JP2018536389A - メソテリンとcd3に結合する二重特異性細胞活性化抗原結合分子 - Google Patents
メソテリンとcd3に結合する二重特異性細胞活性化抗原結合分子 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、概して、T細活性化及び特定の標的細胞に対する再方向付けのための、新規の二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成する方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。【選択図】なし
Description
本発明は、概して、T細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子に関する。加えて、本発明は、このような二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明はさらに、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するための方法と、このような二重特異性抗原結合分子を疾患の治療に使用する方法とに関する。
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、種々の臨床背景において時に望ましい。例えば、健常な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残しながら、腫瘍細胞を特異的に破壊することががん治療の主要目的である。
これを達成する魅力的な方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導することにより、ナチュラルキラー(NK)細胞又は細胞傷害性Tリンパ球(CTL)のような免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃させて破壊させることである。CTLは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、従来の治療抗体のFcドメインにより媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。
これに関し、標的細胞上の表面抗原に一の「アーム」で結合し、T細胞受容体(TCR)複合体の活性化インバリアント成分に第2の「アーム」で結合するように設計された二重特異性抗体が、近年注目を浴びている。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とT細胞の間に一時的な相互作用が生じ、いずれかの傷害性T細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。したがって、免疫応答は、標的細胞に再方向付けされ、CTLの正常なMHC制限活性化がそうであるように、標的細胞によるペプチド抗原の提示又はT細胞の特異性とは無関係である。このような観点から、標的細胞がそれに対して二重特異性抗体を提示するとき、即ち免疫シナプスが模倣されるときにのみ、CTLが活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率のよい溶解を引き起こすために、リンパ球のプレコンディショニング又は同時刺激を必要としない二重特異性抗体である。
複数の二重特異性抗体のフォーマットが開発されており、T細胞媒介性免疫療法に対するそれらの適性が調査されている。これらの中でも、いわゆるBiTE(二重特異性T細胞結合体)分子は、きわめて詳細な特徴付けが済んでおり、臨床の分野で既に何らかの見通しを示している(Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)に掲載)。BiTEは、二のscFv分子が可動性リンカーにより融合したタンデム型のscFv分子である。T細胞結合について評価されたさらなる二重特異性フォーマットには、ダイアボディ(Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996))及びその誘導体、例えばタンデム型ダイアボディ(Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999))が含まれる。さらに最近の開発は、ダイアボディフォーマットに基づくが、さらなる安定性のためにC末端ジスルフィド架橋を特徴とする、いわゆるDART(二重親和性再標的化)分子である(Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011))。全部がハイブリッドマウス/ラットのIgG分子であり、やはり現在臨床治験において評価の対象である、いわゆるトリオマブ(triomab)は、さらに大きなフォーマットを表している(Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に掲載)。
開発されている種々のフォーマットは、免疫療法におけるT細胞の再方向付け及び活性化に起因する大きな可能性を示すものである。しかしながら、そのために適した二重特異性抗体を生成するというタスクは決して簡単はなく、抗体の有効性、毒性、実現可能性、及び生産可能性に関して克服されなければならない複数の困難性を伴っている。
例えばBiTE分子といった小さなコンストラクトは、エフェクターと標的細胞を効率的に架橋することができる一方、非常に短い血清半減期を有し、持続的注入により患者に投与されなければならない。一方、IgG様フォーマットは、半減期が長いという大きな利点を有するが、IgG分子に固有の天然エフェクター機能に関連付けられる毒性を欠点として有する。これらの免疫原性は、治療法開発の成功にとって、特に非ヒトフォーマットのIgG様二重特異性抗体の、別の好ましくない特徴を構成する。最後に、二重特異性抗体の一般的開発においてこれまで主に問題であったのは、臨床的に十分な量及び純度で二重特異性抗体コンストラクトを生産することで、これは、同時発現した際に異なる特異性の抗体重鎖と軽鎖とが誤対合してしまうことにより、正しく構築されたコンストラクトの収量が低減し、所望の二重特異性抗体の分離が困難な複数の非機能性副生成物が生じてしまう。
異なる手法が、二重特異性抗体の鎖会合問題を克服するために用いられている(例えばKlein et al., mAbs 6, 653-663 (2012)参照)。例えば「ノブ・イントゥ・ホール」戦略は、二つの異なる抗体重鎖を、CH3ドメインに突然変異を導入して接触面を修飾することにより、強制的にペアリングさせようと試みる。一の鎖において、嵩高なアミノ酸が短側鎖を有するアミノ酸によって置き換えられることにより、「ホール」がつくられる。逆に、大きな側鎖を有するアミノ酸が他のCH3ドメインに導入されると、「ノブ」がつくられる。これら二の重鎖(及び両方の重鎖に適切でなければならない二の同一軽鎖)を共発現することにより、ヘテロダイマー(「ノブ−ホール」)対ホモダイマー(「ホール−ホール」又は「ノブ−ノブ」)が高い収率で観察される(Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621;及び国際公開第96/027011)。ヘテロダイマーのパーセンテージは、二のCH3ドメインの相互作用表面を、ファージディスプレイ手法を用いて再モデル化し、ジスルフィド架橋を導入してヘテロダイマーを安定させることにより、さらに上昇させることが可能であった(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)。ノブ・イントゥ・ホール技術の新しい手法は、例えばEP1870459に記載されている。
しかしながら、「ノブ・イントゥ・ホール」戦略は、異なる標的抗原に結合するための異なる軽鎖を含む二重特異性抗体に起こる、重鎖−軽鎖の誤対合の問題を解決しない。
重鎖−軽鎖の誤対合を防ぐ一の戦略は、二重特異性抗体の結合アームの一つの重鎖と軽鎖間においてドメインを交換することである(国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号、国際公開第2009/080254号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191参照。これらはドメインクロスオーバーを有する二重特異性IgG抗体に関する。)。
重鎖−軽鎖の誤対合を防ぐ一の戦略は、二重特異性抗体の結合アームの一つの重鎖と軽鎖間においてドメインを交換することである(国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号、国際公開第2009/080254号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191参照。これらはドメインクロスオーバーを有する二重特異性IgG抗体に関する。)。
二重特異性抗体の結合アームの一つにおいて重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVLを交換すること(国際公開第2009/080252号、さらにはSchaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191を参照)により、第1の抗原に対する軽鎖と第2の抗原に対する誤った重鎖との誤対合に起因して生じる副生成物が明らかに減少する(このようなドメイン交換を行わない手法と比較して)。それでも、これら抗体の調製は、副生成物をまったく伴わないというわけではない。主な副生成物は、Bence Jones型相互作用に基づいている(Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191;付録の図S1I)。したがって、このような副生成物をさらに減少させることは、例えばこのような二重特異性抗体の収率を向上させるために望ましい。
T細胞抗原及び標的細胞抗原の両方のための標的抗原及び適切な結合剤の選択は、治療的用途のためのT細胞二重特異性(TCB)抗体の生成において、さらなる重要側面である。
メソテリンは、通常中皮(腹膜、心膜、及び肋膜)に限定された発現を有する細胞表面糖タンパク質である。しかしながら、メソテリンは、卵巣がん、中皮腫、非小細胞肺がん、肺腺癌、卵管がん、頭頚部がん、子宮頸がん、及び膵臓がんを含む様々な腫瘍型において有意に過剰発現する。メソテリンに対する抗体とそのイムノコンジュゲートは、例えば国際公開第2012/087962号及び同2015/051199号に報告されている。
本発明は、良好な有効性及び生産可能性を低い毒性及び好ましい薬物動態的特性と組み合わせた、メソテリン及びCD3のようなT細胞活性化抗原を標的とする、T細胞の活性化と再方向付けのために設計された新規の改良型二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明者らは、メソテリンを標的とする、予想外の改善された特性を有する新規のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を開発した。
例えば、第1の態様において、本発明は、
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部分;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部分;
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がメソテリンであるか、又は第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
例えば、第1の態様において、本発明は、
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部分;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部分;
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がメソテリンであるか、又は第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
特定の実施態様では、第1及び/又は第2の抗原結合部分はFab分子である。特定の一実施態様では、第2の抗原結合部分は、第2の抗原に特異的に結合するFab分子であり、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって置き換えられている(即ちこのような実施態様によれば、第2のFab分子は、Fab軽鎖とFab重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーFab分子である)。
特定の実施態様では、第1の(及び存在する場合、第3の)Fab分子は従来のFab分子である。さらなる特定の実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合できる一を超えないFab分子がT細胞活性化二重特異性抗原結合分子中に存在する(即ちT細胞活性化二重特異性抗原結合分子はT細胞活性化抗原に対して一価の結合を提供する)。
一実施態様では、第1の抗原はメソテリンであり、第2の抗原はT細胞活性化抗原である。さらに特異的な実施態様では、T細胞活性化抗原はCD3、特にCD3エプシロンである。
特定の一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
を含み、
第1の抗原はメソテリンであり、第2の抗原はT細胞活性化抗原であり;
(a)による第1のFab分子は、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
を含み、
第1の抗原はメソテリンであり、第2の抗原はT細胞活性化抗原であり;
(a)による第1のFab分子は、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む。
本発明のさらなる態様によれば、望ましくない副生成物、特にそれらの結合アームの一つにVH/VLドメイン交換を有する二重特異性抗体に起こるBence Jones型副生成物と比較した場合の所望の二重特異性抗体の比率は、CH1及びCLドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに(本明細書では時に「荷電修飾」という)より改善することができる。
例えば、いくつかの実施態様では、(a)による第1の抗原結合部分は、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子であり、(b)による第2の抗原結合部分は、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いに置き換えられている第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であり;
且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け);又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け);又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
このような一実施態様では、i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
さらなる一実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
また別の実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
特定の一実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
別の特定の実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、アルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
代替的な一実施態様では、b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、b)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
さらなる一実施態様では、b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
また別の実施態様では、b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、b)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
また別の実施態様では、b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、b)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
一実施態様では、b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
別の実施態様では、b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、アルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
特定の一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子
を含み、
第1の抗原はメソテリンであり、第2の抗原はT細胞活性化抗原であり;
(a)による第1のFab分子は、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含み;且つ
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子
を含み、
第1の抗原はメソテリンであり、第2の抗原はT細胞活性化抗原であり;
(a)による第1のFab分子は、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含み;且つ
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
いくつかの実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原に特異的に結合する第3の抗原結合部分をさらに含む。特定の実施態様では、第3の抗原結合部分は第1の抗原結合部分と同一である。一実施態様では、第3の抗原結合部分はFab分子である。
特定の実施態様では、第3及び第1の抗原結合部分はそれぞれFab分子であり、第3のFab分子は第1のFab分子と同一である。したがって、これら実施態様では、第3のFab分子は、存在する場合、第1のFab分子と同じアミノ酸置換を含む。第1のFab分子と同様に、第3のFab分子は特に、従来のFab分子である。
第3の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様では、第1及び第3の抗原部分は特異的にメソテリンに結合し、第2の抗原結合部分は、T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンに、特異的に結合する。
第3の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様では、第1及び第3の抗原部分は特異的にメソテリンに結合し、第2の抗原結合部分は、T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンに、特異的に結合する。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかの実施態様では、a)による第1の抗原結合部分とb)による第2の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。特定の実施態様では、第1及び第2の抗原結合部分はそれぞれFab分子である。このような特定の一実施態様では、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端で、第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合する。代替的なこのような一実施態様では、第1のFab分子は、Fab重鎖のC末端で、第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合する。(i)第2のFab分子がFab重鎖のC末端で第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しているか、又は(ii)第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端で、第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している実施態様では、さらにFab分子のFab軽鎖と第2のFab分子のFab軽鎖が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメインをさらに含む。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、異なる構成を有することができる、即ち第1、第2の(及び任意選択的に第3の)抗原結合部分は、互いに、及びFcドメインに、異なる方法で融合していてよい。これらは互いに直接、又は、好ましくは一又は複数の適切なペプチドリンカーを介して、融合することができる。Fab分子の融合先がFcドメインのサブユニットのFab分子のN末端である場合、典型的には免疫グロブリンのヒンジ領域を介している。
一実施態様では、第1及び第2の抗原結合部分はそれぞれFab分子であり、第2の抗原結合部分は、Fab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。このような実施態様では、第1の抗原結合部分は、Fab重鎖のC末端において第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端又はFcドメインのサブユニットの他方のN末端に融合している。
一実施態様では、第1及び第2の抗原結合部分はそれぞれFab分子であり、第1及び第2の抗原結合部分はそれぞれFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している。この実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に免疫グロブリン分子を含み、Fabアームの一つにおいて重鎖と軽鎖の可変領域VHとVL(又は本明細書に記載される荷電修飾がCH1及びCLドメインに導入されない実施態様では定常領域CH1とCL)が交換されている/互いによって置き換えられている(図1A、D参照)。
代替的実施態様では、第3の抗原結合部分、特に第3のFab分子、が、Fab重鎖のC末端において、Fcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。特定のこのような実施態様では、第2及び第3の抗原結合部分は、それぞれFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、第1の抗原結合部分はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。この実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に免疫グロブリン分子を含み、Fabアームの一つにおいて重鎖と軽鎖の可変領域VHとVL(又は本明細書に記載される荷電修飾がCH1及びCLドメインに導入されない実施態様では定常領域CH1とCL)が交換されている/互いによって置き換えられており、追加の(従来の)Fab分子は前記FabアームにN末端融合している(図1B、E参照)。別のこのような実施態様では、第1及び第3の抗原結合部分は、それぞれFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、第2の抗原結合部分はFab重鎖のC末端において第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している。この実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリンのFabアームの一つにN末端融合した追加のFab分子と共に免疫グロブリン分子を本質的に含み、前記追加のFab分子では、重鎖と軽鎖の可変領域VHとVL(又は本明細書に記載される荷電修飾がCH1及びCLドメインに導入されない実施態様では定常領域CH1とCL)が交換されている/互いによって置き換えられている(図1C、F参照)。
特定の一実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる免疫グロブリン分子はIgGクラスの免疫グロブリンである。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンはIgG1サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはIgG4サブクラスの免疫グロブリンである。
特定の一実施態様では、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又はFab軽鎖とFab重鎖の定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又はFab軽鎖とFab重鎖の定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
別の実施態様では、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
(a)による第1のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
(a)による第1のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
さらなる実施態様では、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;及び
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであるか;又は
(ii)第2の抗原がメソテリンであり、第1の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子及びb)による第2のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
メソテリンに特異的に結合するFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;及び
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであるか;又は
(ii)第2の抗原がメソテリンであり、第1の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子及びb)による第2のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
メソテリンに特異的に結合するFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の様々な構成のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換は、存在する場合、第1及び(存在する場合)第3のFab分子のCH1及びCLドメイン、又は第2のFab分子のCH1及びCLドメインに存在しうる。好ましくは、そのような置換は、第1及び(存在する場合)第3のFab分子のCH1及びCLドメインに存在する。本発明の概念によれば、本発明に記載されるアミノ酸置換が第1(及び存在する場合第3)のFab分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第2のFab分子では行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第2のFab分子で行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第1(及び存在する場合第3)のFab分子では行われない。Fab軽鎖とFab重鎖の定常ドメインCLとCH1が互いによって置き換えられているFab分子を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子では、アミノ酸置換は行われない。
特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第1(及び存在する場合第3)のFab分子において行われる、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、第1(及び存在する場合第3)のFab分子の定常ドメインCLはカッパアイソタイプである。特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第2のFab分子で行われる、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の他の実施態様では、第2のFab分子の定常ドメインCLはカッパアイソタイプである。いくつかの実施態様では、第1(及び存在する場合第3)のFab分子の定常ドメインCL及び第2のFab分子の定常ドメインCLはカッパアイソタイプである。
特定の一実施態様では、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
さらに詳細な一実施態様では、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、アルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
c)による第3のFab分子がa)による第1のFab分子と同一であり;
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、アルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
別の実施態様では、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
(i)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しているか、又は
(ii)b)による第2のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてa)による第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、且つ
a)による第1のFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
さらなる実施態様では、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;及び
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであるか;又は
(ii)第2の抗原がメソテリンであり、第1の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
a)による第1のFab分子及びb)による第2のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
メソテリンに特異的に結合するFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって交換されている第2のFab分子;及び
c)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであるか;又は
(ii)第2の抗原がメソテリンであり、第1の抗原がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンであり;
a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け);
a)による第1のFab分子及びb)による第2のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてc)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており;且つ
メソテリンに特異的に結合するFab分子が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、FcドメインはIgGのFcドメインである。特定の実施態様では、FcドメインはIgG1のFcドメインである。別の特定の実施態様では、FcドメインはIgG4のFcドメインである。さらに詳細な実施態様では、Fcドメインは、アミノ酸置換S228P(Kabat番号付け)を含むIgG4のFcドメインである。特定の実施態様ではFcドメインはヒトFcドメインである。
特定の実施態様では、Fcドメインは、第1及び第2のFcドメインサブユニットの会合を促進する修飾を含んでいる。このような特定の一実施態様では、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸残基が、大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第1のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸残基が、小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第2のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部の隆起を収容可能な空洞が生成される。
特定の一実施態様では、Fcドメインは、天然のIgG1 Fcドメインと比較して小さな、Fc受容体への結合親和性及び/又はエフェクター機能を呈する。特定の実施態様では、Fcドメインは、非改変型Fcドメインと比較して小さな、Fc受容体に対する結合親和性及び/又はエフェクター機能を有するように改変される。一実施態様では、Fcドメインは、Fc受容体への結合及び/又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、Fc受容体への結合及び/又はエフェクター機能を低下させるFcドメイン内の一又は複数のアミノ酸置換は、L234、L235、及びP329の群から選択される一又は複数の位置にある(Kabat EUインデックスによる番号付け)。特定の実施態様では、Fcドメインの各サブユニットは、Fc受容体への結合及び/又はエフェクター機能を低下させる三つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はL234A、L235A及びP329Gである(Kabat EUインデックスによる番号付け)。このような一実施態様では、FcドメインはIgG1のFcドメイン、特にヒトIgG1のFcドメインである。他の実施態様では、Fcドメインの各サブユニットは、Fc受容体への結合及び/又はエフェクター機能を低下させる二つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はL235E及びP329Gである(Kabat EUインデックスによる番号付け)。このような一実施態様では、FcドメインはIgG4のFcドメイン、特にヒトIgG4のFcドメインである。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、IgG4のFcドメインであり、アミノ酸置換L235E及びS228P(SPLE)を含んでいる(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
一実施態様では、Fc受容体はFcγ受容体である。一実施態様では、Fc受容体はヒトFc受容体である。一実施態様では、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の一実施態様では、Fc受容体は、ヒトFcγRIIa、FcγRI、及び/又はFcγRIIIaである。一実施態様では、エフェクター機能は抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)である。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号4の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号5のHCDR2、配列番号6のHCDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号8の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号9のLCDR2及び配列番号10のLCDR3を含む軽鎖可変領域を含む。さらに詳細な実施態様では、T細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンに特異的に結合する抗原結合部分は、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分はFab分子である。特定の一実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる第2の抗原結合部分、特にFab分子は、CD3、さらに詳細にはCD3エプシロンに特異的に結合し、配列番号4の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号5の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3、配列番号8の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2及び配列番号10の軽鎖CDR3を含む。さらに詳細な実施態様では、前記第2の抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の具体的な実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号14の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号15の重鎖CDR2、配列番号16の重鎖CDR3、配列番号17の軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含む。さらに具体的な一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。特定の一実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、第1(及び存在する場合第3)の抗原結合部分、特にFab分子は、メソテリンに特異的に結合し、配列番号14の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号15の重鎖CDR2、配列番号16の重鎖CDR3、配列番号17の軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含む。さらに詳細な実施態様では、前記第1(及び存在する場合前記第3)の抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
特定の態様において、本発明は、
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に結合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がCD3、特にCD3エプシロンであり;
(ii)a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれ配列番号14の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号15の重鎖CDR2、配列番号16の重鎖CDR3、配列番号17の軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含み、b)による第2のFab分子が、配列番号4の重鎖CDR1、配列番号5の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3、配列番号8の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2及び配列番号10の軽鎖CDR3を含み;且つ
