos de aminoacido de las unidades, o los residuos de aminoacido correspondientes de los modulos, que contribuyen a la interaccion con sustancias diana. Tal contribucion podrla ser la interaccion directa con las sustancias diana, o la influencia sobre otros residuos que interaccionan directamente, por ejemplo, mediante la estabilizacion de la conformacion del (poli)peptido de dicha unidad (o modulo) para permitir o potenciar la interaccion de dichos residuos que interaccionan directamente con dicha diana. Tales residuos de interaccion con la diana y de region de entramado pueden identificarse mediante analisis de los datos estructurales obtenidos mediante los metodos fisicoqulmicos a los que se hizo referencia anteriormente, o mediante comparacion con informacion estructural conocida y relacionada bien conocida por los profesionales de la biologla estructural y/o bioinformatica. Tales regiones de entramado tambien pueden denominarse armazones ya que proporcionan soporte para la presentacion de los residuos de interaccion con la diana mas divergentes o CDR.

Las CDR o residuos de interaccion con la diana pueden injertarse en regiones de entramado adecuadas, tales como armazones alternativos que se conocen bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, CTLA-4, tendamistat, fibronectina (FN3), neocarzinostatina, CBM4-2, lipocalinas, receptor de celulas T, dominio de protelna A (protelna Z), Im9, protelnas con repeticion de anquirina disenadas (DARPin), protelnas TPR disenadas, dedo de zinc, pVIII, polipeptido pancreatico aviar, GCN4, dominio WW, dominio 3 de homologla con Src (SH3), dominio 2 de homologla con Src (SH2), dominios PDZ, TEM-1b-lactamasa, GFP, tiorredoxina, nucleasa estafilococica, dedo de PHD, CI-2, BPT1 aPpI, HpSTI, ecotina, LACI-D 1, LDTI, MTI-II, toxinas de escorpion, peptido A de defensina de insectos, EETIII, Min-23, CBD, PBP, citocromo b562, dominio A del receptor de Ldl, g-cristalina, ubiquitina, transferina y dominio similar a lectina de tipo C (vease Binz et al. (octubre de 2005) Nat Biotech 23(10):1257-68), o en regiones de entramado adecuadas de polipeptidos de union a antlgeno derivados de inmunoglobulina que se conocen bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a dominios VhH, dominios V-NAR, dominios Vh, Fab, scFv, Bis-scFv, Ig de camello, IfNAR, IgG, Fab2, Fab3, minicuerpo, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos (vease Holliger, P. y Hudson, P. (2005), Nat. Biotechnol. 23(9), pags. 1126-1136).

Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invencion tiene una o mas de las siguientes caracterlsticas adicionales:

- es estable en condiciones reductoras tal como se mide en un ensayo de interaccion con levaduras, en el que la actividad de una protelna marcadora seleccionable fusionada a dicho scFv se correlaciona con una alta estabilidad y solubilidad de dicho scFv en un entorno intracelular. Dicho ensayo de interaccion con levaduras, el denominado “control de calidad”, se describio en detalle (Auf der Maur et al. (2001); Auf der Maur et al., 2004; incorporandose las referencias en su totalidad al presente documento).

- es estable durante al menos 1 mes, preferiblemente al menos dos meses, lo mas preferido al menos seis meses a de 20°C a 40°C, preferiblemente a 37°C en PBS,

- sigue siendo monomerico en condiciones fisiologicas,

- es soluble a temperatura ambiental en PBS a concentraciones de > aproximadamente 1 mg/ml, preferiblemente de

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> aproximadamente 4 mg/ml, mas preferiblemente de > aproximadamente 10 mg/ml, incluso mas preferiblemente de

> aproximadamente 25 mg/ml y lo mas preferiblemente de > aproximadamente 50 mg/ml,

- revela un punto medio de transition en una valoracion con clorhidrato de guanidinio de al menos 1,5 M, preferiblemente de al menos 1,75 M, mas preferiblemente de al menos 1,9 M, lo mas preferiblemente de al menos 2 M, es decir es resistente a la desnaturalizacion.

El termino anticuerpo tal como se usa en el alcance de la presente invention se refiere a un anticuerpo scFv o un fragmento de anticuerpo que se une a un antlgeno seleccionado. Por tanto, el anticuerpo scFv de la presente invencion puede ser o bien un scFv completo que comprende un dominio VL y uno VH que se unen mediante un peptido ligador corto, por ejemplo, un ligador que comprende de 1 a 4 repeticiones de la secuencia GGGGS, preferiblemente un (GGGGS)4-peptido (SEQ. ID. NO. 16), mas preferiblemente un ligador de la secuencia GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS (SEQ. ID. NO: 17), o un ligador tal como se da a conocer en Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731, o simplemente un dominio VL y uno VH, que tiene suficiente capacidad de union para el antlgeno seleccionado. El ligamiento de VL y VH puede ser en cualquier orientation, VL-ligador-VH o VH-ligador-VL.

En un aspecto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo que es estable durante al menos 1 mes, preferiblemente al menos dos meses, en solution salina tamponada con fosfato (PBS). Preferiblemente dicho anticuerpo se somete a prueba para determinar la estabilidad a temperatura fisiologica, es decir, a 37°C. En otra realization preferida, dicho anticuerpo es estable durante al menos 6 meses cuando se mantiene a 4°C en PBS, o despues de liofilizacion a temperatura ambiente. La estabilidad puede someterse a prueba, por ejemplo, analizando cantidades patron de dichos anticuerpos mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) seguido por un procedimiento de tincion convencional, tal como una tincion de Coomassie o tincion de plata, y comparando la intensidad de tincion de la banda de longitud completa con la de una protelna patron. Ademas, se comprueba la ausencia de productos de degradation. La protelna degradada corre como una mancha, o es incluso invisible debido a lo cortos que son los productos de degradacion, en cuyo caso solo la perdida de intensidad de la banda de protelna de longitud completa indica degradacion. En general, puede suponerse una estabilidad flsica de un anticuerpo si no se observan signos de agregacion, precipitation y/o desnaturalizacion tras la inspection visual del color y/o la transparencia o tal como se mide mediante dispersion de luz UV o mediante cromatografla de exclusion molecular.

La estabilidad en cuanto a la actividad despues de un cierto tiempo de almacenamiento es una caracterlstica importante adicional del anticuerpo de la presente invencion. Puede determinarse comparando la potencia del anticuerpo antes y despues del almacenamiento, por ejemplo, en ensayos de union a diana in vitro usando ELISA o en ensayos de actividad celular in vivo en los que se mide la potencia de inhibition del anticuerpo.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo que es y sigue siendo monomerico en condiciones fisiologicas, tal como puede evaluarse, por ejemplo, mediante filtration en gel. El estado monomerico es una caracterlstica importante de anticuerpos que pueden penetrar a traves de barreras epiteliales.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un anticuerpo, que es soluble a temperatura ambiental en PBS a concentraciones mayores de aproximadamente 1 mg/ml, preferiblemente mayores de aproximadamente 4 mg/ml, lo mas preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml. La solubilidad del anticuerpo purificado puede determinarse mediante precipitacion con PEG usando PEG3000, o mediante cromatografla de autointeraccion (SIC).

En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo, que revela un punto medio de transicion en una valoracion con clorhidrato de guanidinio de al menos aproximadamente 1,5 M, preferiblemente de al menos aproximadamente 1,75 M, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 1,9 M, lo mas preferiblemente de al menos aproximadamente 2 M. Esto es una medida para la estabilidad en el sentido de resistencia frente al desplegamiento, mediante lo cual el desplegamiento/desnaturalizacion inducidos mediante la adicion de guanidinio va seguido por espectroscopla de discrolsmo celular o fluorescencia.

En la presente invencion, el anticuerpo que tiene una o mas de caracterlsticas bioflsicas mencionadas anteriormente se caracteriza estructuralmente por una region de entramado del dominio variable de cadena ligera (VL) de una similitud de al menos el 85%, preferiblemente una similitud de al menos aproximadamente el 95%, lo mas preferiblemente una identidad de al menos el 98% con una region de entramado de VL seleccionada del grupo que comprende SEQ. ID. NO. 1 (de tipo kappa1), SEQ. ID. NO. 2 (de tipo kappa1), SEQ. ID. NO. 3 (de tipo kappa3) o SEQ. ID. NO. 4 (de tipo lambda1), SEQ. ID. NO. 5 (de tipo kappa3), SEQ. ID. NO. 6 (de tipo lambda3) o SEQ. ID. NO. 7 (de tipo lambda3) y/o una region de entramado del dominio variable de cadena pesada (VH) de una similitud de al menos el 85%, preferiblemente una similitud de al menos aproximadamente el 95%, lo mas preferido una identidad de al menos el 98% con una region de entramado de VH seleccionada del grupo que comprende SEQ. ID. NO. 8 (de tipo H3, SEQ. ID. NO:9 (de tipo H3), SEQ. ID. NO. 10 (de tipo H1b), o SEQ. ID. NO. 11 (de tipo H3). En una realizacion preferida, se usa la combination entre homologos de Vl de SEQ. ID. NO:2 y homologos de VH de SEQ. ID. NO:8, combinacion entre homologos de VL de SEQ. ID. NO:4 y homologos de VH de SEQ. ID. NO: 10, o combinaciones entre homologos de una cualquiera de las secuencias de VL mencionadas anteriormente, un

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homologo de VH de SEQ. ID. NO:9. Se prefieren mas anticuerpos con una similitud de > el > 90%, e incluso mas preferido con una similitud de > el > 95% de SEQ. ID. NO. 7. Lo mas preferido son anticuerpos de la secuencia SEQ. Id. NO:7 y/o SEQ. ID. NO:8. Tambien se entiende que la invencion engloba una cualquiera de las secuencias de VL dadas a conocer en combinacion con una cualquiera de las secuencias de VH dadas a conocer siempre que se mantenga la especificidad de union a la diana.

