TW201546090A - 用於中和血管內皮生長因子之重組單株抗體vNAR - Google Patents

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Abstract

本發明係關於蛋白質之選擇、分離及純化，該等蛋白質係屬於名為VHNAR或vNAR之可變區，其係源自具有抗原受體能力之板鰓亞綱生物的IgNAR-型免疫球蛋白。該等蛋白質之來源克隆名為VEGFvNAR V32R及V19，以及相應抗體名為V32R及V19。該等蛋白質之胺基酸序列以及三級結構係被鑑定，以及其中和血管內皮生長因子活性的能力係被確定。在本發明之研發過程中，該等蛋白質被最適化於工業級之大腸桿菌生產模式中表現。大體上，本發明係關於該等抗體在關於血管生成或新生血管形成之症狀上的治療，以及特別關於藉由局部給藥來治療與新生血管形成相關之眼科症狀。

Description

用於中和血管內皮生長因子之重組單株抗體vNAR
本發明係關於生物科技領域，特別關於名為vNAR之基於鯊魚之單株抗體生物製藥的生成，其係阻礙血管內皮生長因子，且具有顯著的生物學及生物物理學上的特性。該等vNAR抗體對於環境具有高度的抗性，且可不需要一冷凍鏈。此外，其具有良好的穿透能力，因而提升其治療活性。
抗體係為醫療應用中的重要工具。大部分的抗體係由二重鏈以及二輕鏈所組成，重鏈以及輕鏈形成抗原結合位。非典型的抗體結構在大羊駝(llamas)、駱駝以及軟骨魚類中被發現。這些抗體係由具有四個恆定結構域以及一抗原結合位或可變結構域的單一重鏈所構成，其在駱駝中名為VHH、hcAbs，在板鰓亞綱生物(elasmobranches)中被名為vNAR或VHNAR。1
抗體科技被發展，用於提供新的治療以及診斷系統。其係包含，例如：單株抗體；被設計以減少非人抗原反應之人源化抗體；以及改善其特性之共軛抗體等的使用。被FDA核准用於治療多種人類疾病之抗體的數量有所增加，大約352種抗體係於臨床試驗(第一期及第二期)之階段，大約占所有於臨床試驗階段之蛋白質的25%。大量的努力已經完成，以減少抗體的常規尺寸和保留其抗原結合性質像親和力、抗體親抗原性及特異性。2
具有抗原結合能力的小片段抗體，被做為醫療用途的技術性替代品。這些替代品係自重組分子獲得進展，像是抗原結合之片段(fragment of antigen binding,Fab)及/或單一鏈可變片段(single chain variable fragment,scFv)，於單一結合結構於基於具有VH結構域之蛋白質，其依序被用於研發新的免疫治療及免疫診斷策略。由於穩定性的增加，以及獲取無法被傳統的抗體所辨識之抗原決定部位的可能性，Fad於較小的結構域的模似物係具有優勢的。2
軟骨魚類具有三種同型免疫球蛋白或抗體，其中二種具有二標準重鏈及輕鏈，被命名為IgM及IgW(亦稱IgX或IgNARC)，以及一非典型同型名為IgNAR，其係重鏈的同型二聚體，並未包含輕鏈。鯊魚的抗原受體免疫球蛋白(稱為IgNAR或NAR)具有一單一可變結構域(sbAb片段)及二叉狀高度可變結構(fork hypervariable structures)，以包含整個具有統一專一抗原變異性的譜(repertoire)。IgNAR係高度可溶及高度熱穩定的小分子(12kDa)，且具有良好的活體(in vivo)組織穿透能力，這使得IgNAR成為抗體工程及治療性抗體的良好來源。3,4
本發明係關於IgNAR抗體的選擇及分離，特別關於該抗體之可變區域VHNAR，其係源自免疫接種的佛氏虎鯊(Heterodontus francisci)或斑紋鬚鯊(Orectolobus maculatus)，對於細胞因子具有親和力，且具有中和其活性的能力。這些抗體係大體上源自於軟骨魚類(鯊魚、鰩魚、魟魚及銀鮫)。IgNAR抗體的分子排列係由5個固定區域以及一個可變區域所構成，其與駱駝科生物中發現的VH非常相似，這可能代表在分子層級的趨同演化。1,5
納托爾(Nuttall)及合作者，透過基於斑紋鬚鯊之IgNAR的噬菌體展示技術(phage display technology)，得到了一非免疫的鯊魚抗體庫。這些區域具有辨識蛋白質的能力，例如：源自牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的 牙齦蛋白酶K(gingipain K protease)、粒線體進入受體Tom70(mitochondrial import receptor Tom70)、惡性瘧原蟲的溶菌酶及頂端膜抗原1(Apical Membrane Antigen 1,AMA1)等蛋白質。這些區域被克隆(clone)於大腸桿菌(Escherichia coli)的表達系統中，首先對於自鯊魚之自然譜獲得的NARs的抗原專一性，作為高度親和力的單一結構域抗體的可能來源進行描述。6,7,8
杜利(Dooley)及合作者，在2003年選擇了一源自鉸口鯊(Ginglymostoma cirratum)的目標庫。這些鯊魚被以雞卵溶菌酶(hen egg lysozyme,HEL)產生對HEL抗原高度專一性的克隆，具有奈莫耳等級的親和力(介於10-7至10-10M之間)，以及對於熱變性具有極佳的抗性，其在100℃、3小時的培養後，仍保持超過20%的活性。
IgNAR的基因係被群組化，每一群組係由一個單一可變簡單區域(VH)、三個多樣性元件(D)以及一個單一連接基因(G)所組成。IgNAR VH的主要譜係藉由四個重組事件生成，產生在序列及長度上皆具有一多樣性的CDR3譜。6
在這些單一鏈抗原受體的發現之後，由於其具有高度功能性，隨即發展出其他與鯊魚蛋白質相關的技術。分離及克隆的可變結構域非常的穩定；相較於駱駝科的抗體，該結構域小了20%，以及相較原始受體其係具有相同的抗原結合能力。
此一技術的優勢在於，結合傳統抗體的特性與小分子的優點；其具有高度專一性及低度固有毒性；由於較小的分子量，其具有較大的可能性到達目標區域；其係具有抑制酵素的能力以及能夠到達細胞受體的結合位。所有 的這些特性可被開發用於治療應用。此外，其對於藉由多樣化途徑的給藥具有極大的潛力，包括局部(topical)路徑。最後，其易於生產且成本低廉。5
從文獻中可清楚的了解，VEGF及其受體(VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3)的過度表現，導致微血管穿透性及血管生成的增加，產生眼部病症，例如：糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)、年齡相關的黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)以及新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)。在視網膜的血管及神經元中，VEGFR-1、VEGFR-2及VEGFR-3受體的細胞分布，促成了VEGF家族於正常視網膜的多種特定功能。
血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，被描述為一腫瘤衍生因子，具有誘發內皮細胞通透性、細胞增生及血管生成的能力，致使新血管的形成，特別是為癌組織供應氧氣與養分的血管。雖然，許多其他的因子與血管生成相關，但VEGF是其中關鍵介質。
VEGF(或VEGF-A)係為一種肝素結合的糖蛋白，其屬於包含VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及血小板生長因子的生長因子亞族(subfamily)。由於VEGF mRNA的選擇剪接模式(alternative splicing patterns)，VEGF存在至少七種同功型(isoforms)。四種主要的同功型係為VEGF121、VEGF165、VEGF189及VEGF206(下標數字係指蛋白質的胺基酸數量)。主要的種類係為VEGF165，對於肝素具有親和力，因此，部分的這種同功型係結合且藉由蛋白酶切割(proteolytic cleavage)釋放。其他種類係游離且可供結合至內皮細胞的受體，並產生了二種不同的流程：可溶性同功型的分泌以及結合同功型的蛋白酶切割。不同的VEGF同功型在生理學上的重要性尚未明瞭；然而，VEGF165係為血管生成的主要調節因子。
VEGF主要與二種受體結合：VEGF受體-1(亦被稱為Flt-1)及VEGF受體-2(亦被稱為Flk-1或KDR)。這些受體皆具有一細胞外結構域(其結合VEGF)，具有七個免疫球蛋白-類型區域，一單一跨膜區以及具有酪胺酸激酶活性的一細胞內結構域。這些受體主要在發育中組織的血管內皮細胞中被發現。
與VEGF受體-2的結合，直接促進血管生成及活化之一系列的信號傳導途徑，導致血管內皮細胞的增生、血管內皮細胞的遷移、未成熟血管內皮細胞的存活以及血管通透性的增加。
雖然，VEGF受體-1起先被認為是作為“誘餌受體(decoy receptor)”的角色，藉此減少可結合至VEGF受體-2的VEGF分子數量，但近期研究顯示，VEGF受體-1也具有引發有絲分裂信號的能力。
血管生成係為新血管結構的形成且在例如腫瘤的建立及眼部疾病的病理學過程中扮演了重要的角色。習知，糖尿病性視網膜病變(Diabetic retinopath)係為視網膜中新血管的不正常生長以及纖維組織的出現；當發源於黃斑部下方時，被稱為黃斑變性(Macular Degeneration)；以及當發生於虹膜時，被稱為新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)。
糖尿病性視網膜病變係為一種視網膜的疾病，其發生在具有糖尿病(diabetes mellitus)的患者中；於患有該疾病多年後發生，第一型及第二型患者皆然，當該疾病未被良好控制特別易發。糖尿病性視網膜病變具有二種類型：早期或非增生糖尿病性視網膜病變以及增生或晚期糖尿病性視網膜病變。增生糖尿病性視網膜病變的特點為，新血管的不正常生長以及後續對應視網膜缺血及視網膜前或玻璃體出血之發展的纖維增生。11其重要性在於，這在全世界是導致永久失明的主要原因之一，且可藉由給予適當的預防措施以及即時施加治療 加以預防。11糖尿病性視網膜病變被定義為糖尿病患者中，典型發生之微血管損傷的存在及演化。
年齡相關的黃斑變性(Age-related macular degeneration,ARMD)係為造成超過60歲的患者視力喪失的主因。黃斑係為視網膜的中心區域，其係負責用於閱讀、看電視、看見人群以及大體上任何精密細節的影像的精密視覺。12年齡相關的黃斑變性係為黃斑的退化性病症，其係導致視力喪失的常見原因。其可被分類為濕性(新生血管性)或乾性(非新生血管性)。大約10%的患者受濕性黃斑變性之苦。
一般針對濕性黃斑變性的治療，包含於眼內施加一或多種稱為“抗血管生成”藥物的注射劑，其係試圖移除新生血管膜。只要該治療係即時的施加且沒有太多的疤痕發生，透過這樣的治療，超過90%的患者達到視力的維持，以及大約二分之三的患者達到視力的改善。13
透過創傷或例如上述疾病所造成的損傷的循環，導致這些組織中新血管的發展。角膜新生血管形成係為導致脈絡膜微血管穿過布魯赫膜(Bruch's membrane)的不正常血管生長，以及隨後於視網膜色素上皮下方的增生(第一型)及/或於視網膜下方的增生(第二型)。這可因布魯赫膜的破裂、例如VEGF之細胞因子的釋放、發炎、視網膜色素上皮中的氧化壓力或血管功能不全而發生。此一病症係導致濕性黃斑變性的主因，且可能與多種病徵相關，包含血管樣紋(angioid streaks)、脈絡膜破裂(choroidal rupture)、病理性近視(pathological myopia)、脈絡膜視網膜病變(chorioretinal lesion)以及散彈狀脈絡視網膜症(birdshot chorioretinopathy)。
亦有虹膜新生血管(iris neovascularization)的現象。虹膜前壁表面不正常的新血管形成通常與多種不同的病症相關，其係導致視網膜缺血(retinal ischemia)，例如糖尿病性視網膜病變、視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、頸動脈疾病(carotid artery disease)、葡萄膜黑色素瘤(melanoma uveal)、長期視網膜脫離(prolonged retinal detachment)等。新生血管形成開始於瞳孔邊緣，且通常在此同時於前房角(angle of the anterior chamber)形成以及擴散至整個表面。新血管係伴隨纖維組織膜，其可阻擋水狀液(aqueous humor)經由小梁網狀結構(trabecular meshwork)穿透(新生血管性青光眼)，以及導致瞳孔邊緣的葡萄膜外翻(ectropion uveae)。通常的治療包含施加雷射光凝術(laser photocoagulation)以避免新血管的形成。
新生血管性青光眼係為一種特殊形態的續發性青光眼，其係因虹膜中的新血管的形成所致。這些新血管最終導致水狀液自眼前房的循環受到阻礙，引發高眼壓。這導致視網膜氧氣慢性及長期的缺乏。使得系統產生刺激新生血管形成的物質作為回應。
