JP6226824B2 - 上皮および／または内皮層を通過するｓｃＦｖ抗体 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、選択した抗原の過剰発現に依存する疾患の診断および治療における、組織浸
透および局所適用のための改善された特徴を持つ、ｓｃＦｖ抗体に関する。特に、本発明
は、前記の選択した抗原に特異的に結合し、そして該抗原を不活性化する抗体に関する。

関連情報
本明細書全体で引用するいかなる特許、特許出願、および参考文献の内容も、その全体
が本明細書に援用される。

発明の背景
多くの疾患の局部治療は、上皮組織に浸透することが可能でなければならない薬剤の局
所適用によって起こりうる。隣接する上皮細胞は、密着結合によって封印され、大部分の
溶解した分子が、上皮シートの一方から他方に通過するのを防止する（Ａｌｂｅｒｔｓら
， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ， 第２版）。密着
結合は、単純な上皮および内皮において、傍細胞関門の形成および維持に、そして細胞極
性に決定的である。これらはまた、血液脳関門にも重要な役割を果たし、該関門は、脳か
ら出て行くかまたは脳に進入する物質を制御する。巨大分子量薬剤は、作用部位に到達す
るために、これらの組織関門を通過する必要がある。一般的に、抗体は、上皮細胞層の密
着結合を横断するには大きすぎる。

体の正常な活性の一部として、密着結合は、細胞の内部および外部両方の多様なシグナ
ルに応答して、選択的に開き、そして閉じる。これによって、巨大分子または全細胞さえ
もが密着結合関門を通過することが可能になる。

療法化合物の粘膜投与は、注射および他の投与様式に勝る特定の利点を提供可能であり
、こうした利点は例えば、送達の簡便性および迅速さの観点からであり、ならびに注射に
よる送達に伴うコンプライアンスの問題および副作用を減少させるかまたは除去すること
による。しかし、生物学的活性剤の粘膜送達は、粘膜関門機構および他の要因によって制
限される。これらの理由のため、粘膜薬剤投与は、典型的には、注射による投与より多量
の薬剤を必要とする。巨大分子薬剤、ペプチドおよびタンパク質を含む、他の療法化合物
は、しばしば、粘膜送達に抵抗性である。

送達増進性剤の補助を伴わずに、薬剤が粘膜表面を透過する能力は、分子サイズ、脂溶
性、およびイオン化を含む、いくつかの要因に関連するようである。約３００〜１，００
０ダルトン未満の小分子は、しばしば、粘膜関門に浸透可能であるが、分子サイズが増加
するにつれて、透過性が迅速に減少する。脂溶性化合物は、一般的に、非脂溶性分子より
、粘膜表面を透過可能である。ペプチドおよびタンパク質は、ほとんど脂溶性でなく、そ
してしたがって、粘膜表面を渡る吸収特性が劣る。

ＵＳ２００６０６２７５８は、生物学的活性剤、および哺乳動物被験体における該生物
学的活性剤の粘膜送達を増進するのに有効な透過化ペプチドを含む、組成物および方法を
提供する。透過化ペプチドは、典型的には、被験体の粘膜上皮表面で上皮結合構造および
／または生理を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する。

上皮密着結合の機能を調節可能なペプチドが、先に記載されてきている（Ｊｏｈｎｓｏ
ｎ， Ｐ．Ｈ．およびＱｕａｙ， Ｓ．Ｃ．、２０００）。ＣＡ２３７９６６１は、Ｃａ
ｌｕｄｉｎ−６由来ペプチドを含む傍細胞薬剤送達系を提供する。Ｃｌａｕｄｉｎは、密
着結合部分に位置し、そして関門機能を提供する、膜貫通タンパク質のスーパーファミリ
ーに相当する。

抗体は、生化学研究および分子生物学研究の強力なツールであり、そして高い親和性で
抗原に特異的に結合可能であるために、医学的診断法および療法に広く適用される。典型
的には、抗体は、ジスルフィド結合を介して互いに共有結合している、２つの重鎖および
２つの軽鎖からなる。３つの相補性領域（ＣＤＲ）を含む高可変ドメインは、各鎖のＮ末
端に位置する。重鎖および軽鎖の可変領域は、協調して、抗体の抗原特異性を決定する。
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをコード
するＤＮＡ配列を、柔軟なアミノ酸リンカーをコードするスペーサー配列と連結すること
によって、操作されている（Ｂｉｒｄら、１９８８）。

この形式は、ｓｃＦｖが単一遺伝子によってコードされ、突然変異を容易に導入可能で
あり、そして生じたｓｃＦｖを酵母および原核系において発現可能であり、これによって
単純な分子生物学により、実質的にいかなるエピトープに対する特異的高親和性結合剤も
迅速に選択することが可能になる点で、慣用的な全長抗体に勝る利点を有する。エフェク
ター機能を欠くため、ｓｃＦｖ抗体は、抗体依存性または補体依存性の細胞仲介性細胞傷
害性（それぞれ、ＡＤＣＣまたはＣＤＣＣ）を介して毒性効果を発揮せず、そして全長抗
体とは異なり、ｓｃＦｖ抗体は、優れた組織浸透能を示す。

多数の異なる抗原に対して、多くの一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が生成されてきており、こ
れは特に、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイなどの技術を用いて、高
結合能に関して、これらを容易に選択可能であるためである。さらに、ｓｃＦｖ抗体は、
療法全長抗体の産生と比較して、より低いコストを伴う微生物系において、産生可能であ
る。

慣用的な細胞外およびｉｎ ｖｉｔｒｏ適用に加えて、ｓｃＦｖはまた、細胞内適用に
も成功裡に用いられてきている（Ｗｏｅｒｎら、２０００； Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒ
ら、２００２； Ｓｔｏｃｋｓ ＭＲ、２００４）；したがって、細胞内抗原に対して向
けられるｓｃＦｖが開発されてきた。一般的に、機能するｓｃＦｖの細胞内発現は、不安
定であり、不溶性であり、そして凝集体を形成する傾向があることによって制限される。
このため、いわゆる「品質管理（QualityControl）」スクリーニングを用いて、細胞内
環境（例えば核、細胞質）に典型的な還元条件下で、特に可溶性でありそして安定なｓｃ
Ｆｖ抗体のためのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング系が成功裡に開発され（ＷＯ０１４８０
１７； Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら（２００１）； Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２
００４）、そしてこのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング系によって、こうした目的のため
の特に安定でそして可溶性なｓｃＦｖフレームワーク配列が同定されてきた（ＷＯ０３０
９７６９７）。さらに、これらのフレームワークは、細胞外環境において、天然の酸化条
件下でもまた、例外的な発現レベル、ならびに増進した安定性および可溶性特性を示す。
したがって、これらの好ましい生物物理的および生化学的特性の結果、好ましい高産生収
量が得られ、そしてこれらの抗体断片がひとたび特定の抗原に対して向けられたならば、
特定の療法領域において、局部にそして／または全身性に、タンパク質療法剤として、適
用されることが可能になる。

多くの療法適用、特に局部適用において、抗体を使用するためには、重要な要因は、抗
体が、組織、そして特に上皮組織関門に浸透する能力である。
局部適用は、特定の場所に現れ、そして全身治療を必要としない障害、例えば眼の疾患
の治療に特に望ましい。

前部ブドウ膜炎
ブドウ膜炎は、１００，０００人あたり、３０〜４０人の有病率を持つ、ブドウ膜の急
性または慢性炎症である（ＬｉｇｈｔｍａｎおよびＫｏｋ ２００２）。ブドウ膜炎は、
ブドウ膜前部、中間部または後部の位置によって細分される。治療せずに放置すれば、前
部ブドウ膜炎は後部ブドウ膜炎に発展し、その後、白内障、網膜炎およびさらに盲目など
の合併症を伴う（ＫｏｋおよびＬｉｇｈｔｍａｎ ２００４）。＜６５歳では、ブドウ膜
炎の結果として法律上盲目となった個人が、糖尿病性網膜症と同じだけ多くいる（Ｋｏｋ
およびＬｉｇｈｔｍａｎ ２００４）。前部ブドウ膜炎は、眼内炎症性疾患の最も一般的
な型であり、症例の５０％で、組織適合遺伝子座ＡアレルＢ２７（ＨＬＡ−Ｂ２７）と関
連する（Ｐｏｗｅｒら １９９８）。これらの患者のうち、約半分のみが、強直性脊椎炎
または慢性炎症性腸疾患などのさらなる全身性疾患を患う（Ｅｌ−Ｓｈａｂｒａｗｉおよ
びＨｅｒｍａｎｎ ２００２）。ブドウ膜炎の治療は、主に、炎症プロセスを制御するこ
とを目指す（ＫｏｋおよびＬｉｇｈｔｍａｎ ２００４）。現在、コルチコステロイドは
、ブドウ膜炎の主力療法である（ＫｏｋおよびＬｉｇｈｔｍａｎ ２００４）。重要なこ
とに、局部および全身性コルチコステロイド治療は、緑内障および白内障のリスクを有意
に増加させ、したがって、その反復使用は制限される（Ｅｌ−ＳｈａｂｒａｗｉおよびＨ
ｅｒｍａｎｎ ２００２）。メトトレキセート、シクロスポリンまたはアザチオプリンを
含む他の治療は、効果を生じるために最低６週間の治療を必要とし、患者を、生活の質が
非常に制約された状態で長期間放置する（Ｅｌ−ＳｈａｂｒａｗｉおよびＨｅｒｍａｎｎ
２００２、Ｄｉｃｋら １９９７）。

上記から、明らかに明示された医学的必要性が明らかである。局所コルチコステロイド
が最も一般的な療法オプションであるが、有意な副作用を有し、実際に、盲目となる長期
リスクを悪化させる。

最近、ブドウ膜炎患者の房水中に１５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦα濃度が見出され、一方、健
康な個体における対応するレベルは、０．５６ｐｇ／ｍｌであった（Ｐｅｒｅｚ−Ｇｕｉ
ｊｏら ２００４）。全身性に適用されたＴＮＦα阻害剤を用いたいくつかの小規模臨床
研究は、「即時改善」（Ｅｌ−ＳｈａｂｒａｗｉおよびＨｅｒｍａｎｎ ２００２）また
は「数日以内の顕著な臨床的改善」（Ｍｕｒｐｈｙら ２００４）または「２週間以内」
（Ｊｏｓｅｐｈ ２００３）または「最初のインフリキシマブ用量後の有意な改善」（Ｂ
ｅｎｉｔｅｚ Ｄｅｌ Ｃａｓｔｉｌｌｏら ２００４）を報告する。

したがって、ＴＮＦαをターゲットとする概念は、臨床的によく検証されている。しか
し、ＴＮＦα阻害剤の全身適用に関連する安全性の懸念が残り、そしてこのため、さらな
る全身性疾患徴候を欠く、ブドウ膜炎患者のかなりの割合での使用は正当化されないであ
ろう。

したがって、局所的ＴＮＦα阻害剤は、特に前部ブドウ膜炎患者において、よく定義さ
れた医学的必要性を満たすであろう。分子量が高いため、市販のＴＮＦα阻害剤は、局所
適用不能である（Ｔｈｉｅｌら ２００２を参照されたい）。

ベーチェット病
ベーチェット病は、特発性、多臓器性、慢性および再発性疾患であり、古典的には一時
的な眼性攻撃的炎症性発作、尿生殖器（ｏｒｏｇｅｎｉｔａｌ）潰瘍および皮膚病変によ
って特徴付けられた。まれに、ベーチェット病の重症例では、さらに、関節、内耳前庭（
ａｕｄｉｏ−ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ）、胸部、胃腸、心臓血管、腎またはＣＮＳ関与もま
た観察されうる。眼は、ベーチェット病において、最も一般的に関与がある臓器であり、
そして患者における慢性病的状態の主因である。眼性疾患は、片側性（２０％）または両
側性（８０％）虹彩毛様体炎、前房蓄膿、あるいは慢性および再発経過をたどる汎ブドウ
膜炎からなる。一般的に、初期の悪化は、より前部および片側性である傾向があり、一方
、続く発作は、眼の硝子体腔および後部部分を伴い、両側性になる傾向がある（Ｅｖｅｒ
ｅｋｌｉｏｇｌｕ ２００５）。重度ブドウ膜炎は、日本人およびトルコ人患者などの流
行地の患者の間でより一般的に観察され、この集団の７０〜９０％に影響を及ぼす（Ｏｅ
ｚｅｎ １９９９； Ｔｕｒｓｅｎら、２００３； Ｔｕｇａｌ−Ｔｕｔｋｕｎら、２０
０４； Ｙｕｒｄａｋｕｌら、２００４； Ｅｖｅｒｅｋｌｉｏｇｌｕ ２００５）。視
覚喪失リスクは、進行性に増加し、１０年の時点では症例の１／４に達する。さらに、日
本などの、該疾患の有病率および重症度が高い国では、法律上の盲目が有意であり、そし
て症例の５０％以上で、最終的に結果として生じる（Ｂｏｙｄら、２００１； Ｅｖｅｒ
ｅｋｌｉｏｇｌｕ ２００５）。

ベーチェット病は、独特の地理的変化を示し、そして特に、日本、韓国、サウジアラビ
ア、イランおよびトルコで、ならびに中国およびイスラエルを含む、古代の「シルクロー
ド」沿いの国々で、風土性により高い（ＢｏｎｆｉｏｌｉおよびＯｒｅｆｉｃｅ ２００
５； Ｅｖｅｒｅｋｌｉｏｇｌｕ ２００５）。例えば、ベーチェット病は、米国では、
ブドウ膜炎症例のわずか０．２％であるのに比較して、日本およびトルコでは２０％を占
める。この疾患が風土性である国々では、該疾患はより重症であり、眼性徴候および合併
症の頻度がより高く、そして男性、特に若い成人男性でより一般的である（Ｅｖｅｒｅｋ
ｌｉｏｇｌｕ ２００５）。この特有の疫学は、遺伝学（ＨＬＡ−Ｂ５１アレルとの関連
など（Ｓａｋａｎｅら、１９９９； Ｖｅｒｉｔｙら、１９９９； Ｅｖｅｒｅｋｌｉｏ
ｇｌｕ ２００５））、感染性病原体（Ｄｉｒｅｓｋｅｎｅｌｉ ２００１； Ｅｖｅｒ
ｅｋｌｉｏｇｌｕ ２００５）および環境的要因の組み合わせによって仲介されるようで
ある。ベーチェット病の概算される有病率は、地中海の国々、中東および極東では、１：
１０，０００〜１：１０００の間である。日本およびシルクロード沿いのアジアの国々で
は、有病率は１００，０００あたり１３〜３０であり、そして日本の北部で最も高く；全
体で最高の有病率は、１００，０００あたり最大４００であり、トルコの特定の地方で観
察される。米国には、およそ１５，０００人のベーチェット病患者がいる（Ｚｉｅｒｈｕ
ｔら、２００３； Ｅｖｅｒｅｋｌｉｏｇｌｕ ２００５）。

眼性炎症性発作の結果が、ベーチェット病患者の慢性病的状態の主因である（Ｅｖｅｒ
ｅｋｌｉｏｇｌｕ ２００５）。ベーチェット病の治療は、対症性であり、そして経験的
である。ブドウ膜炎の他の型におけるように、局所、眼周囲および全身性コルチコステロ
イドが、眼性ベーチェット病の主力療法に相当する。しかし、患者における、コルチコス
テロイドに基づく治療様式の使用は、重大な副作用プロフィールのために限定される。さ
らに、コルチコステロイドは、眼性ベーチェット病の完全な寛解をめったに誘導せず、そ
して患者のかなりの割合が、長い間に、ステロイド耐性疾患を発展させる（Ｅｖｅｒｅｋ
ｌｉｏｇｌｕ ２００５）。疾患経過中、治療はしばしば、アザチオプリン、メトトレキ
セートおよびシクロスポリンＡなどの免疫抑制剤を含む。しかし、これらの剤はまた、臨
床的安全性の問題と関連するため、この適応症における、効率的でそして安全な新規治療
様式に関して、よく表明される医学的必要性がある。

ＴＮＦαにおける多型変動が、ベーチェット病の重症度に関連していることを示唆する
最近の疫学的知見（Ｖｅｒｉｔｙら、１９９９ｂ）に加えて、眼性ベーチェット病におけ
るインフリキシマブの使用を記載する、非常に多様な症例報告および小規模臨床試験が存
在する（Ｏｈｎｏら、２００４； Ｗｅｃｈｓｌｅｒら、２００４； Ｇｉａｎｓａｎｔ
ｉら、２００４； Ｌａｎｔｈｉｅｒら、２００５； Ｔｕｇａｌ−Ｔｕｔｋｕｎら、２
００５； Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔら、２００５）。実際、これらの研究はすべて、慣用的療
法に耐性であった患者においてさえ、眼性ベーチェット病の迅速でそして完全な寛解を報
告する（Ｔｕｇａｌ−Ｔｕｔｋｕｎら、２００５）。しかし、いくつかの研究において、
インフリキシマブで治療したブドウ膜炎患者における副作用の頻度および重症度は予想外
に高く、したがって、この疾患の治療のためにＴＮＦαアンタゴニストを全身性に適用す
る潜在的可能性が制限される（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ２００４； Ｓｕｈｌｅｒら、２０
０５）。