El porcentaje de similitud entre dos secuencias es una medida de la extension en que la estan relacionadas secuencias proteicas. La extension de la similitud entre dos secuencias puede basarse en el tanto por ciento de identidad y/o conservacion de secuencia. La conservacion se refiere a cambios en una posicion especlfica de una secuencia de aminoacidos que conserva las propiedades fisicoqulmicas del residuo original. La similitud entre secuencias se determina normalmente mediante alineacion de secuencias.

Las similitudes a las que se hace referencia en el presente documento han de determinarse usando los programas BLAST (Basic Local Alignment Search Tools (herramientas de busqueda de alineacion local basica); vease Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) “Basic local alignment search tool”. J. Mol. Biol. 215:403-410) accesible en Internet. Las busquedas de protelnas mediante BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos similares a las de las moleculas de protelna de la invencion. Para obtener alineaciones con huecos para fines de comparacion, puede utilizarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y nBlAST). El tanto por ciento de identidad entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para la alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del tanto por ciento de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matematico, lo que conocen bien los expertos en la tecnica.

El tanto por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMp y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Tambien puede determinarse el tanto por ciento de identidad usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4.11-17 (1989) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de residuos con peso PAM129, una penalizacion por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Ademas, el tanto por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando o bien una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.

En otro aspecto, el anticuerpo de la presente invencion se modifica qulmicamente. Las modificaciones qulmicas pueden cambiar propiedades del anticuerpo tales como estabilidad, solubilidad, especificidad o afinidad de union a antlgeno, citotoxicidad de semivida in vivo y capacidad de penetracion en tejidos. Las modificaciones qulmicas las conoce bien el experto. Una modificacion qulmica preferida del anticuerpo de la presente invencion es pegilacion.

En otro aspecto preferido, la afinidad del anticuerpo de la presente invencion se caracteriza por una constante de disociacion Kd de menos de aproximadamente 100 nM, preferiblemente menos de aproximadamente 10 nM, y lo mas preferiblemente menos de aproximadamente 1 nM. Se determinan parametros de union tales como afinidad del anticuerpo con su antlgeno relacionado mediante resonancia de plasmon superficial (BiaCore) o ELISA. Estos metodos se conocen bien en la tecnica.

Preferiblemente, el antlgeno al que se une el anticuerpo de la presente invencion es TNFa (factor de necrosis tumoral alfa). TNFa, tambien conocida como caquectina, es una citocina de mamlferos que se produce de manera natural producida por numerosos tipos de celulas, incluyendo monocitos y macrofagos en respuesta a endotoxina u otros estlmulos. TNFa es un mediador importante de reacciones inflamatorias, inmunologicas y fisiopatologicas (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802). Un gran numero de trastornos estan asociados con niveles elevados de TNFa, muchos de ellos de importancia medica significativa. Se ha mostrado que TNFa esta regulado por incremento en varias enfermedades humanas, incluyendo enfermedades cronicas tales como artritis reumatoide (AR), trastornos inflamatorios del intestino incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, septicemia, insuficiencia cardiaca congestiva, asma bronquial y esclerosis multiple. TNFa tambien se denomina citocina proinflamatoria. Sin embargo, tambien esta implicada en trastornos con una manifestation local, tales como enfermedades oculares, por ejemplo, degeneration macular, uveitis, glaucoma, cataratas, retinitis, sindrome de ojo seco, escleritis, conjuntivitis y queratitis. El anticuerpo de la presente invencion es particularmente adecuado para el tratamiento de tales enfermedades, ya que puede aplicarse localmente y de manera topica, por ejemplo, para enfermedades oculares mediante colirio.

Tambien se describe en el presente documento una secuencia de ADN que codifica para el anticuerpo de la presente invencion, asi como un vector de expresion o donation que contiene dicha secuencia de ADN. Ademas, se

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da a conocer en el presente documento una celula huesped adecuada transformada con dicha secuencia de ADN. Esta puede ser una celula procariota o eucariota, en particular una celula de E. coli, de levadura, vegetal, de insecto o de mamlfero.

El anticuerpo de la presente invencion puede generarse usando tecnicas de rutina en el campo de la genetica recombinante. Conociendo las secuencias de los polipeptidos, pueden generase los ADNc que codifican para las mismas mediante slntesis genica.

Ademas, se da a conocer en el presente documento un metodo para la produccion del anticuerpo de la presente invencion, que comprende cultivar la celula huesped transformada con el ADN que codifica para dicho anticuerpo en condiciones que permiten la slntesis de dicho anticuerpo, y recuperar dicha molecula de dicho cultivo. Preferiblemente, dicho metodo proporciona un anticuerpo scFv purificado a partir de cuerpos de inclusion de E. coli o del periplasma de E. coli, si el constructo de scFv usado comprende una secuencia senal que dirige el polipeptido al periplasma.

Se da a conocer en el presente documento el uso del anticuerpo de la presente invencion como herramienta para el diagnostico, preferiblemente diagnostico in vitro, y/o como producto farmaceutico. Este uso se prefiere particularmente en el contexto de cualquier estado relacionado con TNFa. La enfermedad que va a tratarse con un scFv anti-TNFa o fragmento del mismo es preferiblemente una enfermedad relacionada con la sobreexpresion de TNFa. Si la sobreexpresion de TNFa conduce a una funcion celular anomala, un anticuerpo que puede unirse y, por tanto, neutralizar TNFa en exceso, es un producto farmaceutico ideal para el tratamiento de tal enfermedad, si dicho anticuerpo puede alcanzar el lugar de exceso de TNFa. Si este lugar esta dentro de la celula, el anticuerpo debe poder entrar en la celula. Si este lugar es extracelular, el anticuerpo debe poder alcanzar la matriz extracelular en un tejido, es decir, atravesar al menos la capa de celulas mas externa de un tejido, que es habitualmente la capa de celulas epiteliales. En otra realizacion de la presente invencion el anticuerpo puede penetrar el endotelio.

IV. Composiciones farmaceuticas y administracion farmaceutica

A. Composiciones y administracion

En la mayorla de los casos, el anticuerpo de la presente invencion se usara en una composicion farmaceutica, comprendiendo dicha composicion farmaceutica al menos un compuesto adicional. Preferiblemente, este estara en combinacion con un portador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. El excipiente puede seleccionarse del grupo que comprende Azone, cloruro de benzalconio (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, polioxietileno-polioxipropileno 1800, caprato de sodio, acido caprllico, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, colato, aceite de ricino, aceite de malz, Cremophor-EL, DMSO, bromuro de decametonio, desoxicolato, sulfato de dextrano, EDTA, edetato de disodio, etanol, fusidato, glicocolato, laurilsulfato, L-a-lisofosfatidilcolina, N- lauroilsarcosina, NMP, acido oleico, fosfollpidos, lauril eter de polioxietileno-9, saponina, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, taurocolato, taurodesoxicolato, peptidos de apertura de union estrecha y derivados de peptido, protelnas de apertura de union estrecha y derivados de protelna. Preferiblemente, el excipiente se selecciona del grupo que comprende cloruro de benzalconio, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 y clorhexidina. Tambien es posible usar caprato. Tales sustancias pueden funcionar como potenciadores de la penetracion.

En la mayorla de los casos, la composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo de la presente invencion se aplicara localmente en vez de sistemicamente. El anticuerpo de la presente invencion es particularmente adecuado para aplicacion local, ya que su formato de scFv es pequeno, y su region de entramado tiene caracterlsticas fisicoqulmicas que le permiten penetrar barreras de tejido epitelial. Un aplicacion local es una aplicacion en una zona relativamente restringida tal como el ojo, la cavidad nasal, la cavidad oral, el tracto intestinal, la piel, la mucosa de la boca y el tracto urogenital, articulaciones y espacios articulares, el cerebro, las vertebras, etc., en las que la aplicacion de un volumen relativamente pequeno de anticuerpo suficientemente concentrado es eficaz. Por otro lado, la aplicacion topica es una aplicacion a la superficie de una parte del cuerpo.

La forma preferida de administracion de la composicion farmaceutica de la presente invencion es mediante aplicacion topica; sin embargo, otras formas son mediante inhalacion, por ejemplo, si se desea que el anticuerpo este destinado a penetrar el epitelio del pulmon. La administracion pulmonar puede lograrse usando un inhalador o nebulizador y una formulacion que comprende un agente de aerosolizacion.

