KR101773904B1 - ＴＮＦα를 저해하는 안정한 가용성 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 특히, TNF의 안정성, 가용성, 시험관내 및 생체내 결합성과 낮은 면역원성에 대해 최적화한 특이적인 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는, TNF에 특이적인 안정적이고 가용적인 scFv 항체 및 Fab 단편에 관한 것이다. 이러한 항체는 TNF-매개 장애의 진단 및/또는 치료용으로 고안된다. 또한, 본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 핵산, 벡터 및 숙주, 상기 항체의 분리 방법, 및 의학에서의 상기 항체의 용도를 개시한다.

Description

ＴＮＦα를 저해하는 안정한 가용성 항체{STABLE AND SOLUBLE ANTIBODIES INHIBITING TNFα}
본 출원은 2008년 6월 25일자 미국 출원번호 제 61/075,640호 및 2008년 6월 26일자 미국 출원번호 제 61/075,956호에 대한 우선권을 주장한다.
종양 괴사 인자 알파 (TNFα, 또한, 카켁틴이라도 함)는 내독소 또는 다른 자극에 반응하여 단핵구 및 대식세포를 포함한 다수의 세포 타입들에서 생산되는 천연적인 포유류 사이토카인이다. TNFα는 염증 반응, 면역 반응 및 병리생리학적 반응의 주요 매개체이다(Grell, M. , et al. (1995) Cell, 83: 793-802).
가용성 TNFα는 전구체 막관통 단백질의 절단에 의해 형성되며 (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53), 분비된 17 kDa의 폴리펩타이드는 가용성 동형삼량체 복합체로 조합된다(Smith, et al.(1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; TNFA에 대한 리뷰는 Butler, et al. (1986), Nature 320:584 참조함; Old (1986), Science 230: 630). 그 후, 이 복합체는 다양한 세포 상에서 발견되는 수용체에 결합한다. 결합으로, (i) 인터루킨 IL-6, IL-8 및 IL-1과 같은 다른 전-염증성 사이토카인의 분비, (ii) 매트릭스 메탈로프로테나제의 분비 및 (iii) 내피 유착 분자의 발현 상향 조절 등의, 일련의 전-염증성 작용이 이루어지게 되며, 나아가 백혈구의 혈관외 조직 공격에 의해 염증 및 면역 케스케이드로 증폭된다.
다수의 장애들이 TNFα의 농도 증가와 연관되어 있으며, 이들 대부분은 의학적으로 매우 중요하다. TNFα의 상향 조절은 류마티스 관절염(RA), 크론 질환 및 궤양성 대장염 등의 염증성 장 질환, 패혈증, 울혈성 심부전, 기관지 천식 및 다발성 경화증을 비롯한, 다수의 인간 질환들에서 확인되었다. 인간 TNFα로 형질전환된 마우스에서는 구성적으로 TNFα가 고농도로 생산되며, RA와 유사하게 자발적이고 파괴적인 다관절염이 발생된다(Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). 따라서, TNFα는 전-염증성 사이토카인으로 지칭된다.
현재, TNFα는, 신체 열, 불안감 및 피로 증상과 함께, 다관절성 관절 염증 및 손상이 특징적인, 만성의, 진행성 및 소모성 질환인 RA의 발병에 주된 요소로 잘 인지되고 있다. 또한, RA는 만성적인 활액 염증을 유도하며, 빈번히 관절 연골 및 골 손상으로 진행된다. TNFα의 농도 증가는 RA를 앓고 있는 환자의 활액 체액과 말초 혈액 모두에서 확인된다. TNFα 차단제를 RA 환자에게 투여하면, 염증이 경감되고, 증상이 개선되며, 관절 손상이 지연된다(McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208).
또한, TNFα는, 생리적으로는, 특정 감염원에 대한 보호와 관련있다(Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28). TNFα는 그람 음성 박테리아의 리포폴리사카라이드에 의해 활성화 되어진 대식세포로부터 분비된다. 이와 같이, TNFα는 박테리아 패혈증과 관련된 내독소 쇼크 발병 및 병태 발생에 관여하는 매우 중요한 내인성 매개체이다(Michie, et al. (1989), Br. J.Surg. 76:670-671; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. et al. (1990), J. Infect. Dis. 161:982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-170).
또한, TNFα는, 다른 장기 시스템에서와 같이, 중추 신경계에서, 특히 다발성 경화증, 귈랑 바레 증후군 및 중증 근무력증 등의 신경계의 염증 및 자가면역 장애, 및 알츠하이머 질환, 파킨슨병 및 헌팅턴병 등의 신경계의 퇴행성 장애에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, TNFα는 시신경염, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 피부근염, 근위축성 측삭 경화증 및 근이영양증 등의 망막과 근육 관련 시스템의 장애 뿐만 아니라 외상성 뇌 손상, 급성 척수 손상 및 뇌졸증 등의 신경계 손상에 관여한다.
간염은, 다른 유발제들 중에서도, 엡스타인-바, 사이토메갈로바이러스 및 A-E형 간염 바이러스 등의 바이러스 감염에 의해 유발될 수 있는, TNFα와 관련있는 다른 염증 장애이다. 간염은 간문과 소엽 부위에 급성 간 염증을 유발하며, 이후 섬유증 및 종양으로 진행된다. 또한, TNFα는 암에서 악액질을 매개할 수 있으며, 대부분 암 사망 및 치사에 원인이 된다(Tisdale MJ. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305).
염증, 세포성 면역 반응 및 다수 질환의 병인에서, TNFα가 수행하는 주된 역할은, TNFα의 길항제에 대한 연구로 이어졌다. TNFα 매개 질환의 치료용으로 고안된 TNFα 길항제의 한가지 유형은, TNFα에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편으로, 이것에 의해 TNFα의 기능을 차단한다. 항-TNFα 항체를 사용하였을 때, TNFα의 차단이, IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, 유착 분자 및 조직 파괴의 감소 등의, TNFα에 기인한 효과들을 반전시킬 수 있는 것으로 확인되었다(Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997: 283-350). 최근 상업적으로 이용할 수 있게 된 TNFα의 특이적인 저해제로는, RA 및 크론 질환의 치료에 대한 임상적인 효능이 입증된, TNFα에 대한 단일클론의 키메라 마우스-인간 항체(infliximab, Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson)가 있다. AU 시판되는 TNFα 저해제는 볼루스 주사로서 매주 또는 그 이상의 간격으로 정맥내 또는 피하 투여되는데, 이는 높은 초기 농도를 형성하고 다음 주사시까지 꾸준하게 낮아진다. 그래서 이것은 투여 부피에 제한이 있다.
이러한 진보에도 불구하고, RA와 같은 TNFα-관련 장애를 치료하는데, 새롭고 유효한 항체 또는 그외 면역결합제(immunobinder) 형태가 여전히 요구되고 있다. 특히, 더욱 융통성있는 투여와 제형화가 가능하며, 조직 침투성이 개선되어 투여 부피를 높일 수 있는, 관절염과 그외 TNFα-매개 질환의 효과적이고 계속적인 치료를 위한, 최적의 기능적 특성을 갖춘 면역결합제가 절실히 요구되고 있다.
발명의 개요
이에, 본 발명의 개괄적인 과제는 시험관내 및 생체내에서 TNFα에 특이적으로 결합하는, 안정적이고 가용적인 항체 또는 그외 면역결합제를 제공하는 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 면역결합체는 scFv 항체 또는 Fab 단편이다.
본 발명은 TNFα의 안정성, 가용성, 시험관내 및 생체내 결합성과 낮은 면역원성에 대해 최적화된 특이적인 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는, TNFα에 특이적인 안정적이고 가용적인 scFv 항체 및 Fab 단편을 제공한다. 이러한 항체는 TNFα-매개 장애의 진단 및/또는 치료용으로 고안된다. 또한, 본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 핵산, 벡터 및 숙주, 상기 항체의 분리 방법, 및 의학에서의 상기 항체의 용도를 기술한다.
도 1은 44종의 항-TNF RabMab 하이브리도마 상층액의 상대적인 TNFα 결합력(Biacore 분석) 및 이의 활성 중화력(L929 분석)을 나타낸 것이다.
도 2는 20종의 항-TNF RabMab 단쇄 항체와 7종의 항-TNF 단쇄 항체의 선택적인 TNFα 결합력을 나타낸 것이다(ELISA 방출 분석, 이 분석에서, 박테리아 배양물로부터 수득한 상층액을 사용하였고, 단쇄 항체의 함량은 정규화하지 않았음).
도 3은 EP43max(도 3A) 및 EP34max(도 3B)의 인간 TNFα에 대한 결합 동력학을 나타낸 것이다.
도 4는 EP43max(□)와 ESBA105(●)의 효능을 나타낸 것이다. EP43max의 EC50은 1 ng/ml이고, ESBA105의 EC50은 6.5 ng/ml이다.
도 5는 열 언폴딩 분석(FTIR)에서의 EP43max, EP6max 및 EP19max의 성능을 나타낸 것이다.
도 6은 FTIR 분석에 의해 비교한 EP43max 및 이의 유도체들의 열 변성 곡선이다.
도 7은 열 스트레스 테스트에서 EP43max(도 7A) 및 이의 EP43minmax 변이체(도 7B)를 비교한 것이다.
도 8은 항원 결합 부위를 토끼 단일클론 항체에서 가용성이 높고 안정적인 인간 항체 단편로 이식하기 위해 본원에서 사용한, CDR H1을 정의한 것이다.
도 9a는 재조합 인간 TNFα(뮤라인 L929 세포) 1000 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Epi34max 및 Adalimumab의 효능을 예시한 것이다. Epi34max 및 Adalimumab의 IC50은 각각 1.03 ng/ml 및 8.46 ng/ml로 결정되었다. 도 9b는 재조합 인간 TNFα(인간 Kym-1 세포) 10 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Ep34max 및 Adalimumab의 효능을 예시한 것이다. Infliximab 및 Ep34max(791)의 IC50은 각각 66.2 ng/ml 및 0.69 ng/ml로 결정되었다.
도 10a는 재조합 인간 TNFα(뮤라인 L929 세포) 1000 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Epi34max 및 Infliximab의 효능을 예시한 것이다. Ep34max 및 Infliximab의 IC50은 각각 1.04 ng/ml 및 13.9 ng/ml로 결정되었다. 도 9b는 재조합 인간 TNFα(인간 Kym-1 세포) 10 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Infliximab 및 Ep34max(791)의 효능을 예시한 것이다. Infliximab 및 Ep34max의 IC50은 각각 14.8 ng/ml 및 0.63 ng/ml로 결정되었다.
도 11은 Ep34max의 아미드 I 밴드 영역에서의 푸리에 변환된 적외선 스펙트럼(Fourier transformed infrared spectra)으로부터 수득한 BioATR FT-IR 열 변성 프로파일을 ESBA903와 비교하여 예시한 것이다. ESBA903의 V50은 71.12이고, EP34max의 V50은 71.50이고, ESBA903의 슬로프(slope)는 2.481이고 EP34max는 2.540이다.
도 12는 Ep34max 및 ESBA903 scFv 항체들의 DSC 열 언폴딩 곡선을 예시한 것이다. EP34max의 Tm은 78.11℃이고, ESBA903의 Tm은 76.19℃이다.
본 발명의 개괄적인 과제는 시험관내 및 생체내에서 TNFα에 특이적으로 결합하는, 안정적이고 가용적인 면역결합제를 제공하는 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체 유도체는 scFv 항체 또는 Fab 단편이다. 본 발명의 상기 면역결합제는 바람직하게는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함한다.
정의
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어들을 하기와 같이 정의한다. 추가적인 정의들은 상세한 설명 전체에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 "면역글로불린"과 동의어이다. 본 발명에 따른 항체는, 면역글로불린의 적어도 하나의 가변 도메인, 예를 들면 단일 가변 도메인, Fv(Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv(Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 또는 당업자에게 잘 알려져 있는 그외 단편을 포함하는, 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편일 수 있다.
용어 "CDR"은 주로 항원 결합에 기여하는 항체의 가변 도메인내에 있는 6개의 초가변성 영역(hypervariable region)들 중 하나이다. 6개의 CDR에 대해 가장 통상적으로 사용되는 정의 중 한가지는 Kabat E.A. et al, (1991) (Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)에 따른 것이다.
본원에서 사용되는, Kabat의 CDR 정의는 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3(CDR L1, CDR L2, CDR L3, 또는 L1, L2, L3) 뿐만 아니라 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3(CDR H2, CDR H3, 또는 H2, H3)에만 적용된다. 그러나, 본원에서 사용되는 중쇄 가변 도메인의 CDR1(CDR H1 또는 H1)은 뒷따르는 잔기들로 정의된다(Kabat 번호 지정법). 이는 26번 위치에서 시작되어 36번 앞까지이다. 이것은, 기본적으로, Kabat와 Chotia가 다르게 정의 내리는, CDR H1의 융합이다(또한, 예시를 위해 도 8 참조).
본원에서 사용되는 용어 "항체 프레임워크"는, 가변 도메인, VL 또는 VH의 일부분으로서, 이는 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 스캐폴드로서 제공된다.
용어 "단쇄 항체", "단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH)과 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)을 포함하는 분자를 의미한다. 이러한 scFv 분자는 일반 구조: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다.
용어 "면역결합제"는, 타겟 항원을 특이적으로 인지하는, 항체의 항원 결합부 전체 또는 그 일부를 포함하는 분자, 예컨대 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 전체 또는 그 일부이다. 면역결합제의 비제한적인 예로는 전장 면역글로불린 분자, scFv 및 항체 단편이 있으며, 항체 단편으로는, 비제한적으로, (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉 힌지 영역이 이황화 결합으로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) Fab' 단편; (iv) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (vi) VL 및 VH 도메인으로 구성된 Dab 단편과 같은 단일 도메인 항체, Camelid 또는 Shark 항체(예, shark Ig-NARs 나노바디®); 및 (vii) 나노바디, 즉 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 영역을 포함한다.
항체 중쇄 및 경쇄의 가변부에서 아미노산 잔기의 위치를 식별하기 위해, 본원에 사용하는 번호 지정 체계는, A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670 (AHo 체계)에서 규정된 체계에 따른다. AHo 체계와 Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에서 규정된 가장 많이 사용되는 체계 간의 변환표는, A. Honegger, J.MoI.Biol. 309 (2001) 657- 670에 제시되어 있다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부위를 의미한다(예, TNF). 에피토프는 전형적으로 고유한 공간적 배열에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 예로, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)을 참조한다.
용어 "특이적인 결합", "선택적인 결합", "선택적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"는 미리 정해진 항원 상의 에피토프에 대한 항체 결합을 의미한다. 전형적으로, 항체는 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만의 친화성(KD)으로 결합한다.
용어 "KD"는 특별한 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수이다. 전형적으로, 본 발명의 항체는, 예컨대 BIACORE 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법으로 결정된 바에 따르면, 해리 평형 상수(KD) 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만으로 TNF에 결합한다.
본원에서, "동일성"은 2개의 폴리펩타이드, 분자 또는 2개의 핵산 간의 서열 매칭(matching)을 의미한다. 비교하는 2개의 서열들 모두 한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛이 있는 경우(예, 2가지 DNA 분자 각각의 한 위치에 아데닌이 존재하거나, 또는 2개의 폴리펩타이드 각각에서 한 위치에 라이신이 존재하는 경우), 각 분자는 그 위치가 동일한 것이다. 2개의 서열 간의 "동일성%"은 두 서열이 공유하고 있는 매칭 위치의 갯수를 비교하는 위치의 갯수로 나누고, 100을 곱한 함수값이다. 예컨대, 2개 서열에서 위치 10 곳 중 6곳이 매칭된다면, 두 서열은 60％ 동일성을 갖는다. 예를 들면, DNA 서열 CTGACT와 CAGGTT는 50％ 동일성을 공유한다(전체 6개 중 3개의 위치가 매칭됨). 일반적으로, 두 서열이 최대 동일성을 갖도록 정렬하여, 비교한다. 이러한 정렬은 예컨대, ALIGN 프로그램(Align program)(DNAstar, Inc.)과 같은 컴퓨터 프로그램으로 통상적으로 수행되는, Needleman et al. (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453의 방법을 사용하여 제공할 수 있다. 2개의 아미노산 서열간의 동일성%는 또한 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller (Comput. Appl Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 이용하여, PAM120 웨이트(weight) 잔기 테이블, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4로 설정하여 정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 동일성%는 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능함)에서 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch (J MoI Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 이용하여 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스에서, 갭 웨이트 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4와 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 설정하여 정할 수 있다.