ＴＮＦαが眼性ベーチェット病において非常に魅力的な薬剤ターゲットであることが臨
床的に検証され（Ｏｈｎｏら、２００４； Ｗｅｃｈｓｌｅｒら、２００４； Ｇｉａｎ
ｓａｎｔｉら、２００４； Ｌａｎｔｈｉｅｒら、２００５； Ｔｕｇａｌ−Ｔｕｔｋｕ
ｎら、２００５； Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔら、２００５）、そしてブドウ膜炎患者において
、全身でＴＮＦαを抑制すると安全性の懸念があるようである（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ２
０４； Ｓｕｈｌｅｒら、２００５）ことから、眼性ベーチェット病用の、特に主に眼性
症状を有する患者用の、局所適用可能ＴＮＦαアンタゴニストを開発する必要性があるこ
とが明らかである。

優れた組織浸透能を有し、そして腎クリアランスが迅速であるため、ｓｃＦｖ抗体は、
局部適用に好ましい。分子が組織関門に浸透する能力には、電荷、ヒドロパシー性および
分子量に加えて、可溶性、凝集傾向および熱安定性などの特性が影響を及ぼす。例えば、
非常に可溶性である抗体断片は、およそ３７℃の生理学的温度で凝集体を形成するならば
、上皮関門に浸透することは不能である可能性もある。ｓｃＦｖフレームワーク中の単一
アミノ酸残基の突然変異は、一方で、周囲温度での可溶性を改善する可能性もあり、そし
てこの突然変異は、熱安定性を改変して、そしてしたがって３７℃での部分的アンフォー
ルディングおよび凝集につながる可能性もある。こうした凝集体は、分子量がより高いた
め、もはや組織関門を通過不能である。

組織浸透は、特に局所適用において、効率的な薬剤送達のための重要な要因であるため
、安定性が高くそして抗原性が低い、ほかの所望の特徴に加えて、組織浸透能が改善され
た、療法抗体、特にｓｃＦｖ抗体に関する必要性がある。ＷＯ００４０２６２は、それぞ
れ、眼性障害を治療するかまたは診断する、薬剤または診断ツールとしての、抗体断片、
例えばｓｃＦｖを開示する。０．２〜０．２５ｍｇ／ｍｌ ｓｃＦｖの濃度で、眼への浸
透実験を行う。ｓｃＦｖが、浸透増進剤の非存在下では非常に低速で、そして浸透増進剤
の存在下ではより高速で角膜の上皮関門に浸透可能であることが示された。浸透増進剤は
、細胞傷害効果を有するかまたは上皮改変を引き起こしうるため、ｓｃＦｖおよびその断
片による眼性疾患の治療のための代替法および／または改善法に関する必要性がある。特
に、比較的高濃度で投与可能な、低い度合いの副作用しか伴わない局部投与による、制御
された療法用の抗体が必要である。

本明細書に引用するすべての刊行物および参考文献は、その全体が本明細書に援用され
る。

ＵＳ２００６０６２７５８ ＣＡ２３７９６６１ ＷＯ０１４８０１７ ＷＯ０３０９７６９ ＷＯ００４０２６２

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したがって、選択した抗原に特異的に結合し、そして改善された組織浸透能を有する抗
体、好ましくはｓｃＦｖ抗体を提供するのが、本発明の一般的な目的である。
ここで、説明が進むにつれてより容易に明らかになるであろう本発明のこれらの目的、
およびさらにさらなる目的を遂行するため、前記抗体は、
（ｉ）可溶性でそして安定なフレームワークのプールから、選択した抗原に結合する特異
性を持つ非ヒト抗体のフレームワークに最適にマッチするフレームワークを選択し、
（ｉｉ）前記フレームワークに、前記抗原に結合するＣＤＲを提供するか、または前記非
ヒト抗体のフレームワークを、前記の可溶性でそして安定なフレームワークの配列へと突
然変異させるかのいずれかを行い、
（ｉｉｉ）生成した抗体を、可溶性および安定性に関して試験し、そして
（ｉｖ）生成した抗体を、抗原結合に関して試験する
工程を含む方法によって得られうるという特徴によって明示される。

場合によって、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の間に、以下の工程が付加される：
−選択した１以上のＣＤＲおよび／またはフレームワークの部位特異的またはランダム突
然変異誘発によって、前記ｓｃＦｖ抗体を突然変異させる工程。

本発明はまた、可溶性の抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であって、該抗原結合性
ポリペプチドが、約８時間未満で、１以上の上皮層、例えば内皮層または中皮層を横断可
能である、前記組成物も提供する。例えば、抗原結合性ポリペプチドは、約８、７、６、
５、４、３、２、１、またはより短い時間未満で、１以上の上皮層を横断可能である。１
つの態様において、抗原結合性ポリペプチドは、約４時間未満で、単数または複数の上皮
層を横断可能である。すべての値、ならびにこれらの値および範囲間の範囲は、本発明に
含まれると意味されることが理解されるものとする。

他の態様において、上皮層は、眼、例えば角膜のもの、例えば角膜上皮および／または
内皮である。１つの態様において、上皮層は腸のものである。さらに別の態様において、
上皮層は血液脳関門である。

さらに他の態様において、抗原結合性ポリペプチドは、約８時間未満で、損なわれてい
ない（ｉｎｔａｃｔ）哺乳動物角膜を横断可能である。例えば、抗原結合性ポリペプチド
は、約８、７、６、５、４、３、２、１、またはより短い時間未満で、損なわれていない
哺乳動物角膜を横断可能である。１つの態様において、抗原結合性ポリペプチドは、損な
われていないヒト角膜を横断可能である。１つの態様において、抗原結合性ポリペプチド
は、損なわれていないブタまたはウサギ角膜を横断可能である。

さらに他の態様において、組成物は、浸透増進剤をさらに含む。特定の態様において、
浸透増進剤は、アゾン（Ａｚｏｎｅ^{（登録商標）}）、塩化ベンザルコニウム（ＢｚＣｌ）
、ＢＬ−７、ＢＬ−９、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ９９、ポ
リオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００、カプリン酸ナトリウム、カプリル酸
、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、コール酸塩、ヒマシ油、コーン油、クレ
モフォア−ＥＬ、シクロデキストリン、ＤＭＳＯ、臭化デカメトニウム、デオキシコール
酸塩、デキストラン硫酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＥＴＡＴＥ二ナトリウム、エタノール、フシジ
ン酸塩、グリココール酸塩、ラウリル硫酸、Ｌ−α−リソホスファチジロコリン、メタゾ
ールアミド、Ｎ−ラウロイルザルコシン、ＮＭＰ、オレイン酸、Ｐｚ−ペプチド、リン脂
質、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅ
ｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロコール酸塩、およびタウロデオキシコ
ール酸塩からなる群より選択される。別の態様において、浸透増進剤はカプリン酸ナトリ
ウムである。さらに別の態様において、浸透増進剤には、コロイド系、ポリアクリレート
および生体接着性ポリマーが含まれる。

好ましい態様において、本発明の分子は、浸透増進剤の非存在下で、上皮層、例えば眼
の上皮層（角膜）を横断可能である。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、少なくとも１０Ｅ−６Ｍまたはそれより優
れたＫＤの、ターゲット抗原に対する結合親和性を有する。

いくつかの側面において、本発明は、約８未満のｐＨを有する組成物であって、損なわ
れていない角膜を通過するのに十分に可溶性である抗原結合性ポリペプチド（例えば一本
鎖抗体）を含む、前記組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、約６〜約
８の範囲のｐＨを有する。他の態様において、組成物は、約６、６．５、７．０、７．５
、８．０またはその任意の増分値のｐＨを有する。任意の値、ならびにこれらの値および
範囲間の範囲が本発明に含まれると意味されることが理解される。

いくつかの側面において、本発明は、約８未満のｐＨを有する組成物であって、損なわ
れていない角膜を通過するのに十分に可溶性である抗原結合性ポリペプチド（例えば一本
鎖抗体）を含む、前記組成物を提供する。いくつかの側面において、本発明は、可溶性抗
原結合性ポリペプチドを含み、そして該ポリペプチドが、約８時間未満で、損なわれてい
ない角膜を通過するのに十分に可溶性であり、そして約ｐＨ８以下に処方されている、組
成物を提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、約４時間未満で、損なわれ
ていない角膜を通過するのに十分に可溶性である。他の態様において、組成物は、浸透増
進剤をさらに含む。いくつかの態様において、浸透増進剤は、アゾン^{（登録商標）}、塩化
ベンザルコニウム（ＢｚＣｌ）、ＢＬ−７、ＢＬ−９、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ７８、Ｂ
ｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ９９、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００、カプ
リン酸ナトリウム、カプリル酸、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、コール酸
塩、ヒマシ油、コーン油、クレモフォア−ＥＬ、ＤＭＳＯ、臭化デカメトニウム、デオキ
シコール酸塩、デキストラン硫酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＥＴＡＴＥ二ナトリウム、エタノール
、フシジン酸塩、グリココール酸塩、ラウリル硫酸、Ｌ−α−リソホスファチジロコリン
、Ｎ−ラウロイルザルコシン、ＮＭＰ、オレイン酸、リン脂質、ポリオキシエチレン−９
−ラウリルエーテル、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔ
ｗｅｅｎ８０、タウロコール酸塩、およびタウロデオキシコール酸塩からなる群より選択
される。いくつかの態様において、浸透増進剤はカプリン酸ナトリウムである。いくつか
の態様において、浸透増進剤は、クロルヘキシジンである。

いくつかの側面において、本発明は、可溶性抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であ
って、該抗原結合性ポリペプチドが、約８時間未満で、損なわれていない角膜の１以上の
層を横断する、前記組成物を提供する。他の側面において、本発明は、約２．５ｍｇ／ｍ
ｌより高い濃度で抗原結合性ポリペプチド（例えば一本鎖抗体）を含み、該ポリペプチド
が、約８時間未満で、損なわれていない角膜を通過するのに十分に可溶性である、組成物
を提供する。該組成物は、約２．５ｍｇ／ｍｌ以上〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ以上の範囲の
濃度で、抗原結合性ポリペプチドを含んでもよい。例えば、組成物は、約２．５ｍｇ／ｍ
ｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、５．
０ｍｇ／ｍｌ、５．５ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、６．５ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／
ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、８．５ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、９
．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ以上、またはその任意の増分値の濃度で、抗原結
合性ポリペプチドを含んでもよい。すべての値、ならびにこれらの値および範囲間の範囲
が本発明に含まれると意味されることが理解されるものとする。いくつかの態様において
、抗原結合性ポリペプチドは、約４．０ｍｇ／ｍｌより高い濃度である。他の態様におい
て、抗原結合性ポリペプチドは、約１０．０ｍｇ／ｍｌより高い濃度である。

さらに他の態様において、ポリペプチドは、約４時間未満で、損なわれていない角膜を
通過するのに十分に可溶性である。他の態様において、組成物は、浸透増進剤をさらに含
む。いくつかの態様において、浸透増進剤は、アゾン^{（登録商標）}、塩化ベンザルコニウ
ム（ＢｚＣｌ）、ＢＬ−７、ＢＬ−９、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９８、Ｂ
ｒｉｊ９９、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００、カプリン酸ナトリウ
ム、カプリル酸、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、コール酸塩、ヒマシ油、
コーン油、クレモフォア−ＥＬ、ＤＭＳＯ、臭化デカメトニウム、デオキシコール酸塩、
デキストラン硫酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＥＴＡＴＥ二ナトリウム、エタノール、フシジン酸塩
、グリココール酸塩、ラウリル硫酸、Ｌ−α−リソホスファチジロコリン、Ｎ−ラウロイ
ルザルコシン、ＮＭＰ、オレイン酸、リン脂質、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエー
テル、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、
タウロコール酸塩、およびタウロデオキシコール酸塩からなる群より選択される。いくつ
かの態様において、浸透増進剤はカプリン酸ナトリウムである。他の態様において、浸透
増進剤は、クロルヘキシジンである。

いくつかの側面において、本発明は、少なくとも１０Ｅ−６ＭのＫＤの、ターゲット抗
原に対する結合親和性を有し、そして上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性であり、
そして生理学的条件下で、単量体型のままである、抗原結合性ポリペプチド（例えば一本
鎖抗体）を提供する。

他の側面において、本発明は、抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であって、該抗原
結合性ポリペプチドが、摂氏約−８０度から摂氏約３７度の温度で安定である、前記組成
物を含む。例えば、組成物は、摂氏−８０度、摂氏−７０度、摂氏−６０度、摂氏−５０
度、摂氏−４０度、摂氏−３０度、摂氏−２０度、摂氏−１０度、摂氏０度、摂氏１０度
、摂氏２０度、または摂氏３０度、あるいはその任意の増分値で安定であってもよい。す
べての値、ならびにこれらの値および範囲間の範囲が本発明に含まれると意味されること
が理解されるものとする。いくつかの態様において、抗原結合性ポリペプチドは、少なく
とも約８週間安定なままである。他の態様において、抗原結合性ポリペプチドは、摂氏４
度で、少なくとも６週間安定なままである。

いくつかの側面において、本発明は、抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であって、
該抗原結合性ポリペプチドが、本明細書に開示する図のいずれかの中に実験的に示すよう
な薬力学的または薬物動態学的特徴を有する、前記組成物を提供する。

他の側面において、本発明は、少なくとも１０Ｅ−６Ｍまたはそれより優れたＫＤの、
ターゲット抗原に対する結合親和性を有し、そして約８時間未満で上皮密着結合を通過す
るのに十分に可溶性である、抗原結合性ポリペプチドを提供する。いくつかの態様におい
て、ポリペプチドは、約４時間以下で上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性である。

さらにさらなる他の側面において、本発明は、少なくとも１０Ｅ−６Ｍまたはそれより
優れたＫＤの、ターゲット抗原に対する結合親和性を有し、そして約８時間未満で上皮密
着結合を横断可能な抗原結合性ポリペプチドの通過動態に対応する１／２ Ｖｍａｘ値を
有する、抗原結合性ポリペプチドを提供する。

他の側面において、本発明には、療法で使用するのに適しているように、標準的Ｃａｃ
ｏ−２（ヒト結腸腺癌）上皮細胞単層アッセイで測定した際、上皮密着結合を通過するの
に十分に可溶性である抗原結合性ポリペプチドが含まれる。多様な側面において、本発明
には、療法で使用するのに適しているように、標準的マウス十二指腸透過性アッセイで測
定した際、上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性である抗原結合性ポリペプチドが含
まれる。さらに他の側面において、本発明には、療法で使用するのに適しているように、
標準的細胞内１ハイブリッドまたは２ハイブリッド可溶性アッセイによって予測した際、
上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性である抗原結合性ポリペプチドが含まれる。さ
らにさらなる他の側面において、本発明は、療法で使用するのに適しているように、標準
的ＰＥＧ沈殿アッセイまたは自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）アッセイによっ
て予測した際に、上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性である抗原結合性ポリペプチ
ドを提供する。

他の側面において、本発明は、約８時間未満で上皮密着結合を渡る抗原結合性ポリペプ
チドの通過に対応する１／２ Ｖｍａｘ値を有する抗原結合性ポリペプチドを同定するた
めの方法を提供する。該方法は、以下の工程：誘導性レポーター遺伝子系を有する宿主細
胞において、抗原結合性ポリペプチドの候補を細胞内発現させること｛ここでレポーター
遺伝子系は、前記通過動態を有する抗原結合性ポリペプチドが存在する際に、記録可能な
シグナルを生じる｝；そして、記録可能シグナルに関して前記細胞をスクリーニングする
こと、｛ここで前記シグナルの存在は、候補ポリペプチドが前記通過動態を有する抗原結
合性ポリペプチドであると同定する｝を含む。本発明はまた、いくつかの側面において、
この方法によって同定される、抗原結合性ポリペプチドも提供する。いくつかの側面にお
いて、本発明はまた、この方法を実行するためのキットも提供する。

他の側面において、本発明は、治療が達成されるように、本明細書の請求項のいずれか
１項の抗原結合性ポリペプチドの療法的有効量を局所投与することによって、眼の病気を
持つ患者を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、眼の病気はブドウ膜炎で
ある。他の態様において、眼の病気は、加齢性黄斑変性症である。

