JP5925893B2 - 二重特異性抗原結合分子 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、概して、二重特異性抗原結合分子に関する。さらに、本発明は、そのような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するための方法、および疾患の治療においてこれらの二重特異性抗原結合分子を使用する方法に関する。
背景
2種類以上の抗原に結合することができる二重特異性抗体または多重特異性抗体は当技術分野において公知である。このような多重特異性結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞融合、化学的結合、または組換えDNA法によって作製することができる。
二重特異性抗体は、2種類以上の標的抗原を同時に結合し、不活性化し、それによって併用療法が不要になるので治療用途にとって非常に興味深いものである。二重特異性抗体の別の有望な用途は、例えば、細胞癌免疫療法のための免疫エフェクター細胞のエンゲージャー(engager)としての用途である。この目的のために、標的細胞上の表面抗原と、例えば、T細胞受容体(TCR)複合体の活性化成分に結合する二重特異性抗体が設計された。このような抗体がその標的の両方に同時結合すると、標的細胞とT細胞との間に一時的な相互作用が強制的に生じ、それによって細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が活性化され、その後に標的細胞が溶解される。従って、免疫応答は、通常のMHCに限定されるCTL活性化に必要とされるような標的細胞によるペプチド抗原提示またはT細胞特異性とは無関係に標的細胞に強制的に向けられる。この状況で、標的細胞が二重特異性抗体をCTLに提示している時、すなわち、単に抗体とT細胞抗原が結合された時ではなく、免疫シナプスが模倣された時にだけCTLが活性化されることが重要である。
近年になって、例えば、四価IgG-単鎖可変断片(scFv)融合(例えば、Coloma & Morrison, Nat Biotechnol 15, 159-163 (1997)（非特許文献1）を参照されたい)、四価IgG様二重可変ドメイン抗体(Wu et al., Nat Biotechnol 25, 1290-1297 (2007)（非特許文献2）)、または二価ラット/マウスハイブリッド二重特異性IgG(例えば、Lindhofer et al., J Immunol 155, 219-225 (1995)（非特許文献3）を参照されたい)を含む、様々な組換え多重特異性抗体形式が開発されている。
抗体コア構造(IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgM)がもはや保持されていない、いくつかの二重特異性形式も作られている。例には、ダイアボディ(例えば、Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1995)（非特許文献4）を参照されたい)、タンデムscFv分子(例えば、Bargou et al., Science 321, 974-977 (2008)（非特許文献5）を参照されたい)、および様々なその誘導体が含まれる。
これら幾多の開発中の形式は、二重特異性抗体に起因する大きな可能性を示す。しかしながら、ある特定の目的に適した二重特異性抗体を作製する作業は決してささいなものではなく、多くの検討がなされる。例えば、抗体の結合価および形状は、標的抗原の特徴および所期の効果に応じて適切に選択される必要がある。全ての治療抗体と同様に効力および毒性のバランスを取らなければならず、このために、例えば抗体の免疫原性の最小化および薬物動態学的特性の最適化が必要とされる。また、Fcを介した効果の望ましさも考慮しなければならない。さらに、抗体重鎖のホモ二量体化ならびに/または同時発現時の特異性の異なる抗体重鎖と軽鎖の誤対合によって、正しく組み立てられた構築物の収率が減少し、望ましい二重特異性抗体から分離しにくい場合がある機能しない多数の副産物が生じるので、二重特異性抗体構築物を臨床的に十分な量および純度で産生することは極めて難しい。
二重特異性抗体のますます増える、考えられる用途、ならびに現在利用可能な二重特異性抗体に関連した問題および欠点を考慮すると、このような分子の改善された新規の形式が依然として必要とされている。
Coloma & Morrison, Nat Biotechnol 15, 159-163 (1997) Wu et al., Nat Biotechnol 25, 1290-1297 (2007) Lindhofer et al., J Immunol 155, 219-225 (1995) Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1995) Bargou et al., Science 321, 974-977 (2008)
第1の局面において、本発明は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が、第1の抗原および/または第2の抗原との一価結合を提供し、
b)第1のFab断片、第2のFab断片、および第1のFcドメインサブユニットが互いに融合されており、かつ
c)第1のFab断片および/または第2のFab断片において、以下の交換:(i)可変ドメインVLおよびVHが互いに交換される、(ii)定常ドメインCLおよびCH1が互いに交換される、または(iii)可変ドメインおよび定常ドメインVL-CLおよびVH-CH1がいずれも互いに交換される、の1つがなされており、但し、第1のFab断片および第2のFab断片において同じ交換はなされない、二重特異性抗原結合分子を提供する。
特定の態様において、第1のFab断片のC末端が第2のFab断片のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。さらに具体的な態様において、第1のFab断片の重鎖のC末端が第2のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。他の態様において、第2のFab断片のC末端が第1のFab断片のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。さらに具体的な態様において、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。さらに他の態様において、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、さらには、第1のFcドメインサブユニットのC末端が第1のFab断片のN末端と融合されている。さらに具体的な態様において、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、さらには、第1のFcドメインサブユニットのC末端が第1のFab断片の重鎖のN末端と融合されている。
第1のFab断片の重鎖のC末端が第2のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、または第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている態様において、さらに、第1のFab断片のFab軽鎖および第2のFab断片のFab軽鎖が互いに融合されていてもよく、任意でペプチドリンカーを介して互いに融合されていてもよい。
1つの態様において、第1のFab断片において交換がなされている。一部の態様において、交換は可変ドメインVLおよびVHの相互置換である。他の態様において、交換は定常ドメインCLおよびCH1の相互置換である。
1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は、第1のFab断片、第2のFab断片、Fcドメイン、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる。特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原または第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含む。1つの態様において、第3のFab断片は第2のFcドメインサブユニットと融合されている。さらに具体的な態様において、第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。なおさらに具体的な態様において、第3のFab断片の重鎖のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている。1つの態様において、第3のFab断片は第2の抗原に特異的に結合する。一部の態様において、第2のFab断片、第3のFab断片、およびFcドメインは免疫グロブリン分子の一部である。このような特定の態様において、免疫グロブリン分子はIgGクラス免疫グロブリン分子であり、より具体的には、IgG1またはIgG4サブクラス免疫グロブリン分子である。1つの態様において、免疫グロブリン分子はヒト免疫グロブリン分子である。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる。
1つの態様において、同じ抗原に特異的に結合するFab断片において同じ交換がなされている。さらなる態様において、第1のFab断片においてのみ交換がなされている。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は第1の抗原との一価結合を提供する。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は単鎖Fab断片を含まない。
ある特定の態様において、Fcドメインは、第1のFcドメインサブユニットおよび第2のFcドメインサブユニットの会合を促進する改変を含む。このような特定の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、かつFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部が配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる。1つの態様において、Fcドメインは、IgG Fcドメイン、具体的には、IgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメインである。1つの態様において、Fcドメインはヒトである。ある特定の態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して、Fc受容体に対して変化した結合親和性および/または変化したエフェクター機能を有するように操作されている。
本発明の別の局面によれば、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを包含する。さらに、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および単離されたポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の態様において、宿主細胞は、真核細胞、特に、哺乳動物細胞である。別の局面において、a)二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、およびb)二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって生成された二重特異性抗原結合分子を包含する。
さらに、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明の二重特異性抗原結合分子および薬学的組成物を使用する方法も本発明に包含される。1つの局面において、本発明は、医薬として使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物を提供する。1つの局面において、疾患の治療を必要とする個体において疾患の治療において使用するための本発明による二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物が提供される。特定の態様において、疾患は癌である。
疾患の治療を必要とする個体における疾患を治療するための医薬を製造するための本発明の二重特異性抗原結合分子の使用;ならびに個体において疾患を治療する方法であって、本発明による二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形で含む治療的有効量の組成物を前記個体に投与する工程を含む方法も提供される。特定の態様において、疾患は癌である。任意の前記態様において、個体は、好ましくは、哺乳動物、特に、ヒトである。
[本発明1001]
第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が、第1の抗原および/または第2の抗原との一価結合を提供し、
b)第1のFab断片、第2のFab断片、および第1のFcドメインサブユニットが互いに融合されており、かつ
c)第1のFab断片および/または第2のFab断片において、以下の交換:(i)可変ドメインVLおよびVHが互いに交換される、(ii)定常ドメインCLおよびCH1が互いに交換される、または(iii)可変ドメインおよび定常ドメインVL-CLおよびVH-CH1がいずれも互いに交換される、の1つがなされており、
但し、第1のFab断片および第2のFab断片において同じ交換はなされない、二重特異性抗原結合分子。
[本発明1002]
第1のFab断片のC末端が第2のFab断片のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、本発明1001の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1003]
第1のFab断片の重鎖のC末端が第2のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、本発明1002の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1004]
第2のFab断片のC末端が第1のFab断片のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、本発明1001の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1005]
第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、本発明1004の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1006]
さらに、第1のFab断片のFab軽鎖および第2のFab断片のFab軽鎖が、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合されている、本発明1003または1005の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1007]
第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、さらには、第1のFcドメインサブユニットのC末端が第1のFab断片のN末端と融合されている、本発明1001の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1008]
第1のFab断片において交換がなされている、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1009]
交換が、可変ドメインVLおよびVHの相互交換である、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1010]
交換が、定常ドメインCLおよびCH1の相互交換である、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1011]
第1のFab断片、第2のFab断片、Fcドメイン、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1012]
第1の抗原または第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含む、本発明1001〜1010のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1013]
第3のFab断片が第2のFcドメインサブユニットと融合されている、本発明1012の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1014]
第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、本発明1012または1013の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1015]
第3のFab断片の重鎖のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、本発明1014の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1016]
第3のFab断片が第2の抗原に特異的に結合している、本発明1012〜1015のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1017]
第2のFab断片、第3のFab断片、およびFcドメインが、免疫グロブリン分子の一部である、本発明1012〜1016のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1018]
免疫グロブリン分子がIgGクラス免疫グロブリン分子である、本発明1017の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1019]
免疫グロブリン分子がIgG1またはIgG4サブクラス免疫グロブリン分子である、本発明1017または1018の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1020]
免疫グロブリン分子がヒト免疫グロブリン分子である、本発明1017〜1019のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1021]
第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる、本発明1012〜1020のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1022]
同じ交換が、同じ抗原に特異的に結合するFab断片においてなされている、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1023]
第1の抗原との一価結合を提供する、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1024]
交換が第1のFab断片においてのみなされている、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1025]
単鎖Fab断片を含まない、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1026]
Fcドメインが、第1のFcドメインサブユニットおよび第2のFcドメインサブユニットの会合を促進する改変を含む、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1027]
Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、かつFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部が配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる、本発明1026の二重特異性抗原結合分子。
[本発明1028]
FcドメインがIgG Fcドメインである、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1029]
FcドメインがIgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメインである、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1030]
Fcドメインがヒトである、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1031]
操作されていないFcドメインと比較して、Fc受容体との結合親和性が変化するように、および/またはエフェクター機能が変化するようにFcドメインが操作されている、前記本発明のいずれかの二重特異性抗原結合分子。
[本発明1032]
本発明1001〜1031のいずれかの二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1033]
本発明1032の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[本発明1034]
本発明1032の単離されたポリヌクレオチドまたは本発明1033の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1035]
a)二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明1030の宿主細胞を培養する工程、およびb)二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、本発明1001〜1031のいずれかの二重特異性抗原結合分子を生成するための方法。
[本発明1036]
本発明1001〜1031のいずれかの二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1037]
医薬として使用するための、本発明1001〜1031のいずれかの二重特異性抗原結合分子または本発明1036の薬学的組成物。
[本発明1038]
それを必要とする個体において疾患の治療に使用するための、本発明1001〜1031のいずれかの二重特異性抗原結合分子または本発明1036の薬学的組成物。
[本発明1039]
疾患が癌である、本発明1038の二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物。
[本発明1040]
それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬を製造するための、本発明1001〜1031のいずれかの二重特異性抗原結合分子の使用。
[本発明1041]
個体において疾患を治療する方法であって、該個体に、本発明1001〜1031のいずれかの二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形で含む治療的有効量の組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1042]
疾患が癌である、本発明1040の使用または本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記の発明。
本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な形式の図。(A)」「2+1」形式。Fab断片のN末端と融合された、特異性の異なるCrossFab断片が抗体に含まれる(「2+1 IgG Crossfab(N末端)」)。(B)「1+1」形式。Fab断片のN末端と融合された特異性の異なるCrossFab断片が、第2のFab断片のない抗体に含まれる(「1+1 IgG Crossfab(N末端)」)。(C)(A)と同様の「2+1」形式。CrossFab断片、およびCrossFab断片が融合されるFab断片の順番が逆である(「2+1」IgG Crossfab(N末端)、逆」)。(D)「2+1」形式。FcドメインサブユニットのC末端と融合された、特異性の異なるCrossFab断片が抗体に含まれる(「2+1 IgG Crossfab(C末端)」)。黒色の点:ヘテロ二量体化を促進するFcドメインの中にある任意の改変。 (A、B)「1+1 IgG Crossfab(N末端)、Fc(ホール(hole))P329G LALA/Fc(ノブ(knob))wt」(抗MCSP/抗huCD3)(SEQ ID NO 1、2、3および4を参照されたい)のSDS PAGE(4〜12％Tris-酢酸(A)または4〜12％Bis/Tris(B), NuPage Invitrogen, クーマシー染色)。非還元(A)および還元(B)。(C)「1+1 IgG Crossfab(N末端)、Fc(ホール) P329G LALA/Fc(ノブ)wt」(抗MCSP/抗huCD3)の分析用サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare; 2mM MOPS pH7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl;50μgの試料を注入した)。 (A、B)「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(抗MCSP/抗huCD3)(SEQ ID NO 1、3、4、および5を参照されたい)のSDS PAGE(4〜12％Bis/Tris, NuPage Invitrogen, クーマシー染色)。非還元(A)および還元(B)。(C)「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(抗MCSP/抗huCD3)の分析用サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl;50μgの試料を注入した)。 (A、B)「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆」(抗CEA/抗huCD3)(SEQ ID NO 3、8、9、および10を参照されたい)のSDS PAGE(4〜12％ Bis/Tris, NuPage Invitrogen, クーマシー染色)。非還元(A)および還元(B)。(C)「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆」(抗CEA/抗huCD3)の分析用サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaCl;50μgの試料を注入した)。 (A、B)「2+1 IgG Crossfab(C末端)」(抗c-Met/抗Her3)(SEQ ID NO 11、12、13、14を参照されたい)のキャピラリー電気泳動(CE)-SDSゲル分析。非還元(A)および還元(B)。 二重特異性構築物と、ヒトMCSPのD3ドメインおよびヒトCD3γ(G4S) 5CD3ε-AcTev-Fc(ノブ)-Avi/Fc(ホール)との同時結合。(A)Biacoreアッセイの設定;(B)「2+1 IgG Crossfab(N末端)」の測定。 Colo-38腫瘍細胞の存在下(A、B)または非存在下(C、D)で、1nMの異なるCD3-MCSP二重特異性構築物(「2+1 IgG Crossfab(N末端)」、「(scFv) 2」)または対応する対照IgGを用いて24時間、処理した後の、全血上清中に測定された異なるサイトカインのレベル。 ヒトMCSP発現MV-3腫瘍標的細胞(E:T比=3:1)の存在下または非存在下で、示された濃度の「2+1 IgG Crossfab(N末端)」二重特異性構築物(カニクイザルCD3およびヒトMCSPを標的とする)と43時間インキュベートした後の、2匹の異なる動物(cyno Nestor、cyno Nobu)に由来するカニクイザルCD8+T細胞における後期活性化マーカーCD25の表面発現レベル。対照として、参照IgG(抗カニクイザルCD3 IgG、抗ヒトMCSP IgG)または非生理的刺激PHA-Mを使用した。 ヒトpanT細胞(E:T比=5:1)と同時培養され、異なる濃度の「2+1 IgG Crossfab(N末端)」および「(scFv) 2」二重特異性分子ならびに対応するIgGによって20時間、活性化された時のMDA-MB-435腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。 ヒトpanT細胞(E:T比=5:1)と同時培養され、異なる濃度の二重特異性構築物および対応するIgGによって21時間、活性化された時のMDA-MB-435腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。CD3-MCSP二重特異性「2+1 IgG Crossfab(N末端)」および「1+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物、「(scFv) 2」分子、ならびに対応するIgGを比較した。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なるCD3-MCSP二重特異性構築物(「2+1 IgG Crossfab(N末端)」および「(scFv) 2」)で約26時間、処理された時のhuMCSP陽性MV-3黒色腫細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。 連結軽鎖を有する本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。(A)「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」分子の図。(B)「1+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」分子の図。(C)「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆、連結軽鎖」分子の図。(D)「1+1 IgG Crossfab(N末端)、逆、連結軽鎖」分子の図。 CE-SDS分析。「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」(レーン1:還元、レーン2:非還元)のSDS-PAGEとして示した電気泳動図。 「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」(最終産物)の分析用サイズ排除クロマトグラフィー。20μgの試料「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」を注入した。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なるCD3-MCSP二重特異性構築物で約44時間、処理された時のMCSP陽性MV-3腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。ヒトPBMCを健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なるCD3-MCSP二重特異性構築物で約22時間、処理された時のMCSP陽性Colo-38腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。ヒトPBMCを健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なるCD3-MCSP二重特異性構築物で約22時間、処理された時のMCSP陽性Colo-38腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。ヒトPBMCを健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なるCD3-MCSP二重特異性構築物で約22時間、処理された時のMCSP陽性WM266-4細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。ヒトPBMCを健常ボランティアの新鮮な血液から単離した。 ヒトMCSP発現Colo-38腫瘍標的細胞(E:T比=10:1)の存在下または非存在下で、10nM、80pM、または3pMの異なるCD3-MCSP二重特異性構築物と22時間インキュベートした後の、ヒトCD8+T細胞における初期活性化マーカーCD69(A)および後期活性化マーカーCD25(B)の表面発現レベル。 CE-SDS分析。(A)1+1 IgG Crossfab(N末端);VL/VH 交換(LC007/V9):a)非還元、b)還元のSDS-PAGEとして示した電気泳動図。(B)1+1 CrossMab; CL/CH1交換(LC007/V9):a)還元、b)非還元のSDS-PAGEとして示した電気泳動図。(C)2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆;CL/CH1 交換(LC007/V9):a)還元、b)非還元のSDS-PAGEとして示した電気泳動図。(D)2+1 IgG Crossfab(N末端);VL/VH交換(M4-3 ML2/V9):a)還元、b)非還元のSDS-PAGEとして示した電気泳動図。(E)2+1 IgG Crossfab(N末端);CL/CH1交換(M4-3 ML2/V9):a)還元、b)非還元のSDS-PAGEとして示した電気泳動図。(F)2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆;CL/CH1交換(CH1A1A/V9):a)還元、b)非還元のSDS-PAGEとして示した電気泳動図。 示された濃度のCD3/MCSP「1+1 CrossMab」、「1+1 IgG Crossfab(N末端)」、および「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物と24時間インキュベートした後の、ヒトCD4+T細胞またはCD8+T細胞における初期活性化マーカーCD69(A)または後期活性化マーカーCD25(B)の表面発現レベル。示されたように、MV-3標的細胞の存在下または非存在下でアッセイを行った。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なる濃度の「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆(VL/VH)」対「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆(CL/CH1)」構築物によって28時間、活性化された時のMKN-45(A)またはLS-174T(B)腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なる濃度の「2+1 IgG Crossfab (N末端)(VL/VH)」対「2+1 IgG Crossfab(N末端)(CL/CH1)」構築物によって26時間、活性化された時のWM266-4腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。 ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なる濃度の「2+1 IgG Crossfab(N末端)(VH/VL)」対「2+1 IgG Crossfab(N末端)(CL/CH1)」構築物によって27時間、活性化された時のMV-3腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。 示されたように、ヒトPBMC(E:T比=10:1)と同時培養され、異なる濃度の「2+1 IgG Crossfab(N末端)」、「1+1 CrossMab」、および「1+1 IgG Crossfab(N末端)」によって21時間、活性化された時のヒトMCSP陽性WM266-4(A)またはMV-3(B)腫瘍細胞の死滅(LDH放出によって測定した)。 FACSによって確かめられた時の二重特異性構築物と、ジャーカット細胞によって発現されたヒトCD3(A)またはLS-174T細胞によって発現されたヒトCEA(B)との結合。対照として、等価な最大濃度の参照IgGおよび標識二次抗体(ヤギ抗ヒトFITC結合AffiniPure F(ab')2断片、Fcγ断片特異的、Jackson Immuno Research Lab # 109-096-098)によるバックグラウンド染色も評価した。 FACSによって確かめられた時の二重特異性構築物と、ジャーカット細胞によって発現されたヒトCD3またはWM266-4腫瘍細胞によって発現されたヒトMCSP(B)との結合。