Para aplicaciones topicas, el lugar preferido es el ojo. El anticuerpo de la presente invencion es particularmente adecuado para penetrar la cornea, que consiste principalmente en tres capas de tejido, concretamente el epitelio, el estroma y el endotelio. Por tanto, el anticuerpo puede usarse para el tratamiento de muchas enfermedades del ojo.

B. Sistemas de administracion de farmacos

Los ejemplos no limitativos de sistemas de administracion de farmacos oculares topicos para su uso en la invencion

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incluyen potenciadores de la penetracion, escudos de colageno corneales, iontoforesis ocular, micropartlculas o nanopartlculas, insertos oculares, pollmeros mucoadhesivos, sistema de gelificacion in situ, dendrlmeros, emulsiones lipldicas e insertos oculares (vease Sultana, et al. (2007) Future Drugs, 2(2), 309-323 (2007).

i. i. Potenciadores de la penetracion

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir un potenciador de la penetracion. Se conocen bien en la tecnica ejemplos de potenciadores de la penetracion, e incluyen Azone®, cloruro de benzalconio (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, polioxietileno-polioxipropileno 1800, caprato de sodio, acido caprllico, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, colato, aceite de ricino, aceite de malz, Cremophor-EL, ciclodextrinas, DMSO, bromuro de decametonio, desoxicolato, sulfato de dextrano, EDTA, edetato de disodio, etanol, fusidato, glicocolato, laurilsulfato, L-a-lisofosfatidilcolina, metazolamida, N-lauroilsarcosina, NMP, acido oleico, peptido Pz, fosfollpidos, lauril eter de polioxietileno-9, saponina, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, taurocolato y taurodesoxicolato (vease Sultana, et al. (2007) Future Drugs, 2(2), 309-323 (2007). En otra realizacion, el potenciador de la penetracion es caprato de sodio. En aun otra realizacion, el potenciador de la penetracion incluye sistemas coloidales, poliacrilatos y

pollmero bioadhesivo. Vease tambien el documento U.S.S.N. 60/_,__(expediente del apoderado n.° ES5-016-1

titulado “Improved penetration Enhancers for the Delivery of Therapeutic Proteins” presentado el 10 de julio de 2007).

ii. Escudos de colageno corneales

Los anticuerpos de la invencion tambien pueden administrarse con un escudo de colageno corneal. En algunas realizaciones, pueden usarse escudos de colageno con tiempos de disolucion de 12, 24 y 72 horas. En otras realizaciones, el escudo de colageno se empapa previamente en disoluciones de gatifloxacino y/o moxifloxacino.

iii. Iontoforesis ocular

Los anticuerpos de la invencion tambien pueden administrarse mediante iontoforesis ocular. En una realizacion, los anticuerpos pueden administrarse al segmento anterior del ojo mediante iontoforesis transcorneal. En otra realizacion, las concentraciones altas y sostenidas de los anticuerpos de la invencion pueden administrarse al humor vltreo y la retina mediante iontoforesis transescleral. La iontoforesis se aplica durante la duracion de tiempo deseada. En algunas realizaciones, la iontoforesis se aplica de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 minutos. En otras realizaciones, la iontoforesis se aplica menos de 1 minuto. En otra realizacion, la iontoforesis se aplica durante mas de 4 minutos.

iv. Micropartlculas y nanopartlculas

Los anticuerpos de la invencion tambien pueden administrarse usando sistemas de administration microparticulados o nanoparticulados. En algunas realizaciones, la micropartlcula es una microcapsula. En otras realizaciones, la micropartlcula es una microesfera. En realizaciones adicionales, el material microparticulado comprende pollmeros que son erosionables, biodegradables, no erosionables o resinas de intercambio ionico. En otra realizacion, el sistema de administracion microparticulado es Betoptic S®, que contiene betaxolol al 0,25%.

Tambien pueden usarse nanopartlculas, partlculas mas pequenas de 1 pm. En una realizacion, la nanopartlcula es una nanocapsula. En otra realizacion, la nanopartlcula es una nanoesfera. En una realizacion, la nanopartlcula comprende poliacrilcianoacrilato (PACA). En otra realizacion, la nanopartlcula comprende poli-a-caprolactona. En determinadas realizaciones, la nanopartlcula comprende nanopartlculas lipldicas solidas que contienen tobramicina al 2,5% con fosfato de hexadecilo. En otra realizacion, la nanopartlcula comprende Eudragit RS 100 o Eudragit RL 100 y opcionalmente comprende ademas cloricromeno. En realizaciones adicionales, la nanopartlcula incluye nanosuspensiones de pollmero de acrilato cargado con flurbiprofeno (FB).

v. Insertos oculares

Los anticuerpos de la invencion tambien pueden administrarse usando insertos oculares. En algunas realizaciones, los insertos oculares son insertos insolubles, solubles o bioerosionables. Los insertos insolubles incluyen sistemas de difusion, sistemas osmoticos y lentes de contacto hidrofilas. Los insertos solubles pueden componerse de pollmeros naturales, sinteticos o semisinteticos. Los insertos bioerosionables pueden componerse de pollmeros bioerosionables.

vi. Pollmeros mucoadhesivos

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir pollmeros mucoadhesivos. Se conocen bien en la tecnica ejemplos de pollmeros mucoadhesivos, e incluyen quitosano (CS), Ch-HCL y N-carboximetilquitosano (CMCh), pollmeros de N-trimetilquitosano (TMC), CS/Carbopol® cargado con pilocarpina, poli(acido acrllico) (PAA),

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polisacaridos, xiloglucano, polisacarido de semilla de tamarindo (TSP) y pollmeros o tiomeros tiolados.

vii. Sistemas de gelificacion in situ

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir sistemas de gelificacion in situ. Se conocen bien en la tecnica ejemplos de sistemas de gelificacion in situ, e incluyen sistemas de gelificacion in situ mediados por pH, sistemas de gelificacion in situ mediados por temperatura y sistemas de gelificacion in situ mediados por iones. Los sistemas de gelificacion in situ mediados por pH pueden incluir, por ejemplo, pollmeros tales como acetato-ftalato de celulosa (CAP) y Carbopol®. Los sistemas de gelificacion in situ mediados por temperatura pueden incluir, por ejemplo, compuestos pluronicos, tetraonicos y etilhidroxietilcelulosa. Los sistemas de gelificacion in situ tambien pueden incluir Gelrite® (goma gellas desacetilada (DCG)), alginatos, por ejemplo, alginato-poli(L-Lisina), disoluciones oftalmicas de maleato de timolol, por ejemplo, Timoptol XE y Lizmon TG®, y combinaciones de los mismos.

viii. Dendrlmeros

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir dendrlmeros. Se conocen bien en la tecnica ejemplos de dendrlmeros, e incluyen TM poliamidoamina (PAMAM).

C. Formulaciones

En otra realizacion, la formulacion puede ser una formulacion de liberation lenta, prolongada o en el tiempo, una formulation portadora tal como microesferas, microcapsulas, liposomes, etc., tal como conoce un experto en la tecnica. Cualquiera de los sistemas de administration mencionado anteriormente puede administrarse de manera topica, por via intraocular, por via subconjuntival, o mediante implante para dar como resultado la liberacion sostenida del agente a lo largo de un periodo de tiempo. La formulacion puede ser en forma de un vehlculo, tal como una micro o macrocapsula o matriz de pollmeros biocompatibles tales como policaprolactona, poli(acido glicolico), poli(acido lactico), polianhldridos, polilactida-co-glicolidas, poliaminoacidos, poli(oxido de etileno), poli(oxido de etileno) terminado en acrllico, poliamidas, polietilenos, poliacrilonitrilos, polifosfacenos, poli(ortoesteres), acetato- isobutirato de sacarosa (SAIB), y otros pollmeros tales como los dados a conocer en las patentes estadounidenses n.os 6.667.371; 6.613.355; 6.596.296; 6.413.536; 5.968.543; 4.079.038; 4.093.709; 4.131.648; 4.138.344; 4.180.646; 4.304.767; 4.946.931, o llpidos que puede formularse como microesferas o liposomas. Una formulacion microscopica o macroscopica puede administrarse de manera topica o a traves de una aguja, o puede implantarse. Pueden proporcionarse propiedades de liberacion retardada o prolongada a traves de diversas formulaciones del vehlculo (microesfera recubierta o no recubierta, capsula recubierta o no recubierta, componentes lipldicos o de pollmero, estructura unilamelar o multilamelar, y combinaciones de los anteriores, etc.). La formulacion y carga de microesferas, microcapsulas, liposomas, etc. y su implantation ocular son tecnicas convencionales conocidas por un experto en la tecnica, por ejemplo, el uso de un implante de liberacion sostenida de ganciclovir para tratar retinitis por citomegalovirus, dado a conocer en Vitreoretinal Surgical Techniques, Peyman et al., Eds. (Martin Dunitz, Londres 2001, capltulo 45); Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology, Wise, Ed. (Marcel Dekker, Nueva York 2000). Por ejemplo, puede insertarse un implante intraocular de liberacion sostenida a traves de la pars plana para su implantacion en la cavidad vltrea. Una inyeccion intraocular puede ser en el humor vltreo (intravltrea), o bajo la conjuntiva (subconjuntival), o detras del ojo (retrobulbar), o bajo la capsula de Tenon (subtenonica), y puede ser en una forma de deposito. La composition puede administrarse por medio de una lente de contacto aplicada a la superficie exterior de un ojo, con la composicion incorporada en el material de la lente (por ejemplo, en la fabrication, o contenida en una disolucion de la lente). La composicion puede administrarse por medio de una lente intraocular (IOL) que se implanta en el ojo. Las lentes implantables incluyen cualquier IOL usada para reemplazar el cristalino enfermo de un paciente tras la cirugla de cataratas, incluyendo pero sin limitarse a las fabricadas por Bausch and Lomb (Rochester N.Y.), Alcon (Fort Worth Tex.), Allergan (Irvine Calif.), y Advanced Medical Optics (Santa Ana Calif.). Vease tambien Degim, I.T y Celebi, N. (2007), Current Pharmaceutical Design, 13, 99-117]. Cuando la lente se implanta dentro de la capsula de la lente, la composicion proporciona el efecto deseado al ojo. Las concentraciones adecuadas para implantes (lentes y otros tipos) y mediante administracion con lentes de contacto pueden variar, tal como apreciara un experto en la tecnica. Por ejemplo, un implante puede cargarse con una alta cantidad de agente, pero se formula o se regula de modo que se libere de manera sostenida una concentration requerida dentro de los intervalos descritos anteriormente (por ejemplo, formulacion de liberacion lenta).

