CN111840571A - 一种抗体药物偶联物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗体药物偶联物及其用途，所述抗体药物偶联物包括：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:01的CDR‑L1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:02的CDR‑L2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:03的CDR‑L3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4的CDR‑H1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:5的CDR‑H2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:6的CDR‑H3的抗体，和(b)与所述抗体偶联的偶联部分，所述偶联部分选自药物、毒素、细胞因子、放射性核素或其组合。

Description

一种抗体药物偶联物及其用途
技术领域
本发明涉及抗体偶联药物领域，特别地涉及一种抗体药物偶联物及其用途。
背景技术
抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，简称ADC)是将单克隆抗体药物的高特异性和小分子细胞毒药物的高活性相结合，用以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用。和传统的完全或部分人源化抗体或抗体片段相比，ADC因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素从而理论上疗效更高。和融合蛋白相比，它具有更高的耐受性或较低的副作用。
ADC药物对靶点的准确识别性及非癌细胞不受影响性，极大地提高了药效并减少了毒副作用；由于ADC药物结构较为复杂，且不同ADC药物设计之间存在较大的差异。即使同一靶点的不同药物，由于识别位点、连接位点、连接子及所连接小分子的不同，其毒性的差异显而易见。
ADC药物的靶向性来自其中抗体部分，毒性大部分来自小分子化药毒物部分。抗体部分与毒素部分通过连接物互相连接。抗体部分与肿瘤细胞表面的靶向抗原结合后，肿瘤细胞会将ADC内吞。之后ADC药物会在溶酶体中分解，释放出活性的化药毒物，破坏DNA或阻止肿瘤细胞分裂，起到杀死细胞的作用。理想化的连接物应该保持稳定所以不会导致靶外毒性，并且在细胞内高效释放毒物。
B淋巴细胞抗原CD19，在人体中由CD19基因编码。除浆细胞和滤泡树突细胞外，在所有B谱系细胞中均有表达。CD19在人B细胞中起两个主要作用，充当衔接蛋白以将细胞质信号蛋白募集到膜上，并且它在CD19/CD21复合物内起作用以降低B细胞受体信号传导途径的阈值。由于其存在于所有B细胞中，它是B淋巴细胞发育，淋巴瘤诊断的生物标志物。
现在的ADC通常由一个完全人源化的单克隆抗体、一个细胞毒药物、一个合适的连接体和肿瘤细胞上特异性表达的抗原组成。该结构主要保持药物的细胞毒性、靶向性和ADC在体循环中的稳定性。正确的选择组合是成功研制ADC的关键。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗体药物偶联物及其用途。
本发明是以如下技术方案实现的：
一种抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物包括：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:01的CDR-L1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:02的CDR-L2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:03的CDR-L3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4的CDR-H1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:5的CDR-H2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:6的CDR-H3的抗体，和
(b)与所述抗体偶联的偶联部分，所述偶联部分选自药物、毒素、细胞因子、放射性核素或其组合。
进一步地，所述抗体选自单克隆抗体、特异性结合人CD19的抗体片段、鼠源抗体、人源化抗体。
进一步地，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
进一步地，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。
进一步地，所述抗体药物偶联物包括MC-val-cit-PAB、MC-ala-phe-PAB、MP-val-cit-PAB、SPP、SMCC或VcMMAE。
进一步地，所述抗体药物偶联物包括美登素衍生物DM1、美登素衍生物DM4、多拉司他汀、MMAE、DNA损伤药物，优选地，所述抗体药物偶联物包括美登素衍生物DM1。
CD19是参与B细胞活化与增殖的重要膜抗原之一，是所有B细胞共有的表面标志，B细胞活化后不消失，是最重要的B细胞标记因子，同时CD19也是B细胞表面的传达信号复合体的构成部分，CD19的细胞外部分同其他膜抗原结合进行信号传导。CD19阳性细胞升高见于B淋巴细胞系统的恶性肿瘤，如CD19在95％急性前B淋巴细胞白血病细胞和94％急性成熟B淋巴细胞白血病细胞表达，也见于慢性淋巴细胞性白血病和淋巴瘤等；CD19阳性细胞降低见于体液免疫缺陷病。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，细胞株为常规的市售产品或购自ATCC，质粒均为市售产品，除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