新生血管形成之現象所涉及的其他病理學過程係為：視網膜新生血管形成(Retinal Neovascularization)、脈絡膜新生血管形成(Choroidal Neovascularization)、角膜新生血管形成(Corneal Neovascularization)、黃斑變性(Macular Degeneration)、年齡相關的黃斑變性(Age-Related Macular Degeneration)、視網膜疾病(Retinal Diseases)、糖尿病性視網膜病變(Diabetic Retinopathy)、玻璃體出血(Vitreous Hemorrhage)、視網膜出血(Retinal Hemorrhage)、脈絡膜炎(Choroiditis)、視網膜脫離(Retinal Detachment)、視網膜玻璃膜疣(Retinal Drusen)、新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)、脈絡膜疾 病(Choroid Diseases)、葡萄膜炎(Uveitis)、近視(Myopia)、眼部疾病(Eye Diseases)、真菌性眼部感染(Fungal Eye Infections)、微血管擴張(Telangiectasia)、視網膜動脈阻塞(Retinal Artery Occlusion)、退化性近視(Degenerative Myopia)、視網膜靜脈阻塞(Retinal Vein Occlusion)、脈絡膜視網膜炎(Chorioretinitis)、組織胞漿菌病(Histoplasmosis)、葡萄膜疾病(Uveal Diseases)、德國麻疹(Rubella(German Measles))、眼部弓形蟲病(Ocular Toxoplasmosis)、視網膜上膜(Epiretinal Membrane)、缺損(Coloboma)、脈絡膜腫瘤(Choroid Neoplasms)、視網膜變性(Retinal Degeneration)、視網膜炎(Retinitis)、視網膜穿孔(Retinal Perforations)、皰疹性角膜炎(Herpetic Keratitis)、早產兒的視網膜病變(Retinopathy of Prematurity)、黃斑囊樣水腫(Cystoid Macular Edema)、視乳頭水腫(Papilledema)、葡萄膜腦膜腦炎綜合症(Uveomeningoencephalitic Syndrome)、視盤玻璃膜疣(Optic Disk Drusen)、血管樣紋(Angioid Streaks)、視網膜色素變性(Retinitis Pigmentosa)、視力異常(Vision Disorders)、交感性眼炎(Sympathetic Ophthalmia)、疤痕(Scar)、眼部燒傷(Ocular Burns)、復發性缺血(Recurrent Ischemia)、眼部外傷(Eye Injuries)、青光眼(Glaucoma)、眼部出血(Eye Hemorrhage)、盲點(Scotoma)、後葡萄膜炎(Posterior Uveitis)、真菌血症(Fungemia)、視網膜腫瘤(Retinal Neoplasms)、角膜疾病(Corneal Diseases)、色素失禁(Pigmentary Incontinence)、血紅蛋白C疾病(Hemoglobin C Disease)、纖維化(Fibrosis)、角膜渾濁(Opacity of the Cornea)、前葡萄膜炎(Anterior Uveitis)、前房出血(Hyphema)、節結病(Sarcoidosis)、晶狀體缺失症(Aphakia)、醫源病(Iatrogenic Disease)、全葡萄膜炎(Panuveitis)、眼部白內障(Eye Cataract)、手術後併發症(Postoperative Complications)、鐮狀細胞貧血(Sickle Cell Anemia)、視網膜血管炎(Retinal Vasculitis)、骨腫瘤(Osteoma)、巨細胞病毒性視網膜炎(Cytomegalovirus Retinitis)、萎縮症(Atrophy)、靜脈炎(Phlebitis)、圓錐角膜(Keratoconus)、史德格-韋伯症候群(Sturge-Weber Syndrome)、病毒性眼部感染(Viral Eye Infections)、眼部畸形(Eye Abnormalities)、物質相關疾患(Substance-Related Disorders)、眼球穿通外傷(Penetrating Eye Injuries)、第二型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2)、輻射損傷(Radiation Injuries)、鐮狀細胞特徵(Sickle Cell Trait)、假晶狀體(Pseudophakia)、色素痣(Pigmented Nevus)、增殖性玻璃體視網膜病變(Proliferative Vitreoretinopathy)、出血(Bleeding)、第一型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 1)、痣(Nevus)、視神經疾病(Optic Nerve Diseases)、血管疾病(Vascular Diseases)、念珠菌感染(Candidiasis)、化學燒傷(Chemical Burns)、小眼症(Microphthalmia)。
在全世界，28500萬人具有由多種因素所引起的視覺障礙，且其中的3900萬人係為眼盲。14“造成慢性眼盲的主因包含：白內障、青光眼、年齡相關的黃斑變性、角膜渾濁、糖尿病性視網膜病變、砂眼及幼兒眼部疾病，以及因缺少維生素A所導致之幼兒眼部疾病。年齡相關的眼盲以及因未獲控制的糖尿病所導致的眼盲，在全世界有增加的趨勢。四分之三的眼盲係可被預防或治療的”。15
VEGF活性的抑制分子可被用於限制依賴VEGF活性之新生血管形成的過程。
抗-VEGF抗體結合至配體，因此消除自由循環的VEGF，且防止VEGF結合至其受體。由於抗體具有高度的專一性且僅結合至VEGF，其已被用於此一用途上；由所有結合至VEGF之受體所調節的促血管形成效應(pro-angiogenic effects)可被抑制。
不同的策略被研發，以抑制VEGF-調節之訊息傳遞，然而，由於費拉拉(Ferrara)及戴維斯-史密斯(Davis-Smith)提出的文獻中顯示，特定的抗-VEGF抗體在動物模式中可抑制腫瘤的生長，人類形式的抗-VEGF抗體自1997年開始獲得了發展。
貝伐單抗(Bevacizumab)係為一種抗-VEGF單株抗體。其係為第一個用於癌症治療的抗血管形成抗體；其係被用於結合化療方案，作為轉移性結直腸癌的第一線治療。其係被測試於多種器官的癌症，具有正面的臨床結果，包含：腫瘤縮小以及中至長期存活率的增加。16
於2004年，美國食品藥品監督管理局(FDA)核准了哌加他尼(Pegaptanib)，其係為第一個藉由玻璃體腔內注射之用於眼部給藥的抗血管形成藥物。此一抗-VEGF藥物在年齡相關的黃斑變性的患者的研究中被加以分析。其結果顯示70%受治療患者的視力獲得穩定，相較之下，未受此抗體治療之患者係為50%。
於2006年，美國食品藥品監督管理局(FDA)核准了眼部用的蘭尼單抗(Ranibizumab)，其係為抗-VEGF人化小鼠單株抗體之重組Fab片段；其亦被成功地用於眼部疾病的治療上，抑制導致眼盲的新生血管形成，特別用於治療各種類型的黃斑變性，特別是濕性年齡相關的黃斑變性。
蘭尼單抗的給藥途徑係為玻璃體腔內注射。然而，蘭尼單抗會導致視網膜脫離及嚴重感染等副作用。其被報導在老鼠中會導致視網膜之感光細胞及米勒細胞(Müller cells)的死亡，該等細胞對於視覺功能至關重要。
下列所示，係為其他藉由抑制VEGF活性而產生作用且為眼內給藥的眼科用藥：維替泊芬(Verteporfin)，作為與黃斑變性相關的脈絡膜新生血管 形成的選擇治療；阿柏西普(Aflibercept)，其係被用來治療濕性年齡相關的黃斑變性；以及地塞米松(dexamethasone)，其係為皮質類固醇，當作為玻璃體內植入劑施用時，可減少導致黃斑水腫的發炎過程。
美國專利8,496,933，帕尼亞瓜-索利斯等人(Paniagua-Solís et al.)，係關於蛋白質的選擇、分離及生產，該蛋白質係屬於名為VHNAR或vNAR的可變區域，源自具有抗原受體能力之板鰓亞綱生物的IgNAR-型免疫球蛋白。此一vNAR被名為V13，其係根據與血管內皮生長因子(VEGF)的專一性結合能力而被選擇。其係藉由中和VEGF活性而產生作用，其特性在於序列、選擇及最佳化，且其係本發明最接近之先前技術，透過引用以其整體併入本文。
抗-VEGF治療上的試驗，已在多種給藥策略上進行測試，例如：，當治療開始時之給藥頻率，以及這些策略如何在臨床治療上依循(由於第二或副作用如：高血壓、蛋白尿、出血、手術傷口癒合之傷害、甚至是致命的併發症如：動脈血栓形成、胃腸道穿孔及可逆性局灶性後部腦白質病(reversible posterior focal leukoencephalopathy))、給藥途徑、方法之侵襲力(invasiveness)、高劑量、生體可用率(bioavailability)、不穩定性，以及其他如高昂的成本、長期的治療，導致需要研究新穎、具有較佳表現的化合物。即便具有這些替代方案，仍存在研發用於眼部治療之抑制VEGF活性之較佳藥物的需求，藉此移除或減少副作用。
本發明描述新穎克隆及名為V19、V32R的新穎分子，以及先前提及之V13分子，其特性在於三度空間結構、序列及其對於VEGF的親和力，且可被用於治療眼部症狀，特別用於糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、新生血管性青光眼或與血管生成相關的眼科症狀。
本發明係關於名為IgNARs之基於鯊魚之治療用單株抗體的生成，其係包含免疫球蛋白的重鏈。特別地，本發明係關於這些重鏈之可變區域(vNARs)之選擇。在此情況下，其特性在於具有辨識名為血管內皮生長因子(VEGF)之細胞因子的能力。由於生物學及生物物理學上的特性，vNARs在生物技術領域中受到關注。該等vNAR抗體對於環境具有高度的抗性，且對於局部治療作用具有的高度潛力。同時，由於具有衍生自駱駝之免疫球蛋白(名為VHH)之可變結構域，vNARs係為具有辨識抗原能力的最小生物分子。由於這些特性，vNARs勝過了傳統單株抗體治療的缺點與不足。
此外，本發明係關於蛋白質之選擇、分離及純化，該等蛋白質係屬於名為VHNAR或vNAR之可變區，其係源自具有抗原受體能力之板鰓亞綱生物的IgNAR-型免疫球蛋白。該等蛋白質之來源克隆名為VEGFvNAR V32R及V19，以及相應抗體名為V32R及V19(亦被定義為v19或v32R)。
本發明描述名為V19、V32R及後續提及之V13的新穎克隆以及分子，其特性在於三度空間結構、序列及其對於VEGF的親和力，且可被用於治療眼部症狀，特別用於糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、新生血管性青光眼或與血管生成相關的眼科症狀。
為了證明新穎之克隆並非實驗室手腕(laboratory artifice)，且其實際上包含了差異性抗體(differential antibodies)，其係令人驚訝且無法預期地提供超越先前技術之技術優勢，有關克隆V13特性亦被包含於本文中-在前文美國專利8,496,933中被描述-，且為了對結果進行比較，其係被相同地以本發明所研發之分離及純化程序執行。此外，為了改善產率，在本發明之研發期間，進行不 同的測試以及表現及純化之方法，藉此檢測及得到表現及純化蛋白質的最佳條件，並得到對於每一獲得之克隆之結合與中和VEGF性能的後續評估。
〔圖1〕係為抗-VEGF蛋白vNAR V13的胺基酸序列，標示偵測出之被認為的保守結構域。
〔圖2〕係為對應克隆V13、V32R及V19之序列之間的比對。
〔圖3〕係為使用於產生構築體(constructs)之表現質體：A：pET20b+(vNAR 1及3),B：pET28a+(vNAR 2及4)。
〔圖4〕係為培養大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)直到其獲得週質部分(periplasmic fractions)以及可溶及不可溶胞質部分(cytoplasmic fractions)的程序。
〔圖5〕係為具有信號肽(signal peptide,sp)之VEGFvNAR v32R之亞細胞部分(subcellular fractions)檢測的分析：A：SDS PAGE 15%丙烯醯胺還原條件，使用考馬斯藍(Coomasie blue)染色；B：電墨點(Electroblotted)至硝化纖維素膜，使用抗-組胺酸(anti-His)(1：3000)加上結合至過氧化物酶的抗-老鼠二級抗體(1：3000)進行雜合。藉由增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影。各道(lane)之樣本：1)spVEGFvNAR v32R胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)spVEGFvNAR v32R胞外部分30℃,3)spVEGFvNAR v32R週質部分30℃；4)spVEGFvNAR v32R週質部分37℃；5)spVEGFvNAR v32R可溶胞質部分30℃；6)spVEGFvNAR v32R可溶胞質部分 37℃；7)spVEGFvNAR v32R不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))30℃；8)spVEGFvNAR v32R不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))37℃。
〔圖6〕係為不具有信號肽(signal peptide,sp)之VEGFvNAR v32R之亞細胞部分(subcellular fractions)檢測的分析：A：SDS PAGE 15%丙烯醯胺還原條件，使用考馬斯藍(Coomasie blue)染色；B：電墨點(Electroblotted)至硝化纖維素膜，使用抗-組胺酸(anti-His)(1：3000)加上結合至過氧化物酶的抗-老鼠二級抗體(1：3000)進行雜合。藉由增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影。各道(lane)之樣本：1)VEGFvNAR v32R胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)VEGFvNAR v32R胞外部分30℃,3)VEGFvNAR v32R週質部分30℃；4)VEGFvNAR v32R週質部分37℃；5)VEGFvNAR v32R可溶胞質部分30℃；6)VEGFvNAR v32R可溶胞質部分37℃；7)VEGFvNAR v32R不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))30℃；8)VEGFvNAR v32R不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))37℃。
〔圖7〕係為具有信號肽(signal peptide,sp)之VEGFvNAR v19之亞細胞部分(subcellular fractions)檢測的分析：A：SDS PAGE 15%丙烯醯胺還原條件，使用考馬斯藍(Coomasie blue)染色；B：電墨點(Electroblotted)至硝化纖維素膜，使用抗-組胺酸(anti-His)(1：3000)加上結合至過氧化物酶的抗-老鼠二級抗體(1：3000)進行雜合。藉由增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影。各道(lane)之樣本：1) spVEGFvNAR v19胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)spVEGFvNAR v19胞外部分30℃,3)spVEGFvNAR v19週質部分30℃；4)spVEGFvNAR v19週質部分37℃；5)spVEGFvNAR v19可溶胞質部分30℃；6)spVEGFvNAR v19可溶胞質部分37℃；7)spVEGFvNAR v19不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))30℃；8)spVEGFvNAR v19不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))37℃。