Se ha hallado que las concentraciones de anticuerpo logradas normalmente con los scFv en el intervalo de hasta 1 mg/ml no son bastante eficaces en la penetration epitelial a menos que se anadan potenciadores de la penetration (documento WO0040262). La presente invencion se refiere a anticuerpos que son altamente solubles, de modo que pueden prepararse y usarse composiciones farmaceuticas que comprenden dicho anticuerpo a concentraciones superiores, es decir mayores de aproximadamente 2 mg/ml, preferiblemente mayores de aproximadamente 5 mg/ml, lo mas preferiblemente mayores de aproximadamente 10 mg/ml en el tratamiento eficaz de la correspondiente enfermedad relacionada con antlgeno.

Asl, se describe en el presente documento el tratamiento de una enfermedad relacionada con antlgeno, en la que la administracion del anticuerpo al sitio de interaccion antlgeno-anticuerpo requiere penetracion en un tejido que comprende uniones estrechas, en particular un epitelio y/o un endotelio. Un epitelio es un tejido compuesto por una capa de celulas, y reviste tanto el exterior (piel) y como el interior (por ejemplo intestino) de los organismos. Los 5 epitelios tambien incluyen las membranas mucosas que revisten el interior de la boca y cavidades corporales y

comprenden celulas epiteliales escamosas muertas, y celulas epiteliales que revisten el interior de los pulmones, el tracto gastrointestinal, y los tractos reproductor y urinario. Un endotelio es una capa de celulas finas, planas que reviste la superficie interior de vasos sangulneos y organos. En la vasculatura forma una superficie de contacto entre la sangre circulante en la luz y el resto de la pared del vaso. Las celulas endoteliales revisten todo el sistema 10 circulatorio, desde el corazon hasta el capilar mas pequeno. En vasos sangulneos pequenos y capilares, las celulas

endoteliales son a menudo el unico tipo de celula presente. Las celulas endoteliales tambien controlan el paso de materiales dentro y fuera del torrente sangulneo. En algunos organos, hay celulas endoteliales altamente diferenciadas para realizar funciones de “filtracion” especializadas. Los ejemplos de tales estructuras endoteliales unicas incluyen el glomerulo renal y la barrera hematoencefalica. El tejido endotelial es un tipo especializado de 15 tejido epitelial.

El anticuerpo de la presente invencion logra la penetracion en la cornea. El epitelio corneal cubre la parte frontal de la cornea y consiste en varias capas de celulas, que hacen que la penetracion por un anticuerpo sea incluso mas diflcil. El anticuerpo de la presente invencion puede penetrar toda la cornea.

Un farmaco ideal para el tratamiento de uveitis debe cubrir cuatro caracterlsticas cruciales: 1) Proporcionar un 20 comienzo rapido de los efectos sobre slntomas agudos. 2) Mostrar una eficacia comparable en comparacion con corticosteroides topicos convencionales. 3) Mostrar un perfil de seguridad superior en comparacion con corticosteroides topicos convencionales. 4) Tener propiedades farmacocineticas favorables que permiten la aplicacion topica a la cornea asl como la inyeccion intravltrea en comparacion con corticosteroides convencionales o anticuerpos monoclonales convencionales.

25 Un inhibidor de TNFa aplicado localmente, que comprende propiedades farmacocineticas adecuadas, puede abordar todos estos aspectos. La buena penetracion del anticuerpo anti-TNFa scFv ESBA105 dentro de la parte anterior del ojo combinada con su alta actividad neutralizante de TNFa conduce en ultima instancia a concentraciones intraoculares que son muy adecuadas para lograr eficacia terapeutica para uveitis anterior. Teniendo en cuanta que los niveles de TNFa hallado en el ojo enfermo eran de 15 pg/ml y que las concentraciones 30 de ESBA105 medidas eran de hasta 40.000 ng/ml para la parte anterior (vease la figura 7) y de hasta 125 ng/ml para la parte vltrea del ojo (vease la figura 8), se concluye que ESBA105 no solo es adecuado para el tratamiento de uveitis anterior, sino tambien para el tratamiento de diferentes formas de panuveltis como por ejemplo la enfermedad de Behpet ocular. La presente invencion se refiere por tanto a un anticuerpo para el tratamiento de trastornos oculares mediante aplicacion topica al ojo, en particular para el tratamiento de cualquier forma de uveitis, 35 enfermedad de Behpet, retinitis, slndrome de ojo seco, glaucoma, slndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incl. neuropatla diabetica), escleritis, conjuntivitis y queratitis. La administracion se produce preferiblemente mediante colirio, pomada ocular, o a partir de dispositivos de deposito como lentes de contacto).

En otro aspecto, el anticuerpo de la presente invencion debe penetrar el epitelio intestinal.

En el caso de tratamiento en el pulmon, debe usarse inhalacion para aplicar el anticuerpo de la presente invencion al 40 epitelio del pulmon.

En aun otro aspecto, el anticuerpo se usa como herramienta de diagnostico.

Las secuencias de la presente invencion son las siguientes:

SEQ.ID. No:1 VL del tipo kappa1

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKA

SSLESGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYKSYWTFGQGTKLTVL

G

45 SEQ. ID. NO:2 VL del tipo kappa1

5

10

EIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLIYA

GSILQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKVD

IKR

SEQ. ID. NO:3 VL del tipo kappa3

El VMTQS P ATLS VS PGES A ALS CR AS QG VSTN V A W Y QQKPGQ APRLLIY GATTRASGVPARFSGSGSGTEFTLTINSLQSEDFAAYYCQQYKHWPPWTFGQGT KVEIKR

SEQ. ID. NO:4 VL del tipo kappa3

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYD

TSKRATGTPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDSALYYCQQRNSWPHTFGGGTKLE

IKR

SEQ. ID. NO:5 VL del tipo lambda1

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIY

DNTKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGG

TKLTVLG

SEQ. ID. NO:6 VL del tipo lambda 3

SYVLTQPPSVSVAPGQTATVTCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVY

DDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIRRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHNVFGSG

TKVEIKR

SEQ. ID. NO:7 VL del tipo lambda 3

LPVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGNNIETISVHWYQQKPGQAPVLVVSDD

SVRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTK

LTVLG

SEQ. ID. NO:8 VH del tipo H1b

Q V QL VQS G AE VKKPG AS VKV S CT AS G YS FTG YFLHW VRQ APGQGLEW MGRINPDSGDTIYAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPR GT YLDPWD YFD YW GQGTL VT Y S S

SEQ. ID. NO:9 VH del tipo H3

Q V QL V QS GGGL V QPGGSLRLS C A AS GFTFS S Y AMS W VRQ APGKGLEW V SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHVLR FLEWLPD AFDIWGQGTLVT V S S

SEQ. ID. NO: 10 VH del tipo H3

5

10

EVQLVESGGGVAQPGGSLRVSCAASGFSFSSYAMQWVRQAPGKGLEWV A VISNDGRIEH Y AD A VRGRFTISRDN S QNT VFLQMNSLRS DDT AL Y Y C AREIG A TG YLDNW GQGTLVT VS S

SEQ. ID. NO:11 VH del tipo H3

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAGI A V AGTCFD YWGQGTL VT V S S

SEQ. ID. NO: 12 TB-A

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIY SAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTK LEV KRGGGGS GGGGS GGGGS GGGGS Q V QL V QS G AE VKKPG AS VK V S CT AS G Y TFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTV YMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMD YWGQGTL VTVSS