IgG型抗体包括许多不同的亚型，这些亚型的Fc区有轻微的差别，因此具有不同的功能。例如，IgG型抗体的一种亚型IgG3，可以较其他任何亚型更好地固定补体。相似地，IgG1亚型擅长于结合入侵者并调理它们以利于专职吞噬细胞的吞噬，这是因为在巨噬细胞和中性粒细胞表面有能与已结合入侵者的IgG1抗体Fc区结合的受体。
代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。
抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。
“可变区”是指在抗体间，可变区的某些区段的序列显著不同，所述高度可变区为各3-12个氨基酸，其主要采取β折叠构型，由三个高度可变区连接，这些高度可变区形成环，所述环连接β折叠结构及在一些情况下形成β折叠结构的一部分。各链中的高度可变区是由FR紧挨着结合在一起，而与其他链的高度可变区有助于形成抗体的抗原结合位点。
“恒定区”不直接涉及抗体对抗原的结合，但抗体恒定区涉及双特异性抗体的制备。
“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。
“抗体的抗原结合片段”可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。
“抗体的抗原结合片段”可以是单条多肽链(例如，scFv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端，例如，双抗体、Fab片段、Fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。
术语“IgG”是免疫球蛋白G的缩写，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，根据IgG分子中的r链区分，是血清中的主要抗体成分，。
一个或多个二硫键链间连接是指第一Fc链及第二Fc链通过一个或多个二硫键链间连接，形成异源二聚体片段。在本发明中，一个或多个二硫键的形成可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在同一个细胞内合成时形成，也可以是第一Fc链及第二Fc链或者第一Fc链及第二Fc链及其相连接的抗原结合功能区在不同细胞内分别合成，之后通过体外还原氧化的方法形成。
靶细胞表面抗原通常会涉及到细胞的正常生长或增殖过程，一般是细胞表面蛋白、糖蛋白或多肽等。理想的抗原靶标应在靶细胞表面大量特异性的表达，而在正常组织或细胞表面表达有限或不表达，同时应具有一定的内吞速率以及有合适的内吞转运途径。目前在开发的ADCs几乎全部覆盖已确证的靶点，靶点的确定也基本决定了ADCs药物的适应指征。
目前，ADC药物采用人源化单抗，对可结晶片段进行修饰，以降低ADCC和CDC等。首先抗体分子作为生物大分子，存在一般生物大分子的毒性风险，如免疫原性和免疫毒性，以及单抗可能的ADCC作用、CDC作用、肾基底膜免疫复合物沉积等。其次，在ADC药物中，抗体分子最重要的作用是靶向作用，即将小分子化合物定向投递到抗原抗体结合位点。如果抗体选择性较差或正常组织存在该抗原，则会造成细胞毒药物投递到正常细胞中，造成靶向毒性。因此在ADC药物开发中选择正确的抗体尤为重要。
目前ADC有三种经典的偶联方式，一种是氨基偶联、一种是巯基偶联、第三种是桥接偶联(cross-link)。氨基偶联是将药物通过连接子偶联在抗体的赖氨酸(Lys)残基上，但是IgG上包括了近百个赖氨酸，偶联的位置可能会发生在抗体轻链和重链上近40个外露的赖氨酸残基上，产品均一性极差。巯基偶联是先将抗体中的链间二硫键打开形成游离的半胱氨酸(Cys)残基，再和能与半胱氨酸残基配对的连接子-药物复合物进行偶联，由于IgG上只有4对链间二硫键，链间二硫键被全部打开后会形成8个游离的半胱氨酸残基，因此通过单巯基偶联形成的ADC，其平均DAR值为0-8，尽管巯基偶联能够较好地控制每个抗体上连接的数量，但是链间二硫键的断去会极大的降低抗体的稳定性。桥接偶联是在巯基偶联的基础上演变的一种新的偶联方式，同巯基偶联一样，它是先将抗体中的链间二硫键打开形成两个游离的半胱氨酸残基，之后再同时与这两个游离的半胱氨酸残基配对，由于一个抗体上只有4对链间二硫键，链间二硫键被全部打开后会形成8个游离的半胱氨酸残基，因此通过桥接偶联形成的ADC，其平均DAR值为0-4，与巯基偶联相比，桥接偶联既能更好的控制产品的均一性，又能大大的提供偶联后抗体的稳定性，但是桥接偶联方式的DAR值最大为4，即一个抗体上最多会偶联4个药物，由于肿瘤细胞表面上抗原数量有限，有效的ADC活性所需的抗原表达水平根据不同抗原特性而变化。ADC需要至少104个抗原/细胞，以确保能够递送致死数量的细胞毒性药物。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
实施例1：
小鼠免疫：选购6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司)作为实验动物。初次免疫使用45μg人CD19蛋白(购自南京双领生物科技有限公司)与完全弗氏佐剂混合形成乳剂，按0.5ml/只注射量注射小鼠，腹腔注射，每隔两周进行加强免疫，加强免疫方法为：将不完全福氏佐剂与22.5μg人CD19蛋白混合充分制成乳液，按0.5ml/只注射量注射小鼠，腹腔注射，一共加强免疫四次，末次免疫一周后，收集并分离血清ELISA方法检测抗体效价，方法参考说明书，选择具有高效价的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。收集对数生长的骨髓瘤细胞制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合，用不完全培养液洗涤后，离心弃上清，将细胞沉淀和1ml PEG-4000分别置于40℃水浴中预热，之后混合为反应液并静置至出现颗粒，1min内向反应液中加入25ml预热至40℃的不完全培养基终止反应。静置后加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮混匀，之后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到1×107/ml，将上述细胞悬浮液分装至96孔板培养，待细胞表面积达到孔板面积2/3以上时吸出上清液样品供抗体检测。