〔圖8〕係為不具有信號肽(signal peptide,sp)之VEGFvNAR v19之亞細胞部分(subcellular fractions)檢測的分析：A：SDS PAGE 15%丙烯醯胺還原條件，使用考馬斯藍(Coomasie blue)染色；B：電墨點(Electroblotted)至硝化纖維素膜，使用抗-組胺酸(anti-His)(1：3000)加上結合至過氧化物酶的抗-老鼠二級抗體(1：3000)進行雜合。藉由增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影。各道(lane)之樣本：1)VEGFvNAR v19胞外部分(extracellular fraction)30℃；2)VEGFvNAR v19胞外部分30℃,3)VEGFvNAR v19週質部分30℃；4)VEGFvNAR v19週質部分37℃；5)VEGFvNAR v19可溶胞質部分30℃；6)VEGFvNAR v19可溶胞質部分37℃；7)VEGFvNAR v19不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))30℃；8)VEGFvNAR v19不可溶胞質部分(包涵體(Inclusion bodies))37℃。
〔圖9〕係為對應具有信號肽之VEGFvNAR v32R不可溶胞質部分A：溶解(Solubilization)所添加之蛋白質，以及於HisTrap FF粗1ml親和層析柱(HisTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相層析 法(FPLC)(柱上重新折疊(on-column r·efolding))層析；B：藉由丙烯醯胺凝膠電泳(15% SDS-PAGE)分析。
〔圖10〕係為對應不具有信號肽之VEGFvNAR v32R不可溶胞質部分A：溶解(Solubilization)所添加之蛋白質，以及於HisTrap FF粗1ml親和層析柱(HisTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相層析法(FPLC)(柱上重新折疊(on-column refolding))層析；B：藉由丙烯醯胺凝膠電泳(15% SDS-PAGE)分析。
〔圖11〕係為對應具有信號肽之VEGFvNAR v19不可溶胞質部分A：溶解(Solubilization)所添加之蛋白質，以及於HisTrap FF粗1ml親和層析柱(HisTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相層析法(FPLC)(柱上重新折疊(on-column refolding))層析；B：藉由丙烯醯胺凝膠電泳(15% SDS-PAGE)分析。
〔圖12〕係為對應不具有信號肽之VEGFvNAR v19不可溶胞質部分A：溶解(Solubilization)所添加之蛋白質，以及於HisTrap FF粗1ml親和層析柱(HusTrap FF crude 1ml affinity columns)以快速蛋白液相層析法(FPLC)(柱上重新折疊(on-column refolding))層析；B：藉由丙烯醯胺凝膠電泳(15% SDS-PAGE)分析。
〔圖13〕係為間接酶聯免疫吸附試驗(Indirect ELISA)，裝載(upholstered)200-300ng/well之rhVEGF。一級抗體vNAR V13、V19或V32R，預產物(preps B)，藉由柱上重新折疊純化。控制組：藉由柱上重新折疊純化支一級抗體vNAR(1mg/ml)。二級抗體：兔子抗-HA 1：1000，三級抗體：山羊抗-兔子-HRPO 1：1000。控制組+抗-VEGF(Abcam)，500或50ng/well。使用TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine))顯影，測量450nm之吸光度。
〔圖14〕係為西方墨點(Western-Blot)分析。rhVEGF樣本(500ng)及BSA控制組(5000ng)之丙烯醯胺凝膠電泳(15% SDS-PAGE)。B：電墨點(Electroblotted)至硝化纖維素膜，以及隨後使用對應之vNAR(10μg)，抗-His(1：3000)加上結合至過氧化物酶的抗-老鼠二級抗體(1：3000)進行雜合。藉由增強化學發光(ECL)顯影。
〔圖15〕係為U937細胞(106)之流式細胞儀檢測(Flow cytometry)；細胞在其膜中係被通透化(permeabilized)，且以VEGFvNAR1處理，名為SP-VEGFvNARORF-6His-HA，在此例中，V13(可溶胞外)+抗-HIS抗體(1：200)+山羊抗-兔子-alexa fluor 488抗體(1：200)。a)VEGFvNAR1胞外。b)控制組抗-VEGF(Abcam)。
〔圖16〕係為U937細胞(106)之流式細胞儀檢測(Flow cytometry)；細胞在其膜中係被通透化(permeabilized)，且以VEGFvNAR2處理，在此例中，名為SP-VEGFvNARORF-6His-HA，V13(重新折疊之不可溶胞質部分)+抗-HIS抗體(1：200)+山羊抗-兔子-alexa fluor 488抗體(1：200)。A)VEGFvNAR2(重新折疊)。B)控制組抗-VEGF(Abeam)。
〔圖17〕係為VEGF之6ns模擬期間所測量之均方根誤差(Root Mean Square Deviation,RMSD)值。Y軸代表RMSD及X軸代表動力學之步驟編號(每一步驟係為2皮秒)。
〔圖18〕係為VEGF殘基(residues)之平均波動(Average fluctuations)。Y軸代表RMSD及X軸代表殘基之編號。
〔圖19〕係為重疊VEGF動力學模擬之初始(灰色)及最後(青色)結構。
〔圖20〕係為vNAR V19之5ns模擬期間所測量之均方根誤差(Root Mean Square Deviation,RMSD)值。Y軸代表RMSD及X軸代表動力學之步驟編號(每一步驟係為2皮秒)。
〔圖21〕係為vNAR V19殘基(residues)之平均波動(Average fluctuations)。Y軸代表RMSD及X軸代表殘基之編號。
〔圖22〕係為重疊vNAR V19動力學模擬之初始(灰色)及最後(青色)結構。
〔圖23〕係為vNAR V32R之20ns模擬期間所測量之均方根誤差(Root Mean Square Deviation,RMSD)值。Y軸代表RMSD及X軸代表動力學之步驟編號(每一步驟係為2皮秒)。
〔圖24〕係為vNAR V32R殘基(residues)之平均波動(Average fluctuations)。Y軸代表RMSD及X軸代表殘基之編號。
〔圖25〕係為vNAR V32R結構之影像，藉由色彩顯示於動力學模擬期間之波動，從紅色(具有較大可動性之區域)至藍色(較為靜態)。
〔圖26〕係為重疊vNAR V32R動力學模擬之初始(灰色)及最後(青色)結構，可以深藍色強調動性最大的區域。
〔圖27〕係為vNAR V32R之動力學模擬之每一瞬間的結合自由能值(每一步驟係為2皮秒)。Y軸代表全域能量(global energy)單位為kcal/mol及X軸代表動力學之步驟編號。
〔圖28〕係為vNAR V32R於動力學模擬期間所達到之密度能量(Density energy)值。Y軸顯示密度及X軸顯示全域能量(global energy)單位為kcal/mol。虛線代表與分佈相關之高斯函數(Gaussian function)。
〔圖29〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V19(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式1。
〔圖30〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V19(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式2。
〔圖31〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V19(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式3。
〔圖32〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V19(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式4。
〔圖33〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V19(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式5。
〔圖34〕係為複合體控制組(2Z8V)之交互作用的地圖。該圖顯示V19同源物(homolog)(垂直標示之D鏈)以及其受體(水平標示之A鏈)之間的交互作用。色階係基於交互作用能量之值：顏色較紅係表示較為良好的交互作用，以及顏色較藍係表示較不良好的交互作用。
〔圖35a、35b、35c、35d、35e〕係為VEGF-V19複合體之交互作用的地圖。該圖顯示V19(垂直標示之C鏈)以及其受體(水平標示之A鏈及B鏈)之間的交互作用。色階係基於交互作用能量之值：顏色較紅係表示較為良好的交互作用，以及顏色較藍係表示較不良好的交互作用。
〔圖36〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V32R(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式1。
〔圖37〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V32R(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式2。
〔圖38〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V32R(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式3。
〔圖39〕係為VEGF(以綠色和青色鏈結)與vNAR V32R(以洋紅色鏈結)之複合體(complex)的模式4。
〔圖40a、40b、40c、40d〕係為VEGF-V32R複合體之交互作用的地圖。該圖顯示V19(垂直標示之C鏈)以及其受體(水平標示之A鏈及B鏈)之間的交互作用。色階係基於交互作用能量之值：顏色較紅係表示較為良好的交互作用，以及顏色較藍係表示較不良好的交互作用。
〔圖41〕係為VEGF之雙硫橋鍵(Disulfide bridges)。
〔圖42〕係為vNAR V19之雙硫橋鍵(Disulfide bridges)。
〔圖43〕係為vNAR V32R之雙硫橋鍵(Disulfide bridges)。
〔圖44〕係為多重序列比對。
〔圖45〕係為V19(黃色)結合至VEGF(綠色)之抗原結合部位(CDRs)(洋紅色)的呈現。
〔圖46〕係為V19與VEGF之抗原結合部位區域之更為重要的交互作用。a)V19之ARG101與VEGF之GLU17。b)GLU103與ARG10。
〔圖47〕係為V32R(黃色)結合至VEGF(綠色)之抗原結合部位(CDRs)(洋紅色)的呈現。
〔圖48〕係為V32R與VEGF之抗原結合部位區域之更為重要的交互作用。a)V32R之GLU98與VEGF之ARG43及GLN24。b)V32R之LYS95與VEGF之GLU25；ARG100與GLU54；TYR104與CYS55。
〔圖49〕係為原位(in situ)重新折疊HisTrap應用模板(HisTrap application template)之理論梯度。總分離時間=160分鐘+樣本之應用時間。
〔圖50〕係為實驗之設計。係顯示於96孔ELISA盤中測試之vNAR抗體濃度(為進行4重複，需要A-H行，1-12欄)，以及在整個實驗中係使用陽性對照(positive control)及陰性對照(negative control)。
〔圖51〕係為顯示在使用抗體的情況下管狀結構長度(tube length)分析之曲線下面積之平均加上標準差的直方圖：(A)參考抗體*；(B)V13**；(C)V32R；(D)V19。*蘭尼單抗(Ranibizumab(Genentech/Roche))。**參考專利US 8,496,9335中的克隆。
〔圖52〕係為顯示在使用抗體的情況下分支點(branching points)分析之曲線下面積之平均加上標準差的直方圖：(A)參考抗體*；(B)V13**；(C) V32R；(D)V19。*蘭尼單抗(Ranibizumab(Genentech/Roche))。**參考專利US 8,496,9335中的克隆。
〔圖53〕係為VEGF及vNAR V32R抗體在網絡形成之效果的圖像。未經處理之控制組(A)在14天的測試的過程中，顯示最小的管狀結構形成。相對於控制組，使用VEGF 4ng/mL顯示管狀結構形成之增加(B)。可觀察到，V32R抗體的濃度越高，管狀結構形成則越低(C-H)。
〔圖54〕係為VEGF及vNAR V19抗體在網絡形成之效果的圖像。未經處理之控制組(A)在14天的測試的過程中，顯示最小的管狀結構形成。相對於控制組，使用VEGF 4ng/mL顯示管狀結構形成之增加(B)。可觀察到，V19抗體的濃度越高，管狀結構形成則越低(C-H)。
〔圖55〕係為VEGF及vNAR V13*抗體在網絡形成之效果的圖像。未經處理之控制組(A)在14天的測試的過程中，顯示最小的管狀結構形成。相對於控制組，使用VEGF 4ng/mL顯示管狀結構形成之增加(B)。可觀察到，V13抗體的濃度越高，管狀結構形成則越低(C-H)。*參考專利US 8,496,9335中的克隆。
〔圖56〕係為VEGF及參考抗體*在網絡形成之效果的圖像。未經處理之控制組(A)在14天的測試的過程中，顯示最小的管狀結構形成。相對於控制組，使用VEGF 4ng/mL顯示管狀結構形成之增加(B)。可觀察到，參考抗體的濃度越高，管狀結構形成則越低(C-H)。*蘭尼單抗(Ranibizumab(Genentech/Roche))。
本發明係關於名為IgNAR(藉由新抗原受體之縮寫)之基於鯊魚之治療用單株抗體的生成，其係包含免疫球蛋白的重鏈。特別地，本發明係關 於這些重鏈之可變區域(vNARs)之選擇。在此情況下，其特性在於具有辨識名為血管內皮生長因子(VEGF)之細胞因子的能力。由於生物學及生物物理學上的特性，vNARs在生物技術領域中受到關注。該等vNAR抗體對於環境具有高度的抗性，且對於局部治療作用具有的高度潛力。同時，由於具有衍生自駱駝之免疫球蛋白(名為VHH)之可變結構域，vNARs係為具有辨識抗原能力的最小生物分子。由於這些特性，vNARs勝過了傳統單株抗體治療的缺點與不足。
