WO2015158937A1 - ANTICUERPOS MONOCLONALES RECOMBINANTES vNAR NEUTRALIZANTES DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR VEGF - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la selección, aislamiento y purificación de proteínas que pertenecen a regiones variables denominadas V_HNAR ó vNAR propias de las inmunoglobulinas tipo IgNARs receptoras de antígenos y que provienen de elasmobranquios; las clonas de las cuales derivan se les denomina VEGFvNAR V32R y V19, y a los anticuerpos respectivos se les denomina V32R y V19. Sus secuencias aminoacídicas fueron elucidadas,así como sus estructuras terciarias,y se determinó su capacidad para neutralizar la actividad del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF).Durante el desarrollo de la invención estas proteínas fueron optimizadas para expresarse en un modelo de producción de E.coli a nivel industrial. La invención implica el uso de estos anticuerpos en general para tratar padecimientos relacionados con la angiogénesis o neovascularización y de manera particular para tratar padecimientos oftalmológicos relacionados la neovascularización mediante su administración tópica.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES RECOMBINANTES vNAR NEUTRALIZANTES DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR VEGF

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, específicamente a la generación de productos biofarmacéuticos basados en anticuerpos monoclonales terapéuticos de tiburón denominados vNAR que bloquean al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y que poseen notables propiedades biológicas y biofísicas, son altamente resistentes a las condiciones ambientales, pudiendo no requerir cadena de frío y tienen una buena capacidad de penetración, aumentando así su actividad terapéutica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos son herramientas importantes para la aplicación médica. La mayoría de los anticuerpos están compuestos de dos cadenas pesadas y dos ligeras, ambas cadenas forman el sitio de unión del antígeno. Se han encontrado anticuerpos no convencionales en cuanto a estructura en llamas, camellos y en peces cartilaginosos. Estos anticuerpos están constituidos por una sola cadena pesada con cuatro dominios constantes y un sitio de unión al antígeno o dominio variable denominado V_H, en camélidos se denomina hcAbs y en elasmobranquios vNAR o V_HNAR.¹ La tecnología de anticuerpos se ha desarrollado para proporcionar nuevas terapias y sistemas de diagnóstico, incluido, por ejemplo, el uso de anticuerpos monoclonales; el de anticuerpos humanizados, diseñados para disminuir la respuesta al antígeno no humano; y el de anticuerpos conjugados, para mejorar sus propiedades. El número de anticuerpos aprobados por FDA para el tratamiento de diversas enfermedades humanas se ha incrementado, aproximadamente 352 de ellos están en ensayos clínicos (fase I o fase II), constituyendo, cerca del 25% de todas las proteínas en los ensayos clínicos. Se han realizado muchos esfuerzos con el objeto de reducir el tamaño convencional de los anticuerpos y manteniendo sus propiedades de unión al antígeno, como afinidad, avidez y especificidad.² Los fragmentos pequeños de anticuerpos con capacidad de unión al antígeno están entre las alternativas tecnológicas de uso médico. Estas alternativas han evolucionado desde moléculas recombinantes, tipo fragmentos de unión al antígeno (Fab) y/o fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), a dominios sencillos de unión para proteínas, basados en inmunoglobulinas con dominios V_H, que a su vez se han usado para desarrollar nuevas estrategias inmunoterapéuticas e inmunodiagnósticas. La mimetización de los Fabs a dominios más pequeños ofrece la ventaja de incrementar la estabilidad y la posibilidad de acceso a epítopos antigénicos, que no son reconocidos por anticuerpos convencionales.²

Los anticuerpos o inmunoglobulinas de los peces cartilaginosos son de tres isotipos, dos de ellos con dos cadenas estándar, una pesada y una ligera, designadas como IgM e IgW (también llamada IgX o IgNARC) y un isotipo atípico llamado IgNAR que es un homodímero de cadenas pesadas que no se asocian con cadenas ligeras. Las inmunoglobulinas de tiburón receptoras de antígenos (referidas como IgNAR o NAR) poseen un solo dominio variable (fragmentos sdAb) y dos estructuras en horquilla que son hipervariables para abarcar todo el repertorio con especificidad de unión para reconocer a los antígenos. Las IgNARs son moléculas pequeñas (12 kDa) de alta solubilidad, de alta termoestabilidad, y con buena capacidad de penetración tisular in vivo, lo que convierte a los IgNARs en un buen recurso para la ingeniería de anticuerpos y anticuerpos terapéuticos.³' ⁴

La presente invención se refiere a la selección y aislamiento de anticuerpos IgNAR, en particular de su región variable V_HNAR, originados en el tiburón inmunizado de la especie Heterodontus francisci u Orectolobus maculatus con afinidad hacia citocinas y con capacidad para neutralizar las actividades de las mismas. Estos anticuerpos se originan, en general, por el sistema inmunológico de peces cartilaginosos (tiburones, mantas, rayas y quimeras). El arreglo molecular de los anticuerpos IgNAR consta de cinco regiones constantes y una variable, muy similar al V_H encontrado en camélidos, pudiendo esto representar una convergencia evolutiva a nivel molecular.¹' ⁵

Nuttall y colaboradores obtuvieron una biblioteca de anticuerpos de tiburón no inmune por medio de la técnica de despliegue en fagos, basados en regiones variables de IgNAR del tiburón Orectolobus maculatus. Estas regiones tienen la capacidad de reconocer proteínas como la proteasa gingipaina K de Porphyromonas gingivalis, el receptor de importación de mitocondria Tom70, la lisozima y el antígeno 1 de la membrana apical (AMA-1) de Plasmodium falciparum, entre otras. Estas regiones han sido clonadas en sistemas de expresión de E. coli, siendo la primera descripción de especificidad antigénica de vNARs obtenida del repertorio natural del tiburón como una probable fuente de anticuerpos de dominios sencillos con alta afinidad.⁶' ⁷' ⁸ En 2003, Dooley y colaboradores seleccionaron una biblioteca dirigida generada en Ginglymostoma cirratum. Estos tiburones fueron inmunizados con lisozima de huevo blanco de gallina (HEL), lo cual permitió la obtención de clones altamente específicos al antígeno HEL, con una afinidad nanomolar (en un rango de 10^"7 hasta 10^"10 M) y con una gran resistencia a la desnaturalización por calor, al conservar más del 20% de su actividad después de ser incubado 3 horas a lOO°C. ⁹

Los genes de IgNAR se encuentran agrupados, cada grupo está compuesto por una sola región variable sencilla (VH), tres elementos de diversidad (D) y un gen sencillo de unión (J). El repertorio primario de V_H de IgNAR es generado por cuatro eventos de recombinación, resultando en un repertorio diverso de CDR3 tanto en términos de secuencia como de longitud. ⁶

Tras el descubrimiento de estos receptores de antígeno de cadena sencilla y debido a su alta funcionalidad, se han desarrollado diferentes tecnologías basadas en este tipo de proteínas de tiburón. El dominio variable aislado y clonado es extremadamente estable, es un 20% menor que el dominio de los anticuerpos de camélidos, y posee la misma capacidad de unión al antígeno que el receptor original.

Las ventajas de esta tecnológica son: que combina las propiedades de los anticuerpos convencionales con las ventajas de las moléculas pequeñas; que tienen alta especificidad y baja toxicidad inherente; que dado su bajo peso molecular tienen más posibilidades de alcanzar a su diana; que son capaces de inhibir enzimas y que pueden llegar también al sitio de unión de los receptores celulares. Todas estas propiedades pueden explotarse para usos terapéuticos, además presentan un gran potencial para ser administrados por diversas vías, incluyendo la vía tópica. Así mismo, su producción es fácil y de bajo coste. ⁵

En la literatura se evidencia que la sobreexpresión de VEGF y sus receptores (VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3) causa un aumento de la permeabilidad microvascular y la angiogénesis, produciendo patologías oculares tales como la retinopatía diabética, la degeneración macular asociada a la edad, y el glaucoma neovascular. La distribución celular de receptores (VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3) sugiere varias funciones específicas de la familia de VEGF en la retina normal, tanto en la vasculatura de la retina y en los elementos neuronales. ¹⁰ El VEGF ha sido descrito como un factor derivado de tumores con capacidad para inducir la permeabilidad celular endotelial, la proliferación celular y la angiogénesis, la cual define la formación de nuevos vasos sanguíneos, especialmente los que proveen de oxígeno y de nutrientes a los tejidos cancerosos; aunque en la angiogénesis estén implicados muchos otros factores, el VEGF es el mediador clave.

El VEGF (o VEGF -A) es una glucoproteína de unión a heparina que pertenece a una subfamilia que incluye los factores de crecimiento VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y el factor de crecimiento plaquetario. Como resultado de patrones de empalme alternativo del AR m del VEGF, el VEGF existe al menos en siete isoformas; de las cuales las cuatro isoformas principales son VEGF_m, VEGF₁₆5, VEGF₁₈₉ y VEGF₂o6 (los subíndices se refieren al número de aminoácidos de la proteína). La especie predominante es el VEGF₁₆5 y tiene cierta afinidad por la heparina, así que parte de ésta isoforma se encuentra unida y se libera por escisión proteolítica, el resto se encuentra libre y disponible para unirse a receptores de las células endoteliales y es el resultado de dos procesos distintos: la secreción de las isoformas solubles y la escisión proteolítica de isoformas unidas. La importancia fisiológica de las diferentes isoformas del VEGF no está clara, sin embargo el VEGF₁₆5 es el principal regulador de la angiogénesis.

El VEGF se une principalmente a dos receptores: Receptor 1 del VEGF (también conocido como Flt-1) y el receptor 2 del VEGF (también conocido como Flk-1 o KDR). Cada uno de estos receptores posee: un dominio extracelular (al que se une el VEGF) con siete áreas de tipo inmunoglobulina (Ig), una región transmembrana única y un dominio intracelular con actividad tirosina-quinasa. Estos receptores se encuentran principalmente en las células endoteliales vasculares de tejidos en desarrollo.

La unión al receptor 2 del VEGF, estimula directamente la angiogénesis y activa una serie de vías de transducción de señales dando como resultado la proliferación de células endoteliales vasculares, la migración de células endoteliales vasculares, la supervivencia de células endoteliales inmaduras y el aumento de la permeabilidad vascular.

Aunque inicialmente se pensó que el receptor 1 del VEGF actuaba como "receptor señuelo", reduciendo el número de moléculas del VEGF capaces de unirse al receptor 2 del VEGF, estudios recientes demuestran que el receptor 1 del VEGF también es capaz de inducir una señal mitogénica.

La angiogénesis es la formación de nuevas estructuras vasculares y juega un papel fundamental en procesos patológicos, como el establecimiento de tumores y enfermedades oculares. Cuando se produce el crecimiento de vasos nuevos anormales y la aparición de un tejido fibroso en la retina se conoce como Retinopatía Diabética, cuando se origina debajo de la mácula es llamada Degeneración Macular y cuando se ocasiona en el iris se denomina Glaucoma Neovascular. La Retinopatía Diabética es una afección de la retina que ocurre en pacientes con diabetes mellitus tanto tipo 1 como tipo 2 después de varios años de padecer la enfermedad, y especialmente cuando la enfermedad no está bien controlada. Existen dos tipos de retinopatía diabética: retinopatía diabética temprana o no-proliferativa y retinopatía diabética avanzada o proliferativa. El estado proliferativo de la retinopatía diabética se caracteriza por el crecimiento anormal de nuevos vasos y la subsecuente proliferación fibrosa en respuesta a isquemia de la retina, así como el desarrollo de hemorragias pre-retinales o vitreas. ¹¹ La importancia de la ésta radica en que es una de las principales causas de ceguera irreversible a nivel mundial y que puede prevenirse tomando las precauciones adecuadas y aplicando el tratamiento oportunamente¹¹. La retinopatía diabética se define como la presencia y evolución característica de lesiones microvasculares oculares típicas en pacientes diabéticos.

La Degeneración Macular Asociada a la Edad (DMAE) es la principal causa de pérdida visual en pacientes mayores de 60 años. La mácula es el área central de la retina, y se ocupa de la visión fina que utilizamos para leer, ver la televisión, ver las facciones de las personas y en general la visión de detalles finos. ¹² Se trata de una condición degenerativa de la mácula, la cual es una causa común de pérdida de visión. Puede clasificarse como húmeda (neovascular) o seca (no- neovascular). Cerca del 10% de los pacientes que sufren de degeneración macular presentan la de tipo húmedo. Para la degeneración macular húmeda el tratamiento habitual consiste en la aplicación de una o varias inyecciones dentro del ojo de medicamentos conocidos como "antiangiogénicos", cuya intención es hacer desaparecer la membrana neovascular. Con este tratamiento, más del 90% de los pacientes mantienen la visión, y aproximadamente en dos terceras partes de los pacientes la visión mejora, siempre y cuando el tratamiento se aplique de manera oportuna y, no se produzca mucha cicatrización. ¹³

Existe el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos en aquellos tejidos donde la circulación se encuentra dañada ya sea por trauma o por enfermedad como las que hemos mencionado. La neovascularización corneal es el crecimiento anormal de vasos sanguíneos originando coriocapilares que pasan la membrana de Bruch y luego proliferan bajo el epitelio de la retina pigmentada (tipo 1) y/o bajo la retina (tipo 2). Esto puede ocurrir por la ruptura de la membrana de Bruch, la liberación de citocinas como el VEGF, la inflamación, el estrés oxidativo en el epitelio pigmentado de la retina o la insuficiencia vascular. Esta condición es la principal causa de la degeneración macular húmeda y puede estar asociada con varios desórdenes incluyendo estrías angioides, ruptura coroidal, miopía patológica, lesión corioretinal y coriorretinopatía en birdshot.

También existe el fenómeno de neovascularización en el iris. La formación anormal de nuevos vasos sanguíneos en la superficie anterior del iris se asocia comúnmente con diferentes condiciones que han dado lugar a la isquemia retiniana, tales como la retinopatía diabética, la oclusión de la vena retiniana central, la enfermedad de la arteria carótida, melanoma uveal, desprendimiento de retina prolongado, etc. La neovascularización comienza en los márgenes de la pupila y a menudo al mismo tiempo en el ángulo de la cámara anterior y se esparce sobre toda la superficie. Los nuevos vasos están asociados con membranas tisulares fibrosas, las cuales pueden bloquear el pase del humor acuoso a través de la malla trabecular (glaucoma neovascular) y causar ectropión úvea en el reborde pupilar, su tratamiento habitual consiste en aplicar fotocoagulación, para prevenir la formación de nuevos vasos sanguíneos. El glaucoma neovascular es un tipo especial de glaucoma secundario que se produce como consecuencia de la formación de nuevos vasos sanguíneos en el iris. Estos nuevos vasos acaban por provocar una obstrucción en la circulación del humor acuoso por la cámara anterior del ojo, lo cual desencadena una hipertensión ocular. Se produce como consecuencia de una falta de oxígeno crónica y mantenida de la retina. En respuesta a la misma el organismo produce una serie de sustancias que estimulan la neovascularización.

