CN103764681B - 双特异性抗原结合分子 - Google Patents
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Abstract
本发明一般涉及新的双特异性抗原结合分子。此外,本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸,及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法,及在疾病的治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。
Description
技术领域
本发明一般涉及双特异性抗原结合分子。此外,本发明涉及编码这类双特异性抗原结合分子的多核苷酸,及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法,及在疾病的治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。
背景技术
能够结合两种或多种抗原的双特异性或多特异性抗体为本领域已知。这类多特异性结合蛋白可以通过杂交瘤细胞融合、化学缀合或重组DNA技术来产生。
双特异性抗体对治疗应用具有巨大的利益,因为它们允许同时结合和失活两种或多种靶抗原,从而避免了对联合治疗的需要。双特异性抗体的另一有前景的应用是作为免疫效应细胞的招募者(engager)例如用于细胞癌免疫疗法。为了此目的,设计与靶细胞上的表面抗原和例如与T细胞受体(TCR)复合物的激活成分结合的双特异性抗体。这种抗体与它的两种靶标的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间暂时相互作用,导致任意细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活和随后的靶细胞裂解。因此,独立于CTL的正常MHC限制性激活所需的靶细胞肽抗原呈递或T细胞特异性,将免疫反应重定向至靶细胞。在此背景中,CTL仅在靶细胞呈递双特异性抗体给它们时,即在模拟免疫联会(immunological synapse)时激活,而不是简单地通过抗体与T细胞抗原的结合而激活。
近来发展了多种重组多特异性抗体形式,包括例如四价IgG单链可变片段(scFv)融合(见例如Coloma&Morrison,Nat Biotechnol15,159-163(1997))、四价IgG样双可变结构域抗体(Wu等,Nat Biotechnol25,1290-1297(2007))或二价大鼠/小鼠杂合双特异性IgG(见例如Lindhofer等,J Immunol155,219-225(1995))。
还制备了其中不再保留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的几种双特异性形式。实例包括双抗体(见例如Holliger等,Proc Natl Acad Sci USA90,6444-6448(1995))、串联scFv分子(见例如Bargou等,Science321,974-977(2008))及其多种衍生物。
众多正在发展的形式显示归因于双特异性抗体的巨大潜能。但是,产生适合用于特定目的双特异性抗体的任务绝非不重要,需进行许多考虑。例如,取决于靶抗原的特征和预期的作用,需要恰当地选择抗体的效价和几何形状。对于所有治疗性抗体,必须平衡有效性和毒性,其需要最小化抗体的免疫原性,并优化抗体的药物动力学性质。另外,还须考虑是否希望Fc介导的作用。此外,以临床上足够的量和纯度产生双特异性抗体构建提出了重大的挑战,因为共表达时抗体重链的同二聚化和/或不同特异性的抗体重链和轻链的错配降低了正确组装的构建体的产率,产生许多无功能的副产物,将难以从其分离希望的双特异性抗体。
鉴于双特异性抗体可能的应用的数目的不断增加,以及与目前可用的双特异性抗体相关的困难和不足,仍存在对这类分子的新的改进形式的需要。
发明概述
在第一方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含特异性结合第一抗原的第一Fab片段,特异性结合第二抗原的第二Fab片段,及包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域;其中
a)该双特异性抗原结合分子提供与该第一和/或第二抗原的单价结合;
b)该第一Fab片段、该第二Fab片段和该第一Fc结构域亚基相互融合;且
c)在该第一和/或第二Fab片段中进行以下取代之一:(i)可变结构域VL和VH相互取代;(ii)恒定结构域CL和CH1相互取代;或(iii)可变和恒定结构域VL-CL和VH-CH1都相互取代;
只要不在该第一和第二Fab片段中进行相同的取代。
在具体实施方案中,该第一Fab片段在其C端与该第二Fab片段的N端融合,该第二Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合。在更具体的实施方案中,该第一Fab片段在其重链的C端与该第二Fab片段的重链的N端融合,该第二Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合。在其他实施方案中,该第二Fab片段在其C端与该第一Fab片段的N端融合,该第一Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合。在更具体的实施方案中,该第二Fab片段在其重链的C端与该第一Fab片段的重链的N端融合,该第一Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合。还在其他实施方案中,该第二Fab片段在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合,该第一Fc结构域亚基转而在其C端与该第一Fab片段的N端融合。在更具体的实施方案中,该第二Fab片段在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合,该第一Fc结构域亚基转而在其C端与该第一Fab片段的重链的N端融合。
在其中该第一Fab片段在其重链的C端与该第二Fab片段的重链的N端融合,该第二Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合,或该第二Fab片段在其重链的C端与该第一Fab片段的重链的N端融合,该第一Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合的实施方案中,该第一Fab片段的Fab轻链和该第二Fab片段的Fab轻链还可以可选地经肽接头相互融合。
在一个实施方案中,在该第一Fab片段中进行取代。在一些实施方案中,该取代是可变结构域VL和VH的相互取代。在其他实施方案中,该取代是恒定结构域CL和CH1的相互取代。
在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子基本上由该第一Fab片段、该第二Fab片段、该Fc结构域和可选的一个或多个肽接头组成。
在具体实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含特异性结合该第一或第二抗原的第三Fab片段。在一个实施方案中,该第三Fab片段与该第二Fc结构域亚基融合。在更具体的实施方案中,该第三Fab片段在其C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。在甚至更具体的实施方案中,该第三Fab片段在其重链的C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。在一个实施方案中,该第三Fab片段特异性结合该第二抗原。在一些实施方案中,该第二Fab片段、该第三Fab片段和该Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分。在具体的这种实施方案中,该免疫球球蛋白分子是IgG类的免疫球蛋白分子,更具体而言,是IgG1或IgG4亚类的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中,该免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子基本上由特异性结合该第一抗原的第一Fab片段、特异性结合该第二抗原的免疫球蛋白分子和可选的一个或多个肽接头组成。
在一个实施方案中,在特异性结合相同抗原的Fab片段中进行相同的取代。在另一实施方案中,仅在该第一Fab片段中进行取代。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子提供与该第一抗原的单价结合。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子不包含单链Fab片段。
在某些实施方案中,该Fc结构域包含促进该第一和第二Fc结构域亚基的结合的修饰。在具体的这种实施方案中,用具有更大侧链体积的氨基酸残基取代该Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基,从而在该第一亚基的CH3结构域内产生可定位在该第二亚基的CH3结构域内的凹陷中的凸起,用具有更小侧链体积的氨基酸残基取代该Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基,从而在该第二亚基的CH3结构域内产生该第一亚基的CH3结构域内的凸起(protuberance)可定位在其中的凹陷(cavity)。在一个实施方案中,该Fc结构域是IgG Fc结构域,更具体而言,是IgG1或IgG4Fc结构域。在一个实施方案中,该Fc结构域是人Fc结构域。在某些实施方案中,将该Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有改变的对Fc受体的结合亲和力和/或改变的效应子功能。
根据本发明的另一方面,提供编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。本发明还涵盖由本发明的多核苷酸编码的多肽。本发明还提供包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体,及包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中,该宿主细胞是真核细胞,尤其是哺乳动物细胞。
在另一方面,本发明提供产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法,其包括步骤:a)在适于表达该双特异性抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞;和b)回收该双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的双特异性抗原结合分子。
本发明还提供包含本发明的双特异性抗原结合分子和可药用载体的药物组合物。
本发明还涵盖使用本发明的双特异性抗原结合分子和药物组合物的方法。在一方面,本发明提供本发明的双特异性抗原结合分子或药物组合物用作药物。在一方面,本发明提供本发明的双特异性抗原结合分子或药物组合物用于在有需要的个体中治疗疾病。在具体实施方案中,该疾病是癌症。
本发明还提供本发明的双特异性抗原结合分子在制备用于在有需要的个体中治疗疾病的药物中的用途;以及在个体中治疗疾病的方法,该方法包括对该个体施用治疗有效量的组合物,该组合物以可药用形式包含本发明的双特异性抗原结合分子。在具体实施方案中,该疾病是癌症。在以上实施方案的任一个中,该个体优选是哺乳动物,尤其是人。
附图简述
图1.本发明的双特异性抗原结合分子的示例性形式的图解。(A)不同特异性的Crossfab片段与包含在抗体中的Fab片段的N端融合的“2+1”形式(“2+1IgG Crossfab(N端)”)。(B)不同特异性的Crossfab片段与包含在缺乏第二Fab片段的抗体中的Fab片段的N端融合的“1+1”形式(1+1IgG Crossfab(N端))。(C)(A)中的“2+1”形式,其中Crossfab片段和Crossfab片段与之融合的Fab片段的顺序颠倒(“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒”)。(D)不同特异性的Crossfab片段与包含在抗体中的Fc结构域亚基的C端融合的“2+1”形式(“2+1IgG Crossfab(C端)”)。黑点:Fc结构域中促进异二聚化的可选修饰。
图2.(A,B)“1+1IgG Crossfab(N-端),Fc(臼(hole))P329G LALA/Fc(杵(knob))wt”(抗-MCSP/抗-huCD3)(见SEQ ID NO1、2、3和4)的SDS PAGE(4-12%Tris-乙酸(A)或4-12%Bis/Tris(B),NuPage Invitrogen,考马斯染色),(A)非还原,(B)还原。(C)“1+1IgGCrossfab(N-端),Fc(臼)P329G LALA/Fc(杵)wt”(抗-MCSP/抗-huCD3)的分析型大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl;注入50μg样品)。
图3.(A,B)“2+1IgG Crossfab(N-端)”(抗-MCSP/抗-huCD3)(见SEQ ID NO1、3、4和5)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris,NuPage Invitrogen,考马斯染色),(A)非还原,(B)还原。(C)“2+1IgG Crossfab(N-端)”(抗-MCSP/抗-huCD3)的分析型大小排阻层析(Superdex20010/300GLGE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl;注入50μg样品)。
图4.(A,B)“2+1IgG Crossfab(N-端),颠倒”(抗-CEA/抗-huCD3)(见SEQ ID NO3、8、9和10)的SDS PAGE(4-12%Bis/Tris,NuPage Invitrogen,考马斯染色),(A)非还原,(B)还原。(C)“2+1IgG Crossfab(N-端),颠倒”(抗-CEA/抗-huCD3)的分析型大小排阻层析(Superdex20010/300GL GE Healthcare;2mM MOPS pH7.3,150mM NaCl,0.02%(w/v)NaCl;注入50μg样品)。
图5.(A,B)“2+1IgG Crossfab(C-端)”(抗-c-Met/抗-Her3)(见SEQ ID NO11、12、13、14)的毛细管电泳(CE)-SDS凝胶分析,(A)非还原,(B)还原。
图6.双特异性构建体与人MCSP的D3结构域和人CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(杵)-Avi/Fc(臼)的同时结合。(A)Biacore测定设置;(B)“2+1IgG Crossfab(N-端)”的测量。
图7.在Colo-38肿瘤细胞的存在(A、B)或缺乏(C、D)下,用1nM的不同CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab(N-端)”、“(scFv)2”)或相应的对照IgG处理24小时后,在全血的上清中测量的不同细胞因子的水平。
图8.在表达人MCSP的MV-3肿瘤靶细胞的存在或缺乏下,用所示浓度的“2+1IgGCrossfab(N-端)”双特异性构建体(靶向猕猴CD3和人MCSP)孵育43小时后,来自两只不同动物(猕猴Nestor,猕猴Nobu)的猕猴CD8+T细胞上晚期激活标记CD25的表面表达水平(E:T比=3:1)。作为对照,使用了参考IgG(抗-猕猴CD3IgG,抗-人MCSP IgG)或非生理刺激物PHA-M。
图9.与人全T细胞共培养(E:T比=5:1),并通过不同浓度的“2+1IgGCrossfab(N-端)”和“(scFv)2”双特异性分子及相应的IgG激活20小时时,MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。
图10.与人全T细胞共培养(E:T比=5:1),并通过不同浓度的双特异性构建体和相应的IgG激活21小时时,MDA-MB-435肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。比较了CD3-MCSP双特异性“2+1IgG Crossfab(N-端)”和“1+1IgG Crossfab(N-端)”构建体、“(scFv)2”分子及相应的IgG。
图11.与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并用不同的CD3-MCSP双特异性构建体(“2+1IgG Crossfab(N-端)”和“(scFv)2”)处理~26小时时,huMCSP阳性MV-3黑素瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。
图12.本发明的具有连接轻链的双特异性抗原结合分子的示例性构型。(A)“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”分子的图解。(B)“1+1IgGCrossfab(N端),连接轻链”分子的图解。(C)“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒,连接轻链”分子的图解。(D)“1+1IgG Crossfab(N端),颠倒,连接轻链”分子的图解。
图13.CE-SDS分析。显示为“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”的SDS PAGE的电泳图(泳道1:还原;泳道2:非还原)。
图14.“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”(终产物)的分析型大小排阻层析。注入20μg样品“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”。
图15.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并用不同CD3-MCSP双特异性构建体处理~44小时时,MCSP阳性MV-3肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。人PBMC分离自健康志愿者的新鲜血液。
图16.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并用不同CD3-MCSP双特异性构建体处理~22小时时,MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。人PBMC分离自健康志愿者的新鲜血液。
图17.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并用不同CD3-MCSP双特异性构建体处理~22小时时,MCSP阳性Colo-38肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。人PBMC分离自健康志愿者的新鲜血液。
图18.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并用不同CD3-MCSP双特异性构建体处理~22小时时,MCSP阳性WM266-4细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。人PBMC分离自健康志愿者的新鲜血液。
图19.在表达人MCSP的Colo-38肿瘤靶细胞的存在或缺乏下,用10nM、80pM或3pM的不同CD3-MCSP双特异性构建体孵育22小时后,人CD8+T细胞上早期激活标记CD69(A)和晚期激活标记CD25(B)的表面表达水平(E:T比=10:1)。
图20.CE-SDS分析。(A)显示为“1+1IgG Crossfab(N-端);VL/VH交换(LC007/V9)”的SDS-PAGE的电泳图:a)非还原,b)还原。(B)显示为“1+1CrossMab;CL/CH1交换(LC007/V9)”的SDS-PAGE的电泳图:a)还原,b)非还原。(C)显示为“2+1IgG Crossfab(N-端),颠倒;CL/CH1交换(LC007/V9)”的SDS-PAGE的电泳图:a)还原,b)非还原。(D)显示为“2+1IgGCrossfab(N-端);VL/VH交换(M4-3ML2/V9)”的SDS-PAGE的电泳图:a)还原,b)非还原。(E)显示为“2+1IgG Crossfab(N-端);CL/CH1交换(M4-3ML2/V9)”的SDS-PAGE的电泳图:a)还原,b)非还原。(F)显示为“2+1IgG Crossfab(N-端),颠倒;CL/CH1交换(CH1A1A/V9)”的SDS-PAGE的电泳图:a)还原,b)非还原。
图21.用所示浓度的CD3/MCSP“1+1CrossMab”、“1+1IgG Crossfab(N-端)”和“2+1IgG Crossfab(N-端)”构建体孵育24小时后,人CD4+或CD8+T细胞上早期激活标记CD69(A)或晚期激活标记CD25(B)的表面表达水平。该测定按所示在MV-3靶细胞的存在或缺乏下进行。
图22.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并通过不同浓度的“2+1IgG Crossfab(N-端),颠倒(VL/VH)”对“2+1IgG Crossfab(N-端),颠倒(CL/CH1)”构建体激活28小时时,MKN-45(A)或LS-174T(B)肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。
图23.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并通过不同浓度的“2+1IgG Crossfab(N-端)(VL/VH)”对“2+1IgG Crossfab(N-端)(CL/CH1)”构建体激活26小时时,WM266-4肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。
图24.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并通过不同浓度的“2+1IgG Crossfab(N-端)(VH/VL)”对“2+1IgG Crossfab(N-端)(CL/CH1)”构建体激活27小时时,MV-3肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。
图25.在与人PBMC共培养(E:T比=10:1),并通过所示不同浓度的“2+1IgGCrossfab(N-端)”、“1+1CrossMab”和“1+1IgG Crossfab(N-端)”激活21小时时,人MCSP阳性WM266-4(A)或MV-3(B)肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。
图26.通过FACS测定的双特异性构建体与Jurkat细胞表达的人CD3(A)或与LS-174T细胞表达的人CEA(B)的结合。作为对照,还评估了等同最大浓度的参考IgG及由标记二抗(山羊抗-人FITC缀合AffiniPure F(ab’)2片段,Fcγ片段特异,Jackson ImmunoResearch Lab#109-096-098)引起(stain)的背景。
图27.通过FACS测定的双特异性构建体与Jurkat细胞表达的人CD3或与WM266-4肿瘤细胞表达的人MCSP(B)的结合。
发明详述
定义
除非下文中另作定义,本文中按本领域中的通常用法使用术语。
本文所用的术语“抗原结合分子”在其最广泛的含义上指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白及其衍生物,例如片段。
术语“双特异性的”意指抗原结合分子能够特异性结合两个不同的抗原决定簇。通常,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合部位,两个抗原结合部位中的每一个对不同的抗原决定簇特异。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇,尤其是表达在两种不同细胞上的两个抗原决定簇。
本文所用的术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义,指多肽大分子上的部位(例如氨基酸的连续序列或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型),抗原结合部分与之结合,形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以见于例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、游离在血清中和/或胞外基质(ECM)中。除非另有说明,本文中称为抗原的蛋白质(例如MCSP、FAP、CEA、EGFR、CD33、CD3、c-Met、Her3)可以是任意天然形式,该蛋白质来自任意脊椎动物来源,包括哺乳动物,如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在具体实施方案中,该抗原是人蛋白质。在本文中提到具体的蛋白质时,该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质,以及细胞内加工产生的任意形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体,例如剪接变体或等位基因变体。用作抗原的示例性人蛋白质包括但不限于:黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP),也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(Uni Prot no.Q6UVK1,NCBI检索号NP_001888);成纤维细胞激活蛋白(FAP),也称为Seprase(Uni Prot no.Q12884、Q86Z29、Q99998,NCBI检索号NP_004451);癌胚抗原(CEA),也称为癌胚抗原相关细胞黏附分子5(UniProt no.P06731,NCBI检索号NP_004354);CD33,也称为gp67或Siglec-3(UniProt no.P20138,NCBI检索号NP_001076087、NP_001171079);表皮生长因子受体(EGFR),也称为ErbB-1或Her1(UniProtno.P0053,NCBI检索号NP_958439、NP_958440);CD3,尤其是CD3的ε亚基(UniProtno.P07766,NCBI检索号NP_000724);c-Met,也称为肝细胞生长因子受体(UniProtno.P08581,NCBI检索号NP_000236、NP_001120972);和Her3,也称为ErbB-3(UniProtno.P21860,NCBI检索号NP_001973、NP_001005915)。在某些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子与第一或第二抗原的表位结合,该表位在来自不同物种的该第一或第二抗原中保守。