本發明係關於蛋白質之選擇、分離及純化，該等蛋白質係屬於名為VHNAR或vNAR之可變區，其係源自具有抗原受體能力之板鰓亞綱生物的IgNAR-型免疫球蛋白。該等蛋白質之來源克隆名為VEGFvNAR V32R及V19，以及相應抗體名為V32R及V19(亦被定義為v19或v32R)。
本發明亦關於基於vNAR之生物製藥的研發，由於其係對於血管內皮生長因子(VEGF)具有高度且非常專一性的親和力，其可阻礙VEGF。針對所產生之分子，係已進行不同的分離及純化程序。其特性在於例如：序列及三度空間結構之固有性質，以及對於目標分子的親和力與辨識能力，這使得其相較於其他相關分子具有更有效率的中和能力。
用於選擇克隆的載體係為：pCOMb3X，其對於氨苄青黴素(Ampicillin)及羧芐青黴素(Carbenicillin)具有抵抗力。生產菌株(production strain)係為ER2537，以及所使用之表現菌株(expression strains)係為TOP10F’及BL21(DE3)，因為蛋白酶的缺乏對於改善產率具有貢獻，後者被選擇用於表現。
在實施例1中，說明藉由噬菌體呈現進行免疫接種之V19及V32R克隆來源樣本之基因庫的獲得，亦說明先前技術中提及之V13克隆，其係用於比較V19及V32R之特性。使用vNAR蛋白進行ELISA，其係自TOP10F’所表現之週 質間隙(periplasmic space)中選擇。在用於表現及辨識抗-VEGF vNAR的ELISA結果中，藉由對於VEGF的親和力篩選克隆，並隨後獲得每一克隆的序列。
為了證明新穎之克隆並非實驗室手腕(laboratory artifice)，且其實際上包含了差異性抗體(differential antibodies)，其係令人驚訝且無法預期地提供超越先前技術之技術優勢，有關克隆V13特性亦被包含於本文中-在前文美國專利8,496,933中被描述-，且為了對結果進行比較，其係被相同地以本發明所研發之分離及純化程序執行。
用於編碼對於VEGF具有專一性之克隆V13之蛋白質的DNA序列係如下列所示(於序列表中，標示為SEQ.ID NO：1)。實施例4描述獲得該序列之方法：
所獲得之克隆V13，其特性在於對於人類VEGF具有高度專一性，其胺基酸序列係如下列所示(於序列表中，標示為SEQ.ID NO：2)：
圖1係顯示抗-VEGF蛋白vNAR V13的胺基酸序列，標示美國專利8,496,933所描述的保守結構域。
克隆V19係選擇自物種斑紋鬚鯊(Orectolobus maculatus)之針對細胞因子VEGF165之第四輪篩選(panning round 4)。
克隆V19(418bp)之質體DNA序列係如下列所示，其係對應SEQ.ID.NO.3：
vNAR19(V19)之胺基酸序列係對應SEQ.ID.NO.4：
克隆V32R(421bp)之質體DNA序列係如下列所示，其係選擇自採用第四輪免疫接種計畫之物種佛氏虎鯊(Heterodontus francisci)，係對應SEQ.ID.NO.5：
vNAR v32R之胺基酸序列係對應SEQ.ID.NO.6：
圖2係為對應克隆V13、V32R及V19之序列之間的比對，係作為參照，且標示其中的差異。
為了改善先前獲得的產率，在本發明之研發期間，進行不同的測試以及表現及純化之方法，藉此檢測及得到表現及純化蛋白質的最佳條件，並得到對於每一獲得之克隆之結合與中和VEGF性能的後續評估。
基因之合成係將編碼VEGFvNAR抗體之基因的羧基端融合至6His及HA標記(6His and HA tags)。此一合成的關鍵特徵在於最佳化用於在大腸桿菌(Escherichia coli)中表現的密碼子(codons)。該合成基因係於二細菌質體中克隆。其係用於轉形合適之大腸桿菌DH5α菌株細胞。表1顯示被用於測試V13、V19 y V32R之各個序列的構築體。
圖3A及圖3B所示之使用於產生構築體之表現質體係為pET20b+(vNAR 1及3)，以及pET28a+(vNAR 2及4)。目的序列(sequence of interest)的亞克隆(Subcloning)被於載體中表現，其係包含信號肽pelB。
VEGFvNAR的克隆係於細菌表現載體(pET20b+)中執行。藉由使用特定寡核苷酸(oligonucleotides)的聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)，自合成基因中放大以及分離重組抗體的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)。藉由限制酶(restriction enzymes)的使用，放大的片段被亞克隆至特定選擇的細菌表現載體中，且包含pelB信號，當被表現時，其可引導蛋白質至週質。於合適之大腸桿菌DH5α菌株細胞中轉形連接混合物(質體+插入序列(insert))後，獲得該克隆。
未包含信號肽pelB之插入目的序列進入載體的亞克隆：並行地執行於細菌表現載體(pET28a+)中的VEGFvNAR克隆，以及自同樣的合成cDNA模板執行該抗體之第二亞克隆，該模板係被用於先前之克隆，但此時排除用於引導蛋白質至週質的信號肽。
在pET20b+及pET28a+中，藉由於固體培養基(LB瓊脂(LB Agar)/氨苄青黴素(Ampicillin))中選擇來個別化(individualized)，獲得轉形體(transformants)，以及藉由用於保存之基因結構以及藉由序列測定之質體DNA分析，作為驗證方法，選擇二轉形體。
使用最後一點之純化的重組DNA，我們後續轉形於適合表現蛋白質的大腸桿菌品系，一菌株其係缺乏蛋白酶，如前所述之BL21(DE3)菌株。所獲得的克隆係被個體化，以及其性質係藉由菌落-PCR(colony-PCR)及瓊脂糖凝膠電泳確認。
藉由使用陽性克隆，蛋白質的表現係被小規模的評估，係於二溫度下(30℃及37℃)開始50ml的細菌培養，以及二培育時間：16及20小時。為了得到用於製造蛋白質的最好條件，溫度及時間之變因係被研究。此一試驗性研究(pilot study)係基於液體培養基中的細菌培養，其係使用大腸桿菌BL21(DE3)中的生產克隆及表現誘導物異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
培養基係進行離心程序，藉此將細胞從培養基質中分離。處理該細胞以獲得週質部分，一方面，藉由蔗糖-介質滲透壓衝擊(sucrose-mediated osmotic shock)；以及另一方面，使用溶菌酶(lysozyme)、清潔劑(detergent)及超音波處理(sonication)將其溶解，以自其中萃取藉由離心分離之可溶及不可溶細胞內成分。程序示意圖係如圖4所示，於實施例3中描述其方法。
在此階段，於每一不同的細胞部分，分析目標重組蛋白(recombinant protein of interest)的表現量(分泌至培養基質、週質、胞質及包涵體的蛋白質)，藉此評估於每一細胞部分中的蛋白質量，以及接著確定其功能，亦即針對獲取自每一部分的蛋白質，評估其對於hVEGF之辨識或專一性結合能力。
所有克隆的構築體，不論是否具有信號肽，皆被實施，保留組胺酸尾巴(histidine tails)以及HA。每一構築體的表現量皆被評估。
vNARs蛋白質的不同位置，分泌或細胞內(可溶或不可溶部分)，皆被分析。表2呈現之結果係對應於vNAR的表現量。此一結果顯示，vNAR蛋白質係被表現而形成包涵體(inclusion bodies)，這意味其發生於不可溶細胞內部分中。
細胞外的VEGFvNAR1係為原先考量的最佳候選之一。其係藉由電泳識別，但藉由ELISA進行親和力測試之後，我們發現此一蛋白質部分對於目標分子幾乎沒有親和力，而不可溶細胞內係為最具有活性的部分。實施例2描述生產克隆BL21(DE3)的獲得，以及進一步之程序直到進行西方墨點法(Western blot)及ELISA分析，以測量辨識先前純化之每一vNAR的表現。
實施例3描述獲得亞細胞部分：週質、細胞外以及可溶細胞內及對應於該包涵體之不可溶細胞內的程序。在每一部分中，測試蛋白質濃度，同時進行西方墨點法分析。其結果係顯示於圖5至圖8。
從所獲得的結果中，我們得到信號肽的存在於任何部分中並未改善表現之結論；進一步，不可溶胞內部分的包涵體中，信號肽之缺乏係改善了所獲得之不同vNARs的濃度。
由於活性vNARs蛋白質係藉由前述提及之重組方法所獲得，其係被發現於包涵體中形成，本發明之研發期間中所進行之研究係藉由施行特定的替代方法，該方法涉及溶解該等蛋白質，藉此解聚(disaggregate)該等蛋白質，以及在無論過程、不犧牲蛋白質對於目標分子的結合能力的情況下，獲得純化狀態及可溶的蛋白質。
為了改善先前獲得的產率，在本發明之研發期間，進行不同的測試以及表現及純化之方法，藉此檢測及得到表現及純化蛋白質的最佳條件，並得到對於每一獲得之克隆之結合與中和VEGF性能的後續評估。
使用於V13分子之第一純化方法，係為名為工作檯上重新折疊(On-bench refolding)之方法，基本上，其係包含下列步驟：1)藉由超音波處理裂解細胞；2)分離包涵體；3)使用尿素之緩衝液溶解；4)藉由親和力層析柱或固定化金屬離子(TALON TM )純化；5)使用包含穀胱甘肽氧化還原系統(glutathione redox system(GSH,G-S-S-G))重新折疊；以及6)洗脫(elution)穩定化的蛋白質，以及使用非變性緩衝液(non-denaturing buffers)使其在透過親和力層析法(His陷阱(His Trap))的過程中重新折疊。
本發明所包含的替代性方法，名為柱上重新折疊(on-column refolding)(或稱原位重新折疊(refolding in situ))，包含下列步驟：1)藉由超音波處理裂解細胞；2)分離包涵體；3)使用氯化胍(guanidine chloride)溶解，藉由於His-Trap管柱上層析來純化蛋白質，以及使用尿素之變性緩衝液柱上重新折疊(column refolding)；4)洗脫穩定化及重新折疊的蛋白質。使用上述二方法， vNARs將經歷變性及重新折疊的過程，以再次獲得其三級結構，以下進一步詳述其細節。
柱上重新折疊技術之程序的進行，係始於經大腸桿菌中表現最佳化之包含目標序列的質體。係使用包含開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)之設計，其係編碼一由vNAR抗體以及六個HIS及HA標籤所組成的融合蛋白質。這些標籤被融合至該目標分子是必需的，因為其使得所表現之生物系統產物及其後續之純化可被監控；此時，使用標準化程序，這些標籤的存在並不會以任何方式干擾該分子的性能，且其在後續的生產階段將被移除。
柱上重新折疊之方法係為一種純化之程序，其係藉由固定化金屬上的親和力層析；使用特定用於具有六個His的融合蛋白的親和力樹脂，此時目標蛋白質係位於不可溶部分中。在柱上重新折疊程序發生前，該蛋白質係使用氯化胍溶解(Solubilization)。在柱上重新折疊程序期間，該變性蛋白質的樣本係注入管柱中，其中當保留結合緩衝液(A1)時，該蛋白質係藉由親和力留置於管柱中，請見實施例5。當轉換至溶解緩衝液(A2)後，重新折疊梯度(refolding gradient)開始上升至100%。此時，蛋白質重新折疊的程序係以完成。隨後，此一緩衝液係逐漸由洗脫緩衝液(A3)取代，這造成原先結合至親和力管柱之蛋白質的釋放。最後，該包含蛋白質的洗脫部分係藉由丙烯醯胺凝膠電泳-SDS(acrylamide gel electrophoresis-SDS)進行分析，以研究其尺寸及組成。
於280nm下具有一吸光值的1ml部分，係為溶解形式且藉由親和力管柱固定，以及其係原位(in situ)重新折疊，且隨後藉由添加咪唑(imidazole)於不同部位來進行洗脫。
此一層析法系統所洗脫之蛋白質，係藉由丙烯醯胺凝膠電泳(每一部分15μL)分析，以及藉由西方墨點法來驗證其性質。由此回收之樣本被建立於20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris HCl)，0.5M NaCl，1mM β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)，0.3M咪唑(imidazole)，100mM L-精胺酸(L-arginine)之緩衝液中。此一程序之結果係於圖9至圖12中描述。隨後，藉由分析其結合至目標分子(人類VEGF A同功型(isoforms)165)之特性，進行抗-VEGF vNAR之功能驗證。為了功能驗證所進行之分析係為ELISA、斑點墨點法(Dot-blot)、西方墨點法以及流式細胞儀、免疫螢光法(immunofluorescence)及免疫組織化學法(immunohistochemistry)。可以看到反映出較高親和力的蛋白質係為V32R，以及所有蛋白質在親和力方面皆超越了已核准之美國專利8,496,933中所提及之V13分子。當使用二種不同的程序針對相同之V13分子進行比較，可觀察到所獲得的改善係藉由施行「新穎」的方法所達成。ELISA檢測之結果係顯示於圖13。西方墨點法分析之結果係顯示於圖14。
圖14顯示在一比較方法中，本發明之vNAR V19及V32對照所獲得的V13蛋白質，可辨識VEGF之數量上的差異。新蛋白質V19及V32R，相較於V13，皆顯著具有較高的親和力及辨識能力。
抗-VEGF vNAR分子已被最佳化，以及其親和力特性已被顯著地提升，因此，其中和能力亦被提升，且中和VEGF所需要的vNAR量係被降低。見實施例10。
簡言之，在親和力測試中，我們發現所獲得之新的目標分子在親和力及活性方面，係高於美國專利8,496,933中所獲得之分子。
藉由流式細胞儀檢測，對於純化及重新折疊之vNARs進行功能驗證。為達此一目的，使用可表現不同細胞因子(cytokines)及趨化因子(chemokines)之U937細胞株，該細胞株係為骨髓系統(myeloid lineage)之單核細胞(monocytes)。VEGF係被持續的表現及分泌。此一細胞株係為生物醫學科學中常用之模型。在細胞內水平之抗-VEGF vNAR V13、V19及V32R的結合能力係被測定。該檢測係在實施例6中被描述。V13之結果係顯示於圖15及圖16。
本發明所提供之分子係藉由電腦模擬(in silico)了解特性。藉由同源模擬法(homology modeling)製備三維結構(三級)，並藉由分子動力學模擬(molecular dynamics simulations)精製(refinement)該結構。