Otros procesos patológicos donde se involucra el fenómeno de neovascularización son: Neovascularización Retiniana, Neovascularización Coroidal, Neovascularización de la Córnea, Degeneración Macular, Degeneración Macular asociada a la edad, Enfermedades de la Retina, Retinopatía Diabética, Hemorragia Vitrea, Hemorragia Retiniana, Coroiditis, Desprendimiento de Retina, Drusen Retiniano, Glaucoma Neovascular, Enfermedades de la Coroides, Uveitis, Miopía, Oftalmopatías, Infecciones Fúngicas del Ojo, Telangiectasia, Oclusión de la Arteria Retiniana, Miopía Degenerativa, Oclusión de la Vena Retiniana, Coriorretinitis, Histoplasmosis, Enfermedades de la Uvea, Rubéola (Sarampión Alemán), Toxoplasmosis Ocular, Membrana Epirretinal, Coloboma, Neoplasias de la Coroides, Degeneración Retiniana, Retinitis, Perforaciones de la Retina, Queratitis Herpética, Retinopatía de la Prematuridad, Edema Macular Quístico, Papiledema, Síndrome Uveomeningoencefálico, Drusen del Disco Óptico, Estrías Angioides, Retinitis Pigmentosa, Trastornos de la Visión, Oftalmía Simpática, Cicatriz Quemaduras Oculares Recurrencia Isquemia Lesiones Oculares Glaucoma, Hemorragia del Ojo, Escotoma, Uveitis Posterior, Fungemia, Neoplasias de la Retina, Enfermedades de la Córnea, Incontinencia Pigmentaria, Enfermedad de la Hemoglobina C, Fibrosis, Opacidad de la Córnea, Uveitis Anterior, Hipema, Sarcoidosis, Afaquia Enfermedad Iatrogénica, Panuveitis, Catarata, Complicaciones Postoperatorias, Anemia de Células Falciformes, Vasculitis Retiniana, Osteoma, Retinitis por Citomegalovirus, Atrofia, Flebitis, Queratocono, Síndrome de Sturge-Weber, Síndrome, Infecciones Virales del Ojo, Anomalías del Ojo, Trastornos Relacionados con Sustancias, Lesiones Oculares Penetrantes, Diabetes Mellitus Tipo 2, Traumatismos por Radiación, Rasgo Drepanocítico, Seudofaquia, Nevo Pigmentado, Vitreorretinopatía Proliferativa, Hemorragia, Diabetes Mellitus Tipo 1, Nevo, Enfermedades del Nervio Óptico, Enfermedades Vasculares, Candidiasis, Quemaduras Químicas, Microftalmia.

A nivel mundial, 285 millones de personas padecen discapacidad visual por diversas causas, y 39 millones de ellas están ciegas. ¹⁴ "Las principales causas de ceguera crónica son las cataratas, el glaucoma, la degeneración macular relacionada con la edad, las opacidades corneales, la retinopatía diabética, el tracoma y las afecciones oculares infantiles, así como las causadas por la carencia de vitamina A. La ceguera relacionada con la edad y la debida a la diabetes no controlada están aumentando en todo el mundo. Tres cuartas partes de los casos de ceguera son prevenibles o tratables". ¹⁵

Las moléculas inhibidoras de la actividad del VEGF pueden ser utilizadas para limitar procesos de neovascularización dependientes de la acción del VEGF. Los anticuerpos anti-VEGF se unen al ligando eliminando el VEGF circulante libre y evitando así que se una a sus receptores. Los anticuerpos se han utilizado con este fin, ya que son sumamente específicos y sólo se unen al VEGF, y pueden inhibirse los efectos pro-angiogénicos mediados por todos los receptores con los que se une.

Se han desarrollado diferentes estrategias para inhibir la señalización mediada por el VEGF, sin embargo, desde que se demostró que un anticuerpo específico anti-VEGF podía inhibir el crecimiento tumoral en modelos animales descrito por Ferrara y Davis-Smith, en 1997, comenzó el desarrollo de una versión humana del anticuerpo anti-VEGF.

El Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF. Este ha sido el primer agente anti- angiogénico aprobado para el abordaje terapéutico del cáncer; se ha autorizado su uso para el tratamiento en primera línea del cáncer colorrectal metastásico en combinación con un régimen de quimioterapia, se ha probado en cánceres de muchos órganos con resultados clínicos positivos que incluyen regresión tumoral e incremento en la supervivencia media y a largo plazo. ¹⁶

En 2004, la Food and Drug Administration (FDA) de EEUU aceptó el Pegaptanib, el primer medicamento antiangiogénico para el ojo, que se administra mediante inyección intravítrea. Este anti-VEGF se analizó en estudios con pacientes con degeneración macular asociada a la edad. Los resultados de éstos demostraron la estabilización de la visión en el 70% de los pacientes tratados, frente al 50% en pacientes no tratados contra este anticuerpo.

En 2006, la FDA aprobó el uso oftálmico del Ranibizumab , este es un fragmento Fab recombinante de anticuerpo monoclonal murino humanizado anti-VEGF, también se han empleado con éxito en el tratamiento de enfermedades oculares para la inhibición de neovascularización que conlleva la ceguera, en particular para tratar la degeneración macular de todas sus modalidades, en particular la DMAE húmeda.¹⁷

La forma de aplicación del Ranibizumab es mediante inyección intravítrea. Entre los efectos colaterales que produce el Ranibizumab está el desprendimiento de retina e infecciones serias. Se ha publicado que en ratón causa la muerte de fotoreceptores y de células de Müller de la retina, las cuales son esenciales para la función visual. Otros medicamentos oftálmicos que actúan inhibiendo la actividad del VEGF, y cuya aplicación es infraocular, son los siguientes: la Verteporfina, que se utiliza como tratamiento selectivo de la neovascularización coroide asociada con una degeneración macular; el Aflibercept el cual se usa para tratar la degeneración macular húmeda asociada a la edad, y la dexametasona, corticosteroide que ha demostrado reducir el proceso inflamatorio que provoca el edema macular cuando se aplica en forma de implante intravítreo.

La patente US 8,496,933, Paniagua-Solís et al., se refiere a la selección, aislamiento y obtención de una proteína que pertenecen a regiones variables denominadas V_HNAR o vNAR propias de las inmunoglobulinas tipo IgNARs, receptoras de antígenos y que provienen de elasmobranquios; a este vNAR se le denominó V13 y fue seleccionada por su capacidad de unión de manera específica al factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y se caracteriza por su secuencia, seleccionada y optimizada que funciona neutralizando la actividad del VEGF, siendo el estado de la técnica más cercano a la invención que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. Los ensayos sobre las terapias anti-VEGF han probado una variedad de estrategias de dosificación como son: cuándo iniciar el tratamiento, la frecuencia de dosificación, y hasta qué punto estas estrategias se pueden seguir en el tratamiento médico, ya que los efectos secundarios o colaterales como hipertensión, proteinuria, sangrado, daño en la cicatrización de heridas quirúrgicas, incluso complicaciones mortales como trombosis arterial, perforación gastrointestinal y leucoencefalopatía focal posterior reversible, la vía de administración, la invasividad de los métodos, las dosis altas, la biodisponibilidad, la inestabilidad, así como los altos costos, los largos tratamientos, entre otros, dan lugar a la necesidad de investigar nuevas moléculas que tengan un mejor desempeño. Aun con las alternativas mencionadas se requiere desarrollar mejores medicamentos que inhiban la actividad del VEGF para tratamientos oculares para eliminar o disminuir los efectos colaterales.

La presente invención describe nuevas clonas y moléculas denominadas VI 9, V32R, y la descrita VI 3, caracterizadas por su estructura tridimensional, sus secuencias y afinidades al VEGF útiles en el tratamiento de afecciones oculares, particularmente para el tratamiento de la retinopatía diabética, degeneración macular, glaucoma neovascular o afecciones oculares relacionadas con la angiogénesis. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la generación de anticuerpos monoclonales terapéuticos de tiburón conocidos como IgNAR que se componen de cadenas pesadas propias de las inmunoglobulinas. Específicamente la presente invención se refiere a la selección de los dominios variables (vNAR) de estas cadenas pesadas, y que en este caso se caracterizan por su capacidad para reconocer a la citocina conocida como factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Los vNARs resultan de interés en el campo de la biotecnología debido a sus propiedades biológicas y biofísicas, los productos vNAR son altamente resistentes a las condiciones ambientales, y tienen una alta capacidad de acción terapéutica vía tópica. Junto con los dominios variables derivados de inmunoglobulinas de camellos (conocidos como VHH), los vNARs son las moléculas biológicas más pequeñas capaces de reconocer antígenos. Debido a estas propiedades los vNARs superan la mayoría de las desventajas e inconvenientes de la terapia convencional con anticuerpos monoclonales. Más aun, la presente invención se refiere a la selección, aislamiento y purificación de proteínas que pertenecen a regiones variables denominadas V_HNAR ó vNAR propias de las inmunoglobulinas tipo IgNARs receptoras de antígenos y que provienen de elasmobranquios; las clonas de las cuales derivan se les denomina VEGFvNAR V32R y VI 9, y a los anticuerpos respectivos se les denomina V32Ry V19 (indistintamente definidas también como vl9 ó v32R). La presente invención describe nuevas clonas y moléculas denominadas VI 9, V32R, y la descrita VI 3, caracterizadas por su estructura tridimensional, sus secuencias y afinidades al VEGF útiles en el tratamiento de afecciones oculares, particularmente para el tratamiento de la retinopatía diabética, degeneración macular, glaucoma neovascular o afecciones oculares relacionadas con la angiogénesis.

Con el propósito de demostrar que las nuevas clonas no son un artificio de laboratorio y que en realidad comprenden anticuerpos diferenciados que aportan una ventaja técnica sorprendente e inesperada frente al estado de la técnica, se ha incluido también la caracterización de la clona V13 - descrita anteriormente en la publicación de patente US 8,496,933 - y se ha sometido a los mismos protocolos de aislamiento y purificación realizados ahora durante el desarrollo de la invención para que sea comparada. Más aun, con la finalidad de mejorar los rendimientos, durante el desarrollo de la invención se llevaron a cabo diferentes análisis y métodos de expresión y purificación con el fin de detectar y obtener las mejores condiciones de expresión y de purificación de las proteínas, así como la valoración posterior del desempeño de cada una de las clonas obtenidas para unir y neutralizar al VEGF.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Secuencia aminoacídica de la proteína vNAR V13 anti-VEGF, se indica dónde se detectaron los supuestos dominios conservados.

Figura 2: Alineamiento entre las secuencias correspondientes a las clonas V13, V32R y V19. Figura 3: Plásmidos de expresión utilizados para generar las construcciones: A: pET20b+ (vNAR 1 y 3), B: pET28a+ (vNAR 2 y 4).

Figura 4: Procesamiento del cultivo de E. coli BL21 (DE3) hasta la obtención de fracciones periplásmica, y citoplásmica soluble e insoluble.

Figura 5: Análisis de las fracciones subcelulares detección de VEGFvNAR v32R con péptido señal (sp): A: SDS PAGE acrilamida 15% condiciones reductoras, tinción con azul de Coomasie. B: Electrotransferencia a membrana de nitrocelulosa, hibridación con anti-His (1 :3000) más un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a peroxidasa (1 :3000). Revelado por ECL (del inglés, en anced ehemiluminescence). Muestras por carril: 1) sp VEGFvNAR v32RFracción extracelular 30°C, 2) sp VEGFvNAR v32R Fracción extracelular 30°C, 3) spVEGFvNAR v32R Fracción periplásmica 30°C, 4) sp VEGFvNAR v32R Fracción periplásmica 37°C, 5) sp VEGFvNAR v32R Fracción soluble citoplasmática 30°C, 6) sp VEGFvNAR v32R Fracción soluble citoplasmática 37°C, 7) spVEGFvNAR v32R Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 30°C, 8) sp VEGFvNAR v32R Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 37°C

Figura 6: Análisis de las fracciones subcelulares detección de VEGFvNAR v32R sin péptido señal: A: SDS PAGE acrilamida 15% condiciones reductoras, tinción con azul de Coomasie. B: Electrotransferencia a membrana de nitrocelulosa, hibridación con anti-His (1 :3000) más un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a peroxidasa (1:3000). Revelado por ECL. Muestras por carril: 1) VEGFvNAR v32R Fracción extracelular 30°C, 2) VEGFvNAR v32R Fracción extracelular 30°C, 3) VEGFvNAR v32R Fracción periplásmica 30°C, 4) VEGFvNAR v32R Fracción periplásmica 37°C, 5) VEGFvNAR v32R Fracción soluble citoplasmática 30°C, 6) VEGFvNAR v32R Fracción soluble citoplasmática 37°C, 7) VEGFvNAR v32R Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 30°C, 8) VEGFvNAR v32R Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 37°C.

Figura 7: Análisis de las fracciones subcelulares detección de VEGFvNAR vl9 con péptido señal (sp): A: SDS PAGE acrilamida 15% condiciones reductoras, tinción con azul de Coomasie. B: Electrotransferencia a membrana de nitrocelulosa, hibridación con anti-His (1 :3000) más un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a peroxidasa (1:3000). Revelado por ECL. Muestras por carril: 1) spVEGFvNAR vl9 Fracción extracelular 30°C, 2) spVEGFvNAR vl9 Fracción extracelular 30°C, 3) spVEGFvNAR vl9 Fracción periplásmica 30°C, 4) spVEGFvNAR vl9 Fracción periplásmica 37°C, 5) spVEGFvNAR vl9 Fracción soluble citoplasmática 30°C, 6) spVEGFvNAR vl9 Fracción soluble citoplasmática 37°C, 7) spVEGFvNAR vl9 Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 30°C, 8) spVEGFvNAR vl9 Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 37°C.

Figura 8: Análisis de las fracciones subcelulares detección de VEGFvNAR v 19 sin péptido señal: A: SDS PAGE acrilamida 15% condiciones reductoras, tinción con azul de Coomasie. B: Electrotransferencia a membrana de nitrocelulosa, hibridación con anti-His (1 :3000) más un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a peroxidasa (1:3000). Revelado por ECL. Muestras por carril: 1) VEGFvNAR vl9 Fracción extracelular 30°C, 2) VEGFvNAR vl9 Fracción extracelular 30°C, 3) VEGFvNAR vl9 Fracción periplásmica 30°C, 4) VEGFvNAR vl9 Fracción periplásmica 37°C, 5) VEGFvNAR vl9 Fracción soluble citoplasmática 30°C, 6) VEGFvNAR vl9 Fracción soluble citoplasmática 37°C, 7) VEGFvNAR vl9 Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 30°C, 8) VEGFvNAR vl9 Fracción insoluble citoplasmática (Cuerpos de inclusión) 37°C.