SEQ. ID. NO: 13 ESBA105

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIY S AFNR YTGVPSRFSGRG Y GTDFTLTIS SLQPED V A V Y Y CQQD YNS PRTFGQGTK LEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGY TFTH Y GMNW VRQ APGKGLEWMGWINT YT GEPT Y ADKFKDRFTF S LET S AST V YMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMD YWGQGTL VTVSS

SEQ. ID. NO: 14 TB-WT

DIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCTASQSVSNDVVWYQQKPGQSPKMLM

YSAFNRYTGVPDRFTGRGYGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQDYNSPRTFGGGT

KLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYT

FTHYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKEHFAFSLETSASTVF LQINNLKNEDT AT YFC ARERGD AMD YWGQGTS VT V S S

SEQ. ID. NO: 15 scFv Lucentis

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFT SSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIK RGGGGS GGGGS GGGGS S GGGSE V QL VES GGGL V QPGGS LRLS C A AS G YDFTH Y GMNW VRQ APGKGLEWV GWENT YTGEPTY A ADFKRRFTFSLDTS KST A YLQMN SLRAEDTAVYYCAKYPYYYTSSHWYFDVWGQGTL VTVSS

SEQ. ID. NO:16 ligador GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ. ID. NO:17 ligador GGGGSGGGGSGGGGSSGGGS

SEQ. ID. NO: 18 ESBA105-QC15.2

DIVMTQS PS S LS AS V GDR VTLTCT AS QS VSND V VW Y QQRPGKAPKLLIY SAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTK LE VKRGGGGS GGGGS GGGGS S GGGS Q V QL V QS G AE VKKPG AS VK V S CT ASG Y TFTH Y GMNW VRQ APGRGLEWMGWINT YT GEPT Y ADKFKDRITFS LET S AST V Y MELTSLT S DDT A V Y Y C ARERGD AMD YWGQGTL VT V S S

5 SEQ. ID. NO: 19 ESBA105-H_F68A

DIVMTQSPSSLSASVGDR VTLTCT ASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIY SAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTK LEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGY TFTH Y GMNW VRQ APGKGLEWMGWINTYT GEPT Y ADKFKDR ATF S LET S AST V YMELT S LTS DDT A VYYC ARERGD AMD YWGQGTL VTV S S

SEQ. ID. NO:20 TB-H_F68V_F70L

DIVMTQSPSSLSASVGDR VTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIY SAFNRYTGVPSRFSGRGYGTDFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTK LEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGY TFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWDJTYTGEPTY ADKFKDR VTLSLETSASTV YMELTSLTSDDT A V Y Y C ARERGD AMD YWGQGTLVTV S S

SEQ ID ID No:21 TB-H_F70L

DIVMTQSPSSLSASVGDR VTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIY S AFNR YTG VPSRFSGRG Y GTDFTLTIS SLQPED V A V Y YCQQD YNSPRTFGQGTK LE VKRGGGGS GGGGS GGGGS S GGGS Q V QL V QS GAE VKKPG AS VK V S CT AS G Y TFTH Y GMNW VRQ APGKGLEWMGWINTYT GEPT Y ADKFKDRFTLS LET S AS T V YMELTSLT S DDT A V Y Y C ARERGD AMD YW GQGTL VT V S S

Ejemplos

A lo largo de todos los ejemplos, se usaron los siguientes materiales y metodos a menos que se establezca otra cosa.

Materiales y metodos

15 En general, la practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de qulmica, biologla molecular, tecnologla de ADN recombinante, inmunologla (especialmente, por ejemplo, tecnologla de inmunoglobulinas) y crla de animales. Veanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 20 169), McCafferdad, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999);

Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ejemplo 1: Produccion de los scFv

Se produjeron anticuerpos scFv por medio de expresion como cuerpos de inclusion, seguido por una etapa de replegamiento y una de cromatografia. Se produjeron tres anticuerpos de cadena sencilla. Esto incluye dos scFv convencionales, que presumiblemente no cumplen los criterios de ser muy solubles, particularmente estables y monomericos. Uno de ellos es TB-wt (SEQ. ID. NO: 14), que se construyo mediante la union de las secuencias VL y VH naturales del anticuerpo monoclonal murino anti-TNFa Di62 (Doring et al., 1994). El otro es scFv de Lucentis, que se construyo mediante la union de las secuencias VL y VH del fragmento Fab especifico de VEGF ranibizumab (SEQ. ID. NO: 15). ESBA105 es un scFv, que porta las CDR de Di62 y que revela un valor de kD en el intervalo nanomolar para TNFa. Se caracterizaron la solubilidad, estabilidad y comportamiento monomerico de ESBA105 empleando una region de entramado de scFv, que se selecciono mediante el denominado sistema de control de calidad (Auf der Maur et al., 2004). La secuencia de aminoacidos de ESBA105 se da a conocer en SEQ. ID. NO. 13.

La figura 1 muestra los perfiles de elucion de ESBA105 (A), TB-wt (B) y scFv de Lucentis (C) de la filtracion en gel preparativa, que sigue a la etapa de replegamiento. Mientras que el perfil para ESBA105 consiste principalmente en un pico marcado que va hasta 300 mUA (unidades relativas para la absorcion), pueden observarse varios picos anchos con alturas maximas de 16 y 55 mUA, respectivamente, en los perfiles de TB-wt y scFv de Lucentis. Esto indica que o bien la calidad de los cuerpos de inclusion y o el proceso de replegamiento es mucho menos eficaz para TB-wt y scFv de Lucentis en comparacion con ESBA105.

A continuacion, se describe el procedimiento de produccion en detalle para ESBA105.

Construction del plasmido pGMP002 para la expresion de ESBA105:

Se ligo la secuencia codificante de ESBA105 en los sitios Ncol - Hindlll de pET-24d(+) (Novagen, numero de catalogo 69752-3). Posteriormente, se elimino el fragmento de Bpu 1102l - Notl del constructo resultante mediante ligation de extremos romos despues de que se rellenaran los extremos cohesivos producidos mediante digestiones con Bpu 1102l y Notl mediante reaction con polimerasa de T4 para producir pGMP003. Se produjo pGMP002 mediante la elimination de Bpu1102l - Notl de pET-24d(+) directamente.

Expresion de ESBA105 en E. coli:

Para la expresion de ESBA105, se transformo E. coli BL21 (DE3) (Novagen) con el plasmido de expresion pGMP002. Se prepararon cultivos de reserva en glicerol a partir de colonias individuales, se cultivaron en medio M9 (Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual) que contiene glucosa al 1%, 1 ml/l de una disolucion de oligoelementos (Wang y Lee, Biotechnol Bioeng 58:325-328) y kanamicina 50 mg/ml. Se hicieron crecer las celulas durante la noche a 37°C, se anadio glicerol hasta el 20% y se almacenaron alicuotas de 1 ml como reservas en glicerol a -80°C.

Para el primer precultivo, se inocularon 50 ml de un medio definido sintetico (Korz et al., J. Biotechnol. 1995, 39:5965), que contiene glucosa al 1%, 1 ml/l de disolucion de oligoelementos y kanamicina 50 mg/ml, con 1 ml de una reserva en glicerol. Se hizo crecer el precultivo durante la noche a 37°C y 200 rpm en un matraz de agitation con deflectores. Se inoculo un segundo precultivo con 250 ml del mismo medio con el primer precultivo y se hizo crecer durante tres horas adicionales a 37°C.

Se realizaron cultivos en biorreactor en un biorreactor de 5 l (BioFlo 110, New Brunswick Scientific), que contenia un volumen inicial de 3 l del mismo medio sintetico usado para los precultivos. Se fijo la temperatura de cultivo a 37°C. Se controlo el pH del cultivo a 7,0 mediante la adicion de agua amoniacal al 25% y acido fosforico 1 M. El nivel de oxigeno disuelto se mantuvo por encima del 20% del nivel de saturation del aire variando el porcentaje de oxigeno puro a una velocidad de aireacion global de 4 l/min. Se inoculo el biorreactor con el segundo precultivo y se hizo funcionar en modo discontinuo hasta una DO600 de 10-12. Entonces se inicio la alimentation con glucosa exponencial a una velocidad de 0,15 h-1 con una disolucion de glucosa al 50% que contenia MgSO4'7H2O 10 g/l y disolucion de oligoelementos 5 ml/l. Despues de 16 h, se indujo la expresion de proteinas mediante la adicion de lPTG hasta 1 mM y se continuo la alimentacion exponencial durante 3 h. Entonces se recogieron las celulas mediante centrifugacion a 4.600 rpm durante 1 h.