“特异性结合”意指该结合对抗原具有选择性,且可以与不想要或非特异的相互作用区分开。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测定抗体结合特异性抗原决定簇的能力,该其他技术例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))和传统结合测定(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。在一个实施方案中,例如通过SPR测量,抗体与不相关蛋白质结合的程度小于该抗体与抗原的结合的约10%。在某些实施方案中,与抗原结合的抗体或其片段具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小,例如从10-8M至10-13M,例如从10-9M至10-13M)解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如受体)的单个结合部位和它的结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明,本文所用的“结合亲和力”指反映结合对(例如抗原结合部分和抗原,或受体和它的配体)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以表示为解离常数(KD),其是解离和结合速率常数(分别为koff和kon)的比值。因此,等同的亲和力可以包含不同的速率常数,只要速率常数的比值保持相同。亲和力可以通过本领域已知的完善方法来测量,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
本文所用的术语“价”指抗原结合分子中指定数目的抗原结合部位的存在。因此,术语“与抗原的单价结合”指抗原结合分子中存在一个(且不超过一个)对抗原特异的抗原结合部位。
“抗原结合部位”指抗原结合分子的部位,即一个或多个氨基酸残基,其提供与抗原的相互作用。例如,抗体的抗原结合部位包含来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合部位,Fab片段通常具有单个抗原结合部位。
本文所用的术语“抗原结合部分”指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。抗原结合部分包括本文中进一步定义的抗体及其片段。具体的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域,其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中,抗原结合部分可以包含本文中进一步定义且为本领域已知的抗体恒定区。有用的重链恒定区包括α、δ、ε、γ或μ五种同种型中的任一种。有用的轻链恒定区包括κ和λ两种同种型中的任一种。
本文关于Fab片段等所用的术语“第一”和“第二”是为了在存在一个以上各类型的部分时方便区分而使用。除非明确说明,这些术语的使用并非旨在赋予双特异性抗原结合分子的具体顺序或取向。
本文所用的术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。单链Fab片段意指这样的Fab分子,其中通过肽接头连接Fab轻链和Fab重链来形成单条肽链。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体的结构的蛋白质。例如,IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由二硫键连接的两条轻链和两条重链组成。从N端至C端,每条重链具有可变区(VH),也称为可变重链结构域或重链可变结构域,随后是铰链区(HR)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3),也称为重链恒定区。在IgE类免疫球蛋白的情况下,重链还具有CH4结构域。因此,免疫球蛋白重链是在N端至C端方向上由以下结构域组成的多肽:VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4)。类似地,从N端至C端,每条轻链具有可变区(VL),也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域,随后是恒定轻链(CL)结构域,也称为轻链恒定区。因此,免疫球蛋白轻链是在N端至C端方向上由以下结构域组成的多肽:VL-CL。免疫球蛋白的重链可以分配至称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的五种类型之一,它们中的一些可以进一步划分为亚型,例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定结构域的氨基酸序列,免疫球蛋白的轻链可以分配至称为κ和λ的两种类型之一。免疫球蛋白基本上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab片段和Fc结构域组成。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用,涵盖包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段的多种抗体结构,只要它们显示希望的抗原结合活性。
“抗体片段”指完整抗体以外的分子,其包含完整抗体的部分,该部分结合该完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)和单结构域抗体。某些抗体片段的综述见Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)。scFv片段的综述见例如Plückthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约,269-315页(1994);还见WO93/16185;及美国专利号5,571,894和5,587,458。包含挽救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论见美国专利号5,869,046。双抗体是可以为二价或双特异性的具有两个抗原结合部位的抗体片段。见例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat Med9,129-134(2003);和Hollinger等,Proc Natl Acad SciUSA90,6444-6448(1993)。Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中,单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;见例如美国专利号6,248,516B1)。如本文中所述,抗体片段可以通过多种技术来制备,其包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化,以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生。
“Fab片段”指由免疫球蛋白的重链VH和CH1结构域(“Fab重链”)及轻链VL和CL结构域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。与另一蛋白质融合的Fab片段以其未修饰的形式在其重链C端或N端融合。因此,在可变结构域VH和VL相互取代时,Fab片段在CH1结构域的C端或VL结构域的N端融合。类似地,在恒定结构域CH1和CL相互取代时,Fab片段在CL结构域的C端或VH结构域的N端融合,在整个Fab重链(VH-CH1)和Fab轻链(VL-CL)相互取代时,Fab片段在其轻链C端或N端融合。
“融合”意指成分(例如Fab片段和Fc结构域亚基)直接或经一个或多个肽接头通过肽键连接。
术语“抗原结合结构域”指抗体的部分,其包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。尤其是,抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的涉及该抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构,每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,91页(2007)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的区域的每一个。通常,天然四链抗体包含六个HVR;三个在VH中(H1、H2、H3),三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。除VH中的CDR1外,CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补决定区”(CDR),这些术语在本文中可互换使用,指可变区的形成抗原结合区的部分。Kabat等,U.S.Dept.of Healthand Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)和Chothia等,J Mol Biol196:901-917(1987)描述了此具体区域,其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或亚群。但是,应用任一定义来指抗体或其变体的CDR旨在处于本文所定义和使用的术语的范围之内。涵盖上文引用的参考文献的每一篇所定义的CDR的适当氨基酸残基在下文表1中给出作为比较。取决于CDR的序列和大小,涵盖具体CDR的精确残基编号将不同。由于抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含具体的CDR。
表1.CDR定义1
CDR | Kabat | Chothia | AbM2 |
VH CDR1 | 31-35 | 26-32 | 26-35 |
VH CDR2 | 50-65 | 52-58 | 50-58 |
VH CDR3 | 95-102 | 95-102 | 95-102 |
VL CDR1 | 24-34 | 26-32 | 24-34 |
VL CDR2 | 50-56 | 50-52 | 50-56 |
VL CDR3 | 89-97 | 91-96 | 89-97 |
1表1中的所有CDR定义的编号按照Kabat等所示的编号惯例。(见下文)。
2表1中所用的具有小写字母“b”的“AbM”指Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件所定义的CDR。
Kabat等还定义了可应用于任意抗体的可变区序列编号系统。本领域普通技术人员可以毫不含糊地将此“Kabat编号”的系统指定给任意可变区序列,而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。本文所用的“Kabat编号”指Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所示的编号系统。除非另有说明,对抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的引用是按照Kabat编号系统。
序列表的多肽序列不是按照Kabat编号系统编号。但是,序列表的序列编号向Kabat编号的转换完全处于本领域技术人员的普通技术范围之内。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此,HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“种类”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要种类的抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,且这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的C端区域,其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的界限可以轻微变动,但人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有说明,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号按照Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号系统,也称为EU指数。本文所用的Fc结构域的“亚基”指形成二聚体Fc结构域的两条多肽之一,即包含免疫球蛋白重链的C端恒定区、能够稳定地自我结合的多肽。例如,IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定区。
“促进Fc结构域的第一和第二亚基的结合的修饰”是Fc结构域亚基的肽主链或翻译后修饰的操作,其减少或防止包含该Fc结构域亚基的多肽与相同的多肽结合形成同二聚体。本文所用的促进结合的修饰尤其包括对希望结合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一和第二亚基)的每一个进行的分开的修饰,其中该修饰彼此互补,以便促进两个Fc结构域亚基的结合。例如,促进结合的修饰可以改变Fc结构域亚基中的一个或两个的结构或电荷,以便分别使得它们的结合在空间上或静电上有利。因此,在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间发生(异)二聚化,其可以在与各亚基(例如Fab片段)融合的其他成分不同的意义上不同。在一些实施方案中,促进结合的修饰包含Fc结构域中的氨基酸突变,具体而言,氨基酸取代。在具体实施方案中,促进结合的修饰包括Fc结构域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变,具体而言,氨基酸取代。
术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性,其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
认为本文所用的术语“改造”包括天然存在或重组的多肽或其片段的主链或翻译后修饰的任意操作。改造包括氨基酸序列、糖基化模式或单个氨基酸的侧链基团的修饰,以及这些方法的组合。
本文所用的术语“氨基酸突变”意在涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任意组合来达到最终构建体,只要最终构建体具有希望的特征,例如减少的与Fc受体的结合、或增加的与另一多肽的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基端和/或羧基端缺失和插入。具体的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如Fc区的结合特征的目的,尤其优选非保守氨基酸取代,即用另一具有不同的结构和/或化学特性的氨基酸取代一个氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)取代。氨基酸突变可以用本领域公知的遗传或化学方法产生。遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR、基因合成等。考虑通过遗传工程以外的方法改变氨基酸的侧链基团的方法(如化学修饰)也可以是有用的。本文中可以用多种名称来表示同一氨基酸突变。例如,从Fc结构域329位的脯氨酸至甘氨酸的取代可以表示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
本文所用的术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任意链,而不涉及产物的具体长度。因此,用来指两个或多个氨基酸的链的肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任意其他术语都包含在“多肽”的定义之内,术语“多肽”可以用来代替这些术语中的任一个,或可与这些术语中的任一个互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽的表达后修饰的产物,该表达后修饰非限制性地包括糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生,但并非必然翻译自指定的核酸序列。它可以以任意方式产生,包括通过化学合成。本发明的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有确定的三维结构,虽然它们并非必然具有这种结构。具有确定的三维结构的多肽称为折叠的,不具有确定的三维结构,而是可以采用很多不同构象的多肽称为解折叠的。
“分离的”多肽或其变体或衍生物指不处于其天然环境中的多肽。不需要具体的纯化水平。例如,分离的多肽可以取自其天然或自然环境。为了本发明的目的,与已通过任意适宜的技术分开、分级分离或部分或基本上纯化的天然或重组多肽一样,将重组产生的多肽和在宿主细胞中表达的蛋白质视为分离的。
“分离的”核酸分子或多核苷酸指已从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如,为了本发明的目的,将包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸视为分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括包含在通常含有该多核苷酸分子的细胞中的多核苷酸分子,但该多核苷酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置上。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正链和负链形式及双链形式。本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。此外,多核苷酸或核酸可以包括或不包括调节元件,如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义,指用来引入并指导与之有效连接的具体基因在靶细胞中的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体,以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体处于靶细胞内侧,即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含含有编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用,指已将外源核酸引入其中的细胞,包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”,其包括初级转化细胞及从其衍生的后代,而不考虑代数。后代在核酸含量上可以并非与亲本细胞完全相同,但可以包含突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明的双特异性抗原结合分子的任意类型的细胞系统。宿主细胞包括培养细胞,例如哺乳动物培养细胞,如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等,以及包含在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。
“激活Fc受体”是在被抗体的Fc结构域结合后引出刺激具有该受体的细胞执行效应子功能的信号发放事件的Fc受体。人激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
依赖抗体的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物通常经Fc区N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。本文所用的术语“减少(或增加)的ADCC”定义为在靶细胞周围介质中给定的抗体浓度下,在给定的时间内,通过上文定义的ADCC的机制裂解的靶细胞数目的减少(增加),和/或在给定的时间内通过ADCC的机制达到给定数目的靶细胞的裂解所需的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加(减少)。ADCC的减少(增加)是相对于通过相同类型的宿主细胞,使用相同的标准产生、纯化、配制和保存方法(其为本领域技术人员已知)产生,但尚未进行改造的同一抗体介导的ADCC而言。例如,由在其Fc结构域中包含减少ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的减少是相对于在Fc结构域中无此氨基酸取代的同一抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的适宜测定为本领域公知(见例如PCT公开号WO2006/082515或PCT专利申请号PCT/EP2012/055393)。
药物(agent)的“有效量”指在施用它的细胞或组织中产生生理变化所必要的量。
药物(例如药物组合物)的“治疗有效量”指对在必要的剂量下和时间内达到希望的治疗或预防结果有效的量。药物的治疗有效量例如消除、减少、推迟、最小化或防止疾病的不良效应。
“个体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类,如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。尤其是,该个体是人。
术语“药物组合物”指这样的制剂,其处于这样的形式,以致使得包含在其中的活性成分的生物学活性有效,且不包含对将施用该制剂的个体具有不可接受的毒性的其他成分。
“可药用载体”指药物组合物中除活性成分以外的成分,其对个体无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所用的“处理”(及其语法变形)指在所处理的个体中改变疾病的自然过程的尝试中的临床干预,且可以为了预防而进行或在临床病理学的过程中进行。希望的处理效果包括但不限于防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任意直接或间接的病理学结果、防止转移、减慢疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态及缓解或改善的预后。在一些实施方案中,用本发明的双特异性抗原结合分子来延缓疾病的发展或减慢疾病的进展。
术语“包装说明书”用来指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明,其含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症的信息和/或关于使用这类治疗产品的警告。
实施方案详述
本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含特异性结合第一抗原的第一Fab片段,特异性结合第二抗原的第二Fab片段,及包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域;其中
a)该双特异性抗原结合分子提供与该第一和/或第二抗原的单价结合;
b)该第一Fab片段、该第二Fab片段和该第一Fc结构域亚基相互融合;且
c)在该第一和/或第二Fab片段中进行以下取代之一:(i)可变结构域VL和VH相互取代;(ii)恒定结构域CL和CH1相互取代;或(iii)可变和恒定结构域VL-CL和VH-CH1都相互取代;
只要不在该第一和第二Fab片段中进行相同的取代。
双特异性抗原结合分子形式
该双特异性抗原结合分子的成分可以以多种构型相互融合。示例性构型显示在图1中。
在具体实施方案中,该第一Fab片段在其C端与该第二Fab片段的N端融合,该第二Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合(见图1A和1B中的实例)。在一个这种实施方案中,该第二Fab片段经免疫球蛋白铰链区与该第一Fc结构域亚基融合。在另一这种实施方案中,该第一Fab片段经肽接头与该第二Fab片段融合。
在一个实施方案中,该第一Fab片段在其重链的C端与该第二Fab片段的重链的N端融合,该第二Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合。
在其他实施方案中,该第二Fab片段在其C端与该第一Fab片段的N端融合,该第一Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合(见图1C中的实例)。在一个这种实施方案中,该第一Fab片段经免疫球蛋白铰链区与该第一Fc结构域亚基融合。在另一这种实施方案中,该第二Fab片段经肽接头与该第一Fab片段融合。在一个实施方案中,该第二Fab片段在其重链的C端与该第一Fab片段的重链的N端融合,该第一Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合。