Figura 9: Fracción citoplásmica insoluble correspondiente a VEGFvNAR v32R con péptido señal. A: Solubilización de la proteína agregada y cromatografía FPLC (on-column refolding) en columnas de afinidad HisTrap FF crude 1 μλ. B: Análisis mediante electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE 15%)

Figura 10: Fracción citoplásmica insoluble correspondiente a VEGFvNAR v32R sin péptido señal. A: Solubilización de la proteína agregada y cromatografía FPLC (on-column refolding) en columnas de afinidad HisTrap FF crude 1 mi. B: Análisis mediante electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE 15%)

Figura 11 : Fracción citoplásmica insoluble correspondiente a VEGFvNAR vl9 con péptido señal. A: Solubilización de la proteína agregada y cromatografía FPLC (on-column refolding) en columnas de afinidad HisTrap FF crude 1 mi. B: Análisis mediante electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE 15%).

Figura 12: Fracción citoplásmica insoluble correspondiente a VEGFvNAR v 19 sin péptido señal. A: Solubilización de la proteína agregada y cromatografía FPLC (on-column refolding) en columnas de afinidad HisTrap FF crude 1 mi. B: Análisis mediante electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE 15%)

Figura 13: ELISA indirecto tapizado con 200-300 ng/pozo de rhVEGF. Anticuerpo primario vNAR V13, V19 ó V32R, preps B, purificado por el método On-column refolding. Control: anticuerpo primario vNAR purificado por el método On-bench refolding (1 mgr/ml). Anticuerpo secundario: conejo anti-HA 1: 1000, anticuerpo terciario: cabra anti-conejo-HRPO 1 : 1000. Control + anti-VEGF Abcam, 500 o 50 ngr/pozo. Revelado con TMB (3,3',5,5 '- Tetramethylbenzidine), Absorbancia medida a 450nm.

Figura 14: Análisis por Western-Blot. A: Electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE 15%) de las muestras rhVEGF (500 ngr) y BSA control (5000 ngr). B: Electrotransferencia a membrana de nitrocelulosa e hibridación secuencial con el correspondiente vNAR (10 μgr), anti-HIS (1:3000) más un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a peroxidasa (1 :3000). Revelado por ECL.

Figura 15: Citometría de flujo para células U937 (10⁶), permeabilizadas en su membrana y tratadas con VEGFvNARl, es decir SP-VEGFvNARORF-6His-HA siendo en este caso V13

(soluble extracelular) + Anticuerpo Anti-HIS (1 :200) + Anticuerpo Cabra anti-ratón-alexa flúor

488 (1 :200). a) VEGFvNARl Extracelular. b) Control anti-VEGF (Abcam).

Figura 16: Citometría de flujo para células U937 (10⁶), permeabilizadas en su membrana y tratadas con VEGFvNAR2, es decir VEGFvNARORF-6His-HA siendo en este caso VI 3 (fracción citoplasmática insoluble replegada) + Anticuerpo Anti-HIS (1 :200) + Anticuerpo Cabra anti-ratón-alexa flúor 488 (1 :200). A: VEGFvNAR2 (Refolded). B: Control anti-VEGF (Abcam).

Figura 17: Valores de RMSD (del inglés, Root Mean Square Deviation) medidos durante la simulación de 6 ns para VEGF. El eje Y representa el RMSD y el eje X el número de paso de la dinámica (cada paso son 2 picosegundos).

Figura 18: Fluctuaciones medias de los residuos de VEGF. En el eje Y se representa el valor de

RMSD y en el eje X el número de residuos.

Figura 19: Superposición de la estructura inicial (gris) y final de la dinámica (cian) de VEGF. Figura 20: Valores de RMSD medidos durante la simulación de 5 ns para vNAR V19. El eje Y representa el RMSD y el eje X el número de paso de la dinámica (cada paso son 2 picosegundos). Figura 21 : Fluctuaciones medias de los residuos de vNAR V19. En el eje Y se representa el valor de RMSD y en el eje X el número de residuo.

Figura 22: Superposición de la estructura inicial (gris) y final de la dinámica (cian) de vNAR V19. Figura 23: Valores de RMSD medidos durante la simulación de 20 ns para vNAR V32R. El eje Y representa el RMSD y el eje X el número de paso de la dinámica (cada paso son 2 picosegundos).

Figura 24: Fluctuaciones medias de los residuos de vNAR V32R. En el eje Y se representa el valor de RMSD y en el eje X el número de residuo.

Figura 25: Imagen de la estructura de vNAR V32R donde se indica mediante código de color las fluctuaciones observadas durante la dinámica, yendo del rojo las regiones con mayor movilidad, al azul las más estáticas.

Figura 26: Superposición de la estructura inicial de V32R (gris) sobre la estructura final de la dinámica (en cian) con las regiones más móviles resaltadas en azul oscuro.

Figura 27: Valores de energía libre de unión para cada instante de la dinámica de vNAR V32R (cada paso son 2 picosegundos). El eje Y muestra la energía global en kcal/mol y el eje X el número de paso de la dinámica.

Figura 28: Densidad de los valores de la energía alcanzados por vNAR V32R durante la dinámica. En el eje Y se muestra la densidad y en el eje X el valor de energía global en kcal/mol. La línea punteada representa la función de Gauss asociada a la distribución.

Figura 29: Modelo 1 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V19 (cadena en magenta).

Figura 30: Modelo 2 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V19 (cadena en magenta).

Figura 31 : Modelo 3 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V19 (cadena en magenta).

Figura 32: Modelo 4 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V19 (cadena en magenta).

Figura 33: Modelo 5 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V19 (cadena en magenta).

Figura 34: Mapa de Interacciones para el complejo control (2Z8V). En la imagen se muestran las interacciones entre el homólogo de V19 (cadena D representada en la vertical) y su receptor (cadena A representada en la horizontal). La escala de colores es en función del valor de la energía de interacción: cuanto más rojo es la representación más favorable es la interacción y cuanto más azul menos favorable.

Figura 35a, 35b, 35c, 35d, 35e: Mapa de Interacciones para los complejos VEGF-V19. En la imagen se muestran las interacciones entre V19 (cadena C representada en la vertical) y su receptor (cadena A y cadena B representada en la horizontal). La escala de colores es en función del valor de la energía de interacción: cuanto más rojo es la representación más favorable es la interacción y cuanto más azul menos favorable.

Figura 36: Modelo 1 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V32R (cadena en magenta).

Figura 37: Modelo 2 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V32R (cadena en magenta).

Figura 38: Modelo 3 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V32R (cadena en magenta).

Figura 39: Modelo 4 del complejo VEGF (cadenas en verde y cian) con vNAR V32R (cadena en magenta).

Figuras 40a, 40b, 40c, 40d: Mapa de Interacciones para los complejos VEGF-V32R. En la imagen se muestran las interacciones entre V32R (cadena C representada en la vertical) y su receptor (cadena A y cadena B representada en la horizontal). La escala de colores es en función del valor de la energía de interacción: cuanto más rojo es la representación más favorable es la interacción y cuanto más azul menos favorable.

Figura 41 : Puentes disulfuro de VEGF.

Figura 42: Puentes disulfuro de vNAR V19.

Figura 43: Puentes disulfuro de vNAR V32R.

Figura 44: Alineamiento múltiple de secuencias.

Figura 45: Representación de las CDRs (en magenta) de V19 (amarillo) unido a VEGF (verde)

Figura 46: Interacciones más importantes de la zona de CDRs de V19 con VEGF. a) ARG101 de

V19 con GLU17 de VEGF. b) GLU103 con ARG10.

Figura 47: Representación de las CDRs (en magenta) de V32R (amarillo) unido a VEGF (verde). Figura 48: Interacciones más importantes de la zona de CDRs de V32R con VEGF. a) GLU98 de V32R con ARG43 y GLN24 de VEGF; ARG91 con GLN24 y ASP21; HIS90 con PHE23; ARG91 con ASP21. b) LYS95 de V32R con GLU25 de VEGF; ARG100 con GLU54; TYR104 con CYS55.

Figura 49: Gradiente teórico en el repliegue in si tu (On-column refolding) Plantilla de aplicación HisTrap. Tiempo de separación total = 160 min + tiempo de aplicación de la muestra.

Figura 50: Diseño de experimento. Se muestran las concentraciones de anticuerpo vNAR analizadas en una placa para ELISA de 96 pozos (A-H filas, 1-12 columnas necesarias para cuadruplicados), al igual que los controles positivos y negativos empleados a lo largo del experimento.

Figura 51 : Histogramas representando la media más la desviación estándar del área bajo la curva del análisis de longitud de tubo en presencia de los anticuerpos empleados: (A) Anticuerpo de referencia*; (B) V13**; (C) V32R; (D): V19. *Ranibizumab (Genentech/Roche). **Clona referida en la patente US 8,496,933.

Figura 52: Histogramas representando la media más la desviación estándar del área bajo la curva del análisis de puntos de ramificación en presencia de los anticuerpos empleados: (A) Anticuerpo de referencia*; (B) V13**; (C) V32R; (D): VI 9. *Ranibizumab (Genentech/Roche). **Clona referida en la patente US 8,496,933.

Figura 53: Imágenes representativas del efecto del VEGF y del anticuerpo vNAR V32R en la formación de redes. Los controles no tratados (A) muestran mínima formación de tubos en el curso de 14 días de ensayo. El tratamiento con 4ng/mL de VEGF muestra el incremento en la formación de tubos (B) con respecto al control. Se observa que a mayor concentración del anticuerpo V32R disminuye la formación de tubos (C-H).

Figura 54: Imágenes representativas del efecto del VEGF y del anticuerpo vNAR V19 en la formación de redes. Los controles no tratados (A) muestran mínima formación de tubos en el curso de 14 días de ensayo. El tratamiento con 4ng/mL de VEGF muestra el incremento en la formación de tubos (B) con respecto al control. Se observa que a mayor concentración del anticuerpo V19 disminuye la formación de tubos (C-H).

Figura 55: Imágenes representativas del efecto del VEGF y del anticuerpo vNAR V13* en la formación de redes. Los controles no tratados (A) muestran mínima formación de tubos en el curso de 14 días de ensayo. El tratamiento con 4ng/mL de VEGF muestra el incremento en la formación de tubos (B) con respecto al control. Se observa que a mayor concentración del anticuerpo V13 disminuye la formación de tubos (C-H). *clona referida en la patente US 8, 496,93.

Figura 56: Imágenes representativas del efecto del VEGF y del anticuerpo de referencia* en la formación de redes. Los controles no tratados (A) muestran mínima formación de tubos en el curso de 14 días de ensayo. El tratamiento con 4ng/mL de VEGF muestra el incremento en la formación de tubos (B) con respecto al control. Se observa que a mayor concentración del anticuerpo de referencia disminuye la formación de tubos (C-H). * Ranibizumab (Genentech/Roche). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la generación de anticuerpos monoclonales terapéuticos de tiburón conocidos como IgNAR (por las siglas en inglés de new antigen receptor) que se componen de cadenas pesadas propias de las inmunoglobulinas, específicamente la presente invención se refiere a la selección de los dominios variables (vNAR) de estas cadenas pesadas, y que en este caso se caracterizan por su capacidad para reconocer a la citocina conocida como factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Los vNARs resultan de interés en el campo de la biotecnología debido a sus propiedades biológicas y biofísicas, los productos vNAR son altamente resistentes a las condiciones ambientales, y tienen una alta capacidad de acción terapéutica vía tópica. Junto con los dominios variables derivados de inmunoglobulinas de camellos (conocidos como VHH), los vNARs son las moléculas biológicas más pequeñas capaces de reconocer antígenos. Debido a estas propiedades los vNARs superan la mayoría de las desventajas e inconvenientes de la terapia convencional con anticuerpos monoclonales. La presente invención se refiere a la selección, aislamiento y purificación de proteínas que pertenecen a regiones variables denominadas V_HNAR ó vNAR propias de las inmunoglobulinas tipo IgNARs receptoras de antígenos y que provienen de elasmobranquios; las clonas de las cuales derivan se les denomina VEGFvNAR V32R y V 19, y a los anticuerpos respectivos se les denomina V32R y V19 (indistintamente definidas también como v 19 ó v32R).

La presente invención se refiere también al desarrollo de productos biofarmacéuticos basados en vNARs que bloquean el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), ya que poseen una alta afinidad y muy específica por el VEGF, estas moléculas que se han generado se han sometido a diversos protocolos de aislamiento y purificación y se han caracterizado por sus propiedades intrínsecas como lo son su secuencia y su estructura tridimensional, así como por su capacidad de reconocimiento y afinidad por su molécula diana que se traduce en una capacidad neutralizante más eficiente que la de moléculas relacionadas.

Los vectores utilizados para la selección de las clonas son: pCOMb3X, con resistencias a Carbenicilina y Ampicilina. La cepa de obtención es ER2537 y las cepas de expresión utilizadas fueron la TOP10F^' y BL21 (DE3) la cual fue seleccionada para expresión, debido a que su deficiencia en proteasas contribuye a mejorar los rendimientos. En el ejemplo 1 se describe la obtención del banco de genes de especímenes inmunizados mediante despliegue en fagos de donde se originan las clonas V19 y V32R, así como la V13 descrita en el estado del arte y que se utilizó como comparativo a lo largo de la caracterización de V19 y V32R. Las técnicas ELISA se realizaron con proteína vNAR seleccionada del espacio periplásmico expresada en TOP10F^'. A partir de los resultados obtenidos en los ELISA de expresión y de reconocimiento para vNAR anti-VEGF, se seleccionaron las clonas con afinidad para el VEGF y se procedió a la obtención de las secuencias de cada una de ellas.

Con el propósito de demostrar que las nuevas clonas no son un artificio de laboratorio y que en realidad comprenden anticuerpos diferenciados que aportan una ventaja técnica sorprendente e inesperada frente al estado de la técnica, se ha incluido también la caracterización de la clona VI 3 - descrita anteriormente en la publicación de patente US 8,496,933 - y se ha sometido a los mismos protocolos de aislamiento y purificación realizados ahora durante el desarrollo de la invención para que sea comparada.

