JP2023503901A - 免疫療法のためのｔ細胞二重特異性抗体の作製における最適化された抗ｃｄ３アーム - Google Patents

Abstract

生産性、安定性、結合親和性、生物活性、特定のＴ細胞の特異的な標的化、標的化効率、残留している腫瘍細胞の死滅及び低減した毒性などの特に有利な特性を有する新規のＣＤ３抗原結合断片が提供される。Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子も提供される。加えて、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、上記の前記二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法がさらに提供される。【選択図】図１

Description

本出願は、各々の内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１２月２０日に出願された「Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ａｒｍ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」という名称の米国仮特許出願第６２／９７４，７４４号明細書及び２０２０年４月３０日に出願された「Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ａｒｍ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」という名称の米国仮特許出願第６３／０１７，９９９号明細書の利益を主張する。

本発明は、概して、Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、そのようなＣＤ３結合断片及び二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成する方法にも関する。本発明は、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法にさらに関する。

近年、Ｔ細胞特異的抗体を利用する免疫療法が癌治療を変革している。これらの二重特異性抗体は、Ｔ細胞をリクルートし、且つリダイレクトして腫瘍細胞を攻撃し、液性及び固形癌の治療に対して非常に大きい潜在力を有する（Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ，Ｊａｎｍａａｔ ＭＬ，Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ＪＭ，Ｐａｒｒｅｎ ＰＷＨＩ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１９；１８）。固形腫瘍のための二重特異性抗体の開発では、結合親和性、効力、組織分布及び毒性を含むいくつかの課題がある。高親和性のＣＤ３抗体は、細胞溶解性シナプス形成の増加を促進し、それにより腫瘍細胞の排除を増進させる可能性がある。先行文献は、Ｔ細胞エンゲージャー二重特異性抗体により促進されるポリクローナルＴ細胞の活性化による毒性の懸念及び致死的なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を示した。ＣＲＳは、免疫細胞が自己完結できないほど過剰に活性化することによって生じると考えられる。サイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化と本質的に関連するため、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体に関連して、高親和性のＣＤ３結合は、より高いサイトカイン放出を引き起こす。他方では、いくつかの証拠は、高いＣＤ３結合親和性が二重特異性抗体の腫瘍抗原依存的な組織分布を減退させ、Ｔ細胞コンパートメントにおける二重特異性抗体の蓄積を増加させることを実証している。したがって、課題は、抗ＣＤ３アームの親和性を操作することにより、効力と毒性との間の最適なバランスを見出すことである。

ＣＥＡは、胃腸癌のための臨床バイオマーカーとして広範に使用されてきた、約１８０ｋＤの分子量を有する細胞表面糖タンパク質である。ＣＥＡの過剰発現は、結腸、胃、直腸及び膵臓腫瘍を含む胃腸管悪性腫瘍の９０％；肺癌の７０％；乳癌の約３０～５０％；及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）において観察されている。ＣＥＡの異所性発現は、上皮細胞、内皮細胞並びに白血球及び樹状細胞などの免疫細胞における腫瘍形成を促進することが提唱されている。いくつかの腫瘍型上での高い発現（ただし、非悪性一次組織上では相対的に低い発現）は、ＣＥＡを治療抗体のための理想的な標的にしている。ＲｏｃｈｅのＲＧ７８０２（ＣＥＡ－ＴＣＢ）二重特異性抗体に関する第１相臨床試験において、患者の４５％は、６０ｍｇを超える単剤として治療されるときに疾患の部分奏効又は安定化のいずれかを示した（Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ Ｊ，Ｍｅｌｅｒｏ Ｉ，Ｒｏｓ Ｗ，Ａｒｇｉｌｅｓ Ｇ，Ｍａｒａｂｅｌｌｅ Ａ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｒｕｉｚ ＭＥ，Ａｌｂａｎｅｌｌ Ｊ，Ｃａｌｖｏ Ｅ，Ｍｏｒｅｎｏ Ｖ，Ｃｌｅａｒｙ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ Ｉａ ａｎｄ Ｉｂ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）Ｔ－ｃｅｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ）ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｇｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ（ｍＣＲＣ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１７；３５）。しかしながら、ＲｏｃｈｅのＲＧ７８０２（ＣＥＡ－ＴＣＢ）は、依然として高いサイトカイン放出症候群を誘導する一方、患者における低い応答などの多くの不利点を有する。

広範な臨床的要求を満たすために、本発明は、Ｔ細胞上のＣＤ３への結合の低減を有する最適化された抗ＣＤ３抗体と、腫瘍抗原への二価の結合及びＣＤ３に対する機能的に一価の結合を示した最適化された抗ＣＤ３アームを有する新規の二重特異性形式とを提供する。

本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、特定のＴ細胞の特異的な標的化、標的化効率、残留している腫瘍細胞の死滅及び低減した毒性などの特に有利な特性を有する新規のＣＤ３抗原結合断片を提供する。本発明は、Ｔ細胞を活性化するための二重特異性抗原結合分子も提供する。加えて、本発明は、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、上記の前記二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴及び利点のよりよい理解は、実施形態及び実例の提示における以下の詳細な説明で説明される。

ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体構造の図解を示す。抗ＣＤ３配列は、抗ＣＥＡ軽鎖のＣ末端に連結される。その抗ＣＤ３配列は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）エフェクター機能を消失させるＦｃ受容体（ＦｃγＲ、ＦｃＲ）の結合を抑制する重要な点変異を含有する。 活性化ＰＢＭＣによるＣＥＡ発現ＬＳ－１７４Ｔ腫瘍細胞に対するＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂ媒介性細胞傷害を示した。 活性化ＰＢＭＣによるＣＥＡ発現ＬｏＶｏ腫瘍細胞に対するＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂ媒介性細胞傷害を示した。 ＬＳ－１７４Ｔ、ＬｏＶｏ及びＨＥＫ細胞のＣＥＡ発現レベルを示した。 新たに単離されたＰＢＭＣを媒介してＣＥＡ発現ＨＰＡＣ標的細胞を死滅させるＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂを示した。 新たに単離されたＰＢＭＣを媒介してＣＥＡ発現ＫＡＴＯ ＩＩＩ標的細胞を死滅させるＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂを示した一方、陰性ＨＥＫ２９３細胞において、細胞溶解は、実質的に観察されなかった。 ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂに誘導される高レベルのＩＦＮ－γサイトカイン放出を示した。 ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂに誘導される高レベルのＩＦＮ－γサイトカイン放出を示した。 変異体ＣＤ３結合体バリアントの結合の評価を示した。ＣＤ３ＯＰＴバリアントの結合親和性は、フローサイトメトリーでジャーカット細胞及びＰＢＭＣによって評価された。 カニクイザルＣＤ３との交差反応性に対するＣＤ３結合体の変異の影響がないことを示した。 ＣＥＡ発現様式におけるＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂバリアント媒介性ＮＦＡＴシグナル伝達を示した。Ｔ細胞活性は、ＮＦＡＴ活性によって反映された。 様々な結合親和性を有するＣＤ３結合体バリアントによるＬＳ－１７４Ｔ細胞の溶解活性を示した。 様々な結合親和性を有するＣＤ３結合体バリアント（ＣＤ３アーム）によるＨ９２９細胞の溶解活性を示した。 ＬＳ－１７４Ｔ及びＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞のＣＥＡ発現レベルを示した。 本発明のＣＤ３結合体バリアントの存在下でのＰＢＭＣによるＫＡＴＯ ＩＩＩ腫瘍細胞の溶解を示した。 ＰＢＭＣ及びＬＳ－１７４Ｔ細胞とともに培養されるとき、本発明のＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂバリアントがＩＦＮ－γサイトカイン放出を誘導することを示した。 ＰＢＭＣ及びＬＳ－１７４Ｔ細胞とともに培養されるとき、ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂバリアントがＴＮＦ－αサイトカイン放出を誘導することを示した。 ＰＢＭＣ及びＬＳ－１７４Ｔ細胞とともに培養されるとき、ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂバリアントがＩＬ－２サイトカイン放出を誘導することを示した。 本発明のＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂバリアントがＩＦＮ－γサイトカイン放出を誘導することを示した。 これらのＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂバリアントがＴＮＦ－αサイトカイン放出を誘導することを示した。 ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの結合特異性及び組織交差反応性の評価を示した。正常ヒト（ＬＳ－１７４細胞、図１２Ａ～図１２Ｃ）及び癌性組織（ＣＲＣ段階ＩＶ腫瘍細胞、図１２Ｄ～図１２Ｆ及びＣＲＣ段階ＩＩＩ腫瘍細胞、図１２Ｇ～図１２Ｉ）のセットは、ＣＥＡ／ＣＤ３－１ａ３ｂ２ｂ１－ＢｓＡｂ（図１２Ａ～１２ＸにおいてＣＥＡ／ＣＤ３－ｖ２も指す）（図１２Ａ、図１２Ｄ、図１２Ｇ）、対照抗ＣＥＡ ｍＡｂ（図１２Ｂ、図１２Ｅ、図１２Ｈ）又はアイソタイプ対照ＢｓＡｂ（図１２Ｃ、図１２Ｆ、図１２Ｉ）で染色され、免疫組織化学（ＩＨＣ）手法によって調査された。ＣＥＡ発現ＬＳ－１７４細胞（図１２Ａ）、ＣＲＣ段階ＩＶ腫瘍細胞（図１２Ｄ）及びＣＲＣ段階ＩＩＩ腫瘍細胞（図１２Ｇ）は、ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（図１２Ａ～１２ＸにおいてＣＥＡ／ＣＤ３－ｖ２も指す）及び対照抗ＣＥＡ ｍＡｂ（図１２Ｂ、図１２Ｅ及び図１２Ｈ）による非常に濃い（グレード＋４）染色を示した。特異的な染色は、アイソタイプ対照ＢｓＡｂのために染色された切片において見出された（図１２Ｃ、図１２Ｆ及び図１２Ｉ）。正常ヒト結腸、乳房、肺、前立腺、肝臓、卵巣及び脳組織は、試験されたＣＥＡ／ＣＤ３－１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ及び対照抗体といずれのオフターゲット反応性も示さなかった（図１２Ｊ～図１２Ｘ）。 Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の形式の概略図を示す。ＣＥＡ－ＴＣＢは、非対称な２対１の分子形式を使用した。対照的に、Ｌｕｙｅ ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体は、対称なＴｅｔｒａＢｉ抗体形式を使用した。 Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの結合親和性の比較を示した。図１４Ａは、ヒトＰＢＭＣに対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（Ｌｅａｄ ＣＥＡ／ＣＤ３とも称される）の結合を示した。図１４Ｂは、ジャーカット細胞に対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの結合を示した。細胞は、段階希釈されたＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ又はＩｇＧ対照に続いてＰＥ－コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ ａｂで染色された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、フローサイトメトリーによって決定された。図１４Ｃは、ＣＥＡ発現ＭＫＮ－４５細胞に対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの結合を示した。図１４Ｄは、ＣＥＡ発現ＬＳ－１７４Ｔ細胞に対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの結合を示した。細胞は、段階希釈されたＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ又はＩｇＧ対照に続いてＰＥ－コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ａｂで染色された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、フローサイトメトリーによって決定された。 ＭＫＮ－４５腫瘍細胞に対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（Ｌｅａｄ ＣＥＡ／ＣＤ３とも称される）活性化Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示した。ＭＫＮ－４５標的細胞が収集され、計数され、９６ウェルプレートに播種された。エフェクターＰＢＭＣがＲＰＭＩ１６４０中において２０：１の比率で各ウェルに添加された。指定の抗体の段階希釈がＰＲＭＩ１６４０培地中で実施され、標的／エフェクター含有ウェルに添加された。プレートは、４８時間インキュベートされ、ルシフェラーゼ強度が決定された。 ＭＫＮ－４５及びＰＢＭＣの共培養からの上清が回収され、ＩＮＦ－γ（図１５Ｂ）、ＴＮＦ－α（図１５Ｃ）、ＩＬ－２（図１５Ｄ）、ＩＬ－６（図１５Ｅ）及びＩＬ－１０（図１５Ｆ）がＥＬＩＳＡアッセイによって決定された。 Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢと比較して、ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの存在下での様々なＥ／Ｔ比のＣＥＡ発現標的細胞に対する死滅活性を試験する死滅アッセイに基づく死滅効力に対するＥ／Ｔ比の影響の評価を示した。新たに単離されたＰＢＭＣは、ルシフェラーゼがトランスフェクトされたＬＳ－１７４Ｔ細胞とともに４種類のＥ：Ｔ比：２０：１、１０：１、５：１及び２．５：１で共培養された。 Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（Ｌｅａｄ ＣＥＡ／ＣＤ３とも称される）の有効性に対するＣＥＡ発現の影響を示した。図１５Ａと同じ実験プロトコルを使用して、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１の細胞溶解活性が様々なＣＥＡ発現腫瘍細胞株、ＭＫＮ－４５、ＬＳ－１７４Ｔ、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＨＴ－２９及びＡ５４９によって試験された。 ＣＥＡ／ＣＤ３がインビボでの強力なＴ細胞に媒介される腫瘍細胞の死滅を誘導することを示した。図１８Ａは、ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体のインビボ有効性試験のためのヒト化ＮＳＧモデルを示した。雌ＮＳＧマウスは、ヒトＰＢＭＣ及びＬＳ－１７４Ｔ腫瘍細胞の混合物を接種された。マウスは、７日目及びその後、１週間に２回で１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ（１マウス当たり）用量の指定のＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体又は溶媒により治療された。腫瘍増殖がモニターされた。試験は、腫瘍細胞が移植された後の２４日目に終了された。図１８Ｂは、各マウス群の腫瘍体積に関するデータを示した。 同じ異種移植ヒト化動物モデルにおけるＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＬｕｙｅ ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂのインビボ有効性の比較を示した。図１９Ａは、指定の抗体及びＰＢＳ対照に対する個々のマウスの応答を示した。図１９Ｂ：この図は、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢに対する個々のマウスの応答を示したＢａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＥＡ ＴＣＢ）ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２２（１３）Ｊｕｌｙ １，２０１６の３２９２頁（図４）から引用される。

一般的定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書を解釈するために以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は、複数形も含み、逆の場合も同様である。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈において明確に別段の指示がない限り、複数形も指し、例えば、「宿主細胞」への参照は、複数のそのような宿主細胞を含む。

本明細書で使用する場合、用語「抗原結合断片」又は「抗原結合分子」は、最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。本明細書の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）並びに抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含有するか又はモノクローナル抗体製剤の生産中に生じる考えられるバリアント抗体（そのようなバリアントは、一般に、微量で存在する）を除いて、同一であり且つ／又は同じエピトープに結合する。通常異なる決定基（エピトープ）に対して作られる異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して作られる。

用語「二重特異性」は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基、例えば各々が異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の対によって形成される２つの結合部位に特異的に結合できることを意味する。そのような二重特異性抗体は、１＋１形式である。他の二重特異性抗体形式は、２＋１形式（第１の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位及び第２の抗原又はエピトープに対する１つの結合部位を含む）又は２＋２形式（第１の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位及び第２の抗原又はエピトープに対する２つの結合部位を含む）である。通常、二重特異性抗体は、各々が異なる抗原決定基に特異的な２つの抗原結合部位を含む。用語「価」は、本出願内で使用する場合、抗原結合分子における指定される数の結合ドメインの存在を意味する。そのため、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子におけるそれぞれ２つの結合ドメイン、４つの結合ドメイン及び６つの結合ドメインの存在を意味する。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば、「四価」又は「六価」）であり得る。特定の態様では、本発明の抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。すなわち、抗体は、３つ以上の結合部位がある（すなわち抗体が三価又は多価である）場合でも二重特異性であり得る。用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「完全抗体」は、本明細書で互換的に使用されて、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体を指す。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、ジスルフィド結合される２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）に続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）に続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの型の１つに割り当てられ、そのいくつかは、亜型、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、αｌ（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられ得る。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型の１つに割り当てられ得る。「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、交差－Ｆａｂ断片；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；抗体断片及び単一ドメイン抗体から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｉｉｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたく；国際公開第９３／１６１８５号パンフレット；及び米国特許第５，５７１，８９４号明細書及び同第５，５８７，４５８号明細書も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み且つインビボ半減期の増大を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５，８６９，０４６号明細書を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合ドメインを有する抗体断片であり、例えば欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号パンフレット；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディは、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）にも記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂｌ号明細書を参照されたい）。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有する（すなわちＶＬドメインとともに機能的な抗原結合部位に集合することができ、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらす）か、又はＶＬドメインの特徴を有する（すなわちＶＨドメインとともに機能的な抗原結合部位に集合することができ、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらす）一本鎖ポリペプチドを含む。抗体断片は、本明細書に記載されるとおりのインタクトな抗体のタンパク質消化及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生を含むが、これらに限定されない様々な手法によって作製され得る。インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨＩ）を含有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書で使用する場合、用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＬドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片並びにＶＨドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨＩ）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨＩドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の付加の分だけＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。