Preparation de cuerpos de inclusion:

Para la preparacion de cuerpos de inclusion, se resuspendio 1 kg de pasta celular humeda en 5 l de tampon TBS (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,3). Se anadio 1 g de lisozima solida y se incubo la suspension celular durante 3060 min. Para la rotura de las celulas, se hizo pasar la suspension dos veces al traves de un homogeneizador de alta presion (Niro Soavi, Panda 2K) a 1.000 bar. Se centrifugaron las celulas rotas durante 1 h a 4600 rpm y se resuspendieron los resultante cuerpos de inclusion en 2 l de tampon TBS, que contiene LDAO al 0,5% (N-oxido de N-,N-dimetildodecilamina, Fluka). Se lavaron repetidamente los cuerpos de inclusion hasta que no se detecto

5

10

15

20

25

30

35

protelna residual significativa en el sobrenadante de lavado. Finalmente, se lavaron los cuerpos de inclusion dos veces con tampon TBS sin LDAO.

Replegamiento de ESBA105:

Se solubilizaron los cuerpos de inclusion en el volumen de 10 veces de tampon de solubilizacion que contiene guanidinio-HCl 6 M, Tris 100 mM, EDTA 1 mM y DTT 20 mM a pH 8,0 y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Entonces se replego la protelna solubilizada mediante dilucion 1:50 en tampon de replegamiento que contiene urea 3 M, Tris 100 mM y 2 mM de cada una de cistelna y cistina a pH 8,5. Se continuo el replegamiento durante 24 h a temperatura ambiente. Despues del replegamiento, se eliminaron los precipitados mediante filtracion profunda y se concentro la disolucion de replegamiento hasta el 50% del volumen inicial. Entonces se dializo la disolucion de replegamiento concentrada frente al volumen de 4 veces de tampon PBS (fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5) y se concentro adicionalmente hasta una concentration de protelna de aproximadamente 1 mg/ml.

Purification de ESBA105 mediante cromatografia:

Se purifico ESBA105 en dos etapas de cromatografia: cromatografia de filtracion en gel y de intercambio cationico. Todas las etapas de cromatografia se realizaron mediante sistema de purificacion AKTA (GE Healthcare).

Para la cromatografia de filtracion en gel preparativa cromatografia, se uso una columna Sephadex S75 26/60 (GE Healthcare) se con tampon PBS (fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5) como tampon de ejecucion. Se eluyo la fraction de ESBA105 recogida a un volumen de retention de aproximadamente 185 ml como un unico pico.

Se uso Fractogel EMD SO3- (M) (Merck) como resina de columna para la segunda etapa de cromatografia. Se equilibro la resina con cinco volumenes de columna de tampon de equilibration (acetato de Na 50 mM, pH 5,5). Se diluyeron las fracciones de pico de ESBA105 de la filtracion en gel 10 veces con acetato de Na 50 mM pH 5,5 y entonces se cargaron sobre la columna con una velocidad de flujo de 5 ml/min. Despues de cargar, se lavo la columna con cinco volumenes de columna de tampon de equilibracion. Se uso un gradiente lineal de desde el 0 - 35% de tampon de elucion (acetato de Na 50 mM, NaCl 500 mM, pH 5,5) en el plazo de 60 minutos y se usaron 5 ml/min para la elucion de ESBA105. Se recogio el pico mas prominente despues de la elucion y se identifico como ESBA105. Finalmente se dializo la fraccion de ESBA105 recogida frente a PBS (fosfato de Na 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5) y se almaceno a -80°C.

Ejemplo 2: Caracterizacion bioffsica de los scFv

Con el fin de investigar su “semejanza a farmaco”, se caracterizaron bioflsicamente ESBA105 y algunos de sus derivados. La caracterizacion implico la determination de (1) parametros de solubilidad (precipitation con PEG y valor de B22; el valor de B22 es una medida de la autointeraccion de la protelna, que es importante en el crecimiento de cristales de protelna, la solubilizacion y agregacion. Vease Valente et al., Biophys J. diciembre de 2005; 89(6):4211-8. Publication electronica 30 de septiembre de 2005), (2) los valores de pi, (3) la medicion de la desnaturalizacion termica y caotropica, y (4) la cuantificacion de la fraccion monomerica en comparacion con la fraccion oligomerica. Los resultados de los puntos 1-3 se resumen en la tabla 1, que tambien incluye valores de potencia relativa tal como se determinan mediante el ensayo de L929 y KYM-1, respectivamente.

Tabla 1. Resumen de datos sobre algunos derivados de ESBA105.

SEQ | | Smax 1 Valor de B22

: I (prec, con PEG) (SIC)

ESBA105: 7,8 1,839 ± 0,133 -24,5 x 10-4 ± 3,8 x 10-4

ESBA105-QC2.2: 7,8 nd nd

ESBA105-QC7.1: nd nd

ESBA105-QC11.2: 8,2 1,913 ± 0,091 1,59 x 10-3 ± 5,9 x 10-5

ESBA105-QC15.2: 7,8 1,857 ± 0,02 1,28 x 10-3 ± 3,0 x 10-4

ESBA105-QC23.2: 7,8 1,881 ± 0,068 1,06 x 10-4 ± 2,9 x 10-5

ESBA105-H F68A: 7,8 nd nd

TB-H F68V F70L: 7,8 nd nd

TB-H F70L: 7,8 nd nd

SEQ: Comienzo de la desnaturalizacion [°C] [GdnHCl] en el punto medio del desplegamiento Potencia relativa: CE50X / CE50ESBA105

Celulas L929: Celulas KYM-1

ESBA105: 53 2,07 M 1,0 1,0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

SEQ: I Smax 1 Valor de B22

ESBA105-QC2.2: 58 nd 1,1 1,6

ESBA105-QC7.1: nd nd nd

ESBA105-QC11.2: 58 2,33 M 0,8 1,3

ESBA105-QC15.2: 26 2,30 M 1,37 1,5

ESBA105-QC23.2: 58 nd 1,32 1,5

ESBA105-H F68A: nd nd 1,14 nd

TB-H F68V F70L: nd nd 1,28 nd

TB-H F70L: nd nd 2,7 nd

Ejemplo 3: Estabilidad de scFv durante el almacenamiento

La estabilidad del scFv a lo largo del tiempo es una caracterlstica importante en el contexto de un producto farmaceutico. La figura 4 muestra un analisis del scFv ESBA105 (carriles 1-6) y el scFv QC15.2 (carriles 7-12) que se separaron mediante SDS-PAGE y se tineron con Coomassie despues de dos semanas de almacenamiento a diferente temperatura (-80°C: carriles 1, 3, 5, 7, 9 y 11) o 40°C: carriles 2, 4, 6, 8, 10 y 12) y concentraciones (20 mg/ml: carriles 1, 2, 7 y 8; 10 mg/ml; carriles 3, 4, 9 y 10; 1 mg/ml: carriles 5, 6, 11 y 12). Los anticuerpos permanecieron estables a lo largo de todos los intervalos de temperatura y a todas las concentraciones sometidas a prueba, y no se hallaron signos de degradacion o agregacion.

Un anticuerpo que es estable a lo largo de un tiempo determinado debe retener tambien su actividad completa. Por tanto, se sometio a prueba ESBA105 ocho semanas despues del almacenamiento a 37°C o -80°C en ensayos de L929 para determinar su actividad. El resultado se presenta en la figura 5, y no pudieron observarse diferencias entre las dos temperaturas.

Ejemplo 4: Penetracion ex vivo de ESBA105 en ojos de conejo completos

Se sometio a prueba la cantidad de ESBA105 que penetra en diferentes compartimentos de ojos de conejo completos en diversas condiciones en un entorno ex vivo. Para estas series de experimentos, se colocaron los ojos de conejo en placas de prueba de incubacion que tenlan depresiones en su superficie. La depresion contenla la disolucion de prueba de ESBA105 y se colocaron los ojos de conejo sobre las placas de prueba de tal manera que la cornea estaba en contacto con la disolucion de prueba. Despues de un tiempo de incubacion de 4 horas a 37°C, se analizaron los diferentes compartimentos del ojo para determinar su contenido en ESBA105. Para este analisis, se uso una jeringa para retirar sondas del compartimento de interes (vease la figura 6) y se determino la concentracion de ESBA105 de la sonda mediante ELISA.

Se evaluaron las siguientes condiciones con la configuracion experimental descrita anteriormente: se sometio a prueba ESBA105 a concentraciones de 1, 2, 5 y 10 mg/ml. Se sometio a prueba ademas la concentracion de 1 mg/ml en presencia de acido caprico al 0,5%. Thiel et al. (Clin. Exp. Immunol. abril de 2002; 128 (1):67-74) mostraron previamente que el 0,5% de acido caprico potenciaba la penetracion a traves de cornea. Cuando se administro 1 mg/ml en presencia de acido caprico al 0,5%, se midio una concentracion de ESBA105 en la parte anterior del ojo de aproximadamente 40 mg/ml, que era aproximadamente la misma en comparacion con concentraciones medidas despues de la administracion de 10 mg/ml en ausencia de acido caprico (figura 7). De manera interesante, cuando se compararon los resultados de estos dos modos de administracion en el humor vltreo, se midieron aproximadamente 40 ng/ml para la administracion de 1 mg/ml con acido caprico y aproximadamente 125 ng/ml para 10 mg/ml sin acido caprico (figura 8). En ausencia de acido caprico las concentraciones medidas en los dos compartimentos revelaron una clara dependencia de las concentraciones aplicadas de 1, 2, 5 y 10 mg/ml (figura 8).