発明の詳細な説明
定義
以下において特に定めのない限り、当技術分野において一般的に用いられように用語が本明細書において用いられる。本明細書で使用する「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリンおよびその誘導体、例えば、その断片である。
「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、2種類の特異な抗原決定基に特異的に結合できることを意味する。典型的に、二重特異性抗原結合分子は2種類の抗原結合部位を含み、これらの抗原結合部位はそれぞれ異なる抗原決定基に特異的である。ある特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、2種類の抗原決定基、特に、2種類の別個の細胞上に発現している2種類の抗原決定基に同時に結合することができる。
本明細書で使用する「抗原決定基」という用語は「抗原」および「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して、抗原結合部分-抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位(例えば、アミノ酸の連続した領域または連続していないアミノ酸の異なる領域からなるコンホメーション構成)を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、免疫細胞の表面に、血清中に遊離して、および/または細胞外マトリックス(ECM)の中に見つけることができる。本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質(例えば、MCSP、FAP、CEA、EGFR、CD33、CD3、c-Met、Her3)は、特に定めのない限り、任意の天然形態でよく、霊長類(例えば、ヒト)ならびにげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源に由来してもよい。特定の態様において、抗原はヒトタンパク質である。本明細書中の特定のタンパク質について言及された場合、この用語は、「完全長」、プロセシングされていないタンパク質、ならびに細胞内でのプロセシングに起因する任意の形態のタンパク質を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然変種、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子変種を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質には、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4とも知られる(UniProt番号Q6UVK1、NCBIアクセッション番号NP_001888);線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)。セプラーゼとも知られる(Uni Prot番号Q12884、Q86Z29、Q99998、NCBIアクセッション番号NP_004451);癌胎児(Carcinoembroynic)抗原(CEA)。癌胎児抗原関連細胞接着分子5とも知られる(UniProt番号P06731、NCBIアクセッション番号NP_004354);CD33。gp67またはSiglec-3とも知られる(UniProt番号P20138、NCBIアクセッション番号NP_001076087、NP_001171079);上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)。ErbB-1またはHer1とも知られる(UniProt番号P0053、NCBIアクセッション番号NP_958439、NP_958440)、CD3、特に、CD3のεサブユニット(UniProt番号P07766、NCBIアクセッション番号NP_000724);c-Met。肝細胞増殖因子受容体とも知られる(UniProt番号P08581、NCBIアクセッション番号NP_000236、NP_001120972)およびHer3。ErbB-3とも知られる(UniProt番号P21860、NCBIアクセッション番号NP_001973、NP_001005915)が含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、異なる種に由来する第1の抗原または第2の抗原の間で保存されている、第1の抗原または第2の抗原のエピトープに結合する。
「特異的結合」とは、結合が抗原に選択的であり、望ましくない相互作用または非特異的な相互作用と区別できることを意味する。抗体が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫測定法(ELISA)、または当業者がよく知っている他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)法(BIAcore機器で分析される)(Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))および従来の結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))によって測定することができる。1つの態様において、抗体と無関係のタンパク質と結合の程度は、例えば、SPRによって測定された時、抗体と抗原との結合の約10％未満である。ある特定の態様において、抗原に結合する抗体またはその断片の解離定数(KD)は、<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM、または<0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M〜10-13M、例えば、10-9M〜10-13M)である。
「親和性」とは、分子(例えば、受容体)の1つの結合部位と、その結合パートナー(例えば、リガンド)との非共有結合相互作用の合計の強さを指す。特に定めのない限り、本明細書で使用する「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー(例えば、抗原結合部分と抗原、または受容体とそのリガンド)の間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーYに対する分子Xの親和性は、一般的に、解離定数(KD)で表すことができる。解離定数(KD)は解離速度定数および会合速度定数(それぞれ、koffおよびkon)の比である。従って、速度定数の比が同一のままである限り、同じ親和性が異なる速度定数から成り立っていることがある。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当技術分野において公知の十分に確立した方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法が表面プラズモン共鳴(SPR)である。
本明細書で使用する「価」という用語は、特定の数の抗原結合部位が抗原結合分子に存在することを示す。従って、「抗原との一価結合」という用語は、抗原に特異的な1個(および1個以下の)抗原結合部位が抗原結合分子に存在することを示す。
「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用をもたらす、抗原結合分子の部位、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域(CDR)に由来するアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は典型的に2つの抗原結合部位を有し、Fab断片は典型的に1つの抗原結合部位を有する。
本明細書で使用する「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。抗原結合部分には、本明細書においてさらに定義される抗体およびその断片が含まれる。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。ある特定の態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに定義され、当技術分野において公知の抗体定常領域を含んでもよい。有用な重鎖定常領域には、任意の5つのアイソタイプ:α、δ、ε、γ、またはμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、2つのアイソタイプ:κおよびλのいずれかが含まれる。
Fab断片などに関連して本明細書で使用する「第1の」および「第2の」という用語は、それぞれのタイプの部分が複数ある時に区別をよりしやすくするために用いられる。これらの用語の使用は、特に明確に述べられていない限り、二重特異性抗原結合分子の特定の順番または方向を付与することを目的としない。
本明細書で使用する「単鎖」という用語は、ペプチド結合によって直線的に連結したアミノ酸単量体を含む分子を指す。単鎖Fab断片とは、Fab軽鎖およびFab重鎖がペプチドリンカーによりつながって1本のペプチド鎖を形成しているFab分子を意味する。
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合した2本の軽鎖および2本の重鎖からなる約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端にかけて、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)に続いて、ヒンジ領域(HR)、ならびに重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を有する。IgEクラス免疫グロブリンの場合、重鎖はさらにCH4ドメインを有する。従って、免疫グロブリン重鎖は、N末端からC末端の方向にかけて以下のドメイン:VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4)からなるポリペプチドである。同様に、N末端からC末端にかけて、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)に続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖(CL)ドメインを有する。従って、免疫グロブリン軽鎖は、N末端からC末端の方向にかけて以下のドメイン:VL-CLからなるポリペプチドである。免疫グロブリンの重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、またはμ(IgM)と呼ばれる5つのタイプの1つに割り当てられることがあり、これらのうちのいくつかはサブタイプ、例えば、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)、およびα2(IgA2)にさらに分けられることがある。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つのタイプの1つに割り当てられることがある。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結した、2つのFab断片およびFcドメインから本質的になる。
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、望ましい抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片を含むが、これに限定されない様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子(例えば、scFv)、およびシングルドメイン抗体が含まれるが、これに限定されない。ある特定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照されたい。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。WO93/16185;ならびに米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号も参照されたい。サルベージ(salvage)受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が長い、FabおよびF(ab') 2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。ダイアボディは、二価または二重特異性でもよい2つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003);およびHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の態様において、シングルドメイン抗体はヒトシングルドメイン抗体(Domantis, Inc., Waltham, MA;例えば、米国特許第6,248,516B1号を参照されたい)である。抗体断片は、本明細書に記載のようにインタクトな抗体のタンパク質分解消化ならびに組換え宿主細胞(例えば、大腸菌またはファージ)による産生を含むが、これに限定されない様々な技法によって作ることができる。
「Fab断片」とは、免疫グロブリンの重鎖(「Fab重鎖」)のVHおよびCH1ドメインならびに軽鎖(「Fab軽鎖」)のVLおよびCLドメインからなるタンパク質を指す。別のタンパク質と融合されているFab断片は、改変されていない形で、その重鎖C末端またはN末端において融合される。その結果、可変ドメインVHおよびVLが互いに交換された場合、Fab断片は、CH1ドメインのC末端またはVLドメインのN末端において融合される。同様に、定常ドメインCH1およびCLが互いに交換された場合、Fab断片はCLドメインのC末端またはVHドメインのN末端において融合される。完全なFab重鎖(VH-CH1)およびFab軽鎖(VL-CL)が互いに交換された場合、Fab断片はその軽鎖C末端またはN末端において融合される。
「融合された」とは、成分(例えば、Fab断片およびFcドメインサブユニット)がペプチド結合によって直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して連結されたことを意味する。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部または全てに特異的に結合し、抗原の一部または全てに相補的な領域を含む抗体部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、1つまたは複数の抗体可変ドメイン(抗体可変領域とも呼ばれる)によって提供されてもよい。特に、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含む。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれ、VHおよびVL)は、一般的に、類似した構造を有し、それぞれのドメインは4つの保存されたフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。抗原結合特異性を付与するためにはVHシングルドメインまたはVLシングルドメインだけで十分な場合がある。
本明細書で使用する「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が高頻度で変わる、および/または構造が定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメイン領域のそれぞれを指す。一般的に、天然の4本の鎖からなる抗体は、6個のHVR;VHに3個(H1、H2、H3)およびVLに3個(L1、L2、L3)を含む。HVRは、一般的に、超可変ループおよび/または相補性決定領域(CDR)に由来するアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を持つ、および/または抗原認識に関与する。VHにあるCDR1を除いて、CDRは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域(HVR)は「相補性決定領域」(CDR)とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域部分に関して本明細書において交換可能に用いられる。この特定の領域は、互いに比較された時に定義がアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)およびChothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されている。それにもかかわらず、抗体またはその変種のCDRを指すために、いずれかの定義を適用することは、本明細書において定義および使用されるように用語の範囲内であることが意図される。前記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるようにCDRを構成する適切なアミノ酸残基が比較として以下の表1に示される。ある特定のCDRを構成する正確な残基の数は、CDRの配列およびサイズに応じて変化する。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮すれば、どの残基が特定のCDRを構成するかを日常的に決定することができる。
（表１）CDR定義1
Figure 0005925893
1表1の中の全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatらによって示されたナンバリング規則に従う(以下を参照されたい)。
2表1に用いられた小文字「b」のある「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデリングソフトウェアによって定義されたCDRを指す。
Kabatらは、全ての抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者であれば、配列そのものの他に、いかなる実験データにも頼らず、この「Kabatナンバリング」システムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する「Kabatナンバリング」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)に示されたナンバリングシステムを指す。他で特定しない限り、抗体可変領域にある特定のアミノ酸残基位置のナンバリングへの言及はKabatナンバリングシステムに従う。
配列表のポリペプチド配列の番号はKabatナンバリングシステムに従って付けられていない。しかしながら、配列表の配列のナンバリングをKabatナンバリングに変換することは当業者の能力の十分に範囲内にある。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般的に、4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。従って、HVRおよびFR配列は、一般的に、VH(またはVL)において以下の順序:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4で現れる。
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5種類の主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられることがある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
本明細書において「Fcドメイン」または「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列のFc領域および変種Fc領域を含む。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに異なる場合があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端にわたると定義される。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は存在してもよく、存在しなくてもよい。本明細書において他で特定しない限り、Fc領域または定常領域にあるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のようにEUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。本明細書で使用するFcドメインの「サブユニット」は、二量体Fcドメインを形成する2つのポリペプチドのうちの1つ、すなわち、安定した自己会合を可能にする免疫グロブリン重鎖のC末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、IgG FcドメインのサブユニットはIgG CH2定常領域およびIgG CH3定常領域を含む。
「Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変」は、Fcドメインサブユニットを含むポリペプチドと同一のポリペプチドが会合してホモ二量体を形成するのを低減または阻止する、Fcドメインサブユニットのペプチドバックボーン操作または翻訳後改変である。本明細書で使用する、会合を促進する改変は、特に、会合することが望まれる、2つのFcドメインサブユニットのそれぞれ(すなわち、Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニット)に加えられる別々の改変を含む。ここで、改変は、2つのFcドメインサブユニットの会合を促進するように互いに補い合う。例えば、会合を促進する改変は、会合を立体的に好ましくするように一方または両方のFcドメインサブユニットの構造を変えてもよく、会合を静電気的に好ましくするように一方または両方のFcドメインサブユニットの電荷を変えてもよい。従って、第1のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第2のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で(ヘテロ)二量体化が生じる。第1のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第2のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドは、サブユニット(例えば、Fab断片)のそれぞれと融合されるさらなる成分が同一でないという意味で同一でなくてもよい。一部の態様において、会合を促進する改変は、Fcドメインにアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の態様において、会合を促進する改変は、Fcドメインの2つのサブユニットのそれぞれにおいて別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプによって異なる抗体Fc領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込み、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)のダウンレギュレーション、およびB細胞活性化が含まれる。
本明細書で使用する「操作する(engineer)、操作された(engineered)、操作する(engineering)」という用語は、ペプチドバックボーンの任意の操作、または天然もしくは組換えのポリペプチドもしくはその断片の翻訳後修飾を含むとみなされる。操作するは、アミノ酸配列の改変、グリコシル化パターンの改変、または個々のアミノ酸の側鎖基の改変、ならびにこれらのアプローチの組み合わせを含む。
本明細書で使用する「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および改変を包含することが意図される。最終構築物が望ましい特徴、例えば、Fc受容体との低減した結合または別のペプチドとの向上した会合を有するのであれば、最終構築物に達するために、置換、欠失、挿入、および改変の任意の組み合わせを加えることができる。アミノ酸配列の欠失および挿入には、アミノ末端および/またはカルボキシ末端でのアミノ酸欠失およびアミノ酸挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Fc領域の結合特性を変える目的では、非保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸と、異なる構造特性および/または化学特性を有する別のアミノ酸との交換が特に好ましい。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸または20種類の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体(例えば、4-ヒドロキシプロリン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5-ヒドロキシリジン)による交換が含まれる。アミノ酸変異は当技術分野において周知の遺伝的方法または化学的方法を用いて作製することができる。遺伝的方法には、部位特異的変異誘発、PCR、遺伝子合成などが含まれ得る。化学修飾などの遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基を変える方法も有用な場合があることが意図される。同じアミノ酸変異を示すために様々な名称が本明細書において用いられることがある。例えば、Fcドメインの位置329にあるプロリンからグリシンへの置換は、329G、G329、G329、P329G、またはPro329Glyと示すことができる。
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミド結合(ペプチド結合とも知られる)によって直線的に連結された単量体(アミノ酸)からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は2個以上のアミノ酸からなる任意の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2個以上のアミノ酸からなる鎖を指すために用いられる他の任意の用語は「ポリペプチド」の定義に含まれ、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語と交換可能に「ポリペプチド」という用語が用いられることがある。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による改変を含むが、それに限定されるわけではないポリペプチドの発現後改変の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは天然の生物学的供給源から得られてもよく、組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも、指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。化学合成を含む任意のやり方でポリペプチドを作製することができる。本発明のポリペプチドは、約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上のアミノ酸のサイズのポリペプチドでもよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することがあるが、必ずしも、このような構造を有するとは限らない。規定された三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると呼ばれ、規定された三次元構造を有さず、多数の異なるコンホメーションをとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。
「単離された」ポリペプチドまたはその変種もしくは誘導体とは、天然環境にはないポリペプチドであることが意図される。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その自然環境または天然環境から取り出されてもよい。宿主細胞内で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は本発明の目的で単離されたとみなされ、同様に、任意の適切な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されている天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドも単離されたとみなされる。
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、天然環境から取り出されている核酸分子DNAまたはRNAが意図される。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは本発明の目的で単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内で維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解状態にある、(部分的もしくは実質的に)精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有している細胞内に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は染色体外に存在する、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたRNA分子には、本発明のインビボRNAまたはインビトロRNAならびに+鎖および-鎖および二本鎖型が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成により生成された、このような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントでもよく、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントを含んでもよい。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は「発現構築物」と同義であり、標的細胞内で機能的に結合している特定の遺伝子を導入し、その遺伝子の発現を誘導するのに用いられるDNA分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造であるベクター、ならびに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは多量の安定なmRNAの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が細胞の転写機構および/または翻訳機構によって産生される。1つの態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」という用語は同義に用いられ、外因性核酸が導入されている細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、初代形質転換細胞および継代数に関係なく、初代形質転換細胞から得られた子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択された時と同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するのに使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの少し例を挙げると、CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YOミエローマ細胞、P3X63マウスミエローマ細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または植物培養組織もしくは動物培養組織の中にある細胞も含まれる。
「活性化Fc受容体」は、抗体のFcドメインが結合した後に、受容体を有する細胞を刺激してエフェクター機能を果たすシグナル伝達事象を誘発するFc受容体である。ヒト活性化Fc受容体には、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、およびFcαRI(CD89)が含まれる。
抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、抗体でコーティングされた標的細胞を免疫エフェクター細胞が溶解する免疫機構である。標的細胞は、抗体またはFc領域を含むその誘導体が、一般的に、Fc領域のN末端側にあるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用する「低減した(または向上した)ADCC」という用語は、標的細胞を取り囲む培地に含まれる、ある特定の抗体濃度で、ある特定の時間で、前記で定義されたADCC機構によって溶解される標的細胞の数の低減(増加)、および/または、ある特定の時間で、ある特定の標的細胞数をADCC機構によって溶解するのに必要とされる、標的細胞を取り囲む培地に含まれる抗体濃度の増加(低減)と定義される。ADCCの低減(増加)は、(当業者に公知の)同じ標準的な産生方法、精製方法、処方方法、および保管方法を用いて同じタイプの宿主細胞によって産生されたが、操作されていない同じ抗体によって媒介されるADCCと比べられる。例えば、ADCCを低減させるアミノ酸置換をFcドメインに含む抗体によって媒介されるADCCの低減は、このアミノ酸置換がFcドメインにない同じ抗体によって媒介されるADCCと比べられる。ADCCを測定する適切なアッセイは当技術分野において周知である(例えば、PCT公報番号WO2006/082515またはPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393を参照されたい)。