"유사한" 서열은 정렬하였을 때 동일하고 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 서열로서, 유사한 잔기는 정렬된 참조 서열내 대응되는 아미노산 잔기에 대해 보존적 치환이다. 이와 관련하여, 참조 서열에서 잔기의 "보존적 치환"은 대응되는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기, 예컨대, 크기, 형태, 전기적 전하, 및 공유 결합 또는 수소 결합 형성 능력과 같은 화학적 성질 등이 유사한 잔기에 의한 치환이다. 따라서, "보존적 치환으로 변형된" 서열은 하나 이상의 보존적 치환이 존재한다는 점에서 참조 서열 또는 천연형 서열과는 다른 서열이다. 2개의 서열 간의 "유사성%"는 두 서열이 공유하는, 매칭 잔기나 보존적 치환을 포함하는 위치의 갯수를 비교한 위치의 갯수로 나누고, 100을 곱하여 얻은 함수 값이다. 예컨대, 2개의 서열에서 10곳 중 6곳이 매칭되고, 10곳 중 2곳이 보존적 치환을 포함한다면, 이들 2가지 서열은 80％의 포지티브 유사성을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "보존적인 서열 변형"은 그 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특징에 좋지 않게 작용하지 않거나 결합 특성을 변이시키지 않는 아미노산 변형을 의미한다. 이러한 보존적인 서열 변형은 뉴클레오티드와 아미노산의, 치환, 부가 및 결손을 포함한다. 예컨대, 변형은 부위 특이적인 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같이, 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법에 의해 도입할 수 있다. 보존적인 아미노산 치환은, 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 치환하는 치환이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기 패밀리들은 당해 기술 분야에 정해져 있다. 이러한 패밀리들로는, 염기성 측쇄(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄(예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있다. 따라서, 인간 항-VEGF 항체에서 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 치환한다. 항원 결합성이 없어지지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적인 치환을 정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(예, Brummell et al, Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al Proc. Natl Acad. Set USA 94:412-417 (1997)).
본원에서 사용되는 "아미노산 컨센서스 서열"은, 각 위치에 가장 빈번하게 나타나는 아미노산 잔기를 결정할 수 있도록 정렬에서 갭을 허용하여, 적어도 2가지, 바람직하게는 그 이상의 정렬된 아미노산 서열들의 매트릭스를 이용하여 구할 수 있는 아미노산이다. 컨센서스 서열은 각 위치에서 가장 빈번하게 존재하는 아미노산을 포함하는 서열이다. 2가지 이상의 아미노산이 단일 위치에서 균등하게 나타나는 경우, 컨센서스 서열에 이러한 아미노산 둘 또는 모두가 포함된다.
단백질의 아미노산 서열은 다양한 수준으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 보존성 또는 가변성은 단일 잔기 수준으로, 다중 잔기 수준으로, 갭을 포함하는 다중 잔기 수준 등으로 나타낼 수 있다. 잔기는 동일한 잔기의 보존을 나타내거나 또는 클래스 수준에서 보존될 수 있다. 아미노산 클래스의 예로는 비전하성 극성 R기 (세린, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민); 양전하성 R기 (라이신, 아르기닌, 및 히스티딘); 음전하성 R기 (글루탐산 및 아스파르트산); 소수성 R기 (알라닌, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 발린 및 티로신); 및 특수 아미노산 (시스테인, 글리신 및 프롤린)을 포함한다. 다른 클래스들고 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 구조 결정법이나 치환가능성을 평가하는 다른 데이타를 사용함으로써 규명할 수 있다. 이러한 의미에서, 치환가능한 아미노산은 그 위치에서 치환가능하며, 기능적 보존성을 유지할 수 있는 임의의 아미노산을 지칭할 수 있다.
그러나, 동일 클래스의 아미노산도 생리물리학적 특성 수준에서 다양할 수 있음을 알게 될 것이다. 예컨대, 특정 소수성 R기(예, 알라닌, 세린 또는 트레오닌)는 다른 소수성 R기(예, 발린 또는 루신) 보다 친수성이 더 높다(즉, 보다 높은 친수성 또는 보다 낮은 소수성)는 것을 알게 될 것이다. 상대적인 친수성 또는 소수성은 당해 기술 분야에서 인지되는 방법을 이용하여 정할 수 있다(예, Rose et al, Science, 229: 834-838 (1985) 및 Cornette et al, J. MoI. Biol, 195: 659-685 (1987) 참조).
본원에서, 한가지 아미노산 서열 (예, 제1 VH 또는 VL 서열)을 하나 이상의 다른 아미노산 서열 (예, 데이타베이스에서 하나 이상의 VH 또는 VL 서열)과 함께 정렬하였을 때, 하나의 서열 (예, 제1 VH 또는 VL 서열)내 아미노산 위치를 하나 이상의 다른 아미노산 서열내 "대응되는 위치"와 비교할 수 있다. 본원에서, "대응되는 위치"는, 서열을 최적으로 정렬하였을 때, 즉, 동일성(％) 또는 유사성(％) 값이 최고치로 수득되게 서열을 정렬하였을 때, 비교하고 있는 서열(들)간의 등가의 위치를 의미한다.
본원에서, "키메라" 면역결합제는 특정 종으로부터 유래된 항체나 특정 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체의 대응 서열과 동일하거나 상동적인 중쇄 및/또는 경쇄의 부분을 가지지만, 나머지 체인(들)은 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편의 대응 서열과 동일하거나 또는 상동적이다. 본원에서 인간화된 항체는 키메라 항체의 하위군이다.
"인간화된 항체"는 본원에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 피해가기 위해 재조합 DNA 기법을 이용하여 합성한, 면역결합제이다. 인간화는 이종 기원의 단일클론 항체의 면역원성을 낮추기 위해 잘-확립되어 있는 기법이다. 인간화된 항체는 인간화된 중쇄 가변부, 인간화된 경쇄 가변부 및 완전한 인간 불변부로 구성된다. 가변부를 인간화하는데에는, 어셉터 프레임워크의 선정, 전형적으로 인간 어셉터 프레임워크의 선정, 상기 가변 도메인 어셉터 프레임워크에 삽입할 공여체 면역결합제의 CDR 범위, 및 공여체 프레임워크에서 어셉터 프레임워크로의 잔기 치환이 수반된다. CDR을 인간 어셉터 프레임워크에 이식하기 위한 일반적인 방법은 윈터의 미국 특허 제 5,225,539호에 기술되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 미국 특허 제 6,407,213호에는 공여체 면역결합제에서 치환이 바람직한 프레임워크내 아미노산 위치가 다수 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 본 명세서에 원용에 의해 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "기능적 특성"은, 예를 들면 폴리펩타이드의 제조 특성 또는 치료학적 효능을 개선시키기 위해, 당해 기술 분야의 당업자에게는 (예, 종래 폴리펩타이드에 비하여) 개선시키는 것이 바람직하거나 및/또는 유익한, 폴리펩타이드 (예, 면역결합제)의 특성이다. 일 구현예에서, 기능적 특성은 개선된 안정성 (예, 열 안정성)이다. 다른 구현예에서, 기능적 특성은 (예, 세포 조건하에) 개선된 가용성이다. 또다른 구현예에서, 기능적 특성은 비-응집성이다. 또다른 구현예에서, 기능적 특성은 (예, 원핵 세포에서의) 발현 개선이다. 또다른 구현예에서, 기능적 특성은 봉입체의 정제 공정 후 리폴딩 수율 개선이다. 특정 구현예에서, 기능적 특성은 항원 결합 친화성 개선은 아니다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥이며, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 핵산이, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 위치된 경우, "작동가능하게 연결"된다. 예컨대, 프로모터 또는 인핸서가, 서열의 전사에 영향을 미친다면, 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한가지 타입은 부가적인 DNA 세그먼트를 연결시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프인 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 타입은, 바이러스 게놈에 부가적인 DNA 세그먼트들을 연결시킬 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예, 박테리아의 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 에피좀 포유류 벡터). 그외 벡터(예, 비-에피좀 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 그로 인해 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포일 수 있다. 형질전환이 용이한 박테리아로는, 에셔리키어 콜리(Escherichia coli) 또는 살모넬라 균주와 같은 장내세균과; 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스과; 폐렴 쌍구균; 연쇄구군 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)에 속하는 균주가 있다. 적합한 미생물로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)가 있다. 적합한 동물 숙주 세포로는 CHO (중국 햄스터 난소 세포주) 및 NSO 세포가 있다.
용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 본원에 기술된 치료적 또는 예방적 조처를 지칭한다. "치료" 방법은, 이러한 치료가 필요한 개체에게, 예로 TNFα-매개 장애를 가진 개체 또는 궁극적으로 이러한 장애에 걸릴 수 있는 개체에게, 장애 또는 재발성 장애의 한가지 이상의 증상을 예방, 치유, 지연, 중증도 감소 또는 완화하기 위해, 또는 이러한 치료를 하지 않았을 때 예상되는 것 보다 개체의 생존을 연장시키기 위해, 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함한다.
용어 "TNF-매개 장애" 또는 "TNF-매개 질환"은 TNF의 관여가 요구되는 증상 또는 질환 상태의 임의 장애, 개시, 진행 또는 지속을 의미한다. 예시적인 TNF-매개 장애로는, 일반적인 염증의 만성 및/또는 자가면역 상태, 일반적인 면역 매개 염증 장애, 염증성 CNS 질환, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추 신경계, 위장관, 요로 또는 폐에 나타나는 염증 질환, 일반적인 포도막염 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베체트 질환, 안구 건조 증후군, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병(당뇨병성 신경 장애 포함), 인슐린 내성, 일반적인 관절염 상태, 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 소아 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 귈랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축성 측상 경화증, 유육종증, 사구체 신염, 만성 신장 질환, 방광염, 건선(건선성 관절염 포함), 화농성 땀샘염, 지방층염, 괴저성 농피증, SAPHO 증후군(활액막염, 여드름, 농포증, 골 비대증 및 골염), 여드름, 스위트 증후군, 천포창, 크론 질환(장외 증상 포함), 궤양성 결장염, 기관지 천식, 과민성 폐염, 일반적인 알레르기, 알레르기성 비염, 알레르기성 부비강염, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 가와사키 증후군, 자이언트 세포 동맥염, 처그-스트라우스 혈관염, 결절성 다발성 동맥염, 화상, 이식 편대 숙주 질환, 숙주 편대 이식 반응, 장기 또는 골수 이식 후 거부 반응, 일반적인 전신 및 국소 맥관염 상태, 전신 및 원반형 홍반성 루프스, 다발성 근염, 피부근염, 경피증, 자간전증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 눈 수술(예, 백내장(눈 수정체 치환) 또는 녹내장 수술), 관절 수술(관절경 수술 포함), 관절-관련 구조물(예, 인대) 수술, 구강 및/또는 치아 수술, 최소 침습성 심혈관 시술(예, PTCA, 죽상경화반 절제술, 스텐트 장착), 복강경 및/또는 내시경 복막내 및 부인과 시술, 내시경 비뇨기과 시술(예, 전립선 수술, 요관경 검사, 방광경 검사, 간질성 방광염)과 같은 수술 후 염증 또는 일반적인 수술전 염증(예방), 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 헌팅턴병, 얼굴마비, 크로이츠펠트-야콥병, 암 관련 골 용해, 암 관련 염증, 암 관련 통증, 암 관련 악액증, 골 전이, TNFα의 중추 또는 말초 효과에 의해 유발되는지, 그리고, 염증으로 분류되는 지와는 무관한, 급성 및 만성 형태의 통증, 통각 또는 신경병성 통증, 좌골 신경통, 요통, 수근관 증후관, 복합 부위 통증 증후군(CRPS), 통풍, 대상포진 후 신경통, 섬유근육통, 국소 통증 상태, 전이 종양으로 인한 만성 통증 증후군, 월경통, 박테리아, 바이러스 또는 진균으로 인한 패혈증, 결핵, AIDS, 아테롬성 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 고혈압, 이상 지질혈증, 심장 기능부전 및 만성 심부전이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 용어 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 바람직한 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료학적 유효량"은 질병과 이 질병을 이미 앓고 있는 환자에서의 관련 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 억제하는데 충분한 양으로 정의된다. 이러한 용도에 유효한 양은 치료중인 장애의 중증도와 환자의 면역 시스템의 전반적인 상태에 따라 결정될 것이다.
용어 "개체"는 임의의 인간 또는 인간을 제외한 동물을 지칭한다. 예컨대, 본 발명의 방법 및 조성물은 TNF-매개 장애를 가진 개체를 치료하는데 사용할 수 있다.
용어 "라고모프(lagomorph)"는 분류학상 토끼과(예, 산토끼 및 토끼) 및 새앙토끼과(새앙토끼)를 비룻한 토끼목에 속하는 것을 지칭한다. 가장 바람직한 구현예에서, 라고모트는 토끼이다. 본원에서 용어 "토끼"는 토끼과에 속하는 동물을 지칭한다.
제작된 면역결합제에 여러가지 명명법을 적용할 수 있다. 이는, 전형적으로 번호(예, #34)로 식별할 수 있다. EP 또는 Epi와 같은 접두어가 사용된 경우(예, EP34는 Epi34 또는 #34와 동일함), 이는 동일한 면역결합제를 지칭한다.
다르게 정의된 경우를 제외하고는, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 또는 시험에 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질을 사용할 수 있지만, 적합한 방법과 물질을 하기에 기술한다. 의견이 상반되는 경우, 정의부를 비롯한 본 명세서에 따른다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 다양한 측면들은 하기 세부 항목에서 더욱 상세하게 설명된다. 다양한 구현예들, 선호도 및 범위는 임의로 조합할 수 있는 것으로 이해된다. 나아가, 구체적인 구현예, 선택 정의, 구현예 또는 범위에 의존되지 않는다.
항 - TNFα 항체
일 측면에서, 본 발명은 TNFα에 결합하여 생체내에서 TNFα의 기능을 차단하는데 적합한 면역결합제를 제공한다. 이러한 면역결합체의 CDR은 미국 특허 제 7,431,927호에 기술된 바와 같이 토끼 항-TNFα 단일클론 항체로부터 유래된다. 토끼 항체는 특히 높은 친화성을 가진 것으로 알려져 있다. 또한, 본원에 기술된 CDR 서열은 천연 서열이며, 이는, 제조되는 면역결합체의 친화성 성숙화를 수행할 필요가 없음을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 면역결합제는 생체내에서 TNFα를 중화시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하며, TNFα에 특이적으로 결합하는, 면역결합제를 제공한다. 본 발명의 면역겹합제에 사용하기 위한 예시적인 CDR 아미노산 서열은 서열번호 3-50(표 1)에 기재되어 있다. 서열번호 3-50에 기재된 CDR들은 임의의 당해 기술 분야에서 인지되는 방법을 이용하여 임의의 적합한 결합 스캐폴드 상에 이식할 수 있다(예, Riechmann, L. et al (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al (1989) Proc. Natl Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 윈터의 미국 특허 제 5,225,539호, 및 퀸 등의 미국 특허 제 5,530,101호; 미국 특허 제 5,585,089호; 미국 특허 제 5,693,762호 및 미국 특허 제 6,180,370호 참조). 여러가지 모 항체 유래의 CDR을 하나의 항체로 조합하여, 추가적인 항체 종들을 만들 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 면역결합제는 인간화되어, 치료학적 용도에 적합한 것이 바람직하다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 면역결합제를 제공하며,
여기서, 상기 면역결합제는
(i) 인간 중쇄 가변 프레임워크 서열과 토끼 면역결합제로부터 유래된 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3 서열을 포함하는, 인간화된 중쇄 가변부(VH); 및/또는
(ii) 인간 경쇄 가변 프레임워크 서열과 토끼 면역결합제로부터 유래된 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3를 포함하는, 인간화된 경쇄 가변부(VL)를 포함한다.
당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 다수의 토끼 VH 체인들은 뮤라인 및 인간 대응체에 비해 쌍을 이루고 있는 시스테인이 많이 포함되어 있다. 일부 토끼 체인에는, cys22와 cys92 사이에 형성된 보존된 이황화 결합 뿐만 아니라, cys21-cys79 연결과, CDR H1의 마지막 잔기와 CDR H2의 첫번째 잔기 사이에 형성된 CDR간 S-S 연결도 있다. 아울러, 시스테인 잔기 쌍들은 CDR L3에서도 자주 발견된다. 또한, 다수의 토끼 항체 CDR들은 기존에 공지된 임의의 표준적인 구조(canonical structure)에 속하지 않는다. 특히, CDR L3는 대체적으로 인간 또는 뮤라인 대응체의 CDR L3 보다 훨씬 길다.
토끼 외에도, 본 발명은 임의의 라고모프의 CDR 이식에 사용할 수 있다.
항체의 경우, 서열번호 3-50에 기술된 토끼의 CDR은 임의의 종으로부터 유래된 임의 항체의 프레임워크 영역에 이식할 수 있다. 그러나, 이른바 "품질 관리" 스크린(WO 0148017)에서 동정된 프레임워크를 포함하는 항체 또는 항체 유도체는, 일반적으로 높은 안정성 및/또는 가용성이 특징이며, 그래서 인간 TNFα 중화와 같은 세포외 적용 측면에 유용할 수 있다는 것이, 이미 확인된 바 있다. 더욱이, 이러한 가용적이고 안정적인 VL(가변성 경쇄) 및 VH(가변성 중쇄) 프레임워크의 일 특정 조합이, 특히 토끼 CDR을 수용하는데 적합하다는 것도, 확인되었다. 상기 프레임워크 또는 유도체로의 이식시, 매우 다양한 토끼 CDR의 루프 구조가, 공여체 프레임워크의 서열과는 매우 독립적으로, 완전하게 유지될 수 있다는 사실이, 놀랍게도 확인되었다. 또한, 여러가지 토끼 CDR을 포함하는 상기 프레임워크 또는 이의 유도체는, 토끼의 야생형 단쇄와는 대조적으로 원활하게 발현되며 생산성도 우수할 뿐만 아니라, 여전히 오리지날 공여체 토끼 항체의 친화성을 완전하게 유지하고 있다. 따라서, 일 구현예에서, 서열번호 3-50에 기술된 CDR은 EP 1479694에 기술된 "품질 관리" 스크리닝에 의해 수득한 인간 항체 프레임워크에 이식된다. 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 프레임워크의 아미노산 서열은 하기에 서열번호 1 및 2로 나타낸다.