(iii)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子;
b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって交換されている第2のFab分子;
c)第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子;及び
d)安定に結合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(i)第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がCD3、特にCD3エプシロンであり;
(ii)a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれ配列番号14の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号15の重鎖CDR2、配列番号16の重鎖CDR3、配列番号17の軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含み、b)による第2のFab分子が、配列番号4の重鎖CDR1、配列番号5の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3、配列番号8の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2及び配列番号10の軽鎖CDR3を含み;且つ
(iii)a)による第1のFab分子が、Fab重鎖のC末端においてb)による第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、b)による第2のFab分子及びc)による第3のFab分子が、それぞれFab重鎖のC末端においてd)によるFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
一実施態様では、b)による第2のFab分子において、可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられており、さらに(iv)a)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)又はアルギニン(R)、特にアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子及びc)による第3のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
本発明の別の態様によれば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド含む一又は複数の発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
別の態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、a)本発明の宿主細胞を、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、b)T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む。本発明は、本発明の方法によって生成されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子も包含する。
本発明はさらに、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
本発明には、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物を使用する方法も包含される。本発明の一態様では、医薬としての使用のための本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。一態様では、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。
さらに、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用と;薬学的に許容される形態の、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を、個体に対して投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法とが提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
本発明は、T細胞、特に細胞傷害性T細胞の存在下において、標的細胞に本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を接触させることを含む、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法も提供する。
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。したがって、「抗原に対する一価の結合」という表現は、抗原結合分子内において、抗原に特異的な一つの(且つ一つを超えない)抗原結合部位の存在を意味する。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、即ち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域(CDR)由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般に二つの抗原結合部位を有し、Fab分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ(例えば、第2の抗原結合部分)を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばT細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義し、且つ当技術分野において既知であるように、抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ:α、δ、ε、γ、又はμのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、二つのアイソタイプ:κ及びλのいずれかを含む。
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位(例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造)を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び/又は細胞外基質(ECM)に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質(例えばCD3)は、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、CD3、特にCD3のエプシロンサブユニット(ヒト配列についてはUniProt no. P07766(バージョン130)、NCBI RefSeq no. NP_000724.1、配列番号1を;又はカニクイザル[Macaca fascicularis]配列についてはUniProt no. Q95LI5(バージョン49)、NCBI GenBank no. BAB71849.1、配列番号2を参照)、又はメソテリン(UniProt no. Q13421参照)である。メソテリンは、71 kDaの前駆体タンパク質として合成され、その成熟部分は細胞表面に発現される。その前駆体タンパク質は、フューリンによって、31 kDaのshed成分(巨核球増強因子又はMPFと呼ばれる)と40 kDaのメソテリン成分にタンパク質分解性に切断される。例示的なヒトメソテリン前駆体タンパク質のアミノ酸配列は配列番号36に示され、例示的なヒトメソテリンは配列番号37に示される。特定の実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、様々な種由来のCD3又はメソテリン抗原の中でも保存されたCD3又はメソテリンのエピトープに結合する。
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴(SPR)技術(BIAcore計器上での解析)(Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))、及び古典的結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばSPRによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約10%未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(KD)を有する。
「親和性」は、分子(例えば、受容体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば、リガンド)との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対(例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド)のメンバー間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYに対する親和性は、通常、解離定数(KD)によって表され、この解離定数(KD)は、解離速度定数と会合速度定数(それぞれ、koff及びkon)の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)である。
例えばFc受容体への結合減少といった「結合減少」は、例えばSPRによって測定される、各相互作用に対する親和性の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ(又は分析方法の検出限界を下回る値)への親和性の減少、即ち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
本明細書において使用される「T細胞活性化抗原」は、Tリンパ球、特に細胞傷害性Tリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にT細胞の活性化を誘導することができる。具体的には、抗原結合分子とT細胞活性化抗原との相互作用は、T細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを引き起こすことによりT細胞活性化を誘導することができる。特定の一実施態様では、T細胞活性化抗原は、CD3、特にCD3のエプシロンサブユニット(ヒト配列についてUniProt no. P07766(バージョン130)、NCBI RefSeq no. NP_000724.1、配列番号1を;カニクイザル[Macaca fascicularis]配列についてはUniProt no. Q95LI5(バージョン49)、NCBI GenBank no. BAB71849.1、配列番号2を参照)。
本明細書において使用される「T細胞活性化」は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び発現から選択される、Tリンパ球、特に細胞傷害性Tリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化を誘導することができる。T細胞活性化を測定するために適切なアッセイは、本明細書において記載される技術分野で既知である。
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の一実施態様では、標的細胞抗原は、メソテリン、特にヒトメソテリンである。
本明細書において、Fab分子などに関して使用される用語「第1」、「第2」又は「第3」は、各種の部分が複数存在するときに区別を簡便にするために使用される。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
「Fab分子」は、免疫グロブリンの、重鎖(「Fab重鎖」)のVH及びCH1ドメインと、軽鎖(「Fab軽鎖」)のVL及びCLドメインとからなるタンパク質を指す。
「融合した」とは、複数の成分(例えば、Fab分子及びFcドメインのサブユニット)が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
本明細書において使用される用語「単鎖」は、ペプチド結合により線形に結合したアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施態様では、抗原結合部分の一つは、単鎖Fab分子、即ちFab軽鎖とFab重鎖がペプチドリンカーにより接続されて一本のペプチド鎖を形成しているFab分子である。このような特定の一実施態様では、単鎖Fab分子においてFab軽鎖のC末端がFab重鎖のN末端に接続している。
「クロスオーバー」Fab分子(「Crossfab」とも呼ばれる)は、Fab重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている(即ち互いによって置き換えられている)Fab分子を意味し、即ちクロスオーバーFab分子は、軽鎖可変ドメインVL及び重鎖定常ドメイン1 CH1(NからC末端の方向に、VL−CH1)からなるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインVH及び軽鎖定常ドメインCL(NからC末端の方向に、VH−CL)からなるペプチド鎖とを含む。明瞭には、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーFab分子において、重鎖定常ドメイン1 CH1を含むペプチド鎖を、本明細書では(クロスオーバー)Fab分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Fab軽鎖とFab重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバー分子では、重鎖可変ドメインVHを含むペプチド鎖を、本明細書ではクロスオーバーFab分子の「重鎖」と呼ぶ。
これに対して、「従来の」Fab分子とは、その天然フォーマットにおけるFab分子、即ち重鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン(NからC末端の方向に、VH−CH1)からなる重鎖と、軽鎖の可変ドメイン及び定常領域(NからC末端の方向に、VL−CL)からなる軽鎖を含むFab分子を意味する。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン(VH)を有し、その後に重鎖定常ドメインとも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)が続いている。同様に、N末端からC末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン(VL)を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常ドメイン(CL)ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、又はμ(IgM)と呼ばれる五種類のうちの一つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及びα2(IgA2)に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)とラムダ(λ)と呼ばれる、2つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された二つのFab分子とFcドメインからなる。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照されたい。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照;また、国際公開第93/16185号;及び米国特許第5571894号及び 第5587458号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つin vivo半減期を増加させたFab及びF(ab’)2断片の議論については、米国特許第5869046号を参照のこと。ダイアボディは二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、EP404097号;国際公開第1993/01161号;Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、或いは軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA;例えば、米国特許第6248516B1号参照)。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞(例えば、大腸菌又はファージ)による生産を含む。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン(抗体可変領域とも呼ばれる)により提供されうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)及び抗体重鎖可変ドメイン(VH)を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、各々が四つの保存されたフレームワーク領域(FR)と三つの超可変領域(HVR)とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のVH又はVLドメインで十分である。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「HVR」は、配列が超可変であるか、及び/又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型4鎖抗体は、VHに三つ(H1、H2、H3)、及びVLに三つ(L1、L2、L3)、計六つのHVRを含む。HVRは、一般的に超可変ループ由来及び/又は相補性決定領域(CDR)由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び/又は抗原認識に関与している。VHのCDR1を除いて、CDRは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域(HVR)は、「相補性決定領域」(CDR)とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) and by Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のCDRに言及していずれかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるCDRを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Aに明記される。特定のCDRを包含する正確な残基数は、CDRの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のCDRを含むかを、常套的に決定することができる。本明細書に提供されるCDR配列は、概してKabatの定義によるものである。
表A:CDRの定義1
1 表AのすべてのCDRの定義の番号付けは、Kabatら(以下参照)によって規定された番号付けの慣習に従っている。
2 表Aにおいて使用されている小文字の「b」を含む「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるCDRを指す。
1 表AのすべてのCDRの定義の番号付けは、Kabatら(以下参照)によって規定された番号付けの慣習に従っている。
2 表Aにおいて使用されている小文字の「b」を含む「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるCDRを指す。
Kabatらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Kabat番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。可変領域配列に関連して本明細書において使用される場合、「Kabat番号付け」は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Kabat番号付けシステムに従っている。
本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載された、本明細書において「Kabatによる番号付け」又は「Kabat番号付け」と呼ぶ、Kabat番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Kabat番号付けシステム(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))の頁647〜660参照)が、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLに使用され、Kabat EUインデックス番号付けシステム(頁661〜723参照)が、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2及びCH3)に使用され、この場合本明細書でこれはさらに「Kabat EUインデックスによる番号付け」と呼ぶことにより分類される。
配列リストのポリペプチド配列は、Kabat番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列リストの番号付けをKabat番号付けに変換することは、当技術分野のいpp端的技術範囲内である。
配列リストのポリペプチド配列は、Kabat番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列リストの番号付けをKabat番号付けに変換することは、当技術分野のいpp端的技術範囲内である。
「フレームワーク」又は「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に四つのFRのドメイン、即ちFR1、FR2、FR3、及びFR4で構成される。したがって、HVR及びFR配列は一般にVH(又はVL)の以下の配列に現れる:FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRのアミノ酸残基及びヒトFRのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、HVR(例えば、CDR)のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。このような可変ドメインを、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ぶ。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にC1q結合及び/又はFc受容体(FcR)結合に関して本発明による特性を産むように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の五つの主要なクラス、即ちIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IGA1、及びIgA2に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書の用語「Fcドメイン」又は「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域と変異型Fc領域を含む。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに変化しうるが、通常、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226又はPro230から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、宿主細胞によって生成される抗体には、重鎖のC末端から、一又は複数の、特に一又は二のアミノ酸の翻訳後切断が生じうる。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により、宿主細胞によって生成される抗体は、完全長重鎖を含みうるか、又は完全長重鎖の切断された変異体(本明細書では「切断された変異型重鎖」とも呼ぶ)を含みうる。これは、重鎖の最後の二のC末端アミノ酸がグリシン(G446)とリジン(K447、Kabat EUインデックスによる番号付け)である場合に当てはまる。したがって、Fc領域のC末端リジン(Lys447)、又はC末端グリシン(Gly446)とリジン(K447)は、存在してもしなくてもよい。Fcドメイン(又は本明細書において定義されるFcドメインのサブユニット)を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、特に断らない限りC末端グリシン−リジンジペプチドを有さないものとして示される。本発明の一実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるFcドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のC末端グリシン−リジンジペプチド(G446及びK447、KabatのEUインデックスによる番号付け)を含む。本発明の一実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるFcドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のC末端グリシン残基(G446、KabatのEUインデックスによる番号付け)を含む。本明細書に記載される薬学的組成物といった本発明の組成物は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と、切断された変異型重鎖とを含みうる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断された変異型重鎖を有する分子との混合物からなることができ、この場合T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%が切断された変異型重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なC末端グリシン−リジンジペプチド(G446及びK447、KabatのEUインデックスによる番号付け)を有する本明細書に特定されるFcドメインのサブユニットを含む重鎖を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なC末端グリシン残基(G446、KabatのEUインデックスによる番号付け)を有する本明細書に特定されるFcドメインのサブユニットを含む重鎖を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書に特定されるFcドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子からなるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の集団;追加のC末端グリシン残基(G446、KabatのEUインデックスによる番号付け)を有する、本明細書に特定されるFcドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子;及び追加のC末端グリシン−リジンジペプチド(G446及びK447、KabatのEUインデックスによる番号付け)を有する本明細書に特定されるFcドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子を含む。本明細書に別途指定のない限り、Fc領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991(上記も参照)に記載されるように、EUインデックスとも呼ばれるEU番号付けシステムに従う。本明細書において使用されるFcドメインの「サブユニット」は、二量体Fcドメインを形成する二つのポリペプチドの一方、即ち、免疫グロブリン重鎖のC末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、IgG Fcドメインのサブユニットは、IgG CH2及びIgG CH3定常ドメインを含む。
「Fcドメインの第1及び第2のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Fcドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合によるホモダイマーの形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はFcドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい二つのFcドメインサブユニット(即ち、Fcドメインの第1及び第2のサブユニット)の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は、二つのFcドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Fcドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、(ヘテロ)二量体化は、第1のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第2のFcドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合したさらなる成分(例えば、抗原結合部分)が同じでないという意味で非同一でありうる。いくつかの実施態様では、会合を促す修飾は、Fcドメイン内におけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促す修飾は、Fcドメインの二つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のFc領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合及び補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御、及びB細胞の活性化が含まれる。
本明細書において使用される「改変する、改変された、改変」などの用語は、ペプチド骨格のいずれかの操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組合せが含まれる。
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。置換、欠失、挿入、及び修飾のあらゆる組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、Fc受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Fc領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、即ち、一のアミノ酸を、異なる構造及び/又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、20の標準のアミノ酸(例えば、4−ヒドロキシプロリン、3−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5−ヒドロキシリジン)の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置き換えが含まれる。アミノ酸変異体は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、PCR、遺伝子合成などを含みうる。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Fcドメインの329位におけるプロリンからグリシンへの置換は、329G、G329、G329、P329G、又はPro329Glyとして示される。
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ結合(ペプチド結合としても知られる)により線形に結合したモノマー(アミノ酸)からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、二以上のアミノ酸の任意の鎖を指すのであって、特異的な長さの生成物を指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は二以上のアミノ酸の鎖を指す他のいずれの用語も「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これら用語のいずれかの代わりに、又はいずれかと交換可能に、使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾の成果を指すことも意図しており、このような成果には、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解的切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾が含まれる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から得られるか、又は組み換え技術により生成されるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。ポリペプチドは、化学合成を含むあらゆる手法で生成されてよい。本発明のポリペプチドは、約3以上、5以上、10以上、20以上、25以上、50以上、75以上、100以上、200以上、500以上、1000以上、又は2000以上の大きさのアミノ酸からなってよい。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するものではない。既定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると言われ、既定の三次元構造を有さず、多数の異なる形態をとりうるポリペプチドは折り畳まれていないと言われる。
「単離された」ポリペプチド若しくは変異体、又はその誘導体は、その自然の環境にない目的のポリペプチドである。特定のレベルのどのような精製も必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組み換えにより生成されたポリペプチド及びタンパク質を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組み換えポリペプチドのように、本発明のために単離することが考慮される。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムALIGN−2を使用して生成される。ALIGN−2配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンD.C.,20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2は、ジェネンテック社(South San Francisco、California)から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIXのV4.0Dを含む、UNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定されて変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN−2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(或いは、所与のアミノ酸配列Bと、又はそれに対して特定の%アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
100 × 分率X/Y
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2により、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2コンピュータープログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
100 × 分率X/Y
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2により、AとBのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2コンピュータープログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、ウイルス由来のRNA、又はプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるようなアミド結合)を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばDNA又はRNA断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、DNA又はRNAである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された(部分的に又は実質的に)ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたRNA分子は、in vivo又はin vitroの本発明のRNA転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば95%「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドと言うとき、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ100のヌクレオチドにつき最大5ポイントの変異を含んでよいという点以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大5%のヌクレオチドが削除されるか又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、或いは参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大5%の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の5’又は3’末端の位置で、又はこれら末端の間のいずれかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、いずれか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの(例えばALIGN−2)などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
用語「発現カセット」は、組み換えにより又は合成により、標的細胞内の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるDNA分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なmRNAの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び/又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞を含む。