いくつかの側面において、本発明は、少なくとも１つの足場領域が隣接した少なくとも
１つの抗原結合性モチーフを有するポリペプチド領域を含み、そして約８時間未満で上皮
密着結合を横断するのに十分な通過動態を有する、抗原結合性ポリペプチドを提供する。
いくつかの態様において、ポリペプチドは、２つの足場領域が隣接した１つの抗原結合性
モチーフ、３つの足場領域が隣接した２つの抗原結合性モチーフ、４つの足場領域が隣接
した３つの抗原結合性モチーフ、または４番目および５番目の足場領域の間に介在するリ
ンカー領域を伴う、８つの足場領域が隣接した６つの抗原結合性モチーフを含む。他の態
様において、抗原結合性モチーフはＣＤＲであり、そして足場領域は免疫グロブリンフレ
ームワーク領域である。さらにさらなる他の態様において、該ポリペプチドは、３つのＣ
ＤＲおよび４つの介在フレームワーク領域、または６つのＣＤＲおよび８つのフレームワ
ーク領域および介在リンカー領域を含む。

いくつかの側面において、本発明は、ターゲット抗原に特異的に結合可能であり、そし
て約８時間未満で上皮密着結合を横断するのに十分な通過動態を有し、そして式：
Ｙ；または
Ｚ；または
Ｙ−Ｌ−Ｚ；または
Ｚ−Ｌ−Ｙ
式中、Ｙは［Ｆ１−ＣＤＲ１−Ｆ２−ＣＤＲ２−Ｆ３−ＣＤＲ３ Ｆ４］であり、そして
Ｚは［Ｆ５−ＣＤＲ１−Ｆ６−ＣＤＲ２−Ｆ７−ＣＤＲ３ Ｆ８］であり；
Ｙのフレームワーク領域（Ｆ１−Ｆ４）は１以上のヒト軽鎖フレームワークに由来し；Ｚ
のフレームワーク領域（Ｆ５−Ｆ６）は１以上のヒト軽鎖フレームワークに由来し；Ｙの
ＣＤＲ（ＣＤＲ１−３）はターゲット抗原に結合可能な１以上のドナーＣＤＲに由来し；
ＺのＣＤＲ（ＣＤＲ４−６）はターゲット抗原に結合可能な１以上のドナーＣＤＲに由来
し；そしてＬは柔軟なポリペプチドリンカーである
によって表される、抗原結合性ポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、Ｙお
よびＺは、本明細書に開示する任意の配列またはそのコンセンサスによって表される。

あるいは、別の態様において、飽和突然変異誘発によるなどで、抗原結合性ポリペプチ
ドをコードする配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに突然変異を導入してもよい。
「コンセンサス配列」は、関連配列ファミリー中で、最も頻繁に存在するアミノ酸（また
はヌクレオチド）から形成される配列である（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ， Ｆｒｏｍ
Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ， ドイツ
・ワインハイム １９８７））。タンパク質ファミリーにおいて、コンセンサス配列中の
各位は、ファミリーにおいて、その位で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占められる
。２つのアミノ酸が等しく頻繁に存在する場合、どちらがコンセンサス配列に含まれても
よい。

いくつかの側面において、本発明は、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ以上の眼内濃度を
達成するように処方された、抗原結合性ポリペプチドを提供する。さらに他の側面におい
て、本発明は、本明細書に開示するような細胞または動物モデル系に基づいて、１００ｎ
ｇ／ｍｌ以上の眼内濃度を生じる局所投与用に処方された、一本鎖抗体を提供する。

他の側面において、本発明は、眼への局所適用用に製剤化され、そして浸透増進剤の非
存在下で、角膜を通じて、そして眼内空間内に通過することが可能な、抗原結合性ポリペ
プチドを提供する。さらに他の側面において、本発明は、請求項のいずれか１項のポリペ
プチドを用いて、眼の疾患または障害を治療するか、予防するかまたは診断するための方
法を提供する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
可溶性の抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが、８時間
未満で、特に４時間未満で、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）角膜の少なくとも１つの
層を通過する、前記組成物。
（項目２）
ポリペプチドが、損なわれていない角膜を通過するのに十分に可溶性であり、そして組
成物のｐＨが８未満である、項目１の組成物。
（項目３）
可溶性の抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であって、該ポリペプチドが、８時間未
満で、特に４時間未満で、損なわれていない角膜を通過するのに十分に可溶性であり、そ
して該組成物が８未満のｐＨを有する、前記組成物。
（項目４）
１以上の浸透増進剤をさらに含む、先行する項目のいずれか１項記載の組成物。
（項目５）
浸透増進剤が、アゾン ^{（登録商標）} 、塩化ベンザルコニウム（ＢｚＣｌ）、ＢＬ−７、
ＢＬ−９、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ９９、ポリオキシエチ
レン−ポリオキシプロピレン１８００、カプリン酸ナトリウム、カプリル酸、塩化セチル
ピリジニウム、クロルヘキシジン、コール酸塩、ヒマシ油、コーン油、クレモフォア−Ｅ
Ｌ、ＤＭＳＯ、臭化デカメトニウム、デオキシコール酸塩、デキストラン硫酸、ＥＤＴＡ
、ＥＤＥＴＡＴＥ二ナトリウム、エタノール、フシジン酸塩、グリココール酸塩、ラウリ
ル硫酸、Ｌ−α−リソホスファチジロコリン、Ｎ−ラウロイルザルコシン、ＮＭＰ、オレ
イン酸、リン脂質、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、サポニン、Ｔｗｅｅｎ
２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロコール酸塩、およびタ
ウロデオキシコール酸塩、特にカプリン酸ナトリウムからなる群より選択される、項目
４の組成物。
（項目６）
損なわれていない角膜が、哺乳動物、特にヒト、ウサギまたはブタである、先行する請
求項いずれか１項記載の組成物。
（項目７）
ポリペプチドが、少なくとも１０Ｅ−６Ｍ以下のＫＤの、ターゲット抗原に対する結合
親和性を有する、先行する項目のいずれか１項記載の組成物。
（項目８）
抗原結合性ポリペプチドが、８時間未満で、損なわれていない角膜を通過する、先行す
る項目のいずれか１項記載の組成物。
（項目９）
２．５ｍｇ／ｍｌより高い濃度で抗原結合性ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、
８時間未満で、特に４時間未満で、損なわれていない角膜を通過するのに十分に可溶性で
ある、先行する項目のいずれか記載の組成物。
（項目１０）
抗原結合性ポリペプチドを含み、該抗原結合性ポリペプチドが、摂氏−８０度から摂氏
３７度の温度で安定である、先行する項目のいずれか１項記載の組成物。
（項目１１）
抗原結合性ポリペプチドが、少なくとも８週間安定である、項目１０の組成物。
（項目１２）
抗原結合性ポリペプチドが、摂氏４度で、少なくとも６週間安定である、項目１０の
組成物。
（項目１３）
抗原結合性ポリペプチドが、本明細書に開示する図のいずれかの中に実験的に示すよう
な薬力学的または薬物動態学的特徴を有する、先行する項目のいずれか１項記載の組成物。
（項目１４）
少なくとも１０Ｅ−６Ｍ以下のＫＤの、ターゲット抗原に対する結合親和性を有し、そ
して上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性である、抗原結合性ポリペプチド。
（項目１５）
以下の基準：
ａ）ポリペプチドが、生理学的条件下で単量体型のままである
ｂ）ポリペプチドが、８時間未満で、好ましくは４時間未満で、上皮密着結合を通過する
のに十分に可溶性である
ｃ）ポリペプチドが、８時間未満で上皮密着結合を横断可能な抗原結合性ポリペプチドの
通過動態に対応する１／２ Ｖｍａｘ値を有する
の１以上を満たす、項目１４のポリペプチド。
（項目１６）
療法で使用するのに適しているように、上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性であ
る項目１４または１５記載のポリペプチドであって、可溶性が、標準的Ｃａｃｏ−２上
皮細胞単層アッセイで測定され、そして／または標準的細胞内１ハイブリッドまたは２ハ
イブリッド可溶性アッセイによって予測され、そして／または標準的マウス十二指腸透過
性アッセイにおいて測定される、前記ポリペプチド。
（項目１７）
療法で使用するのに適しているように、標準的ＰＥＧ沈殿アッセイまたは自己相互作用
クロマトグラフィー（ＳＩＣ）アッセイによって予測されるとおりに、上皮密着結合を通
過するのに十分に可溶性である、項目１４または１５記載のポリペプチド。
（項目１８）
８時間未満で上皮密着結合を渡る抗原結合性ポリペプチドの通過に対応する１／２ Ｖ
ｍａｘ値を有する抗原結合性ポリペプチドを同定するための方法であって
（ｉ）誘導可能なレポーター遺伝子系を有する宿主細胞において、抗原結合性ポリペプチ
ド候補を細胞内で発現させる工程であって、前記通過動態を有する抗原結合性ポリペプチ
ドが存在する際に、レポーター遺伝子系が記録可能なシグナルを生じるものである当該工程、
（ｉｉ）そして記録可能なシグナルに関して前記細胞をスクリーニングする工程であって
、前記シグナルの存在により候補ポリペプチドが前記通過動態を有する抗原結合性ポリペ
プチドであると同定する当該工程
を含む、前記方法。
（項目１９）
項目１８の方法によって同定される、抗原結合性ポリペプチド。
（項目２０）
項目１８の方法を実行するためのキット。
（項目２１）
治療が達成されるように、本明細書の項目のいずれか１項記載の抗原結合性ポリペプ
チドの療法的有効量を局所投与することによって、眼の病気を持つ患者を治療する方法。
（項目２２）
眼の病気がブドウ膜炎である、項目２１の方法。
（項目２３）
眼の病気が、加齢性黄斑変性症である、項目２２の方法。
（項目２４）
少なくとも１つの足場領域が隣接した少なくとも１つの抗原結合性モチーフを有するポ
リペプチド領域を含み、そして８時間未満で上皮密着結合を横断するのに十分な通過動態
を有する、抗原結合性ポリペプチド。
（項目２５）
２つの足場領域が隣接した１つの抗原結合性モチーフ、３つの足場領域が隣接した２つ
の抗原結合性モチーフ、４つの足場領域が隣接した３つの抗原結合性モチーフ、または４
番目および５番目の足場領域の間に介在するリンカー領域を伴う８つの足場領域が隣接し
た６つの抗原結合性モチーフを含む、項目２４のポリペプチド。
（項目２６）
抗原結合性モチーフがＣＤＲであり、そして足場領域が免疫グロブリンフレームワーク
領域である、項目２４または２５のポリペプチド。
（項目２７）
３つのＣＤＲおよび４つの介在フレームワーク領域、または６つのＣＤＲおよび８つの
フレームワーク領域および１つの介在リンカー領域を含む、項目２６のポリペプチド。
（項目２８）
式：
Ｙ；または
Ｚ；または
Ｙ−Ｌ−Ｚ；または
Ｚ−Ｌ−Ｙ
式中、Ｙは［Ｆ１−ＣＤＲ１−Ｆ２−ＣＤＲ２−Ｆ３−ＣＤＲ３ Ｆ４］であり、そして
Ｚは［Ｆ５−ＣＤＲ１−Ｆ６−ＣＤＲ２−Ｆ７−ＣＤＲ３ Ｆ８］であり；Ｙのフレーム
ワーク領域（Ｆ１−Ｆ４）は１以上のヒト軽鎖フレームワークに由来し；
Ｚのフレームワーク領域（Ｆ５−Ｆ６）は１以上のヒト軽鎖フレームワークに由来し；
ＹのＣＤＲ（ＣＤＲ１−３）はターゲット抗原に結合可能な１以上のドナーＣＤＲに由来し；
ＺのＣＤＲ（ＣＤＲ４−６）はターゲット抗原に結合可能な１以上のドナーＣＤＲに由来し；そして
Ｌは柔軟なポリペプチドリンカーである
によって表される、項目１４〜１７、１９、２４〜２７のいずれか１項の抗原結合性ポ
リペプチド。
（項目２９）
ＹおよびＺが、本明細書に開示する任意の配列またはそのコンセンサスによって表され
る、項目２８のポリペプチド。
（項目３０）
少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ以上の眼内濃度を達成するように製剤化された、項目２
８〜２９のいずれか１項記載の抗原結合性ポリペプチドを含む、組成物。
（項目３１）
本明細書に開示するような細胞または動物モデル系に基づいて、１００ｎｇ／ｍｌ以上
の眼内濃度を生じる局所投与用に製剤化された、項目３０記載の組成物。
（項目３２）
高濃度で可溶性のままであるように製剤化された、項目３０記載の組成物。
（項目３３）
眼への局所適用用に製剤化され、そして浸透増進剤の非存在下で、角膜を通じて、そし
て眼内空間内に通過することが可能な、項目３０〜３２記載の製剤。
（項目３４）
項目のいずれか１項のポリペプチドを用いて、眼の疾患または障害を治療するか、予
防するかまたは診断するための方法。
（項目３５）
（１）配列番号１、２、３、４、５、６、および７からなる群より選択されるＶＬフレ
ームワークに少なくとも約８５％の類似性を持つ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワ
ーク；ならびに
（２）配列番号８、９、１０および１１を含む群より選択されるＶＨフレームワークに
少なくとも約８５％の類似性を持つ、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワーク
の少なくとも１つを含む抗体。
（項目３６）
配列番号２に少なくとも約８５％の類似性を持つ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワ
ーク、および配列番号８に少なくとも約８５％の類似性を持つ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
フレームワークを含む、項目３５の抗体。
（項目３７）
配列番号４に少なくとも約８５％の類似性を持つ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワ
ーク、および配列番号１０に少なくとも約８５％の類似性を持つ重鎖可変ドメイン（ＶＨ
）フレームワークを含む、項目３５の抗体。
（項目３８）
配列番号７または配列番号８、あるいは配列番号７および配列番号８に、少なくとも約
９５％の配列類似性を含む、項目３５〜３６のいずれか１項記載の抗体。
（項目３９）
抗原に対する親和性が、約１００ｎＭ未満の解離定数ＫＤによって特徴付けられる、請
求項３５〜３８のいずれか１項記載の抗体。
（項目４０）
ヒトＴＮＦαに特異性を有する、項目３５〜３９のいずれか１項記載の抗体。
（項目４１）
化学的に修飾されている、先行する項目のいずれか１項記載の抗体。
（項目４２）
項目３５〜４０のいずれか１項記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチ
ド分子。
（項目４３）
項目４２記載の単離されたポリヌクレオチド分子を含む、クローニングまたは発現ベ
クター。
（項目４４）
項目４３記載の発現ベクターで形質転換された適切な宿主細胞。
（項目４５）
原核細胞または真核細胞、特に大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、酵母、植物、昆虫または哺
乳動物細胞である、項目４３の宿主細胞。
（項目４６）
項目３５〜４１のいずれか１項記載の抗体または抗体誘導体を産生するための方法で
あって、前記抗体分子の合成を可能にする条件下で、項目４４または４５の宿主細胞を
培養し、そして前記培養から前記抗体分子を回収する工程を含む、前記方法。
（項目４７）
薬剤としての、項目３５〜４１のいずれか１項記載の抗体または抗体誘導体。
（項目４８）
項目３５〜４１のいずれか１項記載の抗体を含む、医薬組成物。
（項目４９）
薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤または賦形剤をさらに含む、項目４８の医
薬組成物。
（項目５０）
賦形剤が、塩化ベンザルコニウム、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０
、Ｔｗｅｅｎ８０およびクロルヘキシジンを含む群より選択される、項目４９の医薬組成物。
（項目５１）
局部適用用の、特に局所適用用の組成物である、項目４８〜５０のいずれか１項記載
の医薬組成物。
（項目５２）
抗体が＞２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目４８〜５１のいずれか１項記載の医薬
組成物。
（項目５３）
抗原−抗体相互作用部位への項目３５〜４１のいずれか１項記載の抗体の送達が、密
着結合を含む組織への浸透を必要とする、抗原関連疾患の治療のための方法。
（項目５４）
薬剤としてのまたは診断用の、項目３５〜４１のいずれか１項記載の抗体の使用。
（項目５５）
抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ抗体を同定するための方法であって：
（ｉ）可溶性でそして安定な抗体フレームワークのプールから、抗原に対して特定の結合
特異性を持つ非ヒト抗体のフレームワークに最適にマッチする、可溶性でそして安定なフ
レームワークを選択し、
（ｉｉ）前記の可溶性でそして安定なフレームワークに、前記抗原に特異的に結合するＣ
ＤＲを提供するか、または前記非ヒト抗体のフレームワークを、前記の可溶性でそして安
定なフレームワークの配列へと突然変異させるかのいずれかで、ｓｃＦｖ抗体を生成し、
（ｉｉｉ）生成した抗体を、可溶性および安定性に関して試験し、そして生成した抗体を
、抗原結合に関して試験し、そして
（ｉｖ）安定で、可溶性で、そして抗原に特異的に結合する、ｓｃＦＶを選択する
工程を含む、前記方法。
（項目５６）
工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の間に
−選択した１以上のＣＤＲおよび／またはフレームワークの部位特異的またはランダム突
然変異誘発によって、前記ｓｃＦｖ抗体を突然変異させる
工程をさらに含む、項目５５の方法。
（項目５７）
酵母系において選択を行う、項目５６の方法。
（項目５８）
ＰＢＳ中、３７℃で、少なくとも１ヶ月間、好ましくは少なくとも２ヶ月間安定である
、項目５６〜５７のいずれか１項記載の方法。
（項目５９）
生理学的条件下で単量体のままである、項目５６〜５７のいずれか１項記載の方法。
（項目６０）
抗体が、以下の基準：
ａ）＞１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＰＢＳ中、周囲温度で可溶性である；
ｂ）塩酸グアニジン滴定において、少なくとも１．５Ｍの転移中点を示す；
ｃ）＞１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＰＢＳ中の生理学的条件下で単量体のままである
の１以上を満たす、先行する項目のいずれか１項記載の方法。
（項目６１）
抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であって、該ポリペプチドが、損なわれていない
角膜を通過するのに十分に可溶性であり、そして該組成物が８未満のｐＨを有する、前記
組成物。
（項目６２）
可溶性抗原結合性ポリペプチドを含む組成物であって、該抗原結合性ポリペプチドが、
８時間未満で、損なわれていない角膜の１以上の層を通過する、前記組成物。
（項目６３）
療法で使用するのに適しているように、上皮密着結合を通過するのに十分に可溶性であ
る抗原結合性ポリペプチドであって、可溶性が、標準的Ｃａｃｏ−２上皮細胞単層アッセ
イで測定され、そして／または標準的細胞内１ハイブリッドまたは２ハイブリッド可溶性
アッセイによって予測され、そして／または標準的マウス十二指腸透過性アッセイにおい
て測定される、前記ポリペプチド。
（項目６４）
療法で使用するのに適しているように、標準的ＰＥＧ沈殿アッセイまたは自己相互作用
クロマトグラフィー（ＳＩＣ）アッセイによって予測されるとおりに、上皮密着結合を通
過するのに十分に可溶性である、抗原結合性ポリペプチド。
（項目６５）
眼への局所適用用に製剤化され、そして浸透増進剤の非存在下で、角膜を通じて、そし
て眼内空間内に通過することが可能な、抗原結合性ポリペプチドを含む組成物。

