KR20200055740A - 신규한 이중특이적 cd3/cd19 폴리펩티드 복합체 - Google Patents

신규한 이중특이적 cd3/cd19 폴리펩티드 복합체 Download PDF

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KR20200055740A
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Abstract

본 발명은 폴리펩티드 복합체의 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티를 함유하는 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체, 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체의 제조 방법, 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체를 사용하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법, 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

신규한 이중특이적 CD3/CD19 폴리펩티드 복합체
본 출원은 2017년 9월 22일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2017/103032를 우선권으로 청구한다.
본 발명은 일반적으로 TCR 불변 영역에 융합된 항체 가변 영역을 포함하는 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체에 관한 것이다.
이중특이적 항체는 신규한 카테고리의 치료용 항체로 성장하고 있다. 이들은 2개의 상이한 표적 또는 표적상 2개의 상이한 에피토프에 결합하여, 개별 항체의 효과보다 우수한 부가 또는 상승 효과를 생성할 수 있다. DVD-Ig, CrossMab, BiTE 등과 같은 새로운 이중특이적 포맷을 설계하기 위해 많은 항체 공학적인 노력이 이루어졌다 (Spiess et al., Molecular Immunology, 67 (2), pp.95-106 (2015)). 그러나, 이들 포맷은 안정성, 용해도, 짧은 반감기 및 면역원성에 있어서 다양한 잠재적인 제한을 가질 수 있다.
이들 이중특이적 항체 포맷들 중에서, IgG-유사 이중특이적 항체는 일반적인 포맷이다: 하나의 암은 표적 A에 결합하고 다른 하나는 표적 B에 결합한다. 구조적으로 이것은 천연 IgG와 크기 및 모양이 비슷한 항체 A의 절반과 항체 B의 절반으로 만들어진다. 후속 연구개발을 용이하게 하기 위해, 이러한 이중특이적 분자는 높은 발현 수준 및 정확하게 조립된 형태를 갖는 단일 숙주 세포로부터, 정상 IgG와 같이 쉽게 생성될 수 있는 것이 바람직하다. 불행하게도, 동족 경쇄-중쇄 쌍 및 2개의 상이한 반-항체 (half antibody)의 조립은 자동으로 제어될 수 없다. 임의의 방식으로 모든 종류의 미스페어링은 제품의 이질성을 크게 높일 수 있다.
"놉-인투-홀" (Ridgway et al., Protein Engineering, 9 (7), pp. 617-21 (1996); Merchant et al., Nature Biotechnology), 16 (7), pp.677-681 (1998)), 정전기학 (Gunasekaran 등, Journal of Biological Chemistry, 285 (25), pp.19637-19646 (2010)) 또는 음성 상태 설계 (Kreudenstein et al., mAbs, 5 (5), pp.646-654 (2013); Leaver-Fay et al., Structure, 24 (4), pp.641-651 (2016)) 와 같은 돌연변이를 Fc 영역에 도입함으로써, 2개의 상이한 중쇄의 바람직한 이종이량체 조립이 달성되었다. 그러나, 각각의 개별 항체에서의 경쇄-중쇄의 선택적 결합은 여전히 연구중이다. 경쇄 사이의 인터페이스는 가변 도메인 (VH-VL) 및 불변 도메인 (CH1-CL)을 포함한다. 동족 쌍을 용이하게 하기 위해 직교 인터페이스를 설계하는데 몇 가지 전략이 적용되었다. 로슈 (Roche)는 CH1과 CL의 도메인을 교체하면서 크로스맙 (CrossMab) 플랫폼을 만들었고 (Schaefer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108 (27), pp.11187-11192 (2011)), 메디이뮨 (MedImmune)은 대안적으로 이황화 결합을 도입했고 (Mazor et al., mAbs, 7 (2), pp.377-389 (2015)), 암젠은 CH1-CL 영역에서 추가적인 정전기를 일으켰고 (Liu et al., Journal of Biological Chemistry, 290 (12), pp.7535-7562 (2015)), 릴리 (Lewis et al., Nature Biotechnology, 32 (2)), pp.191-198 (2014) 및 젠테크 (Dillon et al., mAbs, 9 (2), pp.213-230 (2017))는 가변 및 불변 도메인 모두에 돌연변이를 도입하였다.
인간 CD19는 면역 글로불린 슈퍼 패밀리에 속하는 타입 I 막-통과 단백질이다 (Carter et al., Curr Dir Autoimmun, 7: 4-32 (2004)). 대부분의 B 세포에서는 발현되지만 형질 세포, 줄기 세포 또는 정상적인 골수 계통에서는 검출되지 않는다 (Tedder, Nat Rev Rheumatol, 5 (10): 572-577 (2009)). CD19는 B 세포 수용체 (BCR)에 의존적이고 독립적인 신호 전달을 조절함으로써 고유 B 세포 신호 전달 임계값을 설정하는데 결정적으로 관여한다 (Wang et al., Experimental Hematology & Oncology, 1:36 (2012)). CD19는 CD20 보다 더 넓은 발현을 갖는다. CD19 발현의 패턴은 B-세포 악성 종양에서 유지되며, B-세포 림프종의 모든 하위 유형을 포함하여 B-세포 만성 림프 구성 백혈병 및 비-T 급성 림프구성 백혈병, 리툭시맙 (Rituximab)에 의해 표적화될 수 없는 급성 림프구 백혈병 (ALL)과 같은 초기 B 세포의 종양 표시의 표적화를 허용한다. 림프종 치료를 위한 몇몇 CD19 단일 클론 항체가 연구되었다 (미국 특허 출원 공개 번호 20140072587 A1, 미국 특허 번호 8,242,252 B2 및 미국 특허 번호 8,097,703 B2).
CD3 T-세포 공-수용체는 4개의 별개의 쇄, CD3 감마 쇄, CD3 델타 쇄 및 2 개의 CD3 입실론 쇄로 구성된 단백질 복합체이다. 4개의 쇄는 T-세포 수용체 (TCR) 및 제타-쇄로 알려진 분자와 결합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR, 제타 쇄 및 CD3 분자는 TCR 복합체를 구성하는데, 여기서 서브 유닛으로서 TCR은 항원을 인식하고 항원에 결합하고, 서브 유닛으로서 CD3는 항원 자극을 신호 전달 경로로 전달 및 전달하여 궁극적으로 T-세포 활성을 조절한다. CD3 단백질은 사실상 모든 T 세포에 존재한다. CD3-TCR 복합체는 선천적 및 후천적 면역 반응뿐만 아니라 세포성 및 체액성 면역 기능 모두에서 T 세포 기능을 조절한다. 여기에는 병원성 유기체 제거 및 광범위한 세포 독성 효과에 의한 종양 성장 제어가 포함된다. 치료를 위해 개발된 1세대 CD3 항체는 OKT3와 같은 인간 CD3에 특이적인 마우스 모노클로날 항체(Kung et al., Science, 206: 347-9 (1979))이다. OKT3는 강력한 면역 억제 효능을 갖지만, 임상적 사용은 면역원성 및 유사 분열 잠재력과 관련된 심각한 부작용으로 인해 제한받았다 (Chatenoud, Nature Reviews, 3:123-132 (2003)). OKT3는 항-글로불린 반응을 유도하여 그 자체의 신속한 제거 및 중화를 촉진하였다 (Chatenoud et al., Eur. J. Immunol., 137 : 830-8 (1982)). 또한, OKT3는 시험관내에서 T-세포 증식 및 사이토카인 생성을 유도하고, 생체 내에서 사이토카인의 대규모 방출을 유발하였다 (Hirsch et al., J. Immunol, 142:737-43 (1989)). 이러한 심각한 부작용은 이식에서 OKT3의 보다 광범위한 사용뿐만 아니라, 자가 면역과 같은 다른 임상 분야로의 확장을 제한하였다.
CD3 및 CD19를 표적화하는 이중특이적 항체는 T 세포 및 B 세포에 동시에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체가 CD3-양성 T 세포 및 CD19-양성 B 세포에 결합하면, 세포 용해성 시냅스가 형성된다. 세포 독성은 세포 독성 T 세포에서 과립으로부터 퍼포린 (perforin) 및 그랜자임 (granzyme)의 방출에 의해 유도되고, 나중에는 악성 B 세포의 세포자살 및 용해를 유도한다.
CD3 및 CD19 모두에 바람직한 발현 수준 및 생체 내 반감기를 갖는 이중특이적 분자를 설계할 필요가 있다. 이러한 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체는 암을 포함한 CD19 관련 상태의 치료에 유용하다.
일 양태에서, 본 발명은 제2 항원-결합 모이어티와 관련된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공한다:
제1 항원-결합 모이어티는 다음을 포함한다:
N-말단에서 C-말단까지, 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드,
상기:
C1은 서열번호 1을 포함하는 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 서열번호 2를 포함하는 조작된 CAlpha를 포함하고,
서열번호 1의 아미노산 C48 및 서열번호 2의 아미노산 C41은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있고,
C1 및 C2는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 이황화 결합은 상기 이량체를 안정화시킬 수 있고,
및
제2 항원-결합 모이어티는 다음을 포함한다:
항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 중쇄 가변 도메인 (VH2), 및
항체 경쇄 불변 (CL) 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 경쇄 가변 도메인 (VL2),
상기:
제1 및 제2 항원-결합 모이어티 중 하나는 항-CD3 결합 모이어티이고, 다른 하나는 항-CD19 결합 모이어티이며,
상기 항-CD3 결합 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래된다:
a) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, b) 서열번호 4를 포함하는 중쇄 CDR2, c) 서열번호 5를 포함하는 중쇄 CDR3, d) 서열번호 6을 포함하는 카파 경쇄 CDR1, e) 서열번호 7을 포함하는 카파 경쇄 CDR2 및 f) 서열번호 8을 포함하는 카파 경쇄 CDR3;
상기 항-CD19 결합 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD19 항체로부터 유래된다:
a) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 CDR1, b) 서열번호 10을 포함하는 중쇄 CDR2, c) 서열번호 11을 포함하는 중쇄 CDR3, d) 서열번호 12를 포함하는 카파 경쇄 CDR1, e) 서열번호 13을 포함하는 카파 경쇄 CDR2, 및 f) 서열번호 14를 포함하는 카파 경쇄 CDR3,
및
상기 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우에 비하여 그렇지 않은 것보다 불일치가 덜 발생한다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 항-CD3 결합 모이어티는 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 17을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래된다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 항-CD3 결합 모이어티는 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래된다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 29.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개 폴리펩티드 서열의 조합을 포함한다: 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 30.
일 양태에서, 본 발명은 모이어티에 접합되어 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 접합체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 제공된 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 제공된 단리된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건 하에 상기 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 제공된 치료적 유효량의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 CD19-관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 상기 질환 또는 상태는 제1 항원 및 제2 항원이 모두 조절될 때 완화, 제거, 치료, 또는 예방될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 VH는 항체 V/C 접합의 C 말단 단편을 포함하고 서열번호 23 (LEDLKNVFPP)의 아미노산 서열을 갖는 제1 접합 도메인에서 CBeta에 작동 가능하게 연결되고, 제1 VL은 TCR V/C 접합의 N 말단 단편을 포함하고 서열번호 24 (KPDIQNPDP)의 아미노산 서열을 갖는 제2 접합 도메인에서 CAlpha에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 제1 이량체화 도메인에 연결되고, 제2 항원-결합 모이어티는 제2 이량체화 도메인에 연결되며, 여기서 제1 및 제2 이량체화 도메인은 연계된다. 특정 실시예에서, 연계는 커넥터, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 염다리, 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통한 것이다.
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 임의로 유래된 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다.
특정 실시예에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고, 제1 이량체화 도메인은 서열번호 25 (YGPPCPPCPAPEFLGGP)를 포함하는 제3 접합 도메인에서 조작된 CBeta에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-결합 모이어티의 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하고 동종이량체화를 방해하고 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연계된다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀, 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 친수성 상호작용 또는 증가한 유연성을 통하여 이종이량체로 연계될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 검출, 진단, 예후, 또는 치료를 위해 상기 제공된 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 전술한 다른 특징 및 장점은 첨부 도면을 참조하여 진행하는 몇몇 실시예에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
본 발명의 다음의 설명은 단지 본 발명의 다양한 실시예들을 설명하기 위한 것이다.
정의
본 발명에 있어서 용어 "a", "an"및 "the"는 문법적 대상 중 하나 이상(예, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, "적어도 하나의 폴리펩티드 복합체"는 하나의 폴리펩티드 복합체 또는 하나 이상의 폴리펩티드 복합체를 의미한다.
본 발명에 있어서 용어"약"또는 "대략"은 수량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이는 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%만큼의 참조 수량, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대하여 나타낸다. 일 양태에서, "약"또는"대략"이라는 용어는 숫자 값 서두에 있을 때 15%, 10%, 5% 또는 1% 범위의 값을 더하거나 뺀 값을 나타낸다.
본 발명에 있어서 문맥상 달리 요구하지 않는 한 용어"포함하다(복수형)", "포함하다(단수형)"및 "포함하는"은 언급된 단계, 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하는 것을 의미하지만, 다른 단계, 요소, 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하는 것은 아님을 의미한다. "~로 구성되는"은 "~로 구성되는"이라는 문구를 따르는 것을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, "~로 구성되는"이라는 문구는 열거된 요소가 필요하거나 필수적이며, 다른 문장 요소 없이 존재할 수 없음을 나타낸다. "본질적으로 구성되는"은 문구 뒤에 열거되는 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하며, 본 명세서에 있어서 개시된 요소에 명시된 활동 또는 행동에 기여하거나 방해하지 않는 다른 요소로 제한한다. 따라서, "본질적으로 구성되는"이라는 상기 문구는 열거된 요소가 필요하거나 필수적이지만, 다른 요소는 선택적이며 열거된 요소의 활동 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라서 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.
본 발명에 있어서 용어"일 실시예", "실시예", "특정 실시예", "관련 실시예", "특정 실시예", "추가 실시예", "추가의 실시예" 또는 이들의 조합은 실시예와 관련하여 설명되는 특정한 특징, 구조 또는 특성은 적어도 하나의 실시예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 여러곳에서 전술한 문구가 등장하는 것이 반드시 모두 동일한 실시예를 언급하는 것은 아니다. 또한, 특정한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체 또는 조립된 아미노산 잔기의 다수의 중합체를 지칭하기 위하여 상호 교환적으로 사용되는 것일 수 있다. 상기 용어인 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기는 자연적으로 발생된 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체뿐만 아니라 자연적으로 발생된 아미노산 및 비자연적으로 발생된 아미노산의 폴리머에 관해서도 적용될 수 있다. "아미노산"이라는 용어는 자연 발생 및 합성 아미노산을 의미할 뿐 아니라, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유도체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것뿐만 아니라, 나중에 변형되는 아미노산인, 예를 들자면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카르복시글루타메이트(gamma-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)이 있다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭하며, 예를 들자면, 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 알파-탄소이며, 또 다른 일 예로는, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄인 것이다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 알파-탄소는 카르보닐과 같은 작용기에 부착되어 있는 제1 탄소 원자를 지칭한다. 베타-탄소는 알파-탄소에 연결된 제2 탄소 원자를 의미하며, 명명 시스템상 그리스 문자와 함께 알파벳 순서로 탄소의 명명을 계속한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학적 구조와는 다른 구조를 갖고 있으나, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 의미한다. 상기 용어 "단백질"은 전형적으로 큰 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 용어 "펩티드"는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드 서열은 일반적으로 폴리펩티드 서열의 좌측 말단이 아미노-말단 (N-말단)이고; 폴리펩티드 서열의 우측 말단은 카르복실-말단 (C-말단)이다. 본 발명에 있어서 용어 "폴리펩티드 복합체"는 특정 기능을 수행하기 위해 관련된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 지칭한다. 특정 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 면역과 관련성이 있다.
본 발명에 있어서 용어 "항체"는 특정 항원에 결합하는 임의의 면역 글로불린, 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 다중 특이적 항체 또는 이중특이적(2가) 항체를 포함한다. 본래의 온전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역("HCVR") 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)으로 구성되는 반면, 각각의 경쇄는 가변 영역 ("LCVR") 및 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 포유류의 중쇄는 α, δ, ε, γ, 및 μ으로 구성되며 포유류의 경쇄는 λ 또는 κ로 분류된다. 항체는 "Y"형상을 가지며, Y의 줄기는 이황화 결합을 통해 함께 결합된 2 개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 구성된다. Y의 각각의 암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 두 사슬의 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDRs)인 3개의 매우 가변적인 루프를 포함한다(LCDR1을 포함한 경쇄 (L) CDR, LCDR2, LCDR3, HCDR1을 포함한 중쇄 (H) CDR, HCDR2, HCDR3). 항체의 CDR 경계는 Kabat, Chothia 또는 Al-Lazikani의 규칙에 의해 정의하거나 식별할 수 있다. (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, AM, J. Mol. Biol., 273 (4), 927 (1997); Chothia, C. 등, J Mol Biol. Dec 5; 186 (3) : 651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, AM, J.Mol. Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. 등, Nature. Dec 21-28; 342 (6252): 877-83 (1989); Kabat EA et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 상기 3개의 CDR은 프레임 워크 영역 (FRs)으로 알려진 플랭킹 스트레치 (flanking stretch) 사이에 개재되며, 이는 CDR보다 더욱 높게 보존되고 초가변 루프를 지지하는 스캐폴드를 형성한다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 4 개의 FR을 포함하고, CDR 및 FR은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에 관여하지 않지만 다양한 효과기의 기능을 나타낸다. 항체는 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 클래스에 할당된다. 항체의 5가지 주요 클래스 또는 이소타입은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 하는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이다. 몇몇의 주요 항체 클래스는 IgG1 (γ1 중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ3 중쇄), IgG4 (γ4 중쇄), IgA1 (α1 중쇄) 또는 IgA2 (α2 중쇄)와 같은 서브 클래스로 분류된다.
"가변 도메인"은 항체와 관련하여 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 가변 영역 또는 이의 단편을 지칭한다. 가변 도메인은 온전한 가변 영역 (예: HCVR 또는 LCVR)을 포함할 수 있지만, 온전한 가변 영역 미만을 포함하면서도 항원에 결합하거나 항원 결합 부위를 형성하는 능력을 여전히 가질 수 있다.
"항원-결합 모이어티"는 하나 또는 그 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부 또는 항원에 결합그러나 온전한 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편으로부터 유래되는 조성물로부터 형성된 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 모이어티의 예는 비제한적으로 가변 도메인, 가변 영역, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv', 이황화 안정화 디아바디(ds 디아바디, 다중특이적 항체, 낙타화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 2가 도메인 항체를 포함한다. 항원-결합 모이어티는 모항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 항원-결합 모이어티는 이식된 특정 인간 항체로부터 하나 또는 그 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역까지 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 항원-결합 모이어티의 보다 상세한 형식은 Spiess et al, 2015 (Supra) 및 Brinkman et al., mAbs, 9 (2), pp.182-212 (2017)에 기술되어 있으며, 이것은 전체적으로 본 명세서에 포함된다.
"Fab"은 항체와 관련하여 이황화 결합에 의한 단일 중쇄의 가변영역 및 제1 불변 영역에 관련된 단일 경쇄(가변 및 불변 영역 둘다)로 이루어진 항체의 부분을 지칭한다. 특정 실시예에서, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 불변 영역은 TCR 불변 영역으로 대체된다.
"Fab"은 힌지 영역의 일부를 포함하는 Fab 단편을 지칭한다.
"F(ab')2"는 Fab의 이량체를 지칭한다.