实施例2：
筛选杂交瘤培养上清液的抗人CD19抗体。在96孔高吸附酶标板上包被人CD19(购自南京双领生物科技有限公司)，包被量100μL每孔，之后冲洗3次；用含1％BSA的缓冲液阻断并于25℃孵育1h，阻断量280μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入75μL上清液样品以及阳性血清作为对照，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL以比例1/10000稀释于含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据OD450nm的强弱选取能够分泌人CD19结合抗体的阳性克隆。将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。使用RNA prep Pure试剂盒提取细胞mRNA，合成cDNA第一链，将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序。
实施例3：
经过PCR扩增得到鼠源抗CD19抗体的轻链可变区和重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ IDNO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4-21*07、抗体重链恒定区序列鼠源IgVH2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体TL10-11中(载体骨架pEGFP-N1)。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为1.5×107细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为39.1μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为45μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。
实施例4：
检测实施例1获得的抗人CD19鼠源单抗(以下简称OM-anti-CD19)与其抗原结合的动力学常数。具体方法为：利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。简要地，将OM-anti-CD19溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭。结合阶段将不同浓度的OM-anti-CD19以27μL/min的速度注入3min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以27μL/min的速度注入8min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件进行分析计算。OM-anti-CD19的结合动力学常数为3.38E+02(1/Ms)、解离动力学常数为1.57E-02(1/s)、解离平衡常数为0.03(nM)。
实施例5：
人源化形式的抗人CD19抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，在Germline数据库中选取与OM-anti-CD19非CDR区匹配最好的人源化模板，将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；替换得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表1所示。
表1.回复突变获得的氨基酸序列
Figure BDA0002615429830000081
实施例6:
将人源化的抗人CD19单抗的重链可变区(SEQ ID NO：9)与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:11)连接，得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人CD19单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：10)与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQ ID NO:12)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入TL10-11(载体骨架pEGFP-N1)载体中。分别构建抗人CD19的抗体的重链和轻链的TL10-11表达载体(重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)，根据常规方法，获得抗人CD19抗体重链和轻链的表达载体，分别用于在真核细胞中表达抗人CD19抗体的重链和轻链。
检测获得的抗体与抗原CD19的结合的动力学常数。方法为：利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。简要地，将抗待测抗体溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH5.0)中并偶联到CM芯片上，用1M乙醇胺封闭。结合阶段将不同浓度的anti-CD19以25μL/min的速度注入3min，在解离阶段用PBS缓冲溶液以25μL/min的速度注入8min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore 3000软件进行分析计算。anti-CD19结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表2所示。