「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した抗体の重（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシン及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）において記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有する（すなわちＶＬドメインとともに機能的な抗原結合部位に集合することができ、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらす）か、又はＶＬドメインの特徴を有する（すなわちＶＨドメインとともに機能的な抗原結合部位に集合することができ、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらす）一本鎖ポリペプチドを含む。

「特異的に結合する」により、結合が抗原に対して選択的であり、望まれないか又は非特異的な相互作用と区別され得ることが意味される。特定の抗原に結合する抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られる他の手法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）手法（ＢＩＡｃｏｒｅ機器上で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかを介して測定され得る。一実施形態では、関連しないタンパク質に対して抗原結合分子が結合する程度は、例えば、ＳＰＲによって測定した場合、抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、＜１μΜ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ又は＜０．００１ｎＭ（例えば、１０^－７Ｍ以下、例えば１０^－７Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。

「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性の相互作用の総計の強度を指す。別段の指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を指す固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離速度定数及び結合速度定数（それぞれｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎ）の比率である解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。したがって、速度定数の比率が同じである限り、均等な親和性は、異なる速度定数から構成され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られる一般的な方法によって測定され得る。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。本明細書で使用する場合、抗体の「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１０^－９Ｍ以下、より具体的には１０^－１０Ｍ以下のＫｄを有する抗体を指す。抗体の「低親和性」という用語は、１０^－８以上のＫｄを有する抗体を指す。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子が抗原に結合することに関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。

超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に対する参照において本明細書で互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）によって記載されており、これらの定義は、互いに対して比較したとき、アミノ酸残基の重複又は部分集合を含む。それにもかかわらず、抗体又はそのバリアントのＣＤＲを参照するためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用されるとおりの用語の範囲内であることが意図される。上で引用される参考文献の各々によって定義されるとおりのＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として表Ａにおいて下に記載される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、いずれの残基が特定のＣＤＲを構成するかを慣例的に決定することができる。

Ｋａｂａｔらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のための付番方式も定義した。当業者は、配列自体以外の実験データに依存することなく、「Ｋａｂａｔ付番」のこの方式を任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔ付番」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって記載される付番方式を指す。別段の指定がない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基位置の付番に対する参照は、Ｋａｂａｔ付番方式に従う。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ又はａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、ＬＩのアミノ酸残基３１～３４、Ｌ２の５０～５５、Ｌ３の８９～９６、ＨＩの３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～５８及びＨ３の９５～１０２で生じる（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照されたい）。別段の指示がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って本明細書において付番される。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の配列において現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含み得るか、又はそれは、アミノ酸配列の変化を含有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸の変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列においてＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。

「～に融合される」又は「～に連結される」は、構成要素（例えば、抗原結合ドメイン及びＦＣドメイン）が直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって結合されることを意味する。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外来核酸が導入されている、そのような細胞の子孫を含む細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。

薬剤、例えば医薬組成物の「治療有効量」は、所望の治療又は予防結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。治療有効量の薬剤は、例えば、疾患の有害作用を消失させるか、低減するか、遅らせるか、最小化するか又は予防する。

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、個体又は対象は、ヒトである。用語「医薬組成物」は、その中に含有される活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、その製剤が投与される対象に許容できない毒性のある追加の成分を含有しない製剤を指す。薬学的に許容される賦形剤は、対象に対して非毒性である活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤としては、緩衝剤、安定剤又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などのその文法的変形形態）は、治療されている個体の自然経過を変えるための臨床介入を指し、予防のために又は臨床病理の経過中のいずれかで実施され得る。治療の望ましい効果としては、疾患の発生又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理学的因果関係の減少、転移を予防すること、疾患進行の速度を低下させること、疾患状態の改善又は緩和及び寛解又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、疾患の発症を遅らせるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。

用語「癌」は、本明細書で使用する場合、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞性細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚性若しくは眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃の癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓若しくは尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、上の癌のいずれかの抵抗性の型又は上の癌の１つ以上の組み合わせなどの増殖性疾患を指す。

本発明は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、特定のＴ細胞の特異的な標的化、標的化効率、残留している腫瘍細胞の死滅及び低減した毒性などの特に有利な特性を有する新規のＣＤ３抗原結合断片を提供する。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ、Ｌ１０８Ｔ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ、Ｋ５２ｂＮ及びＹ５８Ｔから選択される１つ以上の変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、本発明は、重鎖可変領域を含むＣＤ３抗原結合断片を提供し、ＶＨドメインは、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ、Ｋ５２ｂＮ又はＹ５８Ｔから選択される１つ以上の変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ及びＦ９８Ｗの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＫ５２ｂＮの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＹ５８Ｔの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含むＣＤ３抗原結合断片を提供し、ＶＨドメインは、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ及びＬ１０８Ｔから選択される１つ以上の変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ及びＬ１０８Ｔの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ、Ｌ１０８Ｔ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＫ５２ｂＮの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ、Ｌ１０８Ｔ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＹ５８Ｔの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）をさらに含み、ＶＬドメインは、配列番号２を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）をさらに含み、ＶＬドメインは、配列番号４を含む。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）及び軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ、Ｌ１０８Ｔ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＫ５２ｂＮの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものであり、ＶＬドメインは、配列番号２又は配列番号４を含む。

一実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨドメイン）及び軽鎖可変領域（ＶＬドメイン）を含み、ＶＨドメインは、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ、Ｌ１０８Ｔ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＹ５８Ｔの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものであり、ＶＬドメインは、配列番号２又は配列番号４を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号１９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

特別な実施形態では、ＣＤ３抗原結合断片は、配列番号３０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２又は配列番号４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

一態様では、上記のＣＤ３抗原結合断片のいずれか１つは、操作されたＣＤ３抗原結合断片である。

本発明は、ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含む新規の二重特異性抗原結合分子も提供し、本発明の新規の二重特異性抗原結合分子は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、特定のＴ細胞の特異的な標的化、標的化効率、残留している腫瘍細胞の死滅及び低減した毒性などの有利な特性を有する。

一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体であり得る。

一態様では、第２の抗原結合ドメインは、上記のＣＤ３抗原結合断片を含む。

一実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とを含み、及び第２の抗原結合ドメインは、２つの同一のＣＤ３抗原結合断片を含み、各ＣＤ３抗原結合断片は、上記のＣＤ３抗原結合断片から選択され、第１の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖は、第２の抗原結合ドメインのそれぞれの前記ＣＤ３抗原結合断片に融合される。

一実施形態では、第１の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖の定常領域のＣ末端は、直接的に又はＧＳリンカー、より具体的には配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどのペプチドリンカーを介して第２の抗原結合ドメインのそれぞれの前記ＣＤ３抗原結合断片の重鎖可変領域のＮ末端に融合される。

一実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、アグリコシル化モノクローナル抗体であり、及び／又はＣＤ３抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。

一実施形態では、前記第１の抗原結合断片は、ＣＥＡ抗原結合断片である。

１つの特別な実施形態では、ＣＥＡ抗原結合断片は、配列番号５を含む重鎖可変領域及び配列番号６を含む軽鎖可変領域を含む。

１つの特別な実施形態では、ＣＥＡ抗原結合断片は、配列番号７を含む重鎖可変領域及び配列番号８を含む軽鎖可変領域を含む。

本発明は、ＣＥＡに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む新規の二重特異性抗原結合分子も提供し、本発明の新規の二重特異性抗体は、生産性、安定性、結合親和性、生物活性、特定のＴ細胞の特異的な標的化、標的化効率、残留している腫瘍細胞の死滅及び低減した毒性などの有利な特性を有する。

特定の実施形態では、本明細書において、ＣＥＡに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合ドメインが提供され、ＣＥＡに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン又は配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、２つの同一のＣＤ３抗原結合断片を含み、ＣＤ３抗原結合断片の各々は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、
ＶＨドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は
ＶＨドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含み、及びＶＬドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み；
好ましくは、第１の抗原結合ドメインは、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とを含み、及び第２の抗原結合ドメインは、２つの同一のＣＤ３抗原結合断片を含み、第１の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖は、第２の抗原結合ドメインのそれぞれの前記ＣＤ３抗原結合断片に融合され；より好ましくは、第１の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖の定常領域のＣ末端は、直接的に又はペプチドリンカーを介して第２の抗原結合ドメインのそれぞれの前記ＣＤ３抗原結合断片の重鎖可変領域のＮ末端に融合される。