透過三個連續的篩選，尋找最佳結構：1)基於其接觸模式(pattern of contacts)之複合體分組(complex grouping)；2)每一組別之最佳代表的初步能量分析；3)對於具有較佳能量的二蛋白質-蛋白質複合體(complex protein-protein)進行分子動力學模擬，來尋找最穩定的結合模式。針對最佳結構分析交互作用之能量模式。
分析V19之相近同源物(homologue)與AMA1蛋白質(蛋白質資料庫(Protein Data Bank,PDB)編號：2Z8V)之交互作用，做為控制組，這為此一型態的交互作用提供了結合自由能(free-energy-of-binding)的參照。
在V19與VEGF分子的情況中，係自已經被發表之現有的同源物結晶結構中產生最佳結構，在此情況下僅缺失的殘基被建模，以及藉由分子動力學模擬鬆弛(relaxed)所得結構。所使用的模擬時間係為5-6奈秒(ns)。V19蛋白質的結構係源自蛋白質資料庫(Protein Data Bank,PDB)編號：1VES19之結晶結 構，將丙胺酸111變異(mutating)為纈胺酸。VEGF蛋白質之晶體係自蛋白質資料庫(Protein Data Bank,PDB)編號：1VPF20獲得。
於分子動力學模擬的過程中，測量蛋白質相較於起始結構的方均根偏差(Root-mean-square deviation,RMSD)，藉此評價該結構的穩定性。較小的RMSD值代表較為穩定。於全域及殘基層級皆進行測量。分析該結構後，獲得蛋白質-蛋白質複合體。為此，針對每一複合體，進行多個蛋白質-蛋白質(嵌合)分析，其中評價不同的結合區域及方位，直到確定何者最佳。
VEGF
在動力學模擬的過程中，全域波動值(fluctuation global values)(RMSD)並未超過2Å(圖17)，但在此值附近有許多的波動。此一系統係為一二聚體(dimer)，其係由二組藉由一或二轉折之α螺旋連接之β摺板所組成。這些結構模組(motifs)具有高度可動性，其產生了所述的波動。
除了大約每25個殘基坐落之β摺板的交互連結環圈(interconnecting loops)之外，一般而言，每一殘基的的波動並未超過2Å(圖18)。由於其係為二聚體(dimer)，該波動模式在二次單元(subunits)中重複。
經疊合，起始結構與最後500皮秒(ps)之模擬的最小化平均結構相符(圖19)。
V19
在整體的波動方面，該系統係穩定的。分子動力學模擬過程中，全域RMSD值並未超過2Å(圖20)。V19之結構係由多個藉由迴圈連結的β摺板所組成，這些迴圈的可動性以及其對於溶劑的重新定向，造成蛋白質的RMSD產生波動。
殘跡85-100之間的區域的波動值達到4Å，除此之外，各殘基的波動是低的(圖21)，一般而言並未超過2Å。此一區域對應於抗體的可變區域，係由皆由一環圈連接之二β摺板所組成，其具有高度彈性，以及其係為用於結合至其他蛋白質之辨識位置(recognition site)。
當疊合起始結構與最後500皮秒(ps)之模擬的最小化平均結構時，除了先前提及位於殘基85-100的迴圈之外，可觀察到結構之間的相似度(圖22)。
V32R
進行同源建模(homology modeling)，並藉由分子動力學模擬精製(refinement)。其係起始於一基於結構2Z8V18及2I2621之模型，使用20奈秒(ns)之模擬時間。於分子動力學模擬的過程中測量相對於起始結構的RMSD值，藉此評價所述結構的穩定性，於全域及殘基層級皆進行測量。
整體的波動達到4Å。在第一奈秒中，該模型移動離開其初始結構，在其餘的模擬過程中保持穩定(圖23)。
各殘基之波動顯示，在位於殘基40-50及90-110之間的二區域有顯著的波動，到達超過4Å之值。一旦對應殘基90-110的迴圈展開(unfolding)，該蛋白質係為穩定。剩餘的波動在連接β摺板之迴圈及C-末端(C-terminal end)中累積(見圖24)。
圖25顯示呈現vNAR V32R之大可動性之區域的影像。在疊合起始結構與最後500皮秒(ps)之模擬的最小化平均結構中，可發現二結構相似。在殘基G89-Y105及R39-R49偵測到波動(圖26)。V32R的能量分析顯示，該分子最有可能的能量值係為-3250Kcal/ml(圖27及圖28)。
蛋白質-蛋白質嵌合(Protein-protein docking)
使用蛋白質-蛋白質嵌合之技術建立交互作用模型。所獲得的結果係經篩選，藉此尋找不同的結合區域及最佳方位。該篩選之步驟係如下述：
1)基於其接觸模式(pattern of contacts)之複合體分組(complex grouping)，以及移除其中vNARs並非透過抗體辨識迴圈與VEGF交互作用的解決方案。
2)藉由計算自適應泊松-玻爾茲曼解算(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver,APBS)研究受體及配體之靜電力，以及消除觀察到靜電衝擊(electrostatic shocks)的解決方案。
3)每一組別之最佳代表的初步能量分析。計算其他模型的能量，以及以二蛋白質之接觸表面之間的函數校正其值。
4)基於下列條件，選擇用於研究的模型：
●總能量值(kcal/mol)
●凡得瓦能量(Van der Waals energy)
●凡得瓦能量以及氫橋之能量(energy of the hydrogen bridges)
V19-VEGF之蛋白質-蛋白質嵌合
為了研究結構、能量穩定性及接觸地圖(contact map)，經此一篩選程序後，獲得5個結合模式(圖29-33)，並對其施行分子動力學模擬。
相對於控制組模型之能量比較
為了試圖選擇出最能表現VEGF及V19之間之結合模式的模型，對照控制組複合體(在2Z8V晶體中的V19同源物)，針對每一模型之交互作用能量，進行比較研究。基於交互作用表面校正該等能量值；由於能量係以總和的 方式計算，所獲得的數值與所涉及之表面之間，存在顯著相關性。另一方面，總能量中包含一庫倫項(Coulomb term)；亦包含其他與凡得瓦力相關之能量，以及氫橋之強度，以完成總能量之計算。在AMA1-V19同源物複合體的情況中可觀察到，當選擇人為的實際交互作用時，不具庫倫項之能量評價較具區別性。表3之結果中亦呈現個別能量。
表3顯示所選擇之VEGF-V19複合體模型的交互作用能量(kcal/mol)。其係計算分子動力學模擬中最後500皮秒(ps)之最小平均結構之能量值及遮蔽表面(occluded surface)。(Etotal：總能量；Evdw：凡得瓦能量；EHB：氫橋能量；SASA：溶劑可及之表面區域(solvent accessible surface area))。
鑒於上述資料，以及先前章節所研究的結構穩定性，捨棄模型2之VEGF與V19的結合模式。
相對於控制組模型之接觸比較
圖34顯示每一模型的接觸矩陣(contact matrices)，以於控制組複合體(在2Z8V晶體中的V19同源物)之接觸進行比較。考量晶體中的V19及其受體 之間的交互作用，我們可以說V19中的交互作用具有三個區域(Zone)：區域1，其係對應X-末端(X-terminal end)(殘基1-2)；區域2，其係包含殘基25-35之間，對應次級辨識迴圈；以及區域3，其係涉及位置89及103之間的殘基，對應主要辨識迴圈。
在VEGF-V19複合體模型的交互作用地圖(interaction maps)中(圖35a-35e)，可確認參照控制組中的V19所預期之結合區域的重複。
所有獲得的數據及波動模式顯示，我們的分子的模型與模型1(圖29)相符，其係因模型1在模擬過程中，提供了最佳的結構穩定性及交互作用能量，此外，其係具有與控制組複合體(vNAR V19之同源物與AMA1)相似的交互作用模式。
vNAR V32R-VEGF之蛋白質-蛋白質嵌合
隔離涵蓋主要方位之4個VEGF與vNAR V32R之結合模式。分析20奈秒之分子動力學模擬過程中的能量，藉此確定其結構以及其交互作用地圖。為此，我們以VEGF及vNAR V32R經精製(refining)後，所獲得的結構作為開始。隨後，使用蛋白質-蛋白質嵌合技術，產生交互作用模型。所獲得之結果係經篩選，藉此尋找不同的結合區域及最佳方位，其係依循前述實施例中的程序。
相對於控制組模型之能量比較
為了試圖選擇出最能表現VEGF及V32R之間之結合模式的模型，對照控制組複合體(在2Z8V晶體中的V19同源物)，針對每一模型之交互作用能量，進行比較研究。基於交互作用表面校正該等能量值；由於能量係以總和的方式計算，所獲得的數值與所涉及之表面之間，存在顯著相關性。另一方面，總能量中包含一庫倫項(Coulomb term)；亦包含其他與凡得瓦力相關之能量， 以及氫橋之強度，以完成總能量之計算。在AMA1-V19同源物複合體的情況中可觀察到，當選擇人為的實際交互作用時，不具庫倫項之能量評價較具區別性。因此，在本例中此一型態的個別能量係被強調。表4顯示所選擇之VEGF-V19複合體模型的交互作用能量(kcal/mol)。其係計算分子動力學模擬中最後500皮秒(ps)之最小平均結構之能量值及遮蔽表面(occluded surface)。(Etotal：總能量；Evdw：凡得瓦能量；EHB：氫橋能量；SASA：溶劑可及之表面區域(solvent accessible surface area))。
鑒於上述資料，以及先前章節所研究的結構穩定性，捨棄模型4之VEGF與v32R的結合模式。
相對於控制組模型之接觸比較
如同V19-VEGF嵌合之例，每一模型的接觸矩陣(contact matrices)係與控制組複合體(在2Z8V晶體中的V19同源物，圖34)之接觸進行比較。在複合體模型VEGF-V32F之交互作用地圖(圖40a-40d)的例子中，可期待觀察到控制組中的V19之結合區域的重複。
所有獲得的數據及波動模式顯示，我們的分子的模型與模型3(圖38)相符，其係因模型3被認為具有最佳的結構穩定性及交互作用能量參數。此外，其係再現在控制組複合體中所觀察到的交互作用模式。基於所有前述數據，可獲得額外之資訊，更為廣泛地支持本發明之分子的特性：
雙硫橋(Disulfide bridges)
研究中所處理的蛋白質中所呈現的雙硫鍵(disulphide bridges,SS)係揭示如下。特別地，形成雙硫橋的半胱胺酸，在FASTA格式(文字為基礎的格式，用於呈現核苷酸序列或多肽序列，其中使用單一字母的編碼呈現核苷酸或胺基酸)的序列中，被以黃色X標記。下列係敘述各個形成雙硫橋的半胱胺酸對。蛋白質係從殘跡編號1開始編號，且其係連續，即使有鏈的改變。
VEGF
二聚體在每一次單元中具有3個雙硫橋，且具有2個介於次單元之間的雙硫橋，共具有8個雙硫橋，這意味著16個半胱胺酸(圖41及表5)。
>VEGF：A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.7)：
>VEGF：B|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.7)：
vNAR V19
其係為由二組β摺板所組成的單體(monomer)，具有單一鍵結該二組摺板的雙硫橋，這意味著2個半胱胺酸(22-83)(圖42)。
>v19|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.8)：
在最佳化用於在大腸桿菌中生產的密碼子(codons)的過程中，序列SEQ.ID.NO.4及SEQ：ID：NO：8中畫底線的胺基酸序列有所不同。這並未改變其結構，後續試驗所證實之序列係為SEQ.ID.NO.4，因此，其係為工業規模生產V19的較佳實施例。
vNAR V32R
其係為由二組β摺板所組成的單體(monomer)，具有單一鍵結該二組摺板的雙硫橋，這意味著2個半胱胺酸(24-85)(圖43)。
>v32R|PDBID|CHAIN|SEQUENCE(SEQ.ID.NO.9)：
值得注意地，SEQ.ID.NO.9中最後5個畫底線的胺基酸係為前述的組胺酸標籤，且在工業化生產中被移除，因此，V32R的較佳實施例係對應SEQ.ID.NO.6。
互補性決定區域(Complementarity Determining Regions,CDRs)
使用局部BLAST伺服器(基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)的英文縮寫)搜尋該抗體的序列，使用非冗餘(non-redundant)資料庫。這些序列和回收的抗體之間，至少具有70%的相同度(identity)。隨後，將由BLAST所獲得的序列與抗體序列進行多重比對(multiple alignment)。未達此一目的，係使用MAFFT(使用快速傅立葉變換之多重比對(Multiple Alignment using Fast Fourier Transform)的英文縮寫)軟體。
在此一多重比對中，可觀察到其係此一類型的抗體中的不可變及可變區域(與CDRs相關)。如圖44所示，其明顯具有保守區域(conserved regions)、其他半保留(semi-preserved)區域，以及最後的可變區域(variable regions)，其係提供專一性。
可觀察到2個明顯不同的CDRs：
˙CDR 1：介於位置45及51之間
˙CDR 2：介於位置105及139之間
這些參照全域編號的位置係藉由序列組的多重比較所提供。在圖45及圖47中，顯示與V19及V32R有關的CDRs區域的概觀。一些CDRs區域與VEGF之間最重要之交互作用的細節，係顯示於圖46a、圖46b及圖48a、圖48b。
體外(in vitro)模型中的抗-血管生成(Anti-angiogenic)活性
vNAR抗體的活性：V13(先前於美國專利8,496,933中被描述)、V19及V32R係藉由使用CellPlayer ®血管生成套組的體外抗-血管生成試驗，來進行分析。此一研究的目的在於，確認V13、V19及V32R抗體是否具有抑制血管生成(angiogenesis)的能力以及各抗體之間的差異，如實施例10所述，其係對照市售抗體(Genentech/Roche)，分析形成參數以及管的分支情形。
從此一研究中，我們可以斷定vNAR V13(先前於美國專利8,496,933中被描述)、V19及V32R抗體對於藉由VEGF細胞因子調節的血管形成進程係具有抑制能力，其係具有與市售抗體(Genentech/Roche)相似的動力學特性(kinetics behavior)(圖50~圖52)。在所有的例子中，可觀察到抗體濃度依賴(antibody concentration-dependent)的血管生成抑制效果。考量2個參數的抑制值(Inhibition values,(IC50))(表6)顯示，相較於V13抗體(先前於美國專利8,496,933中被描述)，V19及V32R皆僅需要少於12分之1的濃度即可對於血管生成產生抑制效果，其與市售對照抗體(Genentech/Roche)的濃度相近。
本發明之實施方式