"프래그먼트 디피컬트 (Fd)"는 항체와 관련하여 경쇄와 결합하여 Fab를 형성할 수 있는 중쇄 단편의 아미노-말단의 절반을 지칭한다.
"Fc"는 항체와 관련하여 이황화 결합을 통해 제2 중쇄의 제2 및(CH2) 및 제3 (CH3)의 불변 영역에 결합된 제1 중쇄의 제2 (CH2) 및 제3 (CH3)의 불변 영역으로 이루어진 항체의 부분을 지칭한다. 항체의 Fc 영역은 ADCC 및 CDC와 같은 다양한 효과기 기능을 담당그러나, 항원 결합에서는 기능하지 않는다.
"힌지 영역"은 항체와 관련하여 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이와 같은 힌지 영역은 대략 25개의 아미노산 잔기를 포함하며 힌지 영역은 유연성을 가지며, 따라서 2개의 N-말단 항원결합 영역이 독립적으로 이동할 수 있게 한다.
"CH2 도메인"은 연장되는 중쇄 분자의 일부를 포함하며, 예를 들어, 통상적인 넘버링 방식을 사용한 IgG 항체의 아미노산 약 244 내지 360이다 (아미노산 244 내지 360, 카바트 넘버링 시스템; 및 아미노산 231-340, EU 넘버링 시스템; 카바트 (Kabat, E.) 등의 미국 보건 복지부 (1983) 참조).
"CH3 도메인"은 CH2 도메인에서부터 IgG분자의 C-말단까지 연장되며 대략 108개의 아미노산을 포함한다. 특정 면역글로불린 클래스로는, 예를 들어, IgM으로, CH4 영역을 추가로 포함한다.
"Fv"는 항체와 관련하여 완전한 항원 결합 부위를 보유하는 항체의 가장 작은 단편을 지칭한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 도메인에 결합된 단일 경쇄의 가변 도메인으로 구성된다. dsFv를 포함하여 다수의 Fv 설계가 제공되었으며, 여기서 두 도메인 사이의 연계는 도입된 이황화 결합에 의해 향상되고; scFv는 2개의 도메인을 단일 폴리펩티드로서 함께 결합시키기 위해서 펩티드 링커를 사용하여 형성될 수 있다. 상응하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변 및 불변 도메인과 관련된 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 쇄의 가변 도메인을 포함하는 Fvs 구조물을 또한 생산하였다. Fvs는 또한 디아바디 및 트라이아보디를 형성하기 위해 다량화되었다 (Maynard et al.,Annu Rev Biomed Eng 2 339-376 (2000)).
"ScFab"은 폴리펩티드 링커를 통해 경쇄에 연결된 Fd를 갖는 융합 폴리펩티드를 지칭하며, 단일 쇄 Fab 단편 (scFab)을 형성한다.
“TriFabs"은 3가, Fab-기능성을 갖는 3개의 단위로 구성된 이중특이적 융합 단백질을 지칭한다. TriFab은 비대칭 Fab 유사 모이어티에 융합된 2개의 규칙 Fab를 보유한다.
"Fab-Fab"은 제1 Fab 암의 Fd 쇄을 제2 Fab 아암의 Fd 쇄의 N-말단에 융합시켜 형성된 융합 단백질을 지칭한다.
“Fab-Fv"은 HCVR을 Fd 쇄의 C-말단에 융합시키고 LCVR을 경쇄의 C-말단에 융합시킴으로써 형성된 융합 단백질을 지칭한다. “Fab-dsFv"분자는 HCVR 도메인과 LCVR 도메인 사이에 도메인 간 이황화 결합을 도입함으로써 형성될 수 있다.
"MAb-Fv" 또는 "IgG-Fv"는 HCVR 도메인을 하나의 Fc 쇄의 C-말단에 융합시키고 LCVR 도메인을 별도로 발현되게 하거나 혹은 이중특이적인, 3가 IgG-Fv(mAb-Fv)융합 단백질에 의하여 초래된 다른 하나의 C-말단을 도메인간 이황화 결합에 의하여 안정화된 Fv와의 결합을 통해 형성된 융합 단백질을 지칭한다.
"ScFab-Fc-scFv2" 및 "ScFab-Fc-scFv"는 단일 쇄 Fab와 Fc 및 이황화-안정화된 Fv 도메인의 융합에 의해 형성된 융합 단백질을 지칭한다.
“Appended IgG"는 이중특이적(Fab)2-Fc의 형식을 형성하기 위해 IgG에 융합된 Fab 암을 갖는 융합 단백질을 지칭한다. 이는 커넥터가 있거나 없는 IgG 분자의 C-말단 또는 N-말단에 Fab가 융합된 "IgG-Fab" 또는 "Fab-IgG"를 형성할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 appended IgG는 IgG-Fab4의 형식으로 추가로 변형될 수 있다(Brinkman et al., 2017, Supra 참조).
"DVD-Ig"는 추가의 HCVR 도메인 및 제2 특이성의 LCVR 도메인을 IgG 중쇄 및 경쇄에 융합시켜 형성되는 이중 가변 도메인 항체를 지칭한다. 두 개의 HCVR 및 두 개의 LCVR 도메인이 있는것과 관련 형식을 나타내는 "CODV-Ig"는 가변 HCVR-LCVR 도메인의 크로스 오버 쌍을 허용하는 방식으로 연결되어 있으며, 이는 HCVRA-HCVRB 및 LCVRB-LCVRA 순서로 (N-에서 C-말단으로) 또는 HCVRB-HCVRA 및 LCVRA-LCVRB 순서로 정렬된다.
"CrossMab"는 변형되지 않은 중쇄와 상응하는 변형되지 않은 경쇄의 쌍 및 변형된 중쇄와 상응하는 변형된 경쇄의 쌍을 이루는 기술을 지칭하며, 이에 따라서 경쇄에서 미스페어링이 감소된 항체가 생성된다.
"BiTE"는 이중특이적 T-세포 참여자 분자이며, 상기 HCVR-LCVR 배향에서 제2 특이성을 갖는 두번째 scFv와 연결된 LCVR-HCVR 배향에서 제1 항원성을 갖는 첫번째 scFv를 포함하는 방법이다.
"WuXiBody"는 가변 도메인의 항체 및 TCR의 불변 도메인을 갖는 가용성 키메라 단백질을 포함하는 이중특이적 항체이며, 여기에서 TCR 불변 도메인의 서브유닛(알파 및 베타 도메인)은 조작된 이황화 결합에 의하여 연결된다.
아미노산 서열(또는 핵산 서열)과 관련하여 "퍼센트(%)서열 상동성"은 참조 서열에서 아미노산 (또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산(또는 핵산)잔기의 백분율로 정의되며, 서열을 정렬한 후, 필요한 경우, 동일한 아미노산 (또는 핵산)을 최대 수로 달성하기 위하여 간격을 도입한다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로 간주되거나 고려되지 않을 수 있다. 퍼센트 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성을 결정하기 위하여 정렬이 달성될 수 있고, 예를 들면, BLASTN, BLASTp (미국 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI) 웹 사이트에서 사용 가능)와 같은 공개 사이트를 이용할 수 있고, 또한, Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol., 215 : 403-410 (1990); Stephen F. et al., Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402 (1997), ClustalW2 (유럽 생물 정보학 연구소 웹 사이트에서 이용 가능), 또한, 히긴스 D.G. et al., Methods in Enzymology, 266 : 383-402 (1996); Larkin M.A. 등, Bioinformatics (영국 옥스포드), 23 (21) : 2947-8 (2007)) 및 ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 참조할 수 있다. 당업자는 툴에 의해 제공된 디폴트 파라미터를 사용할 수 있거나, 예를 들어 적합한 알고리즘을 선택함으로써 정렬에 적합한 파라미터를 커스터마이징할 수 있다.
"항원" 또는 "Ag"는 본 발명에 사용된 화합물, 조성물, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 물질을 지칭하며 세포 배양 또는 동물에서 항체 또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수 있으며, 세포 배양물 (예: 하이브리도마)에 첨가되는 조성물 (예: 암-특이적 단백질을 포함하는 것)을 포함하거나 또는 동물에 주사 또는 흡수된다. 항원은 이종성 항원에 의해 유도된 것을 포함하여 특이적 체액성 또는 세포성 면역 (예: 항체)의 산물과 반응한다.
"에피토프" 또는 "항원 결정인자"는 항결합제 (예컨대 항체)가 결합하는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산 (선형 또는 순차적 에피토프라고도 함) 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 비연속 아미노산 (구성 또는 형태적 에피토프라고도 함)으로 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로 형성된 에피토프는 일반적으로 단백질의 1 차 아미노산 잔기를 따라 선형으로 배열되며 연속 아미노산의 작은 세그먼트는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자와의 항원 결합으로부터 소화되거나 변성 용매에 노출되어 유지될 수 있으며 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 형태로 3개 이상, 더욱 일반적으로 5개 이상, 약 7개 또는 약 8-10개 이상의 아미노산을 포함한다.
"특이적 결합" 또는 "특이적인 결합"은 2개의 분자 사이, 예를 들어 항체와 항원 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 ≤ 10-6 M (e.g., ≤ 5x10-7 M, ≤ 2x10-7 M, ≤ 10-7 M, ≤ 5x10-8 M, ≤ 2x10-8 M, ≤ 10-8 M, ≤ 5x10-9 M, ≤ 2x10-9 M, ≤ 10-9 M, 또는 ≤ 10-10 M)의 결합 친화도(KD)로 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명에 사용된 KD는 해리 속도 대 회합 속도 (koff/kon)의 비를 지칭하고, 예를 들어 Biacore와 같은 장비를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
"작동 가능하게 연결되는" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 스페이서 또는 링커의 유무에 관계없이 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계 있는 2개 이상의 생물학적 관련 서열을 갖도록 하는 병치를 지칭한다. 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 폴리펩티드 서열은 연결된 생성물이 의도된 생물학적 기능을 갖도록 하는 방식으로 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 항체 가변 영역은 항원-결합 활성을 갖는 안정한 생성물을 제공하기 위해 불변 영역에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이 용어는 또한 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동 가능하게 연결된 경우, 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩티드의 조절된 발현을 허용하는 방식으로 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
"융합" 또는 "융합된"은 아미노산 서열 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질)과 관련하여 사용될 때 2 개 이상의 아미노산 서열의 조합을 지칭하고, 예를 들어 자연적으로 존재하지 않는 단일 아미노산 서열로의 화학적 결합 또는 재조합 수단에 의한 것을 지칭한다. 융합 아미노산 서열은 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 유전자 재조합에 의하여 생성될 수 있고, 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 작제물을 숙주세포 내로 도입하는 방법에 의하여 발현될 수 있다.
"스페이서"는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 잔기를 갖는 인공 아미노산 서열, 또는 5 내지 15, 20, 30, 50개 이상의 아미노산 잔기가 연결된 펩티드 결합에 의해 하나 이상의 폴리펩티드를 연결하는데 사용된다. 스페이서는 이차 구조를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 스페이서 서열은 당 업계에 공지되어 있으며, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure 2:1121-1123 (1994)를 예로 들 수 있다. 당 업계에 공지된 임의의 적합한 스페이서가 사용될 수 있다.
"항원 특이성"은 항원-결합 분자에 의해 선택적으로 인식되는 특정 항원 또는 이의 에피토프를 지칭한다.
"치환"은 아미노산 잔기와 관련하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 자연 발생 또는 유도된 대체된 것을 지칭한다. 폴리펩티드의 치환은 폴리펩티드의 기능을 감소, 향상 또는 제거할 수 있다.
"치환"은 또한 아미노산 서열과 관련하여 "보존적 치환" 일 수 있으며 아미노산 잔기를 유사한 물리 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미하거나 폴리펩티드의 활성에 중요하지 않은 아미노산의 치환을 의미한다. 예를 들어, 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu, 및 Ile, Pro, Phe, Trp), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Cys, Ser, Thr, Asn, Gly 및 Gln), 산성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Asp, Glu), 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, His, Lys 및 Arg), 베타-분 지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Thr, Val 및 Ile), 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Cys 및 Met), 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Trp, Tyr, His 및 Phe)중에서 보존적 치환이 이루어질 수 있다. 특정 실시예에서, "보존적 치환"은 치환, 결실 또는 첨가로 간주될 수 있다. 삽입 또는 결실된 아미노산의 수는 약 1 내지 5의 범위일 수 있다. 보존적 치환은 일반적으로 단백질 형태 구조에 중대한 변화를 일으키지 않으므로 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
"돌연변이"또는 "돌연변이된"은 아미노산 잔기와 관련하여 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 첨가를 지칭한다.
"T 세포"는 세포 매개 면역에 중요한 역할을 하는 림프구의 종류인 헬퍼 T 세포 포함(예를 들어, CD4 + T 세포, T 헬퍼 1 유형 T 세포, T 헬퍼 2 유형 T 세포, T 헬퍼 3 유형 T 세포, T 헬퍼 17 유형 T 세포), 세포 독성 T 세포 (예를 들어, CD8 + T 세포), 기억 T 세포 (예: 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포), 이펙터 메모리 T 세포 (TEM 세포 및 TEMRA 세포 및 상주 메모리 T 세포 (TRM) CD8 + 또는 CD4 +), 자연 살해 T (NKT) 세포 및 억제성 T 세포를 지칭한다.
천연 "T세포 수용체" 또는 천연 "TCR"은 신호 변환을 중재할 수 있는 복합체를 형성하기 위하여 불변 CD3 쇄와 연계된 이종이량체 T 세포 표면 단백질이다. TCR은 면역글로불린 수퍼 패밀리에 속하며, 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 갖는 반항체와 유사하다. 천연 TCR은 세포 외 부분, 막 통과 부분 및 세포 내 부분을 갖는다. TCR의 세포 외 도메인은 막-근위 불변 영역 및 막-말단 가변 영역을 갖는다.
"대상체", "개체", "동물" 또는 "환자"는 포유류 또는 영장류를 포함하는 인간 또는 비인간 동물이고, 질병 또는 장애의 진단, 예후, 개선, 예방 및/또는 치료가 필요한 경우를 지칭한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원용, 스포츠용, 또는 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 돼지, 소, 곰 등과 같은 애완용 동물을 포함한다.
이중특이적 폴리펩티드 복합체
일 양태에서, 본 발명은 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공한다. 상기 "이중특이적"은 2개의 항원-결합 모이어티가 있음을 의미하고, 이들 각각은 동일한 항원상의 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 제2 항원-결합 모이어티와 관련된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하고, 이들 중 하나는 CD3에 특이적으로 결합하고, 다른 하나는 CD19에 특이적으로 결합한다. 다시 말해서, 제1 항원-결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고 제2 항원-결합 모이어티는 CD19에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로, 제1 항원-결합 모이어티는 CD19에 특이적으로 결합할 수 있고 제2 항원-결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 제2 항원-결합 모이어티와 연계된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 제공하고, 상기:
제1 항원-결합 모이어티는 다음을 포함하고:
N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 제1 폴리펩티드, 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH1), 및 N-말단에서 C-말단까지를 포함하는 제2 폴리펩티드, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL1),
상기:
C1은 서열번호 1을 포함하는 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 서열번호 2를 포함하는 조작된 CAlpha를 포함하고,
서열번호 1의 아미노산 C48 및 서열번호 2의 아미노산 C41은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있고,
C1 및 C2는 이량체를 형성할 수 있고, 비천연쇄 이황화 결합은 이량체를 안정화시킬 수 있으며,
제2 항원-결합 모이어티는 다음을 포함하고:
항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 중쇄 가변 도메인 (VH2), 및
항체 경쇄 불변 (CL) 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 경쇄 가변 도메인 (VL2);
상기:
제1 및 제2 항원-결합 모이어티 중 하나는 항-CD3 결합 모이어티고, 다른 하나는 항-CD19 결합 모이어티이고,
항-CD3 결합 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래되고:
a) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, b) 서열번호 4를 포함하는 중쇄 CDR2, c) 서열번호 5를 포함하는 중쇄 CDR3, d) 서열번호 6을 포함하는 카파 경쇄 CDR1, e) 서열번호 7을 포함하는 카파 경쇄 CDR2 및 f) 서열번호 8을 포함하는 카파 경쇄 CDR3,
항-CD19 결합 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD19 항체로부터 유래되고:
a) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 CDR1, b) 서열번호 10을 포함하는 중쇄 CDR2, c) 서열번호 11을 포함하는 중쇄 CDR3, d) 서열번호 12를 포함하는 카파 경쇄 CDR1, e) 서열번호 13을 포함하는 카파 경쇄 CDR2, f) 서열번호 14를 포함하는 카파 경쇄 CDR3, 및
제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우에 비해 그렇지 않은 것보다 불일치되는 경향이 적다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 TCR 불변 영역으로부터 유래된 서열을 함유하는 제1 항원-결합 모이어티를 포함그러나, 제2 항원-결합 모이어티는 TCR 불변 영역으로부터 유래된 서열을 함유하지 않는다.
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 미스페어링된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 경향이 현저히 적다. 이론에 구애됨이 없이, 제1 항원-결합 모이어티의 안정화된 TCR 불변 영역은 서로 특이적으로 연계될 수 있고 따라서 의도된 VH1 및 VL1의 고도로 특이적인 쌍에 기여할 것으로 생각되며, 의도된 항원-결합 부위를 제공하지 않는 다른 가변 영역과 VH1 또는 VL1의 미스페어링을 유도하지 않는다.
특정 실시예에서, 제2 항원-결합 모이어티는 VH2에 작동 가능하게 연결된 항체 불변 CH1 도메인, 및 VL2에 작동 가능하게 연결된 항체 경쇄 불변 도메인을 추가로 포함한다. 따라서, 제2 항원-결합 모이어티는 Fab를 포함한다.
제1, 제2, 제3 및 제4 가변 도메인 (예를 들어, VH1, VH2, VL1 및 VL2)은 하나의 세포에서 발현되고, 바람직하게는 생성된 이중특이적 단백질 생성물이 정확한 항원-결합 특이성을 갖도록 VH1은 VL1과 특별히 쌍을 이루고, VH2는 VL2와 특별히 쌍을 이룬다. 그러나, 하이브리드-하이브리도마(또는 쿼드로마)와 같은 기존 기술에서 VH1, VH2, VL1 및 VL2의 임의 페어링은 결과적으로 최대 10 개의 다른 종을 생성하며, 이 중 하나만이 기능성 이중특이적 항원-결합 분자이다. 이는 잔기 생산 수율을 감소시킬 뿐만 아니라 목표 생성물의 정제를 복잡하게 한다.
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 가변 도메인이 제1 및 제2 항원-결합 모이어티 둘 다가 천연 Fab의 대응물인 경우에 비해 그렇지 않은 것보다 미스페어링되기 쉽다는 점에서 예외적이다. 일 예로서, 제1 항원-결합 도메인은 VL1-C2와 쌍을 이룬 VH1-C1을 포함하고, 제2 항원-결합 도메인은 VL2-CL과 쌍을 이루는 VH2-CH1을 포함한다. 놀랍게도 C1과 C2가 우선적으로 서로 연계되어 있음을 발견했으며, CL 또는 CH1과 연계되기 어려워 C1-CH, C1-CL, C2-CH 및 C2-CL과 같은 원치 않는 쌍의 형성은 권장되지 않으며 상당히 감소된다. C1-C2의 특정 연관의 결과로 VH1은 VL1과 특이적으로 쌍을 이루어 제1 항원 결합 모이어티가 되며, CH1은 CL과 특이적으로 쌍을 이루어, 제2 항원 결합 모이어티를 제공하는 VH2-VL2의 특이적 쌍을 가능하게 한다. 따라서, 제1 항원 결합 모이어티와 제2 항원 결합 모이어티는 미스페어링이 덜 발생하고, 예를 들어, VH1-VL2, VH2-VL1, VH1-VH2, VL1-VL2 사이의 미스페어링은 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 천연 Fab의 대응물이고, 예를 들어, VH1-CH1, VL1-CL, VH2-CH1 및 VL2-CL의 형태인 경우에 비해 달리 감소될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 세포에서 발현될 때 미스페어링 산물(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 미스페어링 산물이 적음) 및/또는 현저히 높은 생산 수율 (예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상 더 높은 수율)이 비슷한 조건에서 발현되는 기준 분자보다 크게 줄어들고, 상기 기준 분자는 C1 대신에 천연 CH1을, C2 대신에 천연 CL을 갖는 것을 제외하고는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 대한 것으로 동일하다.