서열번호 1
FW1.4의 가변성 경쇄
Figure 112011005653678-pct00001
서열번호 2
FW1.4의 가변성 중쇄
Figure 112011005653678-pct00002
X는 임의의 천연 아미노산일 수 있다. 아미노산 3개 이상 최대 50개가 존재할 수 있다. CDR은 전형적으로 X가 제시된 위치에 삽입된다.
다른 구현예에서, 본 발명은, VH 또는 VL 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하며, TNFα에 특이적으로 결합하는, 면역결합제를 제공한다. 본 발명의 면역결합제로 사용하기 위한 예시적인 VH 또는 VL 아미노산 서열은 서열번호 51-111에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 51-111에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하며, TNFα에 특이적으로 결합하는, 면역결합제를 추가로 제공하며, 상기 면역결합제는 본 발명의 항-TNFα 면역결합제의 바람직한 기능적 특성을 보유하거나 개선된 것이다. 유사성%의 예로는, 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 51-111에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하고 TNFα에 특이적으로 결합하는, 면역결합제를 추가로 제공하며, 상기 면역결합제는 본 발명의 항-TNFα 면역결합제의 바람직한 기능적 특성을 보유하거나 개선된 것이다. 동일성%의 예로는, 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 51-111에 기재된 아미노산 서열에 대해 보존적인 치환이 있는 아미노산 서열을 포함하고 TNFα에 특이적으로 결합하는, 면역결합제를 추가로 제공하며, 상기 면역결합제는 본 발명의 항-TNFα 면역결합제의 바람직한 기능적 특성을 보유하거나 개선된 것이다.
가장 바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역결합제는 서열번호 3-50 중 어느 하나와 80% 이상, 더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한, 한가지 이상의 CDR 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 서열번호 3-8로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 9-14로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 15-20으로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 21-26으로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 27-32로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 33-38로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 39-44로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 서열번호 45-50으로 이루어진 군 중에서 적어도 1개, 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 가장 바람직하게는 6개의 CDR을 포함하는 면역결합제가 제공된다.
서열번호 3-50으로 본원에 제공되는 CDR 서열은 추가로 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열은 3개, 더 바람직하게는 2개, 가장 바람직하게는 오직 1개의 치환을 포함한다. 이러한 치환은 바람직하기로는 상기 면역결합제의 선택적인 결합력은 손상시키지 않지만, 친화성은 변이, 바람직하게는 강화되도록 하는 것이 바람직하다.
표 1: Rabmab 공여체 CDR
Figure 112011005653678-pct00003
Figure 112011005653678-pct00004
다른 구현예에서, 본 발명은 표 1에 나열된 CDR 세트(H1-H3, L1-L3; 하나의 Rabmab 클론에 속함)를 포함하는 단일클론 항체에 의해 인지되는, 인간 TNFα의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 그러한 항체는 표 1의 항체를 이용한 표준 TNF 결합 분석에서 교차-경쟁력을 기초로 동정할 수 있다. 표 1의 항체의 인간 TNFα에 대한 결합을 저해하는 시험 항체의 저해력을 통해, 시험 항체가 표 1의 항체와 인간 TNFα에 대한 결합 대해서에 경쟁할 수 있으며, 따라서 표 1의 항체와 인간 TNFα 상의 동일한 에피토프에 관여한다는 것이 확인되었다. 바람직한 구현예에서, 표 1에 기재된 항체로서 인간 TNFα 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단일클론 항체이다. 이러한 단일클론 항체는 본원에 기술된 바에 따라 제조하고 분리할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 단쇄 항체(scFv) 또는 Fab 단편이다. scFv 항체의 경우, 선택된 VL 도메인은 양쪽 방향에 유연한 링커에 의해 선택된 VH 도메인과 연결시킬 수 있다. 당해 기술 분야의 링커로서 적합한 형태는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변형체로 구성된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, (GGGGS)4 링커 (서열번호 72) 또는 이의 유도체가 사용되지만, 1-3번 반복된 서열의 변이체도 가능하다 (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 본 발명에 사용될 수 있는 다른 링커는 Alftlian et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. MoI. Biol. 293:41-56 and Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59에 기재되어 있다. 배열은 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH일 수 있지만, 전자 배열이 바람직하다. Fab 단편의 경우, 선택한 경쇄 가변 도메인 VL은 인간 Ig κ 체인의 불변부에 융합되고, 적합한 중쇄 가변 도메인 VH는 인간 TgG의 첫번째(N-말단) 불변 도메인 CH1에 융합된다. C-말단에서는, 체인간의 이황화 결합이 2가지의 불변 도메인 간에 형성된다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 인간 TNF에 대해 친화성을 가지며, 해리 상수 Kd는 1 fM -10 μM이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, Kd는 ≤ 1 nM이다. 항체의 항원 친화성은 적합한 방법과 본원에 기술된 방법을 이용하여 실험을 통해 정할 수 있다(Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", in Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY).
바람직한 항체는 하기 VH 및 VL 서열(CDR 서열은 밑줄 침) 중에서 가변성 중쇄(VH) 및/또는 가변성 경쇄(VL) 체인 영역을 가진 항체를 포함한다.
서열번호 51:
Figure 112011005653678-pct00005
서열번호 52:
Figure 112011005653678-pct00006
서열번호 53:
Figure 112011005653678-pct00007
서열번호 54:
Figure 112011005653678-pct00008
서열번호 55:
Figure 112011005653678-pct00009
서열번호 56:
Figure 112011005653678-pct00010
서열번호 57:
Figure 112011005653678-pct00011
서열번호 58:
Figure 112011005653678-pct00012
서열번호 59:
Figure 112011005653678-pct00013
서열번호 60:
Figure 112011005653678-pct00014
Figure 112011005653678-pct00015
주의: EP1min CDR-H1은 EP1max에 매치되지 않음
서열번호 61:
Figure 112011005653678-pct00016
서열번호 62:
Figure 112011005653678-pct00017
서열번호 63:
Figure 112011005653678-pct00018
서열번호 64:
Figure 112011005653678-pct00019
서열번호 65:
Figure 112011005653678-pct00020
서열번호 66:
Figure 112011005653678-pct00021
서열번호 67:
Figure 112011005653678-pct00022
서열번호 68:
Figure 112011005653678-pct00023
서열번호 69:
Figure 112011005653678-pct00024
서열번호 70:
Figure 112011005653678-pct00025
서열번호 71:
Figure 112011005653678-pct00026
서열번호 72:
글리신-세린 링커
Figure 112011005653678-pct00027
서열번호 73:
Figure 112011005653678-pct00028
서열번호 74:
Figure 112011005653678-pct00029
서열번호 75:
Figure 112011005653678-pct00030
서열번호 76:
Figure 112011005653678-pct00031
서열번호 77:
Figure 112011005653678-pct00032
서열번호 78:
EP34min VL
Figure 112011005653678-pct00033
서열번호 79:
Figure 112011005653678-pct00034
서열번호 80:
Figure 112011005653678-pct00035
서열번호 81:
Figure 112011005653678-pct00036
서열번호 82:
Figure 112011005653678-pct00037
서열번호 83:
Figure 112011005653678-pct00038
서열번호 84:
Figure 112011005653678-pct00039
서열번호 85:
Figure 112011005653678-pct00040
주의 : EP42min CDR-H1은 EP42max과 매치되지 않는다
서열번호 86:
Figure 112011005653678-pct00041
서열번호 87:
EP42max VH
Figure 112011005653678-pct00042
서열번호 88:
Figure 112011005653678-pct00043
항- TNF 항체의 제조
본 발명은, 품질 관리(QC) 분석에 의해 동정한 매우 가용적이며 안정적인 인간 항체 프레임워크가, 특히 비-인간성 동물 종, 예컨대 토끼 CDR로부터 유래된 CDR을 수용하기 위한 특히 적합한 프레임워크라는 사실을, 일정 부분이상 기초로 한다. 특히, 본 발명은. 특정 인간 항체(소위 "FW1.4" 항체)의 경쇄 및 중쇄 가변부가 특히 여러가지 결합 특이성을 가진 다양한 토끼 항체 유래의 CDR에 대한 어셉터로서 적합하다는 발견 사실을 기초로 한다. ESBATech의 인간 단쇄 프레임워크 FW 1.4는, 품질 관리 분석에서, HeLa 세포에서 오리지날 CDR과 함께 사용하여 발현시켰을 때(WO 03097697), 명백히 기대 이하였지만, 놀랍게도, 토끼 CDR과 같은 다른 CDR과 조합하였을 때에는 매우 안정적이며 가용적이며 원활하게 생산되는 단쇄 항체가 생성된다는 것을 확인하였다. 또한, 토끼 CDR을 혼용성이 높은 경쇄 또는 중쇄 프레임워크에 이식하여 제조한 인간화된 면역결합제는, 공여체 CDR이 유래된 토끼 항체의 결합 특성을 일관되고 확실하게 유지한다. 더욱이, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 면역결합제는 가용성 및 안정성과 같은 탁월한 기능적 특성을 나타낸다. 이에, 본 발명의 일반 과제는 토끼 또는 그외 비-인간성 CDR을 각각 서열번호 1 (K127) 및 서열번호 2 (a43)의 가용적이고 안정적인 경쇄 및/또는 중쇄 인간 항체 프레임워크에 이식하여, 생물물리학적 특성이 우수한 인간화된 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
바람직한 구현예에서, 상기 프레임워크는, 중쇄 프레임워크(VH)내 H24, H25, H56, H82, H84, H89 및 H108번 (AHo 번호 지정 체계) 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 치환을 포함한다. 부가적으로 또는 다른 예로, 상기 프레임워크는 AHo 번호 지정 시스템에 따라 경쇄 프레임워크(VH)내 L87 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 치환이 존재하더라도, 오리지날 공여체 항체의 친화성을 거의 완전하게 유지하고 있는 어셉터 프레임워크가 제조된다는 것이 확인되었다. 보다 바람직한 구현예에서, AHo 번호 지정 체계에 따른, H24번 위치의 트레오닌(T), H25번 위치의 발린(V), H56번 위치의 글리신(G) 또는 알라닌(A), H82번 위치의 라이신(K), H84번 위치의 트레오닌(T), H89번 위치의 발린(V) 및 H108번 위치의 아르기닌(R) 및 L87번 위치의 트레오닌(T)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환이 프레임워크 서열내에 존재한다.
따라서, 더욱 더 바람직한 구현예에서, 어셉터 프레임워크는 다음과 같다:
서열번호 89: rFW1.4의 가변성 중쇄 프레임워크
Figure 112011005653678-pct00044
서열번호 90: rFW1.4(V2)의 가변성 중쇄 프레임워크
Figure 112011005653678-pct00045
서열번호 91: FW1.4의 치환된 가변성 경쇄 프레임워크
Figure 112011005653678-pct00046
서열번호 92: rFW1.4의 프레임워크
Figure 112011005653678-pct00047
서열번호 93: rFW1.4(V2)의 프레임워크
Figure 112011005653678-pct00048
X는 임의의 천연 아미노산일 수 있으며; 3개 이상 최대 50개의 아미노산이 존재할 수 있다. CDR는 전형적으로 X가 존재하는 부위에 삽입된다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 재조합 유전학 분야에서 일반적인 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 폴리펩타이드 서열을 인지하여, 이를 코딩하는 cDNA를 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의한 유전자 합성으로 제작할 수 있다. 이러한 cDNA를 적합한 벡터 플라스미드에 클로닝할 수 있다. VL 및/또는 VH 도메인을 코딩하는 DNA가 수득되면, 예컨대 돌연변이 유발 프라이머를 이용한 PCR에 의한 부위 특이 돌연변이화를 수행하여, 다양한 유도체들을 수득할 수 있다. 최적의 "개시" 서열은 VL 및/또는 VH 서열에 적합한 변이의 수에 따라 선택할 수 있다. 바람직한 서열은 TB-A 서열 및 이의 유도체, 예컨대 scFv 서열 또는 Fab 융합 펩타이드 서열이고, 이는 PCR에 의한 돌연변이 유발 및/또는 클로닝의 PCR의 주형으로서 선택할 수 있다.
CDR을 프레임워크 영역에 삽입 또는 이식하는 방법은, 예컨대 Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 윈터의 미국 특허 제 5,225,539호 및 퀸 등의 미국 특허 제 5,530,101호; 제 5,585,089호; 제 5,693,762호 및 제 6,180,370호, 뿐만 아니라 2008년 6월 25일 및 2009년 2월 4일자 표제 "유니버셜 항체 프레임워크를 이용한 토끼 항체의 인간화"의 미국 가출원번호 제 61/075,697호 및 제 61/155,041호에 기술되어 있다.
당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 클로닝 및 돌연변이화 기법들을 이용하여, Fab 단편을 제조하기 위한 링커, 셔플 도메인 또는 구조체 융합체를 부착시킬 수 있다. 본 발명의 일반적인 방법을 설명하는 기본 프로토콜은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3rd ed. 2001) 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999)에 기술되어 있다.
scFv 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 보유하는 DNA 서열, 또는 Fab 단편의 경우, VL-Cκ 및 VH-CH1 융합체에 대한 2가지 유전자를 포함하는 2가지 별개의 유전자나 바이-시스트론 오페론 중 어느 하나를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 DNA 서열은, 적합한 발현 벡터, 바람직하게는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터에 클로닝한다. 적합한 리보좀 결합부가 번역되도록 각 유전자의 앞 부분에 존재하여야 함에 주의를 기울여야 한다. 본 발명의 항체는 이들로 구성된 것 보다는 개시한 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 클로닝 전략에서는, N-말단에 하나 또는 수개의 부가적인 잔기가 있는 항체가 존재하는 구조체가 제조하여야 할 수 있다. 구체적으로, 개시 코돈으로 생성된 메티오닌은, 번역 후에 절단되지 않으면 최종 단백질에 존재할 수도 있다. 대부분의 scFv 항체 구조체들은 N-말단에 추가적인 알라닌이 생긴다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, E. coli에서 원형질막 공간으로 발현시키는 발현 벡터를 선택한다(Krebber, 1997). 상기 벡터에 절단가능한 신호 서열의 앞부분에 프로모터를 포함시킨다. 그 후, 항체 펩타이드의 코딩 서열을 절단가능한 신호 서열과 프레임으로 융합시킨다. 이는, 신호 서열이 절단되는 박테리아 원형질막 공간으로 폴리펩타이드의 발현을 타겟팅한다. 그 후, 항체는 폴딩(folding)된다. Fab 단편의 경우, VL-Cκ 및 VH- CH1 융합 펩타이드를 유출 신호와 연결하여야 한다. 펩타이드가 원형질막 공간에 도달한 다음에 C-말단의 시스테인에 S-S 공유 결합이 형성된다. 만일, 항체의 세포질 발현이 바람직하다면, 이 항체는 일반적으로 봉입체를 통해 고수율로 수득할 수 있으며, 다른 세포성 단편과 단백질들로부터 쉽게 분리할 수 있다. 이 경우, 봉입체는 예컨대 구아니딘 하이드로클로라이드(GndHCl)와 같은 변성제에서 용해시킨 다음, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 재변성 공정에 의해 리폴딩한다.
scFv 또는 Fab 폴리펩타이드를 발현하는 플라스미드는 적합한 숙주, 바람직하게는 박테리아, 효모 또는 포유류 세포, 가장 바람직하게는 적절한 E. coli 균주, 예컨대 원형질막 공간으로 발현하기 위한 JM83 또는 봉입체로 발현하기 위한 BL21에 도입한다. 폴리펩타이드는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및/또는 젤 여과와 같은 표준 기법을 이용하여 원형질막 공간이나 봉입체로부터 회수하여 정제할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 생체내 수율, 가용성 및 안정성 측면에서 특정될 수 있다. TNF, 바람직하게는 인간 TNFα에 대한 결합력은, ELISA 또는 표면 플라스몬 공명(BIAcore)에 의해 WO 9729131에 기술된 재조합 인간 TNF를 이용하여 시험관내에서 시험할 수 있으며, 또한, 표면 플라스몬 공명 방법으로 koff 속도 상수를 결정할 수 있는데, 바람직하게는, 이는 10-3s-1 미만이 바람직하다. Kd 수치는 ≤ 10 nM이 바람직하다.
인간 TNF에 대한 결합 친화성이 강한 항체 외에도, 치료 경과에 유익한 특성을 가진 항-TNF 항체를 제조하는 것도 바람직하다. 예컨대, 항체는, L929 TNFα-매개 세포독성 분석에서 중화 활성을 보이는 항체일 수 있다. 본 분석에서는, 액티노마이신을 처리한 마우스 L929 섬유모세포의 독성은 재조합 인간 TNF(hTNF)로 유도하였다. 최대 hTNF-유도성 세포독성의 90%는, TNF 농도 1000 pg/ml로 결정되었다.