本發明之目的係為提供一種抗-VEGF分子，其係可用於治療或預防糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)或濕性年齡相關的黃斑變性(wet age-related macular degeneration)及涉及VEGF調節之新生血管形成的眼科症狀，以及其活性成分係由vNAR蛋白質所 構成，該蛋白質係被分離及純化，其特性在於特定的胺基酸序列、三級結構及顯著增加之對於VEGF的親和力及中和與辨識能力。該vNAR重組蛋白質係被稱為V13、V19及V32R，以及其胺基酸序列係被分別定義為SEQ.ID.NO：2、SEQ.ID.NO：4及SEQ.ID.NO：6，其個別皆為本發明之實施方式。
本發明之實施方式包含但不限於將vNAR V32R及V19蛋白質使用於眼部給藥，為涉及新生血管形成現象之病理學過程的治療及預防提出貢獻，該病理學過程可為下列之任一者：視網膜新生血管形成(Retinal Neovascularization)、脈絡膜新生血管形成(Choroidal Neovascularization)、角膜新生血管形成(Corneal Neovascularization)、黃斑變性(Macular Degeneration)、年齡相關的黃斑變性(Age-Related Macular Degeneration)、視網膜疾病(Retinal Diseases)、糖尿病性視網膜病變(Diabetic Retinopathy)、玻璃體出血(Vitreous Hemorrhage)、視網膜出血(Retinal Hemorrhage)、脈絡膜炎(Choroiditis)、視網膜脫離(Retinal Detachment)、視網膜玻璃膜疣(Retinal Drusen)、新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)、脈絡膜疾病(Choroid Diseases)、葡萄膜炎(Uveitis)、近視(Myopia)、眼部疾病(Eye Diseases)、真菌性眼部感染(Fungal Eye Infections)、微血管擴張(Telangiectasia)、視網膜動脈阻塞(Retinal Artery Occlusion)、退化性近視(Degenerative Myopia)、視網膜靜脈阻塞(Retinal Vein Occlusion)、脈絡膜視網膜炎(Chorioretinitis)、組織胞漿菌病(Histoplasmosis)、葡萄膜疾病(Uveal Diseases)、德國麻疹(Rubella(German Measles))、眼部弓形蟲病(Ocular Toxoplasmosis)、視網膜上膜(Epiretinal Membrane)、缺損(Coloboma)、脈絡膜腫瘤(Choroid Neoplasms)、視網膜變性(Retinal Degeneration)、視網膜炎(Retinitis)、視網膜穿孔(Retinal Perforations)、皰疹性角膜炎(Herpetic Keratitis)、早產兒的視 網膜病變(Retinopathy of Prematurity)、黃斑囊樣水腫(Cystoid Macular Edema)、視乳頭水腫(Papilledema)、葡萄膜腦膜腦炎綜合症(Uveomeningoencephalitic Syndrome)、視盤玻璃膜疣(Optic Disk Drusen)、血管樣紋(Angioid Streaks)、視網膜色素變性(Retinitis Pigmentosa)、視力異常(Vision Disorders)、交感性眼炎(Sympathetic Ophthalmia)、疤痕(Scar)、眼部燒傷(Ocular Burns)、復發性缺血(Recurrent Ischemia)、眼部外傷(Eye Injuries)、青光眼(Glaucoma)、眼部出血(Eye Hemorrhage)、盲點(Scotoma)、後葡萄膜炎(Posterior Uveitis)、真菌血症(Fungemia)、視網膜腫瘤(Retinal Neoplasms)、角膜疾病(Corneal Diseases)、色素失禁(Pigmentary Incontinence)、血紅蛋白C疾病(Hemoglobin C Disease)、纖維化(Fibrosis)、角膜渾濁(Opacity of the Cornea)、前葡萄膜炎(Anterior Uveitis)、前房出血(Hyphema)、節結病(Sarcoidosis)、晶狀體缺失症(Aphakia)、醫源病(Iatrogenic Disease)、全葡萄膜炎(Panuveitis)、眼部白內障(Eye Cataract)、手術後併發症(Postoperative Complications)、鐮狀細胞貧血(Sickle Cell Anemia)、視網膜血管炎(Retinal Vasculitis)、骨腫瘤(Osteoma)、巨細胞病毒性視網膜炎(Cytomegalovirus Retinitis)、萎縮症(Atrophy)、靜脈炎(Phlebitis)、圓錐角膜(Keratoconus)、史德格-韋伯症候群(Sturge-Weber Syndrome)、病毒性眼部感染(Viral Eye Infections)、眼部畸形(Eye Abnormalities)、物質相關疾患(Substance-Related Disorders)、眼球穿通外傷(Penetrating Eye Injuries)、第二型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2)、輻射損傷(Radiation Injuries)、鐮狀細胞特徵(Sickle Cell Trait)、假晶狀體(Pseudophakia)、色素痣(Pigmented Nevus)、增殖性玻璃體視網膜病變(Proliferative Vitreoretinopathy)、出血(Bleeding)、第一型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 1)、痣 (Nevus)、視神經疾病(Optic Nerve Diseases)、血管疾病(Vascular Diseases)、念珠菌感染(Candidiasis)、化學燒傷(Chemical Burns)、小眼症(Microphthalmia)。
本發明之另一實施例係關於表現這些vNAR的各個細菌克隆，其係用於工業規模生產，包含名為VEGFvNAR v32R及VEGFvNAR v19的大腸桿菌克隆，其係表現vNAR V32R及V19。
本發明之其他實施方式係關於編碼vNAR V32R及V19的質體載體(p1asmid vectors)，其特性在於所述的載體中包含vNAR V32R及V19的編碼序列。
本發明之實施方式包含vNAR V32R及V19蛋白質用於製備預防或治療疾病之藥物的用途，該疾病需要中和VEGF的活性，以及該藥物可用於眼科用途。
本發明之實施方式係為眼科藥物組合物，其特性在於包含藥學上正確劑量之本發明之vNAR蛋白質，其係作為活性成分，以及其特性在於基礎組成或載體係提供必要的穩定性及對於蛋白質的保護。
下列所提供之實施例係用於佐證在此提及之生物製藥的功效；這些實施例係為示例性質，且並未限制本發明之範疇。
實施例
實施例1：免疫庫之生產及對於VEGF具有專一性之vNAR克隆的選擇
第一步係為鯊魚樣本的免疫接種，使用在磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline,PBS)中的1μg蛋白質，藉由靜脈注射人類重組細胞因子VEGF165，持續20週的免疫接種程序。最初的二個免疫接種亦包含完全形式的 弗氏佐劑(Freund's adjuvant)；在同一期間中，免疫學上的激發(challenges)係每隔15天進行。在每一次免疫強化後，我們從尾靜脈(caudal vein)進行1mL的靜脈抽血(phlebotomies)；此一血漿係儲存於-20℃。
下一步驟係為自樣本的脾臟萃取總體RNA(total RNA)，其係於最後一次免疫接種的7天後進行解剖，遵循苯酚-氯仿RNA萃取(phenol-chloroform RNA extraction)之標準程序，以及自異丙醇中沉澱，結果獲得1.2μg/mL的總體RNA；藉由分光光度法(spectrophotometry)測試其純度。
隨後，使用傳統方法進行逆轉錄(retrotranscription)(RT-PCR)，使用初始濃度20μM之反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)GTTCACAGTCAGCACGGTGCCAGCTC(SEQ.ID.NO.10)，以及1μg的總體RNA。形成大約620鹼基對(bp)的片段，透過2%瓊脂凝膠可視化(visualized)，使用溴化乙錠(ethidium bromide)染色，進行PCR反應來得到雙股DNA。
為了得到雙股DNA，我們亦使用下列7個有義寡核苷酸(sense oligonucleotide)的混合物：GCACGGCTTGAACAAACACC(SEQ.ID.NO.11)、CAACGGGTTGAACAAACACC(SEQ.ID.NO.12)、ACAAGGGTAGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.13)、GCAAGGGTGGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.14)、GCATGGGTAGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.15)、GCAAGCCTGGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.16)、GCATTGACGGACCAAACACC(SEQ.ID.NO.17)。
有義及反義寡核苷酸皆具有一額外的序列，賦予其對於限制酶SfiI的識別位(recognition site)。放大的片段係藉由電泳方法分析，以50ng/μL之最終濃度，使用2%瓊脂凝膠及溴化乙錠，(100伏特下，30分鐘)。根據所使用之寡核苷酸組(oligonucleotide set)，片段之尺寸係與預期尺寸相符，(從大約320-350 bp切下凝膠)。隨後使用一特別套組，自凝膠中萃取DNA。重複此一程序，直到獲得足夠份量的DNA。
隨後，酶切(digested)純化的DNA片段，其係藉由PCR方法獲得，對應vNAR基因，每一微克(μg)的DNA使用5U的限制酶SfiI進行酶切，於50℃培養5小時。該混合物係被去活性並儲存於-80℃。
後續步驟係為製備克隆載體，質體表現載體pCOMb3X，其具有2個限制酶SfiI的切割位(cut sites)，藉此克隆的vNAR係表現於噬菌體(phages)(噬菌體呈現)。酶切產物係於1%瓊脂凝膠上純化，回收受切割的載體，並得到二個片段，其一約為3500bp，以及另一約為1500bp。
第一個片段係對應於二個酶切位(digestion sites)皆被酶切的載體，以及第二個片段係對應於所得的填充片段(staffer fragment)。其係於1%瓊脂凝膠上可視化，並切下凝膠上的二條帶(bands)，隨後透過萃取DNA研磨-冷凍(trituration-freezing)。其係被純化，並藉由在260nm下的分光光度法定量。
隨後，我們接著以小規模進行VHNAR片段及pCOMb3X載體的連接(ligation)，以確認酶切片段的所有條件，以及後續以大規模進行上述程序。使用T4 DNA連接酶酵素，以1：1的莫耳數比完成vNAR插入片段(insert)與pCOMb3X載體之間的連接。不具填充片段之經酶切的載體，使用及不使用T4連接酶，被用來作為陰性控制組，以確認載體並非與自身連接。此外，使用經酶切的載體且不使用T4連接酶製作一控制組，以確認載體係被良好的酶切。
遵循標準方法，藉由電穿孔(electroporation)電勝任細胞(electrocompetent cells)大腸桿菌ER2537(200Ohms，2.5kV，4ms)確認連接的效果，其包含在最後連續3次稀釋，接種電勝任大腸桿菌於LB瓊脂的培養皿之上， 並獲得菌落形成單位(colony-forming units,CFU)。考量CFU的數量以及連接、培養及接種量，計算免疫庫的大小。
所獲得的VEGF165免疫庫大小係為6.36×108CFU/mL，(大規模)，這可以被認為在免疫接種程序後，藉由鯊魚產生了變異性。陰性控制組中，在具有氨芐黴素(ampicilin)(最終濃度20μg/mL)的LB瓊脂培養基上沒有菌落生長。
藉由培養經電穿孔的細胞進行初步的免疫庫放大，遵循傳統的方法，使用輔助噬菌體(helper phage)VCSM13，在包含氨芐黴素與卡那黴素(kanamycin)的SB培養基中培養隔夜，隨後藉由離心取得，以及上清液的儲存係預先藉由過濾滅菌。在初步的免疫庫放大之後，進行4輪選擇，以獲得噬菌體-抗體，在ELISA盤上使用VEGF(於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中1μg)(預先培養以及使用PBS中BSA 3%阻斷)，從而5g/mL的細胞因子VEGF及50μL的3% BSA被放入每一盤孔中進行接觸(每一稀釋)，在陰性控制組中作為抗原。因此，在盤孔中的細胞因子係保持固定。50μL的噬菌體係於37℃培養1小時，針對4輪中的每一者(分別地)，對於每一盤孔使用Tween 0.05%-PBS 1X，進行5、10、15及20收斂劑洗滌(astringent washes)；藉由使用此一程序，我們預期所選擇的噬菌體將對於VEGF抗原更具有專一性。隨後，自第3輪及第4輪中所獲得的噬菌體係被使用，此時係於大腸桿菌TOP10F'的菌落中；透過PCR確認插入序列(insert)的存在，以及接著進行vNAR蛋白質的誘導表現，隨後，使用滲透壓衝擊(osmotic shock)的方法，自大腸桿菌的週質部分(periplasmic fractions)萃取vNAR蛋白質，以及其係藉由鎳離子親和力層析法(affinity chromatography to nickel)純化；進行ELISA，以確定所預期之其對於VEGF的親和力。整體程序的產率並非最佳的，這可能導因於包涵體(Inclusion bodies)的組成包含了不可溶或非活性蛋白質的聚 集；這些蛋白質無法藉由進行週質部分萃取而得到萃取，或導因於ELISA無法偵測這些產量層級。
實施例2：抗-VEGF之表現細胞vNAR BL21(DE3)的製備，後續處理以及透過ELISA確認vNAR之辨識能力