조작된 CAlpha 및 CBeta를 포함하는 항원-결합 모이어티
상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티는 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 항체 중쇄 가변 도메인, 및 제2 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제1 항체 경쇄 가변 도메인으로 구성되며, 여기에서 제1 TCR 불변 영역 및 제2 TCR 불변 영역은 적어도 하나의 비-천연 쇄간 이황화 결합을 통해 연결된다. 제1 항원-결합 모이어티는 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이들 각각은 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 TCR로부터 유래된 불변 영역을 포함한다. 따라서, 제1 항원-결합 모이어티는 각각 한 쌍의 TCR 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티에서 한 쌍의 TCR 불변 영역은 알파/베타 TCR 불변 영역이다. 본 발명에 제공된 폴리펩티드 복합체의 TCR 불변 영역은 서로 연계되어 하나 이상의 비천연 이황화 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있다.
상기 제공된 적어도 하나의 비천연 이황화 결합을 갖는 제1 항원-결합 모이어티는 재조합적으로 발현될 수 있고 원하는 형태로 조립될 수 있으며 이는 항체 가변 영역의 우수한 항원-결합 활성을 제공하면서 TCR 불변 영역 이량체를 안정화시킨다. 또한, 제1 항원 결합 모이어티는 예를 들어, 당화 부위의 변형, 및 자연 서열의 제거 같은 일상적인 항체 조작을 잘 견디는 것으로 밝혀졌다.　또한, 상기 제공된 폴리펩티드 복합체는 이중특이적 포맷으로 통합될 수 있다. 이는 제1 항원-결합 모이어티에서 TCR 불변 영역의 존재로 인하여 항원-결합 서열에 실질적으로 미스페어링없이 쉽게 발현되고 조립될 수 있다. 상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티 및 구조물의 추가 장점은 하기 개시에서 더욱 명백해질 것이다.
요약하자면, 상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티는 N-말단에서 C-말단까지 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 N-말단에서 C-말단까지 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하며, 상기: C1은 서열번호 1을 포함하는 조작된 CBeta를 포함하며, C2는 서열번호 2를 포함하는 조작된 CAlpha를 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 C48 및 서열번호 2의 아미노산 C41은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있고, C1 및 C2는 이량체를 형성할 수 있으며 C1과 C2 사이의 비-천연 쇄간 이황화 결합은 이량체를 안정화 시킬 수 있다.
TCR 불변 영역
상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티는 TCR로부터 유래된 알파 또는 베타 불변 영역을 포함한다.
도 3a 및 3b는 TCR 알파의 천연 TCR 불변 영역 및 베타 쇄의 아미노산 서열을 제시한다. 명확성 및 일관성을 위해 이들 서열에서 각각의 아미노산 잔기는 도 4a 및 4b에 넘버링되어 있으며, 이러한 넘버링은 특정 TCR 불변 영역상의 특정 아미노산 잔기를 지칭하기 위하여 본 발명의 내용 전체에 걸쳐 사용된다.
인간 TCR 알파 쇄 불변 영역은 NCBI 수탁 번호 P01848, 또는 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 TRAC로 알려져 있다.
인간 TCR 베타 쇄 불변 영역에는 두 가지 변형인 TRBC1 및 TRBC2 (IMGT 명명법)이 있다(Toyonaga B, et al., PNAs, Vol. 82, pp.8624-8628, Immunology (1985) 참조). TRBC1 서열 (서열번호 33)은 본 발명에 개시된 폴리펩티드 복합체를 설계하기 위한 골격으로서 선택되었다.
구체적으로, 천연 TCR 베타 쇄는 위치 74에 천연 시스테인 잔기를 함유하며 (도 4b 참조) 이는 짝을 이루지 않아 고유 알파/베타 TCR에서 이황화 결합을 형성하지 않는다. 상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, TCR 베타 쇄의 위치 74에서 이 천연 시스테인 잔기는 알라닌 잔기로 돌연변이된다. 이는 잘못된 쇄내 또는 쇄간 페어링을 피하는 데 유용할 수 있다. 특정 실시예에서, 치환은 시험 관내에서 TCR 리폴딩 효율을 개선시킬 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티의 제1 및 제2 TCR 불변 영역은 이량체를 안정화시킬 수 있는 TCR 불변 영역 사이에 적어도 하나의 비-천연쇄간 이황화 결합을 포함하는 이량체를 형성할 수 있다.
용어 "이량체"는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 2개의 분자에 의해 형성된 연계 구조를 지칭하며 동종이량체 또는 동종이량체화는 두 개의 동일한 분자에 의해 형성된다. 이종이량체 또는 이종이량체화는 2개의 상이한 분자에 의해 형성된다. 제1 및 제2 TCR 불변 영역에 의해 형성된 이량체는 이종이량체이다.
본 발명에 있어 용어 "돌연변이된"은 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또또 첨가 및 상응하는 천연 TCR 불변 영역에서 그것의 천연 대응물 잔기와 상이한 것을 지칭한다. 예를 들어, 야생형 TCR 불변 영역에서 특정 위치의 아미노산 잔기를 "천연"잔기로 지칭하면, 그 돌연변이된 대응물은 천연 잔기와 다르지만 TCR 불변 영역상의 동일한 위치에 존재하는 임의의 잔기이다. 돌연변이된 잔기는 동일한 위치에서 천연 잔기를 대체하거나 천연 잔기 앞에 삽입되어 원래의 위치를 차지하는 상이한 잔기일 수 있다.
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하도록 조작되었다. 이러한 돌연변이된 잔기를 TCR 불변 영역에 도입하기 위해, TCR 영역을 코딩하는 서열은 예를 들어 돌연변이된 잔기를 코딩하는 코돈에 대해 천연 잔기를 코딩하는 코돈을 대체하거나, 천연 잔기의 코돈 앞에 돌연변이된 잔기를 코딩하는 코돈을 삽입할 수 있게 조작될 수 있다.
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역은 하나 이상의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함하도록 조작되어, 시스테인 잔기로 교체한 후, 비-천연 쇄간 이황화 결합은 2 개의 TCR 불변 영역 사이에 형성될 수 있다.
비-천연 쇄간 이황화 결합은 제1 항원-결합 모이어티를 안정화시킬 수 있다. 이러한 안정화 효과는 다양한 방식으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 아미노산 잔기 또는 비-천연 쇄 이황화 결합의 존재는 폴리펩티드 복합체가 안정적으로 발현될 수 있게 하고, 및/또는 높은 수준으로 발현될 수 있게 하고, 및/또는 원하는 생물학적 활성 (예를 들어, 항원 결합 활성)을 갖는 안정한 복합체에 회합하고, 및/또는 원하는 생물학적 활성을 갖는 높은 수준의 원하는 안정한 복합체로 발현 및 조립될 수 있다. 제1 및 제2 TCR 불변 영역을 안정화시키는 쇄간 이황화 결합의 능력은 당업계에 공지된 적절한 방법인 SDS-PAGE에 표시된 분자량 또는 시차 주사 열량 측정 (DSC) 또는 시차 주사 형광 측정 (DSF)에 의해 측정된 열 안정성을 사용하여 평가될 수 있다. 일 예로서, 상기 제공된 본원에 제공된 안정한 제1 항원-결합 모이어티의 형성은 생성물이 제1 및 제2 폴리펩티드의 조합된 분자량에 필적하는 분자량을 나타내는 경우 SDS-PAGE에 의해 확인될 수 있다. 특정 실시예에서, 본원에 제공된 제1 항원-결합 모이어티는 그의 열 안정성이 자연 Fab의 열 안정성의 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상이라는 점에서 안정적이다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티는 그의 열 안정성이 자연 Fab의 열 안정성과 유사하다는 점에서 안정적이다.
이론에 제한받지 않고, 제1 항원-결합 모이어티에서 제1 및 제2 TCR 불변 영역 사이에 형성된 비-천연 쇄 이황화 결합은 TCR 불변 영역의 이종이량체를 안정화시킬 수 있는 것으로 여겨지고, 이로써 정확한 폴딩 수준, 구조 안정성 및/또는 이종이량체 및 제1 항원-결합 모이어티의 발현 수준을 향상시킨다. T 세포 표면의 막에 고정된 천연 TCR과 달리 천연 TCR 세포 외 도메인의 이종이량체는 3D 구조에서 항체 Fab와의 유사성에도 불구하고 훨씬 덜 안정한 것으로 밝혀졌다. 실제로, 용해성 조건에서 천연 TCR의 불안정성은 결정 구조의 설명을 막는 중요한 장애물이 되어왔다 (Wang, Protein Cell, 5 (9), pp.649-652 (2014) 참조). TCR 불변 영역에 한 쌍의 시스테인 (Cys) 돌연변이를 도입함으로써 이에 의해 쇄간 비-천연 이황화 결합이 형성될 수 있고, 제1 항원-결합 모이어티는 안정적으로 발현될 수 있는 한편, 항체 가변 영역의 항원-결합 능력은 유지된다.
돌연변이된 잔기를 포함하는 TCR 불변 영역은 "조작된" TCR 불변 영역으로 지칭된다. 특정 실시예에서, 폴리펩티드 복합체의 제1 TCR 불변 영역 (C1)은 조작된 TCR 알파 쇄 (CAlpha)를 포함하고, 제2 TCR 불변 영역 (C2)은 조작된 TCR 베타 쇄 (CBeta)를 포함한다. 상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 조작된 CAlpha를 포함한다.
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 조작된 TCR 불변 영역은 제1 및/또는 제2 조작된 TCR 불변 영역의 접촉 계면 내에 하나 이상의 돌연변이된 시스테인 잔기를 포함한다.
"접촉 계면"은 폴리펩티드가 서로 상호작용/연계되는 폴리펩티드상의 특정 영역(들)을 지칭한다. 접촉 인터페이스는 상호작용이 발생할 때 접촉하거나 회합되는 상응하는 아미노산 잔기(들)와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 접촉 계면에서의 아미노산 잔기는 연속적인 서열일 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들어, 계면이 3차원인 경우, 계면 내의 아미노산 잔기는 선형 서열상의 상이한 위치에서 분리될 수 있다.
특정 실시예에서, 조작된 CAlpha와 조작된 CBeta 사이에 하나 이상의 이황화 결합이 형성될 수 있다. 특정 실시예에서, CBeta의 돌연변이된 시스테인 잔기는 S56C (서열번호 1의 아미노산 C48에 해당), CAlpha의 돌연변이된 시스테인 잔기는 T49C (서열번호 2의 아미노산 C41에 해당)이며, 시스테인 잔기 쌍은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있다.
본 발명에 있어 용어 TCR 불변 영역에 대한 "XnY"는 TCR 불변 영역상의 n번째 아미노산 잔기 X (상기 제공된 도 4a 및 4b의 넘버링에 기초함) 아미노산 잔기 Y로 대체되며, 여기서 X 및 Y는 각각 특정 아미노산 잔기의 1 문자 약어이다. 숫자 n은도 4a 및 4b에 제공된 숫자에 기초한 것이며 실제 위치와는 다르게 보일 수 있음에 유의해야 한다. 설명을 위해, 서열번호 1로 나타낸 CBeta (S56C) (N69Q)의 서열이 예로서 사용된다. 서열번호 1의 48 번째 잔기에서 S를 C로 치환하는 동안, 많은 잔기는 도 4b의 넘버링 시스템에 기초하여 56번째 잔기로 지정되며, 따라서 S에서 C 로의 치환은 S56C로 지정되지만 S48C는 아니다. 유사 하게, N에서 Q 로의 대체는 또한 도 4a 및 4b의 넘버링 시스템에 기초하여 N69Q로 지정된다. 아미노산 잔기 치환의 이러한 지정 규칙은 달리 명시되지 않는 한 본 개시 내용의 모든 TCR 불변 영역에 적용된다.
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 조작된 CBeta는 서열번호 1을 포함하거나, 조작된 CAlpha는 서열번호 2를 포함하거나 서열번호 2이다. 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열은 하기에 제공된다.
서열번호 1
EVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV C TDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
서열번호 2
AVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDK C VLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
상기 제공된 펩티드 복합체에서, 천연 TCR 불변 영역에 존재하는 하나 이상의 천연 글리코실화 부위는 본 개시에서 제공된 제1 항원-결합 모이어티에서 변형 (예를 들어, 제거)되었다. 폴리펩티드 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "글리코실화 부위"는 탄수화물 모이어티 (예를 들어, 올리고당 구조)가 부착될 수 있는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체와 같은 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 탄수화물 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 의미하고, 예를 들어, 트리펩타이드 서열 중 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌과 같은 아스파라긴 잔기이며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다. O-연결 글리코실화는 당 N-아실갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나가 하이드록시 아미노산에 부착된 것을 의미하며, 세린이나 트레오닌에 가장 일반적이다. 천연 글리코실화 부위의 제거는 (N-연결된 글리코실화 부위에 대해) 하나 이상의 상기 기재된 트리펩타이드 서열이 되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우)가 치환된다.
상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티에서, 예를 들어, 제1 및/또는 제2 TCR 불변 영역에서 하나 이상의 천연 글리코실화 부위가 조작된 TCR 불변 영역에 존재하지 않는다. 이론에 구애됨이 없이, 상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티는 단백질 발현 및 안정성에 영향을 미치지 않으면서 글리코실화 부위의 전부 또는 일부의 제거를 견딜 수 있는 것으로 여겨지며, CAlpha (즉, N34, N68 및 N79) 및 CBeta (즉, N69)와 같은 TCR 불변 영역에 N-연결 글리코실화 부위가 존재한다는 기존 교시와 달리 단백질 발현 및 안정성에 필요하다 (Wu et al., Mabs, 7:2, 364-376, 2015 참조).
상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티에서, N34, N68 및 N79에서 조작된 CAlpha의 N-글리코실화 부위는 존재하지 않는다. 글리코실화 부위가 없는 조작된 CAlpha 서열은 서열번호 2를 포함하거나 서열번호 2이다. 상기 제공된 제1 항원-결합 부위에서, N69에서 조작된 CBeta의 N-글리코실화 부위는 존재하지 않는다. 글리코실화 부위가 없는 조작된 CBeta 서열 (TRBC1)은 서열번호 1을 포함하거나 서열번호 1이다.
상기 제공된 제1 항원-결합 모이어티에서, TCR로부터 유래된 불변 영역은 항체로부터 유래된 가변 영역에 작동 가능하게 연결된다.
특정 실시예에서, 제1 항체 가변 도메인 (VH)은 제1 접합 도메인에서 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 융합되고, 제1 항체 가변 도메인 (VL)은 제2 접합 도메인에서 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 융합된다.
상기 사용된 "접합 도메인"은 2개의 아미노산 서열이 융합되거나 조합된 경계 또는 경계 영역을 지칭한다. 특정 실시예에서, 제1 결합 도메인은 항체 V/C 결합의 C 말단 단편의 적어도 일부를 포함하고, 제2 결합 도메인은 TCR V/C 결합의 N-말단 단편의 적어도 일부를 포함한다.
용어 "항체 V/C 접합"은 항체 가변 도메인 및 불변 도메인의 경계, 예를 들어 중쇄 가변 도메인과 CH1 도메인 사이의 경계 또는 경쇄 가변 도메인과 경쇄 불변 도메인 사이를 지칭한다. 이와 유사하게, 용어 "TCR V/C 접합"은 TCR 가변 도메인 및 불변 도메인의 경계, 예를 들어 TCR 알파 가변 도메인 및 불변 도메인 사이의 경계, 또는 TCRBeta 가변 도메인 및 불변 도메인 사이의 경계를 지칭한다.
특정 실시예에서, 제1 폴리펩티드는 화학식 I에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인: VH-HCJ-C1을 포함하는 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 화학식 II에서와 같이 작동 가능하게 연결된 도메인을 포함하는 서열: VL-LCJ-C2를 포함하고, 여기서:
VH는 항체의 중쇄 가변 도메인이고;
HCJ는 상기 정의된 바와 같은 제1 접합 도메인이고;
C1은 상기 정의된 바와 같은 제1 TCR 불변 도메인이고;
VL은 항체의 경쇄 가변 도메인이고;
LCJ는 상기 정의된 바와 같은 제2 접합 도메인이고;
C2는 상기 정의된 바와 같은 제2 TCR 불변 도메인이다.
이러한 실시예에서, C1은 서열번호 1을 포함하거나 서열번호 1인 조작된 CBeta이며, C2는 서열번호 2를 포함하거나 서열번호 2인 조작된 CAlpha이며, HCJ는 서열번호 23을 포함하거나 또는 서열번호 23인 것이며, LCJ는 서열번호 24를 포함하거나 서열번호 24인 것이다.
항체 가변 영역
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 제2 항원-결합 모이어티와 연계된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하고, 이 중 하나는 CD3과 특이적으로 결합하며, 나머지는 CD19와 특이적으로 결합한다. 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-결합 모이어티는 제1 중쇄 가변 도메인 (VH1) 및 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL1)을 포함하고, 제2 항원-결합 모이어티는 제2 중쇄 가변 도메인 (VH2) 및 제2 항체의 제2 경쇄 가변 도메인 (VL2)을 포함한다. 상기 제1 항체 및 제2 항체는 상이하며 항-CD3 항체 및 항-CD19 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 제1 항체는 항-CD3 항체이고, 제2 항체는 항-CD19 항체이다. 다른 특정 실시예에서, 제1 항체는 항-CD19 항체이고, 제2 항체는 항-CD3 항체이다.
통상적인 천연 항체에서, 가변 영역은 측면 프레임워크 (FR) 영역에 의해 개재된 3개의 CDR 영역, 예를 들어 N-말단에서 C-말단까지 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4을 포함한다.
a) 항-CD3 결합 모이어티
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-결합 모이어티 또는 제2 항원-결합 모이어티는 항-CD3 결합 모이어티이다. 특정 실시예에서, 항-CD3 결합 모이어티는 하기 표 1에 나타낸 항-CD3 항체 WBP3311_2.306.4-z1로부터 유래된다. WBP3311_2.306.4-z1 항체의 CDR 서열은 하기에 제공된다.
항체 ID: CDR1 CDR2 CDR3
WBP3311_2.306.4-z1 VH 서열번호 3 서열번호 4 서열번호 5
GFAFTDYYIH WISPGNVNTKYNENFKG DGYSLYYFDY
WBP3311_2.306.4-z1 VK 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8
KSSQSLLNSRTRKNYLA WASTRQS TQSHTLRT
WBP3311_2.306.4-z1 항체의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열은 하기에 제공된다.
WBP3311_2.306.4-z1-VH
아미노산 서열 (서열번호 15):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
핵산 서열 (서열번호 16):
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC
WBP3311_2.306.4-z1-VK
아미노산 서열 (서열번호 17):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
핵산 서열 (서열번호 18):
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG
CDR은 항원 결합을 담당하는 것으로 알려져 있다.