La secuencia de DNA que codifica para la proteína de la clona 13 específica para VEGF es la siguiente (identificada como SEQ. ID. NO. 1 en el listado de secuencias. En el ejemplo 4 se describe la metodología para la obtención de las secuencias:

GCAAGCCTGGACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACAGGCGAATCCCTGAGCATTAACTG CGTCCTCACTGATACTAGCCATATTTTGTTCGGCACAAAATGGCTCTGGAATAATCCGGGTTCAA CAGAT T GGGAAAGC AT AAC GAT T GGCGGAC GAT AT GCTGAAT C AGT C AAC AAC C AAGC AAAGT C A T T T T C T CT GC AAAT C AAGGACC T GACAGT T GAAGAC AGT GGC ACC T AT TAC T GC AAGCGC AAAC CATAGGAAGACGCAAAAATCTACTTCCACGCCCATTGGTGAACGGTATAGCTGCGATGGGGTATA GCTCCAGT GAC TAC GACGGAGC TGGCACCGTGCT GAC T GT GAAC

La clona V13 resultante tiene una alta especificidad por el VEGF humano, su secuencia aminoacídica es la siguiente (identificada SEQ. ID. NO. 2 en el listado de secuencias):

ASLDQT PRTA TRETGESLS I NCVLTDT SHI L FGTKWLWNN PGSTDWES I T I GGRYAESVN NQAKS FSLQI KDLTVEDSGT YYCKAQT IGR RKNLLPRPLV NGIAAMGYS S SDYDGAGTVL TVN

En la figura 1 se presenta la secuencia de la proteína vNAR V13 anti-VEGF, descrita en la patente US 8,496,933 indicando los dominios conservados. La Clona V19 fue seleccionada de la ronda 4 del panning contra la citocina VEGF₁₆5 de las especie Orectolobus maculatus.

La secuencia de ADN plásmido de la clona V 19 (418 pb) es la siguiente y corresponde a la SEQ. ID. NO. 3:

CAACGGGTTGAACAAACACCAAGAACAGCAACAAAAGAGACGGGCGAATCACTGACCATCAACTG CGTCCTAAGAGATGCTAGTTTTGAATTAAAAGACACGGGCTGGTATCGGACAAAATTGGGTTCAA CAAATGAGCAGAGTATATCAATTGGCGGACGATATGTTGAAACAGTCAACAAGGGATCAAAGTCC TTTTCTCTGAGAATTAGTGATCTGAGAGTTGAAGACAGTGGCACGTATAAGTGTCAAGCATTCTA TTCTCTTCCGTTGGGCGATTACAACTATTCTCTGCTGTTTAGGGGTGAGAAAGGAGCTGGCACCG TGCTGACTGTGAAC

La secuencia de aminoácidos para la vNAR19 (VI 9) corresponde a la SEQ. ID. NO. 4:

AQRVEQTPRTATKETGESLTINCVLRDASFELKDTGWYRTKLGSTNEQSISIGGRYVETVNKGS KSFSLRISDLRVEDSGTYKCQAFYSLPLGDYNYSLLFRGEKGAGTVLTVN

La secuencia de ADN plásmido de la clona V32R (421 pb) es la clona V32R fue seleccionada de un esquema de inmunización de la especie Heterodontus francisci empleando la ronda 4, su secuencia de ADN (421 pb) es la siguiente y corresponde a la SEQ. ID. NO. 5:

GCAAGCCTGGACCAAACACCAAGAACGGCAACGAGAGAGACGGGCGAATCCCTGACCATTAACTG CGTCTTCACTGATTCTAGCTGTGGTTTGTGCGGCACATCTTGGTTCCGGAATAATCCGGGTTCAA CAGATTGGGAACGCATAACGATTGGCGGACGATATGTTGAATCAGTCAACAAGGGAGCAAAGTCA TTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTGACAGTTGAAGACAGTGTCACCTATTACTGCAAAGCGCAAGG TCATCGATACTTCAGTAAGGTGTGCGAGCTGCGATGTCCCAGTTACTACTACGACGGAGCTGGCA CCGTGCTGACTGTGAAC

La secuencia de aminoácidos de vNAR v32R corresponde a la SEQ. ID. NO. 6:

AASLDQTPRTATRETGESLTINCVFTDSSCGLCGTSWFRNNPGSTDWERITIGGRYVESVNKGAK SFSLQIKDLTVEDSVTYYCKAQGHRYFSKVCELRCPSYYYDGAGTVLTVN

En la figura 2 se muestra un alineamiento entre las secuencias correspondientes a las clonas V13, V32R y VI 9, como referencia, e indicando las diferencias de las mismas. Con la finalidad de mejorar los rendimientos anteriormente obtenidos, durante el desarrollo de la invención se llevaron a cabo diferentes análisis y métodos de expresión y purificación con el fin de detectar y obtener las mejores condiciones de expresión y de purificación de las proteínas, así como la valoración posterior del desempeño de cada una de las clonas obtenidas para unir y neutralizar al VEGF.

Se realizó la síntesis de genes que codifican el anticuerpo VEGFvNAR fusionado en su extremo carboxi-terminal a las secuencias codificadoras de los tags 6His y HA. La característica fundamental de esta síntesis fue la optimización de codones para la expresión posterior en Escherichia coli. Los genes sintéticos se clonaron en 2 plásmidos bacterianos. Estos se utilizaron para transformar células competentes de E.coli cepa DH5a. En la tabla 1 se muestran las construcciones ensayadas para cada una de las secuencias VI 3, V19 y V32R.

Tabla 1 : Construcciones para expresión en E. coli

VEGFvNAR 1 SP-VEGFvNAR ORF-6His-HA

VEGFvNAR 2 VEGFvNAR ORF-6His-HA

VEGFvNAR 3 SP-VEGFvNAR-ORF

VEGFvNAR 4 VEGFvNAR-ORF

Los plásmidos de expresión utilizados para generar estas construcciones, figura 3A y 3B, son pET20b+ (vNAR 1 y 3) y pET28a+ (vNAR 2 y 4). Para el sub-clonaje de la secuencia de interés en un vector que incluye péptido señal pelB. Clonaje de VEGFvNAR en un vector de expresión bacteriano (pET20b+) se realizó la amplificación más el aislamiento del Marco Abierto de Lectura (ORF) del anticuerpo recombinante a partir del gen sintético mediante PCR con oligonucleótidos específicos. Mediante el uso de enzimas de restricción el fragmento amplificado se subclonó en un vector de expresión bacteriano seleccionado específicamente y que contiene la señal pelB que direccionará la proteína al periplasma una vez expresada ésta. Los clones obtenidos después de transformar la mezcla de ligación (plásmido+inserto) en células competentes de E.coli cepa DH5a. Para el sub-clonaje de la secuencia de interés en un vector que no incluye péptido señal pelB. El clonaje de VEGFvNAR en un vector de expresión bacteriano (pET28a+) se realizó en paralelo y se realizó un segundo subclonaje del anticuerpo a partir del mismo molde cDNA sintetizado que ha sido utilizado para el clonaje anterior, pero esta vez sin incluir al péptido señal, con la finalidad de dirigir la totalidad de la proteína al citoplasma celular.

En ambos casos, tanto con pET20b+ como con pET28a+, se individualizaron los transformantes obtenidos mediante selección en cultivo sólido (Agar LB/Ampicilina) y se seleccionan 2 transformantes por construcción genética para su conservación y su análisis de DNA plasmídico mediante secuenciación, como método de confirmación.

Con los DNAs recombinantes purificados del punto anterior se procedió a la transformación en una línea de E. coli apropiada para la expresión de proteínas, un cepa que es deficiente en proteasas, la cepa BL21 (DE3), como ya se ha mencionado. Los clones obtenidos se individualizaron y nuevamente se confirmó su naturaleza mediante colony-FCR y electroforesis en geles de agarosa.

Con los clones positivos se evaluó la expresión de proteína a pequeña escala a partir de 50 mi de cultivo bacteriano a dos temperaturas (30°C y 37°C) y dos tiempos de duración de la incubación: 16 y 20 horas. Estas variables de temperatura y tiempo se estudian para obtener las mejores condiciones para la producción de las proteínas. Este ensayo piloto se basa en el uso de cultivos bacterianos en medio líquido a partir de los clones productores en E.coli BL21 (DE3) y del inductor de la expresión IPTG. El cultivo se procesa mediante centrifugación separando las células del medio de cultivo. Las células son tratadas para obtener la fracción periplásmica, por un lado, mediante un choque osmótico mediado por sacarosa; y por otro, son lisadas con lisozima, detergente y sonicación para extraer de ellas componentes intracelulares solubles e insolubles separados entre sí mediante centrifugación. El esquema del proceso está en la figura 4 y la metodología se menciona en el ejemplo 3.

En esta etapa se analizaron los niveles de expresión de la proteína recombinante de interés en cada una de las diferentes fracciones celulares (proteína secretada al medio de cultivo, periplasma, citoplasma y cuerpos de inclusión) con el fin de valorar la cantidad de proteína en cada fracción celular y determinar después su funcionalidad, es decir, el reconocimiento o unión específica por parte de la proteína obtenida a partir de cada fracción a la proteína hVEGF.

Se llevaron a cabo las construcciones para todas las clonas con y sin péptido señal, y se conservaron en todas ellas las colas de histidinas y HA. De cada una se evaluaron sus niveles de expresión.

Se analizaron las distintas localizaciones de las proteínas vNARs, ya sea secretada, o bien intracelular ya sea en fracciones soluble o bien insoluble; los resultados que se presentan en la tabla 2 corresponden a los niveles de expresión de los vNAR. En estos queda de manifiesto que las proteínas vNAR se expresan conformando cuerpos de inclusión lo cual implica que se presenten en la fracción citoplásmica insoluble.

Uno de los mejores candidatos considerados inicialmente fue el VEGFvNARl extracelular. Esto se identificó por electroforesis, pero posteriormente al realizar una prueba de afinidad, mediante ELISA, se vio que esta fracción proteica no tenía casi afinidad por su molécula diana, mientras que la fracción más activa era la citoplasmática insoluble.

En el ejemplo 2 se describe de manera general la obtención de las clonas productoras BL21 (DE3) y su tratamiento posterior hasta la realización de las pruebas Western-Blot y ELISA para medir el reconocimiento de cada vNAR expresado previamente purificado.

En el ejemplo 3 se describen los protocolos para obtención de las fracciones subcelulares: periplásmica, extracelular, citoplasmática soluble, citoplasmática insoluble correspondiente a los cuerpos de inclusión. En cada una de estas fracciones se determinaron las concentraciones de proteína, así como del análisis por Western-Blot. Los resultados se muestran en las figuras 5 a 8. De los resultados obtenidos se pudo concluir que la presencia del péptido señal no mejora la expresión en ninguna de las fracciones, e incluso su ausencia mejoró las concentraciones obtenidas de los diferentes vNARs presentes en la fracción citoplásmica insoluble como cuerpos de inclusión.

Ya que las proteínas vNARs activas obtenidas por los métodos recombinantes descritos se encontraron conformando cuerpos de inclusión, la investigación realizada durante el desarrollo de la invención se dirigió a disolverlas aplicando métodos alternativos específicos con el objetivo de desagregar las proteínas y obtenerlas puras, y solubles, sin que con los procedimientos se comprometa su capacidad de unión a la molécula blanco.

Con la finalidad de mejorar los rendimientos anteriormente obtenidos, durante el desarrollo de la invención se llevaron a cabo diferentes análisis y métodos de expresión y purificación con el fin de detectar y obtener las mejores condiciones de expresión y de purificación de las proteínas, así como la valoración posterior del desempeño de cada una de las clonas obtenidas para unir y neutralizar al VEGF.

Tabla 2: Niveles de Expresión vNAR V13

El primer método de purificación utilizado, para la molécula V 13, fue el método conocido como On-bench refolding que básicamente consiste en los siguientes pasos: 1) lisis celular mediante sonicación, 2) aislamiento de los cuerpos de inclusión, 3) solubilización con buffers de urea, 4) purificación mediante columnas de afinidad o de metal ion inmovilizado (TALON™), 5) repliegue con buffers que incluyen el sistema Glutation redox (GSH, G-S-S-G), y 6) elución de la proteína solubilizada y replegada mediante su pase por cromatografía de afinidad (His Trap) usando aquí buffers no desnaturalizantes.

El método alternativo, incluido en la presente solicitud, se conoce como On-column refolding (o repliegue in situ) que consiste en los siguientes pasos: 1) lisis celular mediante sonicación, 2) aislamiento de los cuerpos de inclusión, 3) solubilización con cloruro de guanidina, y purificación de la proteína mediante cromatografía en columnas His-Trap y de repliegue en columna utilizando buffers desnaturalizantes de urea y 4) elución de la proteína solubilizada y replegada. Con ambos métodos los vNARs se someterían a una desnaturalización y posteriormente a un proceso de repliegue para volver a adquirir su conformación terciaria, tal y como se describe más adelante de manera detallada.

Para llevar a cabo el procesamiento mediante la técnica On-column refolding, se inició a partir de un plásmido que contiene la secuencia de interés optimizada para la expresión en E.coli. Se utilizó un diseño consistente en un marco de lectura abierto (open reading frame (ORF)) que codifica una proteína de fusión formada por los anticuerpos vNAR y 6 tags de HIS y HA. Estos tags fusionados a la molécula de interés son necesarios ya que permite tanto un seguimiento de la producción del sistema biológico de expresión, así como como su posterior purificación, en este caso mediante procedimientos estandarizados, la presencia de estos tags no interfiere de ninguna manera con el desempeño de las moléculas y se eliminan más adelante en la tapa de producción.

El método de On-Colum Refolding es un proceso de purificación mediante cromatografías de afinidad por metales inmovilizados, se utilizan resinas de afinidad específicas para proteínas fusionadas con 6xHis, en este caso la proteína de interés se encuentra en una fracción insoluble. Antes del proceso On-Colum Refolding la proteína se somete a solubilización con Cloruro de Guanidina. Durante el proceso On-colum Refolding, la muestra de proteína desnaturalizada es inyectada en la columna donde queda retenida por afinidad mientras se mantiene el tampón de unión (Al), ver ejemplo 5. Tras el cambio a tampón de solubilización (A2) comienza el gradiente de refolding hasta alcanzar el 100%. En este punto el proceso de refolding de las proteínas ha concluido. Posteriormente este tampón es sustituido progresivamente por tampón de elución (A3) que provoca la liberación de las proteínas unidas hasta entonces a la columna de afinidad. Finalmente las fracciones eluídas que contienen proteína se analizan en geles de electroforesis de acrilamida-SDS para estudiar su tamaño y composición.