本発明の前述のおよび他の側面、態様、目的、特徴および利点は、付随する図と組み合
わせて、以下の説明からより完全に理解可能である。図面において、類似の参照文字は、
一般的に、多様な図面を通じて、類似の特徴および構造要素を指す。図は、必ずしも縮尺
通りではなく、むしろ、本発明の原理を例示することが重視される。

図１は、再フォールディング工程後の分取用サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過）のＥＳＢＡ１０５（Fig. １Ａ）、ＴＢ−ＷＴ（Fig.１Ｂ）およびルセンティス−ｓｃＦｖ（Fig. １Ｃ）の溶出プロフィールを示す。ｍＡＵ：ミリ吸光単位。 図１は、再フォールディング工程後の分取用サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過）のＥＳＢＡ１０５（Fig. １Ａ）、ＴＢ−ＷＴ（Fig.１Ｂ）およびルセンティス−ｓｃＦｖ（Fig. １Ｃ）の溶出プロフィールを示す。ｍＡＵ：ミリ吸光単位。 図２は、分取用ゲルろ過後のＥＳＢＡ１０５の収集ピーク分画の分析用ゲルろ過の溶出プロフィールを示す。 図３は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中のＥＳＢＡ１０５の溶解度を示す。 図４は、異なる温度および濃度で２週間保存した際の、ＥＳＢＡ１０５およびＱＣ１５．２ ｓｃＦｖ抗体の安定性を示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥによって抗体を分離し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。 図５は、どちらもｐＨ７．４で、３７℃または−８０℃のいずれかで８週間保存した後、Ｌ９２９アッセイによって決定されたＥＳＢＡ１０５の活性を示す。三角形は、３７℃で保存されたＥＳＢＡ１０５を、そして正方形は、−８０℃で保存されたＥＳＢＡ１０５を示す。 図６は、それぞれ、硝子体から、そして前房から液体を除去するシリンジを図式的に示す。１ 硝子体腔液、２ 前眼液、３ 虹彩、４ 角膜、１３ シリンジ。 図７は、４時間後、損なわれていないウサギの眼の前房内へのＥＳＢＡ１０５の浸透を示す。 図８は、４時間後、損なわれていないウサギの眼の硝子体腔へのＥＳＢＡ１０５の浸透を示す。 図９は、Ｃａｃｏ−２細胞層を渡るＥＳＢＡ１０５の浸透を示す。 図１０は、腸薬剤吸収のための非反転嚢モデルにおける、ラット十二指腸を通じた全長ＩｇＧ形式抗体（インフリキシマブ）および一本鎖形式抗体断片（ＥＳＢＡ１０５）の浸透効率の比較を示す。黒い正方形は、ｎＭでのＥＳＢＡ１０５濃度を示し、白い円は、ｎＭでのインフリキシマブ濃度を示す。 図１１ａは、実施例７に記載する研究経過に渡って試料採取したウサギの眼の房水中に見られる、ｎｇ／ｍｌのＥＳＢＡ１０５の量をグラフで示す。

図１１ｂは、実施例７に記載する研究経過に渡って試料採取したウサギの眼の硝子体液
中に見られる、ｎｇ／ｍｌのＥＳＢＡ１０５の量をグラフで示す。
図１１ｃは、実施例７に記載する研究経過に渡って試料採取したウサギの眼の神経網膜中に見られる、ｎｇ／ｍｌのＥＳＢＡ１０５の量をグラフで示す。

図１１ｄは、実施例７に記載する研究経過に渡って試料採取したウサギの眼の血清中に
見られる、ｎｇ／ｍｌのＥＳＢＡ１０５の量をグラフで示す。
図１２は、ウサギの眼におけるＥＳＢＡ１０５の局部ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐＫをグラフで示す。網膜抽出物〜５００ｎｇ／ｍｌ。０６０７２１ ＥＬＩＳＡ（＃０６０７１８ウサギの眼全体由来）、網膜。 図１３は、ウサギの眼における硝子体注射に際してのＥＳＢＡ１０５の局部半減期をグラフで示す。 図１４は、ＥＳＢＡ１０５の投与（５滴／日、１０ｍｇ／ｍｌ ＥＳＢＡ１０５、Ｐ_ｅｆｆ＝２．９ｘ１０^−５）後の、局部薬剤集積のモデリングをグラフで示す。 図１５は、眼のｐＫを図示する。４ 角膜、５ 涙液層、６ 前房、７ レンズ、８ 硝子体、９ 網膜、１０ 強膜。 図１６は、ＥＳＢＡ１０５の吸収および排出経路を図示する。１１ 親水性薬剤、１２ 脂溶性薬剤。 図１７は、適切なｉｎ ｖｉｖｏ急性単関節炎（ラット）モデルにおける用量反応データを示す。ｎ＝３、ＴＮＦα：１０μｇ ｉ．ａ。 図１８Ａは、局所ウサギ眼適用のｉｎ ｖｉｖｏ結果をグラフで示す。各データ点は、２匹のウサギ（４つの眼）の平均に相当し、これらの眼には、１０時間の最大治療期間に渡って、２０分ごとに、ＰＢＳ ｐＨ６．５溶液中の１０ｍｇ／ｍｌ ＥＳＢＡ１０５の１滴（３０ｍｃｌ）を投与した。

瞳孔の最上部に滴を適用し、そして続いてまぶたを圧迫して過剰な液体を取り除いた（
７ｍｃｌ残った）。房水、硝子体、および血清中のＥＳＢＡ１０５濃度をＥＬＩＳＡによ
って決定した。
図１９は、局所ウサギ眼適用のｉｎ ｖｉｖｏ結果をグラフで示す。１０ｍｇ／ｍｌ ＥＳＢＡ１０５溶液１滴を、各動物の両眼の下部眼嚢に、最大６日間に渡って、５回適用した。

試料採取：示した時点（１、３または６日後）に２滴目を適用した後、２匹の動物を屠
殺し、そして両眼ならびに血清を定量的ＥＬＩＳＡ分析に供した。示すように、房水中（
図１９Ａ）、硝子体中（図１９Ｂ）、神経網膜中（図１９Ｃ）、脈絡膜中（図１９Ｄ）、
および血清中（図１９Ｅ）でＥＳＢＡ１０５レベルを決定した。

「Ｃａｒｒ」は、キャリアーを表し、これはＥＳＢＡ１０５を含まない緩衝溶液を意味
する。データバーは、示した区画で測定された最大値、最小値および中央値ＥＳＢＡ１０
５濃度を表し、そしてこれらをそれぞれの標準偏差と一緒に示す。

発明の詳細な説明
明細書および請求項の明らかな理解を提供するため、以下の定義を好適に提供する。
定義
用語「抗体」は、全抗体および任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」
、「抗原結合性ポリペプチド」、または「免疫結合剤」）またはその一本鎖を指す。「抗
体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および
２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合性部分を指す。各重鎖は、重
鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成される。重
鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、
軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。
軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域をさらに、フ
レームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が組み入れられた、相補性決
定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域に細分してもよい。各ＶＨおよびＶＬは、３つ
のＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序で
配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖お
よび軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域
は、免疫系の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一構成要素
（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を仲介しうる。

用語、「抗原結合性」は、抗原に特異的に結合する能力を指す。全長抗体の断片によっ
て、抗体の抗原結合機能を実行可能であることが示されてきている。用語、抗体の「抗原
結合性部分」内に含まれる結合性断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ド
メインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によ
って連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）
ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶ
ＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメインまたはｄＡｂ断
片（Ｗａｒｄら， （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖ
ｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）場合によって合成リンカーによって
連結されてもよい、２以上の単離ＣＤＲの組み合わせが含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２
つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用
いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製
されることを可能にする合成リンカーによって、これらを連結してもよい（一本鎖Ｆｖ（
ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４
２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。当業者に知られる慣
用的技術を用いてこれらの抗体断片を得て、そして損なわれていない抗体と同じ方式で、
有用性に関して断片をスクリーニングする。

本明細書において、「免疫グロブリン」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、または
ＩｇＥなどの免疫グロブリンの任意の認識されるクラスまたはサブクラスを指してもよい
。免疫グロブリンは、ヒト、ネズミ、またはウサギ起源など、任意の種に由来してもよい
。さらに、免疫グロブリンは、ポリクローナル、モノクローナル、または断片であっても
よい。こうした免疫グロブリン断片には、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまた
はＦａｂ断片、あるいは他の抗原認識性免疫グロブリン断片が含まれてもよい。こうした
免疫グロブリン断片は、例えば、タンパク質分解的酵素消化によって、例えば、ペプシン
またはパパイン消化、還元性アルキル化、あるいは組換え技術によって、調製可能である
。こうした免疫グロブリン断片を調製するための材料および方法は、当業者に周知である
（Ｐａｒｈａｍ， （１９８３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １３１：２８９５；
Ｌａｍｏｙｉら， （１９８３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，
５６：２３５； Ｐａｒｈａｍ， （１９８２）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５３：１３３；およびＭａｔｔｈｅｗら， （１９８２）Ｊ． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５０：２３９）。

さらに、免疫グロブリンは、一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）であってもよい。これらは、可
変軽鎖（「ＶＬ」）および可変重鎖（「ＶＨ」）ドメインが、ペプチド架橋によって、ま
たはジスルフィド結合によって連結される、一本鎖Ｆｖ断片（「ｓｃＦｖ」）からなって
もよい。また、免疫グロブリンは、抗原結合活性を所持する、単一ＶＨドメイン（ｄａｂ
）からなってもよい。例えば、Ｇ． ＷｉｎｔｅｒおよびＣ． Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎ
ａｔｕｒｅ， ３４９， ２９５（１９９１）； Ｒ． Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９， １３６２（１９９０）；およびＥ．Ｓ． Ｗａｒｄ
ら， Ｎａｔｕｒｅ ３４１， ５４４（１９８９）を参照されたい。

本明細書において、用語「ポリペプチド」は、２以上の天然アミノ酸または非天然アミ
ノ酸のポリマーを指す。本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子由来の少
なくとも１つのアミノ酸配列を含む。１つの態様において、本発明のポリペプチドは、免
疫グロブリン分子に由来しないアミノ酸配列または１以上の部分を含む。例示的な修飾を
以下により詳細に記載する。例えば、１つの態様において、本発明のポリペプチドは、柔
軟なリンカー配列を含んでもよい。別の態様において、ポリペプチドを修飾して、機能部
分（例えば、ＰＥＧ、薬剤、または標識）を付加してもよい。

本発明の好ましいポリペプチドは、ヒト免疫グロブリン配列に由来するアミノ酸配列を
含む。しかし、ポリペプチドは、別の哺乳動物種由来の１以上のアミノ酸を含んでもよい
。例えば、霊長類重鎖部分、ヒンジ部分、または結合部位が、対象ポリペプチド中に含ま
れてもよい。あるいは、ポリペプチド中に１以上のネズミアミノ酸が存在してもよい。本
発明の好ましいポリペプチドは、免疫原性でない。

一般の当業者には、天然ポリペプチドの所望の活性を保持しつつ、由来した天然存在ま
たは天然ポリペプチドから、アミノ酸が変化するように、本発明のポリペプチドを改変し
てもよいこともまた、理解されるであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基での保存的
置換または変化につながるヌクレオチドまたはアミノ酸置換を作製してもよい。コードさ
れるタンパク質内に、１以上のアミノ酸置換、付加または欠失が導入されるように、免疫
グロブリンのヌクレオチド配列内に、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入
することによって、免疫グロブリン由来のポリペプチド（例えば免疫グロブリン重鎖部分
または軽鎖部分）の非天然変異体をコードする単離核酸分子を生成してもよい。部位特異
的突然変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発などの標準的技術によって、突然変異を
導入してもよい。

本発明のポリペプチドは、１以上の非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を含ん
でもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残
基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該
技術分野において定義されてきており、これらには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば
リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、
グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グル
タミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例
えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオ
ニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、
イソロイシン）、および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン
、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ポリペプチド中の非必須アミ
ノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。別
の態様において、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成
が異なる、構造的に類似の一連のアミノ酸で置換してもよい。あるいは、別の態様におい
て、飽和突然変異誘発によるなど、免疫グロブリンコード配列のすべてまたは一部に渡っ
て、突然変異をランダムに導入して、そして生じた突然変異体を本発明のポリペプチド内
に取り込んで、そして所望のターゲットに結合する能力に関してスクリーニングしてもよ
い。

用語「特異的結合性」、「選択的結合性」、「選択的に結合する」および「特異的に結
合する」は、あらかじめ決定された抗原上のエピトープへの抗体結合を指す。典型的には
、抗体は、およそ１０−６Ｍ未満、例えば、およそ１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、または１０
−９Ｍ未満あるいはそれよりさらに低い数値の親和性（ＫＤ）で結合する。

用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。典型的には、本発
明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術
を用いて決定されるように、およそ１０−６Ｍ未満、例えばおよそ１０−７Ｍ、１０−８
Ｍまたは１０−９Ｍ未満あるいはそれよりさらに低い解離平衡定数（ＫＤ）で、ターゲッ
ト抗原に結合する。

用語「通過動態」または「薬物動態学」は、本明細書において、薬剤吸収、体組織また
は体液中の分布、ならびに代謝および／または排出の動態に関するすべての要因を指す。
ポリペプチドの吸収、分布、生体内変換および排出にはすべて、細胞膜を横断するポリペ
プチドの通過が伴うため、この通過動態には、膜を横断するポリペプチドの輸送を制御す
る、物理化学的要因が伴う。

臨床医が非常に関心を持つのは、ポリペプチドの生物学的利用能である。この用語は、
本明細書において、ポリペプチドがその作用部位に到達するか、またはポリペプチドがそ
の作用部位にアクセスできる生体液に到達する度合いを示す。生物学的利用能に影響を及
ぼす要因には、吸収および代謝または被験体からのポリペプチドの排出の速度が含まれる
。多くの要因が吸収に影響を及ぼし、これらには、ポリペプチドの可溶性および取り込み
機構、ならびに投与部位およびポリペプチドの調合（濃度）および組成などの、膜を横断
する輸送に影響を及ぼす多くの物理化学的要因が含まれる。ポリペプチド投与の多様な経
路は、顕著に異なる吸収特性を有する。これらの経路には、経口摂取、肺吸収、筋内、皮
下、静脈内、動脈内、クモ膜下腔内または腹腔内注射を含む非経口注射、および粘膜、皮
膚または眼への局所適用が含まれる。好ましい態様において、眼の疾患を治療するための
本発明のポリペプチドは、眼の表面に、例えば点眼剤の形で、局所投与される。例えば、
本明細書に開示する細胞または動物に基づく任意の分子を用いて、本発明のポリペプチド
の通過動態を決定してもよく、そしてこれは典型的には、血液脳関門、腸、または眼の密
着結合を横断する臨床的に適切な通過に適するように選択される。

用語「被験体」は、当該技術分野に知られ、そして本明細書において、温血動物、より
好ましくは、ヒトに加えて、ラット、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシ
などの非ヒト動物を含む、哺乳動物を指す。好ましい態様において、被験体はヒトである
。被験体は、本発明の可溶性抗原結合性ポリペプチドでの治療に感受性であるものである
。