薬剤の「有効量」とは、投与された細胞または組織において生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、望ましい治療効果または予防結果を実現するために、必要な投与および期間において有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、例えば、疾患の副作用を排除する、減少させる、遅延する、最小化する、または阻止する。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜化された動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、ならびにげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)が含まれるが、これに限定されない。特に、個体または対象はヒトである。
「薬学的組成物」という用語は、薬学的組成物の中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になるような形をしており、かつ製剤が投与される対象に容認できないほど毒性のあるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、薬学的組成物の中にある、活性成分以外の、対象に無毒な成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これに限定されない。
本明細書で使用する「治療(treatment)」(およびその文法上の語尾変化、例えば、「治療する(treat)」または「治療している(treating)」)とは、治療を受けている個体における疾患の自然経過を変えようという臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過の間に行うことができる。望ましい治療効果には、疾患の発生または再発の阻止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の阻止、疾患進行速度の減少、疾患状態の寛解または軽減、および軽快または予後の改善が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延するために、または疾患進行を遅くするために用いられる。
「添付文書」という用語は、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、および/またはこのような治療製品の使用に関する警告を収めている、市販の治療製品パッケージに慣例に従って入れられている説明書を指すために用いられる。
態様の詳細な説明
本発明は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が、第1の抗原および/または第2の抗原との一価結合を提供し、
b)第1のFab断片、第2のFab断片、および第1のFcドメインサブユニットが互いに融合されており、かつ
c)第1のFab断片および/または第2のFab断片において、以下の交換:(i)可変ドメインVLおよびVHが互いに交換される、(ii)定常ドメインCLおよびCH1が互いに交換される、または(iii)可変ドメインおよび定常ドメインVL-CLおよびVH-CH1がいずれも互いに交換される、の1つがなされ、
但し、第1のFab断片および第2のFab断片において同じ交換はなされない、二重特異性抗原結合分子を提供する。
二重特異性抗原結合分子の形式
二重特異性抗原結合分子の成分は様々な構成で互いに融合することができる。例示的な構成を図1に図示する。
特定の態様において、第1のFab断片のC末端が第2のFab断片のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合される(図1Aおよび1Bの例を参照されたい)。1つのこのような態様において、第2のFab断片は免疫グロブリンヒンジ領域を介して第1のFcドメインサブユニットと融合される。さらなるこのような態様において、第1のFab断片はペプチドリンカーを介して第2のFab断片と融合される。
1つの態様において、第1のFab断片の重鎖のC末端は第2のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片の重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合される。
他の態様において、第2のFab断片のC末端が第1のFab断片のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合される(図1Cの例を参照されたい)。1つのこのような態様において、第1のFab断片は免疫グロブリンヒンジ領域を介して第1のFcドメインサブユニットと融合される。さらなるこのような態様において、第2のFab断片はペプチドリンカーを介して第1のFab断片と融合される。1つの態様において、第2のFab断片の重鎖のC末端は第1のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片の重鎖のC末端は第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合される。
第1のFab断片の重鎖のC末端が第2のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合される、または第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合される一部の態様において、さらに、第1のFab断片のFab軽鎖および第2のFab断片のFab軽鎖は、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合される(図12の例を参照されたい)。
これらの態様によれば、特異性の異なる2種類のFab断片が互いに融合され、さらには、これらのうち一方がFcドメインサブユニットと融合される。この構成は、古典的な二重特異性免疫グロブリン形式とは異なる形状(例えば、Fab断片間の距離、角度)を可能にし、免疫グロブリン分子の2つのFab断片は異なる特異性を有する。例えば、本発明者らは、二重特異性抗原結合分子がT細胞結合および強制指向(re-direction)に用いられた場合、この構成が、必要に応じてT細胞と標的細胞との免疫シナプスを模倣するのに、古典的な二重特異性免疫グロブリン形式より適していることを発見した(データ示さず)。
他の態様において、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、さらには、第1のFcドメインサブユニットのC末端が第1のFab断片のN末端と融合される(図1Dの例を参照されたい)。1つのこのような態様において、第2のFab断片は免疫グロブリンヒンジ領域を介して第1のFcドメインサブユニットと融合される。さらなるこのような態様において、第1のFab断片はペプチドリンカーを介して第1のFcドメインサブユニットと融合される。1つの態様において、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、さらには、第1のFcドメインサブユニットのC末端が第1のFab断片の重鎖のN末端と融合される。これらの態様によれば、特異性の異なる2種類のFab断片が、Fcドメインサブユニットの2つの末端と融合される。この構成もまた、特定の用途に有利な場合がある特異な形状を可能にする。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は、第1のFab断片、第2のFab断片、Fcドメイン、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる。
本発明による二重特異性抗原結合分子は、本発明による二重特異性抗原結合分子が結合する2つの抗原のうち少なくとも1つとの一価結合を提供する。例えば、高親和性の抗原結合分子の結合後に標的抗原の内部移行が予想される場合、一価結合は重要である。このような場合、標的抗原に特異的な複数の抗原結合部分の存在は抗原の内部移行を増強し、それによって抗原の利用可能性が低下することがある。さらに、標的抗原の架橋結合が望ましくない場合、一価結合は不可欠である。例えば、T細胞結合および強制指向のための二重特異性抗原結合分子において、CD3などの活性化T細胞抗原との二価結合は標的細胞の非存在下でもT細胞活性化につながる可能性がある。
しかしながら、他の場合において、例えば、結合親和性を高めるために、標的部位への標的化を最適化するために、または標的抗原の架橋結合を可能にするために二価結合が望ましい場合がある。
従って、特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原または第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含む。1つの態様において、第3のFab断片は第2のFcドメインサブユニットと融合される。さらに具体的な態様において、第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合される。さらにより具体的な態様において、第3のFab断片の重鎖のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合される。1つの態様において、第3のFab断片は免疫グロブリンヒンジ領域を介して第2のFcドメインサブユニットと融合される。1つの態様において、第3のFab断片は第2の抗原に特異的に結合する。
一部の態様において、第2のFab断片、第3のFab断片、およびFcドメインは免疫グロブリン分子の一部である。第3のFab断片が第2の抗原に特異的に結合する態様において、免疫グロブリン分子は、第2の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子である。このような特定の態様において、免疫グロブリン分子はIgGクラス免疫グロブリン分子であり、より具体的にはIgG1またはIgG4サブクラス免疫グロブリン分子である。1つの特定の態様において、免疫グロブリン分子は、位置S228(Kabatナンバリング)においてアミノ酸置換、特に、アミノ酸置換S228Pを含むIgG4分子である。このアミノ酸置換はIgG4抗体のインビボFabアーム交換を低減する(Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91(2010)を参照されたい)。1つの態様において、免疫グロブリン分子はヒト免疫グロブリン分子である。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる。
前記態様の一部によれば、第1のFab断片の軽鎖および第2のFab断片の軽鎖は互いに融合され、任意でペプチドリンカーを介して互いに融合される。第1のFab断片および第2のFab断片の構成に応じて、第1のFab断片の軽鎖のC末端が第2のFab断片の軽鎖のN末端と融合されてもよく、または第2のFab断片の軽鎖のC末端が第1のFab断片の軽鎖のN末端と融合されてもよい。第1のFab断片および第2のFab断片の軽鎖の融合は、対応しないFab重鎖および軽鎖の誤対合をさらに減らし、本発明の二重特異性抗原結合分子の一部の発現に必要なプラスミド数も減らす。
前記態様のいずれかによれば、二重特異性抗原結合分子の成分(例えば、Fab断片、Fcドメインサブユニット)は、直接、または本明細書に記載の、もしくは当技術分野において公知の様々なリンカー、特に、1つまたは複数のアミノ酸、典型的に、約2〜20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して連結されてもよい。適切な非免疫原性のペプチドリンカーには、例えば、(G4S) n、(SG4) n、(G4S) n、またはG4 (SG4) nペプチドリンカーが含まれる。式中、nは、一般的には1〜10、典型的には2〜4の数字である。第1のFab断片および第2のFab断片の軽鎖を互いに融合するのに特に適切したペプチドリンカーは(G4S) 2である。さらに、ペプチドリンカーは免疫グロブリンヒンジ領域(の一部)を含んでもよい。例示的なこのようなリンカーはEPKSC(D)-(G4S) 2 (SEQ ID NO 72および73)である。特に、Fab断片がFcドメインサブユニットのN末端と連結される場合、さらなるペプチドリンカーと共に、またはさらなるペプチドリンカーを伴わずに、免疫グロブリンヒンジ領域またはその一部を介して連結されてもよい。
ある特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、VL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CH1領域がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーが免疫グロブリン重鎖(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、抗体軽鎖(VL-CL)、および/またはVH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CL領域がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがFab軽鎖(VL-CL)とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
他の態様において、二重特異性抗原結合分子は、Fab重鎖(VH-CH1)がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CH1領域が、免疫グロブリンヒンジ領域を含むFcドメインサブユニット(HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、抗体軽鎖(VL-CL)、および/またはVH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、Fab軽鎖(VL-CL)がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVH領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
ある特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CL領域がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーが免疫グロブリン重鎖(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、抗体軽鎖(VL-CL)、および/またはVL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、VL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CH1領域がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがFab軽鎖(VL-CL)とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
他の態様において、二重特異性抗原結合分子は、Fab重鎖(VH-CH1)がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVH領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CL領域が、免疫グロブリンヒンジ領域を含むFcドメインサブユニット(HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、抗体軽鎖(VL-CL)、および/またはVL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、Fab軽鎖(VL-CL)がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
さらに他の態様において、二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリン重鎖((VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVH領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は免疫グロブリン重鎖((VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))をさらに含む。別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインサブユニット、任意で、抗体ヒンジ領域((HR)-CH2-CH3-(CH4))を含むFcドメインサブユニットをさらに含む。これらの態様の一部において、二重特異性抗原結合分子は、抗体軽鎖(VL-CL)、および/またはVL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。
Fab断片
本発明の抗原結合分子は二重特異性である。すなわち、本発明の抗原結合分子は、2種類の特異な抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも2種類の抗原結合部分を含む。特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は2種類の特異な抗原決定基に同時に結合することができる。本発明によれば抗原結合部分は、Fab断片(すなわち、重鎖および軽鎖からなる抗原結合ドメイン。重鎖および軽鎖はそれぞれ可変領域および定常領域を含む)である。1つの態様において、前記Fab断片はヒトである。別の態様において、前記Fab断片はヒト化されている。さらに別の態様において、前記Fab断片はヒト重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む。
本発明によれば、Fab断片の少なくとも1つは、Fab重鎖および軽鎖の可変ドメインおよび/または定常ドメインが交換された「Crossfab」断片である。このような改変は、異なるFab断片からの重鎖および軽鎖の誤対合を阻止し、それによって、組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率および純度が改善する。言い換えると、二重特異性抗体産生における重鎖および軽鎖の誤対合の問題は、二重特異性抗原結合分子の1つまたは複数のFab断片の中にある重鎖および軽鎖の可変ドメインおよび/または定常ドメインの交換によって克服され、そのため、特異性の異なるFab断片は同一のドメイン配置を有さず、その結果、軽鎖を「相互に交換しない」。
可能性のある交換には、以下:(i)Fab重鎖および軽鎖の可変ドメイン(VHおよびVL)が互いに交換される;(ii)Fab重鎖および軽鎖の定常ドメイン(CH1およびCL)が互いに交換される;または(iii)Fab重鎖および軽鎖(VH-CH1およびVL-CL)が互いに交換される、が含まれる。
望ましい結果を実現するために、すなわち、特異性の異なる重鎖および軽鎖の誤対合を阻止するために、特異性の異なるFab断片において同じ交換が行われてはならない。例えば、第1の抗原に特異的に結合するFab断片では重鎖および軽鎖の可変ドメインが交換されてもよく、それに対して、第2の抗原に特異的に結合するFab断片では重鎖および軽鎖の定常領域が交換されてもよい。別の例として、第1の抗原に特異的に結合するFab断片では交換はなされないのに対して、第2の抗原に特異的に結合するFab断片では重鎖および軽鎖の可変ドメインが交換されてもよい。
特定の態様において、同じ特異性のFab断片において(すなわち、同じ抗原に特異的に結合するFab断片において)同じ交換がなされる。二重特異性抗原結合分子に含まれる全てのFab断片において交換がなされる必要はない。例えば、3つのFab断片がある態様において、他の2つのFab断片と異なる特異性を有するFab断片においてのみ交換を行えば十分である。具体的には、二重特異性抗原結合分子が、第1の抗原に結合する第3のFab断片を含む態様において、第2のFab断片のみ交換がなされる。同様に、二重特異性抗原結合分子が、第2の抗原に結合する第3のFab断片を含む態様において、第1のFab断片のみ交換がなされる。
特定の態様において、第1のFab断片において交換がなされる。1つのこのような態様において、さらなる交換はなされない。一部の態様において、交換は、可変ドメインのVLおよびVHの相互交換である。他の態様において、交換は、定常ドメインCLおよびCH1の相互交換である。さらに他の態様において、交換は、可変ドメインおよび定常ドメインVL-CLおよびVH-CH1の相互交換である。
特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は第1の抗原との一価結合を提供する。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は単鎖Fab断片を含まない。
特定の局面において、本発明は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が第1の抗原との一価結合を提供し、
b)第1のFab断片のC末端が第2のFab断片のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、
c)第1のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに交換され、かつ
d)二重特異性抗原結合分子が、任意で、第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含み、第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合される、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
別の局面において、本発明は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が第1の抗原との一価結合を提供し、
b)第1のFab断片のC末端が第2のFab断片のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、
c)第1のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに交換され、かつ
d)二重特異性抗原結合分子が、任意で、第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含み、第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合される、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
さらに特定の局面において、本発明は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が第1の抗原との一価結合を提供し、
b)第2のFab断片のC末端が第1のFab断片のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、
c)第1のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1が互いに交換され、かつ
d)二重特異性抗原結合分子が、任意で、第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含み、第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合される、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
さらなる局面において、本発明は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が第1の抗原との一価結合を提供し、
b)第2のFab断片のC末端が第1のFab断片のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、
c)第1のFab断片において、可変ドメインVLおよびVHが互いに交換され、かつ
d)二重特異性抗原結合分子が、任意で、第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含み、第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合される、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
なおさらなる局面において、本発明は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
a)二重特異性抗原結合分子が第1の抗原との一価結合を提供し、
b)第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、さらには、第1のFcドメインサブユニットのC末端が第1のFab断片のN末端と融合され、
c)第1のFab断片において、定常ドメインCLおよびCH1は互いに交換され、かつ
d)二重特異性抗原結合分子が、任意で、第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含み、第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合される、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
Fcドメイン
二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、抗体分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチドからなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは二量体であり、それぞれのサブユニットはCH2およびCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの2つのサブユニット互いに安定的な会合することができる。本発明の二重特異性抗原結合分子は1個以下のFcドメインを含む。
本発明による1つの態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインはIgG Fcドメインである。特定の態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。別の態様において、FcドメインはIgG4 Fcドメインである。さらに具体的な態様において、Fcドメインは、位置S228(Kabatナンバリング)にアミノ酸置換、特に、アミノ酸置換 S228Pを含むIgG4 Fcドメインである。このアミノ酸置換はIgG4抗体のインビボFabアーム交換を低減する(Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照されたい)。さらに特定の態様において、Fcドメインはヒトである。ヒト IgG1 Fc 領域の例示的な配列をSEQ ID NO:71に示した。
ヘテロ二量体化を促進するFcドメイン改変
本発明による二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方または他方と融合された異なるFab断片を含む。従って、Fcドメインの2つのサブユニットは、典型的に、2本の非同一ポリペプチド鎖の中に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現およびその後の二量体化は、2つのポリペプチドのいくつかの可能性のある組み合わせにつながる。従って、組換え産生における二重特異性抗原結合分子の収率および純度を改善するために、二重特異性抗原結合分子のFcドメインに、望ましいポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利であろう。
従って、特定の態様において、Fcドメインは、第1のFcドメインサブユニットおよび第2のFcドメインサブユニットの会合を促進する改変を含む。改変は、第1のFcドメインサブユニットおよび/または第2のFcドメインサブユニットに存在してもよい。
ヒトIgG Fcドメインの2つのサブユニット間にある最も大規模なタンパク質間相互作用の部位はFcドメインのCH3ドメインにある。従って、1つの態様において、前記改変はFcドメインのCH3ドメインにある。
特定の態様において、前記改変は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方に「ノブ」改変および、Fcドメインの2つのサブユニットの他方に「ホール」改変を含む、いわゆる「ノブイントゥホール(knob-into-hole)」改変である。
ノブイントゥホール技術は、例えば、US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)およびCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、この方法は、突出部(「ノブ」)を空洞(「ホール」)の中に配置させてヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害できるように、第1のポリペプチドの境界面に突出部および第2のポリペプチドの境界面に対応する空洞を導入することを伴う。第1のポリペプチドの境界面に由来する小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)と交換することによって突出部が構築される。大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニンまたはスレオニン)と交換することによって、突出部と同一または類似するサイズの埋め合わせとなる空洞が第2のポリペプチドの境界面に作り出される。
従って、特定の態様において、二重特異性抗原結合分子の第1のFcドメインサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のFcドメインサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、第2の第2のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部が配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる。
突出部および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異誘発によって、またはペプチド合成によって作ることができる。
特定の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにある位置366のスレオニン残基がトリプトファン残基と交換され(T366W)、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにある位置407のチロシン残基がバリン残基と交換される(Y407V)。1つの態様において、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、さらに、位置366のスレオニン残基がセリン残基と交換され(T366S)、位置368のロイシン残基がアラニン残基と交換される(L368A)。
なおさらなる態様において、Fcドメインの第1のサブユニットでは、さらに、位置354にあるセリン残基がシステイン残基と交換され(S354C)、Fcドメインの第2のサブユニットでは、さらに、位置349にあるチロシン残基がシステイン残基と交換される(Y349C)。これらの2つのシステイン残基が導入されると、Fcドメインの2つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体がさらに安定化する(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
別の態様において、Fcドメインの第1のサブユニットおよび第2のサブユニットの会合を促進する改変は、静電ステアリング(electrostatic steering)効果を媒介する改変、例えば、PCT公報WO2009/089004に記載の改変を含む。一般的に、この方法は、ホモ二量体形成が静電気的に好ましくないが、ヘテロ二量体化が静電気的に好ましくなるように、2つのFcドメインサブユニットの境界面にある1つまたは複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基と交換することを伴う。
Fc受容体結合および/またはエフェクター機能を変えるFcドメイン改変
ある特定の態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して、Fc受容体に対する変化した結合親和性および/または変化したエフェクター機能を有するように操作されている。
Fc受容体との結合は、例えば、ELISAによって、またはBIAcore装置(GE Healthcare)などの標準的な計器を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)によって容易に確かめることができる。Fc受容体は組換え発現によって入手されてもよい。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載されている。または、Fc受容体に対するFcドメインまたはFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のFc受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、FcγIIIa受容体を発現するNK細胞を用いて評価されてもよい。
FcドメインまたはFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は当技術分野において公知の方法によって測定することができる。関心対象の分子のADCC活性を評価するための適切なインビトロアッセイは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、PCT公報番号WO2006/082515またはPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393に記載されている。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。または、もしくはさらに、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、動物モデル、例えば、Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいて評価されてもよい。