Las fracciones de 1 mi, que presentan Absorbancia a 280nm, son las formas solubilizadas y fijadas por afinidad a la columna son replegadas in si tu y posteriormente eluídas por adición de imidazol en distintas fracciones. Las proteínas eluídas sometidas a este sistema de cromatografías se analizan mediante electroforesis en geles de acrilamida (15μί de cada fracción) y por Western-Blot para verificar su naturaleza. Las muestras así recuperadas se encontraron en el tampón 20mM Tris HC1, 0.5M NaCl, lmM β -mercaptoetanol, 0.3M imidazol, lOOmM L-Arginina. Los resultados de este procesamiento se describen en las figuras 9 a 12.

Seguidamente se llevó a cabo la validación funcional de los vNAR anti-VEGF mediante el análisis de sus propiedades de unión a su molécula diana que es el VEGF A humano isoforma 165. Los análisis que se llevaron a cabo para esta validación funcional fueron ELISA, Dot-blot, Western-Blot y Citometría de flujo, Inmunofluorescencia e Inmunohistoquímica.

Como se puede ver, la proteína que refleja mayor afinidad sería V32R y todas son superiores en afinidad a la molécula V13 descrita en la patente US 8,496,933 otorgada. Comparando la misma molécula V13 con 2 procesamientos diferentes se observa la mejora que supone el "nuevo" método aplicado. Los resultados de las pruebas ELISA se muestran en la figura 13. Los resultados del análisis por Western-Blot se muestran en la figura 14.

En la figura 14 se muestra de manera comparativa las cantidades de proteína que reconocen al VEGF de los vNAR de la invención V19 y V32 frente al obtenido V13. Ambas proteínas nuevas, V19 y V32R, poseen una afinidad y capacidad de reconocimiento significativamente superior a V13.

Las moléculas vNAR anti-VEGF han resultado optimizadas y sus propiedades de afinidad han sido incrementadas de manera notable, por lo que sus capacidades neutralizantes se han incrementado, y la cantidad de vNAR necesaria para neutralizar al VEGF es menor. Véase ejemplo 10.

Resumiendo, en la prueba de afinidad se encontró que las nuevas moléculas diana obtenidas son superiores en afinidad y actividad a la obtenida en la patente US 8,496,933.

También se realizó la validación funcional de las vNARS purificadas y replegadas mediante ensayos por citometría de flujo, para lo cual se utilizó la línea celular U937 que son monocitos de la línea mieloide y expresan diferentes citocinas y quimiocinas, el hVEGF se expresa de manera constitutiva y se secreta. Esta línea celular es un modelo de uso común en las ciencias biomédicas. Se determinó la capacidad de unión de los vNAR anti VEGF VI 3, V19 y V32R a nivel intracelular. El ensayo se describe en el ejemplo 6. Los resultados para V13 se muestran en las figuras 15 y 16.

Las moléculas que se proporcionan en la presente invención fueron caracterizadas in sílico. Se prepararon las estructuras tridimensionales (terciarias) mediante modelado por homología y refinamiento a través de simulaciones de dinámica molecular. La búsqueda de estructura óptima se llevó a cabo a través de tres filtros sucesivos: 1) la agrupación de complejos en función de su patrón de contactos; 2) el análisis energético preliminar de los mejores representantes de cada grupo; y 3) la dinámica molecular de los 2 complejos proteína - proteína con mejor energía para encontrar el modo de unión más estable. Sobre la estructura óptima se analizó el patrón energético de las interacciones.

A modo de control se analizó la interacción de un homólogo muy cercano de V19 con la proteína AMA1 (código PDB: 2Z8V) ¹⁸ que proporcionó una energía libre de unión de referencia para este tipo de interacciones. En el caso de las moléculas V19 y VEGF la estructura óptima se realizó a partir de las estructuras cristalográficas homologas existentes, ya publicadas, en este caso sólo se modelaron los residuos que faltaban y se relajaron las estructuras resultantes mediante dinámica molecular. El tiempo de simulación que se utilizó fue de 5-6 ns. La estructura de la proteína V 19 se derivó de la estructura cristalina de PDB, código: IVES¹⁹, mutando la Alanina I l l a Valina. El cristal de la proteína VEGF se obtuvo a partir del PDB, código 1VPF²⁰.

Se midió el valor de RMSD (Root-mean-square deviation) de las proteínas, respecto a la estructura de partida, a lo largo de la dinámica con el fin de evaluar la estabilidad de dicha estructura. Cuanto menor es el valor de RMSD más estable resulta. La medición se llevó a cabo tanto a nivel global, como a nivel de residuo.

Una vez analizadas las estructuras se obtuvieron los complejos proteína - proteína. Para ello, se realizaron varios análisis de docking proteína - proteína de cada complejo (VEGF -V 19 y VEGF- V32R), en los cuales se evaluaron diferentes zonas de unión y orientaciones hasta determinar la óptima.

VEGF

Los valores globales de fluctuación (RMSD) a lo largo de la dinámica no sobrepasaron los 2 Á (Fig.17), pero hubo bastantes fluctuaciones alrededor de este valor. El sistema es un dímero formado por dos grupos de láminas β unidos por hélices α de una o dos vueltas. Estos motivos estructurales son muy móviles, lo que producen las fluctuaciones citadas.

En general los valores de fluctuación por residuo no superaron los 2 Á (Fig.18), exceptuando los loops de interconexión de las láminas β, que se encuentran aproximadamente cada 25 residuos. Dado que es un dímero, el patrón de fluctuaciones se repitió para ambas subunidades.

La superposición de la estructura inicial con la estructura promedio minimizada de los últimos 500ps de simulación coincide (Fig.19).

V19

Con respecto a la fluctuación global, el sistema resultó estable, los valores globales de RMSD a lo largo de la dinámica no sobrepasaron los 2 Á. (Fig.20) La estructura de V19 consta de varias laminas β unidas por loops, la movilidad de estos loops y su reorientación al solvente son lo que hace que el RMSD de la proteína fluctúe.

La fluctuación por residuo fue baja (Fig.21), no superando, en general, los 2 Á, a excepción de la zona comprendida entre los residuos 85-100, donde se alcanzan valores de hasta 4Á. Dicha zona corresponde a la región variable del anticuerpo, formada por 2 láminas β interconectadas por un loop; posee alta flexibilidad y es la zona de reconocimiento para la unión a otras proteínas.

Superponiendo la estructura inicial con la estructura promedio minimizada de los últimos 500ps de simulación se observó similitud entre las estructuras exceptuando el loop mencionado anteriormente, situado entre los residuos 85-100. (Fig.22) V32R

Se realizó el modelado por homología y se refino mediante dinámica molecular. Se partió de un modelo basado en las estructuras 2Z8V¹⁸ y 2I26²¹, con un tiempo de simulación de 20ns. Se midió el valor de RMSD a lo largo de la dinámica, respecto a la estructura de partida, con el fin de evaluar la estabilidad de dicha estructura, tanto a nivel global como de residuo.

La fluctuación global alcanzó los 4 Á. En los primeros nanosegundos el modelo se alejó de su estructura inicial para mantenerse estable durante el resto de la simulación. (Fig.23)

La fluctuación por residuo mostró fluctuaciones importantes en dos regiones: la comprendida entre los residuos 40-50 y la comprendida entre los 90-110 que alcanzó valores de más de 4 A. Una vez producido el desplegamiento del loop, correspondiente a los residuos 90-110, la proteína se mantuvo estable. El resto de fluctuaciones se acumularon en los loops que conectan las láminas β, así como en el extremo C-terminal (ver Fig. 24).

En la Figura 25 se muestra una imagen donde se representan las zonas más móviles de vNAR V32R. En la superposición de las estructuras inicial y la promedio minimizada de los últimos 500ps se observó que las dos estructuras son similares. Detectándose fluctuación en los residuos G89-Y105 y R39-R49 (Fig. 26). El análisis energético de V32R muestra que el valor energético más probable para la molécula es de -3250 Kcal/mol (Fig. 27 y 28).

Docking proteína-proteína Los modelos de interacción se generaron usando técnicas de docking proteína-proteína. Los resultados obtenidos se filtraron con el fin de encontrar las diferentes zonas de unión y la orientación óptima. Los pasos de filtrado fueron:

1) Agrupación de complejos en función de su patrón de contactos y eliminación de las soluciones en las cuales los vNARs no interaccionase con VEGF por la zona del loop de reconocimiento del anticuerpo. 2) Estudio de la electrostática de receptor y ligando mediante cálculos de APBS (Adaptive Poisson-Boltzmann Solver) y eliminación de aquellas soluciones en las que se observase choques electrostáticos.

3) Análisis energético preliminar de los mejores representantes de cada grupo. Cálculo de la energía de los modelos restantes y corrección de su valor en función de la superficie de contacto entre ambas proteínas.

4) Selección de los modelos a estudiar en base a los siguientes criterios:

• Los valores de energía total (kcal/mol)

« La energía de Van der Waals

• La energía de Van der Waals junto con la de los puentes de hidrógeno.

Docking proteína-proteína V19-VEGF Después de este proceso de filtrado se obtuvieron 5 modelos de unión (Figs. 29-33) y se aplicó dinámica molecular a los mismos, con el fin de estudiar su estabilidad estructural, energética y su mapa de contactos.

Comparativa energética respecto al modelo de control

Con el fin de tratar de elegir los modelos que mejor representasen el modo de unión entre VEGF y VI 9, se hizo un estudio comparativo de la energía de interacción de cada uno teniendo como referencia el complejo control (homólogo de V19 en el cristal de 2Z8V). Los valores de energía se corrigieron en base a la superficie de interacción, ya que al calcularse la energía como un sumatorio, existía una correlación importante entre los valores obtenidos y la superficie implicada. Por otro lado, la energía total se compone de un término coulómbico, otro asociado a las fuerzas de Van der Waals y se completa con la fuerza de los puentes de hidrógeno. Para el caso del complejo AMA1 - homólogo de V19, se vio que a la hora de seleccionar las interacciones reales de las artefactuales, fue más discriminante prescindir del término coulómbico en la evaluación energética, por lo que se presenta también esa descomposición en la Tabla 3 de resultados. En la tabla 3 se indica la energía (kcal/mol) de interacción de los modelos elegidos para el complejo VEGF-V19. Los valores de energía y de superficie ocluida han sido calculados para la estructura promedio minimizada de los últimos 500 ps de la dinámica. (¾_otai: energía total; E^_w: energía de Van der Waals; E_HB: energía de puentes de hidrógeno; SASA: área de superficie accesible al solvente).

Tabla 3: Energía (kcal/mol) de interacción de los modelos elegidos para el complejo VEGF-V32R.

MODELOS £_tóta¡ E_vdw E_H8 SASA E_t(rt3¡/SASA E SASA E_V(twtHfJSASA control ■ $4 .ew ■101.30 ^■19.4? 893.50 0 i 61? 0.113-1 0,1351 modelo 1 -139.50 -89,09 -11.03 929.70 0,1500 0.0958 0.1077 modelo 2 -62.S& -55.69 -5.83 669.70 0,0939 0.0832 0.0919 modelo 3 -63.17 -50.18 -7.74 446.80 0,1414 0.1123 0.1296 modelo 4 -10036 -76.29 -11.58 794.10 G.12S4 0.0961 0.1107 modelo 5 -97.58 -83.25 -10.12 912.80 0.1069 0.0912 0.1023

A la vista de los datos obtenidos, y con la estabilidad estructural que fue estudiada en los apartados anteriores, se descartó el modelo 2 como modo de unión entre VEGF y vl9.

Comparativa de contactos respecto al modelo de control

A continuación, en la figura 34, se muestran las matrices de contactos de cada uno de los modelos para ser comparadas con los contactos del complejo control (homólogo de V 19 en el cristal de 2Z8V). A la vista de las interacciones entre el homólogo de V19 y su receptor en el cristal podemos decir que se observan tres zonas de interacción en VI 9: la zona 1, que corresponde al extremo X-terminal (residuos 1-2); la zona 2, comprendida entre los residuos 25- 35, la cual se corresponde al loop de reconocimiento secundario y la zona 3, que implica a los residuos entre las posiciones 89 y 103 y que se corresponde con el loop principal de reconocimiento.

En el caso de los mapas de interacción de los modelos del complejo VEGF-V19 (Figura 35a-35e) se confirmó la repetición esperada de las zonas de unión vistas para V 19 en el complejo control. Con todos los datos obtenidos, junto al patrón de fluctuaciones, se demostró que el modelo de nuestra molécula correspondía con el MODELO 1 (Fig.29), ya que es el que dispuso de mejor estabilidad estructural y energía de interacción a lo largo de toda la simulación, además de tener un patrón de contactos similar al visto en el complejo control (homólogo de vNAR V19 con AMA1).

Docking proteína-proteína vNAR V32R - VEGF Se aislaron 4 modos de unión entre VEGF y vNAR V32R (Figs. 36-39) que abarcan las principales orientaciones. Se analizaron sus energías a lo largo de dinámicas moleculares de 20 ns con el fin de determinar su estabilidad estructural y energética, así como su mapa de contactos. Para ello, en primer lugar partimos de las estructuras obtenidas tras refinar VEGF y vNAR V32R. Posteriormente los modelos de interacción se generaron usando técnicas de docking proteína- proteína. Los resultados obtenidos se filtraron con el fin de encontrar las diferentes zonas de unión y la orientación óptima siguiendo el mismo protocolo que en el caso anterior.

Comparativa energética respecto al modelo de control Con el fin de elegir los modelos que explicasen el modo de unión entre VEGF y V32R, se realizó un estudio comparativo de la energía de interacción de cada uno, teniendo como referencia el complejo control (homólogo de V19 en el cristal de 2Z8V). Los valores de energía fueron corregidos en base a la superficie de interacción, ya que al calcularse la energía como un sumatorio, existe una correlación importante entre los valores obtenidos y la superficie implicada. Por otro lado, la energía total se compone de un término coulómbico, otro asociado a las fuerzas de Van der Waals y se completa con la fuerza de los puentes de hidrógeno. Para el caso del complejo AMA1 - homólogo de VI 9, se comprobó que a la hora de seleccionar las interacciones reales de las artefactuales, era más discriminante prescindir del término coulómbico en la evaluación energética, por lo que se reiteró en este caso este tipo de descomposición. En la tabla 4 se indica la energía (kcal/mol) de interacción de los modelos elegidos para el complejo VEGF- V32R. Los valores de energía y de superficie ocluida han sido calculados para la estructura promedio minimizada de los últimos 500 ps de la dinámica. (E_totai: energía total; E_vdw: energía de Van der Waals; E_HB: energía de puentes de hidrógeno; SASA: área de superficie accesible al solvente).

Tabla 4: Energía (kcal/mol) de interacción de los modelos elegidos para

el complejo VEGF-V32R.