「浸透増進剤」または「浸透増進剤」は、本明細書において、上皮結合を横断する通過
を促進する分子または化合物を指す。本発明で使用するための浸透増進剤には、限定され
るわけではないが、アゾン（登録商標）、塩化ベンザルコニウム（ＢｚＣｌ）、ＢＬ−７
、ＢＬ−９、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ９９、ポリオキシエ
チレン−ポリオキシプロピレン１８００、カプリン酸ナトリウム、カプリル酸、塩化セチ
ルピリジニウム、クロルヘキシジン、コール酸塩、ヒマシ油、コーン油、クレモフォア−
ＥＬ、ＤＭＳＯ、臭化デカメトニウム、デオキシコール酸塩、デキストラン硫酸、ＥＤＴ
Ａ、ＥＤＥＴＡＴＥ二ナトリウム、エタノール、フシジン酸塩、グリココール酸塩、ラウ
リル硫酸、Ｌ−α−リソホスファチジロコリン、Ｎ−ラウロイルザルコシン、ＮＭＰ、オ
レイン酸、リン脂質、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、サポニン、Ｔｗｅｅ
ｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロコール酸塩、および
タウロデオキシコール酸塩が含まれる。例えば、いくつかの態様において、浸透増進剤は
カプリン酸ナトリウムである。他の態様において、浸透増進剤は、クロルヘキシジンであ
る。

本発明の第一の側面において、選択した抗原に特異的に結合し、そして改善された組織
浸透能を有するｓｃＦｖ抗体を提供する。前記抗体は、
（ｉ）可溶性でそして安定なフレームワークのプールから、選択した抗原に結合する特異
性を持つ非ヒト抗体のフレームワークに最適にマッチするフレームワークを選択し、
（ｉｉ）前記フレームワークに、前記抗原に結合するＣＤＲを提供するか、または前記非
ヒト抗体のフレームワークを、前記の可溶性でそして安定なフレームワークの配列へと突
然変異させるかのいずれかを行い、
（ｉｉｉ）生成した抗体を、可溶性および安定性に関して試験し、そして
（ｉｖ）生成した抗体を、抗原結合に関して試験する
工程を含む方法によって得られうる点で特徴付けられる。

用語「最適にマッチする」は、一次または三次構造に関して、可能な限り近いことを意
味する。
一般的に、本発明の抗体は、ＶＬおよび／またはＶＨドメインを含むフレームワークを
含み、前記フレームワークは、酵母細胞において、高い細胞内安定性および可溶性に関し
て、抗原非異存性の方法によって、天然ヒト抗体レパートリーの少なくとも一部から選択
される。前記方法はまた、抗体フレームワークの「品質管理」スクリーニングとして知ら
れ、そして高い細胞内安定性および可溶性によって特徴付けられる、特に安定でそして可
溶性である抗体フレームワークの選択を生じている。例えば、抗原特異性に関する、第二
の、酵母に基づくスクリーニング系において、これらのフレームワークを用いてもよい。
この場合、特に安定でそして可溶性である抗体のＣＤＲをランダム化して、そして生じた
抗体を、ありうる最適の抗原認識に関してスクリーニングしてもよい。あるいは、選択し
た抗原に強い結合親和性を持つ抗体の既知の抗体ＣＤＲを、前記の特に安定でそして可溶
性であるフレームワーク上に移植してもよい。場合によって、選択したＣＤＲ（単数また
は複数）および／またはフレームワークを突然変異誘発し、「品質管理系」（ＷＯ０１４
８０１７、Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら ２００４）において、改善されたクローンを選
択することによって、前記抗体をさらに改善してしてもよく、すなわち、１以上の選択し
たＣＤＲおよび／またはフレームワークの部位特異的またはランダム突然変異誘発によっ
て、前記ｓｃＦｖ抗体を突然変異させ、そして同じかまたはよりストリンジェントな条件
下で、安定でそして可溶性である抗体を選択することによって、前記抗体をさらに改善し
てもよい。選択を、酵母品質管理系において、ｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよい。

用語「フレームワーク残基」は、抗原結合性ポリペプチド単位のアミノ酸残基、または
抗原結合性ポリペプチド・モジュールの対応するアミノ酸残基であって、フォールディン
グ・トポロジーに寄与する、すなわち前記単位（またはモジュール）のフォールディング
に寄与するか、または隣接単位（またはモジュール）との相互作用に寄与する、前記アミ
ノ酸残基に関する。こうした寄与は、単位（またはモジュール）中の他の残基との相互作
用であってもよいし、あるいは、α−へリックスまたはβ−シート、または直鎖ポリペプ
チドもしくはループを形成するアミノ酸ストレッチにおいて見られるような、ポリペプチ
ド主鎖コンホメーションに対する影響であってもよい。用語「ターゲット相互作用残基」
は、ターゲット物質との相互作用に寄与する、単位のアミノ酸残基、またはモジュールの
対応するアミノ酸残基を指す。こうした寄与は、ターゲット物質との直接相互作用であっ
てもよいし、あるいは、例えば前記単位（またはモジュール）の（ポリ）ペプチドのコン
ホメーションを安定化して、前記ターゲットと直接相互作用する前記残基の相互作用を可
能にするかまたは増進することによる、他の直接相互作用残基に対する影響であってもよ
い。上に引用する物理化学的方法によって得られる構造的データを分析するか、あるいは
構造生物学および／またはバイオインフォマティクスの実施者に周知の、既知のおよび関
連する構造情報と比較することによって、こうしたフレームワークおよびターゲット相互
作用残基を同定してもよい。こうしたフレームワークはまた、より多様なターゲット相互
作用残基またはＣＤＲを提示するための支持体を提供するため、足場と称されてもよい。

ＣＤＲまたはターゲット相互作用残基を、代替足場のような適切なフレームワーク内に
移植してもよく、当該技術分野に周知のそのようなフレームワークとしては、限定される
わけではないが、ＣＴＬＡ−４、テンダミスタット、フィブロネクチン（ＦＮ３）、ネオ
カルジノスタチン、ＣＢＭ４−２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（
プロテインＺ）、Ｉｍ９、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、設計ＴＰ
Ｒタンパク質、ジンクフィンガー、ｐＶＩＩＩ、鳥類膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４，ＷＷ
ドメイン、Ｓｒｃ相同性ドメイン３（ＳＨ３）、Ｓｒｃ相同性ドメイン２（ＳＨ２）、Ｐ
ＤＺドメイン、ＴＥＭ−１ β−ラクタマーゼ、ＧＦＰ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌ
クレアーゼ、ＰＨＤ−フィンガー、ＣＩ−２、ＢＰＴ１ ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチ
ン、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒、昆虫ディフェンシンＡペプチ
ド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、チトクロムｂ_５６２、Ｌｄ１受容
体ドメインＡ、γ−クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒ
ｉｎｇ）、およびＣ型レクチン様ドメインが挙げられ（Ｂｉｎｚら（２００５ Ｏｃｔ）
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（１０）：１２５７−６８を参照されたい）、あるいは免
疫グロブリン由来抗原結合性ポリペプチドの適切なフレームワーク内に移植してもよく、
当該技術分野に周知のそのようなフレームワークとしては、限定されるわけではないが、
ＶｈＨドメイン、Ｖ−ＮＡＲドメイン、Ｖｈドメイン、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃ
Ｆｖ、Ｃａｍｅｌ ＩＧ、ＩｆＮＡＲ、ＩｇＧ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディ、ディ
アボディ、トリアボディ、およびテトラボディが挙げられる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．
およびＨｕｄｓｏｎ， Ｐ．（２００５）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３
（９）， ｐｐ．１１２６−１１３６を参照されたい）。

好ましくは、本発明の抗体は、以下のさらなる特徴の１以上を有する：
−酵母相互作用アッセイにおいて測定した際、還元条件下で安定であり、該アッセイにお
いて、前記ｓｃＦｖに融合した選択可能マーカータンパク質の活性は、細胞内環境におけ
る前記ｓｃＦｖの高い安定性および可溶性と相関する。前記酵母相互作用アッセイ、いわ
ゆる「品質管理」は、詳細に記載された（Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら（２００１）；
Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２００４；該参考文献はその全体が本明細書に援用される
）。
−ＰＢＳ中、２０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で、少なくとも１ヶ月間、好ましくは少
なくとも２ヶ月間、最も好ましくは少なくとも６ヶ月間安定である。
−生理学的条件下で、単量体のままである。
−＞約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは＞約４ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは＞約１０ｍｇ／ｍｌ
、さらにより好ましくは＞約２５ｍｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは＞約５０ｍｇ／ｍｌ
の濃度で、ＰＢＳ中、周囲温度で可溶性である。
−塩酸グアニジン滴定において、少なくとも１．５Ｍ、好ましくは少なくとも１．７５Ｍ
、より好ましくは少なくとも１．９Ｍ、最も好ましくは少なくとも２Ｍの転移中点を示し
、すなわち変性に耐性である。

用語、抗体は、本発明の範囲内で使用した際、選択した抗原に結合するｓｃＦｖ抗体ま
たは抗体断片を指す。したがって、本発明のｓｃＦｖ抗体は、短いリンカーペプチド、例
えば、配列ＧＧＧＧＳの１〜４反復を含むリンカー、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）_４ペプチ
ド（配列番号１６）、より好ましくは配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳ（
配列番号１７）、またはＡｌｆｔｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８：
７２５−７３１に開示されるようなリンカーによって連結されたＶＬおよびＶＨドメイン
を含む全長ｓｃＦｖ、あるいは選択した抗原に対する十分な結合能を有する、単純なＶＬ
またはＶＨドメインのいずれかであってもよい。ＶＬおよびＶＨの連結は、どちらの方向
であってもよく、ＶＬ−リンカ−ＶＨまたはＶＨ−リンカー−ＶＬであってもよい。

１つの側面において、本発明は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、少なくとも１
ヶ月間、好ましくは少なくとも２ヶ月間安定である抗体を提供する。好ましくは、前記抗
体を、生理学的温度、すなわち３７℃での安定性に関して試験する。別の好ましい態様に
おいて、前記抗体は、ＰＢＳ中、４℃で維持した際、または凍結乾燥後、室温で、少なく
とも６ヶ月間安定である。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後、クー
マシー染色または銀染色などの標準的染色法によって、前記抗体の標準量を分析し、そし
て全長バンドの染色強度と標準タンパク質のものとを比較することによって、安定性を試
験してもよい。さらに、分解産物が存在しないことをチェックする。分解タンパク質はス
メアとして泳動されるか、または分解産物が短いために見えないことさえあり、この場合
は、全長タンパク質バンドの強度の喪失のみが分解を示す。一般的に、色および／または
清澄度の視覚的検査に際して、あるいはＵＶ光散乱によってまたはサイズ排除クロマトグ
ラフィーによって、凝集、沈降および／または変性の徴候がまったく観察されなければ、
抗体が物理的に安定であると仮定可能である。

特定の時間、保存した後の活性に関する安定性は、本発明の抗体のさらなる重要な特徴
である。例えばＥＬＩＳＡを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏターゲット結合アッセイ、または抗
体の阻害強度を測定するｉｎ ｖｉｖｏ細胞内活性アッセイによって、保存前および保存
後の抗体の強度を比較して、こうした安定性を決定してもよい。

別の側面において、本発明は、例えばゲルろ過によって判断可能であるように、生理学
的条件下で単量体であり、そして単量体のままである、抗体を提供する。単量体状態は、
上皮関門に浸透することが可能な抗体の重要な特徴である。

さらなる側面において、本発明は、約１ｍｇ／ｍｌより高い、好ましくは約４ｍｇ／ｍ
ｌより高い、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＰＢＳ中、周囲温度で可溶性で
ある抗体を提供する。ＰＥＧ３０００を用いたＰＥＧ沈殿によって、または自己相互作用
クロマトグラフィー（ＳＩＣ）によって、精製抗体の可溶性を決定してもよい。

さらに別の側面において、本発明は、塩酸グアニジン滴定において、少なくとも約１．
５Ｍ、好ましくは少なくとも約１．７５Ｍ、より好ましくは少なくとも約１．９Ｍ、最も
好ましくは少なくとも約２Ｍの転移中点を示す抗体を提供する。これは、アンフォールデ
ィングに対する抵抗性という意味での安定性に関する測定値であり、これによって、塩酸
グアニジンの添加によって誘導されるアンフォールディング／変性を、蛍光または円二色
分光によって追跡する。

本発明のさらなる側面において、前述の生物物理的特性の１以上を有する抗体は、配列
番号１（カッパ１型）、配列番号２（カッパ１型）、配列番号３（カッパ３型）または配
列番号４（ラムダ１型）、配列番号５（カッパ３型）、配列番号６（ラムダ３型）、また
は配列番号７（ラムダ３型）を含む群より選択されるＶＬフレームワークに、少なくとも
８５％の類似性、好ましくは少なくとも約９５％の類似性、最も好ましくは少なくとも約
９８％の同一性を持つ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク、および／または配列
番号８（Ｈ３型）、配列番号９（Ｈ３型）、配列番号１０（Ｈ１ｂ型）、または配列番号
１１（Ｈ３型）を含む群より選択されるＶＨフレームワークに、少なくとも８５％の類似
性、好ましくは少なくとも約９５％の類似性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一
性を持つ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のフレームワークによって構造的に性質決定される。
好ましい態様において、配列番号２のＶＬ相同体および配列番号８のＶＨ相同体の間の組
み合わせ、配列番号４のＶＬ相同体および配列番号１０のＶＨ相同体の間の組み合わせ、
または上述のＶＬ配列の相同体のいずれか１つおよび配列番号９のＶＨ相同体の間の組み
合わせを用いる。より好ましいのは、配列番号７に＞９０％の類似性を持つ抗体であり、
そしてさらにより好ましいのは、＞９５％の類似性を持つ抗体である。最も好ましいのは
、配列番号７および／または配列番号８の配列の抗体である。本発明は、ターゲット結合
特異性が維持される限り、開示するＶＨ配列の任意の１つと組み合わされた、開示するＶ
Ｌ配列の任意の１つを含むことも理解される。

２つの配列間の類似性パーセントは、タンパク質配列が関連する度合いの測定値である
。２つの配列間の類似性の度合いは、配列同一性パーセントおよび／または保存に基づい
ていてもよい。保存は、元来の残基の物理化学特性を保持する、アミノ酸配列の特定の位
での変化を指す。典型的には、配列並列によって、配列間の類似性を決定する。

インターネットにおいてアクセス可能なＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａ
ｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌｓ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．
， Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ． ＆ Ｌｉ
ｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓ
ｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０を参
照されたい）を用いることによって、本明細書で称される類似性が決定されるものとする
。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を
実行して、本発明のタンパク質分子に類似のアミノ酸配列を得てもよい。比較目的のため
のギャップを挿入した並列を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるようなギャッ
プ化ＢＬＡＳＴを利用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを
利用する際、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォ
ルトパラメーターを用いてもよい。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列を最
適に並列させるために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮
に入れた、配列によって共有される同一位の数の関数である。当業者に周知の数学的アル
ゴリズムを用いて、配列比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定を達成しても
よい。

ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または
８０のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用い、ＧＣＧソ
フトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて、２つのヌクレオチド配列間の同一
性パーセントを決定してもよい。また、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナ
ルティおよび４のギャップペナルティを用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０
）に組み入れられている、Ｅ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ
， ４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて、２つのヌクレオチドまたは
アミノ酸配列間の同一性パーセントを決定してもよい。さらに、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マ
トリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１
０、８、６、または４のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を
用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み入れられている、Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４
５３（１９７０））アルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを
決定してもよい。

別の側面において、本発明の抗体を化学的に修飾する。化学的修飾は、安定性、可溶性
、抗原結合特性または親和性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、細胞傷害性、および組織浸透能な
どの、抗体の特性を変化させうる。化学的修飾は、当業者に周知である。本発明の抗体の
好ましい化学的修飾はＰＥＧ化である。

別の好ましい側面において、本発明の抗体の親和性は、約１００ｎＭ未満、好ましくは
約１０ｎＭ未満、そして最も好ましくは約１ｎＭ未満の解離定数Ｋｄによって特徴付けら
れる。表面プラズモン共鳴（ＢｉａＣｏｒｅ）またはＥＬＩＳＡによって抗体の同族抗原
への親和性などの結合パラメーターを決定する。これらの方法は当該技術分野に周知であ
る。