一部の態様では、Fcドメインと補体成分、具体的にはC1qとの結合が変えられる。従って、変化したエフェクター機能を有するようにFcドメインが操作されている一部の態様において、前記変化したエフェクター機能には、変化したCDCが含まれる。二重特異性抗原結合分子がC1qに結合することができ、従って、CDC活性を有するかどうか確かめるためにC1q結合アッセイが実施されてもよい。例えば、WO2006/029879およびWO2005/100402におけるC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイが実施されてもよい(例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003);およびCragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743(2004)を参照されたい)。
a)減少したFc受容体結合および/またはエフェクター機能
Fcドメインは、標的組織における優れた蓄積に寄与する長い血清半減期および好ましい組織-血液分布比を含む、好ましい薬物動態学的特性を二重特異性抗原結合分子に付与する。しかしながら、同時に、Fcドメインは、好ましい抗原を有する細胞ではなくFc受容体発現細胞への二重特異性抗原結合分子の望ましくない標的化につながる場合がある。さらに、Fc受容体シグナル伝達経路の活性化がサイトカイン放出および全身投与時の重篤な副作用につながる場合がある。
従って、特定の態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して、Fc受容体に対して低減した結合親和性および/または低減したエフェクター機能を有するように操作されている。1つのこのような態様において、Fcドメイン(または前記Fcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)は、操作されていないFcドメイン(もしくは操作されていないFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)と比較して50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満のFc受容体に対する結合親和性、および/または操作されていないFcドメイン(もしくは操作されていないFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)と比較して50％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは10％未満、最も好ましくは5％未満のエフェクター機能を示す。1つの態様において、Fcドメインドメイン(または前記Fcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)はFc受容体に実質的に結合しない、および/またはエフェクター機能を実質的に誘導しない。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。1つの態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。1つの態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRI、またはFcγRIIa、最も具体的にはヒトFcγRIIIaである。1つの態様において、エフェクター機能は、CDC、ADCC、ADCP、およびサイトカイン分泌からなる群より選択される1つまたは複数である。特定の態様において、エフェクター機能はADCCである。1つの態様において、Fcドメインドメインは、操作されていないFcドメインと比較して、胎児性Fc受容体(FcRn)に対する実質的に類似した結合親和性を示す。FcRnに対する実質的に類似した結合は、Fcドメイン(または前記Fcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)が、FcRnに対する、操作されていないFcドメイン(または操作されていないFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)の結合親和性の約70％超、詳細には約80％超、より詳細には約90％超を示す時に達成される。
ある特定の態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性および/またはエフェクター機能を低減させる1つまたは複数のアミノ酸変異を含む。典型的に、Fcドメインの2つのサブユニットのそれぞれにおいて1つまたは複数の同じアミノ酸変異が存在する。1つの態様において、アミノ酸変異は、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を低減させる。1つの態様において、アミノ酸変異によって、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性は少なくとも1/2、少なくとも1/5、または少なくとも1/10低減する。Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性を低減させる複数のアミノ酸変異がある態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせによって、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性は少なくとも1/10、少なくとも1/20、またはさらに少なくとも1/50低減し得る。特定の態様において、Fc受容体はFcγ受容体である。一部の態様において、Fc受容体はヒトFc受容体である。一部の態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体、より具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRI、またはFcγRIIa、最も具体的にはヒトFcγRIIIaである。好ましくは、これらの受容体のそれぞれとの結合が低減される。一部の態様において、補体成分との結合親和性、具体的にはC1qとの結合親和性も低減される。1つの態様において、胎児性Fc受容体(FcRn)との結合親和性は低減される。
ある特定の態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して低減したエフェクター機能を有するように操作されている。低減したエフェクター機能には、以下:低減した補体依存性細胞傷害(CDC)、低減した抗体依存性細胞傷害(ADCC)、低減した抗体依存性細胞食作用(ADCP)、低減したサイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した低減した抗原取り込み、NK細胞との低減した結合、マクロファージとの低減した結合、単球との低減した結合、多核白血球との低減した結合、アポトーシスを誘導する低減した直接シグナル伝達、低減した標的結合抗体架橋結合、低減した樹状細胞成熟、または低減したT細胞プライミングの1つまたは複数が含まれ得るが、これに限定されない。1つの態様において、低減したエフェクター機能は、低減したCDC、低減したADCC、低減したADCP、および低減したサイトカイン分泌からなる群より選択される1つまたは複数である。特定の態様において、低減したエフェクター機能は、低減したADCCである。1つの態様において、低減したADCCは、操作されていないFcドメイン(または操作されていないFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)によって誘導されるADCCの20％未満である。
1つの態様において、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性および/またはエフェクター機能を低減させるアミノ酸変異はアミノ酸置換である。1つの態様において、Fcドメインは、E233、L234、L235、N297、P331、およびP329からなる群より選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様において、Fcドメインは、L234、L235、およびP329からなる群より選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。一部の態様において、Fcドメインは、アミノ酸置換L234AおよびL235Aを含む。1つのこのような態様において、Fcドメインは、IgG1Fcドメイン、特にヒトIgG1Fcドメインである。1つの態様において、Fcドメインは、位置P329にアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様において、アミノ酸置換はP329AまたはP329G、特にP329Gである。1つの態様において、Fcドメインは、位置P329にアミノ酸置換を含み、E233、L234、L235、N297、およびP331より選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様において、さらなるアミノ酸置換は、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、またはP331Sである。特定の態様において、Fcドメインは、位置P329、L234、およびL235にアミノ酸置換を含む。さらに詳細な態様において、Fcドメインは、アミノ酸変異L234A、L235A、およびP329G(「P329 GLALA」)を含む。1つのこのような態様において、Fcドメインは、IgG1Fcドメイン、特にヒトIgG1Fcドメインである。その全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393に記載のようにアミノ酸置換の「P329G LALA」組み合わせは、Fcγ受容体とヒトIgG1Fcドメインとの結合をほぼ完全になくす。PCT/EP2012/055393はまた、このような変異体Fcドメインを調製する方法、およびその特性、例えば、Fc受容体結合またはエフェクター機能を確かめるための方法について述べる。
IgG4抗体は、IgG1抗体と比較してFc受容体に対する低減した結合親和性および低減したエフェクター機能を示す。従って、一部の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、IgG4Fcドメイン、特にヒトIgG4Fcドメインである。1つの態様において、IgG4Fcドメインは、位置S228にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228Pを含む。Fc受容体に対するその結合親和性および/またはそのエフェクター機能をさらに低減させるために、1つの態様では、IgG4Fcドメインは位置L235にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換L235Eを含む。別の態様において、IgG4Fcドメインは位置P329にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換P329Gを含む。特定の態様において、IgG4Fcドメインは、位置S228、L235、およびP329にアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228P、L235E、およびP329Gを含む。このようなIgG4Fcドメイン変異体およびこれらのFcγ受容体結合特性は、その全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393に記載されている。
特定の態様において、天然のIgG1Fcドメインと比較して、Fc受容体に対して低減した結合親和性および/または低減したエフェクター機能を示すFcドメインは、アミノ酸置換L234A、L235A、任意で、P329Gを含むヒトIgG1Fcドメイン、またはアミノ酸置換S228P、L235E、任意で、P329Gを含むヒトIgG4Fcドメインである。
ある特定の態様において、FcドメインのN-グリコシル化が排除されている。1つのこのような態様において、Fcドメインは、位置N297にアミノ酸変異、特に、アスパラギンをアラニン(N297A)またはアスパラギン酸(N297D)と交換したアミノ酸置換を含む。
前記およびPCT特許出願番号PCT/EP2012/055393に記載のFcドメインに加えて、Fc受容体結合および/またはエフェクター機能が低減したFcドメインは、Fcドメイン残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を有するFcドメインも含む(米国特許第6,737,056号)。このようなFc変異体は、残基265および297がアラニンに置換された、いわゆる「DANA」Fc変異体(米国特許第7,332,581号)を含む、アミノ酸位置265、269、270、297、および327の2つ以上に置換を有するFc変異体を含む。
変異体Fcドメインは、当技術分野において周知の遺伝的方法または化学的方法を用いたアミノ酸欠失、置換、挿入、または改変によって調製することができる。遺伝的方法には、コードDNA配列の部位特異的変異誘発、PCR、遺伝子合成などが含まれ得る。正しいヌクレオチド変化は、例えば、配列決定によって立証することができる。
b)向上したFc受容体結合および/またはエフェクター機能
逆に、例えば、二重特異性抗原結合分子が高度に特異的な腫瘍抗原に標的化された時に、二重特異性抗原結合分子のFc受容体結合および/またはエフェクター機能を維持する、またはさらに増強することが望ましい状況があり得る。従って、ある特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fc受容体に対して高い結合親和性を有するように操作されている。向上した結合親和性は、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性の少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍の向上でもよい。1つの態様において、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の態様において、Fc受容体は、Fcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である。1つの態様において、Fc受容体は、FcγRIIIa、FcγRI、およびFcγRIIaからなる群より選択される。特定の態様において、Fc受容体はFcγRIIIaである。
1つのこのような態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して変化したオリゴ糖構造を有するように操作されている。このような特定の態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して、高い割合の非フコシル化オリゴ糖を含む。さらに具体的な態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインにあるN結合型オリゴ糖の少なくとも約50％、より詳細には少なくとも約70％が非フコシル化されている。非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド型または複合型でもよい。別の特定の態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して高い割合のバイセクトオリゴ糖(bisected oligosaccharide)を含む。さらに具体的な態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインにあるN結合型オリゴ糖の少なくとも約35％、特に少なくとも約50％、より詳細には少なくとも約70％がバイセクト型である。バイセクトオリゴ糖はハイブリッド型または複合型でもよい。さらに別の特定の態様において、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して高い割合のバイセクト非フコシル化オリゴ糖を含む。さらに具体的な態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインにあるN結合型オリゴ糖の少なくとも約15％、より詳細には少なくとも約25％、少なくとも約35％、または少なくとも約50％がバイセクト型であり、非フコシル化されている。バイセクト非フコシル化オリゴ糖はハイブリッド型または複合型でもよい。
二重特異性抗原結合分子のFcドメインにあるオリゴ糖構造は、当技術分野において周知の方法によって、例えば、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180(1999)またはFerrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861(2006)に記載のようにMALDI TOF質量分析法によって分析することができる。非フコシル化オリゴ糖のパーセントは、Asn297に結合した全てのオリゴ糖(例えば、複合ハイブリッド高マンノース構造)と比べてフコース残基を欠き、かつN-グリコシダーゼF処理試料中でMALDI TOF MSによって特定されたオリゴ糖の量である。Asn297は、Fcドメインの中のほぼ位置297(Fc領域残基のEUナンバリング)に位置するアスパラギン残基を指す。しかしながら、Asn297は、免疫グロブリン中の軽微な配列変化のために、位置297のほぼ+/-3アミノ酸上流または下流、すなわち、位置294〜300にも位置することがある。バイセクトオリゴ糖またはバイセクト非フコシル化オリゴ糖のパーセントが同様に求められる。
二重特異性抗原結合分子のFcドメインにおけるグリコシル化を改変することによって、レベルが変化した、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する1種類または複数種のポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞において二重特異性抗原結合分子を産生することができる。
1つの態様において、1種類または複数種のグリコシルトランスフェラーゼの活性が変化した宿主細胞において二重特異性抗原結合分子を産生することによって、二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して変化したオリゴ糖構造を有するように操作される。グリコシルトランスフェラーゼには、例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)、β(1,4)-ガラクトシルトランスフェラーゼ(GalT)、β(1,2)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI(GnTI)、β(1,2)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII(GnTII)、およびα(1,6)-フコシルトランスフェラーゼが含まれる。特定の態様において、高いβ(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)活性を有する宿主細胞において二重特異性抗原結合分子を産生することによって、二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して高い割合の非フコシル化オリゴ糖を含むように操作される。さらにより具体的な態様において、さらに、宿主細胞は高いα-マンノシダーゼII(ManII)活性を有する。本発明の二重特異性抗原結合分子のグライコエンジニアリング(glycoengineering)に使用することができるグライコエンジニアリング法は、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180(1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861(2006); WO99/54342(米国特許第6,602,684号; EP1071700); WO2004/065540(米国特許出願公開第2004/0241817号; EP1587921)、WO03/011878(米国特許出願公開第2003/0175884号)においてさらに詳細に述べられている。これらのそれぞれの内容はその全体が参照として本明細書にはっきりと組み入れられる。
一般的に、グリコシル化パターンが変化した二重特異性抗原結合分子を産生するための細胞株を作製するために、本明細書において議論された細胞株を含む任意のタイプの培養細胞株を使用することができる。特定の細胞株には、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YOミエローマ細胞、P3X63マウスミエローマ細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、および他の哺乳動物細胞が含まれる。ある特定の態様において、宿主細胞は、高いレベルの、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)活性を有する1種類または複数種のポリペプチドを発現するように操作されている。ある特定の態様において、宿主細胞は、高いレベルの、α-マンノシダーゼII(ManII)活性を有する1種類または複数種のポリペプチドを発現するようにさらに操作されている。特定の態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドは、GnTIII触媒ドメインおよび異種ゴルジ体存在ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に、前記ゴルジ体局在化ドメインはマンノシダーゼIIのゴルジ体局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを作製するための方法およびエフェクター機能が向上した抗体を産生するために、このような融合ポリペプチドを使用する方法は、Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861(2006)およびWO2004/065540に開示される。これらの全内容は、参照として本明細書にはっきりと組み入れられる。
本発明の二重特異性抗原結合分子のコード配列および/またはグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、例えば、DNA-DNAもしくはDNA-RNAハイブリダイゼーションによって、「マーカー」遺伝子機能の存在もしくは非存在によって、宿主細胞におけるそれぞれのmRNA転写物の発現によって測定されるように転写レベルの評価によって、またはイムノアッセイもしくはその生物学的活性によって測定されるような遺伝子産物の検出によって特定することができる。これらの方法は当技術分野において周知である。GnTIII活性またはManII活性は、それぞれ、例えば、GnTIIIまたはManIIの生合成産物に結合するレクチンを使用することによって検出することができる。このようなレクチンの一例は、バイセクティング(bisecting)GlcNAcを含有するオリゴ糖に優先的に結合するE4-PHAレクチンである。GnTIII活性またはManII活性を有するポリペプチドの生合成産物(すなわち、特異的なオリゴ糖構造)はまた、前記ポリペプチドを発現する細胞によって産生された糖タンパク質から放出されるオリゴ糖の質量分析によっても検出することができる。または、GnTIII活性またはManII活性を有するポリペプチドで操作された細胞によって産生された二重特異性抗原結合分子によって媒介される、向上したエフェクター機能および/または向上したFc受容体結合を測定する機能アッセイが用いられることもある。
別の態様において、α(1,6)-フコシルトランスフェラーゼ活性が低い宿主細胞において二重特異性抗原結合分子を産生することによって、Fcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して高い割合の非フコシル化オリゴ糖を含むように操作される。α(1,6)-フコシルトランスフェラーゼ活性が低い宿主細胞は、α(1,6)-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されている、または他の方法で不活性化されている、例えば、ノックアウトされている細胞でもよい(Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol Bioeng 94(4), 680-688 (2006); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)を参照されたい)。
脱フコシル二重特異性抗原結合分子を産生することができる細胞株の他の例には、タンパク質フコシル化が欠損しているLec13 CHO細胞(Ripka et al., Arch Biochem Biophys 249, 533-545(1986);米国特許出願公開第2003/0157108号;およびWO2004/056312、特に、実施例11)が含まれる。または、EP1176195A1、WO03/084570、WO03/085119、および米国特許出願公開第2003/0115614号、同第2004/093621号、同第2004/110282号、同第2004/110704号、同第2004/132140号、米国特許第6,946,292号(Kyowa)に開示される技法に従って、例えば、二重特異性抗原結合分子の産生に用いられる宿主細胞内のGDP-フコース輸送体タンパク質活性を低減する、またはなくすことによってFcドメインのフコース残基が少なくなるように、本発明の二重特異性抗原結合分子の糖が操作されてもよい。
本発明の糖が操作された二重特異性抗原結合分子はまた、改変された糖タンパク質を産生する発現系、例えば、WO2003/056914(GlycoFi, Inc.)またはWO2004/057002およびWO2004/024927(Greenovation)に開示される発現系において産生されてもよい。
1つの態様において、二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、操作されていないFcドメインと比較して向上したエフェクター機能を有するように操作されている。向上したエフェクター機能には、以下:向上した補体依存性細胞傷害(CDC)、向上した抗体依存性細胞傷害(ADCC)、向上した抗体依存性細胞食作用(ADCP)、向上したサイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した向上した抗原取り込み、NK細胞との向上した結合、マクロファージとの向上した結合、単球との向上した結合、多核白血球との向上した結合、アポトーシスを誘導する向上した直接シグナル伝達、向上した標的結合抗体架橋結合、向上した樹状細胞成熟、または向上したT細胞プライミングの1つまたは複数が含まれ得るが、これに限定されない。
1つの態様において、向上したエフェクター機能は、向上したCDC、向上したADCC、向上したADCP、および向上したサイトカイン分泌からなる群より選択される1つまたは複数である。特定の態様において、向上したエフェクター機能は、向上したADCCである。1つの態様において、操作されたFcドメイン(または操作されたFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)によって誘導されたADCCは、操作されていないFcドメイン(または操作されていないFcドメインを含む二重特異性抗原結合分子)によって誘導されたADCCと比較して少なくとも2倍向上している。
抗原
本発明の二重特異性抗原結合分子は様々な抗原に結合し得る。ある特定の態様において、第1の抗原および/または第2の抗原は、病理学的状態に関連する抗原、例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、または炎症部位において提示された抗原である。適切な抗原には、細胞表面抗原(例えば、細胞表面受容体があるが、これに限定されない)、血清中で遊離している抗原、および/または細胞外マトリックス中にある抗原が含まれる。特定の態様において、抗原はヒト抗原である。
抗原の非限定的な例には、腫瘍抗原、例えば、MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質(ADAbp)、シクロフィリンb、結腸直腸関連抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胎児抗原(CEA)およびその免疫原性エピトープCAP-1およびCAP-2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原(PSA)およびその免疫原性エピトープPSA-1、PSA-2、およびPSA-3、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、T-細胞受容体/CD3-ζ鎖、腫瘍抗原のMAGEファミリー(例えば、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、腫瘍抗原のGAGEファミリー(例えば、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、Her3、p21ras、RCAS1、α-フェトプロテイン、E-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、およびγ-カテニン、p120ctn、gp100、Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、大腸腺腫症タンパク質(APC)、フォドリン、コネキシン37、Ig-イディオタイプ、p15、gp75、GM2およびGD2ガングリオシド、腫瘍抗原のSmadファミリー、lmp-1、P1A、EBVコード核抗原(EBNA)-1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1およびCT-7、ならびにc-erbB-2;ECM抗原、例えば、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、link、カドヘリン、ラミニン、ラミニン型EGF、レクチン、フィブロネクチンおよびそのオルタナティブスプライシングされたドメイン(例えば、Extra Domain B)、notch、様々な形態のテネイシン(例えば、テネイシンC)およびそのオルタナティブスプライシングされたドメイン(例えば、テネイシン-CのA1またはA2ドメイン)、およびマトリキシン(matrixin);線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、CD2(T細胞表面抗原)、CD3(TCR関連ヘテロ多量体)、CD19、CD22(B細胞受容体)、CD23(低親和性IgE受容体)、CD25(IL-2受容体α鎖)、CD30(サイトカイン受容体)、CD33(骨髄性細胞表面抗原)、CD40(腫瘍壊死因子受容体)、IL-6R(IL6受容体)、CD20、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、インシュリン様増殖因子-1受容体(IGF-1R)、ならびにPDGFβR(β血小板由来増殖因子受容体)が含まれる。特定の態様において、第1の抗原および第2の抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、Her3、c-Met、癌胎児抗原(CEA)、CD33、およびCD3からなる群より選択される。
特定の態様において、第1の抗原は、CD3、特にヒトまたはカニクイザルCD3、最も詳細にはヒトCD3である。一部の態様において、第1の抗原は、CD3のεサブユニットである。1つの態様において、第1のFab断片は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体H2C(PCT公報番号WO2008/119567に記載)と競合することができる。特定の態様において、第1のFab断片は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体SP34(Pessano et al., EMBO J 4, 337-340 (1985)に記載)と競合することができる。別の態様において、第1のFab断片は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体V9(Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992)および米国特許第6,054,297号に記載)と競合することができる。さらに別の態様において、第1のFab断片は、CD3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体FN18(Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)に記載)と競合することができる。1つの態様において、第1のFab断片はCD3に特異的であり、SEQ ID NO:77の重鎖CDR1、SEQ ID NO:78の重鎖CDR2、SEQ ID NO:79の重鎖CDR3、SEQ ID NO:81の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:82の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:83の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、CD3に特異的なFab断片は、SEQ ID NO:80と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:84と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。別の態様において、第1のFab断片はCD3に特異的であり、SEQ ID NO:104の重鎖CDR1、SEQ ID NO:105の重鎖CDR2、SEQ ID NO:106の重鎖CDR3、SEQ ID NO:108の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:109の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:110の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、CD3に特異的なFab断片は、SEQ ID NO:107と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:111と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
本発明による特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に、腫瘍細胞抗原、およびCD3と同時に結合することができる。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原およびCD3と同時に結合することによってT細胞および標的細胞を架橋結合することができる。さらにより詳細な態様において、このように同時に結合すると、標的細胞、特に、腫瘍細胞が溶解される。1つの態様において、このように同時に結合するとT細胞が活性化される。他の態様において、このように同時に結合すると、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現からなる群より選択される、Tリンパ球、特に、細胞傷害性Tリンパ球の細胞応答が生じる。1つの態様において、二重特異性抗原結合分子が標的細胞抗原と同時に結合せずにCD3と結合してもT細胞は活性化されない。