「活性化Fc受容体」は、抗体のFcドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるFc受容体である。ヒト活性化Fc受容体には、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、及びFcαRI(CD89)が含まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Fc領域を含む抗体又はその誘導体が通常Fc領域に対するN末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ADCCの低下」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したADCCの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、及び/又は、ADCCの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇のいずれかと定義される。ADCCの低下は、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法(当業者に既知の)を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるADCCと相対的なものである。例えば、そのFcドメインにADCCを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるADCCの低下は、このアミノ酸置換をFcドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるADCCと比較される。ADCCを測定するための適切なアッセイは、当技術分野でよく知られている(例えば、国際公開第2006/082515号又は同第2012/130831号参照)。
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ)、霊長類(例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、げっ歯類(例えば、マウス及びラット)が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の有効成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「治療」(及びその文法上の変形)は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び/又は注意事項についての情報を含む。
実施態様の詳細な説明
本発明は、特に有効性及び安全性、並びに生産可能性に関し(例えば純度、収率に関して)、治療的用途に好ましい特性を有するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
本発明は、特に有効性及び安全性、並びに生産可能性に関し(例えば純度、収率に関して)、治療的用途に好ましい特性を有するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。
荷電修飾
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるFab分子に、特にそれらの結合アームの一つ(又は三つ以上の抗原結合Fab分子を含む分子の場合、二つ以上)にVH/VL交換を有するFabベースの二重/多重特異性抗原結合分子の生成において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合(Bence−Jones型副生成物)を減少させるうえで有効なアミノ酸置換を含むことができる(PCT出願番号PCT/EP2015/057165、特にその実施例も参照されたい。この特許文献を、参照によりその全体を本明細書に包含する)。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるFab分子に、特にそれらの結合アームの一つ(又は三つ以上の抗原結合Fab分子を含む分子の場合、二つ以上)にVH/VL交換を有するFabベースの二重/多重特異性抗原結合分子の生成において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合(Bence−Jones型副生成物)を減少させるうえで有効なアミノ酸置換を含むことができる(PCT出願番号PCT/EP2015/057165、特にその実施例も参照されたい。この特許文献を、参照によりその全体を本明細書に包含する)。
したがって、特定の実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている第2のFab分子
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がメソテリンであるか、又は第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)か;又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であって、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている第2のFab分子
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がメソテリンであるか、又は第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)か;又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、i)及びii)に記載の修飾の両方を含むことはない。第2のFab分子の定常ドメインCLとCH1は、互いによって置き換えられない(即ち変化しない)。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一実施態様では、i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
さらなる一実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
特定の一実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)(好ましい一実施態様では、独立して、リジン(K)又はアルギニン(R)により)、a)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
さらに詳細な一実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)又はアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
さらに詳細な実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、リジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、アルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
特定の実施態様では、a)による第1のFab分子の定常ドメインCLは、カッパアイソタイプである。
代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、a)による第1のFab分子の定常ドメインCL及び定常ドメインCH1の代わりに、b)による第2のFab分子の定常ドメインCL及び定常ドメインCH1で行われてもよい。このような特定の実施態様では、b)による第2のFab分子の定常ドメインCLは、カッパアイソタイプである。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子をさらに含んでもよい。特定の実施態様では、前記第3のFab分子は、a)による第1のFab分子と同一である。これら実施態様では、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第1のFab分子及び第3のFab分子の各々の定常ドメインCL及び定常ドメインCH1において行われる。代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、b)による第2のFab分子の定常ドメインCL及び定常ドメインCH1において行われてもよいが、第1のFab分子及び第3のFab分子の定常ドメインCL及び定常ドメインCH1では行われない。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメインをさらに含む。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のフォーマット
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的構成を図1に示す。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構造で互いに融合することができる。例示的構成を図1に示す。
特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はFab分子である。このような実施態様では、第1、第2、第3(など)の抗原結合部分は、本明細書において、それぞれ第1、第2、第3(など)のFab分子と呼ばれことがある。さらに、特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメインを含む。
いくつかの実施態様では、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。
このような一実施態様では、第1のFab分子は、Fab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しいている。このような特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1及び第2のFab分子、第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第1のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。このような構成は、図1G及び1Kに模式的に示されている。任意選択的に、第1のFab分子のFab軽鎖と第2のFab分子のFab軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
別のこのような実施態様では、第1のFab分子はFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。このような特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1及び第2のFab分子、第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第1及び第2のFab分子はそれぞれ、Fab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットのうちの一つのN末端に融合している。このような構成は、図1A及び1Dに模式的に示されている。第1及び第2のFab分子は、直接又はペプチドリンカーを介してFcドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第1及び第2のFab分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してFcドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にFcドメインがIgG1のFcドメインである場合、ヒトIgG1ヒンジ領域である。
他の実施態様では、第1のFab分子はFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。
このような一実施態様では、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。このような特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1及び第2のFab分子、第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第2のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第1のFab分子は、Fab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。このような構成は、図1H及び1Lに模式的に示されている。任意選択的に、第1のFab分子のFab軽鎖と第2のFab分子のFab軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
Fab分子は、Fcドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一又は複数のアミノ酸、典型的には約2〜20のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n 又は4(SG4)nペプチドリンカーが含まれる。「n」は通常1から10、典型的には2から4の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも5のアミノ酸長を、一実施態様では5から100、さらなる実施態様では10から50のアミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、(GxS)n又は(GxS)nGm[式中、G=グリシン、S=セリン、(x=3、n=3、4、5又は6、m=0、1、2又は3)又は(x=4、n=2、3、4又は5、m=0、1、2又は3)]であり、一実施態様では、x=4、n=2又は3であり、さらなる実施態様ではx=4、n=2である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは(G4S)2である。第1及び第2のFab分子のFab軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは(G4S)2である。第1及び第2のFab分子のFab重鎖を接続するために適切な例示的ペプチドリンカーは、配列(D)−(G4S)2(配列番号11及び12)を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列(G4S)4を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域(の一部)を含むことができる。特にFab分子がFcドメインのサブユニットのN末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分(例えばFab分子)を有するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(例えば、図1A、D、G、H、K、Lに示すような)は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な一を超える抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それによりその利用可能性を低下させる。
しかしながら、他の多くの場合、標的細胞抗原に特異的な二以上の抗原結合部分(例えばFab分子)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(図1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M又は1Nに示される実施例参照)を有することは、例えば標的部位へのターゲティングを最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
しかしながら、他の多くの場合、標的細胞抗原に特異的な二以上の抗原結合部分(例えばFab分子)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(図1B、1C、1E、1F、1I、1J、1M又は1Nに示される実施例参照)を有することは、例えば標的部位へのターゲティングを最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
したがって、特定の実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1の抗原に特異的に結合する第3のFab分子をさらに含む。第1の抗原は、好ましくは、標的細胞抗原、即ちメソテリンである。一実施態様では、第3のFab分子は従来のFab分子である。一実施態様では、第3のFab分子は第1のFab分子と同一である(即ち、第1及び第3のFab分子は、同じ重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を含み、同じドメイン構成(即ち従来の又はクロスオーバー)を有する)。特定の一実施態様では、第2のFab分子は、T細胞活性化抗原、特にCD3に特異的に結合し、第1及び第3のFab分子はメソテリンに特異的に結合する。
代替的実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2の抗原に特異的に結合する第3のFab分子をさらに含む。これら実施態様では、第2の抗原は、好ましくは標的細胞抗原である。このような一実施態様では、第3のFab分子はクロスオーバーFab分子(Fab重鎖と軽鎖の可変ドメインVH及びVL又は定常ドメインCLとCH1が交換されている/互いによって置き換えられているFab分子)である。このような一実施態様では、第3のFab分子は第2のFab分子と同一である(即ち第2及び第3のFab分子は、同じ重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を有し、同じドメイン構成(即ち従来の又はクロスオーバー)を有する)。このような一実施態様では、第1のFab分子は、T細胞活性化抗原、特にCD3に特異的に結合し、第2及び第3のFab分子は標的細胞抗原に特異的に結合する。
一実施態様では、第3のFab分子はFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している。
特定の実施態様では、第2及び第3のFab分子は、それぞれFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットのうちの一つのN末端に融合しており、第1のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。このような特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1、第2及び第3のFab分子、第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第1のFab分子は、Fab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端において、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合しており、第3のFab分子はFab重鎖のC末端においてFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合している。このような構成は、図1B及び1E(第3のFab分子が従来のFab分子であり、好ましくは第1のFab分子と同一である特定の実施態様)と、図1I及び1M(第3のFab分子がクロスオーバーFab分子であり、好ましくは第2のFab分子と同一である代替的実施態様)に模式的に示されている。第2及び第3のFab分子は、直接又はペプチドリンカーを介してFcドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第2及び第3のFab分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してFcドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にFcドメインがIgG1のFcドメインである場合、ヒトIgG1ヒンジ領域である。任意選択的に、第1のFab分子のFab軽鎖と第2のFab分子のFab軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
別の一実施態様では、第1及び第3のFab分子は、それぞれFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットのうちの一つのN末端に融合しており、第2のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。このような特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1、第2及び第3のFab分子、第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第1のFab分子は、Fab重鎖のC末端において、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合しており、第3のFab分子はFab重鎖のC末端においてFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合している。このような構成は、図1C及び1F(第3のFab分子が従来のFab分子であり、好ましくは第1のFab分子と同一である特定の実施態様)と、図1J及び1N(第3のFab分子がクロスオーバーFab分子であり、好ましくは第2のFab分子と同一である代替的実施態様)に模式的に示されている。第1及び第3のFab分子は、直接又はペプチドリンカーを介してFcドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第1及び第3のFab分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してFcドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にFcドメインがIgG1のFcドメインである場合、ヒトIgG1ヒンジ領域である。任意選択的に、第1のFab分子のFab軽鎖と第2のFab分子のFab軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
Fab分子がFab重鎖のC末端において免疫グロブリンのヒンジ領域を介してFcドメインのサブユニットの各々のN末端に融合しているT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の構成においては、二つのFab分子、ヒンジ領域及びFcドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はIgGクラスの免疫グロブリンである。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンはIgG1サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはIgG4サブクラスの免疫グロブリンである。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかでは、第1のFab分子のFab軽鎖と第2のFab分子のFab軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。第1及び第2のFab分子の構成に応じて、第1のFab分子のFab軽鎖は、そのC末端において、第2のFab分子のFab軽鎖のN末端に融合しうるか、又は第2のFab分子のFab軽鎖は、そのC末端において、第1のFab分子のFab軽鎖のN末端に融合しうる。第1及び第2のFab分子のFab軽鎖の融合はさらに、マッチしないFab重鎖とFab軽鎖の誤対合を低減し、また本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいくつかの発現に必要なプラスミドの数を低減する。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち、第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含んでいる)、第2のFab分子のFab重鎖定常領域がFcドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2)−CH2−CH3(−CH4))と、第1のFab部分のFab重鎖がFcドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(1)−CH1(1)−CH2−CH3(−CH4))とを含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子がクロスオーバーFab重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている)、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域がFcドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2)−CH2−CH3(−CH4))と、第1のFab分子のFab重鎖がFcドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(1)−CH1(1)−CH2−CH3(−CH4))とを含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち、第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab重鎖定常領域が、第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第1のFab分子のFab重鎖がFcドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(1)−CH1(1)−VH(2)−CH1(2)−CH2−CH3(−CH4))を含む。他の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1のFab分子のFab重鎖が、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち、第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab重鎖定常領域が、Fcドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(1)−CH1(2)−VL(1)−CH1(1)−CH2−CH3(−CH4))を含む。
これら実施態様のいくつかでは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第2のFab分子のクロスオーバーFab軽鎖ポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。これら実施態様のその他では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域が第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2)−VL(1)−CL(1))、又は第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチドが第2のFab分子のFab重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(1)−CL(1)−VH(2)−CL(2))をさらに含む。
これらの実施態様によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子はさらに、(i)Fcドメインのサブユニットポリペプチド(CH2−CH3(−CH4))、又は(ii)第3のFab分子のFab重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Fcドメインのサブユニットと共有するポリペプチド(VH(3)−CH1(3)−CH2−CH3(−CH4))と、第3のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(3)−CL(3))とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち、第2のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域が、第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ端末ペプチド結合を共有し、第1のFab分子のFab重鎖がFcドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(1)−CL(1)−VH(2)−CH1(2)−CH2−CH3(−CH4))を含む。他の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1のFab分子のFab重鎖が、第2のFab分子のFab重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち、第2のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab重鎖定常領域が、Fcドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(1)−CH1(1)−VH(2)−CL(2)−CH2−CH3(−CH4))を含む。
これら実施態様のいくつかでは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が、第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する第2のFab分子のクロスオーバーFab軽鎖ポリペプチド(VL(2)−CH1(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。これら実施態様のその他では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域が第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2)−VL(1)−CL(1))、又は第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチドが第2のFab分子のFab重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(1)−CL(1)−VH(2)−CL(2))をさらに含む。
これらの実施態様によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子はさらに、(i)Fcドメインのサブユニットポリペプチド(CH2−CH3(−CH4))、又は(ii)第3のFab分子のFab重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Fcドメインのサブユニットと共有するポリペプチド(VH(3)−CH1(3)−CH2−CH3(−CH4))と、第3のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(3)−CL(3))とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、第1のFab分子は、Fab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。特定のこのような実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子はFcドメインを含まない。特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に第1及び第2のFab分子から、任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第1のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合する。このような構成は、図1O及び1Sに模式的に示されている。
他の実施態様では、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合する。特定のこのような実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子はFcドメインを含まない。特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に第1及び第2のFab分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第2のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合する。このような構成は、図1P及び1Tに模式的に示されている。
いくつかの実施態様では、第1のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合し、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第3のFab分子をさらに含み、前記第3のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合する。特定のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は従来のFab分子である。他のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ち、Fab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCLとCH1が交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。特定のこのような実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1、第2、及び第3のFab分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第1のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第3のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。このような構成は、図1Q及び1Uに模式的に示されている(第3のFab分子が、従来のFab分子であり、好ましくは第1のFab分子と同一である特定の実施態様)。
いくつかの実施態様では、第1のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合し、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第3のFab分子をさらに含み、前記第3のFab分子はFab重鎖のN末端において第2のFab分子のFab重鎖のC末端に融合する。特定のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。他のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は従来のFab分子である。特定のこのような実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1、第2、及び第3のFab分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第1のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第3のFab分子はFab重鎖のN末端において第2のFab分子のFab重鎖のC末端に融合している。このような構成は、図1W及び1Yに模式的に示されている(第3のFab分子が、クロスオーバーFab分子であり、好ましくは第2のFab分子と同一である特定の実施態様)。
いくつかの実施態様では、第2のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合し、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第3のFab分子をさらに含み、前記第3のFab分子はFab重鎖のN末端において第1のFab分子のFab重鎖のC末端に融合する。特定のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は従来のFab分子である。他のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。特定のこのような実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1、第2、及び第3のFab分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第2のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第3のFab分子はFab重鎖のN末端において第1のFab分子のFab重鎖のC末端に融合している。このような構成は、図1R及び1Vに模式的に示されている(第3のFab分子が、従来のFab分子であり、好ましくは第1のFab分子と同一である特定の実施態様)。