好ましくは、本発明の抗体が結合する抗原は、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）であ
る。ＴＮＦαはカケクチンとしても知られ、内毒素または他の刺激に反応して、単球およ
びマクロファージを含む、多くの細胞種によって産生される、天然存在哺乳動物サイトカ
インである。ＴＮＦαは、炎症、免疫学的、および病理生理学的反応の主な仲介因子であ
る（Ｇｒｅｌｌ， Ｍ．ら（１９９５）Ｃｅｌｌ， ８３：７９３−８０２）。多数の障
害が、ＴＮＦαレベルの上昇と関連しており、これらの多くは医学的に有意に重要である
。ＴＮＦαは、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸障
害、敗血症、鬱血性心不全、気管支ぜんそく、ならびに多発性硬化症などの慢性疾患を含
む、多くのヒト疾患において上方制御されることが示されてきている。ＴＮＦαはまた、
炎症促進性サイトカインとも称される。しかし、ＴＮＦαは、眼の疾患、例えば黄斑変性
症、ブドウ膜炎、緑内障、白内障、網膜炎、ドライアイ症候群、強膜炎、結膜炎、および
角膜炎などの、局部徴候を持つ障害にもまた関与する。本発明の抗体は、局部および局所
に、例えば点眼剤によって眼の疾患用に適用可能であるため、こうした疾患の治療に特に
適している。

本発明はまた、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列、ならびに前記ＤＮＡ配列を含有
するクローニングまたは発現ベクターも提供する。さらに、前記ＤＮＡ配列で形質転換さ
れた適切な宿主細胞を提供する。これは、原核または真核細胞、特に大腸菌（Ｅ． ｃｏ
ｌｉ）、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞であってもよい。

組換え遺伝学の分野でルーチンの技術を用いて、本発明の抗体を生成してもよい。ポリ
ペプチドの配列がわかっている場合、遺伝子合成によって、該ポリペプチドをコードする
ＤＮＡを生成してもよい。

さらに、本発明の抗体を産生するための方法であって、前記抗体をコードするＤＮＡで
形質転換された宿主細胞を、前記抗体の合成を可能にする条件下で培養し、そして前記培
養から前記分子を回収する工程を含む、前記方法を提供する。好ましくは、前記方法は、
大腸菌封入体から、または用いたｓｃＦｖ構築物が、ポリペプチドを周辺質に向けるシグ
ナル配列を含む場合は、大腸菌周辺質から精製されたｓｃＦｖ抗体を提供する。

本発明の別の側面は、診断、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のためのツールとしての
、および／または薬剤としての、本発明が提供する抗体の使用である。この使用は、任意
のＴＮＦα関連の病態に関係して特に好ましい。抗ＴＮＦα ｓｃＦｖまたはその断片で
治療すべき疾患は、好ましくは、ＴＮＦαの過剰発現に関連する疾患である。ＴＮＦαの
過剰発現が、異常な細胞機能につながるならば、過剰なＴＮＦαに結合し、そしてしたが
ってこれを中和可能な抗体は、前記抗体がＴＮＦα過剰の場所に到達可能であるならば、
こうした疾患を治療するために理想的な薬剤である。この場所が細胞内部であるならば、
抗体は、細胞に進入可能でなければならない。この場所が細胞外であるならば、抗体は、
組織中の細胞外マトリックスに到達可能でなければならず、すなわち、抗体は、通常、上
皮細胞層である、組織の少なくとも一番外側の細胞層を横断しなければならない。本発明
の別の態様において、抗体は、内皮に浸透可能である。

ＩＶ．医薬組成物および薬剤投与
Ａ．組成および投与
大部分の場合、本発明の抗体は、医薬組成物中で用いられ、前記医薬組成物は、少なく
とも１つのさらなる化合物を含む。好ましくは、これは、薬学的に許容されうるキャリア
ー、希釈剤または賦形剤と組み合わせられるであろう。賦形剤は、アゾン（登録商標）、
塩化ベンザルコニウム（ＢｚＣｌ）、ＢＬ−７、ＢＬ−９、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ７８
、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ９９、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００、
カプリン酸ナトリウム、カプリル酸、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、コー
ル酸塩、ヒマシ油、コーン油、クレモフォア−ＥＬ、ＤＭＳＯ、臭化デカメトニウム、デ
オキシコール酸塩、デキストラン硫酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＥＴＡＴＥ二ナトリウム、エタノ
ール、フシジン酸塩、グリココール酸塩、ラウリル硫酸、Ｌ−α−リソホスファチジロコ
リン、Ｎ−ラウロイルザルコシン、ＮＭＰ、オレイン酸、リン脂質、ポリオキシエチレン
−９−ラウリルエーテル、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０
、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、密着結合開放ペプチ
ドおよびペプチド誘導体、密着結合開放タンパク質およびタンパク質誘導体を含む群より
選択されてもよい。好ましくは、賦形剤は、塩化ベンザルコニウム、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ
ｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、およびクロルヘキシジンを含む群より
選択される。カプリン酸塩もまた使用可能である。こうした物質は、浸透増進剤として作
用しうる。

大部分の場合、本発明の抗体を含む医薬組成物は、全身性ではなく、局部適用されるで
あろう。本発明の抗体は、そのｓｃＦｖ形式が小型であり、そしてフレームワークが上皮
組織関門に浸透可能な物理化学特性を有するため、局部適用に特に適している。局部適用
は、眼、鼻腔、口腔、腸管、皮膚、口腔および尿生殖器の粘膜、関節および関節腔、脳、
脊髄などの比較的限定された領域中の適用であり、この場合、十分に濃縮された抗体の比
較的少量の適用が有効である。他方、局所適用は、体部分の表面への適用である。

本発明の医薬組成物の投与の好ましい型は、局所適用による；しかし、例えば、抗体を
肺上皮に浸透させる予定であるならば、他の型は、吸入による。吸入器またはネブライザ
ー、およびエアロゾル化剤を含む製剤を用いて、肺送達を達成してもよい。

局所適用のため、好ましい部位は眼である。本発明の抗体は、主に３つの組織層、すな
わち、上皮、角膜実質および内皮からなる、角膜に浸透するのに特に適している。したが
って、眼の多くの疾患の治療に、該抗体を用いてもよい。

Ｂ．薬剤送達系
本発明における使用のための局所眼性薬剤送達系の限定されない例には、浸透増進剤、
角膜コラーゲンシールド、眼性イオントフォレーシス、マイクロ粒子またはナノ粒子、眼
性挿入物、粘膜接着性ポリマー、ｉｎ ｓｉｔｕゲル化系、デンドリマー、脂質エマルジ
ョン、および眼性挿入物が含まれる（Ｓｕｌｔａｎａら（２００７）Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｒ
ｕｇｓ， ２（２）， ３０９−３２３（２００７）ｉを参照されたい）。

ｉ．浸透増進剤
本発明の医薬組成物には、浸透増進剤が含まれてもよい。浸透増進剤の例は当該技術分
野に周知であり、そしてこれには、アゾン（登録商標）、塩化ベンザルコニウム（ＢｚＣ
ｌ）、ＢＬ−７、ＢＬ−９、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ９９
、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００、カプリン酸ナトリウム、カプリ
ル酸、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、コール酸塩、ヒマシ油、コーン油、
クレモフォア−ＥＬ、シクロデキストリン、ＤＭＳＯ、臭化デカメトニウム、デオキシコ
ール酸塩、デキストラン硫酸、ＥＤＴＡ、ＥＤＥＴＡＴＥ二ナトリウム、エタノール、フ
シジン酸塩、グリココール酸塩、ラウリル硫酸、Ｌ−α−リソホスファチジロコリン、メ
タゾールアミド、Ｎ−ラウロイルザルコシン、ＮＭＰ、オレイン酸、Ｐｚ−ペプチド、リ
ン脂質、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗ
ｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロコール酸塩、およびタウロデオキ
シコール酸塩が含まれてもよい（Ｓｕｌｔａｎａら（２００７）Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｒｕｇ
ｓ， ２（２）， ３０９−３２３（２００７）を参照されたい）。別の態様において、
浸透増進剤は、カプリン酸ナトリウムである。さらに別の態様において、浸透増進剤には
、コロイド系、ポリアクリレートおよび生体接着性ポリマーが含まれる。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ
． ６０／＿＿＿，＿＿＿（２００７年７月１０日出願の「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｅｎｅ
ｔｒａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題される代理人整理番号第ＥＳ５−０１６−
１号）もまた参照されたい。

ｉｉ．角膜コラーゲンシールド
本発明の抗体はまた、角膜コラーゲンシールドを用いても投与可能である。いくつかの
態様において、１２、２４および７２時間の溶解時間のコラーゲンシールドを用いてもよ
い。他の態様において、コラーゲンシールドを、ガチフロキサシンおよび／またはモキシ
フロキサシンの溶液中にあらかじめ浸しておく。

ｉｉｉ．眼性イオントフォレーシス
本発明の抗体はまた、眼性イオントフォレーシスによっても送達可能である。１つの態
様において、経角膜イオントフォレーシスによって、眼の前部に抗体を送達してもよい。
別の態様において、高くそして持続される濃度の本発明の抗体を、経強膜イオントフォレ
ーシスによって、硝子体および網膜に送達してもよい。所望の期間、イオントフォレーシ
スを適用する。いくつかの態様において、約１〜約４分間、イオントフォレーシスを適用
する。他の態様において、１分間未満、イオントフォレーシスを適用する。別の態様にお
いて、４分間より長く、イオントフォレーシスを適用する。

ｉｖ．マイクロ粒子およびナノ粒子
本発明の抗体はまた、マイクロ粒子またはナノ粒子送達系を用いても送達可能である。
いくつかの態様において、マイクロ粒子はマイクロカプセルである。他の態様において、
マイクロ粒子はマイクロスフェアである。さらなる態様において、マイクロ粒子は、浸食
性、生体分解性、非浸食性、またはイオン交換樹脂である、ポリマーを含む。別の態様に
おいて、マイクロ粒子送達系は、ベタキソロール０．２５％を含有するＢｅｔｏｐｔｉｃ
Ｓ（登録商標）である。

１μｍより小さい粒子であるナノ粒子もまた使用可能である。１つの態様において、ナ
ノ粒子はナノカプセルである。別の態様において、ナノ粒子はナノスフェアである。１つ
の態様において、ナノ粒子は、ポリアクリルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）を含む。別
の態様において、ナノ粒子は、ポリ−ａ−カプロラクトンを含む。特定の態様において、
ナノ粒子は、リン酸ヘキサデシルとともに、２．５％トブラマイシンを含有する固形脂質
ナノ粒子を含む。別の態様において、ナノ粒子は、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＲＳ １００また
はＥｕｄｒａｇｉｔ ＲＬ １００を含み、そして場合によってクロリクロメンをさらに
含む。さらなる態様において、ナノ粒子には、フルルビプロフェン（ＦＢ）装填アクリレ
ートポリマー・ナノ懸濁物が含まれる。

ｖ．眼性挿入物
本発明の抗体はまた、眼性挿入物を用いても投与可能である。いくつかの態様において
、眼性挿入物は、不溶性、可溶性または生体浸食性挿入物である。不溶性挿入物には、分
散系、浸透系および親水性コンタクトレンズが含まれる。可溶性挿入物は、天然、合成、
または半合成ポリマーで構成されてもよい。生体浸食性挿入物は、生体浸食性ポリマーで
構成されてもよい。

ｖｉ．粘膜接着性ポリマー
本発明の医薬組成物には、粘膜接着性ポリマーが含まれてもよい。粘膜接着性ポリマー
の例は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、キトサン（ＣＳ）、Ｃｈ−ＨＣＬ
およびＮ−カルボキシメチルキトサン（ＣＭＣｈ）、Ｎ−トリメチルキトサン（ＴＭＣ）
ポリマー、ピロカルピン装填ＣＳ／Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、ポリアクリル酸（Ｐ
ＡＡ）、多糖、キシログルカン、タマリンド種子多糖（ＴＳＰ）、およびチオール化ポリ
マーまたはチオマーが含まれる。

ｖｉｉ． ｉｎ ｓｉｔｕゲル化系
本発明の医薬組成物には、ｉｎ ｓｉｔｕゲル化系が含まれてもよい。ｉｎ ｓｉｔｕ
ゲル化系の例は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ｐＨ仲介性ｉｎ ｓｉｔ
ｕゲル化系、温度仲介性ｉｎ ｓｉｔｕゲル化系およびイオン仲介性ｉｎ ｓｉｔｕゲル
化系が含まれる。ｐＨ仲介性ｉｎ ｓｉｔｕゲル化系には、例えば、酢酸フタル酸セルロ
ース（ＣＡＰ）およびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）などのポリマーが含まれてもよい。
温度仲介性ｉｎ ｓｉｔｕゲル化系には、例えば、プルロニクス、テトラオニクスおよび
エチルヒドロキシエチルセルロースが含まれてもよい。ｉｎ ｓｉｔｕゲル化系にはまた
、Ｇｅｌｒｉｔｅ（登録商標）（脱アセチル化ジェランガム（ＤＣＧ））、アルギネート
、例えばアルギネート−ポリ（Ｌ−リジン）、マレイン酸チモロール点眼剤、例えばＴｉ
ｍｏｐｔｏｌ ＸＥおよびＬｉｚｍｏｎ ＴＧ（登録商標）、およびその組み合わせが含
まれてもよい。

ｖｉｉｉ．デンドリマー
本発明の医薬組成物には、デンドリマーが含まれてもよい。デンドリマーの例は当該技
術分野に周知であり、そしてこれにはＴＭポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）が含まれる。

Ｃ．製剤
別の態様において、製剤は、当業者に知られるような、遅延、延長、または時間放出製
剤、マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソームなどのキャリアー製剤であっても
よい。上述の送達系はいずれも、局所、眼内、結膜下に、または移植によって投与されて
、長期にわたる剤の持続放出を生じることも可能である。製剤は、ポリカプロラクトン、
ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ無水物、ポリラクチド−コ−グリコリド、ポリアミノ
酸、ポリエチレンオキシド、アクリル末端ポリエチレンオキシド、ポリアミド、ポリエチ
レン、ポリアクリロニトリル、ポリホスファゼン、ポリ（オルトエステル）、スクロース
アセテートイソブチレート（ＳＡＩＢ）などの生体適合性ポリマー、および各々、その全
体が本明細書に明確に援用される、米国特許第６，６６７，３７１号；第６，６１３，３
５５号；第６，５９６，２９６号；第６，４１３，５３６号；第５，９６８，５４３号；
第４，０７９，０３８号；第４，０９３，７０９号；第４，１３１，６４８号；第４，１
３８，３４４号；第４，１８０，６４６号；第４，３０４，７６７号；第４，９４６，９
３１号に開示されるものなどの他のポリマーの、マイクロもしくはマクロカプセル、また
はマトリックス、あるいはマイクロスフェアまたはリポソームとして製剤化されてもよい
脂質などのビヒクルの形であってもよい。微視的または巨視的製剤を、局所的にまたは針
を通じて投与してもよいし、あるいは移植してもよい。ビヒクルの多様な配合を通じて、
遅延または延長放出特性を提供してもよい（被覆または非被覆マイクロスフェア、被覆ま
たは非被覆カプセル、脂質またはポリマー構成要素、単層または多層構造、および上記の
組み合わせ等）。マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソームなど、およびその眼
性移植物の製剤および装填が当業者に知られ、例えば、Ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎａｌ Ｓ
ｕｒｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｙｍａｎら監修（Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎ
ｉｔｚ， Ｌｏｎｄｏｎ ２００１， 第４５章）； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ， Ｗｉｓｅ監修（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２０００）に
開示される、サイトメガロウイルス網膜炎を治療するためのガンシクロビル持続放出移植
物の使用があり、該文献の関連セクションは、その全体が本明細書に援用される。例えば
、硝子体腔への移植のため毛様体扁平部を通じて、持続放出眼内移植物を挿入してもよい
。眼内注射は硝子体内（硝子体内）、または結膜の下（結膜下）、または眼の後ろ（眼球
後）、またはテノン嚢の下（テノン嚢下）であってもよく、そしてデポ型であってもよい
。レンズ材料内に組成物が取り込まれた（例えば製造時に、またはレンズ溶液中に含有さ
せて）眼の外表面に適用したコンタクトレンズを介して組成物を投与してもよい。眼に移
植された眼内レンズ（ＩＯＬ）を介して組成物を投与してもよい。移植可能レンズには、
限定されるわけではないが、Ｂａｕｓｃｈ ａｎｄ Ｌｏｍｂ（ニューヨーク州ロチェス
ター）、Ａｌｃｏｎ（テキサス州フォートワース）、Ａｌｌｅｒｇａｎ（カリフォルニア
州アービン）、およびＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ（カリフォルニ
ア州サンタアナ）によって製造されたものを含む、白内障手術後、患者の罹患水晶体の代
わりに用いられる、いかなるＩＯＬも含まれる。Ｄｅｇｉｍ， Ｉ．ＴおよびＣｅｌｅｂ
ｉ， Ｎ．（２００７）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉ
ｇｎ， １３， ９９−１１７］もまた参照されたい。レンズを水晶体嚢内に移植すると
、組成物が、所望の効果を眼に提供する。移植物（レンズおよび他のタイプ）およびコン
タクトレンズ投与に適した濃度は、当業者に認識されるであろうように、多様でありうる
。例えば、移植物を多量の剤とともに装填するが、上記範囲内の必要な濃度が持続的に放
出されるように製剤化するかまたは制御してもよい（例えば遅延放出製剤）。