1つの態様において、二重特異性抗原結合分子は、T細胞の細胞傷害活性を標的細胞に強制的に向けることができる。特定の態様において、前記の強制指向は、標的細胞によるMHCを介したペプチド抗原提示および/またはT細胞特異性に依存しない。特に、本発明の任意の態様によるT細胞は細胞傷害性T細胞である。一部の態様において、T細胞は、CD4+T細胞またはCD8+T細胞、特に、CD8+T細胞である。
1つの態様において、第1の抗原はc-Met、特にヒトc-Metである。1つの態様において、第1のFab断片は、c-Metエピトープとの結合においてモノクローナル抗体5D5(例えば、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第7,476,724号に記載)と競合することができる。1つの態様において、第1のFab断片はc-Metに特異的であり、SEQ ID NO:63の重鎖CDR1、SEQ ID NO:64の重鎖CDR2、SEQ ID NO:65の重鎖CDR3、SEQ ID NO:67の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:68の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:69の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、c-Metに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:66と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:70と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
特定の態様において、第2の抗原は、腫瘍関連抗原、特に、腫瘍細胞または腫瘍間質細胞上に提示される抗原である。1つのこのような態様において、第2の抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、Her3、CD33、および癌胎児抗原(CEA)からなる群より選択される。
1つの態様において、第2の抗原は黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)である。別の態様において、第2のFab断片、任意で第3のFab断片は、MCSPエピトープとの結合においてモノクローナル抗体LC007(SEQ ID NO 18および22を参照されたい)と競合することができる。1つの態様において、MCSPに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:15の重鎖CDR1、SEQ ID NO:16の重鎖CDR2、SEQ ID NO:17の重鎖CDR3、SEQ ID NO:19の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:20の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:21の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、MCSPに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:18と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:22と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。別の態様において、第2のFab断片、任意で第3のFab断片は、MCSPエピトープとの結合においてモノクローナル抗体M4-3 ML2(SEQ ID NO 99および103を参照されたい)と競合することができる。1つの態様において、MCSPに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:96の重鎖CDR1、SEQ ID NO:97の重鎖CDR2、SEQ ID NO:98の重鎖CDR3、SEQ ID NO:100の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:101の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:102の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、MCSPに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:99と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:103と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
さらに別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:1のポリペプチド配列、SEQ ID NO:2のポリペプチド配列、SEQ ID NO:3のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:4のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。さらなる態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:1のポリペプチド配列、SEQ ID NO:3のポリペプチド配列、SEQ ID NO:4のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:5のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。さらに別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:4のポリペプチド配列、SEQ ID NO:5のポリペプチド配列、SEQ ID NO:6のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:7のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。さらに別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:4のポリペプチド配列、SEQ ID NO:5のポリペプチド配列、SEQ ID NO:1のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:85のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。さらなる態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:1のポリペプチド配列、SEQ ID NO:3のポリペプチド配列、SEQ ID NO:4のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:86のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。なおさらなる態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:4のポリペプチド配列、SEQ ID NO:87のポリペプチド配列、SEQ ID NO:89のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:90のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。さらなる態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:3のポリペプチド配列、SEQ ID NO:91のポリペプチド配列、SEQ ID NO:92のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:93のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。さらに別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:87のポリペプチド配列、SEQ ID NO:91のポリペプチド配列、SEQ ID NO:93のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:94のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。
1つの態様において、第2の抗原は癌胎児抗原(CEA)である。別の態様において、第2のFab断片、任意で第3のFab断片は、CEAエピトープとの結合においてモノクローナル抗体CH1A1Aと競合することができる。その全体が参照として本明細書に組み入れられる、PCT公報WO2011/023787を参照されたい。1つの態様において、CEAに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:39の重鎖CDR1、SEQ ID NO:40の重鎖CDR2、SEQ ID NO:41の重鎖CDR3、SEQ ID NO:43の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:44の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:45の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、CEAに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:42と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:46と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
さらに別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:3のポリペプチド配列、SEQ ID NO:8のポリペプチド配列、SEQ ID NO:9のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:10のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。さらに別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:9のポリペプチド配列、SEQ ID NO:10のポリペプチド配列、SEQ ID NO:87のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:95のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。
1つの態様において、第2の抗原はHer3である。別の態様において、第2のFab断片、任意で第3のFab断片は、Her3エピトープとの結合においてモノクローナル抗体Mab205.10と競合することができる。その全体が参照として本明細書に組み入れられる、PCT公報番号WO2011/076683を参照されたい。1つの態様において、Her3に特異的なFab断片は、SEQ ID NO:55の重鎖CDR1、SEQ ID NO:56の重鎖CDR2、SEQ ID NO:57の重鎖CDR3、SEQ ID NO:59の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:60の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:61の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、Her3に特異的なFab断片は、SEQ ID NO:58と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:62と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
さらに別の態様において、二重特異性抗原結合分子は、SEQ ID NO:11のポリペプチド配列、SEQ ID NO:12のポリペプチド配列、SEQ ID NO:13のポリペプチド配列、およびSEQ ID NO:14のポリペプチド配列、または機能を保持しているその変種を含む。
1つの態様において、第2の抗原は上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)である。別の態様において、第2のFab断片、任意で第3のFab断片は、EGFRエピトープとの結合においてモノクローナル抗体GA201と競合することができる。その全体が参照として本明細書に組み入れられる、PCT公報WO2006/082515を参照されたい。1つの態様において、EGFRに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:23の重鎖CDR1、SEQ ID NO:24の重鎖CDR2、SEQ ID NO:25の重鎖CDR3、SEQ ID NO:27の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:28の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:29の軽鎖CDR3を含む。
さらなる態様において、EGFRに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:26と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:30と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
1つの態様において、第2の抗原は線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)である。別の態様において、第2のFab断片、任意で第3のFab断片は、FAPエピトープとの結合においてモノクローナル抗体3F2と競合することができる。その全体が参照として本明細書に組み入れられる、PCT公報WO2012/020006を参照されたい。1つの態様において、FAPに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:31の重鎖CDR1、SEQ ID NO:32の重鎖CDR2、SEQ ID NO:33の重鎖CDR3、SEQ ID NO:35の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:36の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:37の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、FAPに特異的なFab断片は、SEQ ID NO:34と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:38と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
1つの態様において、第2の抗原はCD33である。1つの態様において、CD33に特異的なFab断片は、SEQ ID NO:47の重鎖CDR1、SEQ ID NO:48の重鎖CDR2、SEQ ID NO:49の重鎖CDR3、SEQ ID NO:51の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:52の軽鎖CDR2、およびSEQ ID NO:53の軽鎖CDR3を含む。さらなる態様において、CD33に特異的なFab断片は、SEQ ID NO:50と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の重鎖可変領域配列およびSEQ ID NO:54と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一の軽鎖可変領域配列、または機能を保持しているその変種を含む。
ポリヌクレオチド
さらに、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、完全な二重特異性抗原結合分子をコードする1種類のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、同時発現された複数種の(例えば、2種類以上の)ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。同時発現されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合または他の手段を介して会合して、機能的な二重特異性抗原結合分子を形成してもよい。例えば、Fab断片の軽鎖部分は、Fab断片の重鎖部分、Fcドメインサブユニット、任意で、別のFab断片(の一部)を含む二重特異性抗原結合分子部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現された時に、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合してFab断片を形成する。別の例では、2つのFcドメインサブユニットの一方を含み、任意で、1つまたは複数のFab断片(の一部)を含む二重特異性抗原結合分子部分は、2つのFcドメインサブユニットの他方を含み、任意で、Fab断片(の一部)を含む二重特異性抗原結合分子部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現された時に、Fcドメインサブユニットは会合してFcドメインを形成する。
1つの態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第1のFcドメインサブユニット、第2のFab断片の重鎖、および第1のFab断片の重鎖をコードする。さらに具体的な態様において、単離されたポリヌクレオチドは、VL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CH1領域がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーが免疫グロブリン重鎖(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Fab重鎖(VH-CH1)がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CH1領域が、免疫グロブリンヒンジ領域を含むFcドメインサブユニット(HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CL領域がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーが免疫グロブリン重鎖(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Fab重鎖(VH-CH1)がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVH領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CL領域が、免疫グロブリンヒンジ領域を含むFcドメインサブユニット(HR-CH2-CH3-(CH4))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖((VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))がペプチドリンカーとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、ペプチドリンカーがVH領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。
さらなる態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第2のFcドメインサブユニット、任意で、第3のFab断片の重鎖をコードする。特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは免疫グロブリン重鎖((VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))をコードする。別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Fcドメインサブユニット、任意で、抗体ヒンジ領域を含むFcドメインサブユニット((HR)-CH2-CH3-(CH4))をコードする。
なおさらなる態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、二重特異性抗原結合分子に含まれる1つまたは複数の軽鎖をコードする。特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは免疫グロブリン軽鎖(VL-CL)をコードする。別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、VL領域がCH1領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、CL領域がFab軽鎖(VL-CL)とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。さらに別の特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Fab軽鎖(VL-CL)がVH領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、さらには、VH領域がCL領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。
別の態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO 18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、80、84、99、103、107、および111に示した可変領域配列をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。別の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、および95に示したポリペプチド配列をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。別の態様において、本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO 18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、80、84、99、103、107、または111にあるアミノ酸配列と少なくとも約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一の可変領域配列をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。別の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、または95にあるアミノ酸配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一のポリペプチド配列をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する、SEQ ID NO 18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、80、84、99、103、107、または111の可変領域配列をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を有する、SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、または95のポリペプチド配列をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。他の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、RNA、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形をしたRNAである。本発明のRNAは一本鎖または二本鎖でもよい。
組換え方法
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えば、Merrifield固相合成)または組換え産生によって入手することができる。組換え産生の場合、二重特異性抗原結合分子(断片)をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド、例えば、前記のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために1つまたは複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは従来の手順を用いて容易に単離および配列決定することができる。1つの態様において、本発明のポリヌクレオチドの1つまたは複数を含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA法、合成法、およびインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載の技法を参照されたい。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部でもよく、核酸断片でもよい。発現ベクターには、プロモーターおよび/または他の転写制御エレメントもしくは翻訳制御エレメントと機能的に会合して、二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわち、コード領域)がクローニングされている発現カセットが含まれる。本明細書で使用する「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在するのであればコード領域の一部とみなされることがある。だが、いかなる隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域などはコード領域の一部でない。2種類以上のコード領域が1つのポリヌクレオチド構築物、例えば、1つのベクターに存在してもよく、別々のポリヌクレオチド構築物に、例えば、別々の(異なる)ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターが1つのコード領域を含有してもよく、2種類以上のコード領域を含有してもよい。例えば、本発明のベクターは1種類または複数種のポリペプチドをコードしてもよく、1種類または複数種のポリペプチドは翻訳後または翻訳と同時にタンパク質切断を介して最終タンパク質に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子(断片)またはその変種もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと融合された状態で、または融合されていない状態で異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが含まれるが、それに限定されるわけではない。機能的な結合とは、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くように遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が1つまたは複数の調節配列と結合している時の結合である。プロモーター機能が誘導されることで、望ましい遺伝子産物をコードするmRNAが転写されるのであれば、および2つのDNA断片間の連結の内容が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を誘導する能力を妨げない、またはDNA鋳型が転写される能力を妨げないのであれば、2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと結合しているプロモーター)は「機能的に結合している」。従って、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸を転写することができれば、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に結合している。プロモーターは、予め決められた細胞でのみ大幅なDNA転写を誘導する細胞特異的プロモーターでもよい。細胞特異的転写を誘導するように、プロモーターに加えて他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルをポリヌクレオチドと機能的に結合することができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書において開示される。様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらには、サイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメント(例えば、最初期プロモーターとイントロン-A)、シミアンウイルス40(例えば、初期プロモーター)、ならびにレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルス)などがあるが、それに限定されない、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれるが、それに限定されるわけではない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギα-グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する転写制御領域、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサーならびに誘導性プロモーター(例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン)が含まれる。同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらの翻訳制御エレメントには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント(特に、内部リボソーム挿入部位すなわち「IRES」。CITE配列とも呼ばれる)が含まれるが、これに限定されない。発現カセットはまた、他の特徴、例えば、複製起点、および/または染色体組み込みエレメント、例えば、レトロウイルス末端反復配列(LTR)、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)逆位末端配列(ITR)も含んでよい。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を誘導する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする、さらなるコード領域と結合してもよい。例えば、二重特異性抗原結合分子の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするDNAは本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする核酸の上流に配置されることがある。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質にはシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列があり、粗面小胞体を通る成長タンパク質鎖の輸送が開始したらシグナルペプチド配列または分泌リーダー配列は成熟タンパク質から切断される。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般的に、ポリペプチドのN末端にシグナルペプチドが融合しており、シグナルペプチドは翻訳されたポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」型のポリペプチドとなることを知っている。ある特定の態様において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドもしくは軽鎖シグナルペプチド、または機能的に結合しているポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持している、その配列の機能誘導体が用いられる。または、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能誘導体が用いられてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター(TPA)またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されてもよい。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸配列をSEQ ID NO 74-76に示した。
後の精製を容易にするために使用することができる短いタンパク質配列(例えば、ヒスチジンタグ)または二重特異性抗原結合分子の標識を助けるために使用することができる短いタンパク質配列をコードするDNAが、二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチドの中に、または二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチドの末端に含まれてもよい。