一実施形態では、本発明は、ＣＥＡに結合する免疫グロブリンであるアグリコシル化モノクローナル抗体を含む二重特異性抗原結合分子も提供し、前記免疫グロブリンは、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を含み、前記軽鎖は、第１の軽鎖及び第２の軽鎖を含み、第１の軽鎖は、ペプチドリンカーを介して第１の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合されて、第１の軽鎖融合ポリペプチドを作出し、第２の軽鎖は、ペプチドリンカーを介して第２のｓｃＦｖに融合されて、第２の軽鎖融合ポリペプチドを作出し、第１及び第２のｓｃＦｖは、（ｉ）同一であり、且つ（ｉｉ）ＣＤ３に結合し、第１及び第２の軽鎖融合ポリペプチドは、同一である。

より特別な一実施形態では、第１の軽鎖の定常領域のＣ末端は、直接的に又はペプチドリンカーを介して第１のｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端に融合され、及び第２の軽鎖の定常領域のＣ末端は、直接的に又はペプチドリンカーを介して第２のｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端に融合される。

特別な一実施形態では、第１及び第２のｓｃＦｖの各々は、上記のＣＤ３抗原結合断片を含む。

一態様では、二重特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、ＣＥＡ及びＣＤ３に結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、ＬＳ－１７４Ｔ、ＬｏＶｏ、ＭＫＮ－４５、ＫＡＴＯ ＩＩＩ及びＨＰＡＣ標的細胞を含むが、これらに限定されないＣＥＡ発現標的細胞のＴ細胞による死滅を媒介する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又はＣＤ３抗原結合断片は、ＣＤ３との結合親和性の低減を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又はＣＤ３抗原結合断片は、ＴＣＲシグナル伝達の強度の低減を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又はＣＤ３抗原結合断片は、変異体ＣＤ３結合体バリアントによって媒介されるサイトカイン放出の低減を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子又はＣＤ３抗原結合断片は、ＬＳ－１７４Ｔ、ＬｏＶｏ、ＭＫＮ－４５、ＫＡＴＯ ＩＩＩ及びＨＰＡＣ標的細胞を含むが、これらに限定されないＣＥＡ発現腫瘍細胞に対する腫瘍細胞溶解を示す。

一態様では、本明細書において、上記の前記ＣＤ３抗原結合断片又は二重特異性抗原結合分子のいずれか１つを含む医薬組成物が提供される。

一実施形態では、本明細書において、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、上記の前記ＣＤ３抗原結合断片又は上記の前記二重特異性抗原結合分子のいずれか１つを対象に投与することを含む方法が提供される。

一実施形態では、癌は、ＣＥＡ陽性癌である。

特定の実施形態では、癌は、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌又は他の胃腸癌である。

一実施形態では、本発明は、上記のＣＤ３抗原結合断片又は上記の前記二重特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む単離された核酸をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、上記の前記核酸配列を含むベクターをさらに提供する。一実施形態では、本発明は、上記の前記核酸又は上記の前記ベクターを含む単離された宿主細胞をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、抗原結合断片又は二重特異性抗原結合分子を産生する方法であって、抗原結合断片又は二重特異性抗原結合分子が産生されるように上記の前記宿主細胞を培養することを含む方法をさらに提供する。特別な一実施形態では、上の方法は、細胞によって産生される抗原結合断片又は二重特異性抗原結合分子を回収することをさらに含む。

定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。
作製される異なる形式の二機能抗体の定義：
Ｌｕｙｅ ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂとも称されるＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂ（ヒトＣＥＡ及びＣＤ３に対する二重特異性抗体）。
ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ（最適化されたＣＤ３ＯＰＴ１ａバリアントが組み込まれたＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体）。
ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ（最適化されたＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂバリアントが組み込まれたＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体）。
ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ａ（最適化されたＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ａバリアントが組み込まれたＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体）。
Ｌｅａｄ ＣＥＡ／ＣＤ３とも称されるＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１（最適化されたＣＤ３１ａ３ｂ２ｂ１バリアントが組み込まれたＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体）。

Ｌｕｙｅ ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂの構成要素
表１は、以下の実施例において使用されるＬｕｙｅ ＣＥＡ／ＣＤ３の構成要素を示す。

実施例１
ＣＥＡ／ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の構築
これまで開発された大部分のＴ細胞二重特異性抗体は、Ｔ細胞の動員に抗ＣＤ３部分を利用しており、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１、ＳＰ３４及びＴＲ６６（Ｊｕｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３９４５－３９５２（１９８６）；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７－１１００（１９８６）；及びＨａｙｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：８７－９２（１９８８））が抗ＣＤ３アームとして最も一般的に使用されている。ＣＥＡ－ＣＤ３形式における様々なＣＤ３結合体の特徴をさらに比較するために、本発明者らは、図１の形式を使用してＣＥＡ Ｔ細胞二重特異性抗体を作製した。ＳＰ３４及びそのバリアントがＣＤ３結合アームとして使用され（ＣＤ３結合体バリアント）、ｈＴ８４．６６がＣＥＡ結合アームとして使用された（ＣＥＡ結合体バリアント）。ＳＰ３４及びｈＴ８４．６６の最適化された形式（すなわちＯＰＴ形式）を設計して、ｓｃＦｖのフレームワークを安定化させて、半減期に影響を及ぼし、且つ凝集を減少させた（表２を参照されたい）。

実施例２
ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡ発現標的細胞のＴ細胞による死滅及びサイトカイン放出を媒介する。
本発明者らは、異なるＣＥＡ発現腫瘍細胞に対するＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍効果を調べた。新鮮なヒトＰＢＭＣがＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８と６日間培養された。細胞傷害性アッセイは、Ｅ／Ｔ（エフェクター：標的）比１０：１で実施された。異なる抗体によって媒介される細胞傷害性は、試験抗体の段階希釈物中の１８時間のインキュベーション後に死腫瘍細胞から放出されるＬＤＨによって評価された。図２Ａ及び２Ｂに示されるとおり、ｈＴ８４．６６／ＳＰ３４二重特異性抗体（ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂと称される、表１の配列表）は、用量依存的な様式でＣＥＡ発現ＬＳ－１７４Ｔ及びＬｏＶｏ腫瘍細胞のＴ細胞にリダイレクトされる細胞傷害性を増強した。

ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性をさらに評価するために、ヒトＰＢＭＣが健常なドナーの新鮮な血液から精製され、死滅アッセイを実施するために使用された。新鮮なＰＢＭＣエフェクター細胞及びＣＥＡ発現ＨＰＡＣ若しくはＫＡＴＯ ＩＩＩ標的細胞又はＣＥＡ陰性ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体（ここではＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂ）の存在下で共培養された（１０：１のＥ：Ｔ比）。ＰＢＭＣの死滅活性は、インキュベーションの２４時間後にＡＴＰ放出によって評価された。図３Ａ及び３Ｂに示されるとおり、ＣＥＡ／ＣＤ３親二重特異性抗体も、新たに単離されたＰＢＭＣを媒介してＣＥＡ発現標的細胞を死滅させることができる一方、実際には、ＣＥＡ陰性ＨＥＫ２９３細胞とともにＰＢＭＣ及びＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂの存在下で細胞溶解は観察されなかった。本発明者らは、ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂによる強力な腫瘍細胞死滅を観察したが、高レベルのサイトカイン放出も同時に生じる可能性がある。

野生型ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体がインビトロで強力なサイトカイン産生を誘導したかどうかを確認するために、ヒトＰＢＭＣが単離され、抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングされたビーズと６日間培養された。その後、活性化Ｔ細胞は、ＣＥＡ／ＣＤ３親二重特異性抗体（ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂ）の存在下又は非存在下で様々な発現レベルのＣＥＡ（ＣＥＡを高度に発現するＨＰＡＣ及びＣＥＡを中程度に発現するＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞）を有する腫瘍標的細胞株並びにＣＥＡ陰性ＨＥＫ２９３及びＣａｃｏ２細胞と共培養された。上清がＰＢＭＣ及び腫瘍標的細胞の共培養の２４時間後に回収され、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌がＥＬＩＳＡによって評価された。ＣＥＡ／ＣＤ３親二重特異性抗体の治療は、中程度のレベルのＣＥＡ発現を有するＫＡＴＯ ＩＩＩ腫瘍細胞と共培養したＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２産生を増加させた一方、ＣＥＡ／ＣＤ３親二重特異性抗体は、ＣＥＡを高度に発現するＨＰＡＣ腫瘍細胞と共培養するＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２のはるかに強力な増加を惹起した。さらに、両方の共培養条件において、ＣＥＡ／ＣＤ３親二重特異性抗体で処理されたＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２産生は、抗体用量依存的な様式で増加した（図４Ａ及び４Ｂ）。対照的に、検出可能なレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－２産生は、ＣＥＡ陰性ＨＥＫ細胞及びＣａｃｏ２細胞において観察されなかった。データは、野生型ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂ）が、腫瘍細胞に対する溶解及びサイトカイン放出を含む強力なＴ細胞活性を増強することができるという強力な証拠を提供する。