在其中该第一Fab片段在其重链的C端与该第二Fab片段的重链的N端融合,该第二Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合,或该第二Fab片段在其重链的C端与该第一Fab片段的重链的N端融合,该第一Fab片段转而在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合的一些实施方案中,该第一Fab片段的Fab轻链和该第二Fab片段的Fab轻链还可以可选地经肽接头相互融合(见图12中的实例)。
根据这些实施方案,将不同特异性的两个Fab片段相互融合,这两个Fab片段中的一个转而与Fc结构域亚基融合。此构型允许不同于带有具有不同特异性的免疫球蛋白分子的两个Fab片段的经典双特异性免疫球蛋白形式的几何形状(例如Fab片段之间的距离、角度)。例如,本发明人发现,如果该双特异性抗原结合分子将用于T细胞招募和重定向(数据未示出),则此构型比经典双特异性免疫球蛋白形式更适合用于模拟所需的T细胞和靶细胞之间的免疫突触。
在其他实施方案中,该第二Fab片段在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合,该第一Fc结构域亚基转而在其C端与该第一Fab片段的N端融合(见图1D中的实例)。在一个这种实施方案中,该第二Fab片段经免疫球蛋白铰链区与该第一Fc结构域亚基融合。在另一这种实施方案中,该第一Fab片段经肽接头与该第一Fc结构域亚基融合。在一个实施方案中,该第二Fab片段在其重链的C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合,该第一Fc结构域亚基转而在其C端与该第一Fab片段的重链的N端融合。根据这些实施方案,将不同特异性的两个Fab片段与Fc结构域亚基的两端融合。同样,此构型允许可以对具体应用有利的不同几何形状。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子基本上由该第一Fab片段、该第二Fab片段、该Fc结构域和可选的一个或多个肽接头组成。
本发明的双特异性抗原结合分子提供与它所结合的两种抗原中的至少一种的单价结合。例如在预期靶抗原在高亲和力抗原结合分子结合后内化的情况下,单价结合很重要。在这类情况下,一个以上对靶抗原特异的抗原结合部分的存在可以增强抗原的内化,从而降低其可用性。此外,在不希望靶抗原交联时,单价结合是必需的。例如,在用于T细胞招募和重定向的双特异性抗原结合分子中,与诸如CD3的激活T细胞抗原的二价结合可以导致T细胞甚至在缺乏靶细胞的情况下激活。
但是,在其他情况下,可以希望得到二价结合例如来增加结合亲和力、优化向靶位点的靶向或允许靶抗原交联。
因此,在具体实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含特异性结合该第一或第二抗原的第三Fab片段。在一个实施方案中,该第三Fab片段与该第二Fc结构域亚基融合。在更具体的实施方案中,该第三Fab片段在其C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。在甚至更具体的实施方案中,该第三Fab片段在其重链的C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。在一个实施方案中,该第三Fab片段经免疫球蛋白铰链区与该第二Fc结构域亚基融合。在一个实施方案中,该第三Fab片段特异性结合该第二抗原。
在一些实施方案中,该第二Fab片段、该第三Fab片段和该Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分。在该第三Fab片段特异性结合该第二抗原的实施方案中,该免疫球蛋白分子是特异性结合该第二抗原的免疫球蛋白分子。在具体的这种实施方案中,该免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白分子,更具体而言,是IgG1或IgG4亚类免疫球蛋白分子。在一个具体实施方案中,该免疫球蛋白分子是在S228位(Kabat编号)包含氨基酸取代,尤其是氨基酸取代S228P的IgG4分子。此氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(见Stubenrauch等,Drug Metabolism and Disposition38,84-91(2010))。在一个实施方案中,该免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子基本上由特异性结合该第一抗原的第一Fab片段、特异性结合该第二抗原的免疫球蛋白分子和可选的一个或多个肽接头组成。
根据以上实施方案中的一些,该第一Fab片段的轻链和该第二Fab片段的轻链可选地经肽接头相互融合。取决于该第一和第二Fab片段的构型,该第一Fab片段的轻链可以在其C端与该第二Fab片段的轻链的N端融合,或者该第二Fab片段的轻链可以在其C端与该第一Fab片段的轻链的N端融合。该第一和第二Fab片段的轻链的融合进一步减少了不匹配的Fab重链和轻链的错配,还减少了表达本发明的双特异性抗原结合分子中的一些所需的质粒的数目。
根据以上实施方案的任一个,该双特异性抗原结合分子的成分(例如Fab片段、Fc结构域亚基)可以直接连接或通过多种接头连接,该接头尤其是本文中所述或本领域已知的包含一个或多个氨基酸,通常约2-20个氨基酸的肽接头。适宜的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n肽接头,其中n一般是1和10之间、通常在2和4之间的数字。尤其适合用于该第一和第二Fab片段的轻链相互融合的肽接头是(G4S)2。此外,肽接头可以包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。作为示例,这种接头是EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ IDNO72和73)。尤其是在Fab片段与Fc结构域亚基的N端连接时,它可以经含或不含其他的肽接头的免疫球蛋白铰链区或其部分连接。
在某些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含这样的多肽,其中VL区与CH1区共有羧基端肽键,该CH1区转而与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的抗体轻链(VL-CL)和/或多肽,其中VH区与CL区共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的多肽,其中VH区与CL区共有羧基端肽键,该CL区转而与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与Fab轻链(VL-CL)共有羧基端肽键。
在其他实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含这样多肽,其中Fab重链(VH-CH1)与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VL区共有羧基端肽键,该VL区转而与CH1区共有羧基端肽键,该CH1区转而与包括免疫球蛋白铰链区的Fc结构域亚基(HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的抗体轻链(VL-CL)和/或多肽,其中VH区与CL区共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的多肽,其中Fab轻链(VL-CL)与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VH区共有羧基端肽键,该VH区转而与CL区共有羧基端肽键。
在某些实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含这样多肽,其中VH区与CL区共有羧基端肽键,该CL区转而与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的抗体轻链(VL-CL)和/或多肽,其中VL区与CH1区共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的多肽,其中VL区与CH1区共有羧基端肽键,该CH1区转而与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与Fab轻链(VL-CL)共有羧基端肽键。
在其他实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含这样多肽,其中Fab重链(VH-CH1)与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VH区共有羧基端肽键,该VH区转而与CL区共有羧基端肽键,该CL区转而与包括免疫球蛋白铰链区的Fc结构域亚基(HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的抗体轻链(VL-CL)和/或多肽,其中VL区与CH1区共有羧基端肽键。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的多肽,其中Fab轻链(VL-CL)与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VL区共有羧基端肽键,该VL区转而与CH1区共有羧基端肽键。
还在其他实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含这样的多肽,其中免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VH区共有羧基端肽键,该VH区转而与CL区共有羧基端肽键。
在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子进一步包含免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))。在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子进一步包含可选地包括抗体铰链区的Fc结构域亚基((HR)-CH2-CH3-(CH4))。在这些实施方案的一些中,该双特异性抗原结合分子进一步包含这样的抗体轻链(VL-CL)和/或多肽,其中VL区与CH1区共有羧基端肽键。
Fab片段
本发明的抗原结合分子是双特异性的,即它包含至少两个能够特异性结合两个不同抗原决定簇的抗原结合部分。在具体实施方案中,该双特异性抗原结合分子能够同时结合两个不同的抗原决定簇。根据本发明,该抗原结合部分是Fab片段(即由各包含可变区和恒定区重链和轻链组成的抗原结合结构域)。在一个实施方案中,该Fab片段是人的。在另一实施方案中,该Fab片段是人源化的。还在另一实施方案中,该Fab片段包含人重链和轻链恒定区。
根据本发明,该Fab片段的至少一个是“Crossfab”片段,其中Fab重链和轻链的可变和/或恒定结构域交换。这类修饰防止来自不同Fab片段的重链和轻链的错配,从而提高重组产生中本发明的双特异性抗原结合分子的产率和纯度。换言之,通过该双特异性抗原结合分子的一个或多个Fab片段内的重链和轻链可变和/或恒定结构域的交换来克服双特异性抗体产生中重链和轻链错配的问题,使得不同特异性的Fab片段不具有相同的结构域排列,并因此而不“交换”轻链。
可能的取代包括以下:(i)Fab重链和轻链的可变结构域(VH和VL)相互取代;(ii)Fab重链和轻链的恒定结构域(CH1和CL)相互取代;或(iii)Fab重链和轻链(VH-CH1和VL-CL)相互取代。
为了达到希望的结果,即防止不同特异性的重链和轻链的错配,必须在不同特异性的Fab片段中进行不一样的取代。例如,在特异性结合第一抗原的Fab片段中,可以交换重链和轻链可变结构域,而在特异性结合第二抗原的Fab片段中,可以交换重链和轻链恒定区。作为另一实例,在特异性结合第一抗原的Fab片段中,可以不进行取代,而在特异性结合第二抗原的Fab片段中,可以交换重链和轻链可变结构域。
在具体实施方案中,在相同特异性的Fab片段中(即在特异性结合相同抗原的Fab片段中)进行相同的取代。无需在包含在该双特异性抗原结合分子中的所有Fab片段中都进行取代。例如,在存在三个Fab片段的实施方案中,仅在具有不同于另外两个Fab片段的特异性的Fab片段中进行取代就足够。具体而言,在该双特异性抗原结合分子包含结合该第一抗原的第三Fab片段的实施方案中,仅在该第二Fab片段中进行取代。类似地,在该双特异性抗原结合分子包含结合该第二抗原的第三Fab片段的实施方案中,仅在该第一Fab片段中进行取代。
在具体实施方案中,在该第一Fab片段中进行取代。在一个这种实施方案中,不进行其他取代。在一些实施方案中,该取代是可变结构域VL和VH的相互取代。在其他实施方案中,该取代是恒定结构域CL和CH1的相互取代。还在其他实施方案中,该取代是可变和恒定结构域VL-CL和VH-CH1二者的相互取代。
在具体实施方案中,该双特异性抗原结合分子提供与该第一抗原的单价结合。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子不包含单链Fab片段。
在具体方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含特异性结合第一抗原的第一Fab片段、特异性结合第二抗原的第二Fab片段及包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域;其中
a)该双特异性抗原结合分子提供与该第一抗原的单价结合;
b)该第一Fab片段在其C端与该第二Fab片段的N端融合,该第二Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合;
c)在该第一Fab片段中,恒定结构域CL和CH1相互取代;且
d)该双特异性抗原结合分子可选地包含第三Fab片段,该第三Fab片段特异性结合该第二抗原,且在其C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。
在另一方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含特异性结合第一抗原的第一Fab片段、特异性结合第二抗原的第二Fab片段及包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域;其中
a)该双特异性抗原结合分子提供与该第一抗原的单价结合;
b)该第一Fab片段在其C端与该第二Fab片段的N端融合,该第二Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合;
c)在该第一Fab片段中,可变结构域VL和VH相互取代;且
d)该双特异性抗原结合分子可选地包含第三Fab片段,该第三Fab片段特异性结合该第二抗原,且在其C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。
在另一具体方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含特异性结合第一抗原的第一Fab片段、特异性结合第二抗原的第二Fab片段及包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域;其中
a)该双特异性抗原结合分子提供与该第一抗原的单价结合;
b)该第二Fab片段在其C端与该第一Fab片段的N端融合,该第一Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合;
c)在该第一Fab片段中,恒定结构域CL和CH1相互取代;且
d)该双特异性抗原结合分子可选地包含第三Fab片段,该第三Fab片段特异性结合该第二抗原,且在其C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。
在另一方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含特异性结合第一抗原的第一Fab片段、特异性结合第二抗原的第二Fab片段及包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域;其中
a)该双特异性抗原结合分子提供与该第一抗原的单价结合;
b)该第二Fab片段在其C端与该第一Fab片段的N端融合,该第一Fab片段转而在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合;
c)在该第一Fab片段中,可变结构域VL和VH相互取代;且
d)该双特异性抗原结合分子可选地包含第三Fab片段,该第三Fab片段特异性结合该第二抗原,且在其C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。
还在另一方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含特异性结合第一抗原的第一Fab片段、特异性结合第二抗原的第二Fab片段及包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域;其中
a)该双特异性抗原结合分子提供与该第一抗原的单价结合;
b)该第二Fab片段在其C端与该第一Fc结构域亚基的N端融合,该第一Fc结构域亚基转而在其C端与该第一Fab片段的N端融合;
c)在该第一Fab片段中,恒定结构域CL和CH1相互取代;且
d)该双特异性抗原结合分子可选地包含第三Fab片段,该第三Fab片段特异性结合该第二抗原,且在其C端与该第二Fc结构域亚基的N端融合。
Fc结构域
该双特异性抗原结合分子的Fc结构域由一对包含抗体分子的重链结构域的多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体,该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定结构域。该Fc结构域的两个亚基能够相互稳定结合。本发明的双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc结构域。
在本发明的一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG Fc结构域。在具体实施方案中,该Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一实施方案中,该Fc结构域是IgG4Fc结构域。在更具体的实施方案中,该Fc结构域是在S228位(Kabat编号)包含氨基酸取代,尤其是氨基酸取代S228P的IgG4Fc结构域。此氨基酸取代减少了IgG4抗体的体内Fab臂交换(见Stubenrauch等,Drug Metabolism and Disposition38,84-91(2010))。在另一具体实施方案中,该Fc结构域是人的Fc结构域。SEQ IDNO:71中给出了人IgG1Fc区的示例性序列。
促进异二聚化的Fc结构域修饰
本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同Fab片段,因此,Fc结构域的两个亚基通常包含在两条不同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化产生两种多肽的几种可能的组合。为了提高重组产生中双特异性抗原结合分子的产率和纯度,在该双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进希望的多肽结合的修饰因此将是有利的。
因此,在具体实施方案中,该Fc结构域包含促进该第一和第二Fc结构域亚基结合的修饰。修饰可以存在于该第一Fc结构域亚基和/或第二Fc结构域亚基中。
人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的部位在Fc结构域的CH3结构域中。因此,在一个实施方案中,该修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在具体实施方案中,该修饰是所谓的“杵入臼(knob-into-hole)”修饰,其包含Fc结构域的两个亚基之一中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基的另一个中的“臼”修饰。
杵入臼技术描述于例如US5,731,168;US7,695,936;Ridgway等,ProtEng9,617-621(1996);和Carter,J Immunol Meth248,7-15(2001)中。通常,该方法涉及在第一多肽的界面引入凸起(“杵”),而在第二多肽的界面引入对应的凹陷(“臼”),使得该凸起可以定位在该凹陷中,以促进异二聚体形成和妨碍同二聚体形成。通过用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小的氨基酸侧链来构建凸起。通过用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链来在第二多肽的界面中产生具有与凸起相同或相似的大小的互补凹陷。
因此,在具体实施方案中,在该双特异性抗原结合分子的第一Fc结构域亚基的CH3结构域中,用具有更大侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基,从而在该第一亚基的CH3结构域内产生可定位在该第二亚基的CH3结构域内的凹陷中的凸起,在该第二Fc结构域亚基的CH3结构域中,用具有更小侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基,从而在该第二亚基的CH3结构域内产生该第一亚基的CH3结构域内的凸起可定位在其中的凹陷。
可以例如通过位点特异性诱变改变编码多肽的核酸,或通过肽合成来产生凸起和凹陷。
在具体实施方案中,在该Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中,用色氨酸残基取代366位的苏氨酸残基(T366W),在该Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中,用缬氨酸残基取代407位的酪氨酸残基(Y407V)。在一个实施方案中,在该Fc结构域的第二亚基中,还用丝氨酸残基取代366位的苏氨酸残基(T366S),及用丙氨酸残基取代368位的亮氨酸残基(L368A)。
还在另一方面,在该Fc结构域的第一亚基中,还用半胱氨酸残基取代354位的丝氨酸残基(S354C),在该Fc结构域的第二亚基中,还用半胱氨酸残基取代349位的酪氨酸残基(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在该Fc结构域的两个亚基之间形成二硫键,进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods248,7-15(2001))。
在备选实施方案中,促进该Fc结构域的第一和第二亚基结合的修饰包含例如描述于PCT公开WO2009/089004中的介导静电引导效应(electrostatic steering effect)的修饰。通常,此方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面上的一个或多个氨基酸残基,使得同二聚体的形成变得在静电上不利,但异二聚化在静电上有利。
改变Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
在某些实施方案中,将该Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有改变的对Fc受体的结合亲和力和/或改变的效应子功能。
可以例如通过ELISA,或通过使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)的标准仪器的表面等离振子共振(SPR)来容易地测定与Fc受体的结合,这样的Fc受体可以通过重组表达获得。本文描述了适宜的这种结合测定。备选地,可以用已知表达具体的Fc受体的细胞系,如表达FcγIIIa受体的NK细胞来评价Fc结构域或包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可以通过本领域已知的方法来测量Fc结构域或包含Fc结构域的双特异性抗原结合分子的效应子功能。适于评估目的分子的ADCC活性的体外测定描述于PCT公开号WO2006/082515或PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中,其在此完整引入作为参考。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地,或此外,可以例如在动物模型(如Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA95,652-656(1998)中公开的动物模型)中体内评估目的分子的ADCC活性。
在一些实施方案中,改变该Fc结构域与补体成分,尤其是与C1q的结合。因此,在其中将该Fc结构域改造为具有改变的效应子功能的一些实施方案中,该改变的效应子功能包括改变的CDC。可以进行C1q结合测定来确定该双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q,并因此具有CDC活性。见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活,可以进行CDC测定(见例如Gazzano-Santoro等,J Immunol Methods202,163(1996);Cragg等,Blood101,1045-1052(2003);及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。
a)减少的Fc受体结合和/或效应子功能
该Fc结构域赋予该双特异性抗原结合分子有利的药物动力学特性,包括归因于在靶组织中的良好累积的长血清半衰期和有利的组织-血液分布比例。但是,它同时导致不希望的该双特异性抗原结合分子向表达Fc受体的细胞而不是向具有优选抗原的细胞的靶向。此外,在全身施用时,Fc受体信号传导途径的激活可以导致细胞因子释放和严重副作用。