모든 L929 세포는 페놀레드가 첨가된 RPMI 1640의 소태아 혈청(10% v/v)이 보충된 L-글루타민 배지에서 배양하였다. 항-TNFα 결합제의 중화 활성은, 페놀레드과 5% 소태아 혈청이 무첨가된 RPMI 1640에서 분석하였다. 길항 효과가 최대 저해율의 1/2에 도달하는 농도(EC 50%)를 결정하기 위해, 여러가지 농도의 항-TNF 결합제 (0 - 374 ng/mL)를 1000 pg/ml hTNF의 존재 하에 L929 세포에 첨가하였다. 용량 반응 곡선을 가변성 슬로프의 비선형 시그모이드 회귀에 적용하고, EC50을 계산하였다.
최적화된 변이체
본 발명의 항체는, 기능적 특성 강화, 예컨대 가용성 및/또는 안정성 강화를 위해 더욱 최적화할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 2008년 3월 12일자 PCT 출원번호 PCT/EP2008/001958 표제 "단쇄 항체의 서열을 기초로한 조작 및 최적화"에 따라 최적화할 수 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
예컨대, 본 발명의 TNFα 면역결합제는 VEGF 면역결합제에서 대응되는 위치(들) 보다 가변성에 대한 허용성이 더 높거나 낮은 아미노산 잔기 위치를 동정하기 위해, 기능적으로 선택된 scFv의 데이타베이스와 비교할 수 있으며, 그를 통해, 이렇게 동정된 잔기 위치(들)가 안정성 및/또는 가용성과 같은 기능성을 개선하기 위한 조작에 적합할 수 있다는 것이 확인된다.
치환가능한 프레임워크 위치의 예는 2008년 6월 25일자 PCT 출원번호 PCT/CH2008/000285 표제 "항체 변형 방법 및 기능적 특성이 개선된 변형된 항체" 및 2008년 6월 25일자 PCT 출원번호 PCT/CH2008/000284 표제 "단쇄 항체의 서열 기반의 조작 및 최적화"에 기술되어 있다. 예컨대, 본 발명의 면역결합제의 중쇄 가변부내 아미노산 위치에 하기 치환 중 한가지 이상의 치환을 도입할 수 있다(하기 나열된 각각의 아미노산 위치는 AHo 번호 지정법을 참조함):
(a) 아미노산 1번 위치에 Q 또는 E
(b) 아미노산 6번 위치에 Q 또는 E;
(c) 아미노산 7번 위치에 T, S 또는 A, 보다 바람직하게는 T 또는 A, 더욱 더 바람직하게는 T;
(d) 아미노산 10번 위치에 A, T, P, V 또는 D, 더 바람직하게는 T, P, V 또는 D;
(e) 아미노산 12번 위치에 L 또는 V, 보다 바람직하게는 L;
(f) 아미노산 13번 위치에 V, R, Q, M 또는 K, 보다 바람직하게는 V, R, Q 또는 M;
(g) 아미노산 14번 위치에 R, M, E, Q 또는 K, 보다 바람직하게는 R, M, E 또는 Q, 보다 더 바람직하게는 R 또는 E;
(h) 아미노산 19번 위치에 L 또는 V, 보다 바람직하게는 L;
(i) 아미노산 20번 위치에 R, T, K 또는 N, 보다 바람직하게는 R, T 또는 N, 보다 더 바람직하게는 N;
(j) 아미노산 21번 위치에 I, F, L 또는 V, 보다 바람직하게는 I, F 또는 L, 보다 더 바람직하게는 I 또는 L;
(k) 아미노산 45번 위치에 R 또는 K, 보다 바람직하게는 K;
(1) 아미노산 47번 위치에 T, P, V, A 또는 R, 보다 바람직하게는 T, P, V 또는 R, 보다 더 바람직하게는 R;
(m) 아미노산 50번 위치에 K, Q, H 또는 E, 보다 바람직하게는 K, H 또는 E, 보다 더 바람직하게는 K;
(n) 아미노산 55번 위치에 M 또는 I, 보다 바람직하게는 I;
(o) 아미노산 77번 위치에 K 또는 R, 보다 바람직하게는 K;
(p) 아미노산 78번 위치에 A, V, L 또는 I, 보다 바람직하게는 A, L 또는 I, 보다 더 바람직하게는 A;
(q) 아미노산 82번 위치에 E, R, T 또는 A, 보다 바람직하게는 E, T 또는 A, 보다 더 바람직하게는 E;
(r) 아미노산 86번 위치에 T, S, I 또는 L, 보다 바람직하게는 T, S 또는 L, 보다 더 바람직하게는 T;
(s) 아미노산 87번 위치에 D, S, N 또는 G, 보다 바람직하게는 D, N 또는 G, 보다 더 바람직하게는 N;
(t) 아미노산 89번 위치에 A, V, L 또는 F, 보다 바람직하게는 A, V 또는 F, 보다 더 바람직하게는 V;
(u) 아미노산 90번 위치에 F, S, H, D 또는 Y, 보다 바람직하게는 F, S, H 또는 D;
(v) 아미노산 92번 위치에 D, Q 또는 E, 보다 바람직하게는 D 또는 Q, 보다 더 바람직하게는 D;
(w) 아미노산 95번 위치에 G, N, T 또는 S, 보다 바람직하게는 G, N 또는 T, 보다 더 바람직하게는 G;
(x) 아미노산 98번 위치에 T, A, P, F 또는 S, 보다 바람직하게는 T, A, P 또는 F, 보다 더 바람직하게는 F;
(y) 아미노산 103번 위치에 R, Q, V, I, M, F, 또는 L, 보다 바람직하게는 R, Q, I, M, F 또는 L, 보다 더 바람직하게는 Y, 보다 더 바람직하게는 L; 및
(z) 아미노산 107번 위치에 N, S 또는 A, 보다 바람직하게는 N 또는 S, 보다 더 바람직하게는 N.
부가적으로 또는 다른 예로, 본 발명의 면역결합제의 경쇄 가변부에, 하기 치환들 중 하나 이상의 치환을 도입할 수 있다:
(aa) 아미노산 1번 위치에 Q, D, L, E, S, 또는 I, 보다 바람직하게는 L, E, S 또는 I, 보다 더 바람직하게는 L 또는 E;
(bb) 아미노산 2번 위치에 S, A, Y, I, P 또는 T, 보다 바람직하게는 A, Y, I, P 또는 T, 보다 더 바람직하게는 P 또는 T;
(cc) 아미노산 3번 위치에 Q, V, T 또는 I, 보다 바람직하게는 V, T 또는 I, 보다 더 바람직하게는 V 또는 T;
(dd) 아미노산 4번 위치에 V, L, I 또는 M, 보다 바람직하게는 V 또는 L;
(ee) 아미노산 7번 위치에 S, E 또는 P, 보다 바람직하게는 S 또는 E, 보다 더 바람직하게는 S;
(ff) 아미노산 10번 위치에 T 또는 I, 보다 바람직하게는 I;
(gg) 아미노산 11번 위치에 A 또는 V, 보다 바람직하게는 A;
(hh) 아미노산 12번 위치에 S 또는 Y, 보다 바람직하게는 Y;
(ii) 아미노산 14번 위치에 T, S 또는 A, 보다 바람직하게는 T 또는 S, 보다 더 바람직하게는 T;
(jj) 아미노산 18번 위치에 S 또는 R, 보다 바람직하게는 S;
(kk) 아미노산 20번 위치에 T 또는 R, 보다 바람직하게는 R;
(ll) 아미노산 24번 위치에 R 또는 Q, 보다 바람직하게는 Q;
(mm) 아미노산 46번 위치에 H 또는 Q, 보다 바람직하게는 H;
(nn) 아미노산 47번 위치에 K, R 또는 I, 보다 바람직하게는 R 또는 I, 보다 더 바람직하게는 R;
(oo) 아미노산 50번 위치에 R, Q, K, E, T, 또는 M, 보다 바람직하게는 Q, K, E, T 또는 M;
(pp) 아미노산 53번 위치에 K, T, S, N, Q 또는 P, 보다 바람직하게는 T, S, N, Q 또는 P;
(qq) 아미노산 56번 위치에 I 또는 M, 보다 바람직하게는 M;
(rr) 아미노산 57번 위치에 H, S, F 또는 Y, 보다 바람직하게는 H, S 또는 F;
(ss) 아미노산 74번 위치에 I, V 또는 T, 보다 바람직하게는 V, T 또는 R, 보다 더 바람직하게는 T;
(tt) 아미노산 82번 위치에 R, Q 또는 K, 보다 바람직하게는 R 또는 Q, 보다 더 바람직하게는 R;
(uu) 아미노산 91번 위치에 L 또는 F, 보다 바람직하게는 F;
(vv) 아미노산 92번 위치에 G, D, T 또는 A, 보다 바람직하게는 G, D 또는 T, 보다 더 바람직하게는 T;
(xx) 아미노산 94번 위치에 S 또는 N, 보다 바람직하게는 N;
(yy) 아미노산 101번 위치에 F, Y 또는 S, 보다 바람직하게는 Y 또는 S, 보다 더 바람직하게는 S; 및
(zz) 아미노산 103번 위치에 D, F, H, E, L, A, T, V, S, G 또는 I, 보다 바람직하게는 H, E, L, A, T, V, S, G 또는 I, 보다 더 바람직하게는 A 또는 V.
다른 구현예에서, 본 발명의 면역결합제는 2008년 6월 25일자 미국 가출원번호 61/075,692 표제 "면역결합제의 가용성 최적화"에 기술된 1종 이상의 가용성 및/또는 안정성 증강성 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 면역결합제는, 12, 103 및 144번 위치(AHo 번호 지정 관행)으로 이루어진 중쇄 아미노산 위치 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 가용성 강화 돌연변이를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 면역결합제는 하기로 이루어긴 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다: (a) 중쇄 아미노산 위치 12번에 세린(S); (b) 중쇄 아미노산 위치 103번에 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및 (c) 중쇄 아미노산 위치 144번에 세린(S) 또는 트레오닌(T). 다른 구현예에서, 상기 면역결합제는 하기 치환을 포함한다: (a) 중쇄 아미노산 위치 12번에 세린(S); (b) 중쇄 아미노산 위치 103번에 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및 (c) 중쇄 아미노산 위치 144번에 세린(S) 또는 트레오닌(T).
전술한 바와 같이, VL 및 VH 서열의 조합은, 특히 예컨대 전술한 치환기가 존재함에 의해, 동일하거나 또는 근본적으로 동일한 CDR 서열 세트를 가지지만 프레임워크 서열은 상이한 조합은, 링커 서열에 의해 셔플링(shuffle)하여 조합할 수 있다. 조합의 예로는 하기가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다:
서열번호 94
EP43 min
Figure 112011005653678-pct00049
서열번호 95
EP43max
Figure 112011005653678-pct00050
서열번호 96
EP43minmax
Figure 112011005653678-pct00051
서열번호 97
EP43max DHP
Figure 112011005653678-pct00052
서열번호 98
EP43minmaxDHP
Figure 112011005653678-pct00053
서열번호 99
EP43minmax VL: T22K
Figure 112011005653678-pct00054
서열번호 100
EP43minmax: VL: V58F
Figure 112011005653678-pct00055
서열번호 101
EP43minmax VL: D81A
Figure 112011005653678-pct00056
Figure 112011005653678-pct00057
서열번호 102
EP43minmax VL: Q79E
Figure 112011005653678-pct00058
서열번호 103
EP1min
Figure 112011005653678-pct00059
서열번호 104
EP1max
Figure 112011005653678-pct00060
서열번호 105
EP1minmax
Figure 112011005653678-pct00061
서열번호 106
EP6min
Figure 112011005653678-pct00062
Figure 112011005653678-pct00063
서열번호 107
EP6max
Figure 112011005653678-pct00064
서열번호 108
EP6minmax
Figure 112011005653678-pct00065
서열번호 109
EP15min
Figure 112011005653678-pct00066
서열번호 110
EP15max
Figure 112011005653678-pct00067
서열번호 111
EP15minmax
Figure 112011005653678-pct00068
서열번호 112
EP19minmod
Figure 112011005653678-pct00069
서열번호 113
EP19maxmod
Figure 112011005653678-pct00070
서열번호 114
EP34min
Figure 112011005653678-pct00071
서열번호 115
EP34max
Figure 112011005653678-pct00072
Figure 112011005653678-pct00073
서열번호 116
EP35min
Figure 112011005653678-pct00074
서열번호 117
EP35max
Figure 112011005653678-pct00075
서열번호 118
EP35minmax
Figure 112011005653678-pct00076
서열번호 119
EP42min
Figure 112011005653678-pct00077
서열번호 120
EP42max
Figure 112011005653678-pct00078
서열번호 121
EP42minmax
Figure 112011005653678-pct00079
바람직한 구현예에서, 서열은 서열번호 94-121 중 임의의 서열과 적어도 90%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 상동성 및 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 가진다.
항-TNF 항체의 용도
치료학적 용도를 위한, 본 발명의 항-TNF 항체는, 포유류, 바람직하게는 인간에게, 인간에게 볼루스로서 또는 일정 기간 동안 지속적인 주입에 의한 정맥내, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 강내(intrathecal), 경구, 국소 또는 흡입 경로로 투여될 수 있는 형태 등의, 전술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 투약 형태로 투여된다. 또한, 항체는, 국소 뿐만 아니라 전신 치료 효과를 발휘하기 위해, 종양내, 종양 주변에, 병변내 또는 병변 주변 경로에 의해 적절하게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 항체의 적정 투여량은 상기에 정의된 치료할 질병의 타입, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는 질병의 중증도 및 추이, 선행 요법, 환자의 임상 병력과 항체에 대한 반응 및 주치의 판단에 따라 결정될 것이다. 항체는 환자에게 한번 또는 일련의 치료 기간 동안 적절하게 투여된다.
항-TNF 항체는 TNF-매개 질환의 치료에 유용하다. 질환의 유형과 경중도에 따라, 환자에게 투여하기 위한, 예컨대 1회 이상의 개별 투여 또는 지속적인 주입에 의한, 항체의 초기 예상 투여량은, 약 1 μg/kg 내지 약 50 mg/kg (예, 0.1-20 mg/kg)이다. 전형적인 일별 또는 주당 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 약 20 mg/kg 범위일 수 있다. 증상에 따른 수일 또는 그 이상 동안의 반복 투여를 위해, 질병 증상이 원하는 수준으로 억제될 때까지 치료는 반복 실시된다. 그러나, 다른 투약 요법도 사용할 수 있다. 이러한 요법의 경과는 예컨대 방사선촬영에 의한 종양 영상 촬영 등의 통상적인 기법과 분석으로 쉽게 모니터링한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 질환을 예방 또는 치료하는데 있어 항체의 효능은 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 산성 또는 염기성 섬유모세포 성장 인자(FGF)나 간세포 성장 인자(HGF)의 혈관신생 활성을 저해 또는 중화할 수 있는 항체, 조직 인자, 단백질 C 또는 단백질 S(참조: Esmon et al, PCT 특허 공개번호. WO 91/01753, 1991년 2월 21일 공개됨)의 응고 활성들을 저해 또는 중화할 수 있는 항체, HER2 수용체에 결합할 수 있는 항체(참조: Hudziak et al., PCT 특허 공개번호. WO 89/06692, 1989년 7월 27일 공개됨), 또는 예컨대 알킬화제, 엽산 길항제, 핵산 대사의 항-대사산물, 항생제, 피리미딘 유사체, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 푸린 뉴클레오시드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오시드 또는 코르티코스테로이드와 같은 1종 이상의 기존의 치료제 등의, 이러한 목적에 유효한 다른 제제와 조합하거나 또는 연속하여 항체를 투여함으로써, 개선시킬 수 있다. 이러한 다른 제제는 투여되는 조성물에 존재하거나 또는 개별 투여될 수 있다. 또한, 항체는, 방사능 물질의 조사 또는 투여가 수행되거나 수행되지 않든, 방사선 치료와 연속하여 또는 조합하여 적절하게 투여된다.
본 발명의 항체는 친화성 정제 제제로서 사용될 수 있다. 이러한 공정에서, 상기 항체는, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 세파덱스 수지 또는 필터지와 같은 고상에 고정된다. 고정된 항체는 정제할 TNF 단백질(또는 그것의 단편)가 함유된 샘플과 접촉시킨 다음, 샘플에서 고정된 항체에 결합된 TNF를 제외한 모든 물질들을 실질적으로 제거시킬 수 있는 적정 용매로 상기 지지체를 헹군다. 마지막으로, 상기 지지체를, 항체에서 TNF 단백질을 분리시킬 글리신 완충액(pH 5.0)과 같은 다른 적정 용매로 헹군다.
또한, 항-TNF 항체는 TNF 단백질에 대한 진단 분석, 예컨대 특정 세포, 조직 또는 혈청내 이의 발현 검출에 유용할 수 있다. 이러한 진단 방법은 암 진단에 유용할 수 있다.
진단적 이용을 위해, 항체를 검출가능한 모이어티로 표지할 수 있다. 하기 카테고리로 일반적으로 분류될 수 있는 다수의 표지물이 이용가능하다:
(a) 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S 등의 방사성 동위원소. 항체는 예컨대 Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)의 Current Protocol에 기술된 기법을 이용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있으며, 방사성은 신틸레이션 카운팅으로 측정할 수 있다.