いくつかの実施態様では、第2のFab分子は、Fab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は第3のFab分子をさらに含み、前記第3のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。他のこのような実施態様では、前記第3のFab分子は従来のFab分子である。特定のこのような実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第1、第2、及び第3のFab分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第2のFab分子はFab重鎖のC末端において第1のFab分子のFab重鎖のN末端に融合しており、第3のFab分子はFab重鎖のC末端において第2のFab分子のFab重鎖のN末端に融合している。このような構成は、図1X及び1Zに模式的に示されている(第3のFab分子が、クロスオーバーFab分子であり、好ましくは第1のFab分子と同一である特定の実施態様)。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1のFab分子のFab重鎖が第2のFab分子のFab軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(即ち第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)ポリペプチド(VH(1)−CH1(1)−VL(2)−CH1(2))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab重鎖定常領域が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2)−VH(1)−CH1(1))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2)−VH(1)−CH1(1))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab重鎖が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第1のFab分子のFab重鎖が第2のFab分子のFab軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(即ち第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)ポリペプチド(VH(3)−CH1(3)−VH(1)−CH1(1)−VL(2)−CH1(2))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(3)−CL(3))をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab重鎖が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第1のFab分子のFab重鎖が第2のFab分子のFab重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(即ち第2のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)(VH(3)−CH1(3)−VH(1)−CH1(1)−VH(2)−CL(2)ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(3)−CL(3))をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab重鎖定常領域が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第1のFab分子のFab重鎖が第3のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2)−VH(1)−CH1(1)−VH(3)−CH1(3))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(3)−CL(3))をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第1のFab分子のFab重鎖が第3のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2)−VH(1)−CH1(1)−VH(3)−CH1(3))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(2)−CH1(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(3)−CL(3))をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1のFab分子のFab重鎖が第2のFab分子のFab軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む),第2のFab分子のFab重鎖定常領域が第3のFab分子のFab軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第3のFab分子のFab軽鎖可変領域が第3のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(即ち第3のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)ポリペプチド(VH(1)−CH1(1)−VL(2)−CH1(2)−VL(3)−CH1(3))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab重鎖可変領域が第3のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(3)−CL(3))をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第1のFab分子のFab重鎖が第2のFab分子のFab重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域が第3のFab分子のFab重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第3のFab分子のFab重鎖可変領域が第3のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(即ち第3のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)(VH(1)−CH1(1)−VH(2)−CL(2)−VH(3)−CL(3))ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域(VL(2)−CH1(2))及び第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab軽鎖可変領域が第3のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(VL(3)−CH1(3))ポリペプチドをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab軽鎖可変領域が第3のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第3のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第3のFab分子のFab重鎖定常領域が第2のFab分子のFab軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab重鎖定常領域が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VL(3)−CH1(3)−VL(2)−CH1(2)−VH(1)−CH1(1))を含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(2)−CL(2))と、第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab重鎖可変領域が第3のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド(VH(3)−CL(3))をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab重鎖可変領域が第3のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第3のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第3のFab分子のFab軽鎖定常領域が第2のFab分子のFab重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第2のFab分子のFab重鎖可変領域が第2のFab分子のFab軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し(即ち第2のFab分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーFab重鎖を含む)、第2のFab分子のFab軽鎖定常領域が第1のFab分子のFab重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(VH(3)−CL(3)−VH(2)−CL(2)−VH(1)−CH1(1))ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第2のFab分子のFab軽鎖可変領域が第2のFab分子のFab重鎖定常領域(VL(2)−CH1(2))及び第1のFab分子のFab軽鎖ポリペプチド(VL(1)−CL(1))とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、第3のFab分子のFab軽鎖可変領域が第3のFab分子のFab重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する(VL(3)−CH1(3))ポリペプチドをさらに含む。
上記実施態様のいずれによっても、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分(例えば、Fab分子、Fcドメイン)は、直接融合するか、又は、本明細書に記載されるか若しくは当技術分野で既知である様々なリンカー、特に一又は複数のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されうる。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n又はG4(SG4)nペプチドリンカーが含まれ、ここでnは通常1から10、典型的には2から4の整数である。
Fcドメイン
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン G(IgG)分子のFcドメインはダイマーであり、その各サブユニットはCH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一を超えないFcドメインを含む。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン G(IgG)分子のFcドメインはダイマーであり、その各サブユニットはCH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一を超えないFcドメインを含む。
本発明による一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインはIgG Fcドメインである。特定の一実施態様では、FcドメインはIgG1のFcドメインである。別の実施態様では、FcドメインはIgG4のFcドメインである。さらに詳細な実施態様では、Fcドメインは、S228位(カバット番号付け)にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換S228Pを含む、IgG4のFcドメインである。このアミノ酸置換は、IgG4抗体のin vivoでのFabアーム交換を低減する(Stubenrauch et al.、Drug Metabolism and Disposition 38、84-91(2010)参照)。さらに詳細な実施態様では、Fcドメインはヒトである。ヒトIgG1のFc領域の例示的配列は、配列番号13に提示されている。
ヘテロダイマー化を促すFcドメインの修飾
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した複数の異なるFab分子を含み、したがってFcドメインの二つのサブユニットは、通常二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組み換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成におけるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインに所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した複数の異なるFab分子を含み、したがってFcドメインの二つのサブユニットは、通常二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらのポリペプチドの組み換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成におけるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインに所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
即ち、特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、Fcドメインの第1及び第2のサブユニットの会合を促す修飾を含んでいる。ヒトIgGのFcドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、FcドメインのCH3ドメインである。したがって、一実施態様では、前記修飾はFcドメインのCH3ドメイン内で行われる。
ヘテロダイマー化を実施するために、FcドメインのCH3ドメインにおける修飾のための複数の手法が存在し、それらについては例えば国際公開第96/27011号、国際公開第98/050431号、EP1870459、国際公開第2007/110205号、国際公開第2007/147901号、国際公開第2009/089004号、国際公開第2010/129304号、国際公開第2011/90754号、国際公開第2011/143545号、国際公開第2012058768号、国際公開第2013157954号、国際公開第2013096291号に詳細な記載がある。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン及びFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインは共に、各CH3ドメイン(又はそれを含む重鎖)がそれ自体ともはやホモダイマー化することがなく、相補的に改変された他のCH3ドメインとヘテロダイマー化するように、(よって第1と第2のCH3ドメインがヘテロダイマー化し、二つの第1のCH3ドメイン又は二つの第2のCH3ドメインの間にホモダイマーが形成されないように)共に相補的に改変される。重鎖ヘテロダイマー化の改善のためのこれら異なる手法は、軽鎖誤対合及びBence Jones型副生成物を低減する本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子における、重鎖−軽鎖修飾(一の結合アームにおけるVHとVLの交換/置き換えと、CH1/CL接触面における、反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入)と組み合わせた異なる代替法として考慮される。
特定の一実施態様では、Fcドメインの第1及び第2のサブユニットの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ−イントゥ−ホール(knob−into−hole)」修飾であり、Fcドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Fcドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第5731168号;同第7695936号;Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第1のポリペプチドの接触面に隆起(「ノブ」)を、及び第2のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロダイマー形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第1のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖(例えば、チロシン又はトリプトファン)で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)で置き換えることにより、第2のポリペプチドの接触面に作り出される。
このように、特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
好ましくは、大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、及びトリプトファン(W)からなる群より選択される。
好ましくは、小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、及びバリン(V)からなる群より選択される。
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
特定の実施態様では、Fcドメインの第1のサブユニット(「ノブ」サブユニット)のCH3ドメインにおいて、366位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ(T366W)、Fcドメインの第2のサブユニット(「ホール」サブユニット)のCH3ドメインにおいて、407位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる(Y407V)。一実施態様では、Fcドメインの第2のサブユニットにおいてさらに、366位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ(T366S)、368位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる(L368A)(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
さらなる実施態様ではFcドメインの第1のサブユニットにおいてさらに、354位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる(S354C)か、又は356位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ(E356C)、Fcドメインの第2のサブユニットにおいてさらに、349位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる(Y349C)(Kabat EUインデックスによる番号付け)。これら二つのシステイン残基の導入により、Fcドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらにダイマーを安定させる(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
特定の一実施態様では、Fcドメインの第1のサブユニットは、アミノ酸置換S354C及びT366Wを含み、Fcドメインの第2のサブユニットは、アミノ酸置換Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
特定の一実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合するFab分子は、(任意選択的に標的細胞抗原に特異的に結合するFab分子を介して)Fcドメインの第1のサブユニット(「ノブ」修飾を含む)に融合する。理論に縛られることを望まないが、T細胞活性化抗原に特異的に結合するFab分子の、Fcドメインのノブ含有サブユニットに対する融合は、(さらに)T細胞活性化抗原に結合する二つのFab分子を含む抗原結合分子の生成を最小化する(二つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突)。
ヘテロダイマー化を実施するためのCH3修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮され、例えば国際公開第96/27011号、国際公開第98/050431号、EP1870459、国際公開第2007/110205号、国際公開第2007/147901号、国際公開第2009/089004号、国際公開第2010/129304号、国際公開第2011/90754号、国際公開第2011/143545号、国際公開第2012/058768号、国際公開第2013/157954号、国際公開第2013/096291号に記載されている。
一実施態様では、EP1870459に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。この手法は、Fcドメインの二つのサブユニット間のCH3/CH3ドメイン接触面内の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づいている。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一の好ましい実施態様は、(Fcドメインの)二つのCH3ドメインの一方におけるアミノ酸変異体R409D;K370E及びFcドメインのCH3ドメインの他方におけるアミノ酸変異体D399K;E357Kである(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
別の実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン内にアミノ酸変異T366Wを、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメイン内にアミノ酸変異T366S、L368A、Y407Vを含み、さらにはFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン内にアミノ酸変異R409D;K370Eを、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメイン内にアミノ酸変異D399K;E357Kを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
別の実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸変異S354C、T366W、及びFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸変異Y349C、T366S、L368A、Y407Vを含むか、又は前記T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸変異Y349C、T366W及びFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸変異S354C、T366S、L368A、Y407Vと、さらにFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸変異R409D;K370E及びFcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメイン内のアミノ酸変異D399K;E357Kを含む(すべてKabat EUインデックスによる番号付け)。
一実施態様では、国際公開第2013/157953号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異T366Kを含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸変異L351Dを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。さらなる実施態様では、第1のCH3ドメインはさらなるアミノ酸変異L351Kを含む。さらなる実施態様では、第2のCH3ドメインは、Y349E、Y349D及びL368Eより選択されるアミノ酸変異(好ましくはL368E)をさらに含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
一実施態様では、国際公開第2012/058768号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異L351Y、Y407Aを含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸変異T366A、K409Fを含む。さらなる一実施態様では、第2のCH3ドメインは、T411、D399、S400、F405、N390、又はK392の位置に、例えばa)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E又はT411W、b)D399R、D399W、D399Y又はD399K、c)S400E、S400D、S400R、又はS400K、d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V又はF405W、e)N390R、N390K又はN390D、f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F又はK392Eから選択される、さらなるアミノ酸変異を含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。さらなる一実施態様では、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異L351Y、Y407Aを含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸変異T366V、K409Fを含む。さらなる一実施態様では、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異Y407Aを含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸変異T366A、K409Fを含む。さらなる一実施態様では、第2のCH3ドメインは、アミノ酸変異K392E、T411E、D399R及びS400Rをさらに含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
一実施態様では、例えば368及び409からなる群より選択される位置にアミノ酸修飾を用いる、国際公開第2011/143545号に記載されたヘテロダイマー化の手法が代替的に使用される(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
一実施態様では、上述のノブ・イントゥ・ホール技術をやはり使用する、国際公開第2011/090762号に記載されるヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異T366Wを含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸変異Y407Aを含む。一実施態様では、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異T366Yを含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸変異Y407Tを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はそのFcドメインはIgG2サブクラスであり、国際公開第2010/129304号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。
代替的な一実施態様では、Fcドメインの第1及び第2のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第2009/089004号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロダイマー化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのFcドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。このような一実施態様では、第1のCH3ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸(例えばグルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)、好ましくはK392D又はN392D)でのK392又はN392のアミノ酸置換を含み、第2のCH3ドメインは、正の電荷を有するアミノ酸(例えばリジン(K)又はアルギニン(R)、好ましくはD399K、E356K、D356K、又はE357K、さらに好ましくはD399K及びE356K)でのD399、E356、D356、又はE357アミノ酸の置換を含む。さらなる一実施態様では、第1のCH3ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸(例えばグルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)、好ましくはK409D又はR409D)でのK409又はR409のアミノ酸置換をさらに含む。さらなる一実施態様では、第1のCH3ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸(例えばグルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D))でのK439及び/又はK370のアミノ酸置換を、さらに又は代替的に含む(すべてKabat EUインデックスによる番号付け)。
またさらなる一実施態様では、国際公開第2007/147901号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第1のCH3ドメインはアミノ酸変異K253E、D282K、及びK322Dを含み、第2のCH3ドメインはアミノ酸変異D239K、E240K、及びK292Dを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
また別の実施態様では、国際公開第2007/110205号に記載されたヘテロダイマー化手法を代替的に使用することができる。
一実施態様では、Fcドメインの第1のサブユニットは、アミノ酸置換K392D及びK409Dを含み、Fcドメインの第2のサブユニットは、アミノ酸置換D356K及びD399Kを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
Fc受容体の結合及び/又はエフェクター機能を低減するFcドメインの修飾
Fcドメインは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Fcドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Fc受容体を発現する細胞へのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくないターゲティングの原因となりうる。さらには、Fc受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となりえ、サイトカイン放出は、T細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性をを引き起こしうる。T細胞以外の(Fc受容体保有)免疫細胞の活性化は、例えばNK細胞によるT細胞の破壊の可能性により、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性をさらに低下させることすらある。
Fcドメインは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Fcドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Fc受容体を発現する細胞へのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の望ましくないターゲティングの原因となりうる。さらには、Fc受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となりえ、サイトカイン放出は、T細胞活性化特性及び抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性をを引き起こしうる。T細胞以外の(Fc受容体保有)免疫細胞の活性化は、例えばNK細胞によるT細胞の破壊の可能性により、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効性をさらに低下させることすらある。
したがって、特定の実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、天然のIgG1のFcドメインと比較して、Fc受容体に対する結合親和性の低下及び/又はエフェクター機能の低下を呈する。このような一実施態様では、Fcドメイン(又は前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)は、天然のIgG1 Fcドメイン(又は天然のIgG1 Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)と比較して、50%未満、好ましくは20%未満、さらに好ましくは10%未満、及び最も好ましくは5%未満の、Fc受容体に対する結合親和性を呈する、及び/又は、天然のIgG1 Fcドメイン(又は天然のIgG1 Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)と比較して、50%未満、好ましくは20%未満、さらに好ましくは10%未満、及び最も好ましくは5%未満の、エフェクター機能を呈する。一実施態様では、Fcドメイン(又は前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)は、Fc受容体に実質的に結合しない、及び/又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様では、Fc受容体はFcγ受容体である。一実施態様では、Fc受容体はヒトFc受容体である。一実施態様では、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の一実施態様では、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体であり、具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRI又はFcγRIIa、さらに具体的にはヒトFcγRIIIaである。一実施態様では、エフェクター機能は、CDC、ADCC、ADCP、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はADCCである。一実施態様では、Fcドメインは、天然 IgG1 Fcドメインと比較して実質的に同様の、新生児Fc受容体(FcRn)に対する結合親和性を呈する。実質的に同様のFcRnに対する結合は、Fcドメイン(又は前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)が、天然IgG1 Fcドメイン(又は天然IgG1 Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)の約70%、特に約80%、さらには特に約90%を上回る、FcRnに対する結合親和性を呈するとき、達成される。
特定の実施態様では、Fcドメインは、非改変型Fcドメインと比較して小さな、Fc受容体に対する結合親和性及び/又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、FcドメインのFc受容体に対する結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がFcドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はFcドメインのFc受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、FcドメインのFc受容体に対する結合親和性を、少なくとも2分の1、少なくとも5分の1、又は少なくとも10分の1に低下させる。FcドメインのFc受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらアミノ酸変異の組合せにより、FcドメインのFc受容体に対する結合親和性が、少なくとも10分の1、少なくとも20分の1、又は少なくとも50分の1まで低下する。一実施態様では、改変されたFcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、非改変型Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と比較して、20%未満、特に10%未満、さらには5%未満のFc受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様では、Fc受容体はFcγ受容体である。いくつかの実施態様では、Fc受容体はヒトFc受容体である。いくつかの実施態様では、Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の一実施態様では、Fc受容体は活性化ヒトFcγ受容体であり、具体的にはヒトFcγRIIIa、FcγRI又はFcγRIIa、さらに具体的にはヒトFcγRIIIaである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にC1qに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Fc受容体(FcRn)に対する結合親和性は低減しない。FcRnに対する実質的に同様の結合、即ち、前記受容体に対するFcドメインの結合親和性の保存は、Fcドメイン(又は前記Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)が、Fcドメインの非改変型形態(又はFcドメインの前記非改変型形態を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)のFcRnに対する結合親和性の約70%を上回る親和性を呈するとき、達成される。Fcドメイン、又は前記Fcドメインを含む本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約80%、及び場合によっては約90%を上回る親和性を呈しうる。特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、非改変型Fcドメインと比較してエフェクター機能が低下するように改変される。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害(CDC)の低減、抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害(ADCC)の低減、抗体依存性細胞貪食(ADCP)の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、NK細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はT細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、CDCの低減、ADCCの低減、ADCPの低減、及びサイトカイン分泌の低減からなる群より選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低下はADCCの低減である。一実施態様では、低減したADCCは、非改変型Fcドメイン(又は非改変型Fcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子)によって誘導されるADCCの20%未満である。
一実施態様では、FcドメインのFc受容体に対する結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Fcドメインは、E233、L234、L235、N297、P331及びP329の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。具体的な実施態様では、Fcドメインは、L234、L235及びP329の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。いくつかの実施態様では、Fcドメインは、アミノ酸置換L234A及びL235Aを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。このような一実施態様では、FcドメインはIgG1のFcドメイン、特にヒトIgG1のFcドメインである。一実施態様では、FcドメインはP329の位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、アミノ酸置換はP329A又はP329G、特にP329Gである(Kabat EUインデックスによる番号付け)。一実施態様では、Fcドメインは、P329の位置にアミノ酸置換を、E233、L234、L235、N297及びP331から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D又はP331Sである。特定の実施態様では、Fcドメインは、P329、L234及びL235の位置にアミノ酸置換を含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。さらに詳細な実施態様では、Fcドメインは、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(「P329G LALA」)を含む。このような一実施態様では、FcドメインはIgG1のFcドメイン、特にヒトIgG1のFcドメインである。アミノ酸置換の「P329G LALA」の組合せは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる国際公開第2012/130831号に記載のように、ヒトIgG1 FcドメインのFcγ受容体(並びに補体)結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第2012/130831号には、このような変異Fcドメインを調製する方法、及びFc受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