因此,在具体实施方案中,将该双特异性抗原结合分子的Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有减少的对Fc受体的结合亲和力和/或减少的效应子功能。在一个这种实施方案中,该Fc结构域(或包含该Fc结构域的双特异性抗原结合分子)显示与未改造的Fc结构域(或包含未改造的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)相比,小于50%、优选小于20%、更优选小于10%和最优选小于5%的对Fc受体的结合亲和力;和/或与未改造的Fc结构域(或包含未改造的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)相比,小于50%、优选小于20%、更优选小于10%和最优选小于5%的效应子功能。在一个实施方案中,该Fc结构域(或包含该Fc结构域的双特异性抗原结合分子)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在具体实施方案中,该Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中,该Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中,该Fc受体是激活的Fc受体。在具体实施方案中,该Fc受体是激活的人Fcγ受体,更具体而言,该Fc受体是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa,最具体而言,该Fc受体是人FcγRIIIa。在一个实施方案中,该效应子功能是选自CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌的一种或多种。在具体实施方案中,该效应子功能是ADCC。在一个实施方案中,该Fc结构域与未改造的Fc结构域相比,显示基本上相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。在该Fc结构域(或包含该Fc结构域的双特异性抗原结合分子)显示未改造的Fc结构域(或包含未改造的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70%、尤其是大于约80%、更尤其是大于约90%时,达到了基本上相似的与FcRn的结合。
在某些实施方案中,该双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个减低该Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的突变。通常,相同的一个或多个氨基酸突变存在于该Fc结构域的两个亚基的每一个中。在一个实施方案中,该氨基酸突变降低该Fc结构域与Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中,该氨基酸突变使该Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在存在一个以上降低该Fc结构域与Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中,这些氨基酸突变的组合可以使该Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在具体实施方案中,该Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中,该Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中,该Fc受体是激活的Fc受体。在具体实施方案中,该Fc受体是激活的人Fcγ受体,更具体而言,该Fc受体是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa,最具体而言,该Fc受体是人FcγRIIIa。优选地,与这些受体的每一个的结合降低。在一些实施方案中,与补体成分的结合亲和力,特别是与C1q的结合亲和力也降低。在一个实施方案中,与新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力未降低。
在某些实施方案中,将该双特异性抗原结合分子的Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有减少的效应子功能。减少的效应子功能可以包括但不限于以下的一种或多种:依赖补体的细胞毒性(CDC)减少、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)减少、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)减少、细胞因子分泌减少、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取减少、与NK细胞的结合减少、与巨噬细胞的结合减少、与单核细胞的结合减少、与多形核细胞的结合减少、诱导凋亡的直接信号发放减少、靶结合抗体的交联减少、树突细胞成熟减少或T细胞激发减少。在一个实施方案中,该减少的效应子功能是选自减少的CDC、减少的ADCC、减少的ADCP和减少的细胞因子分泌的一种或多种。在具体实施方案中,该减少的效应子功能是减少的ADCC。在一个实施方案中,该减少的ADCC是未改造的Fc结构域(或包含未改造的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC的小于20%。
在一个实施方案中,降低该Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施方案中,该Fc结构域在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的位置上包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中,该Fc结构域在选自L234、L235和P329的位置上包含氨基酸取代。在一些实施方案中,该Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A。在一个这种实施方案中,该Fc结构域是IgG1Fc结构域,尤其是人IgG1Fc结构域。在一个实施方案中,该Fc结构域在P329位包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中,该氨基酸取代是P329A或P329G,尤其是P329G。在一个实施方案中,该Fc结构域包含P329位的氨基酸取代及选自E233、L234、L235、N297和P331的位置上的另一氨基酸取代。在更具体的实施方案中,该另一氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在具体实施方案中,该Fc结构域在P329、L234和L235位包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中,该Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个这种实施方案中,该Fc结构域是IgG1Fc结构域,尤其是人IgG1Fc结构域。如PCT专利申请号PCT/EP2012/055393(在此完整引入作为参考)中所述,氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全废除了人IgG1Fc结构域的Fcγ受体结合。PCT/EP2012/055393还描述了制备这类突变体Fc结构域的方法及用于测定其诸如Fc受体结合或效应子功能的特性的方法。
与IgG1抗体相比,IgG4抗体显示减少的对Fc受体的结合亲和力和减少的效应子功能。因此,在一些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG4Fc结构域,尤其是人IgG4Fc结构域。在一个实施方案中,该IgG4Fc结构域在S228位包含氨基酸取代,尤其是氨基酸取代S228P。为了进一步减少其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能,在一个实施方案中,该IgG4Fc结构域在L235位包含氨基酸取代,尤其包含氨基酸取代L235E。在另一实施方案中,该IgG4Fc结构域在P329位包含氨基酸取代,特别是氨基酸取代P329G。在具体实施方案中,该IgG4Fc结构域在S228、L235和P329位包含氨基酸取代,特别是氨基酸取代S228P、L235E和P329G。这类IgG4Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性描述于PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中,在此完整引入作为参考。
在具体实施方案中,与天然IgG1Fc结构域相比,显示减少的对Fc受体的结合亲和力和/或减少的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A、L235A和可选的P329G的人IgG1Fc结构域,或包含氨基酸取代S228P、L235E和可选的P329G的人IgG4Fc结构域。
在某些实施方案中,消除了该Fc结构域的N-糖基化。在一个这种实施方案中,该Fc结构域在N297位包含氨基酸突变,尤其是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)取代天冬酰胺的氨基酸取代。
除上文及PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中所述的Fc结构域外,具有减少的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域还包括具有Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个上具有取代的Fc变体,包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
可以使用本领域公知的遗传或化学方法,通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变体Fc结构域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。
b)增加的Fc受体结合和/或效应子功能
相反,可以存在希望保持或甚至增强该双特异性抗原结合分子的Fc受体结合和/或效应子功能的情况,例如在该双特异性抗原结合分子靶向高度特异的肿瘤抗原时。因此,在某些实施方案中,将本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域改造为具有增加的对Fc受体的结合亲和力。增加的结合亲和力可以是该Fc结构域与Fc受体的结合亲和力增加至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在一个实施方案中,该Fc受体是激活的Fc受体。在具体实施方案中,该Fc受体是Fcγ受体,尤其是人Fcγ受体。在一个实施方案中,该Fc受体选自FcγRIIIa、FcγRI和FcγRIIa。在具体实施方案中,该Fc受体是FcγRIIIa。
在一个这种实施方案中,将该Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有改变的寡糖结构。在具体的这种实施方案中,与未改造的Fc结构域相比,该Fc结构域包含增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在更具体的实施方案中,该双特异性抗原结合分子的Fc结构域中的N-连接寡糖的至少约50%、更尤其是至少约70%是非岩藻糖基化的。该非岩藻糖基化的寡糖可以属于杂合或复合类型。在另一具体实施方案中,与未改造的Fc结构域相比,该Fc结构域包含增加比例的二等分寡糖。在更具体的实施方案中,该双特异性抗原结合分子的Fc结构域中的N-连接寡糖的至少约35%、尤其是至少约50%、更尤其是至少约70%是二等分的。该二等分寡糖可以属于杂合或复合类型。还在另一具体实施方案中,与未改造的Fc结构域相比,该Fc结构域包含增加比例的二等分、非岩藻糖基化寡糖。在更具体的实施方案中,该双特异性抗原结合分子的Fc结构域中的N-连接寡糖的至少约15%、更尤其是至少约25%、至少约35%或至少约50%是二等分、非岩藻糖基化的。该二等分、非岩藻糖基化的寡糖可以属于杂合或复合类型。
可以通过本领域公知的方法,例如通过Umana等,Nat Biotechnol17,176-180(1999)或Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006)中所述的MALDI TOF质谱分析法来分析该双特异性抗原结合分子Fc结构域中的寡糖结构。非岩藻糖基化寡糖的百分比是缺乏岩藻糖残基的寡糖相对于附着于Asn297的所有寡糖(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的量,且通过MALDI TOF MS来在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定。Asn297指定位在Fc结构域中的约297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基;但是,由于免疫球蛋白中小的序列变异,Asn297也可以定位在297位的上游或下游约±3个氨基酸,即294位和300位之间。类似地测定二等分或二等分非岩藻糖基化寡糖的百分比。
该双特异性抗原结合分子的Fc结构域中的糖基化的修饰可以源自该双特异性抗原结合分子在宿主细胞中的产生,已操作该宿主细胞来表达改变水平的一种或多种具有糖基转移酶活性的多肽。
在一个实施方案中,通过在具有一种或多种改变的糖基转移酶活性的宿主细胞中产生该双特异性抗原结合分子来将该双特异性抗原结合分子的Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有改变的寡糖结构。糖基转移酶包括例如β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)、β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶I(GnTI)、β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶II(GnTII)和α(1,6)-岩藻糖基转移酶。在具体实施方案中,通过在具有增加的β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)活性的宿主细胞中产生该双特异性抗原结合分子来将该双特异性抗原结合分子的Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖。在甚至更具体的实施方案中,该宿主细胞还具有增加的α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。可以用来对本发明的双特异性抗原结合分子进行糖改造的糖改造方法已更详细地描述于Umana等,Nat Biotechnol17,176-180(1999);Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006);WO99/54342(美国专利号6,602,684;EP1071700);WO2004/065540(美国专利公开号2004/0241817;EP1587921);WO03/011878(美国专利公开号2003/0175884)中,每篇文献的内容在此明确地完整引入作为参考。
通常,可以用任意类型的培养细胞系(包括本文中讨论的细胞系)来产生用于产生具有改变的糖基化模式的双特异性抗原结合分子的细胞系。具体的细胞系包括CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞及其他哺乳动物细胞。在某些实施方案中,已操作该宿主细胞来表达提高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施方案中,已进一步操作该宿主细胞来表达提高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。在具体实施方案中,该具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII的催化结构域和异源高尔基体驻留多肽的高尔基体定位结构域的融合多肽。尤其是,该高尔基体定位结构域是甘露糖苷酶II的高尔基体定位结构域。用于产生这类融合多肽并用它们来产生具有增加的效应子功能的抗体的方法公开于Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006)和WO2004/065540中,其全部内容在此明确引用作为参考。
包含本发明的双特异性抗原结合分子的编码序列和/或具有糖基转移酶活性的多肽的编码序列,并表达生物活性基因产物的宿主细胞可以例如通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交、“标记”基因功能的存在或缺乏、评估通过各mRNA转录物在该宿主细胞中的表达测量的转录水平、或通过免疫测定或通过其生物学活性测量的基因产物的检测(本领域公知的方法)来鉴定。可以例如通过利用分别与GnTIII或ManII的生物合成产物结合的凝集素来检测GnTIII或Man II活性。这种凝集素的实例是优先与含有二等分GlcNAc的寡糖结合的E4-PHA凝集素。还可以通过由表达该多肽的细胞产生的糖蛋白释放的寡糖的质谱分析来检测具有GnTIII或ManII活性的多肽的生物合成产物(即特异性寡糖结构)。备选地,可以使用功能测定,该功能测定测量由用具有GnTIII或ManII活性的多肽改造的细胞产生的双特异性抗原结合分子介导的增加的效应子功能和/或增加的Fc受体结合。
在另一实施方案中,通过在具有减少的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中产生该双特异性抗原结合分子来将该Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,包含增加比例的非岩藻糖基化寡糖。具有减少的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞可以是这样的细胞,其中α(1,6)-岩藻糖基转移酶基因已被破坏或以其他方式失活,例如敲除(见Yamane-Ohnuki等,Biotech Bioeng87,614(2004);Kanda等,Biotechnol Bioeng94(4),680-688(2006);Niwa等,J Immunol Methods306,151-160(2006))。
能够产生脱岩藻糖基化的双特异性抗原结合分子的细胞系的其他实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch Biochem Biophys249,533-545(1986);美国专利申请号US2003/0157108;和WO2004/056312,尤其是在实施例11上)。本发明的双特异性抗原结合分子可以备选地按照EP1176195A1、WO03/084570、WO03/085119和美国专利申请公开号2003/0115614、2004/093621、2004/110282、2004/110704、2004/132140、美国专利号6,946,292(Kyowa)中公开的技术,例如通过降低或废除用于双特异性抗原结合分子产生的宿主细胞中的GDP-岩藻糖转运蛋白的活性,糖改造为在Fc结构域中具有减少的岩藻糖基。
本发明的糖改造的双特异性抗原结合分子还可以在产生修饰糖蛋白的表达系统中产生,如WO2003/056914(GlycoFi,Inc.)中或WO2004/057002和WO2004/024927(Greenovation)中所教导的那些。
在一个实施方案中,将该双特异性抗原结合分子的Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有增加的效应子功能。该增加的效应子功能可以包括但不限于以下的一种或多种:依赖补体的细胞毒性(CDC)增加、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)增加、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)增加、细胞因子分泌增加、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取增加、与NK细胞的结合增加、与巨噬细胞的结合增加、与单核细胞的结合增加、与多形核细胞的结合增加、诱导凋亡的直接信号发放增加、靶结合抗体的交联增加、树突细胞成熟增加或T细胞激发增加。
在一个实施方案中,该增加的效应子功能是选自增加的CDC、增加的ADCC、增加的ADCP和增加的细胞因子分泌的一种或多种。在具体实施方案中,该增加的效应子功能是增加的ADCC。在一个实施方案中,与未改造的Fc结构域(或包含未改造的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC相比,由改造的Fc结构域(或包含改造的Fc结构域的双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC增加至少2倍。
抗原
本发明的双特异性抗原结合分子可以结合多种抗原。在某些实施方案中,该第一和/或第二抗原是与病理性条件相关的抗原,如呈递在肿瘤细胞上、病毒感染细胞上或炎症部位处的抗原。适宜的抗原包括细胞表面抗原(例如,但不限于细胞表面受体)、游离在血清中的抗原和/或胞外基质中的抗原。在具体实施方案中,该抗原是人抗原。
抗原的非限制性实例包括肿瘤抗原,如MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽酰肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-δ链、MAGE家族肿瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE家族肿瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、Her3、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白和γ-联蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7及c-erbB-2;ECM抗原,如黏结蛋白聚糖、乙酰肝素酶、整联蛋白、骨桥蛋白、link、钙黏着蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白型EGF、凝集素、纤连蛋白及其选择性剪接结构域(例如外结构域B)、notch、多种形式的生腱蛋白(例如生腱蛋白C)及其选择性剪接结构域(例如生腱蛋白C的A1或A2结构域)和基质蛋白酶;成纤维细胞激活蛋白(FAP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关的异多聚体)、CD19、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD25(IL-2受体α链)、CD30(细胞因子受体)、CD33(髓样细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R(IL6受体)、CD20、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)和PDGFβR(β血小板衍生生长因子受体)。
在具体实施方案中,该第一和第二抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her3、c-Met、癌胚抗原(CEA)、CD33和CD3。
在具体实施方案中,该第一抗原是CD3,尤其是人或猕猴CD3,最尤其是人CD3。在一些实施方案中,该第一抗原是CD3的ε亚基。在一个实施方案中,该第一Fab片段可以与单克隆抗体H2C(描述于PCT公开号WO2008/119567中)竞争结合CD3的表位。在具体实施方案中,该第一Fab片段可以与单克隆抗体SP34(描述于Pessano等,EMBO J4,337-340(1985)中)竞争结合CD3的表位。在另一实施方案中,该第一Fab片段可以与单克隆抗体V9(描述于Rodrigues等,Int J Cancer增刊7,45-50(1992)和美国专利号6,054,297中)竞争结合CD3的表位。还在另一实施方案中,该第一Fab片段可以与单克隆抗体FN18(描述于Nooij等,EurJ Immunol19,981-984(1986)中)竞争结合CD3的表位。在一个实施方案中,该第一Fab片段对CD3特异,且包含SEQ ID NO:77的重链CDR1、SEQ ID NO:78的重链CDR2、SEQ ID NO:79的重链CDR3、SEQID NO:81的轻链CDR1、SEQ ID NO:82的轻链CDR2和SEQ ID NO:83的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对CD3特异的Fab片段包含与SEQID NO:80至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:84至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。在另一实施方案中,该第一Fab片段对CD3特异,且包含SEQ ID NO:104的重链CDR1、SEQ ID NO:105的重链CDR2、SEQ ID NO:106的重链CDR3、SEQ ID NO:108的轻链CDR1、SEQ IDNO:109的轻链CDR2和SEQ ID NO:110的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对CD3特异的Fab片段包含与SEQID NO:107至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:111至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。
在本发明的具体实施方案中,该双特异性抗原结合分子能够同时结合靶细胞抗原(尤其是肿瘤细胞抗原)和CD3。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子能够通过同时结合靶细胞抗原和CD3来交联T细胞和靶细胞。在甚至更具体的实施方案中,这种同时结合导致靶细胞,尤其是肿瘤细胞的裂解。在一个实施方案中,这种同时结合导致T细胞的激活。在其他实施方案中,这种同时结合导致T淋巴细胞,尤其是细胞毒性T淋巴细胞的选自以下的细胞反应:增殖、分化、细胞因子释放、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标记的表达。在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子在不同时结合靶细胞抗原的情况下与CD3的结合不导致T细胞激活。