특정 실시예에서, 본원에 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 WBP3311_2.306.4-z1의 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 서열번호 5를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 중쇄 CDR3 영역은 항원-결합 부위의 중심에 위치하고, 따라서 항원과 가장 많이 접촉하고 항체와 항원의 친화도에 가장 많은 자유 에너지를 제공하는 것으로 여겨진다. 또한, 중쇄 CDR3은 길이, 아미노산 조성 및 다중 다양화 메커니즘에 의한 입체 구조 측면에서 항원 결합 부위의 가장 다양한 CDR인 것으로 여겨진다 (Tonegawa S., Nature. 302:575-81 (1983)). 중쇄 CDR3의 다양성은 대부분의 항체 특이성 (Xu JL, Davis MM., Immunity. 13:37-45 (2000)) 및 바람직한 항원-결합 친화도를 생성하기에 충분하다 (Schier R, et al., J Mol Biol. 263: 551-67 (1996)).
상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 항-CD3 결합 모이어티가 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 한 적합한 골격 영역 (FR) 서열을 추가로 포함한다.
인간화 항-CD3 항체 WBP3311_2.306.4-z1은 CD3-발현 세포 (예를 들어, CD4 T 세포)에 대한 특이적 결합 친화도를 갖으며 인간 T 세포를 활성화시키고 TNF 알파 및 IFN 감마의 사이토카인 방출을 유발할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 17을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티의 결합 친화도는 KD 값으로 나타낼 수 있고, 이는 항원과 항원-결합 분자 사이의 결합이 평형에 도달할 때 해리 속도 대 결합 속도 (koff/kon)의 비를 나타낸다.항원-결합 친화도 (예를 들어, KD)는 당업계에 공지된 적합한 방법을 사용하여 적절하게 결정될 수 있으며, 예를 들어, 유세포 분석법을 포함한다. 특정 실시예에서, 상이한 농도에서 항원에 대한 항체의 결합은 유세포 분석에 의해 결정될 수 있고, 결정된 평균 형광 강도 (MFI)는 먼저 항체 농도에 대해 플롯팅될 수 있으며, 특정 결합 형광 강도 (Y)의 의존성을 피팅 및 프리즘 버전 5 (GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 하나의 부위 포화 방정식으로의 항체 (X)의 농도 : Y = Bmax * X / (KD + X)으로 KD 값을 계산할 수 있으며, 여기서 Bmax는 시험 된 항체의 항원에 대한 최대 특이적 결합을 지칭한다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 세포 표면상에서 발현된 인간 CD3, 또는 재조합 인간 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다. CD3은 세포상에서 발현된 수용체이다. 재조합 CD3은 재조합적으로 발현되고 세포막과 관련이 없는 가용성 CD3이다. 재조합 CD3은 다양한 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 일 예로, 인간 CD3의 세포 외 도메인 (NP_000724.1) (Met1-Asp126)을 암호화하는 CD3 DNA 서열은 발현 벡터에서 C-말단의 폴리히스티딘 태그와 융합될 수 있으며, 이어서 293E 세포에서 형질감염 및 발현시키고 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
특정 실시예에서 상기 제공된 항-CD 결합 모이어티는 세포 표면에서 발현 된 인간 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 5x10-9 M 이하, 4x10-9 M 이하, 3x10-9 M 이하, 2x10-9 M 이하, 10-9 M 이하, 5x10-10 M 이하, 4x10-10 M 이하, 3x10-10 M 이하, 2x10-10 M 이하, 10-10 M 이하, 5x10-11 M 이하, 또는 4x10-11 M 이하, 3x10-11 M 이하, 또는 2x10-11 M 이하, 또는 10-11 M 이하로서 유세포 분석법에 의해 측정된 바와 같다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 시노몰구스 원숭이 CD3, 예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 시노몰구스 원숭이 CD3 또는 가용성 재조합 시노몰구스 원숭이 CD3과 교차-반응한다.
세포 표면에서 발현된 재조합 CD3 또는 CD3에 대한 항-CD3 결합 모이어티의 결합은 당업계에 공지된 방법인, 예를 들어, 샌드위치 분석법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석법 및 기타 결합 분석법에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 ELISA에 의해 EC50 (즉, 50% 결합 농도)의 0.01 nM 이하, 0.02 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.04 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.07 nM 이하 또는 0.08 nM 이하에서 특이적으로 결합하는 재조합된 CD3를 제공한다. 특정 실시예에서, 항-CD결합 모이어티는 유세포 분석법에 의해 EC50의 0.5 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.9 nM 이하, 1 nM 이하, 2 nM 이하, 3 nM 이하, 4 nM 이하, 5 nM 이하, 6 nM 이하, 7 nM 이하, 8 nM 이하, 9 nM 이하 또는 10 nM 이하에서 세포 표면에 발현된 인간 CD3에 특이적이게 결합한다.
특정 실시예에서, 항-CD3 결합 모이어티는 인간 CD3의 것과 유사한 결합 친화도로 시노몰구스 원숭이 CD3에 결합한다. 예를 들어, 예시적인 항체 WBP3311_2.306.4는 인간 CD3의 것과 유사한 친화도 또는 EC50 값으로 시노몰구스 원숭이 CD3에 결합한다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 ELISA 법에 의하여 0.001 nM 이하, 0.005 nM 이하, 0.01 nM 이하, 0.02 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.04 nM 이하, 또는 0.05 nM 이하의 EC50 값에서 재조합 시노몰구스 원숭이 CD3에 특이적으로 결합하였다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD3 결합 모이어티는 진단 및/또는 치료 용도를 제공하기에 충분한 인간 CD3에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는다. 다수의 치료 전략은 TCR 신호 전달을 표적화 함으로써, 특히 임상적으로 사용되는 항-인간 CD3 단일 클론 항체에 의해 T 세포 면역을 조정한다.
b) 항-CD19 항체
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-결합 모이어티 또는 제2 항원-결합 모이어티는 항-CD19 결합 모이어티이다. 특정 실시예에서, 항-CD19 결합 모이어티는 하기 표 B에 나타낸 항-CD19 항체 W7011-4.155.8-z1-P15로부터 유래된다. 항-CD19 항체의 CDR 서열은 하기에 제공된다.
　 CDR1 CDR2 CDR3
W7011-4.155.8-z1-P15 VH 서열번호 9 서열번호 10 서열번호 11
GYAFTSYNMY YIDPYNADTTYNQKFKG TAYAMDY
W7011-4.155.8-z1-P15 VK 서열번호 12 서열번호 13 서열번호 14
SASSTVNYMH STSNLAS HQWSSYPYT
WBP7011_4.155.8-z1-P15 항체의 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역 서열이 하기에 제공된다.
W7011-4.155.8-z1-P15-VH
아미노산 서열 (서열번호 19):
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS
핵산 서열 (서열번호 20):
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
W7011-4.155.8-z1-P15-VK
아미노산 서열 (서열번호 21):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK
핵산 서열 (서열번호 22):
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
CDR은 항원 결합을 담당하는 것으로 알려져 있다.
특정 실시예에서, 상기 항-CD19 결합 모이어티는 항-CD19 항체 W7011-4.155.8-z1-P15의 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 서열번호 11을 포함하는 중쇄 CDR3 서열을 포함한다. 중쇄 CDR3 영역은 항원-결합 부위의 중심에 위치하고, 따라서 항원과 가장 많이 접촉하는 것으로 여겨지며 항체에 대한 항원의 친화력에 가장 많은 자유 에너지를 제공한다. 중쇄 CDR3은 다수의 다양화 메카니즘에 의한 아미노산 조성 및 입체 형태의 길이 측면에서 항원 결합 부위의 가장 다양한 CDR인 것으로 여겨진다(Tonegawa S., Nature. 302 : 575-81 (1983)). 중쇄 CDR3의 다양성은 대부분의 항체 특이성 (Xu JL, Davis MM. Immunity. 13 : 37-45 (2000)) 및 바람직한 항원 결합 친화도를 생성하기에 충분하다 (Schier R, et al., J Mol Biol. 263 : 551-67 (1996)).
본 발명에 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 항-CD19 결합 모이어티가 CD19에 특이적으로 결합할 수 있는 한 적합한 프레임 워크 영역 (FR) 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 유세포 분석법에 의해 측정된 바와 같이 5x10-9 M 이하, 1x10-9 M 이하, 9x10-10 M 이하, 8x10-10 M 이하, 7x10-10 M 이하, 6x10-10 M 이하, 5x10-10 M 이하, 4x10-10 M 이하, 3x10-10 M 이하, 2x10-10 M 이하, 또는 1x10-10 M 이하의 결합 친화도(KD)로 세포 표면에서 발현된 인간 CD19에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 시노몰구스 원숭이의 CD19, 예를 들어, 세포 표면에서 발현된 시노몰구스 원숭이 CD19, 또는 가용성 재조합 시노몰구스 원숭이 CD19와 교차 반응한다.
세포에서 발현된 CD19에 대한 항-CD19 결합 모이어티는 당업계에 공지된 방법인, 예를 들어, 샌드위치 분석법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯, 유세포 분석법 및 기타 결합 분석법에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 유세포 분석법에 의해 측정한 0.01 nM 이하, 0.02 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.04 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.2 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.9 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 EC50 값으로 세포에서 발현된 인간 CD19에 특이적으로 결합한다.
특정 실시예에서, 항-CD19 결합 모이어티는 인간 CD19와 유사한 결합 친화도로 시노몰구스 원숭이 CD19에 결합한다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 유세포 분석법에 의해 0.2 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.8 nM 이하, 1 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 3 nM 이하 EC50 값으로 세포에서 발현된 시노몰구스 원숭이 CD19에 특이적으로 결합한다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 항-CD19 결합 모이어티는 Fab-Zap 분석에 의해 1 pM 이하, 2 pM 이하, 3 pM 이하, 4 pM 이하, 5 pM 이하, 6 pM 이하, 7 pM 이하, 8 pM 이하 9 pM 이하, 10 pM 이하, 11 pM 이하, 12 pM 이하, 13 pM 이하, 14 pM 이하, 15 pM 이하, 16 pM 이하 17 pM, 18 pM 이하, 19 pM 이하, 20 pM 이하, 21 pM 이하, 22 pM 이하, 23 pM 이하, 24 pM 이하, 25 pM 이하 30 pM 이하, 35 pM 이하, 40 pM 이하, 45 pM 이하, 또는 50 pM 이하 EC50에서 CD19-발현 세포에 의해 내재화된다.
이중특이적 폴리펩티드 복합체
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 2가, 3가, 4 가와 같은 다가이다. 상기 사용된 용어 "가"는 주어진 분자에서 특정 수의 항원 결합 부위의 존재를 지칭한다. 이와 같이, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항원-결합 분자에서 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 2개의 결합 부위가 모두 동일한 항원 또는 동일한 에피토프의 특이적 결합에 대한 경우 2가 분자는 단일 특이적일 수 있다. 유사하게, 3가 분자는 예를 들어 2개의 결합 부위가 제1 항원 (또는 에피토프)에 대해 단일 특이적이고 제3 결합 부위가 제2 항원 (또는 에피토프)에 대해 특이적인 경우 이중특이적일 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제1 및/또는 제2 항원-결합 모이어티는 2가, 3가 또는 4가일 수 있으며, 동일한 항원 또는 에피토프에 특이적인 2개 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 이는 특정 실시예에서, 1가 대응물보다 항원 또는 에피토프에 더 강한 결합을 제공한다. 특정 실시예에서, 2가 항원-결합 모이어티에서, 1가의 결합 부위, 2가의 결합 부위는 구조적으로 동일하며 (즉, 동일한 서열을 가짐), 또는 구조적으로 상이하다 (즉, 동일한 특이성을 갖지만 상이한 서열을 가짐).
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 다가이며 스페이서와 함께 또는 스페이서없이 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
특정 실시예에서, 제2 항원 결합 모이어티는 제2 항체의 둘 이상의 Fab를 포함한다. 2개의 Fab는 서로 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 예를 들어 제1 Fab는 사이에 스페이서가 있거나 또는 없는 중쇄를 통해 제2 Fab에 공유적으로 부착될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 항원-결합 모이어티는 제1 이량체화 도메인에 연결되고, 제2 항원 결합 모이어티는 제2 이량체화 도메인에 연결되어 있다. 상기 사용된 용어 "이량체화 도메인"은 서로 결합하여 이량체를 형성할 수 있는 펩티드 도메인을 지칭하고, 또는 일부 예에서, 2개의 펩티드의 자발적인 이량체화가 가능하다.
특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제2 이량체화 도메인과 연계될 수 있다. 회합은 임의의 적합한 상호작용 또는 연결 또는 결합, 예를 들어, 커넥터, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기 상호작용, 염다리 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통한 것일 수 있다. 일 예로 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역, 항체 CH2 도메인, 항체 CH3 도메인, 및 이량체화 및 서로 회합 할 수 있는 다른 적합한 단백질 단량체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인은 임의의 항체 이소형, 예컨대 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 유래될 수 있다.
"이황화 결합"는 구조 R-S-S-R'과의 공유 결합을 지칭한다. 아미노산 시스테인은 예를 들어 다른 시스테인 잔기로부터 제2 티올기와 이황화 결합을 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 이황화 결합은 2개의 폴리펩티드 쇄 상에 각각 존재하는 2개의 시스테인 잔기의 티올기 사이에 형성될 수 있어 쇄간 가교 또는 쇄간 결합을 형성할 수 있다.
수소 결합은 수소 원자가 질소, 산소 또는 불소와 같은 전기 음성도가 높은 원자에 공유 결합될 때 두 극성 그룹 사이의 정전기적 인력에 의해 형성된다. 수소 결합은 골격 산소 (예를 들어, 칼코겐기) 사이의 폴리펩티드 및 각각의 Asn의 질소기 및 His의 산소기, 또는 Asn의 산소기 및 Lys의 질소기 등의 2개의 잔기의 아미드 수소(질소 기)에 의해 형성될 수 있다. 수소 결합은 반데르발스 상호작용보다 강하나 공유 또는 이온 결합보다 약하며 2차 구조 및 3차 구조를 유지하는 데 중요하다. 예를 들어,　아미노산 잔기의 간격이 위치 i와 i+4 사이에서 규칙적으로 발생하고, 베타 시트가 3-10 개 아미노산 길이의 펩티드 쇄의 스트레치인 경우 2개의 펩티드가 2개 또는 3개의 백본 수소 결합에 의해 결합될 때, 꼬인 주름 시트를 형성하는 알파 나선이 형성된다.
정전기 상호작용은 비-공유 상호작용이며 단백질 폴딩, 안정성, 유연성 및 이온성 상호작용, 수소 결합 및 할로겐 결합을 포함하는 기능에 중요하다. 정전기적 상호작용은 폴리펩티드에서, 예를 들어 Lys와 Asp 사이, Lys와 Glu 사이, Glu와 Arg 사이, 또는 제1 쇄의 Glu, Trp와 제2 쇄의 Arg, Val 또는 Thr 사이에서 형성될 수 있다.
염 다리는 근거리 정전기 상호작용이며 주로 Asp 또는 Glu의 음이온 성 카르복실레이트 및 Lys의 양이온성 암모늄 또는 Arg의 구아니디늄에서 발생하며 이는 천연 단백질 구조에서 공간적으로 근접한 쌍으로 대향 하전된 잔기이다. 대부분 소수성 계면에서 하전된 극성 잔기는 결합을 위한 핫스팟으로서 작용할 수 있다. 그 중에서도 His, Tyr 및 Ser와 같은 이온화 가능한 측쇄를 갖는 잔기도 염다리의 형성에 참여할 수 있다.
소수성 상호작용은 제1 쇄 상의 하나 이상의 Val, Tyr 및 Ala와 제2 쇄 상의 하나 이상의 Val, Leu 및 Trp, 또는 제1 쇄 상의 His 및 Ala 및 제2 쇄 상의 Thr 및 Phe 사이에서 형성될 수 있다(Brinkmann, et al, 2017, Supra 참조).
특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 힌지-Fc 영역의 적어도 일부, 즉 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함한다. 특정 실시예에서, 제1 이량체화 도메인은 제1 TCR 불변 영역의 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-결합 모이어티의 항체 CH1 불변 영역의 C 말단에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, C1은 조작된 CBeta를 포함하고, 제1 이량체화 도메인은 서열번호 25를 포함하는 제3 결합 도메인에서 조작된 CBeta에 작동 가능하게 연결된다.
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서 제1 이량체화 도메인은 조작된 TCR 불변 영역의 C-말단에 작동 가능하게 연결되어 있고, 함께 키메라 불변 영역을 형성한다. 다시 말해, 키메라 불변 영역은 조작된 TCR 불변 영역과 작동 가능하게 연결된 제1 이량체화 도메인을 포함한다.
특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래된 제1 힌지-Fc 영역에 부착된 조작된 CBeta를 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 실시예 2에 제공된다.
특정 실시예에서, 키메라 불변 영역은 제1 항체 CH2 도메인 및/또는 제1 항체 CH3 도메인을 추가로 포함한다. 예를 들어, 키메라 불변 영역은 제3 결합 도메인의 C-말단에 부착된 제1 항체 CH2-CH3 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 키메라 불변 영역의 예시적인 서열은 실시예 2에 제공된다.
이러한 키메라 불변 영역 및 제2 TCR 불변 도메인 쌍이 유용하며 이들은 상기 개시된 폴리펩티드 복합체를 제공하기 위해 원하는 항체 가변 영역에 융합되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 가변 영역은 키메라 불변 영역 (C1 포함)에 융합될 수 있고, 이에 의해 상기 제공된 폴리펩티드 복합체의 제1 폴리펩티드 쇄를 제공하는 단계; 및 이와 유사하게, 항체 경쇄 가변 영역은 제2 TCR 불변 도메인 (C2를 포함 함)에 융합 될 수 있고, 이에 의해 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체의 제2 폴리펩티드 쇄를 제공한다.
특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 항체, 예컨대 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 이량체화 도메인은 임의로 항체 CH2 도메인 및/또는 항체 CH3 도메인, 예를 들어 힌지-Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다. 힌지 영역은 제2 항원 결합 부위 (예를 들어 Fab)의 항체 중쇄에 부착될 수 있다.
이중특이적 폴리펩티드 복합체에서 제1 및 제2 이량체화 도메인은 이량체로 결합될 수 있다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하며 동종 이량체화를 방해하고 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연관시킨다. 예를 들어, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 동일하지 않도록 선택될 수 있고 그들 내에 동종이량체를 형성하기보다는 서로간에 이종이량체를 우선적으로 형성한다는 것이다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀, 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 친수성 상호작용 또는 증가된 유연성의 형성을 통해 이종이량체로 결합될 수 있다.
특정 실시예에서, 제1 및 제2 이량체화 도메인은 놉-인투-홀을 형성할 수 있도록 각각 돌연변이된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함한다. 놉은 첫 번째 CH2/CH3 폴리펩티드에서 작은 아미노산 잔기를 더 큰 것으로 대체함으로써 얻어 질 수 있으며, 큰 잔기를 더 작은 것으로 대체함으로써 구멍을 얻을 수 있다. 손잡이 구멍에 대한 돌연변이 부위에 대한 자세한 내용은 Ridgway 등 (1996), 위의 Spiess 등 (2015) 및 Brinkmann 등 (2017)을 참조한다.