MODELOS EHB SASA Etot₃i/ A-»A EE íw ^S-A 5-¾ £_V<_JW+KS/SASA controi ^■ 1 4.04 ^•101 .30 ^■19.42 SÍJJ. S0 G. ibl í 0.11 34 0.1351 modelo 1 -127.05 -77.01 -15.99 827.50 0.1535 0.0930 0.1124 modelo 2 -75.10 -67.56 -6.29 655.60 0.1146 0.1030 0.1126 modelo 3 -116.-16 -63.55 -17.26 816.30 0.1427 0.0779 0.0990 modeío 4 -74.12 -48.93 -7.39 645.30 0.1149 0.0758 0.0873

A la vista de estos valores, y con la estabilidad estructural estudiada en los apartados anteriores, se descartó el modelo 4 como modo de unión entre VEGF y v32R.

Comparativa de contactos respecto al modelo de control

Al igual que en el caso del docking VI 9- VEGF, se consideran las matrices de contactos de cada uno de los modelos para ser comparadas con los contactos del complejo control (homólogo de V19 en el cristal de 2Z8V, Fig.34). En el caso de los mapas de interacción de los modelos del complejo VEGF-V32R (Figura 40a-40d) cabe esperar que se repitan las zonas de unión vistas para V19 en el complejo control. Con todos estos datos, junto al patrón de fluctuaciones, se demostró que el modelo de nuestra molécula correspondería con el MODELO 3 (Fig.38), ya que es el que se considera el óptimo en función de su estabilidad estructural y su energía de interacción. Además reprodujo el patrón de interacciones observado en el complejo control.

En base a todos los datos anteriores presentados se obtuvo información adicional que dará un soporte más amplio a la caracterización de las moléculas de la presente invención: Puentes disulfuro

A continuación se muestran los puentes disulfuro (S-S) presentes en las proteínas tratadas en el estudio. En concreto se marcan con una X en amarillo, sobre las secuencias en formato FASTA (formato basado en texto para la representación de cualquiera de las secuencias de nucleótidos o secuencias de péptidos, en el que están representados los nucleótidos o aminoácidos utilizando el código de una sola letra), las cisteínas que están formando dichos puentes disulfuro. A continuación hay una descripción por pares de cisteínas que forman el puente. La numeración de las proteínas comienza por el residuo número 1 y es continuo aunque se cambie de cadena.

VEGF

Dímero que posee tres puentes disulfuro en cada subunidad y dos puentes entre subunidades, siendo un total de 8 puentes disulfuro lo que implica 16 cisteínas (Fig. 41 y Tabla 5).

>VEGF: A | PDBID | CHAIN | SEQUENCE (SEQ. ID. NO. 7) :

1 VVKFMDVYQRSYXHPIETLVDI FQEYPDEIEYI FKPSXVPLMRXGGXXNDEGLEXVPTEE

61 SNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKXEXRPK

>VEGF: B| PDBID I CHAIN I SEQUENCE (SEQ. ID. NO. 7):

95 VVKFMDVYQRSYXHPIETLVDI FQEYPDEIEYI FKPSXVPLMRXGGXXNDEGLEXVPTEE 155 SNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKXEXRPK

Monómero formado por dos grupos de láminas beta, solo posee un único puente di-sulfuro que une los dos grupos de láminas, lo que implica dos cisteínas (22-83) (Fig. 42).

>vl9|PDBID|CHAIN|SEQUENCE (SEQ. ID. NO. 8):

1 AWVEQTPRTATKETGESLTINXVLRDASFELKDTGWYRTKLGSTNEQSISIGGRYVETVN 61 KGSKSFSLRISDLRVEDSGTYKXQAFYSLPLGDYNYSLLFRGEKGAGTVLTVK Durante la optimización de codones para la producción en E.coli se obtuvieron diferencias en los aminoácidos subrayados entre las secuencias SEQ. ID. NO. 4 y SEQ: ID: NO: 8, esto no altera su estructura, la secuencia probada en los ensayos posteriores has sido la SEQ. ID. NO. 4 por lo que es la modalidad preferida para escalamiento industrial de V 19. vNAR V32R

Monómero formado por dos grupos de láminas beta, solo posee un único puente di-sulfuro que une los dos grupos de láminas, lo que implica dos cisteínas (24-85) (Fig. 43).

>v32R| PDBIDI CHAIN I SEQUENCE ( SEQ . ID . NO . 9) :

1 MAASLDQTPRTATRETGESLTINXVFTDSSCGLCGTSWFRNNPGSTDWERITIGGRYVES 61 VNKGAKSFSLQIKDLTVEDSVTYYXKAQGHRYFSKVCELRCPSYYYDGAGTVLTVNGQAG 121 Q

Cabe aclarar que los últimos 5 aminoácidos subrayados en la SEQ. ID. NO. 9 son los que preceden a las colas de histidina y se eliminan en la producción industrial por lo que la modalidad preferida de V32R corresponde a la SEQ. ID. NO. 6. CDRS (Complementarity Determining Regions) regiones determinantes complementarias

A partir de las secuencias de los anticuerpos, se realizó una búsqueda con un servidor local de BLAST (siglas del inglés para Basic Local Alignment Search Tool) utilizando la base de datos no redundante nr. Se recuperaron aquellas secuencias con al menos un 70% de identidad respecto a alguno de los anticuerpos. Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias obtenidas mediante BLAST y las de los anticuerpos. Para ello se utilizó el software MAFFT (siglas del inglés para Múltiple Alignment using Fast Fourier Transform).

En ese alineamiento múltiple se observó cuáles son las zonas variables (relacionadas con los CDRs) e invariables de este tipo de anticuerpos. Como se puede apreciar en la Figura 44, hay zonas claramente conservadas, otras semi-conservadas (hay variaciones en el conjunto total de secuencias, pero los aminoácidos están conservados a nivel de subconjuntos, lo cual indica un origen evolutivo de estas variaciones) y finalmente las zonas variables propiamente dichas, que son las que proporcionan especificidad.

Se pueden apreciar 2 CDRs claramente diferenciados:

· CDR 1 : entre las posiciones 45 y 51

• CDR 2: entre las posiciones 105 y 139

Estas posiciones hacen referencia a la numeración global proporcionada por el alineamiento múltiple para el conjunto de secuencias.

En las Figuras 45 y 47 se muestran una visión general de la zona de CDRs de V 19 y V32R. En las Figuras 46a, 46b y 48a, 48b se muestran los detalles de algunas de las interacciones más importantes de la zona de CDRs con VEGF. Actividad antiangiogénica en un modelo in vitro

La actividad de los anticuerpos vNAR: V13 (descrito anteriormente en la publicación de patente US 8,496,933), V19 y V32R se evaluaron a través de un ensayo de angiogénesis in vitro empleando el Kit de angiogénesis CellPlayer^® . El objetivo de este estudio fue determinar si los anticuerpos V13, V19 y V32R eran capaces de inhibir la formación de vasos sanguíneos (angiogénesis) y sus diferencias, analizando los parámetros de formación y la ramificación de tubos, tomando como referencia un anticuerpo comercial (Genentech/Roche) como se describe en el ejemplo 10. De este estudio hemos podido concluir que los anticuerpos vNAR V13 (descrito anteriormente en la publicación de patente US 8,496,933), V19 y V32R son capaces de inhibir el proceso de vascularización mediado por la citocina VEGF, con una cinética de comportamiento similar a la del anticuerpo comercial (Genentech/Roche) (Figura 50-52 ). En todos los casos se observa un efecto de inhibición angiogénica dependiente de la concentración de anticuerpo empleada. Los valores de inhibición 50 (IC₅₀) considerando los dos parámetros (Tabla 6) muestran que tanto V 19 como V32R requieren de hasta 12 veces menos concentración de anticuerpo para producir un efecto inhibitorio de angiogénesis con respecto al anticuerpo V13 (descrito anteriormente en la publicación de patente US 8,496,933), y concentraciones similares a las del anticuerpo de referencia comercial (Genentech/Roche).

Modalidades de la invención

El objetivo de la invención es proporcionar moléculas anti-VEGF útiles para tratar o prevenir la retinopatía diabética, el glaucoma neovascular o la degeneración macular asociada a la edad y húmeda así como padecimientos oculares donde se involucre el fenómeno de neovascularización mediada por el VEGF, y cuyo componente activo se constituye de proteínas vNAR aisladas y purificadas y caracterizadas por su secuencia aminoacídica específica, por su estructura terciara definida, y por su afinidad, capacidad de reconocimiento y neutralizante de VEGF significativamente superior. Tales proteínas vNAR recombinantes aquí se han denominado VI 3, V19 y V32R; y sus secuencias aminoacídicas están definidas como SEQ. ID. NO: 2, SEQ. ID. NO: 4 y SEQ. ID. NO: 6, respectivamente que por sí mismas son modalidad de la invención.

Son modalidades no limitantes de la invención el uso de las proteínas vNAR V32R y V19 para administración ocular que contribuyan al tratamiento o prevención de procesos patológicos donde se involucra el fenómeno de neovascularización, pudiendo ser cualquiera de los siguientes: Neovascularización Retiniana, Neovascularización Coroidal, Neovascularización de la Córnea, Degeneración Macular, Degeneración Macular asociada a la edad, Enfermedades de la Retina, Retinopatía Diabética, Hemorragia Vitrea, Hemorragia Retiniana, Coroiditis, Desprendimiento de Retina, Drusen Retiniano, Glaucoma Neovascular, Enfermedades de la Coroides, Uveitis, Miopía, Oftalmopatías, Infecciones Fúngicas del Ojo, Telangiectasia, Oclusión de la Arteria Retiniana, Miopía Degenerativa, Oclusión de la Vena Retiniana, Coriorretinitis,, Histoplasmosis, Enfermedades de la Uvea, Rubéola (Sarampión Alemán), Toxoplasmosis Ocular, Membrana Epirretinal, Coloboma, Neoplasias de la Coroides, Degeneración Retiniana, Retinitis, Perforaciones de la Retina, Queratitis Herpética, Retinopatía de la Prematuridad, Edema Macular Quístico, Papiledema, Síndrome Uveomeningoencefálico, Drusen del Disco Óptico, Estrías Angioides, Retinitis Pigmentosa, Trastornos de la Visión, Oftalmía Simpática, Cicatriz Quemaduras Oculares Recurrencia Isquemia Lesiones Oculares Glaucoma, Hemorragia del Ojo, Escotoma, Uveitis Posterior, Fungemia, Neoplasias de la Retina, Enfermedades de la Córnea, Incontinencia Pigmentaria, Enfermedad de la Hemoglobina C, Fibrosis, Opacidad de la Córnea, Uveitis Anterior, Hipema, Sarcoidosis, Afaquia Enfermedad Iatrogénica, Panuveitis, Catarata, Complicaciones Postoperatorias, Anemia de Células Falciformes, Vasculitis Retiniana, Osteoma, Retinitis por Citomegalovirus, Atrofia, Flebitis, Queratocono, Síndrome de Sturge-Weber, Síndrome, Infecciones Virales del Ojo, Anomalías del Ojo, Trastornos Relacionados con Sustancias, Lesiones Oculares Penetrantes, Diabetes Mellitus Tipo 2, Traumatismos por Radiación, Rasgo Drepanocítico, Seudofaquia, Nevo Pigmentado, Vitreorretinopatía Proliferativa, Hemorragia, Diabetes Mellitus Tipo 1, Nevo, Enfermedades del Nervio Óptico, Enfermedades Vasculares, Candidiasis, Quemaduras Químicas, Microftalmia.

Otra modalidad de la invención se refiere a cada una de las clonas bacterianas que expresan estos vNAR para la producción a escala industrial, incluyendo las clonas de E. coli denominada VEGFvNAR v32R y VEGFvNAR vl9, que expresa a las vNAR: V32Ry V19.

Una modalidad más de la invención se refiere a los vectores plasmídicos que codifican a las vNAR V32R y VI 9, y que se caracterizan por comprender las secuencias codificantes de los mismos incluyendo a los vectores que aquí se describen.

Son modalidades de la invención los usos de las proteínas vNAR V32R y V19 para la preparación de medicamentos para la prevención o el tratamiento de enfermedades donde se requiera la neutralización de la actividad del VEGF, donde los medicamentos pueden ser de uso oftálmico.

Son modalidades de la invención las composiciones farmacéuticas oftálmicas que se caracterizan por contener una dosis farmacéuticamente correcta de las proteínas vNAR de la invención como principio activo y se caracterizan porque su composición base o excipiente proporciona la estabilidad y la conservación necesaria a estas proteínas.

Los siguientes ejemplos se presentan para avalar el desempeño de los productos biofarmacéuticos que aquí se han descrito y son de carácter ilustrativo más no limitativo del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Generación de la biblioteca inmune y selección de las clonas de vNAR específicas para VEGF:

Se inicia con la inmunización del espécimen de tiburón siguiendo un protocolo de 20 semanas de inmunización con ^g de proteína en PBS por vía intravenosa de la citocina humana recombinante VEGF₁₆5. Las dos primeras inmunizaciones incluyeron además adyuvante completo de Freund; los retos se realizaron cada 15 días, durante el mismo periodo, antes de cada refuerzo obtuvimos sangrías de 1 mi de la vena caudal; este suero se almacenó a -20°C. Se procedió a la extracción del RNA total, a partir del bazo del espécimen, disecado 7 días después de la última inmunización, siguiendo protocolos estándar de extracción de RNA fenol- cloroformo, y precipitación con isopropanol, obteniendo RNA total 1.2 μg/μl, se probó su pureza mediante espectrofotometría. Se continuó con la retrotranscripción (RT-PCR) con métodos convencionales, empleando el oligonucleótido antisentido GT T CAC AGT C AGC AC GGT GCC AGC T C ( SEQ . ID . NO . 10) a una concentración inicial de 20 μΜ y ^g de RNA total. A partir del fragmento de aproximadamente 620 pb, visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio, se llevó a cabo la reacción de PCR para obtener las dos hebras de ADN.

Para obtener el ADN de doble hebra también se utilizó una mezcla de los siguientes 7 oligonucleótidos sentido: GCACGGCTTGAACAAACACC ( SEQ . ID . NO . 11 ) , C AAC GGGT T GAAC AAACACC ( SEQ . ID . NO . 12 ) , ACAAGGGTAGACCAAACACC ( SEQ . ID . NO . 13) , GCAAGGGTGGACCAAACACC ( SEQ . ID . NO . 14 ) , GCATGGGTAGACCAAACACC ( SEQ . ID . NO . 15 ) , GCAAGCCTGGACCAAACACC ( SEQ . ID . NO . 16 ) , GC AT T GAC GGACC AAACACC ( SEQ . ID . NO . 17 ) .