在一个实施方案中,该双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒性活性重定向至靶细胞。在具体实施方案中,该重定向独立于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
尤其是,本发明的实施方案中任一个的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中,该T细胞是CD4+或CD8+T细胞,尤其是CD8+T细胞。
在一个实施方案中,该第一抗原是c-Met,尤其是人c-Met。在一个实施方案中,该第一Fab片段可以与单克隆抗体5D5(描述于例如美国专利号7,476,724中,其在此完整引入作为参考)竞争结合c-Met的表位。在一个实施方案中,该第一Fab片段对c-Met特异,且包含SEQ ID NO:63的重链CDR1、SEQ ID NO:64的重链CDR2、SEQ ID NO:65的重链CDR3、SEQ IDNO:67的轻链CDR1、SEQ ID NO:68的轻链CDR2和SEQ ID NO:69的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对c-Met特异的Fab片段包含与SEQ ID NO:66至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:70至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,
或其保留功能性的变体。
在具体实施方案中,该第二抗原是肿瘤相关抗原,特别是呈递在肿瘤细胞或肿瘤基质细胞上的抗原。在一个这种实施方案中,该第二抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her3、CD33和癌胚抗原(CEA)。
在一个实施方案中,该第二抗原是黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。在另一实施方案中,第二及可选的第三Fab片段可以与单克隆抗体LC007(见SEQ ID NO18和22)竞争结合MCSP的表位。在一个实施方案中,该对MCSP特异的Fab片段包含SEQ ID NO:15的重链CDR1、SEQ ID NO:16的重链CDR2、SEQ ID NO:17的重链CDR3、SEQ ID NO:19的轻链CDR1、SEQ ID NO:20的轻链CDR2和SEQ ID NO:21的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对MCSP特异的Fab片段包含与SEQ ID NO:18至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:22至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。在另一实施方案中,第二及可选的第三Fab片段可以与单克隆抗体M4-3ML2(见SEQ ID NO99和103)竞争结合MCSP的表位。在一个实施方案中,该对MCSP特异的Fab片段包含SEQ ID NO:96的重链CDR1、SEQ ID NO:97的重链CDR2、SEQ ID NO:98的重链CDR3、SEQ ID NO:100的轻链CDR1、SEQ ID NO:101的轻链CDR2和SEQ ID NO:102的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对MCSP特异的Fab片段包含与SEQ IDNO:99至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQID NO:103至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。
还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:1的多肽序列、SEQ ID NO:2的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列和SEQID NO:4的多肽序列,或其保留功能性的变体。在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:1的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:4的多肽序列和SEQ ID NO:5的多肽序列,或其保留功能性的变体。还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:4的多肽序列、SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:6的多肽序列和SEQ ID NO:7的多肽序列,或其保留功能性的变体。还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:4的多肽序列、SEQ ID NO:5的多肽序列、SEQ ID NO:1的多肽序列和SEQ ID NO:85的多肽序列,或其保留功能性的变体。在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:1的多肽序列、SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:4的多肽序列和SEQ ID NO:86的多肽序列,或其保留功能性的变体。还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:4的多肽序列、SEQ ID NO:87的多肽序列、SEQ ID NO:89的多肽序列和SEQ ID NO:90的多肽序列,或其保留功能性的变体。在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:91的多肽序列、SEQ ID NO:92的多肽序列和SEQ ID NO:93的多肽序列,或其保留功能性的变体。还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ IDNO:87的多肽序列、SEQ ID NO:91的多肽序列、SEQ ID NO:93的多肽序列和SEQ ID NO:94的多肽序列,或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中,该第二抗原是癌胚抗原(CEA)。在另一实施方案中,该第二及可选的第三Fab片段可以与单克隆抗体CH1A1A竞争结合CEA的表位。见PCT公开WO2011/023787,其在此完整引入作为参考。在一个实施方案中,该对CEA特异的Fab片段包含SEQ IDNO:39的重链CDR1、SEQ ID NO:40的重链CDR2、SEQ ID NO:41的重链CDR3、SEQ ID NO:43的轻链CDR1、SEQ ID NO:44的轻链CDR2和SEQ ID NO:45的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对CEA特异的Fab片段包含与SEQ ID NO:42至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:46至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。
还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:3的多肽序列、SEQ ID NO:8的多肽序列、SEQ ID NO:9的多肽序列和SEQ ID NO:10的多肽序列,或其保留功能性的变体。还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:9的多肽序列、SEQ ID NO:10的多肽序列、SEQ ID NO:87的多肽序列和SEQ ID NO:95的多肽序列,或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中,该第二抗原是Her3。在另一实施方案中,该第二及可选的第三Fab片段可以与单克隆抗体Mab205.10竞争结合Her3的表位。见PCT公开号WO2011/076683,其在此完整引入作为参考。在一个实施方案中,该对Her3特异的Fab片段包含SEQ ID NO:55的重链CDR1、SEQ ID NO:56的重链CDR2、SEQ ID NO:57的重链CDR3、SEQ ID NO:59的轻链CDR1、SEQ ID NO:60的轻链CDR2和SEQ ID NO:61的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对Her3特异的Fab片段包含与SEQ ID NO:58至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:62至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。
还在另一实施方案中,该双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO:11的多肽序列、SEQ ID NO:12的多肽序列、SEQ ID NO:13的多肽序列和SEQ ID NO:14的多肽序列,或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中,该第二抗原是表皮生长因子受体(EGFR)。在另一实施方案中,该第二及可选的第三Fab片段可以与单克隆抗体GA201竞争结合EGFR的表位。见PCT公开WO2006/082515,其在此完整引入作为参考。在一个实施方案中,该对EGFR特异的Fab片段包含SEQ ID NO:23的重链CDR1、SEQ ID NO:24的重链CDR2、SEQ ID NO:25的重链CDR3、SEQ IDNO:27的轻链CDR1、SEQ ID NO:28的轻链CDR2和SEQ ID NO:29的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对EGFR特异的Fab片段包含与SEQ ID NO:26至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:30至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中,该第二抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在另一实施方案中,该第二及可选的第三Fab片段可以与单克隆抗体3F2竞争结合FAP的表位。见PCT公开WO2012/020006,其在此完整引入作为参考。在一个实施方案中,该对FAP特异的Fab片段包含SEQ ID NO:31的重链CDR1、SEQ ID NO:32的重链CDR2、SEQ ID NO:33的重链CDR3、SEQ IDNO:35的轻链CDR1、SEQ ID NO:36的轻链CDR2和SEQ ID NO:37的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对FAP特异的Fab片段包含与SEQ ID NO:34至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:38至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。
在一个实施方案中,该第二抗原是CD33。在一个实施方案中,该对CD33特异的Fab片段包含SEQ ID NO:47的重链CDR1、SEQ ID NO:48的重链CDR2、SEQ ID NO:49的重链CDR3、SEQ ID NO:51的轻链CDR1、SEQ ID NO:52的轻链CDR2和SEQ ID NO:53的轻链CDR3。在另一实施方案中,该对CD33特异的Fab片段包含与SEQ ID NO:50至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的重链可变区序列,和与SEQ ID NO:54至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一的轻链可变区序列,或其保留功能性的变体。
多核苷酸
本发明还提供编码本文中所述的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。该编码本发明的双特异性抗原结合分子的多核苷酸可以作为编码整个双特异性抗原结合分子的单个多核苷酸或作为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其他方式结合来形成功能性双特异性抗原结合分子。例如,Fab片段的轻链部分可以由与包含Fab片段的重链部分、Fc结构域亚基和可选的另一Fab片段(的部分)的双特异性抗原结合分子部分分开的多核苷酸编码。在共表达时,该重链多肽将与该轻链多肽结合形成Fab片段。在另一实例中,包含两个Fc结构域亚基之一和可选的一个或多个Fab片段(的部分)的双特异性抗原结合分子部分可以由与包含两个Fc结构域亚基中的另一个和可选的Fab片段(的部分)的双特异性抗原结合分子部分分开的多核苷酸编码。在共表达时,该Fc结构域亚基将结合形成Fc结构域。
在一个实施方案中,本发明的分离的多核苷酸编码该第一Fc结构域亚基、该第二Fab片段的重链和该第一Fab片段的重链。在更具体的实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中VL区与CH1区共有羧基端肽键,该CH1区转而与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中Fab重链(VH-CH1)与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VL区共有羧基端肽键,该VL区转而与CH1区共有羧基端肽键,该CH1区转而与包括免疫球蛋白铰链区的Fc结构域亚基(HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。还在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中VH区与CL区共有羧基端肽键,该CL区转而与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。还在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中Fab重链(VH-CH1)与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VH区共有羧基端肽键,该VH区转而与CL区共有羧基端肽键,该CL区转而与包括免疫球蛋白铰链区的Fc结构域亚基(HR-CH2-CH3-(CH4))共有羧基端肽键。还在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))与肽接头共有羧基端肽键,该肽接头转而与VH区共有羧基端肽键,该VH区转而与CL区共有羧基端肽键。
在另一实施方案中,本发明的分离的多核苷酸编码该第二Fc结构域亚基和可选的第三Fab片段的重链。在具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码免疫球蛋白重链(VH-CH1-HR-CH2-CH3-(CH4))。在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码可选地包括抗体铰链区的Fc结构域亚基((HR)-CH2-CH3-(CH4))。
还在另一实施方案中,本发明的分离的多核苷酸编码包含在该双特异性抗原结合分子中的一条或多条轻链。在具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码免疫球蛋白轻链(VL-CL)。在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中VL区与CH1区共有羧基端肽键。还在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中VH区与CL区共有羧基端肽键。还在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中VH区与CL区共有羧基端肽键,该CL区转而与Fab轻链(VL-CL)共有羧基端肽键。还在另一具体实施方案中,该分离的多核苷酸编码这样的多肽,其中Fab轻链(VL-CL)与VH区共有羧基端肽键,该VH区转而与CL区共有羧基端肽键。
在另一实施方案中,本发明涉及编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸,其中该多核苷酸包含编码SEQ ID NO18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、80、84、99、103、107和111中所示的可变区序列的序列。在另一实施方案中,本发明涉及编码双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸,其中该多核苷酸包含编码SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94和95中所示的多肽序列的序列。在另一实施方案中,本发明涉及编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸,其中该多核苷酸包含编码与SEQ ID NO18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、80、84、99、103、107或111中的氨基酸序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的可变区序列的序列。在另一实施方案中,本发明涉及编码双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸,其中该多核苷酸包含编码与SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95中的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的多肽序列的序列。本发明涵盖编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸,其中该多核苷酸包含编码具有保守氨基酸取代的SEQ ID NO18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、80、84、99、103、107或111的可变区序列的序列。本发明还涵盖编码双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸,其中该多核苷酸包含编码具有保守氨基酸取代的SEQ IDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95的多肽序列的序列。
在某些实施方案中,该多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施方案中,本发明的多核苷酸是例如信使RNA(mRNA)形式的RNA。本发明的RNA可以是单链或双链。
重组方法
本发明的双特异性抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组产生来获得。对于重组产生,分离例如上文所述的编码双特异性抗原结合分子(片段)的一个或多个多核苷酸,并插入一个或多个载体用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。这种多核苷酸可以容易地用常规方法分离和测序。在一个实施方案中,提供包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体,优选表达载体。可以用本领域技术人员公知的方法来构建包含双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列连同适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。见例如描述于Maniatis等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,冷泉港实验室,N.Y.(1989);和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociatesand Wiley Interscience,N.Y(1989)中的技术。表达载体可以是质粒、病毒的部分,或可以是核酸片段。表达载体包括表达盒,将编码该双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件有效结合地克隆入该表达盒中。本文所用的“编码区”是核酸的部分,其由翻译为氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译为氨基酸,但可以将它视为编码区的部分(如果存在),但任意侧翼序列,例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等不是编码区的部分。两个或多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中,例如单个载体上,或分开的多核苷酸构建体中,例如分开(不同)的载体上。此外,任何载体都可以包含单个编码区,或可以包含两个或多个编码区,例如,本发明的载体可以编码一种或多种多肽,该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分开为最终的蛋白质。此外,本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区,该异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸或其变体或衍生物融合或未融合。异源编码区非限制性地包括特化的元件或基序,如分泌信号肽或异源功能结构域。有效结合是基因产物(例如多肽)的编码区以这样的方式与一个或多个调节序列结合,以将基因产物的表达放置在该一个或多个调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码希望的基因产物的mRNA的转录,且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或干扰将转录的DNA模板的能力,则两个DNA片段(如多肽编码区及与之结合的启动子)“有效结合”。因此,如果启动子能够影响核酸的转录,则该启动子区与该编码多肽的核酸有效结合。该启动子可以是仅在预定的细胞中指导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除启动子外,其他转录控制元件,例如增强子、操纵基因、阻抑物和转录终止信号可以与多核苷酸有效结合来指导细胞特异性转录。本文中公开了适宜的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区为本领域技术人员已知。这些非限制性地包括在脊椎动物细胞中具有功能的转录控制区,如但不限于来自巨细胞病毒(例如与内含子A连接的立即早期启动子)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括衍生自诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α-珠蛋白的脊椎动物基因以及其他能够控制真核细胞中的基因表达的序列的那些。其他适宜的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件为本领域普通技术人员已知。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子及衍生自病毒系统的元件(尤其是内部核糖体进入位点或IRES,也称为CITE序列)。表达盒还可以包含其他特征,如复制起点,和/或染色体整合元件,如逆转录病毒长末端重复序列(LTR),或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与其他的编码区结合,该其他的编码区编码分泌或信号肽,该分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如,如果希望该双特异性抗原结合分子分泌,则可以将编码信号肽的DNA放置在编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的上游。根据信号假说,哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,一旦生长中的蛋白质链跨过粗面内质网的输出起始,其即从成熟蛋白质切割。本领域普通技术人员意识到,脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与该多肽的N端融合的信号肽,其从翻译的多肽切割,以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或保留指导与它有效结合的多肽的分泌的能力的序列的功能性衍生物。备选地,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,可以用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代野生型前导序列。分泌信号肽的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO74-76中给出。
可以在该双特异性抗原结合分子(片段)编码多核苷酸内或其末端包含编码短蛋白质序列的DNA,该短蛋白质序列可以用来便于随后的纯化(例如组氨酸标记)或辅助标记该双特异性抗原结合分子。