(b) 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 덱사스 레드 등의 형광 표지물질을 이용가능하다. 형광 표지물질은 예컨대 전술한 Immunology의 Current Protocol에 기수라된 기법을 이용하여 항체에 접합할 수 있다. 형광은 형광계를 이용하여 정량할 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지물질을 이용할 수 있으며, 미국 특허 제 4,275,149호에 이러한 일부 물질에 대해 논의되어 있다. 예컨대, 효소는, 분광광도측정법으로 측정할 수 있는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있다. 다른 예로, 효소는 기질의 형광 또는 화학 발광을 변형시킬 수 있다. 형광 변화를 정량하는 기법은 상기에 언급되어 있다. 화학 발광 기질은 화학 반응에 의해 전기적으로 여기되기 시작하면, (예로, 발광측정계를 이용하여) 측정가능한 광이 발광되거나 또는 에너지가 형광 어셉터에 제공될 수 있다. 효소 표지물질의 예로는, 루시퍼라제(예, 개똥벌레 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 제 4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 서양고추냉이의 퍼옥시다제(HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아닐라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(예, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥사다제(예, 우리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 있다. 효소를 항체에 접합하는 기법들은 O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)에 기술되어 있다. 효소-기질 조합의 예로는, 예컨대 하기를 포함한다:
(i) 기질로서 수소 퍼옥시다제를 이용하는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 상기 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체(예, 오르소페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB))를 산화함;
(ii) 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 이용하는 알칼리 포스파타제(AP); 및
(iii) 발색성 기질 또는 형광성 기질을 이용하는 베타-D-갈락토시다제(베타-D-Gal)(예, P-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제), 4-메틸움벨리페릴-베타-D-갈락토시다제.
당해 기술 분야의 당업자는 수많은 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 이러한 내용에 대한 일반적인 검토 사항에 대해서는, 미국 특허 제 4,275,149호 및 제 4,318,980호를 참조한다. 때로는, 항체에 표지물질을 간접 접합한다. 당업자는 이를 달성하기 위한 다양한 기법들을 인지하고 있을 것이다. 예를 들어, 항체를 바이오틴과 접합시킬 수 있으며, 전술한 3가지의 다양한 표지물질의 카테고리 중 임의의 것을 아비딘과 접합시키거나 반대로 접합시킬 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하므로, 표지물질은 이러한 간접적인 방식으로 항체에 접합시킬 수 있다. 다른 구현예로, 표지물질을 항체에 간접적으로 접합시키기 위해, 항체를 소형 헵텐(예, 디곡신)에 접합시키고, 전술한 여러가지 타입의 표지물질 중 한가지를 항-헵텐 항체(예, 항-디곡신 항체)에 접합한다. 따라서, 항체에 표지물질을 간접 접촉시키는 것을 달성할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항-TNF 항체는 표지할 필요가 없으며, 이의 존재는 TNF 항체에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 경쟁적인 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침강 분석 등의 임의의 공지된 분석 방법에 이용할 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
경쟁적인 결합 분석은, 표지된 표준물질의, 제한된 양의 항체와의 결합에 대한, 시험 샘플 분석물과의 경쟁력에 의존된다. 시험 샘플내 TNF 단백질의 양은 항체에 결합되기 시작하는 표준물질의 양과 반비례한다. 결합되기 시작하는 표준물질의 양 결정을 용이하게 하기 위해, 일반적으로 항체는 경쟁 전 또는 후에 불용화되어, 항체에 결합된 표준물질과 분석물은, 결합되지 않은 남아있는 표준물질과 분석물로부터 쉽게 분리할 수 있다.
샌드위치 분석법에서는 각각 검출한 단백질의 여러가지 면역원성 부분이나 에피토프에 결합할 수 있는 2종의 항체를 사용한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고형 지지체에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 그 후 제2 항체가 상기 분석물에 결합하여, 불용성의 3성분으로 구성된 복합체가 형성된다. 예로, 미국 특허 제 4,376,110호를 참조한다. 상기 제2 항체는 검출가능한 모이어티로 표지된 항면역글로불린 항체를 이용하여(비간접 샌드위치 분석) 측정하거나, 또는 그 자체를 검출가능한 모이어티(직접 샌드위치 분석)로 표지할 수 있다. 예컨대, 샌드위치 분석의 한가지 유형은 ELISA 분석인데, 이 경우 검출가능한 모이어티는 효소이다.
면역조직화학법을 위해, 종양 샘플은 신선하거나, 냉동되거나 또는 파라핀에 포매하고 예컨대 포르말린과 같은 보존제로 고정할 수 있다.
또한, 항체는 생체내 진단 분석에 사용할 수 있다. 일반적으로, 항체는 방사성 핵종(예, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S)으로 표지하여, 면역신티오그래피를 이용하여 종양의 위치를 확인할 수 있다.
본 발명의 항체는 선결된 함량의 시약과 진단 분석을 수행하기 위한 설명서가 포장된, 키트로 제공할 수 있다. 항체를 효소로 표지하는 경우, 키트에는 효소에 필요한 기질과 조인자(예, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)가 포함될 것이다. 또한, 안정화제, 완충제(예, 차단 완충제 또는 용혈 완충제) 등이 다른 첨가제도 포함할 수 있다. 분석의 민감성을 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중에 농도를 제공하도록, 다양한 시약의 상대적인 양은 광의적으로 변경될 수 있다. 특히, 용해시 적절한 농도를 가진 시약 용액을 제공할 부형제 등의 시약은, 건조 분말로 제공되거나 또는 일반적으로 동결건조될 수 있다.
약학 조제물
본 발명의 일 측면은 TNF-매개 질환의 치료를 위한 항-TNF 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 용어 "약학 제형"은 항체 또는 항체 유도체의 생물 활성이 명백하게 유효하도록 하기 위한 그러한 형태인 조제물로서, 이 조제물에는 제형을 투여받는 개체에게 독성인 추가 성분들은 함유되지 않는다. "약학적으로 허용가능한 부형제(비히클, 첨가제)는 개체 포유류에 활성 성분의 유효량을 제공하도록 알맞게 제공될 수 있는 것이다.
"안정적인" 제형은, 함유된 항체 또는 항체 유도체가 저장시 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 기본적으로 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기법들을 당해 기술 분야에서 이용할 수 있으며, 예컨대 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에 리뷰되어 있다. 안정성은 선정된 기간 동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 바람직하게는, 제형은 실온(약 30℃) 또는 40℃에서 적어도 1달간 안정적이거나 및/또는 약 2-8℃에서는 적어도 1년 또는 적어도 2년간 안정적이다. 또한, 제형은 바람직하게는 제형의 냉동(예, -70℃로) 및 해동 후에도 안정적이다.
항체 또는 항체 유도체가, 색 및/또는 투명성의 육안 검사시 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정시, 분산, 침강 및/또는 변성 징후를 보이지 않는다면, 이는 약학 제형에서 "물리적 안정성을 유지하는 것이다".
주어진 시간에 화학적으로 안정적이어서 단백질이 하기 정의된 바와 같은 생물학적 활성을 여전히 유지하고 있는 것으로 간주된다면, 항체 또는 항체 유도체는 약학 제형내에서 "이의 화학적 안정성을 유지하는 것이다". 화학적 안정성은, 단백질의 화학적으로 변형된 형태를 검출하고 정량하여 평가할 수 있다. 화학적 변형은, 예컨대 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화법/비행시간형 질량 분석기(MALDI/TOF MS)를 이용하여 평가할 수 있는, 크기 변형(예, 클립핑)을 포함할 수 있다. 화학적 변형의 다른 유형으로는, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가할 수 있는 전하 변형(예, 탈아미드화로 인해 형성됨)이 있다.
항체 또는 항체 유도체는, 예컨대 항원 결합 분석에서 결정된 바와 같이 주어진 시간에 항체의 생물학적 활성이 약학 제형이 제조된 시점에 확인된 생물학적 활성과 약 100%(분석의 오차 범위내)이면, 약학 제형내에서 "그것의 생물학적 활성을 유지하는 것이다". 하기에 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 분석도 상세하게 설명되어 있다.
"등장"은, 대상 제형이 본질적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가진 것을 의미한다. 등장 제형은 일반적으로 삼투압이 약 250 - 350 mOsm일 것이다. 등장성은 예컨대 증기압 또는 얼음-동결 타입의 삼투압측정계를 이용하여 측정할 수 있다.
"폴리올"은 복수의 하이드록실기를 가진 물질로, 당(환원 당 및 비환원 당), 당 알코올 및 당 산을 포함한다. 본원에서 바람직한 폴리올은 분자량이 약 600 kD (예, 약 120 내지 약 400 kD의 범위)이다. "환원 당"은 금속 이온을 환원시키거나 단백질에서 라이신과 다른 아미노기와 공유적으로 반응할 수 있는 헤미아세탈기를 포함하는 것이며, "비환원 당"은 환원 당의 이러한 특성이 없는 당이다. 환원 당의 예로는 프럿토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스 및 글루코스이다. 비환원 당은 슈크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스 및 라피노스이다. 당 알코올의 예는 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨 및 글리세롤이다. 당 산과 같이, 당 알코올은 L-글루코네이트 및 이의 금속성 염을 포함한다. 제형이 동결-해동에 안정적인 것이 바람직한 경우에는, 제형내에서 항체를 불안정하게 하는 동결 온도(예, -20℃)에서 결정화되지 않는 폴리올이 바람직하다. 슈크로스 및 트레할로스와 같은 비환원 당이 본원에서 바람직한 폴리올이며, 트레할로스가 탁월한 용액 안정성을 가져 슈크로스 보다 더 바람직하다.
본원에서, "완충액"은 산-염기 접합 구성 요소들의 작용에 의해 pH 변화에 견디는 완충화된 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충액은 약 4.5 내지 약 6.0의 pH를 가지며, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 5.5이며, 가장 바람직하게는 약 5.0의 pH를 가진다. pH를 이러한 범위에서 조절하는 완충액의 예는, 아세테이트(예, 소듐 아세테이트), 숙시네이트(예, 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 히스디틴, 사이트레이트 및 그외 유기산 완충액이 있다. 동결-해동 안정적인 제형이 바람직한 경우, 완충액은 바람직하게는 포스페이트가 아니다.
약학적으로 의미에서, 본 발명에서, 항체 또는 항체 유도체의 "치료학적 유효량"은 항체나 항체 유도체가 치료에 효과적인 장애의 예방 또는 치료에 유효한 양을 지칭한다. "질환/장애"는 항체 또는 항체 유도체를 이용한 치료가 유익한 모든 증상이다. 이러한 것으로는, 포유류를 대상 장애에 걸리게 하는 소인이 되는 병태 증상들을 비롯한, 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다.
"보존제"는 제형내에서 박테리아 작용을 근본적으로 감소시켜, 예컨대 복수-사용 제형의 제조를 가능하게 하기 위해 제형에 포함될 수 있는 성분이다. 가능한 보존제의 예로는, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드(알킬기가 장쇄 화합물인, 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드류의 혼합물) 및 벤즈에토늄 클로라이드가 있다. 다른 유형의 보존제로는 페놀, 부틸알코올, 벤질 알코올과 같은 방향족 알코올, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸이 있다. 본원에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다.
또한, 본 발명은, 1종 이상의 항체 또는 항체 유도체를, 생리학적으로 허용가능한 1종 이상의 담체나 부형제와 함께 포함하는, 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은, 예컨대 물, 완충액(예, 중성으로 완충화된 염수나 포스페이트 완충화된 염수), 에탄올, 미네랄 오일, 식물성 오일, 디메틸설폭사이드, 탄수화물(예, 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 보강제, 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산, 항산화제, EDAT 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 다른 활성 성분도 본원에 제공된 약학 조성물에 (반드시는 아니지만) 포함될 수 있다.
담체는, 화합물의 안정성이나 생체이용성을 조절하기 위한 목적으로, 환자에게 투여하기 전에 항체나 항체 유도체와 조합시킬 수 있는 물질이다. 이러한 제형에 사용하기 위한 담체는 일반적으로 생체적합하며, 또한 생분해성일 수 있다. 담체는, 예컨대 1가 또는 다가 분자들, 예컨대 혈청 알부민(예, 인간 또는 소), 난의 알부민, 펩타이드, 폴리라이신 및 아미노덱스트란 및 폴리아미도아민과 같은 다당류일 수 있다. 또한, 담체는 예컨대 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트, 폴리(락티드-co-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 락텍스, 전분, 셀룰로스 또는 덱스트란을 포함하는, 비드 및 미세결정과 같은 고형 지지체 물질을 포함한다. 담체는 (직접 또는 링커기를 통한) 공유 결합, 비공유성 상호작용 또는 이의 조합을 비롯한 다양한 방식으로 화합물을 가지고 있을 수 있다.
약학 조성물은 예컨대 국소, 경구, 코, 직장 또는 비경구 투여 등의 임의의 적합한 투여 방식으로 제형화할 수 있다. 특정 구현예에서, 경구 사용에 적합한 형태가 바람직하다. 이러한 형태로는, 예컨대 환제, 정제, 트로키제, 로젠제, 수계 또는 오일성 현탁제, 분산성 산제 또는 과립제, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐제 또는 시럽제나 엘리시르제를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본원에 제공되는 조성물은 동결건조물로서 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 비경구는 피하, 진피내, 혈관내(예, 정맥내), 근육내, 척수에, 두개내, 강내 및 복막내 주사, 뿐만 아니라 임의의 유사한 주사 또는 주입 기법을 포함한다.
경구 용도의 조성물은 약학 조성물의 제조를 위해 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 호의적이고 맛이 좋은 조제물을 제공하기 위해 감미제, 향료, 착색제 및 보존제와 같은 한가지 이상의 물질을 포함할 수 있다. 정제는 활성성분을 정제 제조에 적합한 생리학적으로 허용가능한 부형제와 혼합물 형태로 포함한다. 이러한 부형제로는, 예컨대 무활성 희석제(예, 칼슘 카르보네이트, 소듐 카르보네이트, 락토스, 칼슘 포스페이트 또는 소듐 포스페이트), 과립제 및 붕해제(예, 옥수수 전분 또는 알긴산), 결합제(예, 전분, 젤라틴 또는 아카시아) 및 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크)가 있다. 정제는 위장관에서의 분해와 흡수를 지연시켜, 장기간 동안 지속적인 작용을 제공하기 위해, 공지된 기법으로 코팅하거나, 코팅하지 않을 수 있다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 사용할 수 있다.
또한, 경구 용도의 제형은 활성 물질이 무활성 고체 희석제(예, 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린)와 혼합되어 안에 존재하는 경질 젤라틴 캡슐제로서, 또는 활성 성분이 물이나 오일 매질(예, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일)과 혼합되어 안에 존재하는 연질 젤라틴 캡슐제로 제시될 수 있다. 수계 현탁제는 수계 현탁제의 제조에 적합한 부형제와 혼합물 형태로 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 이러한 부형제로는 현탁제(예, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아검); 및 분산제 또는 습윤제(예, 천연적으로 생겨나는 포스파티드, 예컨대 렉시틴, 알킬렌 산화무라과 지방산의 축합 산물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 에틸렌 산화물과 장쇄 지방족 알코올의 축합 산물, 예컨데 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 산물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트, 또는 에틸렌 산화물과 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 산물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트)를 포함한다. 또한, 수계 현탁제는 1종 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 1종 이상의 착색제, 1종 이상의 향료, 및 1종 이상의 감미료, 예컨대 슈크로스 또는 사카린을 포함할 수 있다. 시럽제나 엘리시르제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 슈크로스와 같은 감미료와 함께 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 1종 이상의 연화제, 보존제, 향료 및/또는 착색제를 포함할 수 있다.
오일 현탁제는 식물성 오일(예, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일) 또는 액체 파라핀과 같은 미네랄 오일 중에 활성 성분을 현탁하여 제형화할 수 있다. 상기 오일 현탁제는, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 증점제를 포함할 수 있다. 전술한 물질 등의 감미료, 및/또는 향료를 첨가하여, 맛이 좋은 경구 조제물을 제공할 수 있다. 이러한 현탁제에는 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가하여, 보존시킬 수 있다.
물을 첨가하여 수계 현탁제를 제조하기 적합한 분산성 산제 및 과립제는 분산제, 습윤제, 현탁제 또는 1종 이상의 보존제와 혼합된 형태로 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제, 습윤제 및 현탁제는 상기에 언급된 물질로 예시된다. 추가적인 부형제, 예컨대, 감미료, 향료 및 착색제도 제공될 수 있다.
또한, 약학 조성물은 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 오일상은 식물성 오일(예, 올리브 오일 또는 아라키스 오일), 미네랄 오일(예, 액체 파라핀) 또는 그 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제로는 천연적으로 형성되는 검(예, 아카시아검 또는 트라가칸트 검), 천연적으로 형성되는 포스파티드(예, 소이 빈, 렉시틴 및 지방산과 헥시톨로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르), 무수물(예, 소르비탄 모노올레이트), 및 지방산과 헥시톨 유래 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 산물(예, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트)이 있다. 또한, 에멀젼은 1종 이상의 감미료 및/또는 향료를 포함할 수 있다.
약학 조성물은, 사용되는 비히클과 농도에 따라, 모듈레이터가 비히클 중에 현탁되거나 용해된, 멸균 주사용 수성 또는 오일성 현탁제으로서 조제할 수 있다. 이러한 조성물은 전술한 물질 등의 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 이용하여 당해 기술 분야에 공지된 바에 따라 제형화할 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매로는, 물, 1,3-부탄디올, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이 있다. 또한, 무균 비휘발성 오일을 용매나 현탁 매질로서 사용할 수 있다. 이러한 목적으로, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드를 비롯한, 임의의 블렌드 비휘발성 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산을 주사용 조성물 제조에 사용할 수 있으며, 국소 마취제, 보존제 및/또는 완충화제와 같은 보강제를 비히클에 용해시킬 수 있다.