IgG4抗体は、IgG1抗体と比較して、Fc受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。よって、いくつかの実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFcドメインは、IgG4のFcドメイン、特にヒトIgG4Fcドメインである。一実施態様では、IgG4 Fcドメインは、S228位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228Pを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。Fc受容体に対するその結合親和性及び/又はそのエフェクター機能をさらに低下させるために、一実施態様では、IgG4Fcドメインは、L235位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換L235Eを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。別の実施態様では、IgG4 Fcドメインは、P329位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換P329Gを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。特定の実施態様では、IgG4 Fcドメインは、S228、L235及びP329位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228P、L235E及びP329Gを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。このようなIgG4 Fcドメインの変異及びそれらのFcγ受容体結合特性は、国際公開第2012/130831号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
特定の実施態様では、天然のIgG1 Fcドメインと比較してFc受容体に対する結合親和性の低下及び/又はエフェクター機能の低下を呈するFcドメインは、アミノ酸置換L234A、L235A及び任意選択的にP329Gを含むヒトIgG1 Fcドメインであるか、又はアミノ酸置換S228P、L235E及び任意選択的にP329Gを含むヒトIgG4 Fcドメインである(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
特定の実施態様ではFcドメインのNグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、FcドメインはN297位におけるアミノ酸置換、特にアラニン(N297A)又はアスパラギン酸(N297D)酸によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)。
本明細書及び国際公開第2012/130831号において記載されるFcドメインに加えて、Fc受容体結合及び/又はエフェクター機能の低下を有するFcドメインは、Fcドメイン残基238、265、269、270、297、327及び329の一又は複数の置換を有するものも含む(米国特許第6737056号)(Kabat EUインデックスによる番号付け)。そのようなFc変異体は、残基265及び297のアラニンへの置換を有するいわゆる「DANA」Fc突然変異体を含め、アミノ酸位265、269、270、297、及び327のうちの二以上に置換を有するFc突然変異体を含む(米国特許第7332581号)。
変異Fcドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化DNA配列の部位特異的突然変異、PCR、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
Fc受容体に対する結合は、例えばELISAにより、又はBIAcore器具(GE Healthcare)のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)により容易に決定することができ、このようなFc受容体は組み換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Fcドメイン、又はFcドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のFc受容体に対する結合親和性は、特定のFc受容体を発現することが知られている細胞株、例えばFcγIIIa受容体を発現するヒトNK細胞を用いて評価してもよい。
Fcドメイン、又はFcドメインを含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ADCCを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のADCC活性を評価するためのin vitroアッセイの他の例が、米国特許第5500362号;Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985);米国特許第5821337号;Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる(例えば、フローサイトメトリー用のACTITM非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology,Inc. Mountain View,CA);及びCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ(Promega,Madison,WI)。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞を含む。或いは又は加えて、目的の分子のADCC活性は、Clynes et al.、PNAS USA 95:652-656(1998)に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、in vivoで評価することができる。
いくつかの実施態様では、補体成分に対するFcドメインの結合、特にC1qに対する結合が低減する。したがって、Fcドメインがエフェクター機能が低下するように改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はCDCの低下を含む。C1q結合アッセイが、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子がC1qに結合できるかどうか、それによりCDC活性を有するかどうかを決定するために実行されうる。例えば国際公開第2006/029879号及び国際公開第2005/100402号のC1q及びC3c結合ELISAを参照のこと。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる(例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、即ち二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも二つの抗原結合部分を含む。本発明の特定の実施態様によれば、抗原結合部分はFab分子(即ち、各々が可変及び定常領域を含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン)である。一実施態様では、前記Fab分子はヒトである。別の実施態様では、前記Fab分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Fab分子はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、即ち二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができる少なくとも二つの抗原結合部分を含む。本発明の特定の実施態様によれば、抗原結合部分はFab分子(即ち、各々が可変及び定常領域を含む重鎖と軽鎖とからなる抗原結合ドメイン)である。一実施態様では、前記Fab分子はヒトである。別の実施態様では、前記Fab分子はヒト化されている。また別の実施態様では、前記Fab分子はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも一つはクロスオーバーFab分子である。このような修飾は、異なるFab分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を減少させ、それにより組み換え生成において本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分に有用な特定のクロスオーバーFab分子では、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメイン(それぞれVL及びVH)が交換されている。しかしながら、このようなドメイン交換によっても、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合した重鎖と軽鎖間のいわゆるBence Jones型相互作用に起因する特定の副生成物を含みうる(Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191参照)。異なるFab分子由来の重鎖と軽鎖の誤対合をさらに減少させ、したがって所望のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を向上させるために、本発明により、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、標的細胞抗原に特異的に結合するFab分子(複数可)又はT細胞活性化抗原に特異的に結合するFab分子のCH1及びCLドメイン中の特定のアミノ酸位置に導入することができる。荷電修飾は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のFab分子(複数可)(例えば図1A−C、G−Jに示すような)、又はT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるVH/VLクロスオーバーFab分子(複数可)(例えば図1D−F、K−Nに示すような)において行われる(但し両方で行われることはない)。特定の実施態様では、荷電修飾は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のFab分子(複数可)(特定の実施態様においては標的細胞抗原に特異的に結合するもの)において行われる。
本発明による特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に腫瘍細胞抗原とT細胞活性化抗原、特にCD3に同時結合することができる。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原とT細胞活性化抗原に同時結合することにより、T細胞と標的細胞を架橋することができる。さらに詳細な実施態様では、このような同時結合は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様では、このような同時結合は、T細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、このような同時結合は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び発現の群から選択される、T リンパ球、特に細胞傷害性Tリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様では、標的細胞への同時結合を含まないT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のT細胞活性化抗原、特にCD3に対する結合は、T細胞の活性化を引き起こさない。
一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞の細胞傷害活性を標的細胞へ再方向付けすることができる。特定の一実施態様では、前記再方向付けは、標的細胞によるMHC媒介性ペプチド抗原の提示及び/又はT細胞の特異性と無関係である。
特に、本発明の実施態様のいずれかによるT細胞は、細胞傷害性T細胞である。いくつかの実施態様では、T細胞はCD4+又はCD8+ T細胞、特にCD8+ T細胞である。
T細胞活性化抗原結合部分
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にFab分子(本明細書では「T細胞活性化抗原結合部分又はT細胞活性化抗原結合Fab分子」とも呼ぶ)を含む。特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に対する特異的結合能を有する一を超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に対する一価の結合を提供する。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にFab分子(本明細書では「T細胞活性化抗原結合部分又はT細胞活性化抗原結合Fab分子」とも呼ぶ)を含む。特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に対する特異的結合能を有する一を超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化抗原に対する一価の結合を提供する。
特定の実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。このような実施態様では、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分(複数可)は、好ましくは従来のFab分子である。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に特異的に結合する一を超える抗原結合部分、特にFab分子が存在する実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は好ましくはクロスオーバーFab分子であり、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分は従来のFab分子である。
代替的な実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分は従来のFab分子である。このような実施態様では、標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分(複数可)は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。
特定の一実施態様では、T細胞活性化抗原は、CD3、特にヒトCD3(配列番号1)又はカニクイザルCD3(配列番号2)、さらに詳細にはヒトCD3である。特定の実施態様では、T細胞活性化抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのCD3に交差反応性である(即ち、特異的に結合する)。いくつかの実施態様では、T細胞活性化抗原は、CD3のエプシロンサブユニット(CD3エプシロン)である。
いくつかの実施態様では、T細胞活性化抗原結合部分は、CD3、特にCD3エプシロンに特異的に結合し、配列番号4、配列番号5及び配列番号6からなる群よ要り選択される少なくとも一の重鎖相補性決定領域(CDR)と、配列番号8、配列番号9、配列番号10の群より選択される少なくとも一の軽鎖CDRとを含む。
特定の実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号4の重鎖CDR1、配列番号5の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号8の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2、及び配列番号10の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む。
別の実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号4の重鎖CDR1、配列番号32の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号33の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2、及び配列番号10の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む。
特定の実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号3と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖可変領域配列と、配列番号7と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
一実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
一実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号3の重鎖可変領域配列と、配列番号7の軽鎖可変領域配列とを含む。
他の実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号34と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖可変領域配列と、配列番号35と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
一実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
一実施態様では、CD3結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号39の重鎖可変領域配列と、配列番号40の軽鎖可変領域配列とを含む。
標的細胞抗原結合部分
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリン(標的細胞抗原)に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にFab分子を含む。特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する二の抗原結合部分、特にFab分子を含む。このような特定の一実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。さらに詳細な実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一であり、即ちそれらは、本明細書に記載されるようにCH1及びCLドメイン内に同じアミノ酸置換を含む(もしあれば)同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する二を超えない抗原結合部分、特にFab分子を含む。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリン(標的細胞抗原)に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にFab分子を含む。特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する二の抗原結合部分、特にFab分子を含む。このような特定の一実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。さらに詳細な実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一であり、即ちそれらは、本明細書に記載されるようにCH1及びCLドメイン内に同じアミノ酸置換を含む(もしあれば)同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、メソテリンに特異的に結合する二を超えない抗原結合部分、特にFab分子を含む。
特定の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分(複数可)は、従来のFab分子である。このような実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分(複数可)は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。
代替的実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分(複数可)は、本明細書に記載されるクロスオーバーFab分子、即ちFab重鎖と軽鎖の可変ドメインVHとVL又は定常ドメインCH1とCLが交換されている/互いによって置き換えられているFab分子である。このような実施態様では、T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分(複数可)は従来のFab分子である。
メソテリン結合部分は、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を標的部位へと、例えばメソテリンを発現する特殊な腫瘍細胞へと方向付けることができる。
特定の一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号14の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号15の重鎖CDR2、及び配列番号16の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む。さらなる特定の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号20の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号21の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域とを含む。さらなる特定の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する結合抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号20の重鎖可変領域配列と、配列番号21の軽鎖可変領域配列とを含む。特定の一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号22の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチド、配列番号23の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチド、配列番号24の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチド、及び配列番号25の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチドとを含む。さらなる特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号22のポリペプチド配列、配列番号23のポリペプチド配列、配列番号24のポリペプチド配列及び配列番号25のポリペプチド配列を含む。
別の実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号28の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号29の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域とを含む。さらなる一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号28の重鎖可変領域配列と、配列番号29の軽鎖可変領域配列とを含む。一実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号24の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチド、配列番号38の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチド、配列番号39の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチド、及び配列番号40の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、配列番号24のポリペプチド配列、配列番号38のポリペプチド配列、配列番号39のポリペプチド配列及び配列番号40のポリペプチド配列を含む。
またさらなる一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号30の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である重鎖可変領域と、配列番号31の配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である軽鎖可変領域とを含む。またさらなる一実施態様では、メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分、特にFab分子は、配列番号30の重鎖可変領域配列と、配列番号31の軽鎖可変領域配列とを含む。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
本発明はさらに、本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数(例えば、二以上)のポリヌクレオチドとして発現されうる。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的T細胞活性化二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、Fab分子の軽鎖は、Fab分子の重鎖、Fcドメインのサブユニット及び任意選択的に別のFab分子(の一部)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてよい。同時発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合してFab分子を形成する。別の例では、二つのFcドメインサブユニットの一方び任意選択的に一又は複数のFab分子(の一部)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分は、二つのFcドメインサブユニットの他方及び任意選択的にFab分子(の一部)を含むT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、Fcドメインサブユニットは会合してFcドメインを形成する。
いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はDNAである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)の形態の、RNAである。本発明のRNAは単鎖又は二本鎖である。
組み換え法
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固体相合成)又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルとともに、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitroでの組み換えDNA技術、合成技術及びin vivoでの組み換え/遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(即ち、コード化領域)が、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の調節配列と結合するときである。(ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような)二つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び二つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNA鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロン−Aと連動した即初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)、及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルスなど)が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン)を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素(特に、配列内リボソーム進入部位、又はCITE配列とも呼ばれるIRES)が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び/又はレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)又はアデノ随伴ウイルス(AAV)の末端反転型配列(ITR)などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固体相合成)又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルとともに、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitroでの組み換えDNA技術、合成技術及びin vivoでの組み換え/遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(即ち、コード化領域)が、プロモーター及び/又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の(異なる)ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の調節配列と結合するときである。(ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような)二つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び二つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNA鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロン−Aと連動した即初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)、及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルスなど)が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン)を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素(特に、配列内リボソーム進入部位、又はCITE配列とも呼ばれるIRES)が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び/又はレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)又はアデノ随伴ウイルス(AAV)の末端反転型配列(ITR)などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合させることができる。例えば、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするDNAが、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするために使用されうる(例えば、ヒスチジンタグ)又はT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列をコードするDNAは、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子(断片)をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。
さらなる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされている)。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するよう改変できるいずれかの種類の細胞系を指す。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004),及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。(グリコシル化)ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物(無脊椎動物と脊椎動物)から派生している。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第5959177号、第6040498号、第6420548号、第7125978号及び第6417429号(トランスジェニック植物における抗体生成に関するPLANTIBODIESTM技術を記載)を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40(COS−7)で形質転換されたサル腎臓CV1株、ヒト胚腎臓株(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977))に記載された293細胞又は293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスのセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるTM4細胞)、サル腎細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76)、ヒト子宮頚癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(HepG2)、マウス乳腺腫瘍細胞(MMT060562)、(例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される)TRI細胞、MRC5細胞、及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、dhfr−CHO細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));及びYO、NS0、P3X63及びSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞を含み、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞、又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方も発現するように改変することができる。
一実施態様において、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、本明細書に与えられるように、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、宿主細胞(又は宿主細胞培地)からT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収することとを含む。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の成分は、通常互いに融合している。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
特定の実施態様では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Harlow and Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照)。非天然に存在する抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組み換え的に生成されるか(例えば米国特許第4186567号に記載のように)、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング(例えばMcCaffertyの米国特許第5969108号を参照)によって得ることができる。
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる(例えばWinterの米国特許第5565332号を参照)。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、(a)非ヒト(例えば、ドナー抗体)のCDRを、重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの)の保持を伴う又は伴わないヒト(例えば、レシピエント抗体)のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、(b)非ヒト特異性決定領域(SDR又はa−CDR;抗体−抗原相互作用に重要な残基)のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「覆い隠す(cloaking)」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説があり、さらに、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989);米国特許第5821337号、同第7527791号、同第6982321号、及び同第7087409号;Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)(SDR(a−CDR)移植術について記載);Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)(「リサーフェイシング」について記載);Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)(「FRシャフリング」について記載);及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)(FRシャフリングに対する「ガイド付き選択」アプローチについて記載)に概説がある。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照)。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる(例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照)。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる(例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)参照)。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Fv(scFv)断片、又はFab断片として表示する。