이중특이적 포맷
상기 제공된 폴리펩티드 복합체에서, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티는 Ig-유사 구조와 관련된다. Ig-유사 구조는 항원-결합을 위한 2개의 아암 및 연계 및 안정화를 위한 1개의 줄기를 갖는 Y형 구조물을 갖는 자연 항체와 유사하다. 자연 항체와의 유사성은 우수한 생체 내 약동학, 원하는 면역 학적 반응 및 안정성 등과 같은 다양한 이점을 제공할 수 있다. 상기 제공된 제2 항원-결합 모이어티와 연계된 본원에 제공된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는 Ig-유사 구조는 Ig (예를 들어, IgG)의 그것과 필적하는 열 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 Ig-유사 구조는 천연 IgG의 구조의 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 이상이다.
본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다 :i) VH1-C1-힌지-CH2-CH3; ii) VL1-C2; iii) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3; 및 iv) VL2-CL, 여기서 C1 및 C2는 하나 이상의 비-천연 쇄간 결합을 포함하는 이량체를 형성 할 수 있고, 2개의 힌지 영역 및/또는 2개의 CH3 도메인은 이량체화를 촉진할 수 있는 하나 이상의 쇄간 결합을 형성할 수 있다.
상기 개시된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 생체 내 반감기가 길고 다른 형식의 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 비교할 때 제조하기가 상대적으로 더 쉽다.
이중특이적 복합체 서열
일부 실시예에서, 이중특이적 복합체의 제1 항원-결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 항원-결합 모이어티는 CD19에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 실시예에서, 이중특이적 복합체의 제1 항원-결합 모이어티는 CD19에 특이적으로 결합할 수 있으며, 제2 항원 결합 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 실시예 2에 나타낸 바와 같이 4개의 폴리펩티드 서열: 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 29 (E17)의 조합을 포함한다. 특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 실시예 2에 나타낸 바와 같이 4개의 폴리펩티드 서열: 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 30 (F16)의 조합을 포함한다. 이러한 실시예에서, 제1 항원 결합 모이어티는 CD3에 결합하고, 제2 항원 결합 모이어티는 CD19에 결합한다. E17의 설계는 이중특이적이고, 2가 항체이고, F16의 설계는 2회 반복되는 항-CD19 항체 Fab를 갖는 이중특이적 및 3가 항원-결합 복합체이다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 다음을 포함하는 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다: i) 제1 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH1; ii) 제2 키메라 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VL1; iii) 통상적인 항체 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VH2, 및 iv) 통상적인 항체 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 VL2. 특정 실시예에서, 제1 키메라 불변 영역은 각각 상기 정의된 바와 같은 C1-힌지-CH2-CH3을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 키메라 불변 영역은 상기 정의된 바와 같이 C2를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 통상적인 항체 중쇄 불변 영역은 각각 상기 정의된 바와 같은 CH1-힌지-CH2-CH3을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 통상적인 항체 경쇄 불변 영역은 상기 정의된 바와 같이 CL을 포함할 수 있다.
제조 방법
본 발명은 폴리펩티드 복합체를 인코딩하는 단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 제공된 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체를 제공한다.
"핵산"또는 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보 핵산 (DNA) 또는 리보 핵산 (RNA) 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 이의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 천연 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 별도의 표시가 없는 한 특정 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환), 대립 유전자, 오르쏘로그, SNP 및 상보적 서열뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 변성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-기재 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batter et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
상기 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 인코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술을 사용하여 구축될 수 있다. 이를 위해, 모 항체 (예를 들어, CDR 또는 가변 영역)의 항원-결합 모이어티를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)를 사용하여 단리 및 서열 분석될 수 있다. 마찬가지로, TCR 불변 영역을 인코딩하는 DNA가 또한 수득될 수 있다. 예로서, 가변 도메인 (VH)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 제1 TCR 불변 영역 (C1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 수득될 수 있으며 숙주 세포에서의 전사 및 발현이 제1 폴리펩티드를 생성하도록 작동 가능하게 연결된다. 유사하게, VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에서 제2 폴리펩티드의 발현을 허용하기 위해 C1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 필요한 경우, 하나 이상의 스페이서에 대한 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 것은 또한 원하는 생성물의 발현을 허용하기 위해 다른 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다.
인코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 조절 서열에 추가로 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 선택적으로 발현 벡터에서 제1 및 제2 폴리펩티드의 발현 또는 생산이 실현 가능하고 적절한 제어 하에 있도록 한다.
인코딩 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 벡터에 삽입될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 당업계에 공지된 상동 재조합에 의해 생성될 수 있다. 많은 벡터를 사용할 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: 신호 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, EF-1α) 및 전사 종결 서열.
"벡터"는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 그 단백질의 발현을 야기하도록 작동 가능하게 삽입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 전형적으로, 구조물은 또한 적절한 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자는 가이드 RNA 및/또는 부위 지향적 변형 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 암호화하고, 숙주 세포에서 원하는 전사체/유전자를 발현할 수 있는 방식으로 인코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열의 5'-플랭킹 영역에 위치한 조절 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 숙주 세포 내에서 운반하는 유전자 요소가 발현되도록 숙주 세포를 형질전환, 형질 도입 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 효모 인공 염색체 (YAC)와 같은 인공 염색체, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체 (PAC), 람다 파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로 사용되는 동물 바이러스의 범주에는 레트로바이러스 (렌티 바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연계 바이러스, 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스 및 파포바이러스 (예를 들어, SV40)가 포함된다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 가능한 요소 및 리포터 유전자를 포함하여, 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한 벡터는 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 바이러스 입자, 리포좀 또는 단백질 코팅을 포함하나 이에 제한되지 않는 세포로의 진입을 돕는 물질을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 벡터 시스템은 포유동물, 박테리아, 효모 시스템 등을 포함하고, 이에 제한되지 않는 PALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABA, pWPXL p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 등 플라스미드 및 기타 실험적 및 상업적으로 이용 가능한 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연계 바이러스)를 포함할 수 있다.
상기 제공된 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 사용된 어구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.
본 발명의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵생물, 효모 또는 고급 진핵생물 세포이다. 이 목적에 적합한 원핵생물은 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 진균, 예를 들어, 대장균, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라 등의 대장균과 같은 장내 세균, 구체적인 예를 들어, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 (Serratia), 세라티아 마르케스칸 (Serratia marcescans), 시겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실러스 (B. subtilis 및 B. licheniformis), 녹농균 (P. aeruginosa)과 같은 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyce)를 포함한다.
원핵생물에 더하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물은 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 인코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 제빵 효모는 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주가 일반적으로 이용 가능하며 여기에 유용한 균주는 예컨대 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 예를 들어, K. 락티스(K. lactis), K. 프라질리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), K. 위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), K. 왈티(K. Waltii)(ATCC 56,500), K. 드로소필라럼(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)과 같은 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 숙주 K. 써모톨란스 및 K. 마르크시누스; 야로위아 (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 리시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로 스포라크레사; 슈와니오미세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 슈와니오미세스(Schwanniomyces); 및 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라듐 및 아스페르길루스숙주, 예컨대 A. 니둘란스 및 A. 니제르와 같은 사상균을 포함한다.
상기 제공된 글리코실화된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(캐터필라), 아에데스 애집티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 상응하는 허용 가능한 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 캘리포니아(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용 가능하며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따른 바이러스로서 사용될 수 있으며, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
그러나, 척추 동물 세포에 대한 관심이 가장 높았으며, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인(현탁 배양에서 성장을 위해 서브 클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), Expi293과 같은; 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR　(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 : 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 : 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포 주 (Hep G2)을 포함한다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양 물도 숙주로서 이용될 수 있다.
숙주 세포는 상기 제시한 발현으로 형질전환되거나, 클로닝 벡터는 프로모터의 유도, 형질전환체의 선택 또는 클로닝 벡터의 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.
상기 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 생산을 위해, 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham 's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM), (Sigma)와 같은 시판되는 배지는 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 다른 배지로 Ham et al., Meth. Enz 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem에 설명되어 있다. 102:255 (1980), U.S. Pat. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 번호. Re. 30,985는 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이러한 배지는 다음과 같이 필요한 경우 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCINTM 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로 몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 포도당 또는 동등한 에너지원이 보충될 수 있다. 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 조건이며, 당업자에게 명백할 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 및 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법을 제공하고, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건하에서 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 다음과 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제조 방법을 제공한다. a) 숙주 세포에 도입: N-말단에서 C-말단을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 항원-결합 모이어티를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, N-말단에서 C-말단을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 항원-결합 모이어티를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH), N-말단에서 C-말단을 포함하는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 제2 항원-결합 모이어티를 암호화하는 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드, 상기: C1은 서열번호 1을 포함하는 조작된 CBeta를 포함하고 C2는 서열번호 2를 포함하는 조작 된 CAlpha를 포함하고, C1은 서열번호 1을 포함하는 조작된 CBeta를 포함하고,C2는 서열번호 2를 포함하는 조작된 CAlpha를 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 C48, 서열번호 2의 아미노산 C41은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있으며, C1 및 C2는 이량체를 형성할 수 있으며, 비-천연 쇄간 이황화 결합은 C1 및 C2의 이량체를 안정화시킬 수 있으며, 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티 둘 다가 천연 Fab 대응물인 경우와 달리 미스페어링 형성을 감소시켰으며, 제1 항체는 제1 항원 특이성을 가지며, 제2 항체는 제2 항원 특이성을 가지며, b) 숙주 세포가 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하게 하는 단계.
특정 실시예에서, 상기 방법은 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
재조합 기술을 사용할 때, 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 세포 내, 주변 세포질 공간에서 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 생성물이 세포 내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 잔해물은 예를 들어 원심 분리 또는 한외 여과에 의해 제거된다. 카터(Carter) 등의 Bio/Technology 10:163-167 (1992)은 대장균의 주변 세포질 공간으로 분비되는 항체를 분리하는 절차를 기술하고 있다. 간단히 말해서, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에서 해동시킨다. 세포 파편은 원심 분리로 제거할 수 있다. 생성물이 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 초여과 장치를 사용하여 먼저 농축된다. PMSF와 같은 단백질 분해 효소 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위한 임의의 상기 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적인 오염 물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 염석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되어 세포로부터 제조된 것일 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다.
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 경우, 이어서, 단백질 A는 폴리펩티드 복합체에 존재하는 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 친화성 리간드로서 사용될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 폴리펩티드 복합체의 정제에 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스이지만 다른 매트릭스도 이용 가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리 (스티렌디비닐) 벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 빠른 유속과 짧은 처리 시간을 허용한다.
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커 본드 ABX 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 이온 교환 컬럼에서의 분류, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼)상의 헤파린 SEPHAROSETM 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전에 대한 크로마토그래피는 회수할 항체에 따라 이용 가능하다.
예비 정제 단계(들) 후에, 관련있는 폴리펩티드 복합체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5-4.5의 pH에서 용리 완충제를 사용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있으며, 바람직하게는 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행된다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 통상적인 방법을 사용하여 고수율로 용이하게 정제될 수 있다. 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 장점 중 하나는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열 사이의 유의미하게 감소 된 부정합이다. 이는 원치 않는 부산물의 생성을 감소시키고 비교적 간단한 정제 공정을 사용하여 고수율로 고순도 생성물을 얻을 수 있게 한다.
유도체
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 원하는 접합체와의 접합 염기로서 사용될 수 있다.
다양한 접합체가 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 연결될 수 있는 것으로 고려된다 (예를 들어, "접합 백신", 미생물학 및 면역학에 대한 기여, J. M. Cruse 및 R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989) 참조). 이들 접합체는 다른 방법들 중에서도 공유 결합, 친화성 결합, 삽입, 좌표 결합, 착화, 연계, 배합 또는 첨가에 의해 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 연결될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 하나 이상의 접합체에 결합하기 위해 사용될 수 있는 에피토프 결합 부분 외부의 특정 부위를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기, 예를 들어 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 포함하여 접합체에 대한 공유 결합을 촉진할 수 있다.
특정 실시예에서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 예를 들어 다른 접합체 또는 링커를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 접합체에 연결될 수 있다.
예를 들어, 시스테인과 같은 반응성 잔기를 갖는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 반응성 기가 예를 들어 말레이미드, 요오도아세트아미드, 피리딜 디설파이드 또는 다른 티올-반응성 접합 파트너 (Haugland, 2003, Molecular Probes, Inc.의 Fluorescent Probe and Research Chemicals의 분자 프로브 핸드북; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; 수단 (1990) 생물 접합체 화학 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671) 에 연결될 수 있다.
다른 예를 들어, 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 비오틴에 접합된 후 아비딘에 접합된 제2 접합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 접합체에 추가로 연결되는 링커에 연결될 수 있다. 링커의 예는 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오 네이트 (SPDP), 숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (디메틸아디피데이트 HCl 등) , 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙시니미딜수레레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르 알데히드), 비스-아지도 화합물(비스(p-아지도 벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄유도체 (비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민 등) 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 히스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 과 같은 이작용성 커플링제를 포함한다. 특히 바람직한 커플링제는 N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-숙시니미딜-4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP)이며 이황화 결합을 제공한다.
접합체는 검출 가능한 표지, 약동학적 변형 모이어티, 정제 모이어티 또는 세포 독성 모이어티일 수 있다. 검출 가능한 표지의 예는 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 단실, 피코에리트린 또는 텍사스 레드), 효소 기질 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루리페라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당산화 효소 또는 β-D-갈락토시다제), 방사성 동위 원소 라벨 (예를 들어, 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 111In, 112In, 14C, 64Cu, 67Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi,32P, 기타 란타나이드 및 발광 라벨), 발색 모이어티, 디곡시제닌, 비오틴/아비딘, DNA 분자 또는 검출용 금을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 접합체는 항체의 반감기를 증가시키는 것을 돕는 PEG와 같은 약동학적 변형 모이어티일 수 있다. 다른 적합한 중합체로는 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌글리콜/프로필렌글리콜의 공중합체 등이 포함된다. 특정 실시예에서, 접합체는 자기 비드와 같은 정제 모이어티일 수 있다. "세포 독성 모이어티"는 세포에 유해하거나 세포를 손상시키거나 사멸시킬 수 있는 임의의 제제일 수 있다. 세포 독성 모이어티의 예는 비제한적으로 탁솔, 시토칼라신 B, 그램시딘 D, 에티디움브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 미톡산트론, 미트로마이신, 악티노마이신 D, 1-데코카이코스 테론리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로 마이신 및 그의 유사체, 항대사 물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실데카바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU)) 및 로무스틴 (BSNU) CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모마톨, 스트렙토조토신, 미토이신 C 및 시스-디클로로 디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이포머) , 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC), 및 유사 분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함할 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.
항체, 면역글로불린 또는 이의 단편과 같은 단백질에 대한 접합체의 접합 방법은 예를 들어, 미국 특허 4,029,096; 5,208,020; 미국 특허 6,441,163; WO2005037992; WO2005081711; 및 WO2006/034488의 전체를 참조하여 본 발명에 포함된다.
제약 조성물
본 개시 내용은 또한 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 제약 상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
"약제 학적으로 허용되는"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들) 및/또는 염이 일반적으로 제형을 포함하는 다른 성분과 화학적으로 및/또는 물리적으로 양립 가능하고, 그의 수용자와 생리적으로 양립 가능함을 나타낸다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외의 약제학적 제형의 성분을 말하며, 이는 생체 활성이 허용되고 대상체에게 무독성이다. 상기 제공된 제약 조성물에 사용하기 위한 제약상 허용되는 담체는　예를 들어, 제약상 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 완충제, 산화 방지제, 마취제, 현탁제/용해제, 격리제 또는 킬레이트제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 비-독성 보조 물질, 당업계에 공지된 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 포함한다.
적합한 성분은 예를 들어 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향료, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예를 들어 당 및 시클로덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 산화 방지제는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 제공된 제약 조성물에 메티오닌과 같은 하나 이상의 산화 방지제를 포함시키면 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 산화가 감소된다. 이러한 산화 감소는 결합 친화력의 손실을 방지 또는 감소시켜 단백질 안정성을 개선하고 저장 수명을 최대화한다. 따라서, 특정 실시예에서, 개시된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하는 조성물이 제공된다.
추가로 설명하기 위해, 제약상 허용되는 담체는 예를 들어 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장성 덱스트로스 주사제, 멸균수 주사제 또는 덱스트로스 및 수유 링거 주사제와 같은 수성 비히클, 식물성 기원의 고정 오일과 같은 비수성 비히클, 면화씨 오일, 옥수수 유, 참기름 또는 땅콩 유, 정균 또는 진균성 농도의 항균제, 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 등장제, 인산 또는 시트 레이트 완충액과 같은 완충제, 중황산나트륨과 같은 산화 방지제, 프로카인 염산염과 같은 국소 마취제, 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨, 히드록시프로필 메틸룰로오스 또는 폴리비닐 피롤리돈과 같은 현탁 및 분산제, 폴리소르베이트 80 (TWEEN-80)과 같은 유화제, EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA (에틸렌리콜테트라 아세트산)와 같은 유화제 또는 에틸 알코올, 폴리에틸렌리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함할 수 있다. 담체로 사용되는 항균제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 다중-용량 용기 내의 제약 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 비독성 보조 물질은 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해성 증강제, 또는 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노 라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 또는 시클로덱스트린과 같은 제제를 포함할 수 있다.
제약 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유제, 환제, 캡슐, 정제, 서방형 제제 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 표준 등급의 담체, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 폴리비닐피롤리돈, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 제약 조성물은 주사용 조성물로 제제화된다. 주사용 제약 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 생성하기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사용 제제에는 주사용 멸균 및/또는 비 열분해 용액, 멸균 건조 가용성 제품, 예를 들어, 피하 정제, 주사용 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 배합될 수 있는 멸균 건조 불용성 제품, 및 멸균 및/는 비-용해를 포함하는, 사용 직전에 용매와 조합 될 수 있는 동결 건조된 분말과 같은 고온 에멀젼을 포함할 수 있다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
특정 실시예에서, 단위 용량 비경구 제제는 바늘이 있는 앰풀, 바이알 또는 주사기에 포장된다. 비경구 투여를 위한 모든 준비는 멸균되어야 하고 발열성이 아니어야 하며 당업계에 공지되고 실시되는 바와 같아야 한다.
특정 실시예에서, 멸균 동결 건조된 분말은 상기 제공된 바와 같은 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 분말로부터 제조된 분말 또는 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학적 성분을 개선시키는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 물, 덱스트로스, 소르비탈, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 포도당, 수크로스 또는 다른 적합한 제제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 용매는 완충액, 예를 들어 시트레이트, 나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 일 실시 예에 따라 약 중성 pH에서 당업자에게 공지된 다른 완충액을 함유할 수 있다. 후속 멸균 용액 여과 후 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서 동결 건조하여 바람직한 제제를 제공한다. 일 실시예에서, 생성된 용액은 동결 건조를 위해 바이알로 분류될 것이다. 각각의 바이알은 단일 용량 또는 다중 용량의 폴리펩티드 복합체, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체 또는 그의 조성물을 함유할 수 있다. 동결 건조된 분말의 재구성은 비경구 투여에 사용하기 위한 제형을 제공한다. 일 실시예에서, 재구성을 위해 멸균 및/또는 비열수 또는 다른 액체 적합한 담체가 동결 건조된 분말에 첨가된다. 정확한 양은 선택된 치료법에 따라 달라지며 경험적으로 결정될 수 있다. 용량 또는 용량 세트 (예를 들어, 약 10%)에 필요한 것보다 소량의 바이알을 과충진하는 것은 정확한 샘플 회수 및 정확한 투여를 용이하게 하기 위해 허용된다. 동결 건조된 분말은 약 4 ℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건하에 저장될 수 있다.