ｓｃＦｖでは、抗体濃度は通常、最大１ｍｇ／ｍｌの範囲で達成されるが、これはさら
なる浸透増進剤を添加しなければ、上皮浸透にそれほど有効ではないことが見出されてい
る（ＷＯ００４０２６２）。本発明は非常に可溶性である抗体を提供するため、対応する
抗原関連疾患の有効な治療において、より高い濃度、すなわち約２ｍｇ／ｍｌより高い、
好ましくは約５ｍｇ／ｍｌより高い、最も好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で、
前記抗体を含む医薬組成物を調製し、そして用いることも可能である。

したがって、本発明は、抗原関連疾患の治療法であって、抗原−抗体相互作用部位への
抗体の送達が、密着結合を含む組織、特に上皮および／または内皮への浸透を必要とする
、前記方法を提供する。上皮は、細胞層で構成される組織であり、そして生物の外部（皮
膚）および内部（例えば腸）の両方を裏打ちする。上皮にはまた、口腔および体腔の内側
を裏打ちする粘膜も含まれ、そして上皮は、死んだ扁平上皮細胞、ならびに肺、胃腸管、
および生殖器官および尿路の内側を裏打ちする上皮細胞を含む。内皮は、薄く扁平な細胞
の層であり、これら細胞が、血管および臓器の内部表面を裏打ちする。血管系において、
内皮は管腔中を循環する血液および血管壁の残りの間の界面を形成する。内皮細胞は、心
臓から最小の毛細管まで、全循環系を裏打ちする。小さい血管および毛細管では、内皮細
胞は、しばしば、存在する唯一の細胞種である。内皮細胞はまた、血流内へのそして外へ
の物質の通過も制御する。いくつかの臓器には、特殊化された「ろ過」機能を実行する、
非常に分化した内皮細胞が存在する。こうしたユニークな内皮構造の例には、腎糸球体お
よび血液脳関門が含まれる。内皮組織は、上皮組織の特殊化されたタイプである。

本発明の好ましい態様において、角膜への浸透が達成可能である。角膜上皮は、角膜正
面を覆い、そしていくつかの細胞層からなり、このために、抗体による浸透がさらになお
困難となる。本発明の抗体は、好ましくは、角膜全体に浸透可能である。

ブドウ膜炎の治療に理想的な薬剤は、４つの重大な特性を含まなければならない：１）
急性症状に対して、迅速な効果発現を提供し、２）標準的局所コルチコステロイドと比較
した際、匹敵する効能を示し、３）標準的局所コルチコステロイドと比較した際、優れた
安全性プロフィールを示し、４）標準的コルチコステロイドまたは標準的モノクローナル
抗体と比較した際、角膜への局所適用、ならびに硝子体内注射を可能にする、好ましい薬
物動態学的特性を有する。

適切な薬物動態学的特性を含む、ＴＮＦαの局部適用阻害剤は、これらの側面すべてに
取り組むことも可能である。抗ＴＮＦα ｓｃＦｖ抗体ＥＳＢＡ１０５は、眼の前部に優
れた浸透を示し、ＴＮＦα中和活性が高いことと合わせて、最終的に、前部ブドウ膜炎に
対する療法的効能に非常によく適した眼内濃度を達成する。罹患した眼で見られるＴＮＦ
αレベルが１５ｐｇ／ｍｌであり、そしてＥＳＢＡ１０５濃度が眼の前部に関しては最大
４０，０００ｎｇ／ｍｌ（図７を参照されたい）であり、そして硝子体部分に関しては最
大１２５ｎｇ／ｍｌ（図８を参照されたい）であることを考慮すると、ＥＳＢＡ１０５は
、前部ブドウ膜炎の治療に適しているだけでなく、例えば眼性ベーチェット病などの、異
なる型の汎ブドウ膜炎の治療にも適していると結論づけられる。したがって、本発明は、
眼への局所適用による、眼性障害の治療、特に任意の型のブドウ膜炎、ベーチェット病、
網膜炎、ドライアイ症候群、緑内障、シェーグレン症候群、糖尿病（糖尿病性ニューロパ
シーを含む）、強膜炎、結膜炎および角膜炎の治療のための抗体を提供する。投与は、好
ましくは、点眼剤、眼の軟膏によって、またはコンタクトレンズなどのデポ・デバイスか
ら起こる。

本発明の別の好ましい態様において、抗体は腸上皮に浸透しなければならない。
肺における治療の場合、吸入を用いて、抗体を運び、肺上皮に本発明の抗体を適用しな
ければならない。

本発明のさらに別の側面において、抗体は診断ツールとして用いられる。
本発明の配列は、以下の通りである：

例示
実施例全体で、別に記載しない限り、以下の材料および方法を用いる。
材料および方法
一般的に、本発明の実施は、別に示さない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術
、免疫学（特に、例えば免疫グロブリン技術）および畜産の慣用的な技術を使用する。例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）； Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， ５１０
， Ｐａｕｌ， Ｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）； Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ， １６９）， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ監修， Ｉ
ｒｌ Ｐｒ（１９９６）； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ， Ｈａｒｌｏｗら， Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｐｒｅｓｓ， Ｐｕｂ．（１９９９
）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２）を参
照されたい。

実施例１： ｓｃＦｖの産生
封入体として発現させ、その後、再フォールディングおよびクロマトグラフィー工程を
行って、ｓｃＦｖ抗体を産生した。３つの一本鎖抗体を産生した。これには、非常に可溶
性であり、特に安定でそして単量体であるという基準をおそらく満たさない、２つの慣用
的ｓｃＦｖが含まれる。このうち一方は、ＴＢ−ｗｔ（配列番号１４）であり、ネズミ抗
ＴＮＦαモノクローナル抗体Ｄｉ６２（Ｄｏｒｉｎｇら、１９９４）の天然ＶＬおよびＶ
Ｈ配列を連結することによって構築された。もう一方のものは、ルセンティス−ｓｃＦｖ
であり、ＶＥＧＦ特異的Ｆａｂ断片ラニビズマブのＶＬおよびＶＨ配列を連結することに
よって構築された（配列番号１５）。ＥＳＢＡ１０５は、Ｄｉ６２のＣＤＲを所持し、そ
してＴＮＦαに対して、ナノモル範囲のＫｄ値を示す、ｓｃＦｖである。いわゆる品質管
理系（Ａｕｆ ｄｅｒ Ｍａｕｒら、２００４）によって選択したｓｃＦｖフレームワー
クを使用することによって、ＥＳＢＡ１０５の可溶性、安定性、および単量体性の振る舞
いを最適化した。ＥＳＢＡ１０５のアミノ酸配列を配列番号１３に開示する。

図１は、再フォールディング工程に続く、分取用ゲルろ過のＥＳＢＡ１０５（Ａ）、Ｔ
Ｂ−ｗｔ（Ｂ）およびルセンティス−ｓｃＦｖ（Ｃ）の溶出プロフィールを示す。ＥＳＢ
Ａ１０５のプロフィールは、主に、３００ｍＡＵ（吸収に関する相対的単位）に達する、
１つの鋭いピークからなる一方、ＴＢ−ｗｔおよびルセンティス−ｓｃＦｖのプロフィー
ルでは、それぞれ１６および５５ｍＡＵが最高値の、いくつかの広いピークが見られうる
。これは、封入体の品質およびまたは再フォールディングプロセスのいずれかが、ＥＳＢ
Ａ１０５に比較した際、ＴＢ−ｗｔおよびルセンティス−ｓｃＦｖでははるかに効率的で
ないことを示す。

以下に、ＥＳＢＡ１０５に関する産生法を詳細に記載する。
ＥＳＢＡ１０５を発現するためのプラスミドｐＧＭＰ００２の構築：
ＥＳＢＡ１０５コード配列を、ｐＥＴ−２４ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号
６９７５２−３）のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位内に連結した。続いて、Ｂｐｕ１１０
２１およびＮｏｔＩ消化によって生じた粘着端をＴ４ポリメラーゼ反応によって埋めた後
、平滑端連結によって、生じた構築物のＢｐｕ１１０２１−ＮｏｔＩ断片を除去して、ｐ
ＧＭＰ００３を生じた。ｐＥＴ−２４ｄ（＋）から、Ｂｐｕ１１０２１−ＮｏｔＩを直接
除去することによって、ｐＧＭＰ００２を産生した。

大腸菌におけるＥＳＢＡ１０５の発現：
ＥＳＢＡ１０５を発現するため、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を発現
プラスミドｐＧＭＰ００２で形質転換した。１％グルコース、１ｍｌ／ｌの微量元素溶液
（ＷａｎｇおよびＬｅｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ ５８：３２５−３
２８）および５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＭ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）中
で培養した単一コロニーから、グリセロールストック培養物を調製した。細胞を３７℃で
一晩増殖させ、グリセロールを２０％まで添加して、そして１ｍｌアリコットをグリセロ
ールストックとして−８０℃で保存した。

第一の前培養のため、１％グルコース、１ｍｌ／ｌの微量元素溶液および５０μｇ／ｍ
ｌカナマイシンを含有する５０ｍｌの合成定義培地（Ｋｏｒｚら， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ． １９９５， ３９：５９−６５）に、１ｍｌのグリセロールストックを接種
した。前培養を、３７℃で、そしてバッフル振盪フラスコ中、２００ｒｐｍで一晩増殖さ
せた。同じ培地２５０ｍｌを用いた第二の前培養に、第一の前培養を接種し、そして３７
℃でさらに３時間増殖させた。

前培養に用いたものと同じ合成培地３ｌの初期体積を含有する、５ｌのバイオリアクタ
ー（ＢｉｏＦｌｏ １１０、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で
、バイオリアクター培養を実行した。培養温度を３７℃に設定した。２５％アンモニア水
および１Ｍリン酸を添加することによって、培養ｐＨを７．０に調整した。全通気速度４
ｌ／分で、純酸素率を変化させることによって、溶解酸素レベルが空気飽和レベルの２０
％を超えるように維持した。バイオリアクターに第二の前培養を摂取し、そして１０〜１
２のＯＤ_６００まで、バッチモードで操作した。次いで、１０ｇ／ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏおよび５ｍｌ／ｌ微量元素溶液を含有する５０％グルコース溶液を用いて、指数関数
的グルコース供給を、０．１５ｈ^−１の速度で開始した。１６時間後、ＩＰＴＧを１ｍＭ
まで添加することによって、タンパク質発現を誘導し、そして指数関数的供給を３時間続
けた。次いで、４，６００ｒｐｍで１時間遠心分離することによって、細胞を採取した。

封入体調製：
封入体を調製するため、１ｋｇの湿細胞ペーストを、５ｌのＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）中に再懸濁した。１ｇの固形リゾチーム
を添加し、そして細胞懸濁物を３０〜６０分間インキュベーションした。細胞を破壊する
ため、懸濁物を１，０００バールの高圧ホモジナイザー（Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ， Ｐａ
ｎｄａ ２Ｋ）に２回通過させた。破壊された細胞を４，６００ｒｐｍで１時間遠心して
、そして生じた封入体を、０．５％ ＬＤＡＯ（Ｎ−，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ
−オキシド、Ｆｌｕｋａ）を含有する２ｌのＴＢＳ緩衝液中に再懸濁した。洗浄上清中に
、有意な残渣タンパク質が検出されなくなるまで、封入体を繰り返して洗浄した。最後に
、ＬＤＡＯを含まないＴＢＳ緩衝液で封入体を２回洗浄した。

ＥＳＢＡ１０５の再フォールディング：
ｐＨ８．０で６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよ
び２０ｍＭ ＤＴＴを含有する１０倍体積の可溶化緩衝液中で封入体を可溶化し、そして
室温で一晩インキュベーションした。次いで、ｐＨ８．５で３Ｍ尿素、１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ、ならびに各２ｍＭのシステインおよびシスチンを含有する再フォールディング緩衝
液中に、１：５０希釈することによって、可溶化タンパク質を再フォールディングした。
再フォールディングを室温で２４時間続けた。再フォールディング後、深層ろ過によって
沈殿物を除去し、そして再フォールディング溶液を最初の体積の５０％に濃縮した。次い
で、濃縮した再フォールディング溶液を４倍体積のＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭリン酸Ｎａ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）に対して透析し、そしておよそ１ｍｇ／ｍｌのタン
パク質濃度になるまでさらに濃縮した。

クロマトグラフィーによるＥＳＢＡ１０５の精製：
ＥＳＢＡ１０５を２つのクロマトグラフィー工程で精製した：ゲルろ過および陽イオン
交換クロマトグラフィー。ＡＫＴＡ精製系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、す
べてのクロマトグラフィー工程を行った。

分取用ゲルろ過クロマトグラフィーのため、泳動緩衝液としてＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭ
リン酸Ｎａ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を用い、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ７５
２６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。収集したＥＳＢＡ１０５
分画は、単一ピークとして、およそ１８５ｍｌの保持体積で溶出した。

Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＯ_３ ⁻（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ）を第二のクロマトグラフ
ィー工程のカラム樹脂として用いた。５カラム体積の平衡緩衝液（５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐ
Ｈ５．５）で樹脂を平衡化した。ゲルろ過由来のＥＳＢＡ１０５ピーク分画を５０ｍＭ酢
酸Ｎａ、ｐＨ５．５で１０倍に希釈して、そして次いで流速５ｍｌ／分でカラム上に装填
した。装填後、５カラム体積の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。ＥＳＢＡ１０５の溶出に
は、６０分以内および５ｍｌ／分の０〜３５％の溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸Ｎａ、５０
０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）からの直線勾配を用いた。溶出後の最も顕著なピークを
収集し、そしてこれはＥＳＢＡ１０５と同定された。収集したＥＳＢＡ１０５分画をＰＢ
Ｓ（５０ｍＭリン酸Ｎａ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）に対して最終的に透析し
、そして−８０℃で保存した。

実施例２： ｓｃＦｖの生物物理的特性
「薬剤らしさ（ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅｎｅｓｓ）」を調べるため、ＥＳＢＡ１０５および
その誘導体のいくつかを、生物物理的に性質決定した。性質決定には、（１）可溶性パラ
メーター（ＰＥＧ沈殿およびＢ_２２値；Ｂ２２値は、タンパク質自己相互作用の測定値で
あり、この値は、タンパク質結晶成長、可溶化および凝集に重要である。Ｖａｌｅｎｔｅ
ら， Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ２００５ Ｄｅｃ；８９（６）：４２１１−８． Ｅｐｕ
ｂ ２００５ Ｓｅｐ ３０を参照されたい）、（２）ｐＩ値、（３）熱およびカオトロ
ピック変性、ならびに（４）オリゴマー分画と比較した際の単量体分画の定量化の決定が
伴った。項目１〜３の結果を表１に要約し、該表にはまた、それぞれ、Ｌ９２９およびＫ
ＹＭ−１アッセイによって決定した際の相対強度値も含まれる。

表１．いくつかのＥＳＢＡ１０５誘導体に対するデータの要約

実施例３：保存中のｓｃＦｖの安定性
経時的なｓｃＦｖの安定性は、薬剤との関連で、重要な特徴である。図４は、異なる温
度（−８０℃：レーン１、３、５、７、９、および１１）または４０℃：レーン２、４、
６、８、１０および１２）および濃度（２０ｍｇ／ｍｌ：レーン１、２、７および８；
１０ｍｇ／ｍｌ；レーン３、４、９および１０； １ｍｇ／ｍｌ：レーン５、６、１１お
よび１２）で２週間保存した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてクーマシーで
染色した、ＥＳＢＡ１０５ ｓｃＦｖ（レーン１〜６）およびＱＣ１５．２ ｓｃＦｖ（
レーン７〜１２）の分析を示す。抗体は、温度全範囲に渡って、そして試験したすべての
濃度で安定のままであり、そして分解または凝集の徴候はまったく見られなかった。

特定の時間に渡って安定である抗体はまた、完全な活性も保持するはずである。したが
って、本発明者らは、３７℃または−８０℃で８週間保存した後、活性に関してＬ９２９
アッセイにおいて、ＥＳＢＡ１０５を試験した。結果を図５に提示し、そして２つの温度
間には、相違はまったく見られなかった。

実施例４：ウサギの眼全体へのＥＳＢＡ１０５のｅｘ ｖｉｖｏ浸透
ｅｘ ｖｉｖｏ設定において、多様な条件下で、ウサギの眼全体の異なる区画内に浸透
したＥＳＢＡ１０５の量を試験した。これらの一連の実験に関して、表面にくぼみを有す
るインキュベーション試験プレート上に、ウサギの眼を置いた。くぼみはＥＳＢＡ１０５
試験溶液を含有し、そして角膜が試験溶液と接触するように、試験プレート上にウサギの
眼を置いた。３７℃で４時間インキュベーションした後、ＥＳＢＡ１０５含量に関して、
異なる眼の区画を分析した。この分析のため、シリンジを用いて、目的の区画からプロー
ブを除去して（図６を参照されたい）、そしてＥＬＩＳＡによって、プローブのＥＳＢＡ
１０５濃度を決定した。