在另一实施方案中,提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。该多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别就多核苷酸和载体所述的任意特征。在一个这种实施方案中,宿主细胞包含(例如已用…转化或转染)含有编码本发明的双特异性抗原结合分子(的部分)的多核苷酸的载体。本文中所用的术语“宿主细胞”指可以改造来产生本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的任意类型的细胞系统。适合用于复制及用于支持双特异性抗原结合分子的表达的宿主细胞为本领域公知。这类细胞可以根据需要用具体的表达载体转染或转导,并可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐来获得足量的双特异性抗原结合分子用于临床应用。适宜的宿主细胞包括原核微生物,如大肠杆菌,或多种真核细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如,尤其是在不需要糖基化时,可以在细菌中产生多肽。表达后,可以从可溶性结分中的细菌细胞糊分离该多肽,并可以进一步纯化。除原核生物外,诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码多肽的载体的克隆或表达宿主,其包括这样的真菌和酵母菌株,该真菌和酵母菌株的糖基化途径已“人源化”,导致产生部分或完全具有人糖基化模式的多肽。见Gerngross,Nat Biotech22,1409-1414(2004)和Li等,Nat Biotech24,210-215(2006)。适合用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用,尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的杆状病毒毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如,可以使用驯化为悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7);人胚肾细胞系(描述于例如Graham等,J Gen Virol36,59(1977)中的293或293T细胞);幼仓鼠肾细胞(BHK);小鼠支持细胞(描述于例如Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)中的TM4细胞);猴肾细胞(CV1);非洲绿猴肾细胞(VERO-76);人宫颈癌细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK);buffalo大鼠肝细胞(BRL3A);人肺细胞(W138);人肝细胞(Hep G2);小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562);TRI细胞(描述于例如Mather等,Annals N.Y.Acad Sci383,44-68(1982)中);MRC5细胞;及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980));及骨髓瘤细胞系,如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。适合用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,248卷(B.K.C.Lo编辑,HumanaPress,Totowa,NJ),255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞,例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等,以及包含在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中,该宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
在这些系统中表达外源基因的标准技术为本领域已知。表达含有诸如抗体的抗原结合分子的重链或轻链的多肽的细胞可以改造,以便还表达抗体链的另一种,使得表达产物是具有重链和轻链二者的抗体。
在一个实施方案中,提供产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法,其中该方法包括在适于表达该双特异性抗原结合分子的条件下培养含有编码本文中提供的双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞,并从该宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该双特异性抗原结合分子。
该双特异性抗原结合分子的成分在遗传上相互融合。可以这样设计双特异性抗原结合分子,使得它的成分直接相互融合或通过接头序列间接相互融合。该接头的组成和长度可以按照本领域公知的方法确定,并可以针对有效性进行测试。双特异性抗原结合分子的不同成分之间的接头序列的实例见于本文中提供的序列中。如果希望,还可以包含其他序列来掺入分开该融合的单个成分的切割位点,例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中,形成该双特异性抗原结合分子的部分的Fab片段包含至少一个能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的部分和衍生自天然或非天然存在的抗体及其片段。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法为本领域已知(见例如Harlow和Lane,"Antibodies,a laboratory manual",冷泉港实验室,1988)。非天然存在的抗体可以用固相肽合成构建、可以重组产生(例如,如美国专利号4,186,567中所诉)或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库获得(见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。
任意动物种类的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区都可以用于本发明的双特异性抗原结合分子。用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区可以具有鼠、灵长类或人来源。如果该双特异性抗原结合分子与其用于人用,则可以使用嵌合形式的抗体,其中该抗体的恒定区来自人。还可以按照本领域公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过多种方法来达到,其包括但不限于:(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植至保留或不保留关键构架残基(例如对保持良好的抗原结合亲合力或抗体功能重要的那些)的人(例如受体抗体)构架和恒定区上;(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR;对抗体-抗原相互作用关键的残基)移植至人构架和恒定区上;或(c)移植整个非人可变区,但通过取代表面残基来用人样区段“伪装”它们。人源化抗体及制备它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front Biosci13,1619-1633(2008)中,并进一步描述于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988);Queen等,Proc Natl Acad Sci USA86,10029-10033(1989);美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409;Jones等,Nature321,522-525(1986);Morrison等,Proc NatlAcad Sci81,6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv Immunol44,65-92(1988);Verhoeyen等,Science239,1534-1536(1988);Padlan,Molec Immun31(3),169-217(1994);Kashmiri等,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植);Padlan,Mol Immunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”);Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”);及Osbourn等,Methods36,61-68(2005)和Klimka等,Br J Cancer83,252-260(2000)(描述FR改组的“导向选择”法)中。人抗体和人可变区可以用本领域已知的多种技术产生。人抗体广泛描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤法(见例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63页(MarcelDekker,Inc.,纽约,1987))制备的人单克隆抗体的部分和衍生自通过杂交瘤法制备的人单克隆抗体。人抗体和人可变区还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备,该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(见例如Lonberg,Nat Biotech23,1117-1125(2005)。人抗体和人可变区还可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变区序列来产生(见例如Hoogenboom等in Methods inMolecular Biology178,1-37(O’Brien等编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)及McCafferty等,Nature348,552-554;Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段展示抗体片段。
在某些实施方案中,按照例如公开于美国专利申请公开号2004/0132066(其全部内容在此引入作为参考)中的方法将用于本发明的Fab片段改造为具有增强的结合亲和力。可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术,例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002)),来测量本发明的双特异性抗原结合分子与特异性抗原决定簇结合的能力。可以用竞争结合测定来鉴定与参考抗体竞争结合具体抗原的抗体、抗体片段、抗原结合结构域或可变区。在某些实施方案中,这种竞争抗体结合与该参考抗体所结合的表位相同的表位(例如线性或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods in Molecular Biology66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供了用于定位抗体所结合的表位的详细的示例性方法。在示例性竞争测定中,在溶液中孵育固定化的抗原,该溶液包含结合该抗原的第一标记抗体及针对其与该第一抗体竞争结合该抗原的能力进行测试的第二未标记抗体。该第二抗体可以存在于杂交瘤上清中。作为对照,在溶液中孵育固定化的抗原,该溶液包含该第一标记抗体,但不包含该第二未标记抗体。在允许该第一抗体结合该抗原的条件下孵育后,去除过量的未结合抗体,并测量与固定化的抗原结合的标记的量。如果测试样品中与固定化的抗原结合的标记的量相对于对照样品实质性降低,则表明该第二抗体与该第一抗体竞争结合该抗原。见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(冷泉港实验室,冷泉港,纽约)。
按照本文中所述制备的双特异性抗原结合分子可以通过本领域已知的技术来纯化,如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等的因素,且对本领域技术人员而言显而易见。对于亲和层析纯化,可以使用该双特异性抗原结合分子所结合的抗体、配体、受体或抗原。例如,对于本发明的双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化,可以使用具有A蛋白或G蛋白的基质。可以基本上按实施例中所述,用连续的A蛋白或G蛋白亲和层析和大小排阻层析来分离双特异性抗原结合分子。可以通过包括凝胶电泳、高压液相层析等的多种公知的分析方法中的任一种来测定该双特异性抗原结合分子的纯度。例如,如通过还原型SDS-PAGE(见例如图3)所证明,按实施例中所述表达的重链融合蛋白显示完整且正确组装。在约Mr25,000、Mr50,000和Mr75,000处分辨出三个条带,分别对应于该双特异性抗原结合分子轻链、重链和重链/Fab重链融合蛋白的预测分子量。
测定
可以通过本领域已知的多种测定来针对其物理/化学性质和/或生物学活性鉴定、筛选或表征本文中提供的双特异性抗原结合分子。
亲和力测定
可以使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)的标准仪器,通过表面等离振子共振(SPR)来按照实施例中所示的方法测定该双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的结合亲和力,这类受体或靶抗原可以通过重组表达获得。备选地,可以用表达具体受体或靶抗原的细胞系来评价双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合,例如通过流式细胞术(FACS)。下文中及以下实施例中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。
根据一个实施方案,在25℃使用T100机器(GEHealthcare),通过表面等离振子共振来测量KD。
为了分析Fc部分和Fc受体之间的相互作用,通过固定在CM5芯片上的抗-五组氨酸抗体(Qiagen)来捕获His标记的重组Fc受体,并用双特异性构建体作为分析物。简言之,按照供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)。按5μl/分钟的流速注入前,用10mM柠檬酸钠pH5.0稀释抗五组氨酸抗体,以达到约6500个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入配体后,注入1M乙醇胺来封闭未反应的基团。随后,按4或10nM捕获Fc受体60秒。对于动力学测量,按30μl/分钟的流速在25℃下注入HBS-EP(GE Healthcare,10mMHEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%表面活性剂P20,pH7.4)中的四倍系列稀释的双特异性构建体(500nM和4000nM之间的范围)120秒。
为了测定与靶抗原的亲和力,通过按针对五组氨酸抗体所述固定在活化的CM5传感芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)来捕获双特异性构建体。偶联蛋白质的最终量约为12000RU。按300nM捕获双特异性构建体90秒。靶抗原以30μl/分钟的流速按250至1000nM范围内的浓度通过流动池180秒。监测解离180秒。
通过减去在参考流动池上获得的响应来校正体积折射率差异。用稳态响应来通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合衍生解离常数KD。通过同时拟合结合传感图和解离传感图,用简单的一对一Langmuir结合模型(T100评价软件1.1.1版)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(KD)计算为比值koff/kon。见例如Chen等,JMolBiol293,865-881(1999)。
活性测定
可以通过本领域已知的多种测定(包括实施例中所述的那些)来测量本发明的双特异性抗原结合分子的生物学活性。生物学活性可以例如包括诱导T细胞增殖、诱导T细胞中的信号发放、诱导激活标记在T细胞中的表达、诱导T细胞的细胞因子分泌、抑制诸如肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的靶细胞中的信号发放、抑制靶细胞的增殖、诱导靶细胞的裂解及诱导肿瘤抑制和/或存活改善。
组合、制剂和给药途径
在另一方面,本发明提供包含本文中提供的双特异性抗原结合分子中的任一种的药物组合物,例如用于以下治疗方法中的任一种。在一个实施方案中,药物组合物包含本文中提供的双特异性抗原结合分子中的任一种和可药用载体。在另一实施方案中,药物组合物包含本文中提供的双特异性抗原结合分子中的任一种和至少一种例如下文所述的其他治疗剂。
还提供以适合用于体内施用的形式产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法,该方法包括:(a)获得本发明的双特异性抗原结合分子;和(b)用至少一种可药用载体配制该双特异性抗原结合分子,由此配制双特异性抗原结合分子的制剂用于体内施用。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在可药用载体中的双特异性抗原结合分子。短语“可药用”指这样的分子实体和组合物,在根据需要对动物,例如人施用时,其在所利用的剂量和浓度下一般对受体无毒性,即不产生不良反应、过敏反应或其他不利的反应。如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack PrintingCompany,1990(在此引入作为参考)所示例,鉴于本公开内容,包含至少一种双特异性抗原结合分子和可选的其他活性成分的药物组合物的配制将为本领域技术人员已知。此外,对于动物(例如人)施用,应理解,制剂应符合FDA生物标准办公室或其他国家中的相应机构所要求的无菌性、热源性、一般安全和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。本文所用的“可药用载体”包括本领域普通技术人员已知的任意和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、增甜剂、增香剂、染料等物质及其组合(见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990,1289-1329页,在此引入作为参考)。除与活性成分不相容的任意常规载体外,考虑其在治疗或药物组合物中的用途。
取决于它将以固体、液体或气雾剂形式施用,及它对诸如注射的给药途径而言是否需要无菌,组合物可以包含不同类型的载体。如本领域普通技术人员已知(见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版Mack Printing Company,1990,在此引入作为参考),本发明的双特异性抗原结合分子(和任意其他治疗剂)可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、黏膜、心包内、脐内、眼内、口腔、表面、局部、通过吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸润靶细胞的局部灌注、经导管、经灌洗、在乳剂中、在液体组合物(例如脂质体)中、或通过其他方法或前述的任意组合施用。胃肠外施用,尤其是静脉内注射最常用于施用多肽分子,如本发明的双特异性抗原结合分子。
胃肠外组合物包括设计用于通过注射,例如皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些。对于注射,可以将本发明的双特异性抗原结合分子配制在水溶液中,优选生理上相容的缓冲液,如Hanks溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以包含配制剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地,该双特异性抗原结合分子可以是在使用前用适宜的载体(例如无菌无热原水)重构的粉末形式。通过根据需要将本发明的双特异性抗原结合分子按所需的量掺入含有下文列举的多种其他成分的适当溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以例如通过滤过无菌滤膜来容易地达到无菌。通常,通过将多种无菌活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬液或乳状液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,该技术从其之前无菌过滤的液体介质产生活性成分加任意其他的希望的成分的粉末。如果必要,液体介质应适宜地缓冲,且在注射前先用足够的盐溶液或葡萄糖使液体稀释剂等渗。组合物必须在制备和保存的条件下稳定,并针对微生物(如细菌和真菌)的污染作用进行防腐处理。应理解,应在安全水平保持内毒素污染最小化,例如低于0.5ng/mg蛋白质。适宜的可药用载体包括但不限于:缓冲剂,如磷酸、柠檬酸和其他有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲双铵;苯扎氯铵、苄索氯铵;苯酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯,如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其他糖类,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如EDTA;糖,如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐抗衡离子,如钠;金属络合物(例如,Zn-蛋白质络合物);和/或非离子型表面活性剂,如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以包含提高该悬液的黏度的化合物,如羧甲基纤维素钠、山梨醇、葡聚糖等。可选地,该悬液还可以包含适宜的稳定剂或提高该化合物的溶解度的物质,以允许制备高度浓缩的溶液。此外,活性化合物的悬液还可以制备为适当的油性注射悬液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油,如芝麻油,或合成的脂肪酸酯,如ethyl cleats或甘油三酯,或脂质体。
活性成分可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如,分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版Mack Printing Company,1990)中。可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有多肽的固体疏水聚合物的半透性基质,该基质是成形物品的形式,例如膜或微囊。在具体实施方案中,可以通过在组合物中使用延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝、明胶或其组合)来产生可注射组合物的延长吸收。
除之前描述的组合物外,该双特异性抗原结合分子还可以配制为储存制剂。这类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。因此,例如,该双特异性抗原结合分子可以用适宜的聚合物质或疏水物质(例如作为可用油中的乳状液)或离子交换树脂配制,或作为微溶的衍生物,例如,作为微溶的盐配制。
包含本发明的双特异性抗原结合分子的药物组合物可以利用常规的混合、溶解、乳化、包封、包载或冻干方法来制备。可以用一种或多种便于将蛋白质加工为可以药用的制剂的可药用载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。适当的制剂取决于所选择的给药途径。
该双特异性抗原结合分子可以以游离酸或碱、中性或盐的形式配制为组合物。可药用盐是基本上保持游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐,例如与蛋白质组合物的游离氨基形成,或与诸如例如盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐还可以衍生自诸如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱;或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。药用盐趋向于比对应的游离碱形式更易溶于水性溶剂和其他质子性溶剂。
治疗方法和组合物
本文中提供的双特异性抗原结合分子的任一种都可以用于治疗方法。本发明的双特异性抗原结合分子可以用于例如癌症的治疗。
对于在治疗方法中的用途,将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用本发明的双特异性抗原结合分子。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的原因、递送药物的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。
在一方面,提供本发明的双特异性抗原结合分子用作药物。在另一方面,提供本发明的双特异性抗原结合分子用于治疗疾病。在某些实施方案中,提供本发明的双特异性抗原结合分子用于治疗的方法。在一个实施方案中,本发明提供本文中所述的双特异性抗原结合分子用于在有需要的个体中治疗疾病。在某些实施方案中,本发明提供双特异性抗原结合分子用于治疗患有疾病的个体的方法,该方法包括对该个体施用治疗有效量的双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中,待治疗的疾病是增生性障碍。在具体实施方案中,该疾病是癌症。在某些实施方案中,该方法进一步包括对该个体施用治疗有效量的至少一种其他治疗剂,例如抗癌剂(如果该待治疗的疾病是癌症)。以上实施方案中任一个的“个体”是哺乳动物,优选人。