Se preincubaron las placas de prueba de incubacion con ojos con tampon de bloqueo (leche en polvo al 5% con bajo contenido en grasa en PBS, pH 7,4) durante la noche a 4°C. Al siguiente dla se lavaron las placas con PBS y despues de eso se secaron mediante incubacion a 37°C durante 30 minutos. Se llenaron los pocillos de las placas secadas con 125 ml de disolucion de prueba cada uno y se colocaron ojos de conejo aislados en los pocillos de manera que solo la cornea estaba en contacto con la disolucion de prueba. Despues de la incubacion a 37°C y el 100% de humedad durante 4 horas, se lavaron los ojos durante 3 horas con PBS. Se llevo a cabo la paracentesis usando una aguja de 25G para la camara anterior del ojo y una aguja de 22G para el cuerpo vltreo.

Se determino la concentracion de ESBA105 en las sondas mediante ELISA tal como sigue: Se centrifugaron las sondas con una microcentrlfuga de sobremesa a 13.000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Se diluyeron las sondas del compartimento anterior 1:10, 1:100 y 1:1000, se diluyeron las sondas del compartimento vltreo 1:5 en TBST (TBS complementado con Tween al 0,005%) que contenla leche en polvo al 0,5% con bajo contenido en grasa (a continuacion en el presente documento denominada disolucion de dilucion) para las pruebas de ELISA.

Se recubrieron placas de 96 pocillos de ELISA (Nunc Maxisorb; numero de catalogo 442404) con TNFa humano

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

0,5 mg/ml durante la noche a 4°C. Al siguiente dla se lavaron las placas 3 veces con TBST a temperatura ambiente y se incubaron con 300 ml de tampon de bloqueo (leche en polvo al 5% con bajo contenido en grasa en TBST) por pocillo durante 60 min a temperatura ambiente en un agitador (500-600 rpm). Despues de la etapa de bloqueo, se lavaron las placas 3 veces con TBST antes de que se anadieran 50 ml de sondas diluidas a cada pocillo y se incubaron las placas en un agitador (500 - 600 rpm) durante 90 minutos a temperatura ambiente. Despues de esta etapa de incubacion, se lavaron las placas 3 veces con TBST, antes de que se anadieran 50 ml de una disolucion 1:10.000 (diluida en disolucion de dilucion) del anticuerpo secundario AKA3A-biotinilado a cada pocillo. AKA3A- biotinilado es un anticuerpo policlonal de conejo anti-ESBA105, que estaba recien biotinilado (segun protocolos de biotinilacion convencionales). Despues de 90 minutos de incubacion en un agitador (500-600 rpm) a temperatura ambiente, se lavaron las placas 3 veces con TBST, antes de que se anadieran 50 ml de una dilucion 1:2000 (diluida en disolucion de dilucion) de peroxidasa del rabano acoplada con estreptavidina (estreptavidina-poliHRP40, 1 mg/ml; SDT; n.° SP40C). Despues de 60 minutos de incubacion en un agitador (500-600 rpm) a temperatura ambiente, se lavaron las placas 3 veces con TBST y 2 veces con ddH2O. Se detecto la actividad peroxidasa del rabano (HRP) tras la adicion de 50 ml de sustrato BM Blue POD (Roche Diagnostics, numero de catalogo 1484281) a cada pocillo. Despues de 6-12 minutos de incubacion a temperatura ambiente en la oscuridad, se detuvo la reaccion de HPR mediante la adicion de 50 ml de HCl 1 M a cada pocillo. Se cuantifico la reaccion de HPR mediante medicion espectrometrica a 450 nm en un lector TECAN Genios.

Se determino finalmente la concentration de ESBA105 de las sondas mediante comparacion con una curva patron, que se produjo en paralelo.

Ejemplo 5: Penetracion de ESBA105a traves de monocapas de celulas Caco-2

Se sembraron celulas de adenocarcinoma de colon humano (Caco-2) sobre soportes permeables de una placa de 24 transpocillos y se cultivaron durante 21 dlas a 37°C en una atmosfera del 5% de CO2 para permitir la formation de monocapas apretadas. Antes de realizar el ensayo de permeabilidad, se midio la resistencia electrica transepitelial en cada pocillo para verificar la integridad de las monocapas. Entonces se lavaron las monocapas de Caco-2 tres veces con una disolucion salina (HBSS) y se anadio una mezcla que contenla o bien 1 mM de ESBA105 con o sin caprato, o bien medio de ensayo solo al compartimento superior de los transpocillos como control. Despues de puntos de tiempo definidos, se recogio el contenido de los compartimentos inferiores y se reemplazo por medio de ensayo nuevo. Se analizaron posteriormente las muestras recogidas mediante ELISA cuantitativo para determinar la cantidad de ESBA105 que penetro a traves de la monocapa epitelial de Caco-2 (figura 9).

Ejemplo 6: Penetracion a traves de yeyuno de raton

Se extirparon aproximadamente 5 cm de yeyuno de raton inmediatamente despues de la eutanasia del animal y se incubaron en tampon de Ringer-Krebs saturado con oxlgeno y se lavaron tres times con tampon de Ringer-Krebs. Se ligo una section de 3,5 cm con seda quirurgica y se lleno con 200 mcl de mezcla de anticuerpos, que contenla 1 mg/ml de cada formato de anticuerpo (Infliximab y ESBA105). A aproximadamente 1 cm distal del compartimento del saco evertido se anadio una segunda ligation para garantizar la estanqueidad del compartimento. Se colocaron los sacos evertidos en un vaso de precipitados que contenla 10 ml de tampon de Ringer-Krebs saturado con oxlgeno de tal manera que solo las primeras ligaciones entraron en contacto con el tampon. Se anadieron inhibidores de proteasas a este compartimento receptor para impedir la degradation de anticuerpos. Con el fin de determinar la cantidad de cada anticuerpo que penetro a traves del tejido intestinal, se tomaron sondas de 200 mcl del compartimento receptor despues de puntos de tiempo definidos y se analizaron posteriormente mediante ELISA cuantitativo.

Ejemplo 7: Aplicacion topica de un polipeptido de union a antfgeno soluble

Se estudiaron la farmacodinamica y farmacocinetica de la aplicacion topica de un polipeptido de union a antlgeno soluble, ESBA105, en ojos de conejo in vivo. Se prepararon cuatro formulaciones diferentes. La primera formulation (denominada en el presente documento “B15”) se componla de 9,6 mg/ml de ESBA105 en tampon fosfato 0,15 M a pH 6. La segunda formulacion (denominada en el presente documento “B16”) se componla de 10,3 mg/ml de ESBA105 y clorhexidina al 0,01% (p/v) en tampon fosfato de sodio 0,15 M a pH 6. El primer control (denominado en el presente documento “B15-0”) se componla de tampon fosfato de sodio 0,15 M a pH 6. El segundo control (denominado en el presente documento “B16-0”) se componla de clorhexidina al 0,01% (p/v) en tampon fosfato de sodio 0,15 a pH 6. Se esterilizaron todas las formulaciones antes de su uso, y se almacenaron a 4° C. Tal como se usa en el presente documento, “OTT” indica sin tratamiento.

Para estudiar la farmacodinamica de ESBA105 en el ojo, se usaron 6 conejos para cada formulacion. Se sometio a prueba la formulacion en ambos ojos de los conejos. Se usaron dos conejos (4 ojos) para cada formulacion sin fragmentos de anticuerpo, y se usaron dos conejos (4 ojos) como controles sin tratamiento previo. Se usaron un total de 18 conejos para este estudio.

Se aplicaron las formulaciones localmente a los ojos a lo largo del transcurso de seis dlas. Se trataron los conejos cinco veces al dla, en la hora siete, hora diez, hora trece, hora diecisiete y hora veinte. En el dla de sacrificio, se trataron los conejos dos veces, en la hora siete y hora diez, y se sacrificaron una hora despues de la ultima aplicacion.

5 Se evaluaron los ojos en el dla uno, dla tres y dla seis. Se usaron dos conejos por formulacion para reunir datos farmacocineticos para cada punto de tiempo. Se tomaron una muestra de humor acuoso y una muestra de suero en el dla uno y dla tres. En el dla seis, se tomaron una muestra de humor acuoso y una muestra de suero y se diseccionaron los ojos de los conejos para dar tejidos con el fin de estudiar la distribucion del fragmento de anticuerpo en los diferentes tejidos oculares. Los resultados de este estudio se representan graficamente en las 10 figuras 11a a 11d.

Se realizaron estudios adicionales para estudiar la solubilidad, farmacodinamica y farmacocinetica de ESBA105. Los resultados se registran en las figuras 12 a 16. Tal como puede observarse a partir de estas figuras, se ha mostrado que ESBA105 penetra a traves de capas de tejido corneal en conejos y cerdos. ESBA105 se acumula en el humor vltrieo y tiene un tiempo medio local de aproximadamente 25 horas. El tiempo medio local de ESBA105 en la camara 15 anterior es significativamente menor que en el humor vltreo. La exposicion sistemica tras el tratamiento topico es extremadamente baja, por ejemplo, de aproximadamente el 2% de la concentracion local mas alta. Ademas, basandose en el experimento topico en conejo, pueden alcanzarse niveles de farmaco terapeuticos (aproximadamente 16.000 veces con respecto a TNF) con tan solo cinco gotas topicas al dla. Por tanto, la aplicacion topica de fragmentos de anticuerpos scFv inhibidores de TNF podrla ser una terapia eficaz en enfermedades 20 localizadas en segmentos mas posteriores del ojo, por ejemplo, humor vltreo y retina.