Tanto los oligonucleótidos sentido como el antisentido poseen una secuencia adicional que le confiere un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción SflI. Los fragmentos amplificados se analizaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2% y bromuro de etidio a una concentración final de 50 ng/μΐ, (30 minutos a 100 Volts). Los fragmentos cuyo tamaño correspondió al tamaño esperado de acuerdo al juego de oligonucleótidos utilizados, (de 320-350 pb aproximadamente fueron cortados del gel. Posteriormente se extrajo el DNA del gel utilizando un kit especial. Se repitió este proceso hasta obtener una cantidad suficiente de DNA.

Luego se digirieron l^g del fragmento de DNA purificado obtenido por PCR correspondiente a los genes de vNAR con 5U de la enzima de restricción SflI por μg de ADN a digerir, incubando 5 horas a 50°C, se inactivo la mezcla y se almacenó a -80°C. Se procedió a la preparación del vector de clonación, el vector fagémido de expresión pCOMb3X que posee dos sitios de corte para la enzima SflI, para que los vNAR clonados se expresen en fagos (phague display). Los productos de digestión se purifican en un gel de agarrosa al 1%, se recupera el vector restringido obteniendo un fragmento de aproximadamente 3500 pb y se recupera un fragmento de aproximadamente 1500 pb.

El primer fragmento corresponde al vector digerido en ambos sitios de digestión y el segundo, al fragmento de relleno resultante. Se visualizó en un gel de agarosa al 1%, y se cortaron ambas bandas, posteriormente fue extraído el ADN por trituración-congelación, se purificó y cuantificó en espectrofotómetro a 260 nm.

Se procedió a la ligación de los fragmentos V_HNAR y el vector pCOMb3X realizada a pequeña escala para comprobar las condiciones de los fragmentos digeridos y luego a gran escala. La ligación se hizo entre el inserto vNAR y el vector pCOMb3X previamente digeridos, con una relación molar 1 : 1 usando la enzima T4 ADN ligasa. El control positivo de ligación, consistió en el vector digerido más el fragmento de relleno producido por la digestión en ambos sitios de corte. El control negativo de vector digerido sin fragmento de relleno con y sin T4 ligasa, sirvió para verificar que el vector no se ligara sobre sí mismo. También, se hizo un control con vector digerido y sin enzima T4 ligasa que confirma que el vector este bien digerido.

Se verificó la eficiencia de la ligación electroporando en células E. coli cepa ER2537 electrocompetente (200 Ohms, 2.5kV, 4 ms) siguiendo metodología estándar, incluyendo al final la siembra de las E. coli electroporadas en placas de agar LB en 3 diluciones seriadas y se obtuvieron las unidades formadoras de colonias (UFC), se calculó el tamaño de las bibliotecas considerando el número de UFC y los volúmenes de ligación, cultivo y siembra.

El tamaño de la biblioteca inmune obtenida para VEGF₁₆5 es de 6.36X10⁸ UFC/mL, (a gran escala) que se puede considerar representativa de la variabilidad generada por el tiburón después del protocolo de inmunización. En los controles negativos, no hubo crecimiento en placas de LB agar con ampicilina (20 μg/mL concentración final). Se realizó la amplificación primaria de las bibliotecas cultivando las células electroporadas, se utilizó el fago ayudante VCSM13 siguiendo la metodología convencional cultivando toda la noche en medio SB con ampilicilina y kanamicina, luego se centrifugaron para la obtención y almacenamiento del sobrenadante previamente esterilizado por filtración. Después de amplificar la biblioteca primaria, se llevaron a cabo cuatro rondas de selección de los fago-anticuerpos obtenidos, utilizando VEGF (1 μg en PBS) en una placa de ELISA (previamente incubada y bloqueada con BSA 3% en PBS), para lo cual se pusieron en contacto por cada pozo (por duplicado) 5 μg/ml de citocina VEGF y 50 μΐ_^ de BSA 3% usado como el antígeno en controles negativos. La citocina así quedó inmovilizada en los pozos de la placa. Se incubaron 50 μΐ_^ de fagos a 37° C por 1 hora, se hicieron de 5, 10, 15 y 20 lavados astringentes para cada una de las 4 rondas (respectivamente), utilizando Tween 0.05%-PBS IX por pozo; con esto se espera que los fagos seleccionados sean más específicos al antígeno VEGF. Posteriormente se usaron los fagos obtenidos de las rondas 3 y 4, esta vez en cultivos de E. coli TOP10F^', se verificó la presencia del inserto por PCR y luego se realizó la inducción de la expresión de la proteína vNAR, posteriormente ésta se extrajo de la fracción periplásmica de las E. coli mediante choque osmótico y se purificaron mediante cromatografía de afinidad a níquel; se realizó ELISA para determinar la afinidad esperada por el VEGF. Los rendimientos de todo este proceso no fueron los mejores, esto puede deberse a la formación de cuerpos de inclusión que contienen agregados de proteínas insolubles o no activas, y que no se logran extraer al realizar la extracción periplásmica, o bien porque los niveles de producción no son detectables por ELISA.

Ejemplo 2: Obtención de las células de expresión de vNAR anti-VEGF BL21 (DE3, tratamiento posterior y caracterización de la capacidad de reconocimiento de los vNAR mediante ELISA.

Para determinar la expresión y el reconocimiento específico de los productos de las clonas seleccionadas por el VEGF como su molécula diana, se indujeron 50 mL de cultivo de células BL21(DE3) transformadas con los plásmidos pET-20b(+) (sin péptido señal) y pET-28a(+)(con péptido señal) conteniendo a V13, V19 y a V32R por separado. Los clones obtenidos se individualizaron y los clones positivos se confirmaron por colony-PCR y análisis mediante electroforesis en geles de agarosa. De los clones positivos se prepararon cultivos saturados en medio líquido selectivo LB más ampicilina (clones en pET20b+) o kanamicina (clones pET28a+) y de éstos se obtuvieron stocks en 15% glicerol para su conservación a -80°C. Estudiamos la sobreexpresión de la proteína de interés por electroforesis en geles de acrilamida SDS-PAGE y por immunoblotting (Western-Blot) utilizando para ello anticuerpos anti-His o anti- HA más anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa y revelado con un sustrato específico TMB.

Por otra parte, procedimos a la evaluación la expresión de las proteínas a pequeña escala (ensayos piloto) y luego a gran escala a partir de los clones que resultaron positivos iniciando con cultivos de las bacterias BL21 (DE3) transformadas (positivas), en medio LB más antibiótico a temperatura de 37°C, al llegar a una densidad óptica (0.6-0.8) que nos resultó óptima en los ensayos piloto. Se añadió el inductor de expresión IPTG a 0.8 mM y se mantuvo la expresión a las condiciones óptimas de temperatura (30°C), y tiempo (20-22 horas). Procedimos a la purificación a partir de la obtención de pellets celulares provenientes de estos cultivos, de su lisis mediante buffers y sonicación, y posteriormente separamos los cuerpos de inclusión de la fracción insoluble, la purificación consistió en llevar a cabo una cromatografía de afinidad por metales inmovilizados, la resina correspondiente tiene afinidad para proteínas fusionadas con 6xHis. Una vez solubilizada la proteína, procedimos al plegamiento mediante el método On-colum referido. Para la validación de la funcionalidad de las proteínas vNAR así obtenidas, realizamos ensayos ELISA indirectos, inmunoblotting y citometría de flujo. Para las pruebas ELISA tapizamos placas con 50μ1, 300 ng/pocillo del antígeno rhVEGF {recombinant human vascular endotelial factor, versión 165) producido en laboratorio y también usamos el antígeno equivalente comercial {Recombinant Human VEGF165 de Peprotech®). El tapizado se realizó con resultados idénticos 2hr/37°C o bien 12-16 horas a 4°C. Como antígeno control negativo del ensayo se utilizó albúmina de suero bovino (BSA) e incluso pocilios sin antígeno. Tras la adsorción, los pocilios se bloquearon (16 horas a 4°C o 2horas a temperatura ambiente) con 150 μΐ PBS-5% leche desnatada, y las placas se lavaron con PBS-Tween 0,05%; seguidamente se añadieron a los pocilios 150-50 μΐ de la preparación de vNAR diluida en PBS- 5% leche desnatada (las cantidades de vNAR por pocilio añadidas oscilaron entre 0, 1 y 15 μgr) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras cuatro lavados con PBS-Tween, los anticuerpos vNAR retenidos en los pocilios se detectaron con un anticuerpo secundario para detectar el tag fusionado al vNAR: 6His o HA. Se usó un anticuerpo monoclonal contra el tag de histidinas (Anti 6His) o bien un antisuero policlonal anti-HA a diluciones entre 1:3000 y 1 :1000 (50μ1 por pocilio) diluida en PBS-5% leche desnatada. Las placas se incubaron se lavaron y se añadió el anticuerpo de revelado, conjugado a peroxidasa (50μ1 por pocilio): bien antisuero de cabra anti IgG de conejo en los pocilios con el antisuero policlonal anti-HA o antisuero de conejo anti IgG de ratón en pocilios con el monoclonal antióHis. Las placas se incubaron durante 30-45 minutos a temperatura ambiente, se lavaron exhaustivamente con FBS-Tween, adicionándose a los pocilios 100 μΐ de TM , substrato de la peroxidasa; tras una breve incubación, la reacción se detuvo añadiendo 50 μΐ de 3N H2S04 a los pocilios. La densidad óptica de la o-fenilendiamina (OPD) oxidada se midió (λ = 450 nm) en un espectrofotómetro Multiscan Plus (Flow).

Se utilizó como control positivo un anticuerpo monoclonal anti-VEGF comercial que reconoce la isoforma humana VEGF165 (Anti-VEGF monoclonal de ratón de Abcam, referencia abl316) a dilución 1 : 1000 y el conjugado a peroxidasa antisuero de conejo anti IgG de ratón.

En la figura 13, se muestra el resultado del ensayo de ELISA, donde es evidente una mayor expresión de proteína por las clonas V32R y V13 que la clona VI 9.

Ejemplo 3: Aislamiento de las fracciones subcelulares.

En estos ensayos, de forma estándar se parte de 500 mi de cultivo bacteriano induciendo con IPTG (concentración final 0.8 mM) y a 30°C o 37°C durante 16-20 horas. El cultivo se procesa después mediante la separación por centrifugación de las células y el medio de cultivo. Las células son tratadas para obtener de ellas, el medio extracelular, las proteínas del periplasma, por un lado (suave choque osmótico mediado por sacarosa), y por otro son lisadas con lisozima, detergente y sonicación para extraer de ellas los componentes intracelulares solubles e insolubles separados entre sí mediante centrifugación. La evaluación de cada fracción se realiza fundamentalmente estudiando la sobreexpresión de la proteína de interés en electroforesis en geles SDS-PAGE, seguido de tinción con azul de Coomassie, y mediante la detección específica de la misma mediante métodos serológicos, concretamente Western-Blot usando anticuerpos monoclonales anti "tag" (anti-His o Anti-HA) y anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa.

Ejemplo 4: Determinación de las secuencias aminoacídicas de las vNAR Anti-VEGF.

Las proteínas purificadas de las clonas reactivas se procesaron para obtener la secuencia en el laboratorio (Seqxcel Laboratory, San Diego, CA, EEU U), ía mezcla fue preparada siguiendo las condiciones sugeridas, usando el cebador o primer Ornpseq, debido a que el vector pCOMb3X posee la secuencia complementaria para este oligormcleótido, las secuencias específicas para VEGF fueron obtenidas con el programa Mac Vector 7.2.2; estas se incluyen en el lisiado de secuencias, estas son SEQ. ID NO: 3, SEQ, ID NO: 4 (para la clona V19) y SEQ. ID NO: 5 y SEQ. ID NO: 6 fpara la clona v32R). Ejemplo 5: Método de replegamiento in situ: On column refolding.

La fracción citoplásmica de la proteína de interés se encuentra mayoritariamente formando cuerpos de inclusión, fácilmente aislables después de la lisis bacteriana por centrifugación de los extractos. La proteína de interés se recupera mediante un método de purificación original de GE Healthcare^ denominado On colum Refolding, que requiere tener las proteínas solubilizadas, por lo que fue necesario emplear Cloruro de Guanidina en las fracciones donde se encontraban formando cuerpos de inclusión.

Para llevar a cabo el proceso On Column Refolding primero se procedió a la preparación de tampones (buffers) todos con pH 8.0 y los que hubo que añadir lOOmM L-Arg: Tampón de unión (puerto Al): Basado en Hidrocloruro de Guanidina 6M, el tampón de Solubilización (puerto A2): Basado en Urea 6 M, y los tampones de Elución (puerto A3) y de Refolding (puerto B): ambos contienen Tris-HCl NaCl, imidazol,y 2-mercaptoetanol. Todos contienen imidazol, el cual en el tampón de unión funciona para reducir la unión inespecífica de proteínas, es decir, de las que no poseen las colas de histidinas, y también participa en la elución de las mismas.

Se procedió a la preparación de la muestra (proteína previamente solubilizada con cloruro de guanidina) ajustándola a la composición de tampón de unión diluyendo o resuspendiendo los cuerpos de inclusión en tampón de unión durante toda la noche en agitación rotatoria. Se procedió a la preparación del sistema y cromatografía: Una vez realizado el montaje del equipo AKT A-prime y la columna escogida (His Trap lml FF crude, de GE Healthcare) se seleccionó en el sistema Application Témplate, On-column Refolding His Trap method. Se realizó el intercambio de buffers o tampones en las columnas. Antes de realizar la cromatografía la muestra fue filtrada por 0.45 mieras.

La figura 49 representa un esquema del gradiente que aplica el método seleccionado con el tampón de refolding, las distintas etapas del proceso y los tiempos de duración. Las fracciones con las proteínas eluídas se detectan por su absorbancia a 280 nm. Ejemplo 6: Citometría de flujo.

Las células U937 se utilizaron como células modelo para analizar la reactividad de los anticuerpos vNAR con VEGF. Unas 1.000.000 células previamente fijadas y permeabilizadas se incubaron con el anticuerpo vNAR seleccionado durante 30 min a temperatura ambiente a diferentes diluciones según la preparación y actividad específica del vNAR. Tras varios lavados con PBS pH 7.4, las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-6xHis, seguido del correspondiente lavado e incubación con un anticuerpo conjugado a Alexa Fluor 488. Después del mareaje las células se lavaron con PBS y resuspendieron finalmente en un volumen de 250μ1 de PBS. Las células marcadas fluorescentemente se cuantificaron con un citómetro de flujo. Como control positivo se utilizó el anticuerpo monoclonal anti VEGF comercial y el mismo anticuerpo secundario conjugado. Las células se identificaron en un diagrama de puntos ("dot plot") por su tamaño (dispersión frontal o FSC: "forward-angle light scatter") y complejidad (dispersión lateral, o SSC: "side-angle light scatte ⁷). La emisión del fluorocromo Alexa Fluor 488 se recogió en el detector FL1. El detector amplificador de la intensidad de fluorescencia se ajustó entre 10^o- 10¹ con células U937 no tratados con anticuerpo primario vNAR (control negativo).