実施例３
ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体におけるＣＤ３結合標的アームは、結合親和性の低減のために設計された。
ＣＤ３に結合する高親和性は、固有の課題を伴う。高親和性のＣＤ３結合体を有するＴ細胞エンゲージャー二重特異性抗体も、治療抗体の投与によって引き起こされる重篤な有害な副作用につながるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘導する可能性がある。最も重要なこととして、Ｔ細胞二重特異性抗体の高い結合親和性は、腫瘍細胞の代わりに脾臓及びリンパ節などのＴ細胞に富む組織に高い偏りを有する。通常、ＣＤ３結合親和性が高い（１ｎＭ／Ｌ未満）場合、Ｔ細胞二重特異性抗体は、リンパ器官に蓄積される一方、より低いＣＤ３親和性（５０ｎＭ／Ｌ超）は、抗体組織分布に影響を及ぼすのに十分でないであろう。本発明者らが使用した抗ＣＤ３モノクローナル抗体の親和性は、相対的にＯＫＴ３より低いが、その親和性は、依然としてナノモル濃度範囲である。したがって、本発明者らは、点変異手法を使用するＣＤ３モノクローナル抗体のＶＨ配列に基づいてより低いＣＤ３結合体バリアントを作製しようとした。知られているとおり、抗体のフレームワーク領域は、抗原結合に直接的に関与しないが、それは、分子のフォールディングを決定し、したがって、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原結合部位と相互作用することができる。ランダムフレームワーク変異試験も、フレームワーク中の特定の残基が抗体構造を安定化し、抗原結合においてアロステリックな寄与の役割を果たすことを実証した。結果として、抗体フレームワーク中のそれらの残基の変化は、結合親和性に影響を及ぼす。本発明者らは、抗ＣＤ３及びＣＤ３の相互作用のタンパク質結晶構造を慎重に調査し、コンピューターによる調査に基づいて抗ＣＤ３のＶＨ－フレームワーク領域中の残基の選択的な変異を実施し、１４のＣＤ３結合体バリアントを作製した。ヒトＣＤ３に対するＣＤ３バリアントの結合は、ＣＤ３発現ジャーカット細胞を使用してフローサイトメトリーにより測定された（図５Ａ）。ジャーカット細胞上のＣＤ３に対する結合をほぼ完全に失った２つの変異体ＣＤ３バリアント（ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ２及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ３）に加えて、他の５つのＣＤ３変異体バリアント（ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ３ａ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ３ｂ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ４及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ６）のＣＤ３結合親和性は、それらの親クローンＣＥＡ／ＳＰ３４と比較して異なる程度まで低下したが、最初の変異体ＣＤ３バリアントにおいてＣＤ３に対する結合親和性の劇的な低減は観察されなかった（図５Ａ及び表３）。はるかに低い結合親和性を有する変異体ＣＤ３バリアントを得るために、さらに６つのＣＤ３結合体バリアントがＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ３ｂバリアントの配列に基づいて設計された。したがって、本発明者らは、これらのＣＥＡ／ＣＤ３結合体バリアントを有する健常なドナーから新たに単離されたＰＢＭＣを染色することにより、ＣＤ３に対するそれらの結合親和性を調べた。実際に、ＦＡＣＳ分析は、変異体ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ａ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ２が、単一の変異と比較して著しく低減した結合親和性を呈することを示した（図５Ｂ及び表３）。この実施例における二重特異性抗体の配列：ＣＤ３のＶＨ配列は、表３に列挙され、ＣＤ３のＶＬ配列は、配列番号２に記載され、ＣＥＡのＶＨ及びＶＬ配列は、それぞれ配列番号５～６に記載される。

本発明者らが使用した抗ＣＤ３抗体の最も重要な特徴の１つは、それがカニクイザルＣＤ３タンパク質との交差反応性を示すことである。抗ＣＤ３バリアントは、親抗体のＶＨフレームワーク配列中の変異に由来したため、カニクイザル交差反応性は、変異体バリアント中の配列変化に起因して失われる可能性がある。その後、カニクイザルＣＤ３タンパク質との交差反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイによって分析された（図６及び表４）。興味深いことに、全てのＣＤ３結合体は、親クローンＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体と同等のカニクイザルＣＤ３タンパク質に対する結合親和性を示した。対照的に、陰性対照として使用されたＣＥＡ／ＯＫＴ３二重特異性抗体は、カニクイザルＣＤ３タンパク質との交差反応性を示さなかったが、これは、本発明者らのＣＤ３結合体バリアント中の複数の点変異がＣＤ３に対する結合親和性を著しく低減しなかったが、これらの変異がカニクイザルＣＤ３との交差活性に対して影響を及ぼさないことを示唆している。

実施例４
ＴＣＲシグナル伝達強度の低減に基づくＣＤ３結合体バリアントの選択
Ｔ細胞の表面でのＣＤ２８とＴＣＲ及び共刺激分子の同時の結合は、完全なＴ細胞活性化をもたらす。通常の条件下では、Ｔ細胞において誘発されるシグナル伝達経路は、ＮＦＡＴ転写因子の活性化及び核移行を含む。ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂにおける変異体ＣＤ３結合体によって媒介されるＴＣＲシグナル伝達の強度を評価するために、本発明者らは、ＮＦＡＴプロモーター下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するジャーカットＴ細胞株を使用した。ジャーカット細胞をＣＥＡ発現腫瘍細胞と共培養するとき、ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂは、ジャーカット細胞上のＴＣＲに結合し、且つそれを二量体化して、ＮＦＡＴ遺伝子活性を促進することができ、その結果、ＮＦＡＴプロモーターにより制御されるルシフェラーゼは、抗体の用量に反応する様式で発現される。図７Ａにおいて予想されるとおり、強力なＮＦＡＴ活性のシグナル伝達は、抗ＣＤ３ ｍＡｂではなく、ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の存在下でＣＥＡ発現ＬＳ－１７４Ｔ細胞とジャーカット細胞との共培養によって検出された。加えて、ＮＦＡＴ活性のシグナル伝達は、ＣＥＡ陰性ＨＥＫ２９３細胞を使用して同じ実験構成において観察されなかった（図７Ａ）。この試料及び信頼できるアッセイを利用することにより、本発明者らは、全ての変異体ＣＥＡ／ＣＤ３バリアントによって媒介されるＴＣＲシグナル伝達の強度をさらに評価した。興味深いことに、非常に弱いＮＦＡＴ活性が三重変異体バリアント（ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ａ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ２）による実験構成において検出されたが、二重変異体ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂは、依然として相対的に高いＮＦＡＴ活性が維持され（図７Ｂ～７Ｃ及び表５～６）、これは、ＣＥＡ／ＣＤ３バリアントの結合親和性と一致する（図５Ｂ）。したがって、このアッセイは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体のＶＨフレームワークにおける複数の実施された変異が、ＣＤ３結合親和性を低減しただけでなく、それらの開始されたＴＣＲシグナル伝達経路も減退させたことを示す。この実施例における二重特異性抗体の配列は、表１に列挙された。