さらなる態様において、本発明の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の態様において、本発明の1つまたは複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。前記ポリヌクレオチドおよびベクターは、それぞれ、ポリヌクレオチドおよびベクターに関して本明細書において説明される任意の特徴を単独で、または組み合わせて組み込んでもよい。1つのこのような態様において、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされている)。本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片を生じるように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。二重特異性抗原結合分子の複製および発現の支援に適した宿主細胞は当技術分野において周知である。このような細胞は、適宜、特定の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入されてもよく、ラージスケールファーメンターに播種して、臨床用途に十分な量の二重特異性抗原結合分子を得るために多量のベクター含有細胞を増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば、大腸菌、または様々な真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞などが含まれる。例えば、特に、グリコシル化が必要とされない場合、ポリペプチドが細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、可溶性画分にある細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。原核生物に加えて糸状菌または酵母などの真核微生物が、ポリペプチドをコードするベクターに適したクローニング宿主または発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドが産生される菌類および酵母株を含む。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)およびLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照されたい。(グリコシル化) ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた多細胞生物(無脊椎動物および脊椎動物)に由来する。無脊椎動物細胞の例には植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と一緒に使用することができる、特に、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞をトランスフェクトするために使用することができる非常に多くのバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号(トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES(商標)技術について説明している)を参照されたい。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7)、ヒト胚腎臓株(例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59(1977)に記載の293細胞または293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)に記載のTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット(buffalo rat)肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍細胞(MMT060562)、TRI細胞(例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)に記載)、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、dhfr- CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;ならびにミエローマ細胞株、例えば、YO、NS0、P3X63、およびSp2/0が含まれる。タンパク質産生に適した、ある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照されたい。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ほんの少し例を挙げると哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、および植物細胞を含むが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または植物培養組織もしくは動物培養組織の中に含まれる細胞も含む。1つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎臓(HEK)細胞、またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NSO、Sp20細胞)である。これらの系において外来遺伝子を発現するための標準的な技術が当技術分野において公知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖または軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が重鎖および軽鎖を両方とも有する抗体になるように抗体鎖の他方も発現するように操作されてもよい。
1つの態様において、本発明による二重特異性抗原結合分子を生成する方法であって、本明細書において提供される二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、および宿主細胞(または宿主細胞培地)から二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。
二重特異性抗原結合分子の成分は遺伝的に互いに融合される。二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接、またはリンカー配列を介して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成および長さは当技術分野において周知の方法に従って決定することができ、効力について試験することができる。二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書において提供される配列において見出される。所望であれば、融合の個々の成分を分離するための切断部位、例えば、エンドペプチダーゼ認識配列を組み込むように、さらなる配列も含まれてよい。
ある特定の態様において、二重特異性抗原結合分子の一部を形成するFab断片は、少なくとも、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を含む。可変領域は、天然または非天然の抗体およびその断片の一部でもよく、天然または非天然の抗体およびその断片の一部に由来してもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するための方法は当技術分野において周知である(例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい)。非天然抗体は固相ペプチド合成を用いて構築されてもよく、組換えにより産生されてもよく(例えば、米国特許第4,186,567号に記載)、例えば、可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって入手されてもよい(例えば、McCaffertyへの米国特許第5,969,108号を参照されたい)。
抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、または可変領域の任意の動物種を本発明の二重特異性抗原結合分子において使用することができる。本発明において有用な非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、または可変領域は、マウス、霊長類、またはヒトに由来してもよい。二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を目的とする場合、抗体の定常領域がヒトに由来するキメラ型の抗体が用いられることがある。ヒト化型または完全ヒト型の抗体も当技術分野において周知の方法(例えば、Winterへの米国特許第5,565,332号を参照されたい)に従って調製することができる。ヒト化は、(a)非ヒト(例えば、ドナー抗体)CDRを、極めて重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性もしくは抗体機能の保持に重要なフレームワーク残基)を保持している、もしくは保持していないヒト(例えば、レシピエント抗体)フレームワークおよび定常領域に接ぎ合わせる工程、(b)非ヒト特異性決定領域(SDRもしくはa-CDR;抗体-抗原相互作用に極めて重要な残基)のみをヒトフレームワークおよび定常領域に接ぎ合わせる工程、または(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の交換によってヒト様部分で「覆い隠す(cloaking)」工程を含むが、これに限定されない様々な方法によって実現することができる。ヒト化抗体およびヒト化抗体を作る方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)において概説され、例えば、Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); 米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (SDR (a-CDR)の接ぎ合わせについて説明している); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (リサーフェシング(resurfacing)について説明している); Dall'Acqua et al, Methods 36, 43-60 (2005) (「FR シャッフリング」について説明している);ならびにOsbourn et al, Methods 36, 61-68 (2005)およびKlimka et al, Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FRシャッフリングする「ガイディッドセレクション(guided selection)」法について説明している)においてさらに説明される。ヒト抗体およびヒト可変領域は当技術分野において公知の様々な技法を用いて産生することができる。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)およびLonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)において大まかに説明されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ方法によって作られたヒトモノクローナル抗体の一部を形成してもよく、ハイブリドーマ方法によって作られたヒトモノクローナル抗体に由来してもよい(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照されたい)。ヒト抗体およびヒト可変領域はまた、抗原曝露に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製されてもよい(例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい)。ヒト抗体およびヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーより選択されるFvクローン可変領域配列を単離することによって作製されてもよい(例えば、Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);およびMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい)。ファージは、典型的に、抗体断片を単鎖Fv(scFv)断片またはFab断片としてディスプレイする。
ある特定の態様において、本発明において有用なFab断片は、例えば、その全内容が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2004/0132066号に開示される方法に従って高い結合親和性を有するように操作されている。本発明の二重特異性抗原結合分子が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫測定法(ELISA)、または当業者がよく知っている他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴法(BIACORE T100システムで分析される)(Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))および従来の結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))を介して測定することができる。ある特定の抗原との結合において参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、または可変ドメインを特定するために競合アッセイが用いられてもよい。ある特定の態様において、このような競合抗体は、参照抗体が結合する同じエピトープ(例えば、直鎖エピトープまたはコンホメーションエピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris (1996)「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供される。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原は、抗原に結合する第1の標識抗体、および抗原との結合において第1の抗体と競合する能力について試験されている第2の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化された抗原は、第1の標識抗体を含むが、第2の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体と抗原との結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な非結合抗体が除去され、固定化された抗原に関連した標識の量が測定される。固定化された抗原に関連した標識の量が対照試料と比べて試験試料においてかなり減少していれば、このことから、第2の抗体は抗原との結合において第1の抗体と競合していることが分かる。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照されたい。
本明細書に記載のように調製された二重特異性抗原結合分子は、当技術分野において公知の技法、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製することができる。特定のタンパク質を精製するのに用いられる実際の条件は、部分的に、実効電荷、疎水性、親水性などの要因に左右され、当業者に明らかであろう。アフィニティクロマトグラフィー精製の場合、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、または抗原を使用することができる。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子のアフィニティクロマトグラフィー精製の場合、プロテインAまたはプロテインGを含むマトリックスが用いられてもよい。本質的に実施例に記載のように、連続したプロテインAアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、二重特異性抗原結合分子を分離することができる。二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意の様々な周知の分析方法によって求めることができる。例えば、実施例に記載のように発現された重鎖融合タンパク質は、還元SDS-PAGEによって証明されたようにインタクトであり、適切に組み立てられていることが示された(例えば、図3を参照されたい)。二重特異性抗原結合分子の軽鎖の予測分子量に対応する約Mr25,000、重鎖の予測分子量に対応するMr50,000、および重鎖/Fab重鎖融合タンパク質の予測分子量に対応するMr75,000の3つのバンドが分離された。
アッセイ
本明細書において提供される二重特異性抗原結合分子の物理的/化学的特性および/または生物学的活性を、当技術分野において公知の様々なアッセイによって特定、スクリーニング、または特徴付けすることができる。
親和性アッセイ
Fc受容体または標的抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性は、実施例に示された方法に従って、BIAcore装置(GE Healthcare)などの標準的な計器を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)によって求めることができる。受容体または標的タンパク質は組換え発現によって入手されてもよい。または、異なる受容体または標的抗原に対する二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体または標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー(FACS)によって評価されてもよい。結合親和性を測定するための実例となる、かつ例示的な具体的な態様が、下記および下記の実施例において説明される。
1つの態様によれば、表面プラズモン共鳴によって、25℃でBIACORE(登録商標)T100装置(GE Healthcare)を用いてKDが測定される。
Fc部分とFc受容体との相互作用を分析するために、CM5チップ上に固定化した抗Penta His抗体(Qiagen)によってHisタグ化組換えFc受容体を捕捉する。二重特異性構築物を分析物として使用する。簡単に述べると、供給業者の説明書に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, GE Healthcare)をN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗Penta-His抗体を10mM酢酸ナトリウム, pH5.0で40μg/mlで希釈した後に、約6500応答単位(response unit)(RU)の結合タンパク質となるように5μl/minの流速で注入する。リガンドを注入した後に、反応しなかった基をブロックするために、1Mエタノールアミンを注入する。その後に、Fc受容体を4nMまたは10nMで60秒間、捕捉する。反応速度測定のために、HBS-EP(GE Healthcare、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％Surfactant P20、 pH7.4)に溶解した二重特異性構築物の4倍段階希釈液(500nM〜4000nMの範囲)を30μl/minの流速、25℃で120秒間、注入する。
標的抗原に対する親和性を求めるために、抗Penta-His抗体について述べたように活性化CM5-センサーチップ表面に固定化した抗ヒトFab特異的抗体(GE Healthcare)によって二重特異性構築物を捕捉する。結合タンパク質の最終量は約12000RUである。二重特異性構築物を300nMで90秒間、捕捉する。標的抗原をフローセルに250〜1000nMの濃度範囲、30μl/minの流速で180秒間、通す。解離を180秒モニタリングする。
参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって体積屈折率(bulk refractive index)差を補正する。ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングによって解離定数KDを得るために定常状態での応答を使用した。会合速度(kon)および解離速度(koff)は、単純1：1ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE(登録商標)T100 Evaluation Softwareバージョン1.1.1)を用いて会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算される。平衡解離定数(KD)は比koff/konとして計算される。例えば、 Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照されたい。
活性アッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子の生物学的活性は、実施例に記載のアッセイを含む、当技術分野において公知の様々なアッセイによって測定することができる。生物学的活性には、例えば、T細胞増殖の誘導、T細胞におけるシグナル伝達の誘導、T細胞における活性化マーカー発現の誘導、T細胞によるサイトカイン分泌の誘導、標的細胞、例えば、腫瘍細胞または腫瘍間質細胞におけるシグナル伝達の阻害、標的細胞増殖の阻害、標的細胞溶解の誘導、ならびに腫瘍後退の誘導および/または生存の改善が含まれ得る。
組成物、製剤、および投与経路
さらなる局面において、本発明は、例えば、以下の任意の治療方法において使用するための、本明細書において提供される任意の二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物を提供する。1つの態様において、薬学的組成物は、本明細書において提供される任意の二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書において提供される任意の二重特異性抗原結合分子および少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、下記の治療剤を含む。
さらに、本発明の二重特異性抗原結合分子をインビボ投与に適した形で生成する方法であって、(a)本発明による二重特異性抗原結合分子を入手する工程、および(b)少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と共に二重特異性抗原結合分子を処方する工程であって、二重特異性抗原結合分子の調製物がインビボ投与のために処方される工程を含む方法が提供される。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された治療的有効量の1種類または複数種の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、適宜、動物、例えば、ヒトに投与された時に、使用された投与量および濃度でレシピエントに概して無毒の、すなわち、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を生じない分子的実体および組成物を指す。少なくとも1種類の二重特異性抗原結合分子を含有し、任意で、さらなる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、参照として本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990により例示されるように、本開示を考慮すれば当業者に公知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与の場合、調製物は、FDA生物基準局(Office of Biological Standards)または他の国の対応機関の基準により求められるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たさなければならない。好ましい組成物は凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、任意のおよび全ての溶媒、緩衝液、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、色素、当業者に公知のこのような同様の材料およびその組み合わせを含む(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい)。従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、治療薬または薬学的組成物に用いられることが意図される。
組成物は、固体、液体、またはエアロゾルの形で投与されるかどうかに応じて、および注射剤として、このような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて異なるタイプの担体を含んでもよい。本発明の二重特異性抗原結合分子(および任意のさらなる治療剤)は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎臓内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、経口的に、局部に、局所に、吸入(例えば、エアロゾル吸入)、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流によって、カテーテルを介して、洗浄によって、クリームに入れて、脂質組成物(例えば、リポソーム)に入れて、または当業者に公知の他の方法もしくは前述の任意の組み合わせ(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照されたい)によって投与することができる。本発明の二重特異性抗原結合分子などのポリペプチド分子を投与するために非経口投与、特に、静脈内注射が最も一般的に用いられる。
非経口組成物には、注射、例えば、皮下注射、皮内注射、病巣内注射、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、くも膜下腔内注射、または腹腔内注射による投与のために設計された非経口組成物が含まれる。注射の場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液、例えば、ハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝液に溶解して処方されてもよい。溶液は、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤などの処方用の薬剤(formulatory agent)を含有してもよい。または、二重特異性抗原結合分子は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成するために粉末の形をとってもよい。滅菌注射液は、必要とされる量の本発明の二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙された他の成分のいくつかを含む適切な溶媒の中に組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜で濾過することによって容易に達成することができる。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本分散媒および/または他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌した注射液、懸濁液、またはエマルジョンを調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌したその液体媒体から活性成分+任意のさらなる望ましい成分の散剤を生じさせる真空乾燥法および凍結乾燥法である。液体媒体は必要に応じて安定して緩衝されていなければならない。最初に、液体希釈剤が十分な食塩水またはグルコースで注射前に等張にされる。組成物は製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。エンドトキシン汚染は、安定なレベル、例えば、0.5ng/mgタンパク質未満に最小限に保たれなければならないことが理解されるだろう。適切な薬学的に許容される担体は、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);ならびに/または非イオン界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これに限定されない。注射用水性懸濁液は、懸濁液の粘度を高める化合物、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなどを含有してもよい。任意で、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にする、化合物の溶解度を高める適切な安定剤または薬剤も含有してよい。さらに、適切な注射用油性懸濁液として活性化合物の懸濁液が調製されてもよい。適切な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えば、ゴマ油、あるいは合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル(ethyl cleats)もしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。
活性成分は、調製されたマイクロカプセル、例えば、コアセルベーション法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルジョンに封入されてもよい。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示される。持効性調製物が調製されてもよい。持効性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。このマトリックスは、成型品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形をとる。特定の態様では、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはその組み合わせの組成物中に使用することによって注射用組成物の長期吸収を生じることができる。
前記の組成物に加えて、二重特異性抗原結合分子はまたデポー調製物として処方されてもよい。このような長時間作用型製剤は、移植によって(例えば、皮下もしくは筋肉内に)投与されてもよく、筋肉内注射によって投与されてもよい。従って、例えば、二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば、許容される油に溶解したエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂として処方されてもよく、やや溶けにくい誘導体、例えば、やや溶けにくい塩として処方されてもよい。
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、または凍結プロセスによって製造されてもよい。薬学的組成物は、1種類または複数種の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはタンパク質を、薬学的に使用することができる調製物に処理するのを容易にする補助剤を用いて従来のやり方で処方されてもよい。適切な製剤は、選択された投与経路によって決まる。
二重特異性抗原結合分子は、遊離酸または遊離塩基、中性または塩の形で組成物に処方されてもよい。薬学的に許容される塩は、遊離酸または遊離塩基の生物学的活性を実質的に保持している塩である。これらには、酸添加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成された酸添加塩、あるいは無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸のような有機酸と形成された酸添加塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成された塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄;またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインのような有機塩基からも得ることができる。薬学的塩は、水性溶媒および他のプロトン性溶媒中では、対応する遊離塩基型より溶解度が高くなる傾向がある。
治療方法および組成物
本明細書において提供される任意の二重特異性抗原結合分子を治療方法において使用することができる。本発明の二重特異性抗原結合分子を、例えば、癌治療において使用することができる。
治療方法において使用する場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、優れた医療行為と一致するやり方で処方、投薬、および投与される。この文脈で考慮すべき要因には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、患者1人1人の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、および医師に公知の他の要因が含まれる。
1つの局面において、医薬として使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる局面において、疾患の治療において使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。ある特定の態様において、治療方法において使用するための本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。1つの態様において、本発明は、疾患の治療を必要とする個体において疾患の治療において使用するための本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の態様において、本発明は、治療的有効量の二重特異性抗原結合分子を個体に投与する工程を含む、疾患を有する個体を治療する方法において使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の態様において、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様において、疾患は癌である。ある特定の態様において、前記方法は、治療される疾患が癌であれば、治療的有効量の少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、抗癌剤を個体に投与する工程をさらに含む。前記態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。1つの態様において、医薬は、疾患の治療を必要とする個体において疾患を治療するためのものである。さらなる態様において、医薬は、疾患を有する個体に治療的有効量の医薬を投与する工程を含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。ある特定の態様において、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様において、疾患は癌である。1つの態様において、前記方法は、治療的有効量の少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、治療される疾患が癌であれば抗癌剤を個体に投与する工程をさらに含む。前記態様のいずれかによる「個体」は哺乳動物、好ましくは、ヒトでもよい。