Ejemplo 8: Respuesta a la dosis en el modelo de monoartritis aguda de rata

Para estudiar la respuesta a la dosis, se administro ESBA105 tal como se muestra en la figura 17. Como comparacion, se administro Remicade® (infliximab) tal como se muestra en la figura 17. Para este experimento, se administro TNFa con tres dosificaciones diferentes (156 mg, 45 mg u 11 mg) de ESBA105 o infliximab. Como 25 controles, se usaron PBS, y TNF solo (10 mg i.a.), o scFv solo. Los resultados se muestran en la figura 17.

Ejemplo 9: Aplicacion topica in vivo

Para determinar la exposicion sistemica maxima y los niveles de farmaco locales durante un dla de administracion topica, se administro una gota cada 20 minutos a lo largo de un periodo de 10 horas. Se midieron los niveles de farmaco mediante ELISA en humor acuoso, vltreo y suero. Se formulo ESBA105 como 10 mg/ml en PBS, pH 6,5. 30 Para cada gota, se aplicaron 30 mcl a la parte superior de la pupila, y entonces se apretaron los parpados del ojo para eliminar el fluido en exceso. Los resultados se muestran en la figura 18 y la tabla 2.

Tabla 2: Muestra las concentraciones de ESBA105 maximas (Cmax) medidas en los compartimentos indicados en el transcurso del experimento tal como se describe en la leyenda de la figura 18 A. Los valores en porcentaje indican el porcentaje de Cmax en comparacion con la dosis aplicada total (dosis acumulada).

: Cmax Dosis acumulada total

Humor vltreo: 4,0 ng/ml (6,6E-5%) 9 mg

Humor acuoso: 5,3 ng/ml (1,2E-5%) 9 mg

Suero: 14,2 ng/ml (0,3%) 9 mg

35 Ejemplo 10: Aplicacion topica de un polipeptido de union a antfgeno soluble

Para determinar la exposicion sistemica maxima y los niveles de farmaco locales durante el tratamiento cronico topica de baja frecuencia, se aplico una gota 5 veces al dla a dos conejos (4 ojos) durante hasta 6 dlas. Para cada gota, se aplicaron 30 mcl de ESBA105 en el saco del ojo inferior (presentacion de farmaco principalmente a la esclerotica), quedando 30 mcl completos en la superficie ocular.

40 Se evaluaron los ojos despues de la segunda gota en el dla dos, dla tres y dla seis. Se midieron los niveles de farmaco mediante ELISA en humor acuoso, humor vltreo, neurorretina, coroides y suero. Los resultados de este estudio se representan graficamente en las figuras 19a a 19e.

La tabla 3 resume la mediana de las concentraciones del scFv ESBA105 hallada despues del 6° sexto dla de administracion en los compartimentos indicados en [ng/ml].

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Composicion farmaceutica formulada para la aplicacion local a una superficie de una barrera de tejido epitelial, comprendiendo dicha composicion un polipeptido de union a antlgeno soluble y un portador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable, en la que dicho polipeptido de union a antlgeno puede cruzar una cornea de mamlfero intacta en menos de 8 horas en ausencia de un potenciador de la penetracion, y en la que dicho polipeptido de union a antlgeno es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y comprende:

(a) una region de entramado de dominio variable de cadena ligera (VL) de una similitud de al menos el 85% con una

region de entramado de VL seleccionada del grupo que consiste en las SEQ. ID. NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y una region de entramado de dominio variable de cadena pesada (VH) de una similitud de al menos el 85% con una region de

entramado de VH seleccionada del grupo que comprende SEQ. ID. NO: 8, 9, 10 y 11; o

(b) la secuencia de SEQ. ID. NO: 13.
2. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 1 que es para aplicacion topica a un ojo.
3. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 2, formulada para obtener una concentracion intraocular del polipeptido de union a antlgeno de al menos 100 ng/ml.
4. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 2 o 3, en la que el polipeptido de union a antlgeno se formula para la aplicacion topica al ojo y puede atravesar la cornea y pasar a un espacio intraocular en ausencia de potenciador de la penetracion.
5. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que la composicion esta en forma de colirio.
6. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composicion tiene un pH de menos de 8.
7. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido es suficientemente soluble como para transitar por la una o mas capas epiteliales en menos de 4 horas.
8. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composicion comprende ademas uno o mas agentes de potenciacion de la penetracion.
9. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 8, en la que el agente de potenciacion de la penetracion se selecciona del grupo que consiste en Azone, cloruro de benzalconio (BzCl), BL-7, BL-9, Brij 35, Brij 78, Brij 98, Brij 99, polioxietileno-polioxipropileno 1800, caprato de sodio, acido caprllico, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, colato, aceite de ricino, aceite de malz, Cremophor-EL, DMSO, bromuro de decametonio, desoxicolato, sulfato de dextrano, EDTA, edetato de disodio, etanol, fusidato, glicocolato, laurilsulfato, L-a-lisofosfatidilcolina, N- lauroilsarcosina, NMP, acido oleico, fosfollpidos, lauril eter de polioxietileno 9, saponina, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, taurocolato y taurodesoxicolato, en particular caprato de sodio.
10. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido tiene una afinidad de union por un antlgeno diana de una KD de al menos 10E-6 M o menos.
11. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el polipeptido de union a antlgeno en una concentracion mayor de 2 mg/ml, o mayor de 2,5 mg/ml, preferiblemente mayor de 5 mg/ml, mas preferiblemente mayor de 10 mg/ml.
12. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido de union a antlgeno obtiene una concentracion intraocular mayor de 100 ng/ml.
13. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido de union a antlgeno es estable a una temperatura de desde -80 grados centlgrados hasta 37 grados centlgrados.
14. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido de union a antlgeno sigue siendo estable durante al menos ocho semanas.
15. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido de union a antlgeno sigue siendo estable durante al menos seis semanas a 4 grados centlgrados.

5

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15

20

25

30

35

40
16. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido de union a antigeno sigue siendo estable durante 1 mes, preferiblemente al menos dos meses, lo mas preferido al menos seis meses a de 20°C a 40°C, preferiblemente a 37°C en PBS.
17. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido de union a antigeno es estable en condiciones reductoras tal como se mide en un ensayo de interaccion con levaduras denominado “control de calidad”.
18. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido sigue estando en forma monomerica en condiciones fisiologicas.
19. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido es soluble a temperatura ambiental en PBS a concentraciones mayores de 1 mg/ml, preferiblemente mayores de 4 mg/ml, mas preferiblemente mayores de 10 mg/ml, incluso mas preferiblemente mayores de 25 mg/ml, o lo mas preferiblemente mayores de 50 mg/ml.
20. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipeptido revela un punto medio de transicion en valoracion con clorhidrato de guanidinio de al menos 1,5 M, preferiblemente al menos 1,75 M, mas preferiblemente al menos 1,9 M o lo mas preferiblemente al menos 2 M.
21. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la solubilidad o cinetica de transito del polipeptido de union a antigeno se mide mediante un ensayo seleccionado de un ensayo de monocapa de celulas epiteliales Caco-2 convencional, un ensayo de solubilidad de un solo hibrido o de doble hibrido intracelular convencional y un ensayo de permeabilidad con yeyuno de raton convencional.
22. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que solubilidad se mide mediante un ensayo de precipitacion con PEG convencional o un ensayo de cromatografia de autointeraccion (SIC).
23. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que

(a) la region de entramado de dominio variable de cadena ligera (VL) tiene una similitud de al menos el 85% con SEQ. ID. NO: 2 y la region de entramado de dominio variable de cadena pesada (VH) tiene una similitud de al menos el 85% con SEQ. ID. NO: 8;

(b) la region de entramado de dominio variable de cadena ligera (VL) tiene una similitud de al menos el 85% con SEQ. ID. NO: 4 y la region de entramado de dominio variable de cadena pesada (VH) tiene una similitud de al menos el 85% con SEQ. ID. NO: 10, o

(c) la region de entramado de dominio variable de cadena ligera (VL) tiene una similitud de secuencia de al menos el 95% con SEQ. ID. NO: 7 y la region de entramado de dominio variable de cadena pesada (VH) tiene una similitud de secuencia de al menos el 95% con SEQ. ID. NO: 8.
24. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la afinidad del anticuerpo por su antigeno se caracteriza por una constante de disociacion KD de menos de 100 nM.
25. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo tiene especificidad por TNFa humano.
26. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo se modifica quimicamente.
27. Composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el excipiente se selecciona del grupo que comprende cloruro de benzalconio, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 y clorhexidina.