동결 건조된 분말의 재구성은 비경구 투여에 사용하기 위한 제제를 제공한다. 일 실시예에서, 재구성을 위해 멸균 및/또는 비열수 또는 다른 액체 적합한 담체가 동결 건조된 분말에 첨가된다. 정확한 양은 선택된 치료법에 따라 달라지며 경험적으로 결정될 수 있다.
치료 방법
치료적 유효량의 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체를이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 상태 또는 장애를 치료 또는 예방하는 것을 포함하는 치료 방법이 또한 제공된다. 특정 실시예에서, 대상체는 본원에 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 반응하기 쉬운 장애 또는 상태를 갖는 것으로 확인되었다.
"치료하는" 또는 "치료"는 상태의 예방 또는 완화, 상태의 발병 또는 발병 속도의 둔화, 상태의 발병 위험 감소, 상태와 관련된 증상의 발병의 지연 또는 지연, 상태와 관련된 증상을 감소 또는 종료, 상태의 전체 또는 부분 회귀 생성, 상태 치료 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 치료적 유효량은 해당 기술 분야에 알려진 다양한 요소에 따라 예를 들어, 체중, 연령, 과거 병력, 현재 약물, 대상체의 건강 상태 및 교차 반응, 알레르기, 민감성 및 부작용의 가능성, 뿐만 아니라 질병 발생 경로 및 투여 경로에 따라 의존된다. 복용량은 이들 및 다른 환경 또는 요구 사항에 의해 지시된 바와 같이 당업자 (예를 들어, 의사 또는 수의사)에 의해 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg (예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg 또는 약 100 mg/kg)으로 투여될 수 있다. 이들 실시예 중 일부에서, 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고 이들 중 특정 실시예에서, 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 실시예에서, 투여량은 치료 과정에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시예에서 초기 투여량은 후속 투여량보다 높을 수 있다. 특정 실시예에서, 투여량은 대상체의 반응에 따라 치료 과정에 따라 달라질 수 있다.
투약 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 또는 몇 개의 분할 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있다.
상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 당업계에 공지된 임의의 경로인 예를 들어, 비경구 (예를 들어, 피하, 복강 내, 정맥 내, 정맥 내 주입, 근육 내 또는 피내 주사를 포함) 또는 비경구 (예를 들어, 경구, 비강 내, 안내, 설하, 직장 또는 국소) 경로와 같은 것에 의해 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 의해 치료되는 상태 또는 장애는 암 또는 암 상태, 자가 면역 질환, 감염성 및 기생충 질환, 심혈관 질환, 신경 병증, 신경 정신병적 상태, 상해, 염증 또는 응고 장애이다.
본 발명에 있어서 사용된 "암"또는 "암의 상태"는 종양성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이에 의해 매개되는 임의의 의학적 상태를 말하며, 고형암 및 비고형암, 예컨대 백혈병을 모두 포함한다. 상기 사용된 "종양"은 고형의 종양 및/또는 악성 세포를 지칭한다.
암과 관련하여, "치료하는" 또는 "치료"는 종양성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이를 억제 또는 둔화시키거나, 종양성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이, 또는 이들의 일부 조합의 발달을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭할 수 있다. 종양과 관련하여, "치료하는"또는 "치료하는"은 종양의 전부 또는 일부를 근절하고, 종양 성장 및 전이를 억제 또는 늦추거나, 종양의 발달을 예방 또는 지연하는, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
예를 들어, 암을 치료하기 위한 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 사용과 관련하여, 치료 유효량은 종양의 전부 또는 일부를 근절할 수 있는 폴리펩티드 복합체의 용량 또는 농도, 암성 질환을 매개하는 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 종양 성장 억제 또는 둔화, 종양 세포 전이 억제, 종양 또는 암성 상태와 관련된 증상 또는 마커 개선,종양 또는 암성 질환의 발병 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합이다.
특정 실시예에서, 병태 및 장애는 종양 및 암인 예를 들어, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 신장 세포암, 결장 직장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 진균 곰팡이, 메르켈 세포암, 다른 혈액 악성종양, 예컨대 고전적 호지킨 림프종 (CHL), 원발 종격동 성 큰 B-세포 림프종, T-세포/조직구가 풍부한 B-세포 림프종, EBV-양성 및-음성 PTLD, EBV-연계 확산성 큰 B-세포 림프종 (DLBCL), 형질 모세포 림프종, 림프절 외 NK/T-세포 림프종, 비인두 암종, HHV8-연계 1차 삼출 림프종, 호지킨 림프종, 1차 CNS 림프종과 같은 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 척추 축 종양, 뇌간 신경 교종을 포함한다.
특정 실시예에서, 상태 및 장애는 CD19-관련 상태, 예컨대 B 세포 림프종, 임의로 호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종을 포함하며, 여기서 비호지킨 림프종은 다음을 포함한다: 확산성 큰 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 한계 구역 B-세포 림프종 (MZL), 점막-연계 림프 조직 림프종 (MALT), 소 림프구성 림프종 (만성 림프모구 백혈구 림프종), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 급성 림프 모구 백혈병 (ALL) 또는 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 (WM).
이중특이적 폴리펩티드 복합체는 단독으로 또는 하나 이상의 추가 치료 수단 또는 제제와 함께 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 암이나 종양 또는 진행성 질병 치료에 사용될 때 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 화학 요법, 방사선 요법, 암 치료를 위한 수술 (예를 들어, 종양 절제술)과 조합하여 투여될 수 있고, 화학 요법으로 인한 합병증에 대한 하나 이상의 구토제 또는 다른 치료, 또는 암 또는 관련된 의학적 장애의 치료에 사용하기 위한 임의의 다른 치료제로 투여될 수 있다. 상기 사용된"조합 투여"는 동일한 제약 조성물의 일부로서 동시에, 개별 조성물로서 동시에, 또는 별도의 조성물로서 상이한 시점에 투여하는 것을 포함한다. 조성물 및 제2 작용제가 상이한 경로를 통해 투여되더라도, 다른 작용제 이전 또는 이후에 투여되는 조성물은 본 발명에서 사용되는 어구로서 본 발명에서 사용되는 바와 같이 그 작용제와 "조합하여"투여되는 것으로 간주된다. 가능한 경우, 상기 제공된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체와 함께 투여되는 추가의 치료제는 추가 치료제의 제품 정보 시트에 열거된 스케줄에 따라, 또는 의사의 업무 참조 (Physicians 'Desk Reference, 70th Ed (2016)) 또는 당업계에 잘 알려진 프로토콜에 따라 투여된다.
특정 실시예에서, 치료제는 암에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 종양 백신을 사용하여 특정 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 사이토카인 요법은 또한 면역계에 대한 종양 항원 제시를 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 사이토카인 요법의 예는 인터페론-α, -β 및 -γ와 같은 인터페론, 대식세포-CSF, 과립구 대식세포 CSF 및 과립구-CSF와 같은 콜로니 자극 인자, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, 및 IL-12와 같은 인터루킨, TNF-α 및 TNF-β 같은 종양 괴사 인자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 면역 억제 표적을 불활성화하는 작용제, 예를 들어, TGF-베타 억제제, IL-10 억제제 및 Fas 리간드 억제제가 또한 사용될 수 있다. 다른 약제 그룹이 포함하는 종양 또는 암 세포에 대한 면역 반응을 활성화시키는 약제는, 예를 들어, 이들은 T 세포 활성화 (예를 들어, CTLA-4, ICOS 및 OX-40과 같은 T 세포 공동 자극 분자의 작용제)를 향상시키고, 이들은 수지상 세포 기능 및 항원 제시를 향상시킨다.
키트
상기 개시는 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시예에서, 키트는 생물학적 샘플에서 하나 이상의 관심의 표적의 존재 또는 수준을 검출하거나, 또는 포획 또는 농축하는데 유용하다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 키트는 검출 가능한 표지와 접합된 본원에 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 키트는 본원에 제공된 비표지 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하고, 상기 제공된 비표지 이중특이적 폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 2차 표지된 항체를 추가로 포함한다. 키트는 사용 설명서, 및 키트의 각 성분을 분리하는 패키지를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 제공된 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 기질 또는 장치와 연계된다. 유용한 기판 또는 장치는 예를 들어 자성 비드, 마이크로 타이 터 플레이트 또는 테스트 스트립일 수 있다. 이는 생물학적 시료에서 표적 분자를 포획 또는 농축하는 결합 분석 (예를 들어, ELISA), 면역학적 분석이 유용할 수 있다.
하기 실시예는 청구된 발명을 더 잘 설명하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이하에 기술된 모든 특정 조성물, 재료 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범위 내에 속한다. 이들 특정 조성물, 재료 및 방법은 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 단지 본 발명의 범주 내에 속하는 특정 구체예를 예시하기 위한 것이다. 당업자는 본 발명의 능력을 행사하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 동등한 조성물, 재료 및 방법을 개발할 수 있다. 본 발명의 범위 내에 여전히 남아있는 동안 본원에 기술된 절차에서 많은 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 변형이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이 본 발명자들의 의도이다.
본 발명은 폴리펩티드 복합체의 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티를 함유하는 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체, 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체의 제조 방법, 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체를 사용하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법, 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이중특이적 항-CD3 x CD19 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물을 제공한다.
도 1은 연구된 항체 포맷의 개략도를 제시한다. 항-CD3 항체 T3 및 항-CD19 항체 U4가 개발되었다. T3의 불변 도메인 (CL 및 CH1)을 TCR의 불변 도메인으로 대체하여 규칙적인 항체에 직교하는 독특한 경쇄 인터페이스를 설계하였다. Fc 도메인에서 "놉-인투-홀" 돌연변이와 함께 TCR- 변형 T3 및 천연 U4를 사용하여 이중특이적 항체 포맷 E17 및 F16을 설계하였다.
도 2a 내지 2d는 융합 항체 Fv 및 TCR 불변 영역에서 안내를 제공하는 항체 Fv 모델 및 TCR 구조의 중첩된 형태를 제시한다. 도 2a는 자체적으로 개발된 항-CD3 항체 T3의 서열에 기초하여 구축된 항체 Fv 구조 모델을 제시한다. 그림 2b는 PDB 4L4T의 TCR 구조를 보여준다. 도 2c는 상이한 배향으로 TCR 가변 영역에 중첩된 항체 Fv 구조 모델을 제시한다. 거친 키메라 단백질은 도 2d에 도시된 바와 같이 중첩된 형태에서 TCR 가변 도메인을 제거함으로써 생성되었다. 접합 범위에서 중첩된 잔기는 접합 영역을 설계하는 데 도움이 되었다. 항체 VL 쇄 및 TCR 알파 쇄는 백색으로 채색되었다. VH 및 베타 쇄는 검은 색으로 채색되었다.
도 3a는 돌연변이된 시스테인 잔기를 갖는 천연 TCR 알파 쇄의 서열 및 이에 대응하는 서열을 나타낸 것이다. TRAC_Human은 알파 체인 불변 도메인의 천연 서열이다. 4L4T_Alpha_Crystal은 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있는 S55C 돌연변이를 갖는 결정 구조 (PDB 코드 4L4T)의 서열이다. 회색 영역은 본 발명에서 키메라 단백질의 골격으로서 사용되는 불변 영역이다.
도 3b는 천연 TCR 베타 쇄의 서열 및 돌연변이된 시스테인 잔기를 갖는 그의 대응 서열을 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 N-글리코실화가 제거된 TCR CA1pha 및 CBeta 불변 영역의 서열 및 넘버링을 나타낸 것이다. 도 4a는 TCR 알파 불변 영역의 서열 및 넘버링을 나타낸 것이다. 도 4b는 TCR 베타 불변 영역의 서열 및 넘버링을 나타낸 것이다.
도 5는 시노몰구스-CD19로 형질 감염된 세포주 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 및 CHO-K1 모 세포주의 유세포 분석 히스토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. M: 단백질 마커; 레인 1: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, 비환원; 레인 3: W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP, 환원.
도 7은 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4의 SEC-HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 8은 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. M: 단백질 마커; 레인 1: W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, 비환원; 레인 2: W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP, 환원.
도 9는 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 SEC-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 FACS로 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 Ramos 세포 (도 10a) 및 Jurkat 세포 (도 10b)에 대한 결합을 나타낸다.
도 11a 및 11b는 FACS로 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 Ramos 세포 (도 11a) 및 Jurkat 세포 (도 11b)에 대한 결합을 나타낸다.
도 12는 FACS로 시노몰구스 CD19 발현 세포에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 나타낸다.
도 13은 ELISA로 시노몰구스 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 나타낸다.
도 14a 및14b는 Ramos (도 14a) 및 Jurkat (도 14b) 세포에 대한 결합에 의해 측정된 바와 같이, 인간 CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 친화도를 나타낸다.
도 15a 및 15b는 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 CD19 및 CD3에 대한 이중 결합 (도 15a); 및 음성 대조군 (도 15b) 을 나타낸다.
도 16a 및 16b는 Raji 세포에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 세포 독성 활성 (도 16a) 및 Raji 세포에서 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 세포 독성 활성 (도 16b)을 나타낸다.
도 17a 내지 17d는 CD19+ 표적 세포의 존재 또는 부재하에, T 세포에서의 CD69 및 CD25 발현을 나타낸다. CD4+ T 세포 서브 세트에서 CD69 발현 T 세포의 백분율 (도 17a); CD8+ T 세포 서브 세트에서의 CD69+ 발현 T 세포의 백분율 (도 17b); CD4+ T 세포 서브 세트에서 CD25 발현 T 세포의 백분율 (도 17c); CD8+ T 세포 서브 세트에서 CD25 발현 T 세포의 백분율 (도 17d).
도 18a 내지 18d는 CD19+ 표적 세포의 존재 또는 부재하에, T 세포의 IFN-γ 및 TNF-α 사이토카인 방출을 나타낸다. CD4+ T 세포 서브 세트에서 IFN-γ의 방출 (도 18a); CD4+ T 세포 서브 세트에서 TNF-α의 방출 (도 18b); CD8+ T 세포 서브 세트에서 IFN-γ의 방출 (도 18c); CD8+ T 세포 서브 세트에서 TNF-α의 방출 (도 18d).
도 19a 및 19b는 인간 혈청에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 안정성을 나타낸다. 지시된 날에 혈청 배양된 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 샘플의 Ramos 세포에 결합 (도 19a)한 것; 지시된 날에 혈청 배양된 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 샘플을 Jurkat에 결합 (도 19b)한 것.
도 20은 ELISA로 W1438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 C1Q에 대한 결합을 나타낸다. 대조군으로서 IgG1 항체를 사용하였다.
도 21은 상이한 용량으로 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP를, Raji 이종 이식편 종양을 갖는 혼합된 PBMC 인간화 마우스에 투여한 후의 종양 부피 추적을 나타낸다. 실험값은 그룹의 평균을 나타내며, 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 관련없는 IgG4 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 22는 1 mg/kg의 단일 용량 후, 시노몰구스 원숭이 혈청에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 농도를 나타낸다. 두 원숭이로부터의 혈청 샘플은 ELISA에 의해 검출되었다.
도 23a 및 23b는 원숭이 #1에서 (그림 23a), 원숭이 #2 (도 23b)의 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 전-복용 (predose) 및 후-복용 (postdose)을 모두 포함하여, 혈청 샘플에서의 항-약물 항체 (ADA)를 나타낸다.
실시예 1: 항체 및 TCR 키메라 단백질의 설계 및 조작
TCR 서열
TCR은 2개의 사슬로 구성된 이종이량체 단백질이다. 약 95 %의 인간 T 세포는 알파 및 베타 쇄로 구성된 TCR을 갖는다. 베타 쇄 TRBC1에 대해 더 많은 결정 구조가 이용 가능하다는 것을 고려하여, TRBC1 서열이 "WuXiBody"에 개시된 폴리펩티드 복합체를 설계하기 위한 주요 골격으로서 선택되었다. TRBC1의 전형적인 아미노산 서열은 Protein Data Bgank (PDB) 구조 4L4T에서 찾을 수있다.
TCR의 쇄간 이황화 결합
TCR 결정 구조는 WuXiBody 설계를 안내하기 위해 사용되었다. T 세포 표면의 막에 고정된 천연 TCR과 달리, 가용성 TCR 분자는 3D 구조가 항체 Fab와 매우 유사하지만, 덜 안정적이다. 사실상, 용해성 조건에서 TCR의 불안정성은 결정 구조의 해명을 막는 큰 장애물이었다 (상기, Wang 2014). 우리는 TCR 불변 영역에 한 쌍의 Cys 돌연변이를 도입하는 전략을 채택하였고, 이는 쇄의 조립을 현저하게 개선하고 발현을 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
항체 가변 및 TCR 불변 도메인을 연결하는 연결부, 이들의 상대적인 융합 배향, 및 Fc-연결하는 연결부는 모두, 안정하고 기능적인 WuXiBody를 만들기 위해 조심스럽게 정밀하게 조정되었다. TCR 구조는 항체 Fab와 매우 유사하기 때문에, TCR 가변 영역 (PDB 4L4T, 도 2)에 항체 Fv 상동성 모델을 중첩시켰다. 중첩된 구조는 항체 Fv가 TCR 불변 도메인과 구조적으로 양립 가능함을 나타낸다. 이 구조적 정렬과 해당 서열을 기반으로 모든 조작 매개 변수가 설계되었다. 적합한 결합 영역은 실시예 2에 개시되어 있다.
실시예 2: 이중특이적 항-CD13 x CD19 WuXiBody
시노몰구스 원숭이 CD19를 발현하는 세포주 생성
인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD19의 전장 (full-length) 유전자를 pcDNA3.3 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 각각의 발현 벡터를 리포펙타민 2000을 사용하여 각각 CHO-K1 세포로 형질 감염시켰다. 세포를 10 % FBS와 함께 F12-K에서 배양하였다. 블라스티시딘을 형질 감염 24 내지 48 시간 후에 첨가하였다. 2 내지 3 회의 계대 후, 세포는 PE 접합된 항-CD19 항체 및 항-PE 마이크로비드 (Miltenyi-013-048-801)에 의해 농축되었다. 희석을 제한함으로써 안정한 단일 세포 클론을 단리하고 항-CD19 항체를 사용하여 FACS에 의해 비교 (screening)하였다.
표적-발현 종양주
Raji 및 Jurkat 세포는 ATCC로부터 유래한다. Ramos 세포는 ECACC에서 유래한다. 모든 종양 세포를 RPMI1640/10 % FBS에서 배양하였다.
WuXiBody W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 생성
VL, VH, Ck, CH1 유전자는 기존의 자체 DNA 주형으로부터 PCR에 의해 증폭되었다. CAlpha 및 CBeta 유전자는 Genewiz Inc.에 의해 합성되었다. 천연 항-CD19 또는 항-CD3 키메라 경쇄 유전자를 CMV 프로모터 및 카파 신호 펩티드를 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 항-CD3 VH-CBeta의 DNA 단편을 놉 돌연변이로 인간 IgG4S228P 불변 영역 CH2-CH3을 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 항-CD19 VH-CH1의 DNA 단편을 홀 돌연변이로 인간 IgG4S228P 불변 영역 CH2-CH3을 함유하는 선형화된 벡터에 삽입하였다. 벡터는 CMV 프로모터 및 인간 항체 중쇄 신호 펩티드를 함유한다.
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 발현 및 정제
중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 제조사의 지시에 따라 Expi293 발현 시스템 키트 (ThermoFisher-A14635)를 사용하여 Expi293 세포로 공동 형질 감염시켰다. 형질 감염 5 일 후, 상청액을 수집하고 단백질 A 컬럼 (GE Healthcare-17543802) 및 추가적인 크기 배제 컬럼 (GE Healthcare-17104301)을 사용하여 단백질을 정제하였다. 항체 농도는 나노 드롭 (Nano Drop)에 의해 측정되었다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC에 의해 평가되었다.