약학 조성물은 서방형 제형으로 (즉, 투여 후 모듈레이터의 방출을 느리게 하는 캡슐 등의 제형) 제형화될 수 있다. 이러한 제형은, 잘 공지된 기법을 이용하여 일반적으로 제조할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해, 또는 원하는 타겟 부위에 이식에 의해 투여할 수 있다. 이러한 제형에 사용하기 위한 담체는 생체적합한 것이며 또한 생분해성일 수 있으며; 바람직하게는 제형은 모듈레이터를 상대적으로 일정한 수준으로 방출한다. 서방성 제형내에 포함되는 항체 또는 항체 유도체의 양은, 예컨대 이식 부위, 방출 속도 및 예상 기간, 및 치료 또는 예방할 질환/장애의 특성에 따라 결정된다.
본원에 제공되는 항체 또는 항체 유도체는 TNF에 검출가능하게 결합하여 TNF-매개 질환/장애를 예방 또는 저해하는데 충분한 농도를 체액(예, 혈액, 혈장, 혈청, CSF, 활액, 림프액, 세포성 세포간 체액, 눈물 또는 뇨)에서 달성하는 양으로 일반적으로 투여된다. 투여량은 본원에 기술된 환자에게 식별가능한 이로움이 생기는 경우 유효한 것으로 간주된다. 바람직한 전신 투여량은 1일 당 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 140 mg(1일 당 환자 1인 당 약 0.5 mg 내지 약 7 g)의 범위이며, 경구 투여량은 일반적으로 정맥내 투여량 보다 약 5-20배 높다. 단일 투여량을 형성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 항체 또는 항체 유도체의 양은 치료받는 숙주와 특정 투여 방식에 따라 변경될 것이다. 투여량 단위 형태는 활성 성분을 약 1 mg 내지 약 500 mg으로 일반적으로 포함할 것이다.
약학 조성물은 TNFα에 대한 항체 또는 항체 유도체에 반응을 보이는 증상을 치료하기 위해 패키징될 수 있다. 패키징된 약학 조성물은, 본원에 기술된 1종 이상의 항체 또는 항체 유도체가 유효량으로 포함된 용기와, 환자에게 투여한 후 하나의 항체나 항체 유도체에 반응하는 질환/장애를 치료하기 위해 포함된 조성물의 사용법이 표시된 설명서(예, 라벨링)를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 또한 화학적으로 변형시킬 수 있다. 바람직한 변형기는, 폴리머, 예컨대 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 폴리머 또는 분지형 또는 비분지형의 다당류이다. 이러한 작용기는 생체내 항체 반감기를 증가시킬 수 있다. 합성 폴리머의 특정 예로는, 선택적으로 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 그 유도체를 포함한다. 구체적인 천연 폴리머로는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 그 유도체가 있다. 폴리머의 크기는 원하는 대로 변경할 수 있지만 평균 분자량 500 Da 내지 50000 Da의 범위일 것이다. 항체가 조직에 침투되도록 고안된 국소 적용을 위해, 바람직한 폴리머 분자량은 약 5000 Da이다. 폴리머 분자는, 항체에, 특히 WO 0194585에 기술된 바와 같이 공유 결합된 힌지 펩타이드를 통해 Fab 단편 중쇄의 C-말단에 부착될 수 있다. PEG 모이어티의 부착에 대해서는, "폴리(에틸렌글리콜) 화학, 생물기법 및 생의학적 적용", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York 및 "생의과학에 대한 생물접합 단백질 커플링 기법", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York을 참조한다.
전술한 대상 항체 또는 항체 유도체를 제조한 후, 이를 포함하는 약학 조성물을 제조한다. 제형화할 항체는 동결건조하기 전에는 제형화하지 않으며, 본원의 대상 제형은 수계 제형이다. 바람직하게는, 제형내 항체 또는 항체 유도체는 scFv와 같은 항체 단편이다. 제형내에 존재되는 항체의 치료학적 유효량은, 예컨대 바람직한 투여량 체적과 투여 방식(들)을 고려하여 결정된다. 제형내 항체 농도의 예는 0.1 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 바람직하게는 약 0.5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 2 mg/ml 내지 약 10 mg/ml이다.
pH 완충화된 용액내에 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 수계 제형을 제조한다. 본 발명의 완충액은 pH가 약 4.5 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 5.5, 가장 바람직하게는 약 5.0이다. 이러한 범위로 pH를 조절하는 완충액의 예로는 아세테이트(예, 소듐 아세테이트), 숙시네이트(예, 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 그외 유기산 완충액이 있다. 완충액의 농도는, 예컨대 완충액 및 제형의 바람직한 등장성에 따라 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 30 mM이다. 바람직한 완충액은 소듐 아세테이트이다(약 10 mM)(pH 5.0).
삼투압제(tonicifier)로서 작용하며 항체를 안정화시킬 수 있는 폴리올이 제형에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 항체 또는 항체 유도체를 침전시키거나 및/또는 낮은 pH에서 산화시킬 수 있기 때문에, 제형에는 소듐 클로라이드와 같은 염은 삼투압을 형성하는 함량으로 포함되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 폴리올은 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 비환원 당이다. 폴리올은 제형의 바람직한 등장성 측면에서 변경될 수 있는 양으로 제형에 첨가된다. 바람직하게는, 수계 제형은 등장성이며, 이 경우 제형내 적절한 폴리올 농도는 예컨대 약 1% 내지 약 15% w/v, 바람직하게는 약 2% 내지 약 10% w/v 범위이다. 그러나, 고삼투압성 또는 저삼투압성 제형도 적합할 수 있다. 또한, 첨가되는 폴리올의 양은 폴리올의 분자량에 따라 변경될 수 있다. 예컨대, 단당류(예, 만니톨)를 이당류(예, 트레할로스)에 비해 소량으로 첨가할 수 있다.
또한, 항체 또는 항체 유도체 제형에 계면활성제가 첨가된다. 계면활성제의 예로는, 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트(예, 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머(예, 폴록사머 188)가 있다. 첨가되는 계면활성제의 양은, 제형화된 항체/항체 유도체의 응집을 줄이거나, 및/또는 제형내 미립자의 형성을 최소화하거나, 및/또는 흡착을 감소시키는 양이다. 예컨대, 계면활성제는 제형내에 약 0.001% 내지 약 0.5%, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 0.2% 및 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.1%로 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 제형은 상기 나타낸 제제(즉, 항체 또는 항체 유도체, 완충액, 폴리올 및 계면활성제)를 포함하며, 벤질 알코올, 페놀, m-트레졸, 클로로푸탄올 및 벤즈에토늄 Cl과 같은 1종 이상의 보존제가 본질적으로 없다. 다른 구현예에서, 보존제는, 특히 다중 투여량 제형인 제형에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 가장 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1%의 범위일 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006)에 기재된 것과 같은 1종 이상의 다른 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 제형에 포함시킬 수 있지만, 단 이는 상기 제형의 바람직한 특징에 부정적으로 작용하지 않는 것이다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여체에게 무독성이며, 부가적인 완충제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌 등의 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제; 금속 복합체(예, Zn-단백질 복합체); 폴리에스테르와 같은 생분해성 폴리머; 및/또는 소듐과 같은 염을 형성하는 반대이온을 포함한다.
생체내 투여용으로 사용될 제형은 무균이어야 한다. 이는, 제형의 제조 전 또는 후에 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
제형은, 항체를 이용한 치료가 필요한 포유류, 바람직하게는 인간에게, 공지된 방법에 따라, 예컨대 볼루스로서 또는 일정 기간 동안 지속적인 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로로 투여된다. 바람직한 구현예에서, 제형은 정맥내 투여에 의해 포유류에 투여된다. 이를 위해, 제형은 예컨대 시린지나 IV 선을 통해 주입될 수 있다.
항체의 적정 투여량("치료학적 유효량")은 예컨대 치료할 증상, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되든 간에 증상의 중증도 및 추이, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 환자 반응성, 사용되는 항체의 유형 및 주치의의 판단에 따라 정해질 것이다. 항체 또는 항체 유도체는 환자에게 한번 또는 일련의 치료 기간 동안 적절하게 투여되며, 진단 후에 임의의 시긴에 환자에게 투여될 수 있다. 항체 또는 항체 유도체는, 단독 치료제로 또는 대상 병태를 치료하는데 유용한 다른 약물이나 치료법과 조합하여 투여될 수 있다.
포괄적인 내용으로서, 투여되는 항체 또는 항체 유도체의 치료학적 유효량은 1회 이상 환자 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 50 mg/kg의 범위일 것이며, 사용되는 항체의 전형적인 범위는 약 0.3 내지 약 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg이며, 예컨대 매일 투여된다. 그러나, 다른 투약 요법도 사용할 수 있다. 이러한 치료법의 경과는 통상적인 기법으로 쉽게 모니터링한다.
제조 물품
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물, 바람직하게는 수계 약학 제형을 보유하는 용기를 포함하는 제조 물품이 제공되며, 선택적으로 사용 설명서가 구비된다. 적합한 용기로는, 예컨대 병, 바이얼 및 시린지가 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 제조될 수 있다. 용기의 예는 3-20 cc의 1회 사용 유리 바이얼이다. 다른 예로, 다중 투약 제형의 경우, 용기는 3-100 cc의 유리 바이얼일 수 있다. 용기에는 제형이 수용되며, 라벨이 용기 상에 부착되거나 조합되며, 용기에 사용 지침이 표시될 수 있다. 제조 물품에는, 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 포장 인서트와 사용 설명서가 포함되며, 상업적인 및 사용자 견지에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함될 수 있다.
예시
본원은 하기 실시예를 통해 추가적으로 설명되지만 더욱 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전체에 인용된 모든 도면 및 모든 참조 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
실시예 전반에 걸쳐, 달리 언급된 경우를 제외하고는 하기 재료 및 방법들을 사용하였다.
일반 재료 및 방법
일반적으로, 본 발명의 실시는, 언급된 경우를 제외하고는, 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기법, 면역학(특히, 항체 기법)의 통상적인 기법, 및 표준적인 폴리펩타이드 제조 기법을 채택한다. 예로, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S ., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); and Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992)을 참조한다.
열안정성 측정
다양한 단쇄들에 대해 FTIR-ATR(Attenuated total reflectance Fourier transform IR) 스펙트럼을 수득하였고, Tensor Bruker에서 FT-IR Bio-ATR 셸을 이용하여 분자를 추적하였다. 분자를 최대 3 mg/ml로 농축시키고, PBS(pH 6.5)에서 4℃에서 밤새 투석한 다음, 완충액 통과 분획(flow through)을 블랭크로서 수집하였다. 분자를 다양한 온도 범위에서 5℃ 차이로(25℃에서 95℃) 열에 노출시켜, 변성 프로파일을 수득하였다. 모든 스펙트럼 조작은 OPUS 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 주요 완충액 백그라운드와 일시적인 대기(CO2 및 H2O) 백그라운드를 단백질 스펙트럼에서 제하였다. 그런 후, 수득되는 단백질 스펙트럼을 베이스라인으로 보정하고, 단백질 아미드 I 스펙트럼을 예상한 영역내 가장 넓은 분석가능한 피크의 폭으로 측정하였다. 아미드 I 밴드 스펙트럼에 대한 2번째 유도체 스펙트럼을 3차 다항식 함수와 미분가능한 함수를 이용하여 구하였다. 단백질 구조 변화를 초기 곡선-피트 계산을 위한 선형 보정 곡선을 이용하여 아미드 I 제2 유도체 분석에 의해 예측하여, 3개의 낮은 값에 대한 0% 변성과 3개의 높은 값에 대한 100% 변성을 추측하였다. 변성 프로파일을 이용하여, 볼츠만 시그모이드 모델을 적용하는 각 변이에 대한 열 언폴딩 전이(TM)의 중간값을 추정하였다.
가용성 측정
암모늄 설페이트의 존재 중의 단백질 응집 및 침전을 증가시킨 후, 다양한 scFv 분자의 상대적인 가용성을 측정하였다. 암모늄 설페이트를 단백질 수용액에 첨가하여, 최종 혼합물 염-단백질 중에서 포화율을 5%씩 증가시켰다. 동적 범위에서의 침전을 실험을 통해 측정하였고, 최종 혼합물의 포화 간격을 상기 범위에서 2.5% 포화 간격으로 줄였다. 암모늄 설페이트를 첨가한 후, 샘플을 조심스럽게 혼합하고, 6000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 각각의 암모늄 설페이트 포화율에서, 상층액에 잔류하는 단백질을 회수하였다. 가용성 곡선은 NanoDropTM 1000 분광광도계를 이용하여 상층액 중의 단백질 농도를 측정함으로써 구하였다. 상층액내 잔류하는 가용성 단백질 측정값을 정규화하고, 이를 이용하여 볼츠만 시그모이드 모델을 적용하는 각 변이에 대한 상대적인 가용성의 중간값을 예측하였다.
단기 안정성 테스트
단백질을 40℃에서 2주간 인큐베이션한 후, 가용성 응집물과 분해 산물에 대해 분석하였다. 10 mg/ml 농도의 단백질을 밤새 4℃에서 다양한 pH 범위(3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.5)의 PBS에서 투석하였다. 표준 완충액 PBS(pH 6.5) 중의 동일 농도의 대조군 단백질은 2주간 -80℃에 보관하였다. SDS-PAGE에 의한 분해 밴드 확인은 t=0 및 t=14일에 수행하였고, 가용성 응집물은 SEC-HPLC로 분석하였다. 40℃에서 2주 후의 잔류 활성 측정은 Biacore를 이용하여 수행하였다.
효능 분석
항-TNFα 결합제의 중화 활성을 L929 TNFα-매개 세포독성 분석으로 평가하였다. 액티노마이신 처리한 마우스 L929 섬유모세포의 독성을 재조합 인간 TNF(hTNF)로 유도하였다. hTNF-유도성 최대 세포독성의 90%는 TNF 농도 1000 pg/ml에서 나타나는 것으로 측정되었다. L929 세포 모두 페놀레드, L-글루타민 및 우태아 혈청(10% v/v)이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 항TNFα 결합제의 중화 활성은 페놀레드와 5% 우태아 혈청이 첨가되지 않은 RPMI 1640 배지에서 평가하였다. 길항성 효과가 최고 저해율에 1/2(EC50%)가 되는 농도를 결정하기 위해, 1000 pg/ml hTNF의 존재 하에 L929 세포에 항-TNF 결합제를 다양한 농도(0 - 374 ng/mL)로 첨가하였다. 용량 반응 곡선을 가변성 슬로프를 채택하고 있는 비선형 시그모이드 회귀로 조정하고, EC50을 계산하였다.
항- TNF scFv 의 Biacore 결합 분석
pH 5 및 pH 7.4에서의 결합 친화성을 측정하기 위해(데이타 미기재), BIAcore™-T100을 이용한 플라스몬 공명 측정법을 NTA 센서 칩과 His-테그 달린 TNF (ESBATech에서 제조)를 이용하여 실시하였다. 상기 NTA 센서 칩의 표면은, 히스티딘 테그가 달린 분자를 Ni2+NTA 킬레이션으로 포획하기 위한 니트릴로트리아세트산(NTA)을 미리 고정시킨 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스로 구성된다. 인간 TNFα N-his 삼량체(5 nM)를 이의 N-말단의 his-테그를 통해 상기 니켈에 포착시키고, ESBA105(분석물)을 3배수 희석 단계로 30 nM에서 0.014 nM 범위의 여러가지 농도로 주입하였다. 재생 단계에서, 니켈, 리간드 및 분석물에 의해 형성된 복합체를 세정하였다. 이로써, 여러가지 샘플에 대해 동일한 재생 조건을 사용할 수 있다. 반응 신호는 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법에 의해 발생시키고, 공명 단위(RU)로 측정하였다. 모든 측정은 25℃에서 수행하였다. 인-라인 기준 셸로 보정하고 완충액 샘플을 제한 후, 각 항-TNF scFv 샘 플에 대해 센소그램을 작성하였다. 겉보기 해리 속도 상수(kd), 겉보기 조합 속도 상수(ka) 및 겉보기 해리 평형 상수(KD)를 1:1 랭뮤어 결합 모델을 이용하여 Biacore T100 등식 소프트웨어 버전 1.1로 계산하였다.
실시예 1: 단일클론 토끼 항- TNF 항체의 CDR 이식 및 기능적 인간화
토끼 CDR 의 이식
비-인간 공여체 항체와 가장 높은 서열 상동성을 공유하는 인간 항체 어셉터 프레임워크를 사용하는 전통적인 인간화 방법과는 다르게, 토끼 CDR을 프레임워크 FW1.4 (서열번호 1 및 2, 이는 (GGGGS)4 링커에 의해 연결됨)에 이식하여 Min-이식체를 제조하거나, 또는 "토끼화된" 프레임워크 rFW1.4 (서열번호 92) 또는 이의 변이체 rFW1.4(v2) (서열번호 93)에 이식하여 Max-이식체를 제조하였다. 프레임워크 둘다 바람직한 기능적 특성(가용성과 안정성), 매우 다양한 토끼 CDR을 수용하는 구조 적합성 및 토끼의 가변성 도메인 컨센서스 서열에 적절한 상동성을 우선시하여 선택하였다. 프레임워크 rFW1.4는 거의 모든 토끼 CDR 세트에 대한 유니버셜 어셉터 프레임워크로서 제공하기 위한 목적으로 추가로 조작된 FW1.4의 유도체이다. 안정적이고 가용적인 프레임워크 서열 FW1.4는 토끼 항체에 대해 높은 상동성을 보이지만, 이용가능한 가장 상동성이 높은 서열은 아니다.