表2.人源化抗体与其抗原结合的动力学常数
Figure BDA0002615429830000091
为了确定ORI、AzzH-13单抗的热稳定性，将ORI、AzzH-13样品置于40℃高温条件下，在第2周、第3周分别取样进行SE-HPLC检测以观察热稳定性，测试采用色谱法，流动相为磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)，硫酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH6.7)；流速为0.6mL/min；色谱柱温度为27℃；样品池温度4℃；检测波长280nm；用缓冲液稀释样品至2mg/mL上样，体积20μL，用面积归一化法计算主峰比例处理数据，人源化CD19单抗热稳定性测试结果如表3所示。
表3.人源化CD19单抗热稳定性测试结果
Figure BDA0002615429830000092
热稳定性测试表明ORI、AzzH-13单抗均显示出了很好且相当的稳定性。
实施例7：
向人源化CD19单抗AzzH-13原液中加入PBS/EDTA缓冲液，使混合液终浓度为20mg/ml，然后用2.6eq的硫醇类还原剂(TCEP)于28℃还原3小时，取出后置于冰上冷却，加入6.0eq的mc-VC-PAB-MMAE，0℃反应1.5小时，加半胱氨酸终止反应。采用G25脱盐柱除去过量的小分子，并置换至20mM枸橼酸-枸橼酸钠/6％蔗糖，pH 6.6的缓冲液中，经0.22微米孔径的过滤装置除菌，-80℃保存，所得抗体药物偶联物命名为X17sl。制备完成后分析所制备ADC样品的DAR值约为4。
向人源化CD19单抗AzzH-13原液中加入磷酸钾、NaCl、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，pH为7.4的缓冲液中，控制浓度在15mg/mL左右，将上述抗体样品置于反应釜中，搅拌的同时加入SMCC(人源化CD19单抗与SMCC的摩尔比为1:6.5)，置于室温下反应2小时获得产物一，将产物一置换于磷酸钠，NaCl，辛酸钠，pH7.5的缓冲液体系中，置于反应釜中，搅拌的同时加入经DMA溶解的DM1药物(抗体与DM1的摩尔比为1:4.5)，室温反应1小时，反应结束后取出所制备的DM1类ADC样品，置换于10mM柠檬酸，60g/L蔗糖，pH5.0缓冲液体系中获得抗体药物偶联物命名为X13sl,制备完成后分析所制备ADC样品的DAR值约为4。
实施例8：
检测抗人CD19人源化单抗(AzzH-13)，抗体药物偶联物X17sl，抗体药物偶联物X13sl对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用，实验材料选用人8周龄雌性小鼠(C57BL/6背景，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司)。给试验小鼠接种MC38细胞，共接种20只，待小鼠明显荷瘤切片验证，观察肿瘤生长，记录荷瘤体积，连续给药6周，每周2次。给药第二周起每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(axb2)/2。待小鼠肿瘤体积增至一定体积，按肿瘤体积分组，每组5只：X1,X2,X3,X4,X5(体积约200mm3)；X6,X7,X8,X9,X10(体积约150mm3)；X1,X6设置为溶媒组(注射等体积生理盐水)，X2,X7给药25nmol/kg抗人CD19抗体(AzzH-13)，X3,X8给药25nmol/kg抗体药物偶联物X17sl，X4,X9给药剂量为25nmol/kg抗体药物偶联物X13sl，X5,X10给药剂量为50nmol/kg抗人CD19抗体(AzzH-13)，试验结果如表4所示。
表4.肿瘤消融比效果实验
Figure BDA0002615429830000101
Figure BDA0002615429830000111
由表4可见，50nmol/kg抗人CD19抗体的肿瘤消融比例高于25nmol/kg抗人CD19抗体的肿瘤消融比例，25nmol/kg抗体药物偶联物X13sl的肿瘤消融比例显著高于其他测试品，ADC类抗体药物偶联物的肿瘤消融比例相较于单克隆抗体有较大幅度提升。抗体药物偶联物X13sl针对150mm3的肿瘤消融效果明显优于200mm3级别的肿瘤消融效果。
实施例9：
选6-8周龄雌性SD大鼠随机分成2组(编号测试组1，测试组2，每组5只)，测试组1给予25nmol/kg X13sl。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45min至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。单次静脉注射的剂量为25nmol/kg的双特异性抗体的药代参数如下：半衰期t1/2为88小时，药时曲线下面积AUC last为62823nM.hr，估算零浓度C0为145nM，表观分布容积Vd为77mL/Kg，清除率CL为1.02mL/hr/kg，平均驻留时间MRT last为143小时。
实施例10：
安全性试验，受试动物为雌性食蟹猴，用量为1只，第一天，单次静脉输注50nmol/kg抗体药物偶联物X13sl，观察两周后，再次静脉输注75nmol/kg抗体药物偶联物X13sl，观察两周后再次，再次静脉输注75nmol/kg抗体药物偶联物X13sl，观察两周后安乐死并解剖。试验期间对如下指标进行了评价：生存状态、体重、耗食量、血液指标、形态及其他。实验结果：动物生存状态、体重、耗食量和形态均未见明显改变，精神状态良好。血液学指标：50nmol/kg和75nmol/kg给药两周后可见RBC、LYM轻微减少，NEUT、EOS明显减少；75nmol/kg给药后第14天仍可见RBC、LYM、NEUT、EOS轻微减少，50nmol/kg给药后第14天开始血液指标无显著变动，动物能较好耐受，建议最大耐受剂量80mg/kg。上述结果表明本发明提供的抗体药物偶联物毒性低，稳定性和药代动力学大大提高，偶联脱落速度更低，药物活性高，低抗原水平下的细胞活性高。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Figure BDA0002615429830000121