特定の実施態様では、本発明において有用な抗原結合部分は、例えば米国特許出願公開第2004/0132066号(この全内容を参照によってここに援用する)に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように改変される。特定の抗原決定基に結合する本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術(BIAcoreT100システムで解析される)(Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000))及び古典的な結合アッセイ(Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002))によって測定することができる。競合アッセイを、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定するため、例えばCD3への結合についてV9抗体と競合する抗体を同定するために使用することができる。特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ(例えば直鎖状又は立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris (1996)“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化抗原(例えばCD3)は、抗原に結合する第一の標識された抗体(例えばV9抗体、米国特許第6054297号に記載)、及び抗原への結合について第一の抗体と競合するその能力について試験される第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二の抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第一の標識された抗体を含むが第二の未標識抗体は含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗体が、抗原への結合において第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
本明細書で記載のように調製されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインA又はプロテインGを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインA又はGアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるようにT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を単離するために使用されうる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、インタクトで、且つSDS−PAGEの低減により実証されるように適切に構築されていることが示された(図3参照)。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の軽鎖、重鎖、及び重鎖/軽鎖融合タンパク質の予測される分子量に対応する、概ねMr25000、Mr50000及びMr75000における三つの帯域が分離された。
アッセイ
本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされる。
本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされる。
アフィニティーアッセイ
Fc受容体又は標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、BIAcore機器(GE Healthcare)のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ(SPR)により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
Fc受容体又は標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、BIAcore機器(GE Healthcare)のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ(SPR)により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、評価することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的で例示的な実施態様は、後述及び以下の実施例に記載されている。
一実施態様によれば、KDは、25 ℃でBIACORE(登録商標)T100マシン(GE Healthcare)を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
Fc部分とFc受容体との相互作用を分析するために、Hisタグを付した組み換えFc受容体を、CM5チップ上に固定化された抗ペンタHis抗体(Qiagen)により捕捉し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5,GE Healthcare)を、供給業者の指示書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗Penta−His抗体を、10mM酢酸ナトリウム(pH5.0)で40μg/mlに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ6500反応単位(RU)を達成するために5μl/分の流速で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入する。その後、Fc受容体を4又は10nMで60秒間捕捉する。反応速度測定のため、二重特異性コンストラクトの4倍の連続希釈物(500nM〜4000nMの)を、25 ℃のHBS−EP(GE Healthcare、10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05 %のSurfactant P20、pH 7.4)に流速30μl/分で120秒間注入する。
標的抗原に対する親和性を決定するため、二重特異性コンストラクトを、抗Penta−His抗体について記載したように、活性化されたCM5−センサーチップ表面上に固定化された抗ヒトFab特異性抗体(GE Healthcare)により捕捉する。結合したタンパク質の最終的な量は、約12000RUである。二重特異性コンストラクトは、300nMで90秒間捕捉される。標的抗原は、流速30μl/分且つ濃度範囲250〜1000nMでフローセルに180秒間通過させる。解離を180秒間モニタする。
バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正される。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線適合により解離定数KDを得た。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)T100 Evaluation Softwareバージョン1.1.1)を用いて、会合速度(kon)と解離速度(koff)を算出する。平衡解離定数(KD)はkoff/kon比として算出される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。
活性のアッセイ
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、T細胞の増殖の誘導、T細胞中のシグナル伝達の誘導、T細胞中の活性マーカーの発現の誘導、T細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び/又は生存率の改善が含まれる。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、T細胞の増殖の誘導、T細胞中のシグナル伝達の誘導、T細胞中の活性マーカーの発現の誘導、T細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び/又は生存率の改善が含まれる。
投与の組成、製剤、及び経路
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも一の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも一の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
さらには、in vivoでの投与に適した形態の、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、(a)本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を得ること、及び(b)少なくとも一の薬学的に許容される担体を用いてT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を製剤化することであって、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の調製物が、in vivoでの投与のために製剤化される、製剤化することを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された一又は複数のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、即ち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990(参照により本明細書に包含される)によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)への投与のために、調製物は、FDA Office of Biological Standards又は他の国の対応する官庁によって必要とされる無菌状態、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさねばならない。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、当技術者に既知のように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、それらの類似物質及び組合せが含まれる(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照(参照により本明細書に包含される)。いずれの一般的な担体も、活性成分と不適合でない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考慮される。
組成物は、それが固体、液体、又はエアロゾルの形態で投与されるかどうかに応じて、及びそれが注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子(及び任意の追加的治療剤)は、当業者に既知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所内、局部内に、吸入(例えば、エアロゾル吸入)、注射、注入、連続的注入、標的細胞を直接浸す局所的かん流により、カテーテル経由で、洗浄により、クリームで、脂質組成物(例えば、リポソーム)で、又は他の方法、又は上記のいずれかの組合せで投与することができる。(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990参照(参照により本明細書に包含される)。非経口投与、特に静脈内注入が、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び/又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的には、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び/又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全レベル、例えばタンパク質1mgあたり0.5ng未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが;リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−(メチルメタクリレート(methylmethacylate))マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム(例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。持続放出性調製物が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
上記の組成物に加えて、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植込(implantation)(例えば、皮下又は筋肉内)により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性又は疎水性物質(例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての)又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基;又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
治療的方法及び組成物
本明細書において提供されるいずれのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用することができる。
本明細書において提供されるいずれのT細胞活性化二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用することができる。
治療法において使用される場合、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、医学行動の規範に則って製剤化、投薬、及び投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
一態様では、医薬としての使用のための本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療において使用される本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療法において使用される本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、治療的有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、疾患を有する個体に投与することを含む、個体の治療法において使用されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患は、がんである。特定の実施態様では、方法はさらに、個体に対し、治療的有効量の少なくとも一の追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合抗がん剤を投与することを含む。さらなる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用される、本明細書に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与することを含む、個体の標的細胞、特に細胞の溶解を誘導する方法に使用されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。さらなる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に対し、治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用を目的としている。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患は、がんである。一実施態様では、方法はさらに、個体に対し、治療的有効量の少なくとも一の追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合抗がん剤を投与することを含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる実施態様では、医薬は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために有効量の医薬を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用を目的とする。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
さらなる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのような疾患を有する個体に対し、治療的有効量の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患は、がんである。特定の実施態様では、方法はさらに、個体に対し、治療的有効量の少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合抗がん剤を投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、T細胞、特に細胞傷害性T細胞の存在下において、標的細胞を、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む。さらなる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対し、有効量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺(副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺)、眼、頭部及び頸部、神経系(中枢及び末梢)、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、膀胱がん、子宮頸がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭頸部がん、中皮腫、及び卵巣がんからなる群より選択される。一実施態様において、がんは卵巣がんである。一実施態様では、がんは中皮腫である。当業者は、多くの場合T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを認識する。いくつかの実施態様では、いくつかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらすT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする被検体、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
いくつかの実施態様では、有効量の本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は(単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの)、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、直前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及びT細胞活性化二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。投与の責任を負う施術者は、いずれにしろ、組成物中の活性成分の濃度及び個別の対象に適切な用量を決定する。限定されないが、様々な時点にわたる、単一回又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0.1mg/kg〜10mg/kg)のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日あたり用量は、上記要因に応じて約1μg/kg〜100mg/kg又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の一つの例示的用量は、約0.005mg/kg〜約10mg/kgであろう。他の非限定的実施例では、用量は、一回の投与につき、体重1kgあたり約1マイクログラム、体重1kgあたり約5マイクログラム、体重1kgあたり約10マイクログラム、体重1kgあたり約50マイクログラム、体重1kgあたり約100マイクログラム、体重1kgあたり約200マイクログラム、体重1kgあたり約350マイクログラム、体重1kgあたり約500マイクログラム、体重1kgあたり約1ミリグラム、、体重1kgあたり約5ミリグラム、体重1kgあたり約10ミリグラム、体重1kgあたり約50ミリグラム、体重1kgあたり約100ミリグラム、体重1kgあたり約200ミリグラム、体重1kgあたり約350ミリグラム、体重1kgあたり約500ミリグラム、体重1kgあたり約1000mg以上及びそこで導かれるあらゆる範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重1kgあたり約5mg〜体重1kgあたり約100mg、体重1kgあたり約5マイクログラム〜体重1kgあたり約500ミリグラムなどが投与されうる。したがって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg又は10mg/kgの一又は複数の用量(又はこれらのいずれかの組み合わせ)を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は3週毎(例えば患者が約2〜約20投与量、又は例えば約6投与量のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を受けるように)投与してよい。初期の高負荷用量の後、一又は複数の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量レジメンも有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなin vitroアッセイに基づいて推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるIC50を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
初期投与量は、in vivoデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分なT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約0.1〜50mg/kg/日、典型的には約0.5〜1mg/kg/日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばHPLCにより測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、通常、実質的な毒性なしで治療的恩恵を提供する。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、LD50(集団の50%を死に至らしめる用量)及びED50(集団の50%において治療的に有効な用量)を決定するために使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比LD50/ED50と表現することができる。大きな治療指数を呈するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く有さないED50を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる(例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献は参照により本明細書に包含される)。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には(毒性なしで)、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。さらに、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動するであろう。
その他の薬剤及び治療
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一の追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一の追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上述した他の要因によって決まる。T細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された投与量の1%〜99%で、又は経験的に/臨床的に妥当であると決定された任意の投与量で任意の経路により使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与(二以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている)、及び本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び/又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び/又は投与の後に起こりうる分離投与を包含する。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び/又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる(例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性な薬剤は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、(a)本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に含む第一の容器;及び(b)さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物を中に含む第2の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の材料をさらに含んでもよい。
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び/又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる(例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性な薬剤は、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、(a)本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に含む第一の容器;及び(b)さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物を中に含む第2の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の材料をさらに含んでもよい。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
一般的方法
組み換えDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにDNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている:Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thed., NIH Publication No. 91-3242。
組み換えDNA技術
標準的な方法を使用して、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにDNAを操作した。分子生物学的試薬を、製造者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている:Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thed., NIH Publication No. 91-3242。
DNA配列決定
DNA配列は、二本鎖配列決定により決定された。
DNA配列は、二本鎖配列決定により決定された。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてPCRによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR生成物からGeneart AG(Regensburg、Germany)により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするRNAからRT−PCRによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング/シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を含むように設計された。
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてPCRによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR生成物からGeneart AG(Regensburg、Germany)により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするRNAからRT−PCRによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング/シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を含むように設計された。
実施例1
抗メソテリン(MSLN)/抗CD3T細胞二重特異性(TCB)分子の調製
この実施例では以下の分子を調製した;その模式図を図2に示す:
A.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2A、配列番号22〜25)。
B.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、代替的メソテリンバインダー)を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2B、配列番号24、38〜40)。
C.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有さない「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2C、配列番号24、41〜43)。
D.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、代替的メソテリンバインダー)を有さない「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2D、配列番号24、44〜46)。
E.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有する「1+1のIgG CrossFab、反転型」(図2E、配列番号23〜25、47)。
F.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有する「1+1のIgG CrossMab」(図2E、配列番号22、24、25、48)。
抗メソテリン(MSLN)/抗CD3T細胞二重特異性(TCB)分子の調製
この実施例では以下の分子を調製した;その模式図を図2に示す:
A.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2A、配列番号22〜25)。
B.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、代替的メソテリンバインダー)を有する「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2B、配列番号24、38〜40)。
C.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有さない「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2C、配列番号24、41〜43)。
D.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾、代替的メソテリンバインダー)を有さない「2+1のIgG CrossFab、反転型」(図2D、配列番号24、44〜46)。
E.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有する「1+1のIgG CrossFab、反転型」(図2E、配列番号23〜25、47)。
F.荷電修飾(CD3バインダーにおけるVH/VL交換、メソテリンバインダーにおける荷電修飾)を有する「1+1のIgG CrossMab」(図2E、配列番号22、24、25、48)。
重鎖及び軽鎖DNA配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクター中に予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。タンパク質発現はMPSV又はCMVプロモーターによりドライブされ、合成ポリAシグナル配列がCDSの3’末端に存在する。加えて、各ベクターはEBV OriP配列を含有する。
分子は、ポリエチレンイミン(PEI)を使用して、懸濁液中において増殖するHEK293−EBNA細胞を哺乳動物発現ベクターとコトランスフェクトすることにより生成された。細胞は、1:2:1:1の比の対応する発現ベクター(分子A、B、C、D:「ベクター重鎖(VH−CH1−VL−CH1−CH2−CH3)」:「ベクター軽鎖(VL−CL)」:「ベクター重鎖(VH−CH1−CH2−CH3)」:「ベクター軽鎖(VH−CL)」)又は1:1:1:1の比の対応する発現ベクター(分子E:「ベクター重鎖(VH−CH1−VL−CH1−CH2−CH3)」:「ベクター軽鎖(VL−CL)」:「ベクター重鎖(CH2−CH3)」:「ベクター軽鎖(VH−CL)」;分子F:「ベクター重鎖(VL−CH1−CH2−CH3)」:「ベクター軽鎖(VH−CL)」:「ベクター重鎖(VH−CH1−CH2−CH3)」:「ベクター軽鎖(VL−CL)」)を用いてトランスフェクトされる。
トランスフェクションのために、HEK293 EBNA細胞を、6mMのL−グルタミン及び250mg/lのG418を含むExcell培地において、懸濁液無血清で培養した。600mlのチューブスピンフラスコ(最大作業体積400mL)内での生成のために、6億個のHEK293 EBNA細胞をトランスフェクションの24時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を210×gで5分間遠心分離し、予め温めた20mlのCD CHO培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、DNAの量が最終的に400μgになるまで20mlのCD CHO培地中で混合した。1080μlのPEI溶液(2.7μg/ml)を加えた後、混合物を15秒間ボルテックスし、その後室温で10分間インキュベートした。その後細胞を、DNA/PEI溶液と混合し、600mlのチューブスピンフラスコに移し、5% CO2雰囲気のインキュベーター内において37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション後、6mMのL−グルタミン、5g/LのPepsoy及び1.25mMのVPAを含む360mlのExcell培地を加え、細胞を24時間培養した。トランスフェクションの一日後、12%のFeed 7及び3g/lのグルコースを加えた。7日後、培養物の上清を収集して45分間2500×gで遠心分離(Sigma 8K遠心分離)することによって精製し、溶液を滅菌濾過し(0.22μmのフィルター)、最終濃度0.01%w/vのアジ化ナトリウムを加えた。溶液を4℃に保った。
培地中の分子の濃度をProtein A−HPLCにより決定した。分離の基礎は、pH8.0のProtein Aに対するFc含有分子の結合及びpH2.5からのステップ溶出であった。二の移動相が存在した。これらはTris(10mM)−グリシン(50mM)−NaCl(100mM)バッファーであり、異なるpH(8及び2.5)に調整したこと以外は同一であった。カラム本体は、POROS 20Aを充填した〜63μlの内部体積を有するUpchurch 2×20mmのプレカラムであった。100μlの各試料を、平衡化した材料に0.5ml/分の流速で注入した。0.67分後、試料を、pH2.5までのpHステップで溶出した。定量化は、280nmの吸光度の決定及び16から166mg/lのヒトIgG1の濃度範囲での標準曲線を用いる計算により行う。
分泌タンパク質を、細胞培養物の上清から、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程を実施した。
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、25mlの20mM リン酸ナトリウム、20mM クエン酸ナトリウム(pH7.5)により平衡化したHiTrapMabSelect SuReカラム(CV=5mL、GE Healthcare)に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも10カラム容積の20mM リン酸ナトリウム、20mM クエン酸ナトリウム(pH7.5)で洗浄することにより除去し、標的タンパク質を、6カラム容積の20mM クエン酸ナトリウム、100mM 塩化ナトリウム、100mM グリシン(pH3.0)において溶出した。タンパク質溶液を、1/10の0.5M リン酸ナトリウム(pH8.0)を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、20mM ヒスチジン、140mM 塩化ナトリウム(pH6.0)、0.01%のTween20で平衡化したHiLoad XK16/60 Superdex 200カラム(GE Healthcare)に充填した。
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、25mlの20mM リン酸ナトリウム、20mM クエン酸ナトリウム(pH7.5)により平衡化したHiTrapMabSelect SuReカラム(CV=5mL、GE Healthcare)に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも10カラム容積の20mM リン酸ナトリウム、20mM クエン酸ナトリウム(pH7.5)で洗浄することにより除去し、標的タンパク質を、6カラム容積の20mM クエン酸ナトリウム、100mM 塩化ナトリウム、100mM グリシン(pH3.0)において溶出した。タンパク質溶液を、1/10の0.5M リン酸ナトリウム(pH8.0)を加えることにより中和させた。標的タンパク質を、濃縮し、濾過した後、20mM ヒスチジン、140mM 塩化ナトリウム(pH6.0)、0.01%のTween20で平衡化したHiLoad XK16/60 Superdex 200カラム(GE Healthcare)に充填した。
Protein Aクロマトグラフィー後のインプロセス分析のために、単一の画分中の分子の純度及び分子量を、還元剤の非存在下において、クーマシー(InstantBlueTM,Expedeon)で染色し、SDS−PAGEにより分析した。NuPAGE(登録商標)Pre−Castゲルシステム(4〜12%のBis−Tris,Invitrogen)を、製造者の指示に従って使用した。
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmにおける光学濃度(OD)を測定することにより決定した。
最終的な精製工程後の分子の純度及び分子量を、還元剤の存在下及び非存在下において、CE−SDS分析により分析した。Caliper LabChip GXIIシステム(Caliper Lifescience)を、製造元の指示に従って使用した。