実施例５
ＣＥＡ／ＣＤ３バリアントによる細胞傷害性に対するＣＤ３親和性の影響を評価する
理論上、Ｔ細胞二重特異性抗体におけるＣＤ３結合アームは、それがＴ細胞と腫瘍細胞との間で維持している相互作用を架橋でき、Ｔ細胞が腫瘍細胞に対する溶解を最終的に活性化し、誘発することを可能にするように相対的に高い結合親和性を必要とする。しかしながら、高いＣＤ３結合親和性は、免疫療法に対する重篤な副作用を誘導する可能性がある。したがって、Ｔ細胞二重特異性抗体のＣＤ３結合親和性を評価し、サイトカイン放出レベルと腫瘍溶解活性との間の最適なバランスを実現することは、特に重要である。異なる結合親和性を有する６つの抗ＣＤ３バリアント間で細胞傷害活性を比較するために、ＣＥＡ／ＣＤ３バリアント抗体によって誘導される標的細胞のＴ細胞に媒介される死滅がＬＳ－１７４Ｔ Ｌｕｃ（高いＣＥＡ発現）及びＫＡＴＯ ＩＩＩ Ｌｕｃ（中程度のＣＥＡ発現）ヒト腫瘍細胞に対して評価された。Ｈ９２９ Ｌｕｃ（ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株）は、陰性対照として使用された。健常ドナーから単離されたヒトＰＢＭＣがＩＬ－２（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８と６日間培養された。得られたＰＢＭＣ集団が計数され、１０：１の最終的なＥ：Ｔ比で標的細胞に加えられた。特異的な溶解は、インキュベーションの１８時間後にルシフェラーゼ強度単位の定量化によって決定された。図８Ａ及び表７に示されるとおり、６つのＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ３ｂ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ａ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１）は、用量依存的な様式でＣＥＡ発現ＬＳ－１７４Ｔ腫瘍細胞のＴ細胞にリダイレクトされた細胞傷害性を増強し、特異的な溶解によって測定されるＩＣ５０値は、これらのアッセイにおいて試験されるこれらの６つの二重特異性抗体間で著しく変動しなかったが、これは、ＣＤ３アーム結合親和性が、ＣＥＡを高度に発現するＬＳ－１７４Ｔ細胞によって誘導される細胞傷害活性に強い影響を及ぼさないことを示唆している。対照的に、ＣＥＡ陰性Ｈ９２９Ｌｕｃ細胞に対して、他のパラメーターが同じであるアッセイにおいて、著しい細胞傷害性は見出されなかった（図８Ｂ）。次に、本発明者らは、標的細胞上でのＣＥＡ発現レベルが、ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂ、特に比較的低いＣＤ３結合親和性を有するものによって誘発される細胞傷害活性に対して影響を及ぼすかどうかを調査した。結果として、本発明者らは、標的としてＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞を選択したが、それは、中程度のレベルのＣＥＡがこの細胞株上で発現されるためである（図９Ａ）。同様の細胞傷害性アッセイが実施され、異なるＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体により媒介される腫瘍溶解活性がＫＡＴＯ ＩＩＩ及びＰＢＭＣの共培養の１８時間後にルシフェラーゼ強度単位によって評価された。明らかに、ＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞に対する溶解の効率は、全ての試験されたＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂにおけるＬＳ－１７４Ｔの死滅と比較して著しく低かった（図９Ｂ及び表８）。さらに、二重特異性抗体形式において比較的低いＣＤ３親和性の結合体によって媒介される細胞傷害活性は、標的細胞における比較的低い発現レベルのＣＥＡによって著しく影響を及ぼされるように見える（図９Ｂ及び表８）。この実施例における二重特異性抗体の配列は、表１に列挙される。

実施例６
変異体ＣＤ３結合体バリアントによって媒介されるサイトカイン放出の評価
活性化Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインは、インビトロ及びインビボでの免疫応答に非常に影響を及ぼし得る。それらの中で、ＩＬ－２及びＩＮＦ－γは、Ｔ細胞増殖の支持並びに細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージの活性化を刺激する能力を含む、様々な細胞型に対する複数の免疫調節性の効果を有する。しかしながら、高レベルのサイトカイン放出は、固有であり、且つ潜在的に致死的な有害作用を引き起こす可能性があるため、最近では、Ｔ細胞媒介性免疫療法におけるサイトカイン分泌の低減が重要視されている。したがって、サイトカイン放出のレベルを測定することにより、Ｔ細胞二重特異性抗体のＣＤ３結合親和性を評価することが重要である。サイトカイン放出に対するＣＥＡ／ＣＤ３結合体バリアントの直接的な影響について試験するために、ヒトＰＢＭＣが単離され、抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングされたビーズとともに６日間培養された。その後、ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の存在下でＬＳ－１７４Ｔ細胞（ＣＥＡの高い発現）及びＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞（ＣＥＡの中程度の発現）と共培養された活性化Ｔ細胞が段階希釈された。上清は、共培養の２４時間後に回収され、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α分泌は、ＥＬＩＳＡによって評価された。実際に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２のレベルは、それらのＣＤ３結合親和性と完全に相関する；ＣＥＡ／ＣＤ３親ＢｓＡｂの投与における最も高いサイトカイン放出及び三重変異体ＣＤ３結合体における最も低いサイトカイン放出（図１０）。このサイトカイン放出プロファイルは、ＮＦＡＴ活性のものと同様であった。比較的低い有効性の細胞傷害性が、ＣＥＡを中程度に発現するＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞（図９Ｂ）において見出されたため、本発明者らは、ＣＥＡ発現レベルもサイトカイン放出に寄与するかどうかを探索することを必要とした。ＣＥＡ／ＣＤ３親二重特異性抗体の投与は、抗体用量依存的な様式でＰＢＭＣ及びＫＡＴＯ ＩＩＩ腫瘍細胞の共培養からＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α産生を誘導した一方、サイトカイン分泌のレベルは、ＣＥＡを高度に発現するＬＳ－１７４Ｔ細胞との共培養において観察されるものよりはるかに低かった（図１０Ａ～図１０Ｃ、図１１Ａ～図１１Ｂ）。対照的に、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの産生は、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ａ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１二重特異性抗体で治療された同様の共培養系においてかろうじて検出可能であった（図１１Ａ～図１１Ｂ）。データは、ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体によって誘発されるサイトカイン放出がＣＤ３結合親和性に大きく依存し、及び標的上での抗原発現レベルもサイトカイン放出に部分的に寄与するという強力な証拠を提供する。この実施例における二重特異性抗体の配列は、表１に列挙される。

実施例７
ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの結合特異性及び組織交差反応性の評価
ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂが、治療に関連する毒性を引き起こす可能性がある非標的抗原決定基に結合する潜在力を有するかどうかを確かめるために、正常ヒト及び癌性組織のセットが免疫組織化学（ＩＨＣ）手法によって染色され、調査された。簡潔には、スライド上のＦＦＰＥ組織切片は、脱パラフィンされ、水和され、且つ加熱されたクエン酸緩衝液抗原賦活化に低圧下で２０分間かけられた。ＰＢＳによる洗浄後、切片は、内在性の過酸化物でブロッキングされ（１０分）、タンパク質でブロッキングされ（６０分）、一次抗体とインキュベート（６０分）された後、室温で二次抗体とインキュベートされた（６０分）。染色は、ジアミノベンジジン過酸化物で可視化され（１～２分）、組織は、ヘマトキシリンで対比染色された。細胞株のために、前に固定された細胞は、ガラススライド上に塗りつけられ、一晩風乾され、４℃で保管された。分析のために、なすりつけ標本は、新たな冷たい４％ＰＦＡ中で１０分間固定された後、ＰＢＳで洗浄された。洗浄後、切片は、抗原賦活化のために処理された後、ＦＦＰＥ切片について記載された同じ工程にかけられた。

ＴＣＲ試験の結果は、３μｇ／ｍｌの濃度において、ＣＥＡ発現ＬＳ－１７４細胞（図１２Ａ）、ＣＲＣ段階ＩＶ腫瘍細胞（図１２Ｄ）及びＣＲＣ段階ＩＩＩ腫瘍細胞（図１２Ｇ）が、ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ及び対照抗ＣＥＡ ｍＡｂ（図１２Ｂ、図１２Ｅ及び図１２Ｈ）による非常に濃い（グレード＋４）染色を示すことを示した。染色は、それぞれＣＲＣ段階ＩＶ及びＣＲＣ段階ＩＩＩ組織において多巣性であり、且つ散在性のパターンで分布した。ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１及び抗ＣＥＡ ｍＡｂの両方（データは示さず）は、上皮細胞において低いグレード（グレード＋１）の陽性染色及び正常な結腸の管腔粘液と中程度の非特異的な交差反応性を示した。特異的な染色は、アイソタイプ対照ＢｓＡｂのために染色された切片において見出された（図１２Ｃ、図１２Ｆ及び図１２Ｉ）。正常ヒト結腸、乳房、肺、前立腺、肝臓、卵巣及び脳組織は、試験されたＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ及び対照抗体といずれのオフターゲット反応性も示さなかった（図１２Ｊ～図１２Ｘ）。これらの試験は、段階ＩＶの結腸直腸癌及び胃腺癌が、試験されたＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ及び抗ＣＥＡ ｍＡｂによるグレード４の染色を示したが、正常組織との予測外の交差反応性は観察されなかった。

実施例８
インビトロ及びインビボでの機能におけるＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１二重特異性抗体に対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢの比較分析
Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの抗体形式
Ｒｏｃｈｅは、ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体を開発し、転移性結腸直腸癌の治療における有望な臨床効果が観察された。Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ（シビサタマブとしても知られる、ＲＧ７８０２、ＲＧ－７８０２、ＲＯ６９５８６８８又はＲＯ－６９５８６８８）ＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の構造及び配列情報は、ＩＭＧＴデータベースから得られた。ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ｍＡｂ－ＤＢ／ｓｅａｒｃｈ．ａｃｔｉｏｎ？ｉｎｎＮａｍｅ＝ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂを参照されたい。Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ形式は、以下の４つのコンストラクトを異なる比でトランスフェクトし、およそ１８０ｋＤａの分子量の完全長抗体を同定することによって作製された。配列は、以下のとおりである。
（１）１０６３６Ｈ｜シビサタマブ｜ヒト化｜｜ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－Ｃ－ＫＡＰＰＡ－ＣＨ２－ＣＨ３（ＶＨ（１－１２１）［Ｄ１］＋ＣＨ１（１２２－２１９）［Ｄ２］＋ＶＨ（２３６－３６０）［Ｄ３］＋Ｃ－ＫＡＰＰＡ（３６２－４６７）［Ｄ４］＋ＣＨ２（４７８－５８７）［Ｄ５］＋ＣＨ３（５８８－６９２）［Ｄ６］）６９４