Figure BDA0002615429830000131
Figure BDA0002615429830000141
Figure BDA0002615429830000151
Figure BDA0002615429830000161
Figure BDA0002615429830000171
Figure BDA0002615429830000181
Figure BDA0002615429830000191
Figure BDA0002615429830000201
Figure BDA0002615429830000211
序列表
<110> 杭州皓阳生物技术有限公司
<120> 一种抗体药物偶联物及其用途
<141> 2020-08-03
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(7)
<223> Anti-CD19 CDR-L1
<400> 1
Leu Trp Lys Trp Arg Asn Asn
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(5)
<223> Anti-CD19 CDR-L2
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Ser Glu Leu Gln Ser
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(10)
<223> Anti-CD19 CDR-L3
<400> 3
Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(7)
<223> Anti-CD19 CDR-H1
<400> 4
Glu Leu Ser His Thr Ser Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
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Asp Val Asp Ile Asn Arg
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(10)
<223> Anti-CD19 CDR-H3
<400> 6
Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(116)
<223> CD19-ORI-VH
<400> 7
Gly Phe Val Leu Ser Met Thr His Trp Ile Arg Gln Gly Pro Gln His
1 5 10 15
Ile Asp Thr Ile Pro His Trp Gln Glu Leu Ser His Thr Ser Gly Pro
20 25 30
Asp Phe Ser Gln Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ile Leu Ala His Met Arg
35 40 45
Arg Trp Ser Glu Trp Val Asn Val Trp Val Gly Ile Tyr Lys Asp Val
50 55 60
Asp Ile Asn Arg Val His Gly Trp Met Val Phe Ala Phe Gly Tyr Arg
65 70 75 80
Val Leu His Gln Ser Phe Arg Ile Met Tyr Pro His Asp Thr Cys Arg
85 90 95
Glu Phe Trp Glu Gln Val Asn Met His Asn Gly Gln Trp Arg Ser Asp
100 105 110
Thr Pro Ser Thr
115
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(112)
<223> CD19-ORI-VL
<400> 8
Met Thr Arg Ser Ile Lys Glu Gln Cys Tyr Cys Gly Arg Arg His Tyr
1 5 10 15
Ser Asp Pro Trp Glu Phe Met Met Leu Trp Lys Trp Arg Asn Asn Lys
20 25 30
Asn Val Ser Asn His Trp Trp Pro Phe Arg Asn Ser His Glu Glu Asn
35 40 45
His Glu Tyr Glu Arg Cys Arg Asp Tyr Ser Glu Leu Gln Ser Met Pro
50 55 60
Thr Trp Gly Arg Met Gln Ala Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Glu Trp Pro
65 70 75 80
Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala Lys Ser Tyr Thr Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Arg Tyr Lys Val Glu Tyr Gln Trp His Leu Met Gln Ser His
100 105 110
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(116)
<223> AzzH-13-VH