FACS에 의한 표적 결합
CD3- 및 CD19-발현 세포에 대한 이중특이적 항체의 결합은 각각 Jurkat 및 Ramos를 사용하여 평가되었다. 비-관련 항체를 이소형 대조군으로서 사용하였다. 세포를 웰 당 105세포의 밀도인 96-웰 플레이트 (Corning-3799)에 펼치고 PBS/1 % BSA로 세척하였다. 항체를 연속 희석하고 4 ℃에서 1시간 동안 세포와 함께 배양하였다. PE-접합된 염소 항-인간 IgG Fc 항체 (Jackson-109-115-098)를 검출에 사용하였다. 세척 및 재현탁 후, 세포를 유세포 분석 (Canto II, BD Biosciences)에 의해 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. Prism GraphPad 소프트웨어로 4-파라미터 비선형 회귀 분석을 사용하여 EC50 값을 계산하였다.
시노몰구스 CD3에 대한 결합
시노몰구스 CD3에 대한 CD3 x CD19 이중특이적 항체의 결합을 단백질 결합 ELISA로 시험하였다. 96-웰 고 단백질 결합ELISA 플레이트 (Nunc MaxiSorp, ThermoFisher, Thermo-442404)는 탄산-중탄산염 완충액 (20 mM Na2CO3, 180 mM NaHCO3, PH 9.2)에서 100 ul의 시노몰구스 CD3 입실론 단백질 (농도: 1 ug/mL, Acro, #CDE-C5226)과 함께 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 모든 웰을 PBS/0.5 ? 트윈-20 (v/v)의 웰당 300 uL로 1회 세척하였다. 이어서, 웰을 PBS/2 % BSA (BOVOGEN, #BSAS)의 웰당 200 uL로 실온에서 1시간 동안 차단하고, PBS/0.5 % 트윈 -20 (v/v)의 웰당 300 uL로 3회 세척하였다. 1 차 항체 결합을 위해, PBS/2 % BSA에 연속 희석된 CD3 x CD19 이중특이적 항체를 관련 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 100 ul/mL 2차 항체 염소 항-인간 IgG Fc-HRP (Bethyl, # A80-304P)를 첨가하기 전과 같이 플레이트를 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 전술한 바와 같이 6회 세척하였다. 결합 검출을 위해, 100 ul 2 M HCl과의 반응을 중지시키기 전에, 100 ul 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액 (Sigma-860336)을 실온의 암실에서, 10분 동안 모든 웰에 처리하였다. 시노몰구스 CD3에 대한 이중특이적 항체 결합도는 SpectraMax® M5e 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 OD450 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 적절하다고 판단되는 곳에서, 결합 EC50 값은 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하는 4-파라미터 비선형 회귀 분석에 의해 얻어졌다.
시노몰구스 CD19에 대한 결합
CHOK1 세포상에서 발현된 시노몰구스 CD19 표적 단백질에 대한 CD3 x CD19 이중특이적 항체의 결합을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 간략히, 시노몰구스 CD19가 과발현된 안정한 세포주 (WBP701.CHOK1.cPro1.C9, WuXi Biologics)를 트립신으로 수확하고 1 x 106 세포/mL 까지 1 % BSA/1XPBS로 희석하였다. 1 x 105 세포/웰 (100 ul)을 96-웰 U-플레이트 (Corning, #3799)의 각 웰에 첨가하고, 상청액을 제거하기 전에 1500rpm (Eppendorf, #5810R)에서 5분 동안 원심 분리하였다. 1 % BSA/1XPBS로 연속 희석된 항체를 펠렛 세포에 100 ul/웰로 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 관련 없는 hIgG4 항체를 이소형 대조군으로 사용하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심 분리하여 180 ul/웰, 1 % BSA/1XPBS로 2회 세척하였다. 펠렛화된 세포를 100 ul/웰, 형광-표지된 항-인간 IgG Fc 항체 (Jackson, #109-115-098)로 4℃에서 30 분 동안 어두운 곳에서, 1 % BSA/1XPBS로 1:150 비율로 재현탁하였다. 이어서, 세포를 상기 기재된 바와 같이 2 회 세척하였다. 최종 세척 후, 세포를 80 ul의 1 % BSA/1X PBS에 재현탁하고 FACS Canto II 세포 계측기 (BD Biosciences)로 형광값을 측정하였다. 평균 형광 (MFI)을 측정함으로써 세포 표면에 결합된 항-CD19&CD3 이중특이적 항체의 양을 평가하였다. FACS 미가공 데이터는 FlowJo 소프트웨어에 의해 분석되었고, 항체가 없거나 이차 항체만을 함유하는 웰은 백그라운드 형광을 확립하는데 사용되었다. 결합 EC50 값은 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하는 4-파라미터 비선형 회귀 분석에 의해 얻어졌다.
FACS에 의한 친화성
CD3 및 CD19에 대한 결합 친화도는 각각 Jurkat 및 Ramos 세포를 사용하는 유세포 분석에 의해 결정되었다. 세포를 5 x 104 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-바닥 플레이트 (BD)로 옮겼다. 시험 대상 항체를 1 % 1XPBS/1 % BSA에 1:2 비율로 연속 희석하고 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 이어서, 플레이트를 1500 rpm에서 4분 동안 원심 분리하고 상청액을 버렸다. 2차 항체인, Alexa647이 접합된 염소 항-인간 IgG Fc (Jackson, Cat #109-605-098) 또는 FITC 가 접합된 염소 항-His (Bethyl, Cat #A190-113F)를 재현탁된 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 1회 세척하고 100 ul 1XPBS/1 % BSA에 재현탁하였다. 유세포 분석법 (BD Canto II)에 의해 형광 강도를 측정하고 FlowJo에 의해 분석하였다. 형광 강도는 정량 비드 (QuantumTM MESF Kits, Bangs Laboratories)에 기초하여 결합된 분자/세포로 변환되었다. KD는 Graphpad Prism5에 의해 계산되었다.
표적 세포에서의 이중-결합
CD3 T 세포 및 CD19 B세포를 가교시키는 이중특이적 항체의 능력을 FACS로 시험하였다. Jurkat 세포 및 Raji 세포를 37 ℃에서 30분 동안 1 x 106 세포/mL의 밀도로 20 nM CellTrace Far Red (인비트로젠-C34564) 및 50 nM Calcein-AM (인비트로젠-C3099)으로 사전에 구분 표지하였다. 사전 표지된 세포 펠렛을 PBS/1 % BSA로 2회 세척한 다음, 최종 밀도 1 x 106 세포/mL에 1:1 비율로 혼합하였다. 세포 혼합물을 원심 분리하고 10 nM 항체로 재현탁한 후 1시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 직후에 유세포 분석법으로 세포 혼합물을 분석하였다. 가교 백분율은 표지된 Far-Red 및 Calcein을 통해 동시에 결합 백분율이 계산되었다.
세포 독성 분석
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 헤파린 정맥혈로부터 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare-17-1440-03) 밀도 원심 분리에 의하여 새롭게 단리하였다. 이어서, 수득된 PBMC를 CD8+ T 세포의 농축을 위해 EasySep (Stemcell-19053) 컬럼을 통과시켰으며, 이를 이펙터 세포로서 사용하였다. CD8+ T 세포에 의한 종양 세포 용해를 매개하는 항체의 효능을 유세포 분석에 의해 결정하였다. 세포 독성 분석에서, 표적 세포로서의 Raji CD19 B 세포를 37 ℃에서 30분 동안 20 nM CellTrace Far Red (Invitrogen-C34564)로 사전표지한 후, 1% FBS가 보충된 페놀-프리 RPMI 1640 (Invitrogen- 18355030)로 세포 펠렛을 2회 세척하였다. 원적외선 염색된 Raji (웰당 20000 세포)를 분리된 CD8+ T 세포 (이펙터/표적 세포 비율 5:1) 및 37 ℃에서 연속 희석된 항체와 함께 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Corning-3799)에서 배양하였다. 4시간 인큐베이션한 후, 3 uM 프로피듐 요오다이드 (PI, Invitrogen-P3566)를 죽은 세포를 확인하기 위해 철저히 혼합하였다. 15 분 후, 세포를 FACSCanto II 세포 측정기를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다. Ab-매개 세포 독성은 Far Red-양성 표적 세포에 대한 PI-양성 표적 세포의 백분율로 정의될 수 있다. 세포 독성의 EC50을 프리즘 (Prism)을 사용하여 측정하였다.
T 세포 활성화 분석-분비된 시토카인 TNFa 및 IFNr
T 세포의 활성화 여부는 상청액에 분비된 TNFa 및 TNFr 의 양에 의하여 영향을 받는다. CD4 및 CD8 양성 T 세포의 단리 절차는 "T 세포 활성화 (세포내 사이토카인 TNFa&IFNr 염색)" 부분에 기술되어 있다. Raji 인간 B 세포 (2 x 104 세포/웰), CD4 또는 CD8 T 세포 (1 x 105 세포/웰) 및 항체의 혼합물을 37 ℃에서 24 시간 동안 공동 배양하였다. 상청액을 수집한 후, 반응 혼합물을 1500 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하였다. 상청액에서의 TNFa 및 IFNr의 양은 인간 TNF ELISA 세트 (R & D-DY210) 및 인간 IFNr ELISA 세트 (포획 항체: Thermo Fisher-M700A, 탐지 항체: Thermo Fisher-M701B, 표준 물질: PEROTECH-300-02)에 의하여 결정될 수 있다.
샌드위치 ELISA의 절차는 다음과 같다. 키트에 따라 96-웰 고단백질 결합 ELISA 플레이트 (ThermoFisher-442404)를 탄산염-중탄산염 완충액 (20mM Na2CO3, 180mM NaHCO3, pH 9.2) 중 50 ul/웰 포획 항체로 4 ℃ 또는 실온에서 밤새 코팅하였다. 모든 웰을 PBS/0.5 % 트윈-20 (v/v)의 웰당 300 ul로 3회 세척하고 분석에서 후속 세척 단계를 동일하게 수행하였다. INFa에 대하여 PBS/2 % BSA (BovoGen Biologicals-BSAS) 및 IFNr에 대하여 100 % 카제인 (Pierce-37528)으로 웰을 1시간 동안 고정한 다음, 세 번 세척하였고, 수집된 상청액 또는 표준 물질 (50 ul/웰)을 실온에서 1시간 동안 결합시킨 후 3회 세척하였다. 이어서, 상청액 또는 표준 물질 (50 ul/웰)을 실온에서 1시간 동안 결합시킨 후 3회 세척하였다. 검출 항체 결합을 위해 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 TNFa를 위한 PBS/2 % BSA로 희석된 상응하는 항체 및 IFNr를 위한 50 % 카제인이 관련있는 웰에 첨가되었다. 2차 항체 SA-HRP 50ul를 첨가하기 전에 플레이트를 3회 세척하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 전술한 바와 같이 6 회 세척하였다. 검출을 위해, 50 ul 테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질 용액 (Sigma-860336)을 10 분 동안 모든 웰에 첨가한 후, 50 ul 2 M HCl과의 반응을 정지시켰다. TNFα 및 IFN micro의 양은 SpectraMax® M5e 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 OD450 흡광도를 측정함으로써 결정되었다.
T 세포 활성화 분석-표면 마커 CD25 및 CD69 발현
T 세포의 활성화 여부는 표면 수용체 CD25 및 CD69의 염색 신호에 의해 반영되었다. CD4 및 CD8 양성 T 세포의 단리 절차는 "T 세포 활성화 (세포 내 사이토카인 TNFa & IFNr 염색)" 부분에 기술되어 있다. Raji 인간 B 세포 (2 x 104 세포/웰), CD4 또는 CD8 T 세포 (1 x 105 세포/웰) 및 항체의 혼합물을 37 ℃에서 24시간 동안 공동 배양하였다. 1 % BSA로 1회 세척한 후, 세포 펠렛을 FITC 마우스 항-인간 CD4 (BD-550628) 또는 PerCpCy5.5 마우스 항-인간 CD8 (BD-560662), PE 마우스 항-인간 CD69 (BD-560968) 및 APC 마우스 항-인간 CD25 (BD-555434)에 이어 4 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척한 후, FITC 또는 PerCpCy5.5 양성 세포에서 PE 및 APC 양성 세포의 백분율을 유세포 분석법에 의해 결정하였다.
열 안정성 (DSF)
QuantStudioTM의 7 Flex Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 항체의 용융 온도 (Tm)를 조사하였다. 19 ul의 항체 용액을 1 ul의 62.5 X SYPRO 오렌지 용액 (인비트로젠)과 혼합하고 96-웰 플레이트 (Biosystems)로 옮겼다. 플레이트를 0.9 ℃/분의 속도로 26 ℃에서 95 ℃로 가열하고, 생성된 형광 데이터를 수집하였다. 상이한 온도에 대한 형광 변화의 음성 유도체가 계산되었고, 최대 값은 용융 온도 Tm으로 정의되었다. 단백질에 여러 개의 전개 변형 (unfolding transformation)이 있는 경우, Tm1 및 Tm2로 명명된 처음 두 Tm을 기록하였다. 데이터 수집 및 Tm 계산은 운영 소프트웨어에 의해 자동으로 수행되었다.
혈청 안정성
인간 혈액을 선택된 공여자로부터 항응고제가 없는 폴리스티렌 튜브로 수집하였다. 실온에서 30분 동안 방치한 후, 인간 혈액을 4000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 혈청층을 수집하였다. 혈청이 정화될 때까지 원심 분리 단계를 반복하였다. 수집된 혈청을 1:9의 비율로 검출하에 항체를 검출하에 혼합하고, 표시된 시간 동안 0일, 1일, 4일, 7일 및 14일 동안 분취량을 37 ℃에서 채취하였다. 액체 질소에서 서로 다른 시점에서 샘플을 급속 냉동하고 사용할 때까지 -80 ℃에 보관하였다. 혈청 처리 없이 상응하는 항체의, Jurkat CD3 T 세포 및 Ramos CD19 B 세포에 대한 결합 능력을 평가하기 위해, 샘플을 FACS로 분석하였다.
SPR에 의한 Fcγ 수용체 결합 친화력
FcγR에 대한 항체 결합 친화도는 Biacore T200 (또는 Biacore 8K)을 사용하여 검출하였다. 각각의 수용체는 항-his 항체 고정화 CM5 센서 칩 (GE)에 포획되었다. 상이한 농도의 항체를 60초의 회합 (association) 단계를 위해 30 uL/분의 유속으로 센서칩상에 주입한 후 60초 동안 해리시켰다. 이어서, 각각의 결합 사이클 후 칩은 10 mM 글리신 (pH 1.5)으로 재생되었다.
블랭크 표면 및 완충액 채널의 센서그램을 테스트 센서 그램에서 감산하였다. 실험 데이터는 Langmiur 분석 (FcγRI의 경우) 또는 정상 상태 모델 (다른 수용체의 경우)을 사용하여, 1:1 모델로 조정됐다. 150 KDa의 분자량을 사용하여 항체의 몰 농도를 계산하였다.
ELISA에 의한 C1q 결합
ELISA 플레이트 (Nunc)를 3 ug/mL 항체 샘플로, 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 차단 및 세척 후, C1q를 600 ug/mL에서 시작하여 농도 구배로 희석하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 양 항-인간 C1q Ab-HRP와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고 2M HCl에 의해 상호 작용을 중단시켰다. 450nm에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Device)를 사용하여 판독되었다.
SPR에 의한 FcRn 결합 친화력
FcRn에 대한 항체 결합 친화성을 Biacore T200 (또는 Biacore 8K)을 사용하여 검출하였다. 각 항체를 CM5 센서 칩 (GE)에 고정하였다. 60 초의 연계 단계에서, 러닝 버퍼 (50 mM Na2HPO4/Na2HPO4, 150 mM NaCl, 0.05 % Tween20, pH 6.0)의 상이한 농도를 갖는 FcRn을 30 uL/분의 유속으로 센서칩에 주입하였고, 곧 60초 동안 해리되었다. 이어서, 각각의 결합주기 후 1XPBS (pH 7.4)에 의해 칩을 재생시켰다.
블랭크 표면 및 완충액 채널의 센서그램을 테스트 센서그램에서 감산하였다. 실험 데이터는 정상 상태 모델로 조정됐다. 45 KDa의 분자량을 사용하여 FcRn의 몰 농도를 계산하였다.
마우스 Raji/PBMC 모델의 효능 연구
Raji 종양 세포 (ATCC® CCL-86 ?)는 공기 중 5 % CO2, 37℃에서 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 ug/mL 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 단일층 배양물로서 유지되었다. 종양 세포는 주 2회 일상적으로 계대 배양되었다. 지수 성장기에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
인간 PBMC는 제조사의 지시에 따라 피콜-파크 플러스 (Ficoll-Paque Plus)를 사용하여 헤파린 전혈로부터 단리되었다.
각각의 마우스는 D0에 0.2 ml의 PBS에 든, 마트리겔 및 신선한 PBMC와 혼합된 Raji 종양 세포와 함께 우측 옆구리에 피하 접종받았다. 항체 주사는 D3 (i.v. BIW x 4회)부터 진행되었다.
테스트 준비
Figure pct00001
종양 측정 및 목적
주된 목적은 종양 성장이 지연될 수 있는지 또는 마우스가 치료될 수 있는지를 확인하는 것이었다. 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 2차원으로 매주 2회 측정하고, 부피는 다음 식을 사용하여 mm3으로 표현하였다: V = 0.5 a x b2에 있어서, a 및 b는 각각 종양의 길고 짧은 직경이다. T/C 값 (백분율)은 항-종양 효과의 지표이다.
TGI는 다음 식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산되었다: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] Х 100; Ti는 주어진 날의 치료 그룹의 평균 종양 부피이고, T0는 치료 시작일의 치료 그룹의 평균 종양 부피이고, Vi는 Ti와 같은 날의 대조군 그룹의 평균 종양 부피이며, V0는 치료 시작일의 대조군 그룹의 평균 종양 부피이다.
시노몰구스 PK, 독성 및 면역원성
하나의 수컷 및 하나의 암컷 시노몰구스 원숭이에게 정맥 내 볼루스 (bolus) 투여에 의해 1 mg/kg으로 WBP3438을 1회 투여하였다. 제제는 20 mM NaAc-HAc, 7.0 % (w/w) 수크로스, 0.02 % (w/v) PS80, pH 5.0로 조제하였다. PK 혈액 샘플을 투여 전 (-1 일), 0.25 시간, 0.5 시간, 1 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 3 일, 7 일, 14 일, 21 일 및 28 일에 수집하였다. 항 약물 항체 (ADA) 샘플을 3 일, 14 일 (312 시간) 및 28 일 (480 시간)에 수집하였다.
혈청 샘플에서 WBP3438 및 ADA의 혈청 농도는 ELISA에 의해 결정되었다. 원숭이에서 WBP3438의 혈청 농도는 Phoenix WinNonlin 소프트웨어 (버전 6.3, Pharsight, Mountain View, 캘리포니아)를 사용하여 비-구획 약동학 분석을 수행하였다. 선형/로그 사다리꼴 규칙이 PK 파라미터를 획득하는데 적용되었다.
일반적인 건강 및 외모, 특히 피부 자극에 대한 케이지 측 관찰이 관찰되었다. 혈액학 (CBC)에 대한 전혈 샘플 분석 및 화학 검출에 대한 혈청 분석은 각각 혈액학 분석기 (ADVIA2120) 및 화학 (HITACHI 7180)에 의해 결정되었다.