為了確認所選擇之克隆之產物的表現以及其對於目標分子VEGF的專一性辨識能力，50mL之BL21(DE3)細胞培養物係被誘導，藉由質體pET-20b(+)(不具有信號肽)及pET-28a(+)(具有信號肽)改性(modified)，其係分別地具有V13、V19及V32R。個體化(individualized)所獲得的克隆，並藉由菌落PCR(colony-PCR)之方法及透過瓊脂凝膠上的電泳分析，以確認陽性克隆。於包含氨芐黴素(ampicilin)(pET20b+克隆)或卡那黴素(kanamycin)(pET28a+克隆)選擇性LB液態培養基中，製備陽性克隆的標準培養，並將我們所得的培養克隆儲存於15%甘油中，以將其於-80℃中保存。
我們藉由SDS-PAGE及透過免疫墨點法(immunoblotting)(西方墨點法)來研究目標蛋白質的過度表現，其係使用抗-His或抗-HA抗體及共軛過氧化物酶的二級抗體，以及使用特定的基質TMB顯影。
另一方面，我們接著評量小規模(先導測試(pilot trials))的蛋白質表現，以及隨後自所得之陽性克隆進行大規模評量，首先培養轉型(陽性)之BL21(DE3)細菌，其係於包含抗體之LB培養基於37℃下進行，直到達到最適合的密度(0.6-0.8)，該密度係為我們在先導測試中認為最適合的。添加表現誘導物IPTG 0.8mM，以及於最適條件之溫度(30℃)進行表現，並維持20-22小時之時間。我們接著自這些培養物中所獲得的細胞顆粒(pallets)中進行純化，其係藉由緩衝液及超音波進行裂解，以及隨後我們自不可溶部分中分離包涵體；純化包含藉由固定 化的金屬進行親和力層析法，相對應的樹脂對於融合6個His的蛋白質具有親和力。一旦蛋白質被溶解，我們接著藉由先前所提及的柱上(On-column)方法進行蛋白質的折疊。
為了驗證透過此依程序所獲得之vNAR蛋白質的功能性，進行間接ELISA檢測、免疫墨點法及流式細胞儀檢測。
為了進行ELISA測試，我們於盤上裝載(upholster)實驗室所生產之50μL,300ng/well的rhVEGF抗原(重組的人類血管內皮生長因子，版本165)，我們亦使用市售等效的抗原(Peprotech®的重組人類VEGF165)。裝載係使用相同的結果進行，2小時/37℃或於4℃ 12-16小時。使用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)做為檢測的陰性控制組，即便於不具有抗原的盤孔中亦被使用。在吸收之後，使用150μl PBS-5%脫脂牛奶來阻斷盤孔(於4℃ 16小時或於室溫2小時)，並使用PBS-Tween 0.05%將盤洗滌；隨後將於150μl PBS-5%脫脂牛奶中製備之稀釋的vNAR 150-50μl加入盤孔(每一盤孔所添加之vNAR的輛係介於0.1至15μg之間)，並於室溫中培養2小時。使用PBS-Tween洗滌4次之後，使用二級抗體偵測融合至該vNAR的標籤：6His或HA，藉此檢測保留於孔盤中的vNAR抗體。其係使用抗組胺酸標籤(抗6His)之單株抗體或為抗-HA多克隆抗血清(polyclonal antiserum)，係於PBS-5%脫脂牛奶中稀釋，稀釋比例介於1：3000至1：1000(每一盤孔50μl)。該等盤係被培養及洗滌，以及添加共軛過氧化物酶的抗體用於顯影：在具有抗-HA多克隆的盤孔中，其係為山羊抗-兔子IgG抗血清，或者在具有抗6His之單株抗體，其係為抗-老鼠IgG抗血清。該等盤係於室溫中培養30-45分鐘，使用PBS-Tween廣泛地洗滌，添加100μl的TMB至盤孔中，作為過氧化酶的基質。在短暫的培養後，藉由添加50μl的3N硫酸(H2SO4)至盤孔 中，來停止反應。於Multiscan Plus(Flow)分光光度計中，測量氧化鄰苯二胺(oxidized o-phenylenediamine,OPD)的光學密度(λ=450nm)。
市售可辨識人類同功型(isoform)VEGF165之抗-VEGF單株抗體(自Abcam之老鼠的抗-VEGF單株抗體)以1：1000稀釋，以及一共軛過氧化物酶兔子抗-老鼠IgG抗血清，係被用來作為陽性控制組。
圖13顯示ELISA檢測的結果，其中克隆V32R及V13蛋白質所增加的表現，明顯地超越了克隆V19。
實施例3：次細胞部分的分離
此一測試的標準程序，首先藉由使用IPTG(0.8mM最終濃度)誘導，於30℃或37℃培養細菌16-20小時。該培養物隨後藉由離心處理，以分離細胞及培養基質。這些細胞被使用溫和的滲透壓衝擊處裡，其係藉由蔗糖作為介質，以獲得細胞外基質，週質部分的蛋白質；或者使用溶菌酶溶解、清潔劑及超音波，以自其中萃取藉由離心分離之可溶及不可溶細胞內成分。藉由在SDS-PAGE中研究目標蛋白質的過度表現，實際對於每一部分進行評估，其係藉由考馬斯藍(Coomassie blue)染色，以及藉由血清學方法進行特定的偵測，具體而言，其係藉由使用抗“標籤”之單株抗體(抗-His或抗-HA)及共軛過氧化物酶之二級抗體的西方墨點法。
實施例4：抗-VEGF vNAR之胺基酸序列的定序
純化具有反應能力之克隆的蛋白質，以於實驗室中得到序列(Seqxcel Laboratory,San Diego,CA,EEUU)，混合物係根據建議條件使用引子Ompseq製備，由於載體pCOMb3X具有對於此一寡核苷酸具有互補序列，使用Mac Vector 7.2.軟體獲得對於VEGF的特定序列；這包含了序列表中的序列，其 係為：SEQ.ID NO：3,SEQ.ID NO：4(克隆V19)以及SEQ.ID NO：5及SEQ.ID NO：6(克隆V32R)。
實施例5：原位(in situ)重新折疊：柱上重新折疊
目標蛋白質的胞質部分被發現大部分形成包涵體，易於在細菌裂解後，藉由離心萃取物加以分離。藉由GE HealthcareMR原創，稱為柱上重新折疊的方法，回收目標蛋白質，其係需要溶解的蛋白質。因此，必須在蛋白質形成包涵體的部分中應用氯化胍(guanidine chloride)。
為進行柱上重新折疊程序，我們首先進行緩衝液的製備，其pH值皆為8.0。於添加100mM L-Arg之後：結合緩衝液(A1部分)：以6M氯化胍為基礎，溶解緩衝液(A2部分)：以6M尿素為基礎，以及洗脫緩衝液(A3部分)及重新折疊緩衝液(B部分)：其皆包含三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、氯化鈉(NaCl)、咪唑(imidazole)以及2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)。所有的緩衝液都包含咪唑，其在結合緩衝液中的作用為減少蛋白質的非特定結合，這是那些缺少組胺酸尾端及參與其洗脫的蛋白質。
我們接著製備樣本(先前使用氯化胍溶解的蛋白質)，其係藉由調整結合緩衝液的組成成分，隔夜漩渦震盪，稀釋或重新懸浮結合緩衝液中的包涵體。
我們繼續系統及層析法的製備：在設置AKTA-prime裝置及選擇的管柱(His Trap 1ml FF crude,GE Healthcare)之後，Application Template柱上重新折疊His陷阱方法在該系統中被選用。進行緩衝液的交互置換或留置緩衝液於管柱中。該樣本在進行層析法之前，係透過0.45微米的篩選。
圖49顯示藉由使用重新折疊緩衝液之選用方法的梯度圖，顯示不同的程序階段以及運行時間。包含洗脫蛋白質的部分係藉由於280nm的吸光度偵測。
實施例6：流式細胞儀分析
U937細胞株被用來作為模型細胞，以分析vNAR抗體與VEGF的活性。預先被固定及滲透化的1,000,000個細胞，被用來在室溫下與選擇的vNAR抗體培養30分鐘，其係根據製備方法及vNAR的特定活性，以不同的比例稀釋。在使用pH值7.4的PBS洗滌多次之後，將該等細胞與抗-6xHis單株抗體培養，隨後適當的洗滌，以及與共軛至Alexa Fluor 488的抗體培養。再經標籤化(labeling)後，使用PBS洗滌該等細胞，以及最後將其重新懸浮於體積250μl的PBS。使用流式細胞儀，計量經螢光標籤的細胞。使用市售抗-VEGF單株抗體及同樣的共軛二級抗體，作為陽性控制組。該等細胞根據其尺寸(前向散射(forward scatter)或FSC：“前向角度光散射(forward-angle light scatter)”)以及根據其複雜度(側向散射(side scatter)或FSC：“側向角度光散射(side-angle light scatter)”)於“點陣圖”中被識別。藉由FL1偵測器收集螢光物質Alexa Fluor 488之輻射。螢光強度的放大檢測器係根據未經初級vNAR抗體處理的U937細胞調整為介於100-101之間(陰性控制組)。
實施例7：熱穩定性
製備不同等分式樣(aliquots)的vNAR，並將其在不同溫度向培養數天(介於3至7天)，以評估其短期熱穩定性。典型地，研究溫度係為37℃(1小時)、室溫、4℃、0℃、-20℃及-80℃。於-20℃及-80℃之冷凍係快速，且於乙醇-乾冰浴中進行。在培養期間之後，該等樣本係被離心，以去除於該期間中所產生的 集合體。於-20℃及-80℃之冷凍樣本，在離心前係於冰上解凍。針對這先樣本的上清液，使用15% SDS-PAGE進行變性。在使用考馬斯藍(Coomasie blue)染色之後，分析不同培養情況下可溶性蛋白質的損失，其係因集合體的形成所致。
實施例8：質譜儀分析
為了藉由質譜儀進行身分分析，vNAR之準備工作係使用15% SDS-PAGE進行變性。在使用考馬斯藍(Coomasie blue)染色之後，自凝膠切割vNAR條帶，並藉由基質輔助雷射解析電離-飛行時間-飛行時間(MALDI-TOF-TOF)質譜儀進行分析。此一系統可藉由測定酵素酶切所形成之多肽的確切質量，來分析蛋白質的身分。此外，該系統可藉由串連飛行時間(time-of-flight)(TOF/TOF)，更為精確的測定蛋白質的身分及特性，該技術係分離及片段化一目標分子離子，以及獲得蛋白質片段的離子質量的測量值。使用50%乙腈(acetonitrile)洗滌凝膠片段。隨後，該凝膠片段係於黑暗中置於10mM DTT，55mM碘代乙醯胺(iodoacetamide)於25mM碳酸氫銨(ammonium bicarbonate)中，於56℃放置45分鐘。碳酸氫銨被添加至凝膠片段胰蛋白酶，以及其係於37℃培養隔夜。隨後其係被轉移至50%乙腈(acetonitrile)、0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid)中，以及藉由5分鐘的超音波，萃取該凝膠片段之多肽。該多肽係重新懸浮於10μL的33%乙腈、0.1%三氟乙酸中。使用ABi 4800 MALDI TOF/TOF TM，以陽離子反射器模式(positive ion reflector mode)，進行MALDI-TOF-TOF質譜儀分析。離子加速電壓係為20kV。為了鑑定多肽中的質量指紋(mass fingerprinting)，經胰蛋白酶分解之多肽的質量地圖係透過BioToolsTM MS(Bruker Daltonics)程式傳輸，以使用Mascot(Matrix Science)軟體搜尋Swiss-Prot蛋白質序列資料庫。
實施例9：內毒素的移除
為了移除vNAR之製備過程中的內毒素，使用2種工具：Detoxi-Gel內毒素去除管柱(Detoxi-Gel Endotoxin Removing Columns)：該管柱使用固定於基體(matrix)上的多黏菌素B(polymyxin B)來結合及去除存在於溶液中的致熱源(pyrogens)。此一層析方法使用簡單，且為小量的樣本提供快速的致熱源移除。不同的vNAR樣本，使用此一管柱得到了良好的結果。藉由變性SDS-PAGE，於管柱中填充及洗脫vNAR樣本後，分析所收集的部分。該蛋白質所存在的部分，係被合併以及再次藉由電泳定量。總體而言，vNAR的製備係容許此一處理，以及回收蛋白質中所獲得的產量大部分介於75-90%。
實施例10：體外(in vitro)的抑制血管生成的比較研究
該分析包含於96-孔盤中培養取自人類臍靜脈(human umbilical vein,HUVEC)的內皮細胞，其係使用綠螢光蛋白質轉染(transfected)，並與人類纖維母細胞(human fibroblasts,NHDF)共同培養14天。使用4ng/mL VEGF作為陽性控制組，其係在所有的盤中，產生全面的管狀結構形成及網絡，管狀結構之長度達到約13-14mm/mm2的層級。
作為第一陰性控制組，培養係保持在不存在VEGF的狀態，其不利於管狀結構的形成，僅達到2-3mm/mm2的層級。另一應用的陰性控制組係添加100μM蘇拉明(suramin)；此一處理完全抑制VEGF調控的血管生成。
於實驗的第4、5、7、10及12天，在4ng/ml VEGF的存在下，添加不同濃度的vNAR抗體至盤孔中：V13(先前於美國專利8,496,933中被描述)、V19及V32R，以及參考抗體(Genentech/Roche)(見圖50)。每一盤係被用於分析二 種化合物。因此，可獲得依濃度的四重複(quadruplicates)。每一處理結束時，針對每一盤孔拍攝6個影像。
在暴露至化合物14天後，測量血管形成過程中的2個參數：管狀結構的長度(圖51)及分支點(圖52)。將這些參數的測量結果與僅接受4ng/mL VEGF(陽性控制組)及接受20μM蘇拉明(suramin)+VEGF的細胞進行比較。
此一分析顯示，相較於控制組，VEGF刺激管狀結構與分支點的形成，以及參考抗體(Genentech/Roche)(A)，V13(B)、V32R(C)及V19(D)，濃度依賴性地抑制管狀結構形成，且亦抑制分支點的形成。
使用非線性回歸模型建構劑量-反應曲線，藉此分析每一抗體在體外測試中，抑制血管生成達50%的所需濃度(IC50)。所獲得之資料係顯示於表6；以中和50%之血管生成活性之2個參數所需的濃度(mg/mL)代表抗體之效力，該2參數係為體外測試中所測量的：管狀結構長度與分支點。
圖53、54、55及56顯示呈現V32R、V19及V13抗體以及參考 抗體血管形成抑制效果的影像。
此一研究的主要結論係為，藉由測量血管的數量及分支點顯示，所有的抗體對於血管形成過程具有濃度依賴性的抑制效果。達到50%抑制效果之V32R及V19抗體的濃度係介於20-40mg/mL的範圍。
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Claims (18)

  1. 一種分離的抗-VEGF vNAR蛋白質，該蛋白質係選自由V19及V32R所組成之群組，包含胺基酸序列SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.6，並對於其目標分子VGEF具有辨識能力以及強化的親和力。
  2. 如請求項1所述之抗-VEGF vNAR蛋白質，其中V19包含多個藉由迴圈連接的β摺板，具有一高度彈性的可變區域，其係由藉由迴圈交互連接的二個β摺板所組成，以及一由二組具有單一雙硫橋之β摺板所組成之單體，該雙硫橋係結合二組摺板，包含SEQ.ID.NO.4(圖20-22及42)。
  3. 如請求項1所述之抗-VEGF vNAR蛋白質，其中V32R包含β摺板以及一由二組具有單一雙硫橋之β摺板所組成之單體，該雙硫橋係結合二組摺板，包含SEQ.ID.NO.6(圖23-28及43)。