在另一方面,本发明提供本发明的双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中,该药物用于在有需要的个体中治疗疾病。在另一实施方案中,该药物用于治疗疾病的方法,该方法包括对患有该疾病的个体施用治疗有效量的该药物。在某些实施方案中,该待治疗的疾病是增生性疾病。在具体实施方案中,该疾病是癌症。在一个实施方案中,该方法进一步包括对该个体施用治疗有效量的至少一种其他治疗剂,例如抗癌剂(如果该待治疗的疾病是癌症)。以上实施方案中任一个的“个体”是哺乳动物,优选人。
在另一方面,本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中,该方法包括对患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,对该个体施用以可药用形式包含本发明的双特异性抗原结合分子的组合物。在某些实施方案中,该待治疗的疾病是增生性疾病。在具体实施方案中,该疾病是癌症。在某些实施方案中,该方法进一步包括对该个体施用治疗有效量的至少一种其他治疗剂,例如抗癌剂(如果该待治疗的疾病是癌症)。以上实施方案中任一个的“个体”是哺乳动物,优选人。
在某些实施方案中,该待治疗的疾病是增生性障碍,尤其是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以用本发明的双特异性抗原结合分子治疗的其他细胞增殖障碍包括但不限于定位在以下中的肿瘤:腹部、骨、乳腺、消化系统、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖系统。还包括癌前病症或损伤和癌症转移。在某些实施方案中,该癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。熟练的技术人员容易地认识到,在许多情况下,该双特异性抗原结合分子可以不提供治愈,但可以仅提供部分益处。在一些实施方案中,还认为具有某种益处的生理变化在治疗上有益。因此,在一些实施方案中,认为提供生理变化的双特异性抗原结合分子的量是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常是哺乳动物,更具体而言,是人。
在一些实施方案中,对细胞施用有效量的本发明的双特异性抗原结合分子。在其他实施方案中,对个体施用治疗有效量的本发明的双特异性抗原结合分子用于治疗疾病。
对于疾病的预防或治疗,本发明的双特异性抗原结合分子的适当剂量(单独使用或与一种或多种其他其他治疗剂组合使用)将取决于待治疗的疾病的类型、给药途径、患者的体重、双特异性抗原结合分子的类型、疾病的严重度和病程、为了预防或是治疗的目的施用该双特异性抗原结合分子、之前或并行的治疗干预、患者的临床病史和对该双特异性抗原结合分子的反应及主治医师的判断。负责施用的工作者将在任何情况下确定组合物中一种或多种活性成分的浓度及对单个个体适当的一个或多个剂量。本文中考虑多种给药方案,其包括但不限于在多种时间点单次或多次施用、快速注射施用和脉冲输注。
在一次或一系列的治疗中适宜地对患者施用双特异性抗原结合分子。取决于疾病的类型和严重度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗原结合分子可以是例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来对患者施用的初始候选剂量。取决于上述因素,一个典型的日剂量可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几天或更长时间内反复施用,取决于病症,治疗通常将持续直至出现希望的疾病症状的抑制。双特异性抗原结合分子的一个示例性剂量将在从约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中,剂量还可以包含每次施用从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多,及可从其衍生的任意范围。在可从本文中所列的数字衍生的范围的非限制性实例中,根据上述数字,可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围。因此,可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg的一个或多个剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间歇施用,例如每周或每三周(例如,使得患者接受约2个至约20个,或例如约6个剂量的双特异性抗原结合分子)。可以施用最初较高的负荷剂量,然后施用一个或多个较低的剂量。但是,可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定容易地监测此治疗的进展。
本发明的双特异性抗原结合分子通常将以对达到预期目的有效的量使用。为了用来治疗或预防疾病病症,以治疗有效量施用或应用本发明的双特异性抗原结合分子或其药物组合物。尤其是鉴于本文中提供的详细公开内容,治疗有效量的测定良好地处于本领域技术人员的能力范围之内。
对于全身施用,最初可以从诸如细胞培养物测定的体外测定估计治疗有效剂量。然后可以配制在动物模型中达到包括在细胞培养物中测定的IC50的循环浓度范围的剂量。这种信息可以用来更准确地测定在人类中有用的剂量。
还可以用本领域公知的技术从体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以根据动物数据容易地优化施用。
可以单独调节剂量和间隔来提供足以维持治疗效果的血浆双特异性抗原结合分子水平。通过注射施用的常见患者剂量在从约0.1至50mg/kg/天、通常从约0.5至1mg/kg/天的范围内。可以通过每天施用多个剂量来达到治疗有效血浆水平。血浆中的水平可以例如通过HPLC来测量。
在局部施用或选择性摄取的情况下,双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够在不进行过多实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。
本文中所述的双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定双特异性抗原结合分子的毒性和治疗有效性。可以用细胞培养物测定和动物研究来测定LD50(致死群体的50%的剂量)和ED50(在群体的50%中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数,其可以表示为比值LD50/ED50。优选显示大治疗指数的双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子显示高治疗指数。从细胞培养物测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列适合用于人类的剂量。该剂量优选处于具有很小毒性或无毒性的包括ED50的循环浓度的范围之内。取决于多种因素(例如所利用的剂型、所利用的给药途径、个体的病症等),剂量可以在此范围内变动。精确的制剂、给药途径和剂量可以由个别医师基于患者的病症来选择(见例如Fingl等,1975,在The Pharmacological Basisof Therapeutics,第1章,第1页中,在此完整引入作为参考)。
用本发明的双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治医师将指导如何及何时由于毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调整施用。相反,主治医师还将知道在临床反应不充分(排除毒性)时如何将治疗调整至更高水平。在目的障碍的治疗中施用的剂量的量级将随待治疗的病症的严重度、随给药途径等而变。病症的严重度可以例如通过标准预后评价法来部分评价。此外,剂量,可能还有剂量频率还将根据个体患者的年龄、体重和反应而变。
其他药物和治疗
本发明的双特异性抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其他药物组合施用。例如,本发明的双特异性抗原结合分子可以与至少一种其他治疗剂共同施用。术语“治疗剂”涵盖施用来在需要这种治疗的个体中治疗症状或疾病的任意药物。这种其他治疗剂可以包含适合用于所治疗的具体适应症的任意活性成分,优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。在某些实施方案中,其他治疗剂是免疫调节剂、细胞生长抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞毒剂、细胞凋亡激活剂或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药物。在具体实施方案中,该其他治疗剂是抗癌剂,例如微管破坏剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素治疗、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡激活剂或抗血管发生剂。
这类其他药物适宜地以对预期目的有效的量组合存在。这类其他药物的有效量取决于所使用的双特异性抗原结合分子的量、障碍或治疗的类型及上文讨论的其他因素。双特异性抗原结合分子通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径,或本文中所述剂量的约1%至99%,或以经验上/临床上确定为适当的任意剂量和通过任意途径使用。
上文指出的这类联合治疗涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或分开的组合物中),及分开施用,在这种情况下,本发明的双特异性抗原结合分子的施用发生在施用其他治疗剂和/或佐剂之前、与之同时和/或在之后。本发明的双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法组合使用。
制成品(article of manufacture)
在本发明的另一方面,提供包含用于治疗、预防和/或诊断上述障碍的材料的制成品。制成品包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器、IV溶液袋等。容器可以形成自多种材料,如玻璃或塑料。容器容纳组合物,该组合物自身或与另一组合物组合对治疗、预防和/或诊断病症有效,且可以具有无菌接口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性抗原结合分子。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外,制成品可以包含(a)组合物包含在其中的第一容器,其中该组合物包含本发明的双特异性抗原结合分子;和(b)组合物包含在其中的第二容器,其中该组合物包含其他细胞毒剂或其他治疗剂。本发明的此实施方案中的制成品可以进一步包含指示该组合物可以用来治疗具体病症的包装说明书。备选地或此外,制成品可以进一步包含第二(或第三)容器,该容器包含可药用缓冲液,如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包含商业和用户角度希望的其他材料,包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解,鉴于上文给出的一般描述,可以实施多种其他实施方案。
一般方法
重组DNA技术
按Sambrook等,Molecular cloning:A laboratory manual;冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989中所述用标准方法来操作DNA。分子生物学试剂按照厂家的说明使用。Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication No.91-3242中给出了关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。
DNA测序
通过双链测序来测定DNA序列。
基因合成
需要时,通过使用适当模板的PCR产生或由Geneart AG(Regensburg,德国)通过自动基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合成希望的基因区段。在不可获得精确的基因序列的情况下,根据来自最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物,并通过RT-PCR从源自适当组织的RNA分离基因。将单个限制性内切核酸酶切割位点位于侧翼的基因区段克隆入标准克隆/测序载体。从转化的细菌纯化质粒DNA,并通过UV光谱测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因区段设计为具有适宜的限制位点,以允许亚克隆入各表达载体。所有构建体都设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列,该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。SEQ ID NO74-76给出了示例性前导肽。
从PBMC分离初级人全T细胞
通过Histopaque密度离心来从获自地方血库的富集淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)或从来自健康人供体的新鲜血液制备外周血单核细胞(PBMC)。简言之,用无菌PBS稀释血液,并小心地在Histopaque梯度(Sigma,H8889)上分层。室温下450xg离心30分钟后(制动器(brake)关闭),弃掉含有PBMC的中间相上方的血浆的部分。将PBMC转入新的50ml Falcon管,并用PBS填充管至50ml的总体积。室温下400xg离心混合物10分钟(制动器关闭)。弃上清,用无菌PBS洗涤PBMC沉淀两次(4℃下350xg离心10分钟的离心步骤)。自动计数(ViCell)所得到的PBMC群体,并于培养箱中37℃、5%CO2保存在含有10%FCS和1%L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom,K0302)的RPMI1640培养基中,直至测定开始。
按照厂家的说明用全T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)进行从PBMC富集T细胞。简言之,将细胞沉淀每一千万个细胞稀释在40μl冷缓冲液(含0.5%BSA、2mM EDTA的PBS,无菌过滤)中,每一千万个细胞用10μl生物素-抗体混合物在4℃下孵育10分钟。每一千万个细胞加入30μl冷缓冲液和20μl抗-生物素磁珠,4℃下再孵育混合物15分钟。通过加入10-20x当前体积和随后300xg10分钟的离心步骤来洗涤细胞。将至多一亿个细胞重悬在500μl缓冲液中。按照厂家的说明用LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)进行未标记的人全T细胞的磁性分离。自动计数(ViCell)所得到的T细胞群体,并于培养箱中37℃、5%CO2保存在AIM-V培养基中,直至测定开始(不长于24小时)。
从PBMC分离初级人稚T细胞
通过Histopaque密度离心来从获自地方血库的富集淋巴细胞制备物(暗黄覆盖层)或从来自健康人供体的新鲜血液制备外周血单核细胞(PBMC)。按照厂家的说明用来自Miltenyi Biotec的稚CD8+T细胞分离试剂盒(#130-093-244)进行从PBMC富集T细胞,但省去CD8+T细胞的最后的分离步骤(还见初级人全T细胞的分离的描述)。
从肝素化血液分离初级猕猴PBMC
按以下通过密度离心来从来自健康猕猴供体的新鲜血液制备外周血单核细胞(PBMC):用无菌PBS1:3稀释肝素化血液,用无菌PBS将Lymphoprep培养基(Axon Lab#1114545)稀释至90%。在一体积的稀释密度梯度上分层两体积的稀释血液,并通过在室温下无制动520xg离心30分钟来分开PBMC级分。将PBMC条带转入新鲜的50ml Falcon管,并通过在4℃下400xg离心10分钟来用无菌PBS洗涤。进行一次低速离心来去除血小板(150xg、4℃下15分钟),自动计数(ViCell)所得到的PBMC群体,并立即用于其它测定。
靶细胞
对于靶向MCSP的双特异性抗原结合分子的评估,使用了以下肿瘤细胞系:衍生自恶性黑素瘤的转移部位并表达高水平的人MCSP的人黑素瘤细胞系WM266-4(ATCC#CRL-1676);表达中等水平的人MCSP的人黑素瘤细胞系MV-3(The Radboud UniversityNijmegen Medical Centre惠赠)。
对于靶向CEA的双特异性抗原结合分子的评估,使用了以下肿瘤细胞系:表达非常高水平的人CEA的人胃癌细胞系MKN45(DSMZ#ACC409);表达中等水平至低水平的人CEA的女性白种人结肠腺癌细胞系LS-174T(ECACC#87060401);表达(非常)低水平的人CEA的人上皮样胰腺癌细胞系Panc-1(ATCC#CRL-1469);内部改造为稳定表达人CEA的鼠结肠癌细胞系MC38-huCEA。
此外,用人T细胞白血病细胞系Jurkat(ATCC#TIB-152)来评估不同双特异性构建体与细胞上的人CD3的结合。
实施例1
双特异性抗原结合分子的制备、纯化和表征
与预先插入各受体哺乳动物表达载体的恒定重链或恒定轻链符合读框地亚克隆了重链和轻链可变区DNA序列。抗体表达由MPSV启动子驱动,合成的polyA信号序列位于CDS的3’端。此外,每个载体包含EBV OriP序列。
通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293EBNA细胞来产生该分子。用磷酸钙法转染指数生长的HEK293EBNA细胞。备选地,用聚乙烯亚胺(PEI)转染悬浮生长的HEK293EBNA细胞。对于“1+1IgG Crossfab”构建体的制备,按1:1:1:1的比例(“第二重链载体”:“第一轻链载体”:“轻链Crossfab载体”:“第一重链-重链Crossfab载体”)用相应的表达载体转染细胞。对于“2+1IgG Crossfab”构建体的制备,按1:2:1:1的比例(“第二重链载体”:“轻链载体”:“第一重链-重链Crossfab载体”:“轻链Crossfab载体”)用相应的表达载体转染细胞。对于“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”构建体的制备,按1:1:1:1(“重链载体”:“轻链载体”:“重链(CrossFab-Fab-Fc)载体”:“连接轻链载体”)的比例用相应的表达载体转染细胞。对于“1+1CrossMab”构建体的制备,按1:1:1:1(“第一重链载体”:“第二重链载体”:“第一轻链载体”:“第二轻链载体”)的比例用相应的表达载体转染细胞。
对于使用磷酸钙的转染,用补充了10%(v/v)FCS的DMEM培养基将细胞作为贴壁单层培养物培养在T瓶中,并在它们50%至80%汇合时转染。对于T150瓶的转染,转染前24小时将一千五百万个细胞接种在25ml补充了FCS(按最终为10%v/v)的DMEM培养基中,并将细胞在具有5%CO2空气的培养箱中37℃过夜放置。对于每个待转染的T150瓶,通过将94μg按对应的比例分配的总质粒载体DNA、终体积469μl的水和469μl1M CaCl2溶液混合来制备DNA、CaCl2和水的溶液。向此溶液中加入938μl pH7.05的50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mMNa2HPO4溶液,立即混合10秒,并在室温下静置20秒。用10ml补充了2%(v/v)FCS的DMEM稀释该悬液,并加至T150来替代现有培养基。随后,加入额外13ml的转染培养基。细胞在37℃、5%CO2下孵育约17至20小时,然后用25ml DMEM、10%FCS更换培养基。更换培养基后约7天,通过210xg离心15分钟来收集条件培养基,无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮钠至0.01%(w/v)的终浓度,并保存在4℃。
对于使用聚乙烯亚胺(PEI)的转染,将HEK293EBNA细胞悬浮培养在无血清CD CHO培养基中。对于500ml摇瓶中的产生,转染前24小时接种四亿个HEK293EBNA细胞。对于转染,210xg离心细胞5分钟,并用20ml预温的CD CHO培养基替代上清。将表达载体混合在20mlCDCHO培养基中至200μg DNA的最终量。加入540μl PEI后,涡旋混合物15秒,随后在室温下孵育10分钟。然后,将细胞与DNA/PEI溶液混合,转移至500ml摇瓶,并在具有5%CO2空气的培养箱中37℃孵育3小时。赋予时间之后,加入160ml F17培养基,并培养细胞24小时。转染后一天,加入1mM丙戊酸(valpronic acid)和7%Feed1(Lonza)。培养7天后,通过210xg离心15分钟来收集上清用于纯化,将溶液无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮钠至0.01%w/v的终浓度,并保存在4℃。
通过A蛋白亲和层析后进行大小排阻层析步骤来从细胞培养物上清纯化分泌性蛋白质。
对于亲和层析,将上清上样在用25ml20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、pH7.5或40ml20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、pH7.5平衡的HiTrap ProteinA HP柱(CV=5ml,GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠pH7.5洗涤及随后使用6个柱体积的10mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠pH5.45的其他洗涤步骤来去除未结合的蛋白质。随后,用20ml10mM MES、100mM氯化钠、pH5.0洗涤柱,并用6个柱体积的20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸、pH3.0洗脱靶蛋白。备选地,用超过20个柱体积的从20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、pH7.5至20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、pH2.5的梯度洗脱靶蛋白。通过加入1/10的0.5M磷酸钠pH8来中和蛋白质溶液。浓缩并过滤靶蛋白,然后上样在用pH6.7的25mM磷酸钠、125mM氯化钠、100mM甘氨酸溶液平衡的HiLoadSuperdex200柱(GE Healthcare)上。对于1+1IgG Crossfab的纯化,用pH6.0的20mM组氨酸、140mM氯化钠平衡柱。
使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测量280nm光密度(OD)来测定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。按厂家的说明(4-12%Tris-乙酸盐凝胶或4-12%Bis-Tris)使用Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen,USA),通过存在和缺乏还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)情况下的SDS-PAGE及考马斯染色(来自Invitrogen的SimpleBlueTMSafeStain)来分析双特异性构建体的纯度和分子量。备选地,按厂家的说明使用CaliperLabChip GXII系统(Caliper Lifescience),通过存在和缺乏还原剂情况下的CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。
在25℃下用Superdex20010/300GL分析型大小排阻层析柱(GEHealthcare)在2mMMOPS、150mM NaCl、0.02%(w/v)NaN3、pH7.3运行缓冲液中分析蛋白质样品的聚集体含量。备选地,在25℃下用TSKgel G3000SW XL分析型大小排阻层析柱(Tosoh)在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02%(w/v)NaN3、pH6.7运行缓冲液中分析抗体样品的聚集体含量。
用具有基因组基因组织(包括内含子序列、CMV启动子和来自牛生长激素的多腺苷酸化信号)的质粒载体制备“2+1IgG Crossfab(C端)”构建体(参见SEQ ID NO:11、12、13和14)。通过用不同的质粒比经脂质转染法同时转染所需的质粒来在HEK293F细胞中瞬时表达该双特异性构建体。将细胞培养在F17培养基中。转染后5-7天收集上清。纯化前通过0.2μm孔径的膜(Millipore)无菌过滤所收集的细胞培养物上清。对于纯化,将双特异性分子捕获在MabSelectSure树脂(GE Healthcare)上,用1x PBS洗涤,并用pH3.0的20mM柠檬酸钠洗脱。使用用20mM组氨酸、140mM NaCl、pH6.0平衡的SuperdexTM200GL(Amersham Bioscience)柱,通过大小排阻层析进一步纯化分子。用使用微流体Labchip技术(Caliper)的毛细管电泳(CE-SDS)分析来进行双特异性分子的表征(抗体完整性评估)。按厂家的说明用HT蛋白质表达试剂盒制备5μl蛋白质溶液用于CE-SDS,并用HT蛋白质表达芯片在LabChip GXII系统上分析。
图2-5显示SDS PAGE和分析型大小排阻层析的结果,表2显示不同双特异性构建体的制备物的产率、A蛋白后的聚集体含量和最终单体含量。重要地,与对应的包含单链Fab片段替代Crossfab片段的双特异性构建体相比,本发明的双特异性IgG Crossfab构建体在A蛋白亲和层析后显示降低10至20倍的聚集体含量(数据未显示)。
图13显示抗-CD3/抗-MCSP双特异性“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”构建体(见SEQ ID NO1、4、5和85)的CE-SDS分析的结果。用2μg样品进行分析。图14显示终产物的分析型大小排阻层析(注入20μg样品)。