分子の凝集物含有量を、25mMのK2HPO4、125mMのNaCl、200mMのL−アルギニン一塩酸塩、0.02%(w/v)のNaN3(pH6.7)の25℃のランニングバッファー中において、TSKgel G3000 SW XL分析的サイズ除外カラム(Tosoh)を用いて分析した。
分子の質量分析を、Agilent LC−MSシステム(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)において実施した。クロマトグラフィーシステム(Agilent 1260 Infinity)は、Agilent 6224 TOF LC/MS ESIデバイスに連結された。約5μgの試料をNUCLEOGEL RP1000−8、250mm×4.6mmカラム(MACHEREY−NAGEL GmbH & Co. KG,Duren,Germany)に、1ml/分の流速で40℃で注入した。移動相は以下の通り、即ち、A:5%のアセトニトリル、0.05%のギ酸及びB:95%のアセトニトリル、0.05%のギ酸、であった。溶出勾配を適用するために、10分以内に15%Bを60%Bに、次いで2.5分で100%Bに上昇させた。質量分析計は、高解像度モード4 GHzポジティブで測定され、500から3200m/zの範囲で記録された。m/zスペクトルは、Roche(Hoffman−La Roche,Ltd)社のMassAnalyzer 2.4.1を用いて手動でデコンボリューションした。
すべての分子は、同じ方法に従って生成及び精製された。最終的な純度は、フォーマットによって異なっていた。最良の品質は、分子Aについて得られた。メソテリンバインダーから荷電修飾を除去すること、又は荷電修飾をCD3バインダーにおけるCH1/CL交換と組み合わせることは、共に低品質の分子をもたらした。
LC−MS分析により、分子Aの誤対合がないことが判明したが、対照的に分子Cは誤対合した軽鎖を有する分子を約30%含んでいた。LC−MS分析により、分子E及び分子Fが共に約90%純粋であることが示された。
共に荷電修飾を欠く分子C及び分子Dは、一回目実行後の品質が満足のゆくものではなかったため、二つの追加的サイズ排除実行により精製された。
分子Aの最終的品質は極めて良好であり、CE−SDS上98%を上回るモノマー含有量と98%を上回る純度を有していた(表1及び2、図3)。二回の追加的サイズ排除の実行後、分子Cの最終的品質も良好であった(96.2%のモノマー(表1)及び93.5%の純度(表2))が、収率は損害を受けて低下していた。
分子Aの最終的品質は極めて良好であり、CE−SDS上98%を上回るモノマー含有量と98%を上回る純度を有していた(表1及び2、図3)。二回の追加的サイズ排除の実行後、分子Cの最終的品質も良好であった(96.2%のモノマー(表1)及び93.5%の純度(表2))が、収率は損害を受けて低下していた。
荷電修飾を有さない対応する分子と比較した場合の荷電修飾を有する分子の別の利点は、アフィニティー精製後のg補凝集物の含有量である。荷電修飾を有さない分子は約30%の平均含有量を有し、それに対し荷電修飾を有する分子は約10%の凝集物しか有していなかった(表3)。
実施例2
メソテリン及びCD3発現細胞に対するメソテリン(MSLN)TCB分子の結合
実施例1において調製されたMSLN TCB分子Aの結合を、メソテリン陽性腫瘍細胞(NCI−H322M細胞、Sigma−Aldrich #95111734)及びCD3発現不死化Tリンパ球細胞(GloResponse Jurkat NFAT−RE−luc2P;Promega #CS176501)において試験した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、1ml当たり2百万個の細胞でFACSバッファー(0.1%のBSAを含むPBS)に再懸濁された。100μlの細胞懸濁液(20万個の細胞を含む)を、丸底96ウェルプレートにおいて30分間4℃で、MSLN TCBの濃度を漸増させながら(示されるように、H322細胞に対する結合について4pM〜60nM、又はJurkat細胞に対する結合について4pM〜300nM)インキュベートし、細胞を冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄し、さらに30分間4℃でAlexa Fluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ断片特異的抗体(Jackson Immuno Research Lab #109−606−008)と共に再インキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄した。染色を、1ウェル当たりFACSバッファー中150μlの2% PFAを用いて、20分間暗所において4℃で固定した。蛍光性を、FACS Fortessa(Software FACS Diva)を用いるFACSにより分析した。結合曲線はGraphPadPrism6を使用して得られた。
メソテリン及びCD3発現細胞に対するメソテリン(MSLN)TCB分子の結合
実施例1において調製されたMSLN TCB分子Aの結合を、メソテリン陽性腫瘍細胞(NCI−H322M細胞、Sigma−Aldrich #95111734)及びCD3発現不死化Tリンパ球細胞(GloResponse Jurkat NFAT−RE−luc2P;Promega #CS176501)において試験した。簡潔には、細胞は、回収され、カウントされ、生存率をチェックされて、1ml当たり2百万個の細胞でFACSバッファー(0.1%のBSAを含むPBS)に再懸濁された。100μlの細胞懸濁液(20万個の細胞を含む)を、丸底96ウェルプレートにおいて30分間4℃で、MSLN TCBの濃度を漸増させながら(示されるように、H322細胞に対する結合について4pM〜60nM、又はJurkat細胞に対する結合について4pM〜300nM)インキュベートし、細胞を冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄し、さらに30分間4℃でAlexa Fluor 647コンジュゲートAffiniPure F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ断片特異的抗体(Jackson Immuno Research Lab #109−606−008)と共に再インキュベートし、冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄した。染色を、1ウェル当たりFACSバッファー中150μlの2% PFAを用いて、20分間暗所において4℃で固定した。蛍光性を、FACS Fortessa(Software FACS Diva)を用いるFACSにより分析した。結合曲線はGraphPadPrism6を使用して得られた。
結果は、MSLN TCB分子Aが、細胞上のヒトメソテリン及びヒトCD3εの両方に、濃度依存性に結合できることを示すものである(図5A、NCI−H322M細胞に対する結合;図5B、Jurkat細胞に対する結合)。CD3標的化部分の一価の結合は、コントロール分子、非標的化TCB分子(CD3に結合するが標的細胞抗原には結合しない、配列番号26、27)の一つと同等であるが、飽和状態にはない。
実施例3
MSLN TCB分子によって誘導される腫瘍細胞の溶解
MSLN TCB分子Aによって媒介されるT細胞の死滅を、メソテリン発現NCI−H596(ATCC(登録商標)HTB−178)、AsPC−1(ECACC 96020930)及びBxPC−3(ECACC 93120816)上において、メソテリン陰性NCI−H358(ATCC(登録商標)CRL−5807)ヒト腫瘍細胞との対比において評価した。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と共になされたインキュベーションの24時間及び48時間経過時に死滅を検出した。簡潔には、実験の一日前に、付着した標的細胞を、トリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核細胞(PBMC)を、バフィーコート(「Blutspende Zurich」)から取得したヘパリン化血の濃縮リンパ球調製物のHistopaque密度遠心分離により調製した。血液を滅菌PBSで1:4に希釈し、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H8889)。遠心分離(450×g、30分、室温)後、PBMCを含有する界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいファルコンチューブに移し、その後50mlのPBSを満たした。混合物を遠心分離(400×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを、滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:350×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントし(ViCell)、加湿したインキュベーター内において、37℃、2%のFCS及び1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中に、アッセイ開始まで保管した。腫瘍細胞溶解アッセイのために、抗体を、示された濃度(2pM〜100nMの範囲で3通り)で加えた。非標的化TCB分子をネガティブコントロールとして含めた。PBMCを標的細胞に、最終的なE:T比が10:1となるように加えた。標的細胞の死滅を、37℃、5% CO2での24時間及び48時間のインキュベーションの後に、アポトーシス/壊死細胞による細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)が、1% Triton X−100と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解(=0%)は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解のEC50値は、GraphPadPrism6を用いて計算した(表4参照)。
MSLN TCB分子によって誘導される腫瘍細胞の溶解
MSLN TCB分子Aによって媒介されるT細胞の死滅を、メソテリン発現NCI−H596(ATCC(登録商標)HTB−178)、AsPC−1(ECACC 96020930)及びBxPC−3(ECACC 93120816)上において、メソテリン陰性NCI−H358(ATCC(登録商標)CRL−5807)ヒト腫瘍細胞との対比において評価した。ヒトPBMCをエフェクターとして使用し、二重特異性抗体と共になされたインキュベーションの24時間及び48時間経過時に死滅を検出した。簡潔には、実験の一日前に、付着した標的細胞を、トリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核細胞(PBMC)を、バフィーコート(「Blutspende Zurich」)から取得したヘパリン化血の濃縮リンパ球調製物のHistopaque密度遠心分離により調製した。血液を滅菌PBSで1:4に希釈し、Histopaqueグラジエント上に重ねた(Sigma、H8889)。遠心分離(450×g、30分、室温)後、PBMCを含有する界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいファルコンチューブに移し、その後50mlのPBSを満たした。混合物を遠心分離(400×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを、滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:350×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントし(ViCell)、加湿したインキュベーター内において、37℃、2%のFCS及び1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中に、アッセイ開始まで保管した。腫瘍細胞溶解アッセイのために、抗体を、示された濃度(2pM〜100nMの範囲で3通り)で加えた。非標的化TCB分子をネガティブコントロールとして含めた。PBMCを標的細胞に、最終的なE:T比が10:1となるように加えた。標的細胞の死滅を、37℃、5% CO2での24時間及び48時間のインキュベーションの後に、アポトーシス/壊死細胞による細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)が、1% Triton X−100と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解(=0%)は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。腫瘍細胞溶解のEC50値は、GraphPadPrism6を用いて計算した(表4参照)。
結果は、MSLN TCB分子Aが、異なるメソテリン陽性標的細胞株の強力且つ標的特異的な死滅を誘導できることを示すものである(図6)。腫瘍細胞溶解の兆候は、24時間後に既に観察可能であった(図6、A−D)が、死滅した腫瘍細胞のパーセンテージは次の24時間内で有意に上昇した(図6、E−H)。メソテリン陰性NCI−H358細胞の存在下では、48時間後まで腫瘍細胞の溶解は観察されなかった。
表4.MSLN TCB分子Aによって誘導されたT細胞媒介性メソテリン発現腫瘍細胞の死滅のEC50値(pM)
* 表は、製造者の指示に従い、Quantum Cy5 MESFビーズ(Bangs Laboratories)を用いて決定された、異なる細胞株上のメソテリン結合部位を示す。腫瘍細胞溶解のEC50値は、Graph Pad Prismによって決定された。
* 表は、製造者の指示に従い、Quantum Cy5 MESFビーズ(Bangs Laboratories)を用いて決定された、異なる細胞株上のメソテリン結合部位を示す。腫瘍細胞溶解のEC50値は、Graph Pad Prismによって決定された。
実施例4
標的細胞とエフェクター細胞に対するMSLN TCB分子の同時結合時のT細胞上の活性化マーカーの上方制御
メソテリン発現標的細胞とヒトCD3発現エフェクター細胞に対するMSLN TCB分子Aの同時結合時のCD8+及びCD4+ T細胞の活性化を、T細胞活性化マーカーCD69(早期活性化マーカー)及びCD25(後期活性化マーカー)を認識する抗体を用いてFACS分析により評価した。コントロールとして、T細胞活性化マーカーを、標的細胞の不在化においても評価した。抗体及び死滅アッセイ条件は、基本的に上記(実施例3)と同じであった。インキュベーション後、PBMCを丸底96ウェルプレートに移し、350×gで5分間遠心分離し、0.1% BSAを含有するPBS(FACSバッファー)で2度洗浄した。CD8(FITC抗ヒトCD8、BioLegend # 344704)、CD4(PECy7抗ヒトCD4、BioLegend # 344612)、CD69(PE抗ヒトCD69、BioLegend #310906)及びCD25(APC抗ヒトCD25、BioLegend #302610)の表面染色を、供給者の指示に従って実行した。細胞を、0.1% BSAを含有する150μl/ウェルのPBSを用いて二度洗浄し、150μl/ウェルのFACSバッファー(2%のPFAを含む)を用いて4℃で30分間固定した。遠心分離後、試料を150μl/ウェルのFACSバッファーに再懸濁し、BD FACS Fortessaを用いて分析した。
標的細胞とエフェクター細胞に対するMSLN TCB分子の同時結合時のT細胞上の活性化マーカーの上方制御
メソテリン発現標的細胞とヒトCD3発現エフェクター細胞に対するMSLN TCB分子Aの同時結合時のCD8+及びCD4+ T細胞の活性化を、T細胞活性化マーカーCD69(早期活性化マーカー)及びCD25(後期活性化マーカー)を認識する抗体を用いてFACS分析により評価した。コントロールとして、T細胞活性化マーカーを、標的細胞の不在化においても評価した。抗体及び死滅アッセイ条件は、基本的に上記(実施例3)と同じであった。インキュベーション後、PBMCを丸底96ウェルプレートに移し、350×gで5分間遠心分離し、0.1% BSAを含有するPBS(FACSバッファー)で2度洗浄した。CD8(FITC抗ヒトCD8、BioLegend # 344704)、CD4(PECy7抗ヒトCD4、BioLegend # 344612)、CD69(PE抗ヒトCD69、BioLegend #310906)及びCD25(APC抗ヒトCD25、BioLegend #302610)の表面染色を、供給者の指示に従って実行した。細胞を、0.1% BSAを含有する150μl/ウェルのPBSを用いて二度洗浄し、150μl/ウェルのFACSバッファー(2%のPFAを含む)を用いて4℃で30分間固定した。遠心分離後、試料を150μl/ウェルのFACSバッファーに再懸濁し、BD FACS Fortessaを用いて分析した。
結果は、MSLN TCB分子Aが、メソテリン陽性標的細胞の存在下において、CD8+上(それぞれ図7A−E及びF−J,)及びCD4+ T細胞上(それぞれ図7K−O及びP−T)において活性化マーカーCD69及びCD25の強力且つ標的特異的な上方制御を誘導したが、メソテリン陰性腫瘍細胞の存在下又は標的細胞の非存在下では誘導しなかったことを示すものである。
実施例5
メソテリン発現細胞及びCD3発現細胞に対するMSLN TCB分子の結合
異なるMSLN TCB分子の結合を、CD3発現不死化Tリンパ球細胞(Jurkat、DSMZ #ACC 282)及びMSLN発現AsPC−1細胞(ECACC #96020930)を用いて試験した。
メソテリン発現細胞及びCD3発現細胞に対するMSLN TCB分子の結合
異なるMSLN TCB分子の結合を、CD3発現不死化Tリンパ球細胞(Jurkat、DSMZ #ACC 282)及びMSLN発現AsPC−1細胞(ECACC #96020930)を用いて試験した。
簡潔には、Jurkat懸濁細胞を、回収し、カウントし、生存率についてチェックした。付着したAsPC−1細胞を、Cell Dissociation Buffer(Gibco、#13151014)を用いて回収し、カウントし、生存率についてチェックし、FACSバッファー(100μl PBS 0.1% BSA)中0.9×106細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液(0.09×106個の細胞を含む)を、丸底96ウェルプレートにおいて30分間4℃で、MSLN TCB分子の濃度を漸増させながら(3.8pM〜300nM)インキュベートし、次いで0.1%のBSAを含む冷たいPBS(FACSバッファー)で二度洗浄した。細胞を、さらに30分間4℃で、1:100に事前希釈したAlexaFluor 647 − F(ab’)2 断片ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ断片特異的二次抗体(Jackson Immuno Research Lab、FITC #109−096−008)と共に再インキュベートし、その後冷たいPBS 0.1% BSAで二度洗浄した。
染色した細胞を、100μlの2%パラホルムアルデヒド含有FACSバッファーに再懸濁し、30分間室温でインキュベートし、染色を固定した。最後に、細胞を4分間350×g及び4℃で遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを200μlのFACSバッファーに再懸濁した。染色を、FACS Canto II(Software FACS Diva)を用いるFACSにより分析した。GraphPadPrism6を用いて、結合曲線及びEC50値を取得した(図8A:Jurkat細胞に対する結合、図8B:AsPC−1細胞に対する結合)。
図8Aに示すように、MSLN TCB分子のいずれもが、CD3発現細胞に対する結合の飽和に到達していない。このことは、結合の親和性が低いことと、結合が一価性であることに起因している。結合シグナルの全体的な強度には、各分子フォーマット中のCD3バインダーのアクセシビリティによってわずかな相違が存在する。ここで、分子Fは、最も高い全体の結合シグナルを示している。同様に、分子フォーマット並びにMSLNの結合価は、表5に示すように、メソテリン発現細胞に対する全体の結合シグナルと、結合のEC50とに影響している。分子CとD(異なるメソテリンバインダーを有する)の比較は、分子Cの結合の方が有意に良好であることを示す。
別の実験において(図15)、ヒト又はカニクイザルのCD3陽性PBMCと、ヒト又はカニクイザルMSLN陽性一過性CHO トランスフェクタントとに対する分子Aの結合を、FACSによって評価した。
ヒトPBMCの単離を、実施例6に記載のようにして実施した。カニクイザルPBMCの単離は以下のように実施された:末梢血単核(PBMC)を、健常なカニクイザルドナーから得られたヘパリン化血のHistopaque密度遠心分離により調製した。血液を滅菌PBSで1+1に希釈し、Histopaqueグラジエント(Sigma、H8889)上に重ねた。遠心分離(520×g、30分間、室温)後、PBMC含有界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいファルコンチューブに移し、その後50mlのPBSで満たした。混合物を遠心分離し(400×g、10分、4℃)、上清を棄てた。
細胞ペレットをACK溶解バッファー中において5分間室温でインキュベートし(0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA、pH8.0)、赤血球を溶解させた。その後、カニクイザルPBMCを滅菌PBSで二度洗浄した(遠心分離工程、350×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を、上述のように自動カウントし(ViCell)、PBS、0.1% BSA(FACSバッファー)に再懸濁した。
アッセイの設定は基本的に上述と同じであった。抗体範囲は3.8pM〜300nMであった。図15に示すように、ヒトCD3(図15A)又はカニクイザルCD3(図15B)に対する分子Aの結合は、極めて類似している。いずれの場合も、CD3バインダーの低い親和性と、このフォーマットでのCD3結合の一価性により、飽和には達しなかった。
さらに、ヒト又はカニクイザルMSLNを発現するように一過性にトランスフェクトされたCHO細胞を使用したとき、ヒト(図15C)及びカニクイザルMSLN(図15D)に対する結合も、同様の範囲内である(EC50は、ヒトMSLNについては7.76nM、カニクイザルMSLNについては5.5nMである)。
実施例6
異なるMSLN TCB分子によって誘発されるT細胞媒介性腫瘍溶解
異なるMSLN TCB分子によって媒介されたT細胞死滅を、MSLN発現NCI−H596(ATCC、#HTB−178、〜150000のMSLN結合部位)、AsPC−1(ECACC #96020930、〜44000のMSLN結合部位)及びBxPC3細胞(ECACC #93120816、〜1700のMSLN結合部位)において評価した。ヒトPBMCをエフェクター細胞として使用し、TCB分子と共になされた24時間及び48時間のインキュベーション後に死滅を検出した。付着した標的細胞を、トリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核(PBMC)を、健常なヒトドナーから得られたヘパリン化血の濃縮リンパ球調製物のHistopaque密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaqueグラジエント(Sigma、H8889)上に重ねた。遠心分離(450×g、30分、室温)後、PBMCを含有する界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいfalconチューブに移し、その後50mlのPBSを満たした。混合物を遠心分離(400×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:350×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントし(ViCell)、細胞インキュベーター内において、37℃、5% CO2で2%のFCS及び1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中に、アッセイ開始まで保管した。
異なるMSLN TCB分子によって誘発されるT細胞媒介性腫瘍溶解
異なるMSLN TCB分子によって媒介されたT細胞死滅を、MSLN発現NCI−H596(ATCC、#HTB−178、〜150000のMSLN結合部位)、AsPC−1(ECACC #96020930、〜44000のMSLN結合部位)及びBxPC3細胞(ECACC #93120816、〜1700のMSLN結合部位)において評価した。ヒトPBMCをエフェクター細胞として使用し、TCB分子と共になされた24時間及び48時間のインキュベーション後に死滅を検出した。付着した標的細胞を、トリプシン/EDTAを用いて回収し、洗浄し、平底96ウェルプレートを用いて25000細胞/ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。末梢血単核(PBMC)を、健常なヒトドナーから得られたヘパリン化血の濃縮リンパ球調製物のHistopaque密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌PBSで希釈し、Histopaqueグラジエント(Sigma、H8889)上に重ねた。遠心分離(450×g、30分、室温)後、PBMCを含有する界面相上の血漿を棄て、PBMCを新しいfalconチューブに移し、その後50mlのPBSを満たした。混合物を遠心分離(400×g、10分間、室温)し、上清を棄て、PBMCペレットを滅菌PBSを用いて二度洗浄した(遠心分離工程:350×g、10分間)。その結果得られたPBMC集団を自動カウントし(ViCell)、細胞インキュベーター内において、37℃、5% CO2で2%のFCS及び1%のL−アラニル−L−グルタミン(Biochrom、K0302)を含有するRPMI1640培地中に、アッセイ開始まで保管した。
腫瘍溶解アッセイのために、TCB分子を、示された濃度(0.4pM〜20nMの範囲で3通り)で加えた。PBMCを標的細胞に、最終的なE:T比が10:1となるように加えた。標的細胞の死滅を、37℃、5% CO2での24時間及び48時間のインキュベーションの後に、アポトーシス/壊死細胞により細胞上清中に放出されたLDHの定量化(LDH検出キット、Roche Applied Science、#11 644 793 001)により評価した。標的細胞の最大溶解(=100%)が、1% Triton X−100と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解(=0%)は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。
24時間後(図9、A−C)及び48時間後(図9、D−F)の結果は、分子Aが、異なるMSLNバインダーを含む分子Bと比較して、腫瘍溶解の誘導能が高いことを示すものである。非標的化TCB分子は、ネガティブ標準分子の役割を担い、予想通り、腫瘍細胞の溶解を誘導することはできなかった。
腫瘍細胞溶解の対応するEC50値を、GraphPadPrism6を用いて計算し、表6に示した。
別の実施態様において(図12、G−I)、分子A、分子E及び分子Fの力価を、上述と同じアッセイ設定と、MSLN陽性NCI−H596、AsPC−1及びBxPC3腫瘍細胞を用いて比較した。ここで、抗体濃度の範囲は0.07pM〜20nMであった。
図12のG−Iは、分子Aが48時間後に誘導する異なるMSLN陽性腫瘍細胞の溶解が、分子E、特に分子Fと比較して良好であることを示している。腫瘍細胞溶解の対応するEC50値を、GraphPadPrism6を用いて計算し、表7に示した。
図12のG−Iは、分子Aが48時間後に誘導する異なるMSLN陽性腫瘍細胞の溶解が、分子E、特に分子Fと比較して良好であることを示している。腫瘍細胞溶解の対応するEC50値を、GraphPadPrism6を用いて計算し、表7に示した。
別の実験において(図14C)、標的細胞上のMSLNの発現に対する腫瘍細胞溶解の依存性を、分子Aについて評価した。抗体濃度及びアッセイ条件は、上述のものと基本的に同じであった。図14Cに示すように、分子Aは、異なるMSLN陽性標的細胞の腫瘍細胞溶解を誘発したが、MSLN陰性NCI−H358腫瘍細胞の腫瘍細胞溶解は誘発しなかった。対応するEC50値を表8に示す。
実施例7
Jurkat−NFAT活性化アッセイ
異なるMSLN TCB分子の、細胞上でのCD3及びヒトMSLNに対する同時結合時の、エフェクター細胞のCD3媒介性活性化誘導能を、腫瘍抗原陽性標的細胞(NCI−H596、AsPC−1及びBxPC−3)と、Jurkat−NFATレポーター細胞(NFATプロモーター、GloResponse Jurkat NFAT−RE−luc2P、Promega #CS176501を有するCD3発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株)の共培養物を用いて評価した。MSLN及びCD3抗原に対するTCB分子の同時結合時、NFATプロモーターは活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現をもたらす。蛍光シグナルの強度(ルシフェラーゼ 基質の添加により得られる)は、CD3活性及びシグナル伝達の強度に比例する。
Jurkat−NFAT活性化アッセイ
異なるMSLN TCB分子の、細胞上でのCD3及びヒトMSLNに対する同時結合時の、エフェクター細胞のCD3媒介性活性化誘導能を、腫瘍抗原陽性標的細胞(NCI−H596、AsPC−1及びBxPC−3)と、Jurkat−NFATレポーター細胞(NFATプロモーター、GloResponse Jurkat NFAT−RE−luc2P、Promega #CS176501を有するCD3発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株)の共培養物を用いて評価した。MSLN及びCD3抗原に対するTCB分子の同時結合時、NFATプロモーターは活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現をもたらす。蛍光シグナルの強度(ルシフェラーゼ 基質の添加により得られる)は、CD3活性及びシグナル伝達の強度に比例する。
アッセイのために、ヒト腫瘍細胞を回収し、生存率を、ViCellを用いて決定した。20000細胞/ウェルを、平底ホワイトウォール96ウェルプレート(#655098、Greiner Bio−One)に蒔き、希釈した抗体又は培地(コントロールとして)を加えた(0.07pM〜20nMの範囲)。
その後、Jurkat−NFATレポーター細胞を回収し、ViCellを用いて生存率を評価した。細胞を、細胞培地に再懸濁し、2%のGloSensor(Promega、#E1291)をJurkat細胞懸濁液に加えた。Jurkat細胞懸濁液を腫瘍細胞に加えて、示されるように最終的なE:Tを2.5:1とし、1ウェル当たりの最終容積を200μlとした。
細胞を、加湿したインキュベーター内において、2.5時間、4時間、18.5時間及び24時間にわたり、37℃でインキュベートした。それぞれのインキュベーション時間の最後に、WALLAC Victor3 ELISAリーダー(PerkinElmer2030)を用いて、検出時間を1ウェル当たり1秒として発光を検出した。EC50値は、GraphPad Prism6を用いて決定された。
図11に示すように、評価されたすべてのMSLN TCB分子は、CD3を介したT細胞架橋とその後のT細胞活性化を誘導し、その際分子Aが最も強力である。加えて、Jurkat−NFATレポーター細胞活性化のEC50は、通常、アッセイ中に存在する標的細胞上のMSLN結合部位の数に逆相関する。
実施例8
標的細胞とエフェクター細胞に対するMSLN TCB分子の同時結合時のT細胞上の活性化マーカーの上方制御
NSLN発現標的細胞とヒトCD3発現エフェクター細胞に対するMSLN TCB分子の同時結合時のCD8+及びCD4+ T細胞の活性化を、T細胞活性化マーカーCD69(早期活性化マーカー)を認識する抗体を用いてFACS分析により評価した。抗体範囲は0.4pM〜20nMであった。腫瘍溶解アッセイの条件は、上述(実施例6、図9)と基本的に同じであった。
標的細胞とエフェクター細胞に対するMSLN TCB分子の同時結合時のT細胞上の活性化マーカーの上方制御
NSLN発現標的細胞とヒトCD3発現エフェクター細胞に対するMSLN TCB分子の同時結合時のCD8+及びCD4+ T細胞の活性化を、T細胞活性化マーカーCD69(早期活性化マーカー)を認識する抗体を用いてFACS分析により評価した。抗体範囲は0.4pM〜20nMであった。腫瘍溶解アッセイの条件は、上述(実施例6、図9)と基本的に同じであった。
インキュベーション後、PBMCを丸底96ウェルプレートに移し、350×gで5分間遠心分離し、0.1% BSAを含有するPBS(FACSバッファー)で2度洗浄した。CD8(APC−Cy7抗ヒトCD8、BioLegend #344714)、CD4(PE抗ヒトCD4、BioLegend #317410)、CD69(BV421抗ヒトCD69、BioLegend #310930)の表面染色を、供給者の指示に従って30分間暗所において4℃で実施した。細胞を、0.1% BSAを含有する150μl/ウェルのPBSを用いて2度洗浄し、2%のパラホルムアルデヒドを含むFACSバッファー150μl/ウェルを用いて4℃で30分間固定した。遠心分離後、試料を200μl/ウェルのFACSバッファーに再懸濁し、BD FACS LSR Fortessaを用いて分析した。
72時間後、T細胞活性化を、CD69を発現するCD4T細胞(図10、A−C)、又はCD69を発現するCD8T細胞(図10、D−F)のパーセントとして決定した。グラフは、GraphPad Prism6を用いて得られた。
図10に示すように、分子Aは、T細胞上のCD3と、異なる標的細胞上のMSLNとに対する同時結合時に、異なるMSLNバインダーを含む分子Bと比較してより強いT細胞活性化を誘導する。対応するEC50値は、Graph Pad Prism6を用いて計算されたものであり、表9に示される。
表9.72時間後に、NCI−H596、AsPC−1又はBxPC−3標的細胞の存在下におけるCD69の上方制御により決定された、一次CD4又はCD8T細胞のMSLN TCB媒介性活性化のEC50値(pM)(FACS)
別の実施態様において、48時間後、T細胞活性化を、CD69を発現するCD4T細胞(図12、A−C)、及びCD69を発現するCD8T細胞(図12、D−F)のパーセントとして決定した。ここで、抗体濃度の範囲は0.07pM〜20nMであった。図12D−Fに示すように、分子Aは、T細胞上のCD3と標的細胞上のMSLNとに対する同時結合時に、分子E及びFと比較してより強いT細胞活性化を誘導する。これは、NCI−H596の存在下において、表10に示されるように全体の蛍光シグナルがより高いことと、EC50値がより低いこととに反映されている。
表10.NCI−H596、AsPC−1又はBxPC−3標的細胞の存在下におけるCD69の上方制御により決定された、一次CD4又はCD8T細胞のMSLN TCB媒介性活性化のEC50値(pM)(FACS)
別の実験において(図14A及びB)、MSLN陽性又はMSLN陰性標的細胞の存在下における分子Aの同時結合時のCD4+及びCD8+ T細胞の活性化を評価した。抗体及び腫瘍溶解アッセイの条件は、上述(実施例6、図5G−I)と基本的に同じであった。抗体範囲は0.07pM〜20nMであった。図14に示すように、分子Aは、MSLN陽性NCI−H596、AsPC−1又はBxPC−3の存在下においてCD4(A)及びCD8(B)上のCD69の上方制御を誘発したが、MSLN陰性NCI−H358腫瘍細胞の存在下においては誘発しなかった。
表11.NCI−H596、AsPC−1又はBxPC−3標的細胞の存在下におけるCD69の上方制御により決定された、一次CD4又はCD8T細胞のMSLN TCB媒介性活性化のEC50値(pM)(FACS)
実施例9
MSLN TCB抗体によって誘導されたMSLN発現腫瘍細胞のT細胞媒介性の溶解後の、ヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
分子Aによって誘導されたMSLN発現NCI−H596腫瘍細胞のT細胞媒介性溶解後の、ヒトPBMCによるサイトカイン分泌を、腫瘍細胞溶解アッセイ後の細胞上清のFACS分析により評価した。
MSLN TCB抗体によって誘導されたMSLN発現腫瘍細胞のT細胞媒介性の溶解後の、ヒトエフェクター細胞によるサイトカイン分泌
分子Aによって誘導されたMSLN発現NCI−H596腫瘍細胞のT細胞媒介性溶解後の、ヒトPBMCによるサイトカイン分泌を、腫瘍細胞溶解アッセイ後の細胞上清のFACS分析により評価した。
抗体及びアッセイ条件は、基本的に上述(実施例6、図12)と同じであり、10:1のE:T比と48時間のインキュベーション時間が用いられた。抗体範囲は2pM〜100nMであった。
インキュベーション時間の最後に、プレートを350×gで5分間遠心分離し、上清を新しい96ウェルプレートに移し、−20℃でその後の分析まで保管した。細胞上清中に分泌されたグランザイムB、TNFα、IFN−γ、IL−4及びIL−10を、FACS CantoIIにおいて製造元の指示に従い、BD CBAヒト可溶型タンパク質Flex Setを用いて検出した。以下のキットが使用された:BD CBAヒトグランザイムB;BD CBAヒトグランザイムB Flex Set #BD 560304;BD CBAヒトTNF Flex Set #BD 558273;BD CBAヒトIFN−γ Flex Set #BD 558269;BD CBAヒトIL−6 Flex Set #BD 558276;BD CBAヒトIL−10 Flex Set #BD 558274。サイトカイン放出のグラフ及びEC50値は、GraphPad Prism6を用いて得られた。
図13に示すように、分子Aは濃度依存性に、IFNγ、IL−6、TNF、グランザイムB及びIL−10の分泌を誘導した。
前述の発明は理解を明確にするために説明及び例示によってある程度詳細に記載されているが、これら記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
Claims (63)
- T細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、
(a)第1の抗原に特異的に結合する第1の抗原結合部分;
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合部分;
を含み、第1の抗原がT細胞活性化抗原であり、第2の抗原がメソテリンであるか、又は第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原であり;且つ
メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号14の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号15のHCDR2及び配列番号16のHCDR3を含む重鎖可変領域、特にヒト化重鎖可変領域と、配列番号17の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号18のLCDR2及び配列番号19のLCDR3を含む軽鎖可変領域、特にヒト化軽鎖可変領域とを含む、
T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - メソテリンに特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び/又は第2の抗原結合部分がFab分子である、請求項1又は2に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第2の抗原結合部分が、第2の抗原に特異的に結合するFab分子であり、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVH又は定常ドメインCLとCH1が互いによって置き換えられている、請求項1から3のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1の抗原がメソテリンであり、第2の抗原がT細胞活性化抗原である、請求項1から4のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- T細胞活性化抗原がCD3、特にCD3エプシロンである、請求項1から5のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号4の重鎖相補性決定領域(CDR)1、配列番号5の重鎖CDR2、配列番号6の重鎖CDR3、配列番号8の軽鎖CDR1、配列番号9の軽鎖CDR2及び配列番号10の軽鎖CDR3を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- T細胞活性化抗原に特異的に結合する抗原結合部分が、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- (a)による第1の抗原結合部分が、第1の抗原に特異的に結合する第1のFab分子であり、(b)による第2の抗原結合部分が、Fab軽鎖とFab重鎖の可変ドメインVLとVHが互いによって置き換えられている第2の抗原に特異的に結合する第2のFab分子であり;