  4. 一種DNA序列，包含SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.5之核苷酸，其係編碼如請求項1所述之vNAR蛋白質。
  5. 如請求項1所述之分離的抗-VEGF vNAR蛋白質，該蛋白質係選自由V19及V32R所組成之群組，其中：a)其係源自佛氏虎鯊(Heterodontus francisci)或斑紋鬚鯊(Orectolobus maculatus)；以及b)其在眼中結合至血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，並中和血管內皮生長因子的活性。
  6. 一種藥學組合物，其係包含如請求項1所述之分離的抗-VEGF vNAR蛋白質，該蛋白質係選自由V19及V32R所組成之群組，以及藥學上可接受的賦形劑。
  7. 如請求項6所述之藥學組合物，其中其係用於局部給藥之劑型。
  8. 如請求項6所述之藥學組合物，其中該組合物係為一種用於眼部局部給藥之劑型。
  9. 如請求項6所述之藥學組合物，其中該組合物係用於VEGF相關的眼部疾病的局部給藥，該等疾病係選自：視網膜新生血管形成(Retinal Neovascularization)、脈絡膜新生血管形成(Choroidal Neovascularization)、角膜新生血管形成(Corneal Neovascularization)、黃斑變性(Macular Degeneration)、年齡相關的黃斑變性(Age-Related Macular Degeneration)、視網膜疾病(Retinal Diseases)、糖尿病性視網膜病變(Diabetic Retinopathy)、玻璃體出血(Vitreous Hemorrhage)、視網膜出血(Retinal Hemorrhage)、脈絡膜炎(Choroiditis)、視網膜脫離(Retinal Detachment)、視網膜玻璃膜疣(Retinal Drusen)、新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)、脈絡膜疾病(Choroid Diseases)、葡萄膜炎(Uveitis)、近視(Myopia)、眼部疾病(Eye Diseases)、真菌性眼部感染(Fungal Eye Infections)、微血管擴張(Telangiectasia)、視網膜動脈阻塞(Retinal Artery Occlusion)、退化性近視(Degenerative Myopia)、視網膜靜脈阻塞(Retinal Vein Occlusion)、脈絡膜視網膜炎(Chorioretinitis)、組織胞漿菌病(Histoplasmosis)、葡萄膜疾病(Uveal Diseases)、德國麻疹(Rubella(German Measles))、眼部弓形蟲病(Ocular Toxoplasmosis)、視網膜上膜(Epiretinal Membrane)、缺損(Coloboma)、脈絡膜腫瘤(Choroid Neoplasms)、視網膜變性(Retinal Degeneration)、視網膜炎(Retinitis)、視網膜穿孔(Retinal Perforations)、皰疹性角膜炎(Herpetic Keratitis)、早產兒的視網膜病變(Retinopathy of Prematurity)、黃斑囊樣水腫(Cystoid Macular Edema)、視乳頭水腫(Papilledema)、葡萄膜腦膜腦炎綜合症(Uveomeningoencephalitic Syndrome)、 視盤玻璃膜疣(Optic Disk Drusen)、血管樣紋(Angioid Streaks)、視網膜色素變性(Retinitis Pigmentosa)、視力異常(Vision Disorders)、交感性眼炎(Sympathetic Ophthalmia)、疤痕(Scar)、眼部燒傷(Ocular Burns)、復發性缺血(Recurrent Ischemia)、眼部外傷(Eye Injuries)、青光眼(Glaucoma)、眼部出血(Eye Hemorrhage)、盲點(Scotoma)、後葡萄膜炎(Posterior Uveitis)、真菌血症(Fungemia)、視網膜腫瘤(Retinal Neoplasms)、角膜疾病(Corneal Diseases)、色素失禁(Pigmentary Incontinence)、血紅蛋白C疾病(Hemoglobin C Disease)、纖維化(Fibrosis)、角膜渾濁(Opacity of the Cornea)、前葡萄膜炎(Anterior Uveitis)、前房出血(Hyphema)、節結病(Sarcoidosis)、晶狀體缺失症(Aphakia)、醫源病(Iatrogenic Disease)、全葡萄膜炎(Panuveitis)、眼部白內障(Eye Cataract)、手術後併發症(Postoperative Complications)、鐮狀細胞貧血(Sickle Cell Anemia)、視網膜血管炎(Retinal Vasculitis)、骨腫瘤(Osteoma)、巨細胞病毒性視網膜炎(Cytomegalovirus Retinitis)、萎縮症(Atrophy)、靜脈炎(Phlebitis)、圓錐角膜(Keratoconus)、史德格-韋伯症候群(Sturge-Weber Syndrome)、病毒性眼部感染(Viral Eye Infections)、眼部畸形(Eye Abnormalities)、物質相關疾患(Substance-Related Disorders)、眼球穿通外傷(Penetrating Eye Injuries)、第二型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2)、輻射損傷(Radiation Injuries)、鐮狀細胞特徵(Sickle Cell Trait)、假晶狀體(Pseudophakia)、色素痣(Pigmented Nevus)、增殖性玻璃體視網膜病變(Proliferative Vitreoretinopathy)、出血(Bleeding)、第一型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 1)、痣(Nevus)、視神經疾病(Optic Nerve Diseases)、血管疾病 (Vascular Diseases)、念珠菌感染(Candidiasis)、化學燒傷(Chemical Burns)、小眼症(Microphthalmia)。
  10. 如請求項9所述之藥學組合物，其中該等VEGF相關之眼部疾病係選自濕性年齡相關的黃斑變性(wet age-related macular degeneration)、糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)或新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)。
  11. 一種有效量之蛋白質用於製備治療VEGF相關之眼部疾病之藥物的用途，係使用如請求項1所述之抗-VEGF vNAR蛋白質，該蛋白質係選自由V19及V32R所組成之群組，其係藉由局部眼部途徑給藥。
  12. 如請求項11所述之用途，其中該疾病亦為與血管生成過程相關的病變，其中當病變細胞產生不正常數量的VEGF或VEGF受體時，發生過度的血管生成。
  13. 如請求項12所述之用途，其中該血管生成過程係選自由年齡相關的黃斑變性(age-related macular degeneration)、糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)或新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)所組成之群組。
  14. 如請求項13所述之用途，其中該血管生成過程係為糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)。
  15. 如請求項13所述之用途，其中該血管生成過程係為濕性年齡相關的黃斑變性(wet age-related macular degeneration)。
  16. 如請求項13所述之用途，其中該血管生成過程係為新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)。
  17. 一種蛋白質用於製備治療VEGF相關之眼部疾病之藥物的用途，係使用至少一如請求項1所述之抗-VEGF vNAR蛋白質，該蛋白質係選自由V19及V32R所組成之群組，其係可用於預防或治療VEGF相關之眼科症狀，該眼科症狀係選 自：視網膜新生血管形成(Retinal Neovascularization)、脈絡膜新生血管形成(Choroidal Neovascularization)、角膜新生血管形成(Corneal Neovascularization)、黃斑變性(Macular Degeneration)、年齡相關的黃斑變性(Age-Related Macular Degeneration)、視網膜疾病(Retinal Diseases)、糖尿病性視網膜病變(Diabetic Retinopathy)、玻璃體出血(Vitreous Hemorrhage)、視網膜出血(Retinal Hemorrhage)、脈絡膜炎(Choroiditis)、視網膜脫離(Retinal Detachment)、視網膜玻璃膜疣(Retinal Drusen)、新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma)、脈絡膜疾病(Choroid Diseases)、葡萄膜炎(Uveitis)、近視(Myopia)、眼部疾病(Eye Diseases)、真菌性眼部感染(Fungal Eye Infections)、微血管擴張(Telangiectasia)、視網膜動脈阻塞(Retinal Artery Occlusion)、退化性近視(Degenerative Myopia)、視網膜靜脈阻塞(Retinal Vein Occlusion)、脈絡膜視網膜炎(Chorioretinitis)、組織胞漿菌病(Histoplasmosis)、葡萄膜疾病(Uveal Diseases)、德國麻疹(Rubella(German Measles))、眼部弓形蟲病(Ocular Toxoplasmosis)、視網膜上膜(Epiretinal Membrane)、缺損(Coloboma)、脈絡膜腫瘤(Choroid Neoplasms)、視網膜變性(Retinal Degeneration)、視網膜炎(Retinitis)、視網膜穿孔(Retinal Perforations)、皰疹性角膜炎(Herpetic Keratitis)、早產兒的視網膜病變(Retinopathy of Prematurity)、黃斑囊樣水腫(Cystoid Macular Edema)、視乳頭水腫(Papilledema)、葡萄膜腦膜腦炎綜合症(Uveomeningoencephalitic Syndrome)、視盤玻璃膜疣(Optic Disk Drusen)、血管樣紋(Angioid Streaks)、視網膜色素變性(Retinitis Pigmentosa)、視力異常(Vision Disorders)、交感性眼炎(Sympathetic Ophthalmia)、疤痕(Scar)、眼部燒傷(Ocular Burns)、復發性缺血(Recurrent Ischemia)、眼部外傷 (Eye Injuries)、青光眼(Glaucoma)、眼部出血(Eye Hemorrhage)、盲點(Scotoma)、後葡萄膜炎(Posterior Uveitis)、真菌血症(Fungemia)、視網膜腫瘤(Retinal Neoplasms)、角膜疾病(Corneal Diseases)、色素失禁(Pigmentary Incontinence)、血紅蛋白C疾病(Hemoglobin C Disease)、纖維化(Fibrosis)、角膜渾濁(Opacity of the Cornea)、前葡萄膜炎(Anterior Uveitis)、前房出血(Hyphema)、節結病(Sarcoidosis)、晶狀體缺失症(Aphakia)、醫源病(Iatrogenic Disease)、全葡萄膜炎(Panuveitis)、眼部白內障(Eye Cataract)、手術後併發症(Postoperative Complications)、鐮狀細胞貧血(Sickle Cell Anemia)、視網膜血管炎(Retinal Vasculitis)、骨腫瘤(Osteoma)、巨細胞病毒性視網膜炎(Cytomegalovirus Retinitis)、萎縮症(Atrophy)、靜脈炎(Phlebitis)、圓錐角膜(Keratoconus)、史德格-韋伯症候群(Sturge-Weber Syndrome)、病毒性眼部感染(Viral Eye Infections)、眼部畸形(Eye Abnormalities)、物質相關疾患(Substance-Related Disorders)、眼球穿通外傷(Penetrating Eye Injuries)、第二型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 2)、輻射損傷(Radiation Injuries)、鐮狀細胞特徵(Sickle Cell Trait)、假晶狀體(Pseudophakia)、色素痣(Pigmented Nevus)、增殖性玻璃體視網膜病變(Proliferative Vitreoretinopathy)、出血(Bleeding)、第一型糖尿病(Diabetes Mellitus Type 1)、痣(Nevus)、視神經疾病(Optic Nerve Diseases)、血管疾病(Vascular Diseases)、念珠菌感染(Candidiasis)、化學燒傷(Chemical Burns)、小眼症(Microphthalmia)。
  18. 如請求項17所述之用途，其中該眼科症狀係為濕性年齡相關的黃斑變性(wet age-related macular degeneration)、糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy)或新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)。
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