결합에 관여할 가능성이 있는 잔기의 동정
각각의 토끼 가변성 도메인서열에 대해, 가장 근접한 토끼 생식계 대응물을 동정하였다. 가장 근접한 생식계를 확립할 수 없다면, 서열을 서브그룹의 컨센서스나 또는 유사성%이 높은 토끼 서열의 컨센서스와 비교하였다. 드문 프레임워크 잔기들은 체세포의 과다 돌연변이화로 인한 결과일 가능성으로 간주하였고, 따라서 항원 결합에 역할을 하는 것으로 보았다. 이에, 이러한 잔기들은 어셉터 프레임워크 rFW1.4 또는 rFW1.4(v2)에 이식하여 Max-이식체를 제조하기 위한 것으로 고려하였다. 구체적으로, 직접적인 항원 접촉이나 또는 VL 및 VH의 성질에 영향을 미치는 것과 관련될 가능성이 있는 잔기를 이식하였다. CDR 구조에 영향을 미치는 것으로 기술된 추가적인 잔기들도 필요에 따라 치환하였다. CDR을 FWl.4 (Min-이식체) 상에 이식한 경우, 프레임워크 치환은 이루어지지 않았다. 본원에 기술된 바와 같은 Max-이식체를 수득하기 위해 이식되는 프레임워크 위치의 예는, rFWl.4, rFW1.4(v2)의 프레임워크 영역과 본원에 제공되는 대상 scFv 서열을 정렬함으로써 동정할 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 웹툴을 예컨대 이러한 목적으로 사용할 수 있다(예, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html에서 2009년 6월 23일에 이용가능한 ClustalW, 또는 http://bioinfo. genotoul.fr/multalin에서 2009년 6월 23일에 이용가능한 MultiAlin). rFW1.4 및 rFW1.4(v2)가 동일한 잔기를 포함하고 있으며, 대상 scFv가 다른 잔기를 나타내는, 프레임워크의 모든 위치가 Max-이식체를 수득하기 위해 이식되는 프레임워크 위치이다.
도메인 셔플링
Min-이식체의 가변성 경쇄를 Max-이식체의 가변성 중쇄와 조합하여, 생물물리학적 특성(가용성과 안정성) 및 활성 측면에서의 최적의 조합을 동정하였다.
scFv 의 클로닝 및 발현
본원에 기술되고 특정화된 scFv를 다음과 같이 제조하였다. 인간화된 VL 서열과 인간화된 VH 서열(서열번호 75를 제외한, 51-88)을 서열번호 72의 링커를 통해 연결하여, 하기 배치의 scFv를 수득하였다: NH2-VL-링커-VH-COOH (서열번호 94-121 참조). 다수의 경우에서, 다양한 scFv를 코딩하는 DNA 서열은 서비스 제공사인 Entelechon GmbH (www.entelechon.com)에서 새롭게 합성하였다. 제조되는 대상 DNA를 박테리아 발현 벡터인 pGMP002에 scFv DNA 서열의 5' 및 3' 말단에 각각 도입된 NcoI 및 HindIII 제한효소 부위를 이용하여 클로닝하였다. VL 도메인과 VH 도메인 사이의 DNA 서열에는 BamHI 제한효소 부위가 위치된다. 일부 경우에는, scFv를 코딩하는 DNA는 신규 합성하지 않고, 도메인 셔플링에 의해 scFv 발현 구조체를 클로닝하였다. 즉, VL 도메인은 잘라 NcoI 및 BamHI 제한효소 부위에 도입하고. VH 도메인을 BamHI 및 HindIII 제한효소 부위에 도입하였다. 다른 경우에는, PCR 방법이 조합된 당해 기술을 이용하여 VH 및/또는 VL 도메인에 점 돌연변이를 도입하였다. GMP002의 클로닝은 WO 2008006235의 실시예 1에 설명되어 있다. 2008006235의 실시예 1에 기술된 바와 같이 ESBA105와 유사하게 scFv를 제조하였다.
실시예 2: 토끼 CDR 공여체 항체의 프로파일링 및 선별
TNF 저해 활성을 가진 토끼 항체("RabMab")를 선별하기 위해 수행되는 일반적인 실험 과정은 다음과 같다: 가용성이 높은 TNF 면역결합제의 제조에서 CDR의 공여체 항체로서 토끼 항체를 사용하였다. 토끼를 TNFα로 면역화한 후 비장 절제하였다. 하이브리도마를 제조하기 위해 토끼로부터 비장세포를 분리하였다. 총 44개의 하이브리도마를 분리하고, 이들 하이브리도마의 상층액에 대해 결합 친환성, 생물학적 효능 및 결합 특이성을 분석하였다.
도 1은 44개의 항-TNF RabMab 하이브리도마 상층액의 생체내 상대적인 TNFα 중화력을 나타낸 것이다. 중화는 배양한 마우스 L929 섬유모세포에서 TNFα의 세포독성의 저해를 측정함으로써 평가하였다. 상층액은 L929 분석에서 다양한 효능을 보인다. EC50 수치(50%의 저해를 달성하는 유효 농도)를 1차(파란색 막대) 및 2차(붉은색 막대) 스크리닝에서 결정하였고, 각 분석에서 최상의 수행 결과에 대해 정규화하였다. 또한 TNF 결합 친화성은 각 RabMab에 대한 BIACore 분석으로 측정하였다(녹색 막대).
또한, 각 하이브리도마에 의해 코딩된 RabMab의 서열을 분석하고, 에피토프 클러스터 예측을 기반으로 한 계통발생적 분석을 수행하였다. CDR 이식의 공여체 항체로서, 계통발생학적 패밀리 중에서, 결합 활성이 높고 중화 활성이 우수한, 대표적인 4가지 Rabmab(EPI-6, EPI-19, EPI-34, 및 EPI-43)를 선별하였다. 또한, 분비성 ELISA에서의 활성이 우수한 다른 4종의 Rabmab(EPI-1, EPI- 15, EP-35 및 EP-42)도 CDR 이식용으로 선별하였다(도 2 참조).
실시예 3: 토끼 공여체 항체로의 CDR 이식 및 기능적 인간화
비-인간 공여체 항체와 가장 높은 서열 상동성을 공유하는 인간 항체 어셉터 프레임워크를 사용하는 전통적인 인간화 방법과는 다르게, 토끼 CDR을 품질 관리 분석을 이용하여 바람직한 기능적 특성(가용성 및 안정성)을 이유로 미리 선별한 인가 프레임워크 (FW 1.4)에 이식하였다. 안정적이고 가용성인 프레임워크 서열은 RabMab와 높은 상동성을 보였지만, 선택된 어셉터 항체가 이용가능한 상동성이 가장 높은 서열은 아니다.
각 RabMab에 대해 다수의 CDR 이식체를 제작하였다. 본원에서 사용되는 용어 "Min-이식체" 또는 "min"은 토끼의 가변 도메인으로부터 유래된 토끼 CDR을 천연적으로 형성되는 인간 어셉터 프레임워크 (FW 1.4, 서열번호 172)에 이식함으로써 제작한, 인간화된 가변 도메인을 지칭한다. 상기 프레임워크 영역내에는 변화가 없다. 프레임워크 자체는 바람직한 기능성 특징(가용성 및 안정성)으로 미리 선별하였다. 본원에서 사용되는 용어 "Max-이식체" 또는 "max"는, 토끼의 가변 도메인으로부터 유래된 토끼 CDR을 "토끼화된" 인간 어셉터 프레임워크 "RabTor" (rFW1.4, 서열번호 173) 또는 rFW1.4(v2) (서열번호 174)로 지칭되는 그것의 유도체에 이식함으로써 제작한, 인간화된 가변 도메인을 지칭한다. 상기 "RabTor" 프레임워크는, 이의 추정가능한 원조 서열에서 상이한 위치, 예컨대 체세포의 과다 돌연변이화가 이루어지는 동안에 변형되어 항원 결합에 기여할 가능성이 있는, 위치가 아닌 다른 위치에 공여체 프레임워크 잔기들을 이식할 필요없이, 거의 모든 토끼 CDR 세트를 수용하는 보편적으로 이용가능한 프레임워크를 제작하기 위한 목적으로, 토끼 가변성 도메인 구조와 안정성에 일반적으로 참여하는 프레임워크 위치에 보존된 (다른 경우에는, 다른 종들에서는 다소 가변적인) 토끼 잔기들를 삽입하여 제조하였다. 상기 추정가능한 원조 서열은 가장 가까운 토끼 생식계 대응물로 한정되며, 가장 가까운 생식계 대응물을 확립할 수 없는 경우에는, 토끼 서브그룹의 컨센서스 또는 유사성%이 높은 토끼 서열의 컨센서스로 한정된다. "Min-Max" 또는 "minmax"는 "Min-이식체"의 가변성 경쇄와 "Max-이식체"의 가변성 중쇄의 조합으로 구성된 인간화된 가변성 도메인을 지칭하며, "Max-Min" 또는 "maxmin"는 "Maxn-이식체"의 가변성 경쇄와 "Min-이식체"의 가변성 중쇄의 조합으로 구성된 인간화된 가변성 도메인을 지칭한다.
표 2는 8가지의 다양한 단일클론 토끼 항체 또는 rabmab (EPl, EP6, EP15, EP19, EP34, EP35, EP42 및 EP43)로부터 기원한, 인간화된 단쇄 항체의 구체적인 특징 데이타를 요약 개시하고 있다. 이른바 "min" 이식체(예, EP1min)는 토끼 공여체 CDR만 이식된 구조체이며, 이른바 "max" 이식체는 공여체 프레임워크내 CDR 뿐만 아니라 일부 아미노산 위치도 이식된 구조체이다. 부가적으로, 표 2는 2가지의 His-테그 달린 단쇄 항체(EP34min_C-His 및 EP19max_C-His)와 WO 2006/131013에 언급된 비교 단쇄 항체인 ESBA105에 대한 데이타도 나타낸다. 3번째 열의 "L929"는 L929 분석에서 결정된 여러가지 단쇄 항체의 효능을 ESBA105의 효능과 비교하여 상대적으로 나타낸 것이다. kon, koff 및 KD의 값은 각각 단위 M-1S-1, s-1 및 M으로 나타낸다. 7번째 열은 FT-IR로 결정된 열에 의해 유도되는 언폴딩의 중간값을 나타낸다. 마지막 열은, 리폴딩 방법을 수행한 후 가용화한 봉입체로부터 수득되는 바르게 폴딩된 단백질의 상대적인 수율을 나타낸 것이다.
표 2에 나타낸 BIACore 데이타의 일부는 도 3으로 제시한다: 인간 TNFα에 대한 ESBA105 (도 3a), EP43max (도 3b) 및 EP34max (도 3c) 결합의 결합 동력학을 나타낸다. 세포 효능 분석의 예는 도 4에 나타내었는데, 도 4는 L929 분석에서 ESBA105 (●)를 EP43max (□)와 비교한 것이다. 시판되는 항체인 infliximab 및 adalimumab에 대해 EP34max를 비교한 세포 효능 분석의 예는, 도 9 및 10에 나타낸다.
표 2: 4가지 토끼 단일클론(EP6, EP19, EP34 및 EP43) 및 이의 CDR 이식된 변이체에 대한 구체적인 특정화 데이타 요약
* ESBA105(WO 06/l31013)의 성능에 상대적인, 중량 단위[ng/ml]로 비교한 L929 [EC50-E105 / EC50-X]
**(mg/L 리폴딩 용액);
*** 검출 안됨
Figure 112011005653678-pct00080

실시예 4: 강력한 TNF α 결합제인 EP43max 의 가용성 및 안정성 최적화
EP43max를 이것의 강력한 TNF 결합 활성을 기초로 추가적으로 최적화하기 위한 것으로 선택하였다. 이 면역결합제의 생물물리학적 특정화를 통해, 열 언폴딩 분석(FTIR)에서 높은 변성 중앙값(Tm > 70℃)을 가지는 것으로 확인되었다(도 5 참조). 그럼에도 불구하고, 열 언폴딩에서의 넓은 전이 상을 좁게 하기 위해 EP43max에 대한 가용성 최적화를 수행하였다. 천연 EP43max의 가용성을 개선시키기 위해, VH 체인내 3곳의 잔기 위치 12, 103 또는 144번을 친수성이 더 높은 아미노산으로 치환하였다. 이러한 조합은 안정성 또는 결합 활성에 영향을 미치지 않으면서 천연 단백질의 용해도를 증가시키는 것으로 확인되었다. (AHo에 따른 12번: V -> S, AHo에 따른 103번: V -> T, AHo에 따른 144: L -> T)를 도입하여, EP43max의 가변성 중쇄(VH) 영역의 V-C 계면에서 소수성 잔기를 치환하였다. 가용성을 증가시키는 돌연변이 유발 외에도, 9가지의 안정화 돌연변이(VL에서 T1OS, K47R, Y57S, L91F 및 T103V, VH에서 ElQ, E6Q, S7T 및 V103L)도 EP43max에서 확인되었다(표 3 참조). 이들 안정화 잔기들은 ESBATech의 품질 관리(QC) 프레임워크의 기능성 컨센서스 분석으로 동정되었다. VL의 1번 및 3번 위치와 VH의 89번 위치의 안정화 잔기들은 이미 EP43max 분자에 존재하고 있었다. VL 위치 4번에서도 추가적인 안정화 돌연변이(M -> L)이 동정되었지만, 항원 결합에서의 예상되는 역할로 인해 고려 대상에서 제외시켰다.
표 3: EP43max에서의 안정화 돌연변이
Figure 112011005653678-pct00081
1열, 가변성 도메인. 2열, AHo 아미노산 위치. 3열, EP43max의 모체 잔기. 4열, 2열에 나타낸 위치에 대한 바람직한 치환. 5열, 안정화 돌연변이.
실시예 5: 강력한 TNF α 결합제인 EP43max 의 변이체들
표4와 5는 EP43max의 최적화된 3가지 변이체들의 특징 데이타이다. EP43_maxDHP는 가용성이 증강된 EP43max 변이체로서, 전술한 3가지의 가용성 증강 돌연변이(AHo에 따른 12번: V -> S, AHo에 따른 103번: V -> T, AHo에 따른 144: L -> T)를 가지고 있다. "min"과 "max" 이식체들간의 도메인 셔플링에 의해 EP43_maxmin 및 EP43_minmax 변이체들을 제작하였다. 예로, "minmax" 변이체는 경쇄의 최소 이식(CDR만 이식) 및 중쇄의 최대 이식체 버전(즉, 토끼 CDR + 항원 결합에 관여하는 토끼 프레임워크 잔기 이식)으로 구성되고, "maxmin" 변이체는 경쇄의 최대 이식 버전과 중쇄의 최소 이식 버전으로 구성된다.
표 4: EP43max 및 그 변이체의 특성
Figure 112011005653678-pct00082
*L929 [EC50-E105/EC50-X], 중량 단위[ng/ml]로 비교됨
표 5: EP43max 및 그 변이체의 특성
Figure 112011005653678-pct00083
EP43max 및 그의 최적화된 변이체의 열 변성 곡선을 FTIR 분석으로 비교하였다(도 6 및 표 6 참조). EP43minmax는 EP43max 보다 언폴딩 중간값이 더 낮은 것으로 확인되었다.
표 6: FTIR 분석에 의한, EP43max 및 그의 최적화된 변이체의 열 변성 곡선 비교
Figure 112011005653678-pct00084
또한, mimax 변이체는 한-단계 언폴딩 전이를 나타내었는데, 이는, 2개의 도메인이 매우 유사한 온도에서 폴딩되지 않는다는 것을 의미한다. EP43 max (도 7A) 및 이의 EP43minmax 변이체(도 7B)를 열 스트레스 테스트로 더욱 비교하였다. 베타-시트의 함량과 가용성 단백질의 농도를, 승온(50, 60 및 70℃)시키면서 열 농축한 다음 평가하였다. EP43minmax는 중간 온도인 60℃에서 EP43max 보다 훨씬 더 안정적이었다.
실시예 6: EP34max 와 시판되는 TNF α 결합제의 비교
EP34max, Adalimumab 및 Infliximab의 재조합 인간 TNFα 1000 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 능력은 상기 L929 분석에 상세하게 기술된 바와 같이 비교하였다. EP34max, Adalimumab 및 Infliximab의 재조합 인간 TNFα 10 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 능력은 상기 Kym-1 분석으로 평가하였다. 결과는 도 9a, b 및 도 10a, b에 각각 나타낸다.
도 9a는 재조합 인간 TNFα(뮤라인 L929 세포) 1000 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Ep34max 및 Adalimumab의 효능을 예시한 것이다. Ep34max 및 Adalimumab의 IC50은 각각 1.03 ng/ml 및 8.46 ng/ml로 결정되었다. 도 9b는 재조합 인간 TNFα(인간 Kym-1 세포) 10 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Ep34max 및 Adalimumab의 효능을 예시한 것이다. Adalimumab 및 Ep34max(791)의 IC50은 각각 66.2 ng/ml 및 0.69 ng/ml로 결정되었다.