Ejemplo 7: Estabilidad térmica.

Se prepararon diferentes alícuotas de los vNAR y se incubaron a diferentes temperaturas durante varios días (entre 3 y 7 días) para estudiar su estabilidad térmica a corto plazo. Típicamente las temperaturas estudiadas son: 37°C (1 hora), RT, 4°C, 0°C, -20°C y -80°C. La congelación a - 20°C y a -80°C es rápida y se realiza en un baño etanol-nieve carbónica. Transcurrido el tiempo de incubación las muestras se someten a centrifugación para descartar los agregados producidos en ese tiempo. Las muestras congeladas a -20°C y a -80°C se descongelan en hielo antes de la centrifugación. Con el sobrenadante de esas muestras se realiza una electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida 15% PAGE-SDS. Tras la tinción con azul de Coomassie se analiza la pérdida de proteína soluble por la formación de agregados en las distintas incubaciones.

Ejemplo 8: Espectrometría de masas

Para los análisis de identidad por espectrometría de masas las preparaciones de vNAR se sometieron a electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida 15% PAGE-SDS. Tras la tinción con azul de Coomassie, se recortó del gel la banda de vNAR y se analizó por espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF. Este sistema puede identificar las proteínas mediante la determinación de las masas exactas de péptidos formados mediante digestión enzimática. Además, el sistema puede identificar con más precisión y caracterizar proteínas por tándem de tiempo de vuelo (TOF / TOF), una tecnología para aislar y fragmentar un ion molecular de interés y obtener la medición de las masas de iones de los fragmentos de proteína. Las piezas de gel se lavaron con acetonitrilo al 50%. A continuación, los fragmentos de gel se colocaron a 56 ° C durante 45 min en 10 mM DTT, 55 mM de yodoacetamida en bicarbonato de amonio 25 mM en oscuridad. Se añadieron al fragmento del gel tripsina, bicarbonato de amonio y se incubó durante la noche a 37°C. Después se transfirió a acetonitrilo al 50%, 0, 1% ácido trifluoroacético, y se extrajeron los péptidos de la pieza de gel por tratamiento con ultrasonidos durante 5 min. Los péptidos se volvieron a suspender en 10 μΐ_^ de acetonitrilo 33%, 0, 1% ácido trifluoroacético. Para el análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF se utiliza un espectrómetro ABi 4800 MALDI TOF/TOF™ en el modo reflector de ion positivo. El voltaje iónico de aceleración fue de 20 kV. Para la identificación en los péptidos de huellas dactilares en masa, los mapas de masas de los péptidos trípsinizados son transferidos a través del programa BioToolsTM MS (Bruker Daltonics) para buscar en Swiss-Prot usando el software Mascot (Matrix Science).

Ejemplo 9: Eliminación de endotoxinas.

Para la eliminación de endotoxinas en las preparaciones de vNAR se utilizaron dos herramientas: -Detoxi-Gel Endotoxin Removing Columns: columnas que utilizan polimixin B inmovilizada en una matriz para unir y eliminar pirógenos presentes en soluciones. Esta aproximación cromatográfica es de uso sencillo y ofrece una remoción rápida de muestras de pequeño volumen.

Se han utilizado diferentes muestras de vNAR con estas columnas ofreciendo buenos resultados.

Las fracciones recogidas tras cargar y eluir la muestra de vNAR en estas columnas se analizó por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida SDS-PAGE. Aquellas en las que está la proteína se juntan y se cuantifican de nuevo por electroforesis. En general, las preparaciones de vNAR toleran bien este tratamiento y los rendimientos de proteína obtenidos se encuentran mayoritariamente entre el 75-90% de proteína recuperada. Ejemplo 10: Estudio comparativo de la inhibición de angiogénesis in vitro

El ensayo consistió en cultivos en placa de 96 pocilios de células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC) transfectadas con la proteína verde fluorescente en cocultivo con fibroblastos humanos (NHDF) durante 14 días. Como control positivo se utilizaron 4ng/mL VEGF, que produjo una formación extensa de tubos y de redes en todas las placas, alcanzando niveles de longitud de tubo de cerca de 13-14 mm/mm2.

Como primer control negativo los cultivos se mantienen en ausencia de VEGF, con lo cual no se favorece la formación de tubos, alcanzando niveles de tan sólo 2-3 mm/mm2. Otro control negativo que se aplica se consigue mediante la adición de ΙΟΟμΜ suramina, este tratamiento inhibió completamente la angiogénesis mediada por VEGF.

Los días 4, 5, 7, 10 y 12 del experimento se añaden a los pozos diferentes concentraciones de los anticuerpos vNAR: V13 (descrito anteriormente en la publicación de patente US 8,496,933) , V19 y V32R, así como el anticuerpo de referencia (Genentech/Roche) en presencia de 4ng/mL VEGF (ver Figura 50). Cada placa se utiliza para analizar 2 compuestos, así se dispone de cuadruplicados por concentración y se tomaron 6 imágenes por pozo al término de cada tratamiento.

Se midieron 2 parámetros del proceso de vascularización tras la exposición a los compuestos durante 14 días: la longitud de los tubos (Figura 51) y los puntos de ramificación (Figura 52). Los resultados de la medición de estos parámetros fueron comparados con las células que sólo recibieron 4ng/mL VEGF (control positivo), y 20 μ M suramina + VEGF (control negativo). Los análisis muestran que el VEGF estimula la formación de tubos y los puntos de ramificación en comparación con los controles, y que los anticuerpos de referencia (Genentech/Roche) (A), V13 (B), V32R (C) y V19 (D) inhiben la formación de tubos y también inhiben la formación de puntos de ramificación de manera dependiente de la concentración. El análisis de la concentración de cada anticuerpo que se requiere para inhibir el proceso de angiogénesis en un 50% (IC₅₀) en el ensayo in vitro, fue determinada mediante la construcción de una curva dosis respuesta, mediante un modelo de regresión no lineal, los datos obtenidos se encuentran representados en la tabla 6; la potencia de los anticuerpos es expresada como la concentración (mg/mL) requerida para neutralizar el 50% de la actividad angiogénica de dos parámetros: longitud de tubos y puntos de ramificación medidos en un ensayo in vitro. Tabla 6. Valores de inhibición 50(IC₅₀)

Tratamiento Longitud de Puntos de Valor

tubos^g/mL) ramificación^g/mL) promedio

(ug/mL)

Anticuerpo de 57.6 37.5 47.6

referencia

Genentech/Roche)

V13 436.1 340.4 388.3

V32R 27.6 19.3 23.4

V19 35.8 24.7 30.2

En la figuras 53, 54, 55 y 56 se muestran las imágenes representativas del efecto de inhibición de angiogénesis de los anticuerpos V32R, VI 9, VI 3 y el anticuerpo de referencia, La principal conclusión de este estudio es que todos los anticuerpos muestran un efecto inhibitorio del proceso angiogénico medido a través del número y puntos de ramificación de los vasos, dependiente de la concentración. La concentración de anticuerpo V19 y V32R que inhibe en un 50% está en un intervalo de 20-40 μg/mL. REFERENCIAS

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. REIVINDICACIONES

1. Una proteína vNAR anti-VEGF aislada y seleccionada del grupo formado por V19 y V32R caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. NO. 4 ó SEQ. ID. NO.6 y que presenta capacidad de reconocimiento y afinidad mejorada por su molécula diana VEGF.

2. La proteína vNAR anti-VEGF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque V19 comprende varias laminas β unidas por loops con una región variable formada por 2 láminas β interconectadas por un loop con alta flexibilidad y un monómero formado por dos grupos de láminas beta con un único puente de disulfuro que une los dos grupos de láminas, que comprende la SEQ. ID. No. 4 (fig. 20-22 y 42).

3. La proteína vNAR anti-VEGF de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque V32R comprende láminas beta y un monómero formado por dos grupos de láminas beta con un único puente di-sulfuro que une los dos grupos de láminas, que comprende la SEQ. ID. NO. 6 (fig. 23-28 y 43).

4. Una secuencia de DNA que comprende un ácido nucleico de la SEQ. ID. NO. 3 ó 5 que codifica para la proteína vNAR de la reivindicación 1.

5. La proteína vNAR anti-VEGF aislada y seleccionada del grupo formado por V19 y V32R de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque:

a) se origina de Orectolobus maculatus o de Heterodontus francisci

b) se une y neutraliza la actividad del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en el ojo.

6. Una composición farmacéutica que comprende la proteína vNAR anti-VEGF aislada y seleccionada del grupo formado por V19 y V32R de la reivindicación 1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque está formulada para administración tópica.

8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la composición está formulada para la administración oftálmica tópica.

9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la composición está diseñada para ser administrable tópicamente en una enfermedad del ojo relacionada al VEGF seleccionada de: neovascularización retiniana, neovascularización coroidal, neovascularización de la córnea, degeneración macular, enfermedades de la retina, retinopatía diabética, hemorragia vitrea, hemorragia retiniana, coroiditis, desprendimiento de retina, drusen retiniano, glaucoma neovascular, enfermedades de la coroides, uveitis, miopía, oftalmopatías, infecciones fúngicas del ojo, telangiectasia, oclusión de la arteria retiniana, miopía degenerativa, oclusión de la vena retiniana, coriorretinitis, histoplasmosis, enfermedades de la úvea, rubéola (sarampión alemán), toxoplasmosis ocular, membrana epirretinal, coloboma, neoplasias de la coroides, degeneración retiniana, retinitis, perforaciones de la retina, queratitis herpética, retinopatía de la prematuridad, edema macular quístico, papiledema, síndrome uveomeningoencefálico, drusen del disco óptico, estrías angioides, retinitis pigmentosa, trastornos de la visión, oftalmía simpática, cicatriz quemaduras oculares recurrencia isquemia lesiones oculares glaucoma, hemorragia del ojo, escotoma, uveitis posterior, fungemia, neoplasias de la retina, enfermedades de la córnea, incontinencia pigmentaria, enfermedad de la hemoglobina c, fibrosis, opacidad de la córnea, uveitis anterior, hipema, sarcoidosis, afaquia enfermedad iatrogénica, panuveitis, catarata, complicaciones postoperatorias, anemia de células falciformes, vasculitis retiniana, osteoma, retinitis por citomegalovirus, atrofia, flebitis, queratocono, síndrome de sturge-weber, síndrome, infecciones virales del ojo, anomalías del ojo, trastornos relacionados con sustancias, lesiones oculares penetrantes, diabetes mellitus tipo 2, traumatismos por radiación, rasgo drepanocítico, seudofaquia, nevo pigmentado, vitreorretinopatía proliferativa, hemorragia, diabetes mellitus tipo 1, nevo, enfermedades del nervio óptico, enfermedades vasculares, candidiasis, quemaduras químicas, microftalmia.

10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque de la enfermedad del ojo relacionada al VEGF se selecciona preferiblemente de degeneración macular asociada a la edad húmeda, la retinopatía diabética, o glaucoma neovascular.

11. El uso de una cantidad efectiva de una proteína vNAR anti-VEGF seleccionada del grupo que consiste de V 19 ó V32R de conformidad con la reivindicación 1, para preparar un medicamento administrable por vía oftálmica tópica para el tratamiento de una enfermedad del ojo relacionada con el VEGF.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la enfermedad es además una patología relacionada a un proceso angiogénico, donde la angiogénesis excesiva ocurre cuando las células enfermas producen cantidades anormales de VEGF o receptores de VEGF.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde el proceso angiogénico se selecciona del grupo que consiste de retinopatía diabética, degeneración macular asociada a la edad y glaucoma neovascular.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el proceso angiogénico es preferiblemente retinopatía diabética.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el proceso angiogénico es preferiblemente degeneración macular asociada a la edad.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde el proceso angiogénico es preferiblemente glaucoma neovascular.

17. El uso de al menos una proteína vNAR anti-VEGF seleccionada del grupo que consiste de V19 ó V32R de conformidad con la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento útil en la prevención o tratamiento de un padecimiento oftálmico relacionado a VEGF, seleccionada de: neovascularización retiniana, neovascularización coroidal, neovascularización de la córnea, degeneración macular, enfermedades de la retina, retinopatía diabética, hemorragia vitrea, hemorragia retiniana, coroiditis, desprendimiento de retina, drusen retiniano, glaucoma neovascular, enfermedades de la coroides, uveitis, miopía, oftalmopatías, infecciones fúngicas del ojo, telangiectasia, oclusión de la arteria retiniana, miopía degenerativa, oclusión de la vena retiniana, coriorretinitis, histoplasmosis, enfermedades de la úvea, rubéola (sarampión alemán), toxoplasmosis ocular, membrana epirretinal, coloboma, neoplasias de la coroides, degeneración retiniana, retinitis, perforaciones de la retina, queratitis herpética, retinopatía de la prematuridad, edema macular quístico, papiledema, síndrome uveomeningoencefálico, drusen del disco óptico, estrías angioides, retinitis pigmentosa, trastornos de la visión, oftalmía simpática, cicatriz quemaduras oculares recurrencia isquemia lesiones oculares glaucoma, hemorragia del ojo, escotoma, uveitis posterior, fungemia, neoplasias de la retina, enfermedades de la córnea, incontinencia pigmentaria, enfermedad de la hemoglobina c, fibrosis, opacidad de la córnea, uveitis anterior, hipema, sarcoidosis, afaquia enfermedad iatrogénica, panuveitis, catarata, complicaciones postoperatorias, anemia de células falciformes, vasculitis retiniana, osteoma, retinitis por citomegalovirus, atrofia, flebitis, queratocono, síndrome de sturge-weber, síndrome, infecciones virales del ojo, anomalías del ojo, trastornos relacionados con sustancias, lesiones oculares penetrantes, diabetes mellitus tipo 2, traumatismos por radiación, rasgo drepanocítico, seudofaquia, nevo pigmentado, vitreorretinopatía proliferativa, hemorragia, diabetes mellitus tipo 1, nevo, enfermedades del nervio óptico, enfermedades vasculares, candidiasis, quemaduras químicas, microftalmia.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde el padecimiento oftálmico es preferiblemente la degeneración macular asociada a la edad húmeda, la retinopatía diabética o el glaucoma neovascular.