（２）１０６３６Ｌ｜シビサタマブ｜ヒト化｜｜Ｖ－ＬＡＭＢＤＡ－ＣＨ１（Ｖ－ＬＡＭＢＤＡ（１－１０９）［Ｄ１］＋ＣＨ１（１１２－２０９）［Ｄ２］）｜｜２１４

（３）１０６３６Ｍ｜シビサタマブ｜ヒト化｜｜Ｈ－ＧＡＭＭＡ－１（ＶＨ（１－１２１）［Ｄ１］＋ＣＨ１（１２２－２１９）［Ｄ２］＋ＣＨ２（２３５－３４４）［Ｄ３］＋ＣＨ３（３４５－４４９）［Ｄ４］）｜｜４５１

（４）１０６３６Ｎ｜シビサタマブ｜ヒト化｜｜Ｌ－ＫＡＰＰＡ（Ｖ－ＫＡＰＰＡ（１－１０８）［Ｄ１］＋Ｃ－ＫＡＰＰＡ（１０９－２１５）［Ｄ２］）｜｜２１５

この新規のＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体は、インビトロ及びインビボ試験において十分に特徴付けられたため、本発明者らは、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢをＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂと比較する一連の試験を設計することを決めた。この実施例におけるＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの配列は、表１に列挙される。

ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの抗体構造形式は、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢと異なる。Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢは、非対称な２対１の分子形式を使用する（図１３）。それは、Ｔ細胞上のＣＤ３に対する一価の結合及び腫瘍細胞上のＣＥＡに結合する２本のアームを有するように設計される。ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂは、腫瘍細胞上のＣＥＡに対する二価の結合部位及びＴ細胞上のＣＤ３に対する構造的には２本のアームであるが、機能的には１本のアームの結合部位を含む対称なＴｅｔｒａＢｉ抗体形式を使用する（図１３）。Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの両方のＦｃ領域は、潜在的なＦｃ媒介性のＡＤＣＣ及びＣＤＣ副作用を排除するように変異されている。２つのＣＥＡ二重特異性抗体間の主な相違は、ＣＥＡ／ＣＤ３形式の対称な分子構造がＣＥＡに対して同等の結合親和性をもたらすことであり、それは、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢの非対称形式より腫瘍細胞に対してはるかに強力な結合を有するとされている。加えて、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂは、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を有するように設計され、これは、非対称な鎖から生じる複雑化を排除し、製造をより容易に且つより経済的にする。

ＣＤ３及びヒト標的ＣＥＡ結合
Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（図中でＬｅａｄ ＣＥＡ／ＣＤ３とも称される）は、異なる分子構造を有するため、本発明者らは、まず標的分子ＣＥＡ及びＣＤ３に対する両方の抗体の結合親和性を比較した。ヒトＰＢＭＣ及びジャーカットヒトＴリンパ球細胞株とＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１との相互作用が調査された。フローサイトメトリーアッセイによって評価されるとおり、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢは、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（ＥＣ_５０＝８１．０３ｎＭ）よりはるかに高い親和性（ＥＣ_５０＝０．３４ｎＭ）を有してヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞に結合する（図１４Ａ及び表９）。ＰＢＭＣに対する結合と同様に、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢは、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂと比較してジャーカット細胞に対して著しく高い結合親和性を示し、１１２ｎＭに対して０．２の結合ＥＣ_５０を有する（図１４Ｂ及び表９）。抗原ＣＥＡに関するＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂに対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢの結合活性は、フローサイトメトリーによってＣＥＡを高度に発現するＭＫＮ－４５及びＬＳ－１７４Ｔ腫瘍細胞において評価された。ＣＤ３に対する結合とは対照的に、ＭＫＮ－４５及びＬＳ－１７４Ｔ細胞に対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢの結合活性は、ＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂのものよりはるかに低かった（図１４Ｃ、図１４Ｄ）。データは、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂが、ＣＥＡ及びＣＤ３の分子構造又は異なる結合体に起因して標的及びＣＤ３に対する正反対の結合活性を有することを実証した。

ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂに対するＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢのインビトロ及びインビボでの機能活性の比較
Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢとＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（図面においてＬｅａｄ ＣＥＡ／ＣＤ３とも称される）との間のＣＥＡ及びＣＤ３に対する異なる結合親和性を実証したため、次に、本発明者らは、ＣＥＡ発現標的細胞ＭＫＮ－４５の細胞溶解を媒介する２つの二重特異性抗体のインビトロでの有効性を評価した。インビトロ腫瘍溶解アッセイを準備するために、ヒトＰＢＭＣが健常ドナーから新たに単離され、段階希釈されたＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ中で１×１０^４のＭＫＮ－４５発現ルシフェラーゼとともに１ウェル当たり２×１０^５細胞（Ｅ／Ｔ比：２０：１）で４８時間蒔かれた。特異的な溶解は、ルシフェラーゼ強度によって計算された。図１５Ａに示されるとおり、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１は、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢと比較して用量依存的な様式でＭＫＮ－４５細胞に対してより強力な著しい標的特異的な細胞傷害性を示し、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢのＥＣ_５０は、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂのものより５０倍高かった（図１５Ａ）。炎症性サイトカイン（ＩＬ－６及びＴＮＦ－αなど）及び慢性炎症は、腫瘍発生率の増大及び癌を有する患者に関する予後の悪化と相関した。サイトカイン放出と抗体媒介性細胞傷害性の関連性を決定するために、ＰＢＭＣ及び標的細胞ＭＫＮ－４５の共培養の上清からのサイトカイン放出の並行した分析がＥＬＩＳＡアッセイによってなされた。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及びＩＬ－６のレベルは、ＰＢＭＣ及びＭＫＮ－４５のＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ処理された共培養物中でＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢより高く見えるが、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂからのサイトカイン放出レベルは、抗体に誘導されるＥＣ_５０の濃度で判断した場合Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢと同様であった（図１５Ｂ～図１５Ｅ）。（示される矢印は、腫瘍溶解のＥＣ５０濃度を指している）。本発明者らは、上清からの抗炎症性サイトカインＩＬ－１０レベルにも注目した。ＩＬ－１０産生の抗体用量依存的な応答は、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂで処理された共培養上清の両方から検出されたが、２つの抗体処理上清間で著しい相違はなかった（図１５Ｆ）。データは、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂがＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢより強力な細胞溶解活性を有するが、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢと同様のサイトカイン放出レベルを有することを示した。

死滅効力に対するＥ／Ｔ比の影響をさらに評価するために、ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１の存在下で様々なＥ／Ｔ比でのＣＥＡ発現標的細胞に対する死滅活性を試験する死滅アッセイが設定され、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢと比較された。簡潔には、新たに単離されたＰＢＭＣは、ルシフェラーゼでトランスフェクトされたＬＳ－１７４Ｔ細胞とともに４種類のＥ：Ｔ比：２０：１、１０：１、５：１及び２．５：１で共培養された。死滅活性は、共培養の４８時間後の発光単位によって決定された。図１６に示されるとおり、最も高い死滅活性は、２０：１比において観察され、死滅活性は、Ｅ：Ｔ比が低くなるにつれて徐々に低減した。しかしながら、ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂによって媒介される標的溶解は、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢより良好であった。図１６に示されるとおり、ＬＳ－１７４Ｔ細胞に対する２０％の死滅活性は、依然として５：１のＥ：Ｔ比でＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１によって媒介され得るが、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢによって明らかな死滅は観察されなかった。これらの知見は、ＣＥＡ／ＣＤ３－ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１が、Ｔ細胞の限定的な存在下を伴う腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中でＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢより良好に機能し得ることを示唆する。

ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの有効性の閾値の決定
ＣＥＡは、多数のヒト癌において過剰発現されるが、この細胞表面の糖タンパク質は、腎尿路生殖器路、気道及び胃腸管などの様々な上皮組織でも一般的に発現される。結果として、本発明者らのＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体は、理論的には、エフェクターＴ細胞と正常ＣＥＡ発現細胞との間の結合をもたらすことができ、オフターゲット細胞傷害性を引き起こす可能性がある。したがって、本発明者らのＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体によって媒介される細胞傷害性に必要となるＣＥＡ発現の最小レベルを評価することが重要である。Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢの細胞傷害活性は、ＣＥＡを発現する様々なものとともに１００を超える標的細胞株で死滅アッセイを実施することによって十分に特徴付けられた。これらの細胞傷害性実験から、ＣＥＡ－ＴＣＢ二重特異性抗体は、１０，０００を超えるＣＥＡ結合部位を有する腫瘍標的細胞を死滅させることができるが、１０，０００未満のＣＥＡ結合部位を有する標的細胞は、ＣＥＡ－ＴＣＢに対してほとんど応答しなかったことがわかった。本発明者らのＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体に媒介される細胞傷害性に必要となるＣＥＡ発現の閾値レベルを決定するために、本発明者らは、様々なＣＥＡ発現レベルを有する複数の腫瘍細胞株を選択した。フローサイトメトリー分析は、ＣＥＡが胃腫瘍ＭＫＮ－４５細胞上で最も高度に発現され、肺癌Ａ５４９細胞上で最も低く発現されたことを示し、中間のＣＥＡ発現レベルは、ＬＳ－１７４Ｔ、ＫＡＴＯ ＩＩＩ及びＨＴ－２９において示された（図１７及び表１０）。新たに単離されたヒトＰＢＭＣは、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ（図面においてＬｅａｄ ＣＥＡ／ＣＤ３とも称される）又はアイソタイプ／ＣＤ３ ＢｓＡｂ（すなわち非ＣＥＡ抗体／ＣＤ３、非ＣＥＡ抗体部分は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｔｏｘ Ｂに結合する）の存在下又は非存在下においてＥ／Ｔ比 １０：１で腫瘍細胞と４８時間共培養され、ベンチマーク抗体としてのＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢと比較された。予想されるとおり、ＣＥＡを高度に発現するＭＫＮ－４５及びＬＳ－１７４Ｔ標的細胞の細胞溶解は、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢよりＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１によってより強力であるように見えた。並行したウェルにおいて、アイソタイプ／ＣＤ３処理された共培養物で細胞傷害活性は観察されなかった（図１７及び表１０）。興味深いことに、ＣＥＡの中程度の発現を有するＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞の比較的弱い細胞溶解は、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂによって媒介されたが、ＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞は、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ二重特異性抗体に対して全く応答を有しなかった。より重要なこととして、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢのように、ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂは、比較的低いＣＥＡ発現を有するＨＴ－２９に対して細胞溶解活性を誘発しなかった。（図１７及び表１０）。本発明者らのデータは、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢ二重特異性抗体が、その比較的低いＣＥＡ結合親和性に起因してインビトロ及びインビボでの腫瘍溶解において高いＣＤ３親和性結合体から恩恵を被らないため、腫瘍標的に対する結合親和性が細胞溶解の効力において重要な役割を果たすことを示唆する。

インビボ有効性
最終的に、本発明者らは、インビボでの異種移植分析によって腫瘍発達に対するＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の影響を評価した。ＮＳＧマウスは、０日目に右側腹部の皮下にＬＳ－１７４Ｔ細胞を、７日目にヒトＰＢＭＣを注射された。溶媒（ＰＢＳ）又は抗体（１又は３ｍｇ／Ｋｇ）は、１４日にわたり１週間に２回腹腔内投与された（図１８Ａ）。抗腫瘍有効性試験のために、腫瘍体積がキャリパーで毎週測定され、計算された。ＣＥＡ／ＣＤ３ ＢｓＡｂの抗腫瘍応答は、終点で比較された。ＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１、ＣＥＡ／ＣＤ３親及びＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ ＢｓＡｂは、３ｍｇ／Ｋｇ治療でＰＢＳ対照群と比較してＬＳ－１７４Ｔ細胞で誘導される腫瘍増殖を完全に阻害した（図１８Ｂ）。７匹のマウスのうちの１匹は、１ｍｇ／ｋｇでマウスにおいてＣＥＡ／ＣＤ３ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂの治療に対して十分に応答しなかったが、腫瘍増殖の強力な阻害が観察された（図１９Ａ）。マウスの体重変化は、ＰＢＳと抗体治療マウスとの間で著しく異ならなかった（データは示さず）。しかしながら、Ｒｏｃｈｅが公表したデータと比較した場合、Ｒｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢは、完全な腫瘍応答がＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢの比較的高い用量での治療（２．５ｍｇ／ｋｇ）において観察されなかったため、十分に強力ではなかった（図１９Ｂ）。

まとめると、ＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂ治療は、インビトロ及びインビボでＲｏｃｈｅ ＣＥＡ－ＴＣＢより効果的に癌細胞の増殖を強力に阻害したが、これは、ＣＥＡ／ＣＤ３ ＯＰＴ１ａ３ｂ２ｂ１ ＢｓＡｂが有望な抗腫瘍剤であり得ることを実証している。

他の実施形態
本開示は、その詳細な説明と関連して記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図しており、限定するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点及び変更形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書において参照され、且つ／又は出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物の全ては、全体として参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、さらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願及び刊行物の概念を利用することが必要な場合、改変され得る。

上の詳細な説明に照らして、実施形態に対するこれら及び他の変更形態がなされ得る。一般に、以下の請求項において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲で開示される特定の実施形態に限定するように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を与えられる均等物の全範囲とともに全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

Claims (10)

1. 重鎖可変領域を含むＣＤ３抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ、Ｋ５２ｂＮ、Ｙ５８Ｔ、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ及びＬ１０８Ｔから選択される１つ以上の変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み、前記付番は、Ｋａｂａｔ番号におけるものである、ＣＤ３抗原結合断片。
2. 前記重鎖可変領域は、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ、Ｋ５２ｂＮ及びＹ５８Ｔから選択される１つ以上の変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み；好ましくは、前記重鎖可変領域は、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ及びＦ９８Ｗの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み；より好ましくは、前記重鎖可変領域は、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＫ５２ｂＮの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含むか、若しくは前記重鎖可変領域は、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＹ５８Ｔの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含むか；又は前記重鎖可変領域は、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ及びＬ１０８Ｔから選択される１つ以上の変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含み；好ましくは、前記重鎖可変領域は、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ及びＬ１０８Ｔの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含むか；又は前記重鎖可変領域は、Ｑ１３Ｋ、Ｋ８３Ｒ、Ｌ１０８Ｔ、Ｎ３０Ｓ、Ｋ３１Ｔ、Ｆ９８Ｗ及びＹ５８Ｔの変異を有する配列番号１の改変されたバージョンを含む、請求項１に記載のＣＤ３抗原結合断片。
3. 配列番号４又は配列番号２を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項１又は２に記載のＣＤ３抗原結合断片。
4. 前記重鎖可変領域は、配列番号１５、又は配列番号２２、又は配列番号２４、又は配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、及び前記軽鎖可変領域は、配列番号４又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤ３抗原結合断片。
5. 第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、前記第２の抗原結合ドメインは、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＤ３抗原結合断片を含む、二重特異性抗原結合分子。
6. 前記第１の抗原結合ドメインは、２つの同一の重鎖と、２つの同一の軽鎖とを含み、及び前記第２の抗原結合ドメインは、請求項１～４のいずれか一項に記載の２つの同一のＣＤ３抗原結合断片を含み、前記第１の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖は、前記第２の抗原結合ドメインのそれぞれの前記ＣＤ３抗原結合断片に融合される、請求項５に記載の二重特異性抗原結合分子。
7. 前記第１の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖の定常領域のＣ末端は、直接的に又はペプチドリンカーを介して前記第２の抗原結合ドメインのそれぞれの前記ＣＤ３抗原結合断片の前記重鎖可変領域のＮ末端に融合される、請求項６に記載の二重特異性抗原結合分子。
8. 前記第１の抗原結合ドメインは、アグリコシル化モノクローナル抗体を含み、及び／又は前記ＣＤ３抗原結合断片は、ｓｃＦｖを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
9. 前記第１の抗原結合ドメインは、ＣＥＡ抗原結合ドメインであり；好ましくは、前記ＣＥＡ抗原結合ドメインは、配列番号５を含む重鎖可変領域及び配列番号６を含む軽鎖可変領域を含むか；又は前記ＣＥＡ抗原結合ドメインは、配列番号７を含む重鎖可変領域及び配列番号８を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
10. 癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＤ３抗原結合断片又は請求項５～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を前記対象に投与することを含み；好ましくは、前記癌は、ＣＥＡ陽性癌であり、より好ましくは、前記癌は、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌又は他の胃腸癌である、方法。

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