且つ
i)a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け);又は
ii)b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、
請求項1から8のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)により置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9又は10に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9から11のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9から12のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- a)による第1のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つa)による第1のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9から12のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸又は213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9又は15に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)又はヒスチジン(H)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)、又はアスパラギン酸(D)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9、15及び16のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がアルギニン(R)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9及び15から17のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- b)による第2のFab分子の定常ドメインCLにおいて、124位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、123位のアミノ酸がリジン(K)によって置換されており(Kabatによる番号付け)、且つb)による第2のFab分子の定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されており(Kabat EUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)によって置換されている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項9及び15から17のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- c)第1の抗原に特異的に結合する第3の抗原結合部分
をさらに含む、請求項1から19のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。 - 第3の抗原結合部分がFab分子である、請求項20に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第3の抗原結合部分が第1の抗原結合部分と同一である、請求項20又は21に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第3の抗原結合部分が標的細胞抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合部分がT細胞活性化抗原、特にCD3、さらに詳細にはCD3エプシロンに特異的に結合する、請求項20から22のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- d)安定に会合することができる第1及び第2のサブユニットからなるFcドメイン
を追加的に含む、請求項1から23のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特性抗原結合分子。 - 第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項1から24のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項1から25のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項1から25のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1の抗原結合部分のFab軽鎖と第2の抗原結合部分のFab軽鎖が、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している、請求項26又は27に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第2の抗原結合部分がFab分子であり、第1及び第2の抗原結合部分の各々がFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第3の抗原結合部分がFab分子であり、Fab重鎖のC末端においてFcドメインの第1又は第2のサブユニットのN末端に融合している、請求項24、29、又は30に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1、第2及び第3の抗原結合部分がFab分子であり、第2及び第3の抗原結合部分の各々がFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットのうちの一つのN末端に融合しており、第1の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第2の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1、第2及び第3の抗原結合部分がFab分子であり、第1及び第3の抗原結合部分の各々がFab重鎖のC末端においてFcドメインのサブユニットの一つのN末端に融合しており、第2の抗原結合部分がFab重鎖のC末端において第1の抗原結合部分のFab重鎖のN末端に融合している、請求項24に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 第1及び第3の抗原結合部分とFcドメインとが、免疫グロブリン分子、特にIgGクラスの免疫グロブリンの一部である、請求項34に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがIgG、具体的にはIgG1又はIgG4のFcドメインである、請求項24から35のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがヒトFcドメインである、請求項24から36のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- FcドメインがFcドメインの第1及び第2のサブユニットの会合を促す修飾を含む、請求項24から37のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が形成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第2のサブユニットのCH3ドメイン内部に、第1のサブユニットのCH3ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が形成される、請求項38に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 前記大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、及びトリプトファン(W)からなる群より選択され、前記小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、及びバリン(V)からなる群より選択される、請求項39に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、366位のスレオニン残基がトリプトファン残基によって置き換えられており(T366W)、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、407位のチロシン残基がバリン残基によって置き換えられており(Y407V)、任意選択的に、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、追加的に366位のスレオニン残基がセリン残基によって(T366S)、及び368位のロイシン残基がアラニン残基によって(L368A)、それぞれ置き換えられている(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項39又は40に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットにおいて、追加的に354位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている(S354C)か、又は356位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており(E356C)、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、追加的に349位のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられている(Y349C)(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項39から41のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットがアミノ酸置換S354C及びT366Wを含み、Fcドメインの第2のサブユニットがアミノ酸置換Y349C、T366S、L368A及びY407Vを含む(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項39から42のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、天然IgG1のFcドメインと比較して、Fc受容体に対する結合親和性の低下及び/又はエフェクター機能の低下を呈する、請求項24から43のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインが、Fc受容体への結合を低減する及び/又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項24から44のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 前記一又は複数のアミノ酸置換が、L234、L235、及びP329(Kabat EUインデックスによる番号付け)からなる群より選択される一又は複数の位置におけるものである、請求項45に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fcドメインの各サブユニットが、活性化Fc受容体への結合を低減する及び/又はエフェクター機能を低下させる三つのアミノ酸置換を含んでおり、前記アミノ酸置換はL234A、L235A及びP329Gである(Kabat EUインデックスによる番号付け)、請求項24から46のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- Fc受容体がFcγ受容体である、請求項44から47のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)である、請求項44から48のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1から49のいずれか一項に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子をコードする一又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項50に記載のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクター、特に発現ベクター。
- 請求項50に記載のポリヌクレオチド又は請求項51に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- メソテリン及びT細胞活性化抗原に特異的に結合することができるT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の生成方法であって、a)請求項52に記載の宿主細胞を、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、b)任意選択的にT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む方法。
- 請求項53に記載の方法により生成される、T細胞活性化二重特異性抗原結合分子。
- 請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又は請求項55に記載の薬学的組成物。
- それを必要とする個体の疾患の治療における使用のための、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又は請求項55に記載の薬学的組成物。
- 疾患ががんである、請求項57に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
- それを必要とする個体の疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子の使用。
- 個体に対し、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法。
- 前記疾患ががんである、請求項59に記載の使用又は請求項60に記載の方法。
- 標的細胞を、T細胞の存在下において、請求項1から49のいずれか一項又は請求項54に記載のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
- 上述の本発明。
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US11566082B2 (en) | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
KR20240024318A (ko) | 2014-11-20 | 2024-02-23 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 CD3 ABD 엽산 수용체 1(FolR1) 및 PD-1 축 결합 길항물질의 조합 요법 |
LT3223845T (lt) | 2014-11-26 | 2021-08-25 | Xencor, Inc. | Heterodimeriniai antikūnai, kurie suriša cd3 ir cd20 |
US10259887B2 (en) | 2014-11-26 | 2019-04-16 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens |
AR106188A1 (es) | 2015-10-01 | 2017-12-20 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización |
EP3356410B1 (en) | 2015-10-02 | 2021-10-20 | F. Hoffmann-La Roche AG | Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules |
KR20180085740A (ko) | 2015-12-09 | 2018-07-27 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항-약물 항체의 형성을 감소시키기 위한 ii형 항-cd20 항체 |
US10596257B2 (en) | 2016-01-08 | 2020-03-24 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods of treating CEA-positive cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-CEA/anti-CD3 bispecific antibodies |
PE20231511A1 (es) | 2016-03-22 | 2023-09-26 | Hoffmann La Roche | Moleculas biespecificas de celulas t activadas por proteasas que se unen especificamente al receptor 1 de folato (folr1) y cd3 |
US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
WO2017194592A1 (en) | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Method of storing a separation matrix |
ES2874974T3 (es) | 2016-05-11 | 2021-11-05 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Matriz de separación |
CN109311948B (zh) | 2016-05-11 | 2022-09-16 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 清洁和/或消毒分离基质的方法 |
US10654887B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
JP7175769B2 (ja) * | 2016-06-30 | 2022-11-21 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 改善された養子t細胞療法 |
CN109843926B (zh) | 2016-09-30 | 2023-01-20 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 针对cd3的双特异性抗体 |
CA3059769A1 (en) * | 2017-04-28 | 2018-11-01 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof |
TWI690539B (zh) * | 2017-06-22 | 2020-04-11 | 財團法人生物技術開發中心 | 一個需依賴標靶細胞使T細胞接合及活化之不對稱異二聚Fc-ScFv融合抗體形式及其在癌症治療上之應用 |
MX2020008289A (es) | 2018-02-08 | 2020-09-25 | Genentech Inc | Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso. |
WO2019204522A1 (en) * | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Invenra Inc. | Binding molecules |
BR112020021279A2 (pt) * | 2018-04-17 | 2021-04-13 | Invenra Inc. | Constructos de anticorpos trispecíficos trivalentes |
JP2021528988A (ja) * | 2018-07-04 | 2021-10-28 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 新規の二重特異性アゴニスト4−1bb抗原結合分子 |
CN110964114B (zh) * | 2018-09-29 | 2023-07-04 | 上海博槿生物科技有限公司 | 一种双靶点抗原结合分子 |
JP7061733B2 (ja) * | 2018-12-21 | 2022-04-28 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | Cd3に結合する抗体 |
US20220106403A1 (en) * | 2020-05-14 | 2022-04-07 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind msln and cd3 |
WO2021231976A1 (en) | 2020-05-14 | 2021-11-18 | Xencor, Inc. | Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3 |
EP3915580A1 (en) * | 2020-05-29 | 2021-12-01 | Numab Therapeutics AG | Multispecific antibody |
MX2022016069A (es) | 2020-06-19 | 2023-02-02 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se unen a cd3 y cd19. |
CN117120477A (zh) * | 2020-11-10 | 2023-11-24 | 上海齐鲁制药研究中心有限公司 | 针对密蛋白18a2和cd3的双特异性抗体及其应用 |
KR20230156079A (ko) | 2021-03-09 | 2023-11-13 | 젠코어 인코포레이티드 | Cd3과 cldn6에 결합하는 이종이량체 항체 |
JP2024509274A (ja) | 2021-03-10 | 2024-02-29 | ゼンコア インコーポレイテッド | Cd3及びgpc3に結合するヘテロ二量体抗体 |
CN114423789B (zh) * | 2021-12-24 | 2022-09-30 | 浙江时迈药业有限公司 | 针对间皮素的抗体及其用途 |
US20230340128A1 (en) | 2022-02-24 | 2023-10-26 | Xencor, Inc. | Anti-cd28 x anti-msln antibodies |
WO2023246911A1 (zh) * | 2022-06-24 | 2023-12-28 | 北京可瑞生物科技有限公司 | 基于t细胞受体的双特异性多肽分子及其用途 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012504402A (ja) * | 2008-10-01 | 2012-02-23 | マイクロメット アーゲー | PSCA×CD3、CD19×CD3、C−MET×CD3、エンドシアリン×CD3、EpCAM×CD3、IGF−1R×CD3、またはFAPアルファ×CD3の異種間特異的二重特異性単鎖抗体 |
WO2014056783A1 (en) * | 2012-10-08 | 2014-04-17 | Roche Glycart Ag | Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use |
JP2014515921A (ja) * | 2011-05-06 | 2014-07-07 | ザ ガバメント オブ ザ ユナイテツド ステイツ オブ アメリカ アズ リプリゼンテツド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒユーマン サービシズ | メソテリンを標的とする組換え免疫毒素 |
WO2014131712A1 (en) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | Roche Glycart Ag | Bispecific t cell activating antigen binding molecules |
WO2014131694A1 (en) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | Roche Glycart Ag | Bispecific t cell activating antigen binding molecules |
JP2014529402A (ja) * | 2011-08-23 | 2014-11-13 | ロシュ グリクアート アーゲー | 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 |
Family Cites Families (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL7802170A (nl) | 1977-04-18 | 1978-10-20 | Hitachi Metals Ltd | Sierraad. |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
EP0368684B2 (en) | 1988-11-11 | 2004-09-29 | Medical Research Council | Cloning immunoglobulin variable domain sequences. |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
LU91067I2 (fr) | 1991-06-14 | 2004-04-02 | Genentech Inc | Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines |
WO1994004679A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
GB9114948D0 (en) | 1991-07-11 | 1991-08-28 | Pfizer Ltd | Process for preparing sertraline intermediates |
ES2136092T3 (es) | 1991-09-23 | 1999-11-16 | Medical Res Council | Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados. |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
CA2372813A1 (en) | 1992-02-06 | 1993-08-19 | L.L. Houston | Biosynthetic binding protein for cancer marker |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
DK0979281T3 (da) | 1997-05-02 | 2005-11-21 | Genentech Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele |
US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
IL136544A0 (en) | 1997-12-05 | 2001-06-14 | Scripps Research Inst | Humanization of murine antibody |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
MXPA02003456A (es) | 1999-10-04 | 2002-10-23 | Medicago Inc | Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos. |
CN1961003B (zh) | 2004-03-31 | 2013-03-27 | 健泰科生物技术公司 | 人源化抗TGF-β抗体 |
SG172616A1 (en) | 2004-04-13 | 2011-07-28 | Hoffmann La Roche | Anti-p-selectin antibodies |
TWI380996B (zh) | 2004-09-17 | 2013-01-01 | Hoffmann La Roche | 抗ox40l抗體 |
ES2755976T3 (es) | 2005-02-07 | 2020-04-24 | Roche Glycart Ag | Moléculas de unión a antígeno que se unen a EGFR, vectores que las codifican y usos de las mismas |
JP4949373B2 (ja) * | 2005-03-10 | 2012-06-06 | モルフォテック、インク. | 抗メソテリン抗体 |
EP3050963B1 (en) | 2005-03-31 | 2019-09-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Process for production of polypeptide by regulation of assembly |
AR060070A1 (es) | 2006-03-24 | 2008-05-21 | Merck Patent Gmbh | Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria |
JP2009541275A (ja) | 2006-06-22 | 2009-11-26 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | 二重特異性抗体の生産 |
US9266967B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-02-23 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US8242247B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-08-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US8227577B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
US20090162359A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Christian Klein | Bivalent, bispecific antibodies |
DK2235064T3 (en) | 2008-01-07 | 2016-01-11 | Amgen Inc | A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects |
US20120100140A1 (en) * | 2009-01-23 | 2012-04-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Stabilized fc polypeptides with reduced effector function and methods of use |
EP2424567B1 (en) | 2009-04-27 | 2018-11-21 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Method for making heteromultimeric molecules |
CN103124743A (zh) | 2009-12-29 | 2013-05-29 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | Ron结合构建物及其使用方法 |
WO2011143545A1 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Rinat Neuroscience Corporation | Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them |
DK2635607T3 (da) | 2010-11-05 | 2019-11-18 | Zymeworks Inc | Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet |
EP4303237A3 (en) * | 2010-11-30 | 2024-03-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cytotoxicity-inducing therapeutic agent |
TWI477513B (zh) | 2010-12-20 | 2015-03-21 | 建南德克公司 | 抗間皮素(mesothelin)抗體及免疫接合物 |
AU2012234335B2 (en) | 2011-03-29 | 2016-09-01 | Roche Glycart Ag | Antibody Fc variants |
JP6541974B2 (ja) | 2011-12-20 | 2019-07-10 | メディミューン,エルエルシー | 二重特異的抗体足場用改変ポリペプチド |
US9248181B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-02-02 | Merus B.V. | Methods and means for the production of Ig-like molecules |
US10202452B2 (en) * | 2012-04-20 | 2019-02-12 | Aptevo Research And Development Llc | CD3 binding polypeptides |
UY35148A (es) * | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc | Immunoglobulinas heterodiméricas |
RU2687143C2 (ru) * | 2013-10-06 | 2019-05-07 | Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез | Модифицированный экзотоксин а псевдомонад |
JP6557664B2 (ja) * | 2014-01-06 | 2019-08-07 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 一価の血液脳関門シャトルモジュール |
-
2016
- 2016-09-29 US US15/279,799 patent/US20170096485A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-29 JP JP2018516675A patent/JP2018536389A/ja active Pending
- 2016-09-29 AR ARP160102986A patent/AR106365A1/es unknown
- 2016-09-29 EP EP16775650.1A patent/EP3356417A1/en not_active Withdrawn
- 2016-09-29 WO PCT/EP2016/073173 patent/WO2017055391A1/en active Application Filing
- 2016-09-29 CN CN201680051891.0A patent/CN108026179A/zh active Pending
- 2016-09-30 TW TW105131822A patent/TW201726721A/zh unknown
-
2018
- 2018-11-05 HK HK18114074.0A patent/HK1254967A1/zh unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012504402A (ja) * | 2008-10-01 | 2012-02-23 | マイクロメット アーゲー | PSCA×CD3、CD19×CD3、C−MET×CD3、エンドシアリン×CD3、EpCAM×CD3、IGF−1R×CD3、またはFAPアルファ×CD3の異種間特異的二重特異性単鎖抗体 |
JP2014515921A (ja) * | 2011-05-06 | 2014-07-07 | ザ ガバメント オブ ザ ユナイテツド ステイツ オブ アメリカ アズ リプリゼンテツド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒユーマン サービシズ | メソテリンを標的とする組換え免疫毒素 |
JP2014529402A (ja) * | 2011-08-23 | 2014-11-13 | ロシュ グリクアート アーゲー | 二重特異性t細胞活性化抗原結合分子 |
WO2014056783A1 (en) * | 2012-10-08 | 2014-04-17 | Roche Glycart Ag | Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use |
WO2014131712A1 (en) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | Roche Glycart Ag | Bispecific t cell activating antigen binding molecules |
WO2014131694A1 (en) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | Roche Glycart Ag | Bispecific t cell activating antigen binding molecules |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BIODRUGS, vol. 27, JPN6020035119, 2013, pages 35 - 53, ISSN: 0004346706 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170096485A1 (en) | 2017-04-06 |
EP3356417A1 (en) | 2018-08-08 |
HK1254967A1 (zh) | 2019-08-02 |
TW201726721A (zh) | 2017-08-01 |
AR106365A1 (es) | 2018-01-10 |
WO2017055391A1 (en) | 2017-04-06 |
CN108026179A (zh) | 2018-05-11 |
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