<400> 9
Gly Phe Ala Leu Ser Met Thr Asp Trp Ile Arg Gln Gly Pro Gln His
1 5 10 15
Ile Asp Thr Ile Pro His Trp Gln Glu Leu Ser His Thr Ser Gly Pro
20 25 30
Asp Phe Ser Gln Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ile Leu Ala His Met Arg
35 40 45
Arg Trp Ser Glu Trp Val Asn Val Trp Val Gly Ile Tyr Lys Asp Val
50 55 60
Asp Ile Asn Arg Val His Gly Trp Met Val Phe Ala Phe Gly Tyr Arg
65 70 75 80
Val Leu His Gln Ser Phe Arg Ile Met Tyr Pro His Asp Thr Cys Arg
85 90 95
Glu Phe Trp Glu Thr Val Asn Met His Asn Gly Gln Trp Arg Ser Asp
100 105 110
Thr Pro Ser Thr
115
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(112)
<223> AzzL-13-VL
<400> 10
Met Thr Arg Ser Ile Lys Glu Gln Ala Tyr Cys Gly Arg Arg His Tyr
1 5 10 15
Ser Asp Pro Trp Glu Phe Met Met Leu Trp Lys Trp Arg Asn Asn Lys
20 25 30
Asn Val Ser Asn His Trp Trp Pro Phe Arg Asn Gln His Glu Glu Asn
35 40 45
His Glu Tyr Glu Arg Cys Arg Asp Tyr Ser Glu Leu Gln Ser Met Pro
50 55 60
Thr Trp Gly Arg Met Gln Ala Gln Thr Tyr Trp Glu Leu Glu Trp Pro
65 70 75 80
Asn Glu Cys Arg Phe Ser Thr Trp Pro Ala Lys Ser Tyr Thr Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Arg Tyr Lys Val Glu Tyr Gln Trp His Leu Met Gln Ser His
100 105 110
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(329)
<223> 人抗体IgG1重链恒定区
<400> 11
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(110)
<223> 人抗体IgG1轻链恒定区
<400> 12
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
20 25 30
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
35 40 45
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
50 55 60
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
65 70 75 80
Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
85 90 95
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 110

Claims (6)

1.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物包括：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:01的CDR-L1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:02的CDR-L2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:03的CDR-L3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4的CDR-H1，和氨基酸序列如SEQ ID NO:5的CDR-H2，和氨基酸序列如SEQ ID NO:6的CDR-H3的抗体，和
(b)与所述抗体偶联的偶联部分，所述偶联部分选自药物、毒素、细胞因子、放射性核素或其组合。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述抗体选自单克隆抗体、特异性结合人CD19的抗体片段、鼠源抗体、人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQID NO:9所示，所述抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物包括MC-val-cit-PAB、MC-ala-phe-PAB、MP-val-cit-PAB、SPP、SMCC或VcMMAE。
6.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物包括美登素衍生物DM1、美登素衍生物DM4、多拉司他汀、MMAE、DNA损伤药物，优选地，所述抗体药物偶联物包括美登素衍生物DM1。
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