결과
시노몰구스 CD19 발현 세포주 생성
시노몰구스 CD19 발현 세포주 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9의 발현은 유세포 분석법에 의해 항-CD19 항체를 사용하여 검출되었다. WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9는 원숭이 CD19의 높은 발현을 나타냈다(도 5).
WuXiBody 생성 및 최적화
도 1은 연구된 항체 및 포맷의 개략도를 나타낸 것이다. 항-CD3 항체 T3 및 항-CD19 항체 U4 둘 모두가 개발되었다. T3의 불변 영역 (CL 및 CH1)을 TCR의 불변 도메인으로 대체하여 규칙적인 항체에 직교하는 독특한 경쇄 인터페이스를 설계하였다. Fc 도메인에서 "놉-인투-홀" 돌연변이와 함께 TCR-변형 T3 및 천연 U4를 사용하여 이중특이적 항체 포맷 E17 및 F16을 설계하였다.
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP로부터의 항-CD3 및 항-CD19 결합 모이어티의 가변 중쇄 및 경쇄 서열은 하기에 제공된다:
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP& W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP 항-CD3 항체
VH		 DNA 서열
(서열번호 16)		 CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCAGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCTAGTGTCAAGGTGTCATGCAAGGCTAGCGGGTTCGCCTTTACTGACTACTACATCCACTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGACAAGGGTTGGAGTGGATGGGATGGATCTCCCCAGGCAATGTCAACACAAAGTACAACGAGAACTTCAAAGGCCGCGTCACCATTACCGCCGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCAGAAGCGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCAGGGATGGGTACTCCCTGTATTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGAGCTCC
아미노산 서열
(서열번호 15)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVSS
항-CD3 항체
VL
DNA 서열
(서열번호 18)		 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCAGACTCCCTTGCTGTCTCCCTCGGCGAAAGAGCAACCATCAACTGCAAGAGCTCCCAAAGCCTGCTGAACTCCAGGACCAGGAAGAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATCTACTGGGCCTCCACCCGGCAGTCTGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGATCTGGGAGCGGGACAGACTTCACATTGACAATTAGCTCACTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTCTACTACTGTACTCAGAGCCACACTCTCCGCACATTCGGCGGAGGGACTAAAGTGGAGATTAAG
아미노산 서열
(서열번호 17)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIK
항-CD19 항체
VH		 DNA 서열
(서열번호 20)		 CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
아미노산 서열
(서열번호 19)		 QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNADTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSS
항-CD19
항체
VL		 DNA 서열
(서열번호 22)		 GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
아미노산 서열
(서열번호 21)		 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK
전장 (full-length) W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 및 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP 서열은 하기에 제공된다:
항체 쇄 서열
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP T3-LC
(서열번호 26)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC
(서열번호 27)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC(서열번호 28) DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC(서열번호 29) QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
항체 쇄 서열
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP T3-LC
(서열번호 26)		 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSHTLRTFGGGTKVEIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDFACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
T3-HC
(서열번호 27)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFAFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWISPGNVNTKYNENFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSLYYFDYWGQGTLVTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
U4-LC(서열번호 28) DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSTVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
U4-HC(서열번호 30) QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVGGGGSGGGGSQMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYAFTSYNMYWVRQARGQRLEWIGYIDPYNGDTTYNQKFKGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTTAYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 생산
항체 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 발현 역가는 일시적 발현 동안에는 90 mg/L 보다 높다. 2 단계 정제 후 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 순도는 97.5 %에 이른다 (SEC-HPLC, 도 7). W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 상응하는 환원 조건하에 SDS-PAGE에서 75 kDa, 55 kDa 및 25 kDa의 겉보기 분자 질량 (apparent molecular mass)으로 이동한다. 2개의 경쇄는 유사한 분자량으로 인해 중첩될 수 있다. 항체는 손상되지 않은 이중특이적 분자를 나타내는 비-환원 조건에서 200 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 6).
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 생산
항체 W3438-T3U4.F17-1.uIgG4.SP의 발현 역가는 일시적 발현 동안에는 100 mg/L 보다 높다. 2 단계 정제 후 W3438-T3U4.F17-1.uIgG4.SP의 순도는 95 %에 이른다 (SEC-HPLC, 도 9). W3438-T3U4.F17-1.uIgG4.SP는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 상응하는 환원 조건하에 SDS-PAGE에서 54 kDa, 56 kDa 및 25 kDa의 겉보기 분자 질량 (apparent molecular mass)으로 이동한다. 2개의 경쇄는 유사한 분자량으로 인해 중첩될 수 있다. 항체는 손상되지 않은 이중특이적 분자를 나타내는 비-환원 조건에서 150 kDa의 겉보기 분자 질량으로 이동한다 (도 8).
표적-결합
CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 유세포 분석법에 의해 Ramos 및 Jurkat 세포상에서 시험하였다 (도 10a 및 10b). 항체 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 각각 15.6 nM 및 47 nM의 EC50값으로 Ramos 및 Jurkat 세포에 대한 강한 결합 활성을 나타냈다.
CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 결합을 유세포 분석법에 의해 Ramos 및 Jurkat 세포상에서 시험하였다 (도 11a 및 11b). 항체 W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP는 각각 1.8 nM 및 19.3 nM의 EC50 값으로 Ramos 및 Jurkat 세포에 대한 강한 결합 활성을 나타냈다.
교차 종 결합
시노몰구스 CD19에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 유세포 분석법에 의해 WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 세포 (CD19-발현 세포)에서 시험하였다 (도 12). 결합 EC50은 26 nM이었다. 시노몰구스 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 ELISA에 의해 W331-cynoPro1.ECD.His (시노몰구스 CD3 입실론 단백질)를 사용하여 시험하였다 (도 13). 결합 EC50은 0.04 nM이었다.
표적 세포에 대한 친화도
인간 CD19 및 CD3에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합 친화도는 유세포 측정법에 의해 Ramos 및 Jurkat 세포상에서 시험되었다. 결합된 IgG/자유 IgG 대 결합된 IgG를 도 14a 및 14b에 플롯팅하였다. CD19 및 CD3에 대한 결합의 적합한 KD 값은 각각 23 nM 및 9.0 nM이었다.
표적 세포에서의 이중 결합
CD3 T 세포 및 CD19 B 세포를 연결하기 위한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 활성을 유세포 분석법에 의해 미리 표지된 Jurkat 및 Raji 세포를 사용하여 시험하였다 (도 15a 내지 15b). Q2는 가교된 Jurkat 및 Raji 세포의 집단을 보여준다. 음성 대조군과 비교하여, 대략 18 %의 세포가 이중특이적 항체 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP를 통해 연결되었다.
세포 독성 분석
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 세포 독성 활성은 CD8+ T 세포 및 Raji 세포를 사용하여 평가하였다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 15 nM의 EC50 값으로 4시간 배양 후 신속하고 효과적인 세포 용해를 유도하였다 (도 16a). 최대 세포 사멸 백분율은 90%였다.
W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP의 세포 독성 활성을 CD8+ T 세포 및 Raji 세포를 사용하여 평가하였다. W3438-T3U4.F16-1.uIgG4.SP는 3.2 nM의 EC50 값으로 4시간 인큐베이션 후 빠르고 효과적인 세포 용해를 유도하였다 (도 16b). 최대 세포 사멸 백분율은 90%였다.
표적 특이적 T 세포 활성화
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 CD19+ 표적 세포의 존재 또는 부재 하에서, 활성화 마커 CD69 및 CD25를 통한 T 세포 활성화를 나타내는 분석에서 조사되었다. 결과는 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP가 CD19+ 표적 세포의 존재 하에서만, 용량 의존적 방식으로 T 세포 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현을 유도한다는 것을 입증하였다 (도 17a 내지 17d). B 세포가 없는 경우에는, CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브 세트에서 CD25 및 CD69의 발현은 관찰되지 않았다.
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 또한 CD19+ 표적 세포의 존재 또는 부재 하에서, 사이토카인 방출의 T 세포 활성화 분석에서 조사되었다. 결과는 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP가 CD19+ 표적 세포의 존재 하에서만 용량 의존적 방식으로 IFN-γ 및 TNF-α 방출을 유도한다는 것을 입증하였다 (도 18a 내지 18d). B 세포가 없는 경우에는, CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브 세트에서 IFN-γ 및 TNF-α가 검출되지 않았다.
열 안정성
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 열 안정성을 실시간 PCR을 사용하여 조사 하였다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 Tm1 및 Tm2는 60.2 ℃ 및 72.7 ℃이다.
혈청 안정성
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP를 37 ℃에서 14일 동안 혈청 중에서 항온 처리 하였다. 0, 1, 4, 7 및 14일 동안 배양된 항체의 결합 활성을 유세포 분석법에 의해 검출하였다. 결과는 CD3 및 CD19 세포에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합 활성이 14 일 동안 인간 혈청에서 인큐베이션한 후에 변하지 않았음을 보여주었다 (도 19a 및 19b).
Fcγ 수용체 결합
FcγRI, FcγRIIa (H167), FcγRIIa (R167), FcγRIIb, FcγRIIIa (F176), FcγRIIIa (V176) 및 FcγRIIIb에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합 활성을 SPR에 의해 조사하였다. 친화도는 표 7에 요약되어 있다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 모든 Fcγ 수용체에 대한 전형적인 인간 IgG4 결합 친화도를 나타냈다.
SPR에 의한 Fc 수용체에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 친화력
Fc 수용체 KD (M)
FcγRI 9.79E-09
FcγRIIa (H167) 2.05E-05
FcγRIIa (R167) 1.58E-05
FcγRIIb 2.41E-05
FcγRIIIa (F176) 2.93E-05
FcγRIIIa (V176) 1.40E-05
FcγRIIIb >4.10E-05
C1Q에 대한 항체의 결합 활성을 ELISA에 의해 시험하였다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 ELISA에서 결합 신호를 보이지 않았으며 (도 20), 대조군 인간 IgG1 항체는 정상 결합 신호를 나타냈다.
FcRn 결합
FcRn에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 결합을 pH 6.0에서 SPR에 의해 시험하였다. 친화도는 인간 IgG4의 FcRn에 대한 전형적인 친화도인 2.58 uM와 일치하였다.
생체 내(in vivo) 특성
PBMC / Raji 이종 이식편 모델의 효능 연구
이 연구에서는, NOG 마우스에서 Raji 세포를 함유하는 혼합된 PBMC 인간화 모델에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 항-종양 효능이 조사되었다. 종양 성장 곡선은 그림 21에 나타내었다.
14일에서, 이소형 대조군 처리 그룹의 평균 종양 크기는 342 mm에 도달하였다. 1.5 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 W3438-T3U4.E17-1.uIG4.SP를 사용한 처리는 상당한 항-종양 활성을 나타냈다. 평균 종양 크기는 각각 78 mm3 (T/C = 23.0 %, TGI = 93.9 %, p = 0.016) 및 75 mm3 (T/C = 22.0 %, TGI = 95.3 %, p = 0.014)이고, 고용량 투여 그룹의 한 동물의 종양이 사라졌다. 매우 낮은 용량 (0.06 mg/kg)에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 항-종양 활성을 나타내지 않았다.
시노몰구스 원숭이에서 WuXiBody의 약동학
시노몰구스 혈청 중 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 농도를 ELISA로 시험하였다 (도 22). 계산된 PK 파라미터를 표 2에 열거하였다. 1 mg/kg에 대한 단일 IV 주사 1 회에 대한 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 반감기는 152시간이었다. W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP는 블리나투모맙(blinatumomab) 보다 원숭이에서 반감기가 훨씬 길었으며 침팬지에서는 반감기 (1.5 내지 2.6 시간)가 매우 짧았다 (유럽 의약품청 평가 보고서 EMA/CHMP/469312/2015).
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP 의 시노몰구스 PK
PK 파라미터 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP
C0 (ug/mL) 60.4
T1/2 (h) 152
Vdss (L/kg) 0.0513
Cl (mL/min/kg) 0.00462
AUC0-last (h*ug/mL) 3552
AUC0-inf (h*ug/mL) 3708
MRT0-last (h) 157
MRT0-inf (h) 187
독성
모든 원숭이는 연구의 전체 과정 동안 약물을 잘 견뎌냈다. 연구의 생애기 동안 부작용은 관찰되지 않았다. 음식 소비와 체중에는 뚜렷한 변화가 없었다. AST, ALT, WBC, HGB 및 HCT를 포함한 혈액학 및 임상 화학에 대한 파라미터는 일반적으로 기준 범위 내에 있었다.
면역원성
W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 항-약물 항체 (ADA)의 결과가 도 23a 및 23b에 도시되어 있다. 투여 후 3, 14 및 28일의 원숭이 혈청에서 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP에 대한 ADA의 역가는 투여 전에 비하여 유의한 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 1 mg/kg의 W3438-T3U4.E17-1.uIgG4.SP의 단일 IV 주사는 원숭이에서 면역원성이 나타나지 않았다.
<110> WuXi Biologics (Shanghai) CO., LTD. WUXI BIOLOGICS (CAYMAN) INC. <120> NOVEL BISPECIFIC CD3/CD19 POLYPEPTIDE COMPLEXES <130> PI200008CN <150> PCT/CN 2017/103032 <151> 2017-09-22 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln 1 5 10 15 Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val 20 25 30 Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys 35 40 45 Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg 50 55 60 Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn 65 70 75 80 Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu 85 90 95 Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val 100 105 110 Ser Ala Glu Ala 115 <210> 2 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys 1 5 10 15 Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln Val Ser 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600 605 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 610 615 620 Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 625 630 635 640 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 645 650 655 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 660 665 <210> 31 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 85 90 95 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 100 105 110 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 32 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 85 90 95 <210> 33 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 130 135 140 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala 145 150 155 160 Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp 165 170 175 Phe <210> 34 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 Ala Asp 130 <210> 35 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 35 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 85 90 95 <210> 36 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 36 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 85 90 95 <210> 37 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 37 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 85 90 95 <210> 38 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr 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Trp Gly 115 120 125 Arg Ala 130 <210> 40 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 40 Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu 1 5 10 15 Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys 20 25 30 Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val 35 40 45 Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu 50 55 60 Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg 65 70 75 80 Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg 85 90 95 Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln 100 105 110 Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly 115 120 125 Arg Ala 130

Claims (31)

  1. 제2 항원-결합 모이어티와 관련된 제1 항원-결합 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체:
    제1 항원-결합 모이어티는 다음을 포함한다:
    N-말단에서 C-말단까지, 제1 T 세포 수용체 (TCR) 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및
    N-말단에서 C-말단까지, 제2 TCR 불변 영역 (C2)에 작동 가능하게 연결된 제1 항체의 제1 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 제2 폴리펩티드,
    상기:
    C1은 서열번호 1을 포함하는 조작된 CBeta를 포함하고, C2는 서열번호 2를 포함하는 조작된 CAlpha를 포함하고,
    서열번호 1의 아미노산 C48 및 서열번호 2의 아미노산 C41은 비-천연 쇄간 이황화 결합을 형성할 수 있고,
    C1 및 C2는 이량체를 형성할 수 있고, 비-천연 쇄간 이황화 결합은 상기 이량체를 안정화시킬 수 있고, 및
    제2 항원-결합 모이어티는 다음을 포함한다:
    항체 중쇄 CH1 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 VH, 및
    항체 경쇄 불변 (CL) 도메인에 작동 가능하게 연결된 제2 항체의 제2 VL,
    상기:
    제1 및 제2 항원-결합 모이어티 중 하나는 항-CD3 결합 모이어티이고, 다른 하나는 항-CD19 결합 모이어티이며,
    상기 항-CD3 결합 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD3 항체로부터 유래된다:
    a) 서열번호 3을 포함하는 중쇄 CDR1, b) 서열번호 4를 포함하는 중쇄 CDR2, c) 서열번호 5를 포함하는 중쇄 CDR3, d) 서열번호 6을 포함하는 카파 경쇄 CDR1, e) 서열번호 7을 포함하는 카파 경쇄 CDR2 및 f) 서열번호 8을 포함하는 카파 경쇄 CDR3;
    상기 항-CD19 결합 모이어티는 다음을 포함하는 항-CD19 항체로부터 유래된다:
    a) 서열번호 9를 포함하는 중쇄 CDR1, b) 서열번호 10을 포함하는 중쇄 CDR2, c) 서열번호 11을 포함하는 중쇄 CDR3, d) 서열번호 12를 포함하는 카파 경쇄 CDR1, e) 서열번호 13을 포함하는 카파 경쇄 CDR2, 및 f) 서열번호 14를 포함하는 카파 경쇄 CDR3,
    및
    상기 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티는 제1 및 제2 항원-결합 모이어티가 모두 천연 Fab의 대응물인 경우 그렇지 않은 것보다 불일치가 덜 발생한다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-CD3 결합 모이어티는 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 17을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-CD19 결합 모이어티는 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체:
    제1 VH는 제1 접합 도메인에서 C1에 작동 가능하게 연결되고, 및
    제1 VL은 제2 접합 도메인에서 C2에 작동 가능하게 연결된다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 접합 도메인이 서열번호 23을 포함하고, 및/또는 제2 접합 도메인이 서열번호 24를 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 모이어티는 제1 이량체화 도메인에 연결되고, 제2 항원-결합 모이어티는 제2 이량체화 도메인에 연결되며, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 연계되는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 연계는 커넥터, 이황화 결합, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 염다리, 또는 소수성-친수성 상호작용, 또는 이들의 조합을 통한 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 임의로 유래된 항체 힌지 영역의 적어도 일부를 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  9. 제6항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 이량체화 도메인은 항체 CH2 도메인, 및/또는 항체 CH3 도메인을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  10. 제6항에 있어서, 상기 제1 이량체화 도메인은 제3 접합 도메인에서 제1 TCR 불변 영역 (C1)에 작동 가능하게 연결된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제3 접합 도메인은 서열번호 25를 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  12. 제6항에 있어서, 상기 제2 이량체화 도메인은 제2 항원-결합 모이어티의 중쇄 가변 도메인에 작동 가능하게 연결된 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인은 상이하고 동종이량체화를 방해하고 및/또는 이종이량체화를 선호하는 방식으로 연계되는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이량체화 도메인이 놉-인투-홀, 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 친수성 상호작용, 또는 증가한 유연성을 통하여 이종이량체로 연계될 수 있는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 및 서열번호 29.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 4개 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 것인, 이중특이적 폴리펩티드 복합체: 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 및 서열 번호 30.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하고, 모이어티에 접합된 접합체.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터.
  20. 제18항의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제19항의 단리된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현시키는 방법에 있어서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체가 발현되는 조건 하에서 제21항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 다음을 포함하는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 제조 방법:
    a) 숙주 세포에 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 및
    b) 숙주 세포가 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 발현하도록 하는 단계.
  23. 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 조성물.
  25. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 치료적 유효량의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 CD19-관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 암인 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 암은 림프종, 폐암, 간암, 자궁경부암, 결장암, 유방암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 교모세포종, 전립선암, 식도암 또는 위암인 것인, 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 질환 또는 병태는 B 세포 림프종, 임의로 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종이고, 상기 비-호지킨 림프종은 다음을 포함한다: 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 소포성 림프종, 변연부 B-세포 림프종 (MZL), 점막-관련 림프 조직 림프종 (MALT), 소림프성 림프종 (만성 림프구성 백혈병, CLL) 또는 외투 세포 림프종 (MCL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 또는 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 (WM).
  30. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 이중특이적 폴리펩티드 복합체를 포함하는 키트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 키트는 CD19-관련 질환 또는 상태의 검출, 진단, 예후, 또는 치료에 사용되는 것인, 키트.
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