さらなる局面において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。1つの態様において、前記方法は、このような疾患を有する個体に治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子を投与する工程を含む。1つの態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形で含む組成物が前記個体に投与される。ある特定の態様において、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様において、疾患は癌である。ある特定の態様において、前記方法は、治療的有効量の少なくとも1種類のさらなる治療剤、例えば、治療される疾患が癌であれば抗癌剤を個体に投与する工程をさらに含む。前記態様のいずれかによる「個体」は哺乳動物、好ましくは、ヒトでもよい。
ある特定の態様において、治療される疾患は、増殖性障害、特に癌である。癌の非限定的な例には、膀胱癌、脳癌、頭頚部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、および腎臓癌が含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖障害には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭頚部、神経系(中枢および末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部領域、ならびに泌尿生殖器系に位置している新生物が含まれるが、これに限定されない。前癌状態または病変部および癌転移も含まれる。ある特定の態様において、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳癌、および頭頚部癌からなる群より選択される。当業者であれば、多くの場合、二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさない場合があり、部分的利益しかもたらさない場合があることを容易に認める。一部の態様において、いくらかの利益のある生理学的変化が治療上有益であるとみなされる。従って、一部の態様において、生理学的変化をもたらす二重特異性抗原結合分子の量は「有効量」または「治療的有効量」とみなされる。治療を必要とする対象、患者、または個体は典型的に哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
一部の態様において、有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の態様において、疾患を治療するために、治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子が個体に投与される。
疾患を予防または治療する場合、(単独でまたは1種類もしくは複数種の他のさらなる治療剤と組み合わせて用いられる場合)本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は、治療しようとする疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、二重特異性抗原結合分子のタイプ、疾患の重篤度および経過、二重特異性抗原結合分子が予防目的または治療目的に投与されるかどうか、以前の治療介入または同時の治療介入、患者の病歴、ならびに二重特異性抗原結合分子に対する応答、ならびに主治医の裁量に左右される。投与を担当する医師は、どのような場合でも、組成物に含まれる活性成分の濃度および対象1人1人に合った適切な用量を決定するだろう。1回の投与または様々な時点にわたる複数回の投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これに限定されない様々な投与計画が本明細書において意図される。
二重特異性抗原結合分子は、一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重篤度に応じて、例えば、1回もしくは複数回の別々の投与でも、または連続注入でも、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば、0.1mg/kg〜10mg/kg)の二重特異性抗原結合分子が、患者に投与するための初回候補投与量になり得る。前述の要因に応じて、代表的な一日量は約1μg/kg〜100mg/kg以上になるかもしれない。数日間またはそれより長い反復投与のために、状態に応じて、一般的に、疾患の症状の望ましい抑制が生じるまで治療は維持される。二重特異性抗原結合分子の例示的な投与量の1つは約0.005mg/kg〜約10mg/kgの範囲になるだろう。他の非限定的な例において、用量は、1回の投与につき約1マイクログラム/kg体重、約5マイクログラム/kg体重、約10マイクログラム/kg体重、約50マイクログラム/kg体重、約100マイクログラム/kg体重、約200マイクログラム/kg体重、約350マイクログラム/kg体重、約500マイクログラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約200ミリグラム/kg体重、約350ミリグラム/kg体重、約500ミリグラム/kg体重〜約1000mg/kg体重以上、およびこれらから導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書において列挙された数字から導き出せる範囲の非限定的な例では、前記の数字に基づいて、約5mg/kg体重〜約100mg/kg体重、約5マイクログラム/kg体重〜約500ミリグラム/kg体重などの範囲を投与することができる。従って、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg、または10mg/kg(またはその任意の組み合わせ)の1つまたは複数の用量が患者に投与されてもよい。このような用量は、(例えば、約2〜約20用量、または、例えば、約6用量の二重特異性抗原結合分子が患者に与えられるように)断続的に、例えば、毎週または3週間ごとに投与されてもよい。高い初回負荷量の後に1つまたは複数の低い用量が投与されることがある。しかしながら、他の投与計画が有用な場合がある。この療法の進行は従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、一般的に、所期の目的を達成するのに有効な量で用いられる。疾患状態を治療または予防するための使用の場合、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその薬学的組成物は治療的有効量で投与または適用される。治療的有効量の決定は、特に、本明細書中で提供される詳細な開示を考慮すれば当業者の能力の十分に範囲内にある。
全身投与の場合、最初に、治療に有効な用量をインビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから見積もることができる。次いで、動物モデルにおいて、細胞培養において求められたIC50を含む循環濃度範囲に達するように用量を処方することができる。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に求めることができる。
当技術分野において周知の技法を用いてインビボデータ、例えば、動物モデルからも初回投与量を見積もることができる。当業者であれば、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができるだろう。
治療効果を維持するのに十分な二重特異性抗原結合分子の血漿中濃度をもたらすように、投与量および間隔を個々に調節することができる。注射による投与のための通常の患者投与量は、約0.1〜50mg/kg/day、典型的には、約0.5〜1mg/kg/dayである。治療に有効な血漿中濃度は、毎日、複数の用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中濃度は、例えば、HPLCによって測定されてもよい。
局所投与または選択的取り込みの場合、二重特異性抗原結合分子の有効局所濃度は血漿中濃度と関連しない場合がある。当業者であれば、過度の実験なく、治療に有効な局所投与量を最適化することができるだろう。
本明細書に記載の治療に有効な用量の二重特異性抗原結合分子は、一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療利益を提供する。二重特異性抗原結合分子の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって求めることができる。細胞培養アッセイおよび動物試験を用いて、LD50 (集団の50％を死に致らしめる用量)およびED50 (集団の50％において治療に有効な用量)を求めることができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、比LD50/ED50で表すことができる。高い治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。1つの態様において、本発明による二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用に適した範囲の投与量の処方において使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くなく、ED50を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、様々な要因、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変動してもよい。患者の状態を考慮すれば、医師1人1人が正確な製剤、投与経路、および投与量を選択することができる(例えば、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1を参照されたい)。
本発明の二重特異性抗原結合分子による治療を受けている患者の主治医であれば、毒性、臓器機能不全などにより、投与を止める方法、中断する方法、もしくは調節する方法、または投与を止める時、中断する時、もしくは調節する時を知っているだろう。逆に、主治医であれば、臨床応答が十分でなければ治療を高い水準まで調節することも知っているだろう(毒性を除外する)。関心対象の障害の管理における投与される用量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与経路などによって異なる。状態の重篤度は、例えば、部分的に、標準的な予後評価方法によって評価されることがある。さらに、用量、もしかすると投与頻度も、患者1人1人の年齢、体重、および応答によって異なる。
他の薬剤および治療
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法において1種類または複数種の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の二重特異性抗原結合分子は少なくとも1種類のさらなる治療剤と同時投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体において症状または疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このようなさらなる治療剤は、治療されている特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性成分を含んでもよい。ある特定の態様において、さらなる治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞傷害薬剤、細胞アポトーシスアクチベーター、またはアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の態様において、さらなる治療剤は、抗癌剤、例えば、微小管分裂剤(microtubule disruptor)、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスアクチベーター、または血管新生阻害剤である。このような他の薬剤は、所期の目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される二重特異性抗原結合分子の量、障害または治療のタイプ、および前記で議論された他の要因によって決まる。二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載のものと同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載の投与量の約1〜99％、または経験的に/臨床的に適切であると確かめられた任意の投与量および任意の経路で用いられる。
前記のこのような併用療法は、併用投与(2種類以上の治療剤が同じ組成物または別々の組成物に含まれる場合)および別々の投与を包含する。別々の投与の場合、本発明の二重特異性抗原結合分子の投与は、さらなる治療剤および/もしくはアジュバントの投与の前に、さらなる治療剤および/もしくはアジュバントの投与と同時に、ならびに/またはさらなる治療剤および/もしくはアジュバントの投与の後に行うことができる。本発明の二重特異性抗原結合分子は放射線療法と併用することもできる。
製造物品
本発明の別の局面において、前記の障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器および容器に貼られている、または容器に関連するラベルまたは添付文書を備える。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器、IV溶液バック(IV solution bag)などが含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、単独の組成物、または状態の治療、予防、および/もしくは診断に有効な別の組成物と組み合わされる組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バックまたは皮下注射針で穴を開けることができるストッパーを有するバイアルでもよい)。組成物中の少なくとも1種類の活性薬剤は本発明の二重特異性抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、えり抜きの状態を治療するのに用いられることを示す。さらに、製造物品は、(a)本発明の二重特異性抗原結合分子を含む組成物が中に入れられている第1の容器;および(b)さらなる細胞傷害剤または他の治療剤を含む組成物が中に入れられている第2の容器を備えてもよい。本発明のこの態様における製造物品は、ある特定の状態を治療するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに備えてもよい。または、もしくはさらに、製造物品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、無菌注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、およびデキストロース液を含む第2の(または第3の)容器をさらに備えてもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
以下は本発明の方法および組成物の例である。前記で概要が示されていれば、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
一般的方法
組換えDNA法
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のように、DNAを操作するために標準的な方法を使用した。分子生物学用試薬を製造業者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242に示されている。
DNA配列決定
DNA配列を二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
必要に応じて、望ましい遺伝子セグメントが適切なテンプレートを用いてPCRによって作製されたか、またはGeneart AG(Regensburg, Germany)によって自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から合成された。正確な遺伝子配列を入手できなかった場合、オリゴヌクレオチドプライマーを、最も近いホモログからの配列に基づいて設計した。遺伝子を、適切な組織に由来するRNAからRT-PCRによって単離した。独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する遺伝子セグメントを標準的なクローニング/配列決定ベクターにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、濃度をUV分光法によって求めた。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位が備わった設計にした。全ての構築物を、真核細胞においてタンパク質を分泌するように向けるリーダーペプチドをコードする5'末端DNA配列が備わった設計にした。SEQ ID NO 74-76は例示的なリーダーペプチドを示す。
PBMCからの初代ヒトpanT細胞の単離
地元の血液バンクから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)または健常ヒトドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)をHistopaque密度遠心分離によって調製した。簡単に述べると、血液を滅菌PBSで希釈し、注意深くHistopaque 勾配(Sigma, H8889)の上に層状に積み重ねた。450xgで室温で30分間、遠心分離した後に(ブレーキのスイッチをオフにした)、中間期(interphase)を含有するPBMCの上にある血漿の一部を捨てた。PBMCを新たな50ml Falconチューブに移し、チューブをPBSで総体積50mlまで満たした。混合物を400xg、室温で10分間、遠心分離した(ブレーキのスイッチをオンにした)。上清を捨て、PBMCペレットを滅菌PBSで2回洗浄した(350xg、4℃で10分間の遠心分離工程)。結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、10％FCSおよび1％L-アラニル-L-グルタミン(Biochrom, K0302)を含有するRPMI1640培地に溶解し、アッセイ開始までインキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した。
PBMCからのT細胞濃縮は、Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec #130-091-156)を用いて製造業者の説明書に従って行った。簡単に述べると、細胞ペレットを、1x107細胞あたり40μlの冷緩衝液 (0.5％BSA、2mM EDTAを含むPBS。濾過滅菌済)で希釈し、1x107細胞あたり10μlのビオチン-抗体カクテルと4℃で10分間インキュベートした。1x107細胞あたり30μlの冷緩衝液および20μlの抗ビオチン磁気ビーズを添加し、混合物をさらに15分間、4℃でインキュベートした。現体積の10〜20xを添加することによって細胞を洗浄し、その後に、300xgで10分間、遠心分離工程を行った。1x108個までの細胞を500μlの緩衝液に再懸濁した。非標識ヒトpanT細胞の磁気分離を、LSカラム(Miltenyi Biotec #130-042-401)を用いて製造業者の説明書に従って行った。結果として生じたT細胞集団を自動計数し(ViCell)、AIM-V培地に溶解し、アッセイ開始までインキュベーターに入れて37℃、5％CO2で保管した(24時間未満)。
PBMCからの初代ヒトナイーブT細胞の単離
地元の血液バンクから入手した濃縮リンパ球調製物(バフィーコート)または健常ヒトドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)をHistopaque密度遠心分離によって調製した。PBMCからのT細胞濃縮は、Miltenyi BiotecのNaive CD8+ T cell isolation Kit(#130-093-244)を用いて製造業者の説明書に従って行ったが、CD8+T細胞の最後の単離工程を省いた(初代ヒトpanT細胞の単離についての説明も参照されたい)。
ヘパリン添加血液からの初代カニクイザルPBMCの単離
以下の通りに、健常なカニクイザルドナーに由来する新鮮な血液から末梢血単核球(PBMC)を密度遠心分離によって調製した。ヘパリン添加血液を滅菌PBSで1:3に希釈し、Lymphoprep培地(Axon Lab #1114545)を滅菌PBSで90％まで希釈した。2体積の希釈血液を1体積の希釈密度勾配の上に層状に積み重ねた。ブレーキなしで、PBMC画分を520xg、室温で30分間、遠心分離によって分離した。PBMCバンドを新しい50ml Falconチューブに移し、遠心分離によって滅菌PBSで400xg、4℃で10分間、洗浄した。血小板を除去するために低速遠心分離(150xg、4℃で15分間)を1回、行い、結果として生じたPBMC集団を自動計数し(ViCell)、さらなるアッセイのために、すぐに使用した。
標的細胞
MCSPを標的とする二重特異性抗原結合分子を評価するために、以下の腫瘍細胞株:悪性黒色腫の転移部位に由来し、高レベルのヒトMCSPを発現するヒト黒色腫細胞株WM266-4(ATCC#CRL-1676);および中程度のレベルのヒトMCSPを発現するヒト黒色腫細胞株MV-3(The Radboud University Nijmegen Medical Centreからの寄贈品)を使用した。
CEAを標的とする二重特異性抗原結合分子を評価するために、以下の腫瘍細胞株:非常に高いレベルのヒトCEAを発現するヒト胃癌細胞株MKN45(DSMZ#ACC409);中程度から低いレベルのヒトCEAを発現する、ヒト白人女性結腸腺癌細胞株LS-174T(ECACC#87060401);(非常に)低いレベルのヒトCEAを発現するヒト類上皮膵臓癌(epithelioid pancreatic carcinoma)細胞株Panc-1(ATCC#CRL-1469);およびヒトCEAを安定発現するように社内で操作されたマウス結腸癌細胞株MC38-huCEAを使用した。
さらに、ヒトT細胞白血病細胞株であるJurkat(ATCC#TIB-152)を用いて、異なる二重特異性構築物と細胞上にあるヒトCD3との結合を評価した。
実施例1
二重特異性抗原結合分子の調製、精製、および特徴付け
重鎖可変領域および軽鎖可変領域のDNA配列を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。MPSVプロモーターによって抗体を発現させた。合成ポリAシグナル配列はCDSの3'末端に位置する。さらに、それぞれのベクターはEBV OriP配列を含有した。
HEK293 EBNA細胞を哺乳動物発現ベクターでコトランスフェクトすることによって前記分子を産生した。指数関数的に増殖しているHEK293 EBNA細胞を、リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトした。または、懸濁液中で増殖しているHEK293 EBNA細胞を、ポリエチレンイミン(PEI)を用いてトランスフェクトした。「1+1 IgG Crossfab」構築物の調製のために、細胞を、1:1:1:1比(「ベクター第2の重鎖」:「ベクター第1の軽鎖」:「ベクター軽鎖Crossfab」:「ベクター第1の重鎖-重鎖Crossfab」)の対応する発現ベクターでトランスフェクトした。「2+1 IgG Crossfab」構築物の調製のために、細胞を、1:2:1:1比(「ベクター第2の重鎖」:「ベクター軽鎖」:「ベクター第1の重鎖-重鎖Crossfab」:「ベクター軽鎖Crossfab」の対応する発現ベクターでトランスフェクトした。「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」構築物の調製のために、細胞を、1:1:1:1比(「ベクター重鎖」:「ベクター軽鎖」:「ベクター重鎖(CrossFab-Fab-Fc)」:「ベクター連結軽鎖」)の対応する発現ベクターでトランスフェクトした。「1+1 CrossMab」構築物の調製のために、細胞を、1:1:1:1比(「ベクター第1の重鎖」:「ベクター第2の重鎖」:「ベクター第1の軽鎖」:「ベクター第2の軽鎖」)の対応する発現ベクターでトランスフェクトした。
リン酸カルシウムを用いたトランスフェクションの場合、細胞を、Tフラスコ中で、10％(v/v)FCSを添加したDMEM培地を用いて付着単層培養として増殖させ、50〜80％コンフルエントになった時にトランスフェクトした。T150フラスコのトランスフェクションのために、トランスフェクションの24時間前に、(10％v/v最終濃度の)FCSを添加したDMEM培地25mlに1.5x107個の細胞を播種し、細胞を5％CO2雰囲気のインキュベーターに37℃で一晩、入れた。それぞれのT150フラスコのトランスフェクションのために、対応する比で割られた94μgの総プラスミドベクターDNA、最終体積469μlまでの水、および469μlの1M CaCl2溶液を混合することによって、DNA、CaCl2、および水からなる溶液を調製した。この溶液に、938μlの50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液、pH7.05を添加し、すぐに10秒間、混合し、室温で20秒間、静置したままにした。懸濁液を、2％(v/v)FCSを添加したDMEM 10mlで希釈し、既存の培地の代わりにT150に添加した。その後に、さらなる13mlのトランスフェクション培地を添加した。細胞を37℃、5％CO2で約17〜20時間インキュベートし、次いで、培地を25ml DMEM、10％FCSと交換した。培地交換して約7日後に210xgで15分間、遠心分離することによって条件培地を回収し、濾過滅菌(0.22・mフィルター)し、最終濃度0.01％(w/v)までアジ化ナトリウムを添加し、4℃に保った。
ポリエチレンイミン(PEI)を用いたトランスフェクションの場合、HEK293 EBNA細胞を無血清CD CHO培地中で懸濁培養した。500ml振盪フラスコ中で産生するために、トランスフェクションの24時間前に、4x108個のHEK293 EBNA細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を210xgで5分間、遠心分離し、上清を、20mlの予め温めたCD CHO培地と交換した。発現ベクターを200μg のDNAの最終量まで20mlのCD CHO培地中で混合した。540μlのPEIを添加した後に、混合物を15秒間ボルテックスし、その後に、室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振盪フラスコに移し、5％CO2雰囲気のインキュベーターに入れて37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、160mlのF17培地を添加し、細胞を24時間、培養した。トランスフェクションの1日後に、1mMバルプロ酸および7％Feed1(Lonza)を添加した。7日間、培養した後、精製のために210xgで15分間、遠心分離することによって上清を収集した。溶液を濾過滅菌(0.22μmフィルター)し、最終濃度0.01％w/vまでアジ化ナトリウムを添加し、4℃に保った。プロテインAアフィニティクロマトグラフィーの後にサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことによって細胞培養上清から分泌タンパク質を精製した。
アフィニティクロマトグラフィーのために、上清を、25mlの20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、pH7.5、または40mlの20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5で平衡にしたHiTrap ProteinA HPカラム(CV=5ml、GE Healthcare)にロードした。少なくとも10カラム体積の20mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウムpH7.5で洗浄し、その後に6カラム体積の10mMリン酸ナトリウム、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウムpH5.45を用いた、さらなる洗浄工程を行うことによって非結合タンパク質を除去した。その後に、カラムを20mlの10mM MES、100mM塩化ナトリウム、pH5.0で洗浄し、標的タンパク質を6カラム体積の20mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、100mMグリシン、pH3.0で溶出させた。または、標的タンパク質を、20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH7.5から20mMクエン酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、pH2.5への20カラム体積にわたる勾配を用いて溶出させた。1/10の0.5Mリン酸ナトリウム、pH8を添加することによってタンパク質溶液を中和した。標的タンパク質を濃縮および濾過した後に、pH6.7の25mMリン酸カリウム、125mM塩化ナトリウム、100mMグリシン溶液で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム(GE Healthcare)にロードした。1+1 IgG Crossfabを精製するために、カラムをpH6.0の20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム溶液で平衡化した。
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光率を用いて280nmでの光学密度(OD)を特定することによって求めた。二重特異性構築物の純度および分子量は、NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen, USA)を用いて製造業者の説明書に従って(4〜12％Tris-酢酸ゲルまたは4〜12％Bis-Tris)、還元剤(5mM 1,4-ジチオスレイトール(dithiotreitol))の存在下および非存在下でのSDS-PAGE、ならびにクーマシー(SimpleBlue(商標) SafeStain, Invitrogen)による染色によって分析した。または、分子の純度および分子量は、Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper Lifescience)を用いて製造業者の説明書に従って還元剤の存在下および非存在下でのCE-SDS分析によって分析した。
タンパク質試料の凝集物含有率は、2mM MOPS、150mM NaCl、0.02％(w/v)NaN3、pH7.3のランニングバッファーに溶解してSuperdex 200 10/300GL分析用サイズ排除クロマトグラフィーカラム(GE Healthcare)を用いて25℃で分析した。または、抗体試料の凝集物含有率は、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩(monohydrocloride)、0.02％(w/v)NaN3、pH6.7ランニングバッファーに溶解してTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム(Tosoh)を用いて25℃で分析した。
「2+1 IgG Crossfab(C末端)」構築物(SEQ ID NO 11、12、13および14を参照されたい)は、イントロン配列を含むゲノム遺伝子構成、CMVプロモーター、およびウシ成長ホルモン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナルを有するプラスミドベクターを用いて調製した。必要とされるプラスミドを、異なるプラスミド比を用いてリポフェクションを介して同時にトランスフェクトすることによって、二重特異性構築物をHEK293F細胞において一過的に発現させた。細胞をF17培地中で増殖させた。トランスフェクションの5〜7日後に上清を収集した。回収された細胞培養上清を、精製の前に0.2μm孔径の膜(Millipore)で濾過滅菌した。精製のために、二重特異性分子をMabSelectSure樹脂(GE Healthcare)上で捕捉し、1xPBSで洗浄し、20mMクエン酸ナトリウム、pH3.0を用いて溶出させた。この分子を、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex(商標)200 GL(Amersham Bioscience)カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。二重特異性分子の特徴付け(抗体完全性の評価)は、マイクロ流体LabChip技術(Caliper)を用いたキャピラリー電気泳動(CE-SDS)分析を用いて行った。CE-SDS分析のために、HT Protein Express Reagent Kitを用いて製造業者の説明書に従って5μlのタンパク質溶液を調製し、HT Protein Express Chipを用いたLabChip GXIIシステムによって分析した。
図2〜5は、SDS-PAGEおよび分析用サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示し、表2は、異なる二重特異性構築物の調製物の収率、プロテインA後の凝集物含有率、および最終単量体含有率を示す。重要なことに、本発明の二重特異性IgG Crossfab構築物は、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー後に、CrossFab断片の代わりに単鎖Fab断片を含む対応する二重特異性構築物と比較して1/10〜1/20の凝集物含有率を示した(データ示さず)。
図13は、抗CD3/抗MCSP二重特異性「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」構築物(SEQ ID NO 1、4、5および85を参照されたい)のCE-SDS分析の結果を示す。分析には2μg試料を使用した。図14は、最終産物(20μgの試料を注入した)の分析用サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