도 10a는 재조합 인간 TNFα(뮤라인 L929 세포) 1000 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Ep34max 및 Infliximab의 효능을 예시한 것이다. Ep34max 및 Infliximab의 IC50은 각각 1.04 ng/ml 및 13.9 ng/ml로 결정되었다. 도 9b는 재조합 인간 TNFα(인간 Kym-1 세포) 10 pg/ml의 세포독성 활성을 차단하는 Infliximab 및 Ep34max(791)의 효능을 예시한 것이다. Infliximab 및 Ep34max의 IC50은 각각 14.98 ng/ml 및 0.63 ng/ml로 결정되었다. 따라서, 2가지 경우들에서, EP34max는 Infliximab만큼 우수한 성능을 보여주었다.
그외 구현예들
본 발명은 또한 첨부된 부록 A - E에 기술된 방법, 참조 자료 및/또는 조성물 중 임의의 것을 포함하는 것으로 이해된다.
등가물
당해 기술 분야의 당업자라면, 전술한 설명에 비추어 본 발명에 대한 다수의 변형 및 대안적인 구현예들을 명확하게 인식할 것이다. 이에, 본 명세서의 내용은 단지 예로만 해석되며, 당해 기술 분야의 당업자에게 본 발명을 수행하기 위한 최상의 방식을 인식시키기 위한 것이다. 구성에 대한 상세한 내용은 본 발명의 사상으로부터 이탈되지 않는 범위에서 실질적으로 변경될 수 있으며, 첨부된 청구항의 범위내에 포함되는 모든 변형으로만 제한된다. 본 발명은 단지 첨부된 청구항과 적용가능한 법률 규칙에 의해 규정되는 범위로 한정되는 것으로 의도된다. 특허, 특허 출원, 기사, 책, 보고서, 논문, 웹 페이지, 도면 및/또는 부록을 비롯한 본 출원에 인용된 모든 문헌과 유사 소재들은 이들 문헌과 유사 소재의 형식에 상관없이 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다. 포함되는 문헌과 유사 소재들 중 한가지 이상이, 정의된 용어, 용어 사용, 기술된 기법 등을 포함하여 본 발명과 다르거나 모순되는 경우, 본 발명을 따른다.
본원에 사용되는 섹션의 제목은 단지 조직화를 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 기술된 내용으로 한정되는 것으로 해석되진 않는다.
본 발명은 다양한 구현예들과 실시예를 들어 설명되어 있지만, 본 발명의 내용은 이러한 구현예나 실시예로 한정되는 것은 아니다. 반면, 본 발명은 당해 기술 분야의 당업자에게 인지되는 바와 같은 다양한 대안, 변형 및 등가를 포괄한다.
청구항은 그 효과가 언급되어 있지 않더라도 기재된 지시 또는 요소로 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 첨부된 청구항의 범위내에서 형태나 구체적인 내용에 대한 다양한 변화를 가할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 하기 청구항의 범위 및 사상 그리고 이의 등가에 포함되는 모든 구현예들을 청구한다.
SEQUENCE LISTING <110> ESBATech AG <120> Stable and soluble antibodies inhibiting TNFalpha <130> P103779PC00 <160> 121 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (170)..(219) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Pro Ser Arg Phe Ser 130 135 140 Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 145 150 155 160 Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr 210 215 220 Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CDP <222> (26)..(75) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDP <222> (90)..(139) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDP <222> (172)..(221) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser 130 135 140 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 145 150 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CDR-L2 <400> 7 Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP43 CDR-L3 <400> 8 Gln Gln Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Val Asp Asn Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP1 CDR-H1 <400> 9 Gly Ile Asp Leu Ser Asn Asp Ala Ile Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP1 CDR-H2 <400> 10 Tyr Ile Ser Asp Trp Ser Ile Arg Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Gln Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP1 CDR-H3 <400> 11 Gly Ala Pro Gly Ala Gly Asp Asn Gly Ile 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP1 CDR-L1 <400> 12 Gln Ser Thr Glu Ser Val Tyr Lys Asn Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP1 CDR-L2 <400> 13 Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP1 CDR-L3 <400> 14 Ala Gly Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser Gly Thr 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Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Tyr Arg Ser 85 90 95 Gly Phe Gly Thr Ala Asn Gly Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 Val Leu Gly 115 <210> 87 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP42max VH <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Arg Asn Asp 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Asp Trp Gly Ile Lys Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Ala Pro Gly Ala Gly Asp Asn Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP42max VL <400> 88 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Thr Glu Ser Val Tyr Lys Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Tyr Arg Ser 85 90 95 Gly Phe Gly Thr Ala Asn Gly Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 Val Leu Gly 115 <210> 89 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of rFW1.4 <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (90)..(139) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (172)..(221) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser 130 135 140 Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 90 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of rFW1.4(V2) <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (90)..(139) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (172)..(221) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 91 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substituted variable light chain framework of FW1.4 <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> CDR <222> (170)..(219) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (220)..(220) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 91 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 92 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rFW1.4 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(138) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (171)..(220) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (277)..(326) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (341)..(390) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (423)..(472) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 92 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 93 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> framework of rFW1.4(V2) <220> <221> misc_feature <222> (24)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (89)..(138) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (171)..(220) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (277)..(326) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (341)..(390) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (423)..(472) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 93 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa 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Asn Thr 85 90 95 Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 Ile Ser Arg Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Ala Cys Ile Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Thr Pro 180 185 190 Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Pro Val Ser Thr Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala Tyr 225 230 235 240 Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 116 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP35min scFv <400> 116 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Leu 20 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Ala Gly Thr Ser Gly Gly Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Ser Ser Asn Gly Tyr Tyr Phe 225 230 235 240 Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 118 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP35minmax scFv <400> 118 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Leu 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Trp Ser His Thr Asn 85 90 95 Val Asp Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe 145 150 155 160 Ser Val Gly Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Val Ala Cys Ile Asp Ala Gly Thr Ser Gly Gly Thr Tyr 180 185 190 Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser 195 200 205 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Ser Ser Asn Gly Tyr Tyr Phe 225 230 235 240 Lys Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 119 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EP42min scFv <400> 119 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Thr Glu Ser Val Tyr Lys Asn 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 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Leu Ser Cys Thr Val Ser 145 150 155 160 Gly Ile Asp Leu Arg Asn Asp Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 165 170 175 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Asp Trp Gly Ile Lys 180 185 190 Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Pro Gly Ala Gly Asp Asn 225 230 235 240 Gly Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250

Claims (53)

  1. (i) 인간 중쇄 가변성 프레임워크 서열과, 토끼 면역결합제로부터 유래된 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3 서열; 및
    (ii) 인간 경쇄 가변성 프레임워크 서열과, 토끼 면역결합제로부터 유래된 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3 서열을 포함하고,
    상기에서 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크는 서열번호 2, 서열번호 89 또는 서열번호 90과 98% 이상의 동일성을 갖고, 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크는 서열번호 1 또는 서열번호 91과 98% 이상의 동일성을 가지며,
    상기에서 토끼 면역결합제로부터 유래된 CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 및 CDR L3의 서열은 하기로부터 선택되는, 인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 면역결합제:
    a) 각각 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8;
    b) 각각 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14;
    c) 각각 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20;
    d) 각각 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26;
    e) 각각 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32;
    f) 각각 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37 및 서열번호 38; 또는
    g) 각각 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44.
  2. 제1항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크는 서열번호 89 또는 서열번호 90이거나 이를 포함하며; 및 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 91이거나 이를 포함하는, 면역결합제.
  3. 제2항에 있어서, AHo 번호 지정 체계에 따라, 중쇄 프레임워크(VH)내 H24, H25, H56, H82, H84, H89 및 H108로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 치환을 포함하거나; 또는 경쇄 프레임워크(VL)내 L87 위치에 치환을 포함하는, 면역결합제.
  4. 제3항에 있어서, 치환이, AHo 번호 지정 체계에 따라, H24번 위치에 트레오닌(T), H25번 위치에 발린(V), H56번 위치에 글리신(G) 또는 알라닌(A), H82번 위치에 라이신(K), H84번 위치에 트레오닌(T), H89번 위치에 발린(V) 및 H108번 위치에 아르기닌(R) 및 L87번 위치에 트레오닌(T)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역결합제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 면역결합제가 (AHo 번호 지정 체계에 따라) 중쇄의 12, 103 및 144번 위치의 아미노산 하나 이상에 가용성을 증가시키는 치환을 포함하는, 면역결합제.
  6. 제5항에 있어서, 가용성을 증가시키는 치환이 (a) 12번 위치에서의 세린(S); (b) 103번 위치에서의 트레오닌(T); 및 (c) 144번 위치에서의 트레오닌(T)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역결합제.
  7. a) 서열번호 51, 서열번호 53 및 서열번호 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58 및 서열번호 59로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 경쇄 가변부(VL);
    b) 서열번호 60 및 서열번호 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 61 및 서열번호 63으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 경쇄 가변부(VL);
    c) 서열번호 64 및 서열번호 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 65 및 서열번호 67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 경쇄 가변부(VL);
    d) 서열번호 68 및 서열번호 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 69 및 서열번호 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 경쇄 가변부(VL);
    e) 서열번호 73 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 74 및 서열번호 76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 경쇄 가변부(VL);
    f) 서열번호 77 및 서열번호 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 78 및 서열번호 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 경쇄 가변부(VL);
    g) 서열번호 81 및 서열번호 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 82 및 서열번호 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 경쇄 가변부(VL); 또는
    h) 서열번호 85 및 서열번호 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 중쇄 가변부(VH); 및 서열번호 86 및 서열번호 88로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 경쇄 가변부(VL);
    를 포함하는 면역결합제.
  8. 서열번호 94 내지 서열번호 121 중 어느 하나와 100%의 서열 동일성을 갖는 면역결합제.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 항체, scFv, Fab 또는 Dab인 면역결합제.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 따른 면역결합제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며,
    일반적인 염증의 만성 또는 자가면역 상태, 일반적인 면역 매개 염증 장애, 염증성 CNS 질환, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추 신경계, 위장관, 요로 또는 폐에 나타나는 염증 질환, 일반적인 포도막염 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베체트 질환, 안구 건조 증후군, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병, 당뇨병성 신경 장애, 인슐린 내성, 일반적인 관절염 상태, 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 소아 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 귈랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축성 측상 경화증, 유육종증, 사구체 신염, 만성 신장 질환, 방광염, 건선, 건선성 관절염, 화농성 땀샘염, 지방층염, 괴저성 농피증, SAPHO 증후군, 여드름, 스위트 증후군, 천포창, 크론 질환, 궤양성 결장염, 기관지 천식, 과민성 폐염, 일반적인 알레르기, 알레르기성 비염, 알레르기성 부비강염, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 가와사키 증후군, 자이언트 세포 동맥염, 처그-스트라우스 혈관염, 결절성 다발성 동맥염, 화상, 이식 편대 숙주 질환, 숙주 편대 이식 반응, 장기 또는 골수 이식 후 거부 반응, 일반적인 전신 및 국소 맥관염 상태, 전신 및 원반형 홍반성 루프스, 다발성 근염, 피부근염, 경피증, 자간전증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 눈 수술, 관절 수술, 관절 구조물 수술, 구강 또는 치아 수술, 최소 침습성 심혈관 시술, 복강경 또는 내시경 복막내 및 부인과 시술, 내시경 비뇨기과 시술 후 염증 또는 일반적인 수술전 염증, 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 헌팅턴병, 얼굴마비, 크로이츠펠트-야콥병, 암으로 인한 골 용해, 암으로 인한 염증, 암으로 인한 통증, 암으로 인한 악액증, 골 전이, 급성 및 만성 형태의 통증, 통각 또는 신경병성 통증, 좌골 신경통, 요통, 수근관 증후관, 복합 부위 통증 증후군(CRPS), 통풍, 대상포진 후 신경통, 섬유근육통, 국소 통증 상태, 전이 종양으로 인한 만성 통증 증후군, 월경통, 박테리아, 바이러스 또는 진균으로 인한 패혈증, 결핵, AIDS, 아테롬성 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 고혈압, 이상 지질혈증, 심장 기능부전 및 만성 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 TNFα-매개 질환을 치료할 수 있는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 정의된 가변성 중쇄(VH) 영역 또는 가변성 경쇄(VL) 영역을 코딩하는, 분리된 핵산 분자.
  12. 제11항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 따른 면역결합제를 사용하는 것을 특징으로 하는,
    일반적인 염증의 만성 또는 자가면역 상태, 일반적인 면역 매개 염증 장애, 염증성 CNS 질환, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추 신경계, 위장관, 요로 또는 폐에 나타나는 염증 질환, 일반적인 포도막염 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베체트 질환, 안구 건조 증후군, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병, 당뇨병성 신경 장애, 인슐린 내성, 일반적인 관절염 상태, 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 소아 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 귈랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축성 측상 경화증, 유육종증, 사구체 신염, 만성 신장 질환, 방광염, 건선, 건선성 관절염, 화농성 땀샘염, 지방층염, 괴저성 농피증, SAPHO 증후군, 여드름, 스위트 증후군, 천포창, 크론 질환, 궤양성 결장염, 기관지 천식, 과민성 폐염, 일반적인 알레르기, 알레르기성 비염, 알레르기성 부비강염, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 가와사키 증후군, 자이언트 세포 동맥염, 처그-스트라우스 혈관염, 결절성 다발성 동맥염, 화상, 이식 편대 숙주 질환, 숙주 편대 이식 반응, 장기 또는 골수 이식 후 거부 반응, 일반적인 전신 및 국소 맥관염 상태, 전신 및 원반형 홍반성 루프스, 다발성 근염, 피부근염, 경피증, 자간전증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 눈 수술, 관절 수술, 관절 구조물 수술, 구강 또는 치아 수술, 최소 침습성 심혈관 시술, 복강경 또는 내시경 복막내 및 부인과 시술, 내시경 비뇨기과 시술 후 염증 또는 일반적인 수술전 염증, 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 헌팅턴병, 얼굴마비, 크로이츠펠트-야콥병, 암으로 인한 골 용해, 암으로 인한 염증, 암으로 인한 통증, 암으로 인한 악액증, 골 전이, 급성 및 만성 형태의 통증, 통각 또는 신경병성 통증, 좌골 신경통, 요통, 수근관 증후관, 복합 부위 통증 증후군(CRPS), 통풍, 대상포진 후 신경통, 섬유근육통, 국소 통증 상태, 전이 종양으로 인한 만성 통증 증후군, 월경통, 박테리아, 바이러스 또는 진균으로 인한 패혈증, 결핵, AIDS, 아테롬성 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 고혈압, 이상 지질혈증, 심장 기능부전 및 만성 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 TNFα-매개 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 일반적인 염증의 만성 또는 자가면역 상태, 일반적인 면역 매개 염증 장애, 염증성 CNS 질환, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추 신경계, 위장관, 요로 또는 폐에 나타나는 염증 질환, 일반적인 포도막염 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베체트 질환, 안구 건조 증후군, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병, 당뇨병성 신경 장애, 인슐린 내성, 일반적인 관절염 상태, 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 소아 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 귈랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축성 측상 경화증, 유육종증, 사구체 신염, 만성 신장 질환, 방광염, 건선, 건선성 관절염, 화농성 땀샘염, 지방층염, 괴저성 농피증, SAPHO 증후군, 여드름, 스위트 증후군, 천포창, 크론 질환, 궤양성 결장염, 기관지 천식, 과민성 폐염, 일반적인 알레르기, 알레르기성 비염, 알레르기성 부비강염, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 가와사키 증후군, 자이언트 세포 동맥염, 처그-스트라우스 혈관염, 결절성 다발성 동맥염, 화상, 이식 편대 숙주 질환, 숙주 편대 이식 반응, 장기 또는 골수 이식 후 거부 반응, 일반적인 전신 및 국소 맥관염 상태, 전신 및 원반형 홍반성 루프스, 다발성 근염, 피부근염, 경피증, 자간전증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 눈 수술, 관절 수술, 관절 구조물 수술, 구강 또는 치아 수술, 최소 침습성 심혈관 시술, 복강경 또는 내시경 복막내 및 부인과 시술, 내시경 비뇨기과 시술 후 염증 또는 일반적인 수술전 염증, 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 헌팅턴병, 얼굴마비, 크로이츠펠트-야콥병, 암으로 인한 골 용해, 암으로 인한 염증, 암으로 인한 통증, 암으로 인한 악액증, 골 전이, 급성 및 만성 형태의 통증, 통각 또는 신경병성 통증, 좌골 신경통, 요통, 수근관 증후관, 복합 부위 통증 증후군(CRPS), 통풍, 대상포진 후 신경통, 섬유근육통, 국소 통증 상태, 전이 종양으로 인한 만성 통증 증후군, 월경통, 박테리아, 바이러스 또는 진균으로 인한 패혈증, 결핵, AIDS, 아테롬성 동맥 경화증, 관상 동맥 질환, 고혈압, 이상 지질혈증, 심장 기능부전 및 만성 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 TNFα-매개 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 면역결합제.
  16. 제10항에 있어서, 국소, 경구, 비강, 직장 또는 비경구 투여용으로 제제화된 조성물.
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