上述の実験設定で、以下の条件を評価した：１、２、５および１０ｍｇ／ｍｌの濃度で
、ＥＳＢＡ１０５を試験した。０．５％カプリン酸の存在下で、１ｍｇ／ｍｌの濃度をさ
らに試験した。０．５％カプリン酸は、角膜を通じた浸透を増進することが、Ｔｈｉｅｌ
ら（Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２ Ａｐｒ；１２８（１）：６７
−７４）によって以前示された。０．５％カプリン酸の存在下で、１ｍｇ／ｍｌを投与し
た場合、眼の前部のＥＳＢＡ１０５濃度が約４０μｇ／ｍｌであると測定され、これは、
カプリン酸の非存在下で１０ｍｇ／ｍｌ投与した後に測定された濃度と比較して、ほぼ同
じであった（図７）。興味深いことに、これらの２つの投与様式の結果を硝子体液中で比
較すると、カプリン酸を伴う１ｍｇ／ｍｌの投与では約４０ｎｇ／ｍｌと測定され、そし
てカプリン酸を伴わない１０ｍｇ／ｍｌの投与では、約１２５ｎｇ／ｍｌと測定された（
図８）。カプリン酸の非存在下では、２つの区画で測定される濃度は、１、２、５および
１０ｍｇ／ｍｌの適用濃度に明らかな依存を示した（図８）。

眼のインキュベーション試験プレートを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中
の５％低脂肪粉乳）と、４℃で一晩プレインキュベーションした。翌日、プレートをＰＢ
Ｓで洗浄し、そしてその後、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、乾
燥させた。乾燥したプレートのウェルに各１２５μｌの試験溶液を満たし、そして単離し
たウサギの眼を、角膜のみが試験溶液と接触するような方式で、ウェルに入れた。３７℃
および１００％湿度で４時間インキュベーションした後、眼をＰＢＳで３時間洗浄した。
前房には２５Ｇ針を用いて、そして硝子体には２２Ｇ針を用いて、穿刺術を実行した。

ＥＬＩＳＡによって、以下のように、プローブ中のＥＳＢＡ１０５の濃度を決定した：
１３，０００ｒｐｍで５分間、室温で、実験台微量遠心分離装置を用いて、プローブを遠
心分離した。ＥＬＩＳＡ試験のため、０．５％低脂肪粉乳を含有するＴＢＳＴ（０．００
５％Ｔｗｅｅｎを補ったＴＢＳ）（以後、希釈溶液と称する）中で、前部区画由来のプロ
ーブを１：１０、１：１００および１：１０００に希釈し、硝子体区画由来のプローブを
１：５に希釈した。

ＥＬＩＳＡ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ；カタログ番号４４２４
０４）を０．５μｇ／ｍｌヒトＴＮＦαで４℃で一晩コーティングした。翌日、プレート
を室温で３回、ＴＢＳＴで洗浄し、そしてウェルあたり３００μｌのブロッキング緩衝液
（ＴＢＳＴ中、５％低脂肪粉乳）と、振盪装置（５００〜６００ｒｐｍ）上、室温で６０
分間インキュベーションした。ブロッキング工程後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した
後、５０μｌの希釈プローブを各ウェルに添加して、そして振盪装置（５００〜６００ｒ
ｐｍ）上、室温で９０分間インキュベーションした。このインキュベーション工程後、プ
レートをＴＢＳＴで３回洗浄し、その後、二次抗体ＡＫＡ３Ａ−ビオチン化の１：１０，
０００溶液（希釈溶液中で希釈）５０μｌを各ウェルに添加した。ＡＫＡ３Ａ−ビオチン
化は、（標準的ビオチン化プロトコルにしたがって）新鮮にビオチン化したポリクローナ
ルウサギ抗ＥＳＢＡ１０５抗体である。振盪装置（５００〜６００ｒｐｍ）上、室温で９
０分間インキュベーションした後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、その後、ストレプ
トアビジンとカップリングした西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダー
ゼ（ストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ；ＳＤＴ；＃ＳＰ４０Ｃ）の１
：２０００希釈（希釈溶液中で希釈）５０μｌを添加した。振盪装置（５００〜６００ｒ
ｐｍ）上、室温で６０分間インキュベーションした後、プレートをＴＢＳＴで３回、そし
てｄｄＨ_２Ｏで２回洗浄した。各ウェルに、５０μｌのＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（Ｒ
ｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１４８４２８１）を添加して、西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性を検出した。暗所中、室温で６〜１２分間インキ
ュベーションした後、各ウェルに５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを添加することによって、ＨＰ
Ｒ反応を停止した。ＴＥＣＡＮ Ｇｅｎｉｏｓ読み取り装置中、４５０ｎｍでの分光測定
によって、ＨＰＲ反応を定量化した。

平行して産生した標準曲線に比較することによって、プローブのＥＳＢＡ１０５濃度を
最終的に決定した。
実施例５：ＥＳＢＡ１０５による、Ｃａｃｏ−２細胞単層への浸透
ヒト結腸腺癌（Ｃａｃｏ−２）細胞を、２４トランスウェルプレートの透過可能支持体
上に植え付け、そして５％ＣＯ_２大気中、３７℃で２１日間培養して、密着単層の形成を
可能にした。透過性アッセイを行う前に、各ウェルにおいて、経上皮電気抵抗を測定して
、単層の完全性を検証した。次いで、Ｃａｃｏ−２単層を生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ）で
３回洗浄して、そしてカプリン酸塩を含むまたは含まない１μＭのＥＳＢＡ１０５のいず
れかを含有する混合物、あるいはアッセイ培地のみを、対照としてトランスウェルの上部
区画に添加した。明示した時点後、下部区画の内容物を収集し、そして新鮮なアッセイ培
地と交換した。続いて、収集した試料を、定量的ＥＬＩＳＡによって分析して、Ｃａｃｏ
−２上皮単層に浸透したＥＳＢＡ１０５の量を決定した（図９）。

実施例６：マウス十二指腸への浸透
動物を安楽死させた直後に、およそ５ｃｍのマウス十二指腸を切除し、そして酸素飽和
リンガー−クレブス緩衝液中でインキュベーションし、そしてリンガー−クレブス緩衝液
で３回フラッシュした。３．５ｃｍのセクションを、外科絹糸で結紮し、そして１ｍｇ／
ｍｌの各抗体形式（インフリキシマブおよびＥＳＢＡ１０５）を含有する２００ｍｃｌ抗
体混合物で満たした。反転嚢区画のおよそ１ｃｍ遠位で、第二の結紮を加えて、区画が堅
固であることを確実にした。最初の結紮のみが緩衝液と接触するように、１０ｍｌの酸素
飽和リンガー−クレブス緩衝液１０ｍｌを含有するビーカーガラス内に、反転嚢を入れた
。プロテアーゼ阻害剤をこのレセプター区画に添加して、抗体の分解を防止した。腸組織
に浸透した各抗体の量を決定するため、明示した時点後、レセプター区画から２００ｍｃ
ｌプローブを採取し、そして続いて定量的ＥＬＩＳＡによって分析した。

実施例７：可溶性抗原結合性ポリペプチドの局所適用
ウサギの眼における、ｉｎ ｖｉｖｏでの可溶性抗原結合性ポリペプチド、ＥＳＢＡ１
０５の局所適用の薬力学および薬物動態学を研究した。４つの異なる製剤を調製した。第
一の製剤（本明細書において、「Ｂ１５」と称される）は、ｐＨ６の０．１５Ｍリン酸緩
衝液中の９．６ｍｇ／ｍｌのＥＳＢＡ１０５で構成された。第二の製剤（本明細書におい
て、「Ｂ１６」と称される）は、ｐＨ６の０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の１０．
３ｍｇ／ｍｌのＥＳＢＡ１０５および０．０１％（ｗ／ｖ）クロルヘキシジンで構成され
た。第一の対照（本明細書において、「Ｂ１５−０」と称される）は、ｐＨ６の０．１５
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で構成された。第二の対照（本明細書において、「Ｂ１６−０
」と称される）は、ｐＨ６の０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の０．０１％（ｗ／ｖ
）クロルヘキシジンで構成された。すべての製剤を使用前に滅菌し、そして４℃で保存し
た。本明細書において、「ＯＴＴ」は、未治療を示す。

眼におけるＥＳＢＡ１０５の薬力学を研究するため、各製剤に関して６匹のウサギを用
いた。ウサギの両眼において、製剤を試験した。抗体断片を伴わない各製剤に関しては２
匹のウサギ（４つの眼）を用い、そして未処置対照として２匹のウサギ（４つの眼）を用
いた。この研究には、総数１８匹のウサギを用いた。

６日間の経過に渡って、製剤を眼に局部適用した。ウサギを毎日５回、７時、１０時、
１３時、１７時、および２０時に治療した。屠殺日には、７時および１０時にウサギを２
回治療し、そして最後の適用の１時間後に屠殺した。

第１日、第３日、および第６日に眼を評価した。製剤あたり２匹のウサギを用いて、各
時点での薬物動態学的データを集めた。第１日および第３日に房水試料および血清試料を
採取した。第６日、房水試料および血清試料を採取し、そして異なる眼の組織における抗
体断片の分布を研究するために、ウサギの眼を組織に切り分けた。この研究の結果を図１
１ａ〜１１ｄにグラフで示す。

さらなる研究を実行して、ＥＳＢＡ１０５の可溶性、薬力学および薬物動態学を研究し
た。結果を図１２〜１６に記録する。これらの図からわかるように、ＥＳＢＡ１０５は、
ウサギおよびブタの角膜組織層に浸透することが示された。ＥＳＢＡ１０５は、硝子体中
に集積し、そして局部半減期は約２５時間である。前房中のＥＳＢＡ１０５の局部半減期
は、硝子体中より有意に低い。局所治療に際して、全身曝露は非常に低く、例えば最高局
部濃度のおよそ２％である。さらに、ウサギ局所実験に基づいて、１日あたり局所５滴程
度に低くても、療法薬剤レベル（ＴＮＦに関して、およそ１６，０００倍）に到達可能で
ある。したがって、ＴＮＦ阻害性ｓｃＦｖ抗体断片の局所適用は、眼のより後部部分、例
えば硝子体および網膜に位置する疾患において、有効な療法でありうる。

実施例８：ラット急性単関節炎モデルにおける用量反応
用量反応を研究するため、図１７に示すようにＥＳＢＡ１０５を投与した。比較として
、図１７に示すように、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）を投与した。この
実験のため、ＴＮＦαをＥＳＢＡ１０５またはインフリキシマブの３つの異なる投薬量（
１５６μｇ、４５μｇ、または１１μｇ）とともに投与した。対照として、ＰＢＳ、およ
びＴＮＦのみ（１０μｇ ｉ．ａ．）、またはｓｃＦｖのみを用いた。結果を図１７に示
す。

実施例９： ｉｎ ｖｉｖｏの局所適用
局所投与の１日の間の最大全身曝露および局部薬剤レベルを決定するため、１０時間の
期間に渡って２０分ごとに１滴を投与した。ＥＬＩＳＡによって房水、硝子体および血清
中の薬剤レベルを測定した。ＥＳＢＡ１０５をＰＢＳ、ｐＨ６．５中、１０ｍｇ／ｍｌと
して処方した。各滴に関して、３０ｍｃｌを瞳孔の最上部に適用し、そして次いでまぶた
を圧迫して過剰な液体を取り除いた。結果を図１８および表２に示す。

表２：図１８Ａのレジェンドに記載するように、実験の経過中に、示す区画で測定した
、最大ＥＳＢＡ１０５濃度（Ｃｍａｘ）を示す。割合値は、総適用用量（累積用量）に比
較した際のＣｍａｘの割合を示す。

実施例１０：可溶性抗原結合性ポリペプチドの局所適用
長期局所低頻度治療中の最大全身曝露および局部薬剤レベルを決定するため、最大６日
間、１滴を１日５回、２匹のウサギ（４つの眼）に適用した。各滴に関して、３０ｍｃｌ
のＥＳＢＡ１０５を眼の下部の嚢内に適用し（主に強膜に薬剤を提示する）、３０ｍｃｌ
すべてが眼球表面上に残った。

第２日、第３日、および第６日の第２滴後に、眼を評価した。ＥＬＩＳＡによって、房
水、硝子体、神経網膜、脈絡膜および血清中の薬剤レベルを測定した。この研究の結果を
図１９ａ〜図１９ｅにグラフで示す。

表３は、示す区画中、投与第６日後に見られる、［ｎｇ／ｍｌ］の中央値ｓｃＦｖ Ｅ
ＳＢＡ１０５濃度を要約する。
表３：投与第６日後に見られる中央値ｓｃＦｖ ＥＳＢＡ１０５濃度

先行する説明を考慮して、当業者には、本発明の多くの修飾および代替態様が明らかで
あろう。したがって、この説明は例示のみであると見なされ、そして当業者に、本発明を
実行する最適な様式を解説する目的のためである。構造詳細は、本発明の精神から実質的
に逸脱することなく、変化させることも可能であり、そして付随する請求項の範囲内に属
するすべての修飾の独占的使用が留保される。本発明は、付随する請求項、および適用可
能な法規則によって必要とされる度合いにまでしか限定されないことが意図される。

特許、特許出願、記事、書籍、論文、学位論文およびウェブページを含めて、本出願に
引用するすべての文献および類似の資料は、こうした文献および類似の資料の形式に関わ
らず、その全体が、明確に本明細書に援用される。援用される文献および類似の資料の１
以上が、定義された用語、用語使用法、記載する技術等を含めて、本出願と異なるかまた
は矛盾する場合は、本出願が統制する。

本明細書で用いるセクション見出しは、構成する目的のみのためであり、そしていかな
る方式でも、記載する主題を限定するとは見なされないものとする。
本発明は、多様な態様および実施例と組み合わせて記載されているが、本解説がこうし
た態様または実施例に限定されるとは意図されない。逆に、当業者に認識されるであろう
ように、本発明は、多様な代替物、修飾、および同等物を含む。

請求項は、その効果に言及しない限り、記載する順序または要素に限定されると解釈さ
れてはならない。付随する請求項の範囲から逸脱することなく、形式および詳細の多様な
変化を作製してもよいことを理解しなければならない。したがって、以下の請求項および
その同等物の範囲および精神に属するすべての態様が請求される。

参考文献：

Claims (22)

1. 浸透増進剤の非存在下で、８時間未満で、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）哺乳動物角膜を横断させるための医薬組成物であって、該医薬組成物は可溶性の抗原結合性ポリペプチドおよび医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含み、該ポリペプチドは、抗体断片であり、該医薬組成物は、上皮組織関門の表面への局所適用のために製剤化されており、該ポリペプチドが、配列番号１３の配列を含む一本鎖抗体である、医薬組成物。
2. 前記組織関門が眼の表面である、請求項１の医薬組成物。
3. 眼への局所適用のためのものである、請求項１または２の医薬組成物。
4. 前記抗原結合性ポリペプチドの少なくとも１００ｎｇ／ｍｌの眼内濃度を達成するように配合された、請求項３の医薬組成物。
5. 前記抗原結合性ポリペプチドが、眼への局所適用用に処方され、浸透増進剤の非存在下で、角膜を通して眼内空間へと通過することができる、請求項３または４の医薬組成物。
6. 点眼剤の形態の組成物である、請求項３から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. 組成物のｐＨが８未満である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. 前記ポリペプチドが損なわれていない哺乳動物角膜を４時間未満で移行するのに十分に可溶性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
9. 前記ポリペプチドが、少なくとも１０Ｅ−６Ｍ以下のＫＤの、ターゲット抗原に対する結合親和性を有する、請求項１〜８のいずれかに一項に記載の医薬組成物。
10. 前記抗原結合性ポリペプチドを、２ｍｇ／ｍｌより高い濃度で含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 前記抗原結合性ポリペプチドが１００ｎｇ／ｍｌを超える治療的濃度に達する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 前記抗原結合性ポリペプチドが、摂氏−８０度から摂氏３７度の温度で安定である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 前記抗原結合性ポリペプチドが、少なくとも８週間安定である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
14. 前記抗原結合性ポリペプチドが、摂氏４度で、少なくとも６週間安定である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
15. 前記抗原結合性ポリペプチドが、ＰＢＳ中、１ヶ月間、２０℃から４０℃で安定である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
16. 前記抗原結合性ポリペプチドが、「品質管理」と称される酵母相互作用アッセイで測定した際に、還元条件下で安定である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
17. 前記ポリペプチドが、生理学的条件下で単量体型のままである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
18. 前記ポリペプチドが、１ｍｇ／ｍｌより高い濃度で、ＰＢＳ中、周囲温度で可溶性である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
19. 前記ポリペプチドが、塩酸グアニジン滴定において、少なくとも１．５Ｍの転移中点を示す、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
20. 前記抗体のその抗原に対する親和性が、１００ｎＭ未満の解離定数ＫＤによって特徴付けられる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
21. 前記抗体がヒトＴＮＦαに特異性を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
22. 前記抗体が化学的に修飾されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。