図20は、1+1 IgG Crossfab(N末端);VL/VH交換(LC007/V9)、1+1 CrossMab; CL/CH1交換(LC007/V9)、2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆; CL/CH1交換(LC007/V9)、 2+1 IgG Crossfab(N末端); VL/VH交換(M4-3 ML2/V9)、2+1 IgG Crossfab(N末端); CL/CH1交換(M4-3 ML2/V9)、および2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆;CL/CH1交換(CH1A1A/V9)のCE-SDS分析の結果を示す。表2は、異なる二重特異性構築物の調製物の収率、プロテインA後の凝集物含有率、および最終単量体含有率を示す。
（表２）収率、プロテインA後の凝集物含有率、ならびに最終単量体含有率
Figure 0005925893
実施例2
二重特異性構築物と両標的抗原との同時結合
「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物(SEQ ID NO 1、3、4、5)とヒトMCSPおよびヒトCD3εとの同時結合を表面プラズモン共鳴によって分析した(図6)。表面プラズモン共鳴(SPR)実験は全て、BiacoreT100において25℃で、ランニングバッファーとしてHBS-EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％Surfactant P20、 Biacore, Freiburg/Germany)を用いて行った。
標準的なカップリング手順を用いて1650共鳴ユニット(RU)のビオチン化MCSP D3ドメインをセンサーチップSAに直接カップリングすることによって、二重特異性構築物と腫瘍抗原およびヒトCD3εの同時結合の分析を行った。アッセイの設定を図6Aに示した。
「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物を200nMで60秒間、捕捉した。その後に、ヒトCD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(ノブ)-Avi/Fc(ホール)を2000nMの濃度および40μl/minの流速で60秒間、通した。固定化されたMCSP D3ドメインがあるが、捕捉された二重特異性構築物がない表面に組換えCD3εを流した参照フローセルにおいて得られた応答を差し引くことによって体積屈折率差を補正した。
図6Bに示したように、構築物は腫瘍抗原およびCD3と同時に結合することができた。ヒトCD3ε注入後の結合レベル(RU)は、構築物のみの注射後に得られた結合レベルより高かった。このことは、腫瘍抗原およびヒトCD3εが両方とも二重特異性構築物に結合することを反映している。
実施例3
標的細胞の存在下および非存在下での二重特異性構築物によるT細胞活性化
サイトカイン放出
ヒトMCSPおよびヒトCD3を両方とも標的とする精製「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物(SEQ ID NO 1、3、4、5)および「(scFv) 2」分子を、腫瘍標的細胞の存在下または非存在下でT細胞性新規サイトカイン分泌を誘導する能力について分析した。
簡単に述べると、ディープウェル96ウェルプレート1ウェルにつき、健常なドナーに由来する全血280μlをプレーティングした。ヒトMCSPを発現する30000個のColo-38腫瘍標的細胞ならびに2種類の二重特異性構築物およびIgG対照を1nM最終濃度で添加した。細胞を5％CO2、37℃で24時間インキュベートし、次いで、350xgで5分間、遠心分離した。後で分析するために、上清を新たなディープウェル96ウェルプレートに移した。CBA分析を、FACS Canto IIの製造業者の説明書に従って以下のCBA Flex Sets:ヒトグランザイムB(BD#560304)、ヒトIFN-γ Flex Set(BD#558269)、ヒトTNF Flex Set(BD#558273)、ヒトIL-10 Flex Set(BD#558274)、ヒトIL-6 Flex Set(BD#558276)、ヒトIL-4 Flex Set(BD#558272)、ヒトIL-2 Flex Set(BD#558270)の組み合わせを用いて行った。
図7は、上清中に測定された異なるサイトカインのレベルを示す。Colo-38腫瘍細胞の存在下で分泌された主要なサイトカインはIL-6であり、IFN-γがこれに続いた。さらに、標的細胞の存在下でT細胞が活性化された時にグランザイムBのレベルも強力に増加した。一般的に、両二重特異性構築物とも標的細胞の存在下で高レベルのサイトカイン分泌を誘導したが(図7、AおよびB)、標的細胞の非存在下では誘導しなかった図7、CおよびD)。標的細胞の存在下(または非存在下)でT細胞が活性化された時にTh2サイトカイン(IL-10およびIL-4)は有意に分泌されなかった。
表面活性化マーカーの発現
別の実験では、カニクイザルCD3およびヒトMCSPを標的とする精製「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 4、5、6、7)を、腫瘍標的細胞の存在下で、CD8+T細胞上にある表面活性化マーカーCD25をアップレギュレートする能力について分析した。簡単に述べると、ヒトMCSP発現MV-3腫瘍標的細胞をCell Dissociation Bufferを用いて回収し、洗浄し、2％FCSおよび1％GlutaMaxを含有するDMEMに再懸濁した。30000個の細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートにプレーティングし、それぞれの抗体希釈液を示された濃度で添加した(図8)。二重特異性構築物および異なるIgG対照を同じモル濃度になるように調節した。3:1の最終E:T比となるように2匹の健常な動物の血液から単離されたカニクイザルPBMCエフェクター細胞を添加した。5％CO2、37℃で43時間のインキュベーション後、細胞を350xgで5分間、遠心分離し、0.1％BSAを含有するPBSで2回、洗浄した。CD8(Miltenyi Biotech#130-080-601)およびCD25(BD#557138)の表面染色を供給業者の提案に従って行った。細胞を150μl/ウェルの0.1％BSA含有PBSで2回、洗浄し、100μl/ウェルの固定緩衝液(BD#554655)を用いて4℃で15分間、固定した。遠心分離後、試料を200μl/ウェルの0.1％BSA含有PBSで再懸濁し、FACS CantoII装置(Software FACS Diva)を用いて分析した。
図8に図示したように、二重特異性構築物は、標的細胞の存在下でのみCD8+T細胞上のCD25の濃度依存的アップレギュレーションを誘導する。抗cyno CD3 IgG(クローンFN-18)も、腫瘍標的細胞と架橋せずにCD8+T細胞上のCD25のアップレギュレーションを誘導することができる(cyno Nestorで得られたデータを参照されたい)。(標的細胞の非存在下では)二重特異性構築物の最大濃度を用いてもcyno T細胞は過剰に活性化されない。
別の実験では、腫瘍標的細胞の存在下でCD8+T細胞上の初期活性化マーカーCD69または後期活性化マーカーCD25をアップレギュレートする能力について、CD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」(SEQ ID NO 1、4、5、および85を参照されたい)をCD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、および5を参照されたい)と比較した。MCSP陽性Colo38標的細胞の存在下または非存在下で、(前記のように単離された)初代ヒトPBMCを示された濃度の二重特異性構築物と少なくとも22時間インキュベートした。簡単に述べると、MCSP陽性標的細胞(または培地)を含有する平底96ウェルプレート1ウェルあたり0.3x106個の初代ヒトPBMCをプレーティングした。最終エフェクター:標的細胞(E:T)比は10:1であった。細胞を、示された濃度の二重特異性構築物および対照と5％CO2、37℃で、示されたインキュベーション期間にわたってインキュベートした。エフェクター細胞をCD8およびCD69またはCD25について染色し、FACS CantoIIによって分析した。
図19は、この実験の結果を示す。CD69(A)またはCD25のアップレギュレーション(B)について2種類の2+1 IgG Crossfab分子(連結軽鎖を有する、または連結軽鎖を有さない)の間で有意差は検出されなかった。
さらに別の実験では、腫瘍標的細胞の存在下でCD4+T細胞またはCD8+T細胞上にあるCD69またはCD25をアップレギュレートする能力について、CD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、5を参照されたい)および「1+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、86を参照されたい)構築物を、1本の抗原結合アームをCrossFab断片と交換した二重特異性CD3-MCSP IgG様構築物(「1+1 CrossMab」;SEQ ID NO 4、87、88、89を参照されたい)と比較した。このアッセイは、ヒトMCSPを発現するMV-3腫瘍細胞の存在下または非存在下ならびに24時間のインキュベーション時間を用いて前記のように行った。
図21に示したように、「1+1 IgG Crossfab(N末端)」および「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物は「1+1 CrossMab」分子より顕著な活性化マーカーアップレギュレーションを誘導した。
実施例4
T細胞上のCD3および腫瘍細胞上のMCSPを標的とする架橋二重特異性構築物によって媒介される、強制的に向けられたT細胞傷害性(LDH放出アッセイ)
抗原結合部分が細胞上のそれぞれの標的抗原と結合することによって二重特異性構築物が架橋された時に、二重特異性構築物が腫瘍標的細胞においてT細胞性アポトーシスを誘導する能力を分析した。
ある実験では、ヒトCD3およびヒトMCSPを標的とする精製「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物(SEQ ID NO 1、3、4、5)を対応する「(scFv) 2」分子と比較した。簡単に述べると、huMCSP発現MDA-MB-435ヒト黒色腫標的細胞をCell Dissociation Bufferを用いて回収し、洗浄し、AIM-V培地(Invitrogen #12055-091)に再懸濁した。30000個の細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートに入れてプレーティングし、構築物のそれぞれの希釈液を示された濃度で添加した。全ての構築物および対照を同じモル濃度まで調節した。5:1の最終E:T比となるようにヒトpanTエフェクター細胞を添加した。ヒトpan T細胞活性化の正の対照として、1μg/ml PHA-M(Sigma #L8902)を使用した。規準化のために、標的細胞の最大溶解(=100％)を、標的細胞を最終濃度の1％TritonX-100とインキュベートすることによって確かめた。最小溶解(=0％)とは、エフェクター細胞とコインキュベートされたが、いかなる構築物とも抗体ともコインキュベートされていない標的細胞を指す。5％CO2、37℃で20時間の一晩インキュベーション後、アポトーシス/壊死標的細胞から上清へのLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science, #11644793001)を用いて製造業者の説明書に従って測定した。
図9に図示したように、「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物は「(scFv) 2」分子と同等に標的細胞においてアポトーシスを誘導する。
さらなる実験では、精製「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、5)、「1+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、2、3、4)、および「(scFv) 2」分子が、細胞上にある両標的抗原CD3およびMCSPの結合を介して構築物が架橋された時に腫瘍標的細胞においてT細胞性アポトーシスを誘導する能力を分析した。標的細胞として、huMCSP発現MDA-MB-435ヒト黒色腫細胞を使用した。E:T比は5:1であり、インキュベーション期間は20時間であった。結果を図10に示した。「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物は「(scFv) 2」分子と同等に標的細胞においてアポトーシスを誘導する。一価および二価「IgG Crossfab(N末端)」形式の比較は、このアッセイでは二価形式の方が強力であることを示す。
さらに別の実験では、カニクイザルCD3およびヒトMCSPを標的とする精製「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 4、5、6、7)ならびに対応する「(scFv) 2」構築物を、標的細胞としてMCSP発現ヒト黒色腫細胞株(MV-3)を用いて比較した。簡単に述べると、MV-3細胞をCell Dissociation Bufferを用いて回収し、洗浄し、2％FCSおよび1％GlutaMaxを含有するDMEMに再懸濁した。30000個の細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートに入れてプレーティングし、構築物または参照IgGのそれぞれの希釈液を示された濃度で添加した。二重特異性構築物および異なるIgG対照を同じモル濃度まで調節した。10:1の最終E:T比となるように健常なカニクイザルの血液から単離されたカニクイザルPBMCエフェクター細胞を添加した。5％CO2、37℃で26時間のインキュベーション後、アポトーシス/壊死標的細胞から上清へのLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science, #11644793001)を用いて製造業者の説明書に従って測定した。
図11に図示したように、EC50の点で「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物は「(scFv) 2」分子より強力であった。
別の一連の実験では、CD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab(N末端)、連結軽鎖」(SEQ ID NO 1、4、5、および85を参照されたい)をCD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、および5を参照されたい)と比較した。簡単に述べると、標的細胞(ヒトColo-38、ヒトMV-3、またはWM266-4黒色腫細胞)をアッセイ日にCell Dissociation Bufferを用いて(またはアッセイを開始する1日前にトリプシンを用いて)回収し、洗浄し、適切な細胞培地(2％FCSおよび1％Glutamaxを含むRPMI1640)に再懸濁した。20000〜30000個の細胞/ウェルを平底96ウェルプレートに入れてプレーティングし、それぞれの抗体希釈液を、示されたように(3回繰り返して)添加した。10:1の最終エフェクター:標的細胞(E:T)比となるようにエフェクター細胞としてPBMCを添加した。全ての構築物および対照を同じモル濃度まで調節した。インキュベーション期間は22時間であった。LDH放出の検出および規準化は前記のように行った。
図15〜18は、MV-3黒色腫細胞(図15)、Colo-38細胞(図16および17)、またはWM266-4細胞(図18)を用いて行われた4つのアッセイの結果を示す。図15に示したように、標的細胞としてMV-3細胞を用いたアッセイにおいて、連結軽鎖を有する構築物は、連結軽鎖を有さない構築物と比較して弱かった。図16および17に示したように、標的細胞として高MCSP発現Colo-38細胞を用いたアッセイにおいて、連結軽鎖を有する構築物は、連結軽鎖を有さない構築物と比較して強かった。最後に、図18に示したように、高MCSP発現WM266-4細胞を標的細胞として使用した時に2種類の構築物間に有意差はなかった。
別の実験では、CrossFab断片においてV領域(VL/VH、SEQ ID NO 3、8、9、10を参照されたい)またはC領域(CL/CH1、SEQ ID NO 9、10、87、95を参照されたい)が交換された、CEAを標的とする2種類の「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆」構築物を比較した。このアッセイは、エフェクター細胞としてヒトPBMCおよびヒトCEA発現標的細胞を用いて前記のように行った。標的細胞(MKN-45またはLS-174T腫瘍細胞)をトリプシン-EDTA(LuBiosciences #25300-096)を用いて回収し、洗浄し、1％Glutamax(LuBiosciences #35050087)および2％FCSを含むRPMI1640(Invitrogen #42404042)に再懸濁した。30000個の細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートに入れてプレーティングし、二重特異性構築物を示された濃度で添加した。全ての構築物および対照を同じモル濃度まで調節した。10:1の最終E:T比となるようにヒトPBMCエフェクター細胞を添加した。インキュベーション期間は28時間であった。EC50値をGraphPad Prism 5ソフトウェアを用いて計算した。
図22に示したように、両標的細胞株に対してCL/CH1交換を有する構築物は、VL/VH交換を有する構築物よりわずかに優れた活性を示す。EC50計算値は、CL/CH1交換構築物およびVL/VH交換構築物についてそれぞれMKN-45細胞では115pMおよび243pMならびにLS-174T細胞では673pMおよび955pMであった。
同様に、CrossFab断片においてV領域(VL/VH、SEQ ID NO 3、91、92、93を参照されたい)またはC領域(CL/CH1、SEQ ID NO 87、91、93、94を参照されたい)が交換された、MCSPを標的とする2種類の「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物を比較した。このアッセイは、エフェクター細胞としてヒトPBMCおよびヒトMCSP発現標的細胞を用いて前記のように行った。標的細胞(WM266-4)をCell Dissociation Buffer(LuBiosciences#13151014)を用いて回収し、洗浄し、1％Glutamax(LuBiosciences#35050087)および2％FCSを含むRPMI1640(Invitrogen#42404042)に再懸濁した。30000個の細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートに入れてプレーティングし、構築物を示された濃度で添加した。全ての構築物および対照を同じモル濃度まで調節した。10:1の最終E:T比となるようにヒトPBMCエフェクター細胞を添加した。インキュベーション期間は26時間であった。EC50値をGraphPad Prism 5ソフトウェアを用いて計算した。
図23に図示したように、2種類の構築物は同等の活性を示す。CL/CH1交換を有する構築物のEC50値の方がわずかに低かった(VL/VH交換構築物の16.8pMと比較して、CL/CH1交換構築物の12.9pM)。
図24は、ヒトMCSP発現MV-3標的細胞を用いて行われた同様のアッセイの結果を示す。再度、両構築物は同等の活性を示す。CL/CH1交換を有する構築物のEC50値の方がわずかに低かった(VL/VH交換構築物の約82.2pMと比較して、CL/CH1交換構築物の約11.7pM)。高い化合物濃度で死滅曲線がプラトーに達しなかったので、正確なEC50値を計算することができなかった。
さらなる実験では、CD3-MCSP「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、5を参照されたい)および「1+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、86を参照されたい)構築物をCD3-MCSP「1+1 CrossMab」(SEQ ID NO 4、87、88、89を参照されたい)と比較した。このアッセイは、エフェクター細胞としてヒトPBMCおよびWM266-4標的細胞またはMV-3標的細胞(E:T比=10:1)ならびに21時間のインキュベーション時間を用いて前記のように行った。
図25に示したように、「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物は、このアッセイにおいて最も強力な分子であり、「1+1 IgG Crossfab(N末端)」および「1+1 CrossMab」がこれに続く。この順序は、多量のMCSPを発現するWM266-4細胞と比較して、中程度のレベルのMCSPを発現するMV-3細胞でより顕著であった。EC50計算値は、「2+1 IgG Crossfab(N末端)」、「1+1 IgG Crossfab(N末端)」および「1+1 CrossMab」についてそれぞれ、MV-3細胞では9.2pM、40.9pM、および88.4pM、WM266-4細胞では33.1pM、28.4pM、および53.9pMであった。
実施例5
二重特異性構築物と、細胞上のそれぞれの標的抗原との結合
異なる二重特異性構築物と、Jurkat(ATCC#TIB-152)細胞上のCD3およびそれぞれの腫瘍抗原、WM266-4細胞上のMCSPまたはLS174-T細胞上のCEAとの結合を、FACSによって確かめた。簡単に述べると、細胞を回収し、計数し、生存率について調べた。0.15〜0.2x106個の細胞/ウェルを丸底96ウェルプレートに入れてプレーティングし、示された濃度の二重特異性構築物および対照と4℃で30分間インキュベートした。より明確に比較するために、構築物を同じモル濃度に対して基準化した。0.1％BSA含有PBSで細胞を1回、洗浄した。FITC結合二次抗体またはPE結合二次抗体と4℃で30分間インキュベートした後、結合した構築物を、FACSCantoII(Software FACS Diva)を用いて検出した。FITCまたはPEが結合したAffiniPure F(ab')2 Fragmentヤギ抗ヒト IgG Fcγ断片特異的(それぞれ、Jackson Immuno Research Lab #109-096-098/ワーキング溶液1:20、または#109-116-170/ワーキング溶液1:80)を使用した。特に定めのない限り、細胞を100μl/ウェルの固定緩衝液(BD#554655)で4℃で15分間、暗所で固定し、400xgで6分間、遠心分離し、分析するまで200μl/ウェルの0.1％BSA含有PBSの中に保持した。EC50値をGraphPad Prism 5ソフトウェアを用いて計算した。
図26は、CrossFab断片の中にVL/VH(SEQ ID NO 3、8、9、10を参照されたい)またはCL/CH1交換(SEQ ID NO 9、10、87、95を参照されたい)のいずれかを有するCD3/CEA「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆」二重特異性構築物と、ジャーカット細胞によって発現されたヒトCD3またはLS-174T細胞によって発現されたヒトCEAとの結合を示す。対照として、標識二次抗体(ヤギ抗ヒトFITC結合AffiniPure F(ab')2断片、Fcγ断片特異的、Jackson Immuno Research Lab #109-096-098)による等価な最大濃度の対応IgGおよびバックグラウンド染色も評価した。両構築物とも細胞上にあるヒトCD3ならびにヒトCEAと良好な結合を示す。EC50計算値は、「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆(VL/VH)」および「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆(CL/CH1)」構築物についてそれぞれ4.6nMおよび3.9nM(CD3)ならびに9.3nMおよび6.7nM(CEA)であった。図27は、CD3/MCSP「2+1 IgG Crossfab(N末端)」(SEQ ID NO 1、3、4、5を参照されたい)および「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆」(SEQ ID NO 4、87、89、90を参照されたい)構築物とジャーカット細胞によって発現されたヒトCD3またはWM266-4細胞によって発現されたヒトMCSPとの結合を示す。両構築物と細胞上のMCSPとの結合は同等に良好であったが、「逆」構築物とCD3との結合は他の構築物と比較して弱かった。EC50計算値は、「2+1 IgG Crossfab(N末端)、逆」および「2+1 IgG Crossfab(N末端)」構築物についてそれぞれ6.1nMおよび1.66nM(CD3)ならびに0.57nMおよび0.95nM(MCSP)であった。
前述の発明は、はっきりと理解できるようにするために例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、説明および実施例が本発明を限定すると解釈してはならない。本明細書において引用された全ての特許および科学文献の開示は、その全体が参照により本明細書にはっきりと組み入れられる。

Claims (40)

  1. 第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する第2のFab断片、ならびに安定的な会合が可能な第1のサブユニットおよび第2のサブユニットからなるFcドメインを含む、二重特異性抗原結合分子であって、
    (a)二重特異性抗原結合分子が、第1の抗原および/または第2の抗原との一価結合を提供し、
    (b)第1のFab断片、第2のFab断片、および第1のFcドメインサブユニットが互いに融合されており、
    (c)第1のFab断片および/または第2のFab断片において、以下の交換:(i)可変ドメインVLおよびVHが互いに交換される、または(ii)定常ドメインCLおよびCH1が互いに交換される、の1つがなされており、
    但し、第1のFab断片および第2のFab断片において同じ交換はなされず、かつ
    (d)二重特異性抗原結合分子が単鎖Fab断片を含まない、
    二重特異性抗原結合分子。
  2. 第1のFab断片のC末端が第2のFab断片のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項1記載の二重特異性抗原結合分子。
  3. 第1のFab断片の重鎖のC末端が第2のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項2記載の二重特異性抗原結合分子。
  4. 第2のFab断片のC末端が第1のFab断片のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項1記載の二重特異性抗原結合分子。
  5. 第2のFab断片の重鎖のC末端が第1のFab断片の重鎖のN末端と融合され、さらには、第1のFab断片の重鎖のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項4記載の二重特異性抗原結合分子。
  6. さらに、第1のFab断片のFab軽鎖および第2のFab断片のFab軽鎖が、任意でペプチドリンカーを介して、互いに融合されている、請求項3または5記載の二重特異性抗原結合分子。
  7. 第2のFab断片のC末端が第1のFcドメインサブユニットのN末端と融合され、さらには、第1のFcドメインサブユニットのC末端が第1のFab断片のN末端と融合されている、請求項1記載の二重特異性抗原結合分子。
  8. 第1のFab断片において交換がなされている、請求項1〜7のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  9. 交換が、可変ドメインVLおよびVHの相互交換である、請求項1〜8のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  10. 交換が、定常ドメインCLおよびCH1の相互交換である、請求項1〜9のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  11. 第1のFab断片、第2のFab断片、Fcドメイン、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる、請求項1〜10のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  12. 第1の抗原または第2の抗原に特異的に結合する第3のFab断片を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  13. 第3のFab断片が第2のFcドメインサブユニットと融合されている、請求項12記載の二重特異性抗原結合分子。
  14. 第3のFab断片のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項12または13記載の二重特異性抗原結合分子。
  15. 第3のFab断片の重鎖のC末端が第2のFcドメインサブユニットのN末端と融合されている、請求項14記載の二重特異性抗原結合分子。
  16. 第3のFab断片が第2の抗原に特異的に結合する、請求項12〜15のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  17. 第2のFab断片、第3のFab断片、およびFcドメインが、免疫グロブリン分子の一部である、請求項12〜16のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  18. 免疫グロブリン分子がIgGクラス免疫グロブリン分子である、請求項17記載の二重特異性抗原結合分子。
  19. 免疫グロブリン分子がIgG1またはIgG4サブクラス免疫グロブリン分子である、請求項17または18記載の二重特異性抗原結合分子。
  20. 免疫グロブリン分子がヒト免疫グロブリン分子である、請求項17〜19のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  21. 第1の抗原に特異的に結合する第1のFab断片、第2の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子、および任意で、1つまたは複数のペプチドリンカーから本質的になる、請求項12〜20のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  22. 同じ交換が、同じ抗原に特異的に結合するFab断片においてなされている、請求項1〜21のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  23. 第1の抗原との一価結合を提供する、請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  24. 交換が第1のFab断片においてのみなされている、請求項1〜23のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  25. Fcドメインが、第1のFcドメインサブユニットおよび第2のFcドメインサブユニットの会合を促進する改変を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  26. Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に配置可能な突出部が、第1のサブユニットのCH3ドメイン内に生じ、かつFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにあるアミノ酸残基が、これより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と交換され、それによって、第1のサブユニットのCH3ドメイン内にある突出部が配置可能な空洞が、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に生じる、請求項25記載の二重特異性抗原結合分子。
  27. FcドメインがIgG Fcドメインである、請求項1〜26のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  28. FcドメインがIgG1 FcドメインまたはIgG4 Fcドメインである、請求項1〜27のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  29. FcドメインがヒトFcドメインである、請求項1〜28のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  30. 操作されていないFcドメインと比較して、Fc受容体との結合親和性が変化するように、および/またはエフェクター機能が変化するようにFcドメインが操作されている、請求項1〜29のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子。
  31. 請求項1〜30のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  32. 請求項31記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  33. 請求項31記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項32記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  34. a)二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項33記載の宿主細胞を培養する工程、およびb)二重特異性抗原結合分子を回収する工程を含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子を生成するための方法。
  35. 請求項1〜30のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  36. 医薬として使用するための、請求項1〜30のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子または請求項35記載の薬学的組成物。
  37. それを必要とする個体において疾患の治療に使用するための、請求項1〜30のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子または請求項35記載の薬学的組成物。
  38. 疾患が癌である、請求項37記載の二重特異性抗原結合分子または薬学的組成物。
  39. それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜30のいずれか一項記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
  40. 疾患が癌である、請求項39記載の使用。
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