图20显示“1+1IgG Crossfab(N端);VL/VH交换(LC007/V9)”、“1+1CrossMab;CL/CH1交换(LC007/V9)”、“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒;CL/CH1交换(LC007/V9)”、“2+1IgGCrossfab(N端);VL/VH交换(M4-3ML2/V9)”、“2+1IgG Crossfab(N端);CL/CH1交换(M4-3ML2/V9)”和“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒;CL/CH1交换(CH1A1A/V9)”的CE-SDS分析的结果,表2显示不同双特异性构建体的制备物的产率、A蛋白后的聚集体含量和最终单体含量。
表2.产率、A蛋白后的聚集体含量和最终单体含量。
实施例2
双特异性构建体与两种靶抗原的同时结合
通过表面等离振子共振来分析“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体(SEQ ID NO1、3、4、5)与人MCSP和人CD3ε的同时结合。
所有表面等离振子共振(SPR)实验都以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPESpH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%表面活性剂P20,Biacore,弗莱堡/德国)于25℃下在Biacore T100上进行。
通过用标准偶联方法直接将1650共振单位(RU)的生物素化MCSP D3结构域直接偶联在传感芯片SA上来进行双特异性构建体与肿瘤抗原和人CD3ε的同时结合的分析。图6A中显示测定设置。
按200nM捕获“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体60秒。然后使人CD3γ(G4S)5CD3ε-AcTev-Fc(杵)-Avi/Fc(臼)按2000nM的浓度和40μl/分钟的流速通过60秒。通过减去在参考流动池上获得的响应来校正体积折射率差异,在该参考流动池中,重组CD3ε流过具有固定化的MCSP D3结构域而无捕获的双特异性构建体的表面。
如图6B中所示,构建体能够同时结合肿瘤抗原和CD3。注入人CD3ε后的结合水平(RU)高于单独注入构建体后所达到的结合水平,反映出肿瘤抗原和人CD3ε都与双特异性构建体结合。
实施例3
双特异性构建体在靶细胞的存在和缺乏下的T细胞激活
细胞因子释放
针对它们在肿瘤靶细胞的存在或缺乏下诱导T细胞介导的细胞因子从头分泌的能力分析了纯化的“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体(SEQ IDNO1、3、4、5)和“(scFv)2”分子,二者都靶向人MCSP和人CD3。
简言之,在深孔96孔板的每个孔中铺入280μl来自健康供体的全血。加入30000个Colo-38肿瘤靶细胞(表达人MCSP),以及终浓度为1nM的两种双特异性构建体和IgG对照。细胞在37℃、5%CO2下孵育24小时,然后350xg离心5分钟。将上清转入新的深孔96孔板用于随后的分析。按照厂家针对FACS CantoII的说明进行CBA分析,使用以下CBAFlex Set的组合:人粒酶B(BD#560304)、人IFN-γFlex Set(BD#558269)、人TNF Flex Set(BD#558273)、人IL-10Flex Set(BD#558274)、人IL-6Flex Set(BD#558276)、人IL-4Flex Set(BD#558272)、人IL-2Flex Set(BD#558270)。
图7显示在上清中测量的不同细胞因子的水平。在Colo-38肿瘤细胞的存在下分泌的主要细胞因子是IL-6,随后是IFN-γ。此外,在靶细胞的存在下,粒酶B的水平也在T细胞激活时强烈提高。一般而言,两种双特异性构建体都在靶细胞的存在下(图7,A和B)而不是在靶细胞的缺乏下(图7,C和D)诱导高水平的细胞因子分泌。在靶细胞的存在(或缺乏)下,T细胞激活时不存在Th2细胞因子(IL-10和IL-4)的显著分泌。
表面激活标记的表达
在另一实验中,针对其在肿瘤靶细胞的存在下上调CD8+T细胞上的表面激活标记CD25的潜能分析了纯化的“2+1IgG Crossfab(N端)”(SEQ ID NO4、5、6、7)(靶向猕猴CD3和人MCSP)。简言之,用细胞解离缓冲液收集表达人MCSP的MV-3肿瘤靶细胞,洗涤,并重悬在含有2%FCS和1%GlutaMax的DMEM中。在圆底96孔板中每孔接种30000个细胞,按所示浓度加入各抗体稀释液(图8)。将双特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。加入从两只健康动物的血液分离的猕猴PBMC效应细胞,以获得3:1的最终E:T比。37℃、5%CO2下孵育43小时后,350xg离心细胞5分钟,并用含有0.1%BSA的PBS洗涤两次。按照供应商的建议进行CD8(Miltenyi Biotech#130-080-601)和CD25(BD#557138)的表面染色。用150μl/孔的含0.1%BSA的PBS洗涤细胞两次,并用100μl/孔的固定缓冲液(BD#554655)在4℃下固定15分钟。离心后,将样品重悬在200μl/孔的含0.1%BSA的PBS中,并用FACSCantoII机器(软件FACS Diva)分析。
如图8中所示,双特异性构建体仅在靶细胞的存在下诱导CD8+T细胞上的CD25的浓度依赖性上调。抗猕猴CD3IgG(克隆FN-18)也能够诱导CD8+T细胞上的CD25的上调,而不与肿瘤靶细胞交联(见用猕猴Nestor获得的数据)。最大浓度的双特异性构建体不存在猕猴T细胞的超活化(在靶细胞的缺乏下)。
在另一实验中,针对其在肿瘤靶细胞的存在下上调CD8+T细胞上的早期激活标记CD69或晚期激活标记CD25的潜能,将CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”(见SEQID NO1、4、5和85)与CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab(N端)”(见SEQ ID NO1、3、4和5)相比较。在MCSP阳性Colo38靶细胞的存在或缺乏下用所示浓度的双特异性构建体孵育初级人PBMC(按上文所述分离)至少22小时。简言之,在包含MCSP阳性靶细胞(或培养基)的平底96孔板的每个孔中接种三十万个初级人PBMC。最终的效应细胞与靶细胞(E:T)比例为10:1。用所示浓度的双特异性构建体和对照在37℃、5%CO2下孵育细胞所示的孵育时间。对效应细胞进行CD8和CD69或CD25染色,并通过FACS CantoII分析。
图19显示此实验的结果。未在两种2+1IgG Crossfab分子(含有或不含连接轻链)之间检测到CD69(A)或CD25上调(B)的显著差异。
还在另一实验中,针对它们在肿瘤靶细胞的存在下上调CD4+或CD8+T细胞上的CD69或CD25的潜能,将CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab(N端)”(见SEQ ID NO1、3、4、5)和“1+1IgGCrossfab(N端)”(见SEQID NO1、3、4、86)构建体与一个抗原结合臂被Crossfab片段取代的双特异性CD3-MCSP IgG样构建体(“1+1CrossMab”;见SEQ ID NO4、87、88、89)相比较。该测定在表达人MCSP的MV-3肿瘤细胞的存在或缺乏下按上文所述进行,孵育时间为24小时。
如图21中所示,“1+1IgG Crossfab(N端)”和“2+1IgG Crossfab (N端)”构建体诱导比“1+1CrossMab”分子更深刻的激活标记上调。
实施例4
由靶向T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的MCSP的交联双特异性构建体介导的重定向的T细胞细胞毒性(LDH释放测定)
针对它们在经抗原结合部分与它们各自在细胞上的靶抗原的结合交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜能分析了双特异性构建体。
在一个实验中,比较了纯化的“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体(SEQID NO1、3、4、5)(靶向人CD3和人MCSP)和相应的“(scFv)2”分子。简言之,用细胞解离缓冲液收集表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤靶细胞,洗涤,并重悬在AIM-V培养基(Invitrogen#12055-091)中。在圆底96孔板中每孔接种30000个细胞,并按所示浓度加入构建体的各稀释液。将所有构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。加入人全T效应细胞来获得5:1的最终E:T比。作为人全T细胞激活的阳性对照,使用了1μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化,通过用终浓度1%的Triton X-100孵育靶细胞来测定靶细胞的最大裂解(100%)。最小裂解(=0%)指靶细胞与效应细胞共孵育,但无任何构建体或抗体。37℃、5%CO2下20小时的过夜孵育后,按照厂家的说明用LDH检测试剂盒(Roche AppliedScience,#11644793001)测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清中的LDH。
如图9中所示,“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体与“(scFv)2”分子相当地在靶细胞中诱导凋亡。
在另一实验中,针对它们在通过结合细胞上的CD3和MCSP两种靶抗原交联构建体时在肿瘤靶细胞中诱导T细胞介导的凋亡的潜能,分析了纯化的“2+1IgG Crossfab(N端)”(SEQ ID NO1、3、4、5)、“1+1IgG Crossfab(N端)”(SEQ ID NO1、2、3、4)和“(scFv)2”分子。用表达huMCSP的MDA-MB-435人黑素瘤细胞作为靶细胞,E:T比为5:1,孵育时间为20小时。结果显示在图10中。“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体与“(scFv)2”分子相当地在靶细胞中诱导凋亡。单价和二价“IgG Crossfab(N端)”形式的比较显示,二价形式在此测定中更有效。
还在另一实验中,用表达MCSP的人黑素瘤细胞系(MV-3)作为靶细胞,比较了纯化的“2+1IgG Crossfab(N端)”(SEQ ID NO4、5、6、7)(靶向猕猴CD3和人MCSP)和对应的“(scFv)2”构建体。简言之,用细胞解离缓冲液收集MV-3细胞,洗涤,并重悬在含有2%FCS和1%GlutaMax的DMEM中。在圆底96孔板的每个孔中接种30000个细胞,并按所示浓度加入构建体或参考IgG的各稀释液。将双特异性构建体和不同的IgG对照调节至相同的体积摩尔浓度。加入从健康猕猴的血液分离的猕猴PBMC效应细胞,以获得10:1的最终E:T比。37℃、5%CO2下孵育26小时后,按照厂家的说明用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science,#11644793001)测量凋亡/坏死的靶细胞释放入上清中的LDH。
如图11中所示,就EC50而言,“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体比“(scFv)2”分子更有效。
在另一组实验中,将CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab(N端),连接轻链”(见SEQ IDNO1、4、5和85)与CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab(N端)”(见SEQ ID NO1、3、4和5)相比较。简言之,在测定当天用细胞解离缓冲液(或在测定开始前一天用胰蛋白酶)收集靶细胞(人Colo-38、人MV-3或WM266-4黑素瘤细胞),洗涤,并重悬在适当的细胞培养基(包含2%FCS和1%Glutamax的RPMI1640)中。在平底96孔板中每孔接种20000-30000个细胞,并按所示加入各抗体稀释液(三个重复)。加入作为效应细胞的PBMC,以获得10:1的最终效应细胞-靶细胞(E:T)比。将所有构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度,孵育时间为22小时。按上文所述进行LDH释放的检测和归一化。
图15至18显示用MV-3黑素瘤细胞(图15)、Colo-38细胞(图16和17)或WM266-4细胞(图18)进行的四次测定的结果。如图15中所示,在以MV-3细胞作为靶细胞的测定中,与不含连接轻链的构建体相比,含有连接轻链的构建体效果较差。如图16和17中所示,在以高表达MCSP的Colo-38细胞作为靶细胞的测定中,与不含连接轻链的构建体相比,含有连接轻链的构建体更有效。最后,如图18中所示,在用高表达MCSP的WM266-4细胞作为靶细胞时,两种构建体之间不存在显著差异。
在另一实验中,比较了两种靶向CEA的“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒”构建体,其中在该Crossfab片段中,交换了V区(VL/VH,见SEQ ID NO3、8、9、10)或C区(CL/CH1,见SEQID NO9、10、87、95)。使用作为效应细胞的人PBMC和表达人CEA的靶细胞,按上文所述进行测定。用胰蛋白酶-EDTA(LuBiosciences#25300-096)收集靶细胞(MKN-45或LS-174T肿瘤细胞),洗涤,并重悬在包含1%Glutamax(LuBiosciences #35050087)和2%FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042)中。在圆底96孔板中每孔接种30000个细胞,并按所示浓度加入双特异性构建体。将所有构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。加入人PBMC效应细胞来获得10:1的最终E:T比,孵育时间为28小时。用GraphPad Prism5软件计算EC50值。
如图22中所示,具有CL/CH1交换的构建体对两种靶细胞系都显示比具有VL/VH交换的构建体略好的活性。对于CL/CH1交换的构建体和VL/VH交换的构建体,计算的EC50值对MKN-45细胞分别为115pM和243pM,对LS-174T细胞分别为673pM和955pM。
类似地,比较了两种靶向MCSP的“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体,其中在该Crossfab片段中,交换了V区(VL/VH,见SEQ ID NO3、91、92、93)或C区(CL/CH1,见SEQ IDNO87、91、93、94)。使用作为效应细胞的人PBMC和表达人MCSP的靶细胞,按上文所述进行测定。用细胞解离缓冲液(LuBiosciences#13151014)收集靶细胞(WM266-4),洗涤,并重悬在包含1%Glutamax(LuBiosciences#35050087)和2%FCS的RPMI1640(Invitrogen#42404042)中。在圆底96孔板中每孔接种30000个细胞,并按所示浓度加入构建体。将所有构建体和对照调节至相同的体积摩尔浓度。加入人PBMC效应细胞来获得10:1的最终E:T比,孵育时间为26小时。用GraphPad Prism5软件计算EC50值。
如图23中所示,两种构建体显示可比的活性,具有CL/CH1交换的构建体具有略低的EC50值(与VL/VH交换的构建体的16.8pM相比,CL/CH1交换的构建体为12.9pM)。
图24显示用表达人MCSP的MV-3靶细胞进行的相似测定的结果。同样,两种构建体都显示可比的活性,具有CL/CH1交换的构建体具有略低的EC50值(与VL/VH交换的构建体的约82.2pM相比,CL/CH1交换的构建体为约11.7pM)。由于杀伤曲线未在高浓度的化合物下达到平台,不能计算精确的EC50值。
在另一实验中,将CD3-MCSP“2+1IgG Crossfab(N端)”(见SEQ ID NO1、3、4、5)和“1+1IgG Crossfab(N端)”(见SEQ ID NO1、3、4、86)构建体与CD3-MCSP“1+1CrossMab”(见SEQID NO4、87、88、89)相比较。使用作为效应细胞的人PBMC和WM266-4或MV-3靶细胞(E:T比=10:1),按上文所述进行测定,孵育时间为21小时。
如图25中所示,“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体是在此测定中最有效的分子,随后是“1+1IgG Crossfab(N端)”和“1+1CrossMab”。与高表达MCSP的WM266-4细胞相比,此排序对表达中等水平的MCSP的MV-3细胞而言甚至更显著。对于“2+1IgG Crossfab(N端)”、“1+1IgG Crossfab(N端)”和“1+1CrossMab”,计算的EC50值对MV-3细胞分别为9.2pM、40.9pM和88.4pM,对WM266-4细胞分别为33.1pM、28.4pM和53.9pM。
实施例5
双特异性构建体与细胞上的各靶抗原的结合
通过FACS来测定不同双特异性构建体与Jurkat(ATCC#TIB-152)细胞上的CD3和WM266-4细胞上的肿瘤抗原MCSP或LS174-T细胞上的CEA的结合。简言之,收集细胞,计数,并检验活率。在圆底96孔板中每孔接种十五万至二十万个细胞,并用所示浓度的双特异性构建体和对照在4℃下孵育30分钟。为了更好地比较,将构建体归一化至相同的体积摩尔浓度。用含0.1%BSA的PBS洗涤细胞一次。用FITC或PE缀合的二抗在4℃孵育30分钟后,用FACSCantoII(软件FACS Diva)检测结合的构建体。使用了FITC或PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段、山羊抗-人IgG Fcγ片段特异性(分别为Jackson Immuno Research Lab#109-096-098/工作液1:20,或#109-116-170/工作液1:80)。除非另有说明,用100μl/孔的固定缓冲液(BD#554655)在4℃下避光固定细胞15分钟,400xg离心6分钟,并保存在200μl/孔的含0.1%BSA的PBS中,直至分析。用GraphPad Prism5软件计算EC50值。
图26显示在Crossfab片段中具有VL/VH(见SEQ ID NO3、8、9、10)或CL/CH1交换(见SEQ ID NO9、10、87、95)的CD3/CEA“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒”双特异性构建体与Jurkat细胞表达的人CD3或与LS-174T细胞表达的人CEA的结合。作为对照,还评估了等同最大浓度的相应IgG及由标记二抗(山羊抗-人FITC缀合AffiniPure F(ab’)2片段,Fcγ片段特异,Jackson Immuno Research Lab#109-096-098)引起的背景。两种构建体都显示与细胞上的人CEA以及人CD3的良好结合。对于“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒(VL/VH)”和“2+1IgG Crossfab(N端),颠倒(CL/CH1)”构建体,计算的EC50值分别为4.6nM和3.9nM(CD3)及9.3nM和6.7nM(CEA)。
图27显示CD3/MCSP“2+1IgG Crossfab(N端)”(见SEQ ID NO1、3、4、5)和“2+1IgGCrossfab(N端),颠倒”(见SEQ ID NO4、87、89、90)构建体与Jurkat细胞表达的人CD3或与WM266-4细胞表达的人MCSP的结合。虽然两种构建体与细胞上的MCSP的结合类似好,但与另一种构建体相比,“颠倒”构建体与CD3的结合减少。对于“2+1IgGCrossfab(N端),颠倒”和“2+1IgG Crossfab(N端)”构建体,计算的EC50值分别为6.1nM和1.66nM(CD3)及0.57nM和0.95nM(MCSP)。
虽然已为了理解的清晰性的目的以说明和实例的方式非常详细地描述了前述发明,但该描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容以其整体明确引入作为参考。
Claims (30)
1.双特异性抗原结合分子,其由(A)特异性结合第一抗原的第一Fab片段,特异性结合第二抗原的第二Fab片段,包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域,和一个或多个肽接头,或(B)特异性结合第一抗原的第一Fab片段,特异性结合第二抗原的第二和第三Fab片段,包含能够稳定结合的第一和第二亚基的Fc结构域,和一个或多个肽接头组成;其中
a)所述双特异性抗原结合分子提供与所述第一抗原的单价结合;
b)(i)所述第一Fab片段在其C端与所述第二Fab片段的N端融合,所述第二Fab片段转而在其C端与所述第一Fc结构域亚基的N端融合,或(ii)所述第二Fab片段在其C端与所述第一Fab片段的N端融合,所述第一Fab片段转而在其C端与所述第一Fc结构域亚基的N端融合;
c)第三Fab片段,其存在时,在其C末端与第二Fc结构域亚基的N末端融合,
d)在所述第一和/或第二Fab片段中进行以下取代之一:(i)可变结构域VL和VH相互取代;或(ii)恒定结构域CL和CH1相互取代;条件是在所述第一和第二Fab片段中不进行相同的取代,并且在第二个Fab片段和存在第三个Fab片段时在第三个Fab片段中进行相同的取代,且
e)所述双特异性抗原结合分子不包含单链Fab片段。
2.权利要求1的双特异性抗原结合分子,其中所述第一Fab片段在其重链的C端与所述第二Fab片段的重链的N端融合,所述第二Fab片段转而在其重链的C端与所述第一Fc结构域亚基的N端融合。
3.权利要求1的双特异性抗原结合分子,其中所述第二Fab片段在其重链的C端与所述第一Fab片段的重链的N端融合,所述第一Fab片段转而在其重链的C端与所述第一Fc结构域亚基的N端融合。
4.权利要求1至3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述第一Fab片段的Fab轻链和所述第二Fab片段的Fab轻链还可选地经肽接头相互融合。
5.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中在所述第一Fab片段中进行所述取代。
6.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述取代是可变结构域VL和VH的相互取代。
7.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述取代是恒定结构域CL和CH1的相互取代。
8.权利要求1-3任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述第三Fab片段在其重链的C端与所述第二Fc结构域亚基的N端融合。
9.权利要求1至3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述第二Fab片段、所述第三Fab片段和所述Fc结构域是免疫球蛋白分子的部分。
10.权利要求9的双特异性抗原结合分子,其中所述免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白分子。
11.权利要求9的双特异性抗原结合分子,其中所述免疫球蛋白分子是IgG1或IgG4亚类免疫球蛋白分子。
12.权利要求9的双特异性抗原结合分子,其中所述免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。
13.权利要求1至3中任一项的双特异性抗原结合分子,其由特异性结合所述第一抗原的第一Fab片段、特异性结合所述第二抗原的免疫球蛋白分子和一个或多个肽接头组成。
14.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中仅在所述第一Fab片段中进行取代。
15.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述Fc结构域包含促进所述第一和第二Fc结构域亚基的结合的修饰。
16.权利要求15的双特异性抗原结合分子,其中用具有更大侧链体积的氨基酸残基取代所述Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基,从而在所述第一亚基的CH3结构域内产生可定位在所述第二亚基的CH3结构域内的凹陷中的凸起,并用具有更小侧链体积的氨基酸残基取代所述Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基,从而在所述第二亚基的CH3结构域内产生所述第一亚基的CH3结构域内的凸起可定位在其中的凹陷。
17.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述Fc结构域是IgG Fc结构域。
18.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述Fc结构域是IgG1结构域或IgG4Fc结构域。
19.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中所述Fc结构域是人的Fc结构域。
20.权利要求1-3中任一项的双特异性抗原结合分子,其中将所述Fc结构域改造为与未改造的Fc结构域相比,具有改变的与Fc受体的结合亲和力和/或改变的效应子功能。
21.分离的多核苷酸,其编码权利要求1至20中任一项的双特异性抗原结合分子或其片段。
22.表达载体,其包含权利要求21的分离的多核苷酸。
23.宿主细胞,其包含权利要求21的分离的多核苷酸或权利要求22的表达载体。
24.用于产生权利要求1至20中任一项的双特异性抗原结合分子的方法,其包括步骤a)在适于表达所述双特异性抗原结合分子的条件下培养权利要求23的宿主细胞和b)回收所述双特异性抗原结合分子。
25.药物组合物,其包含权利要求1至20中任一项的双特异性抗原结合分子和可药用载体。
26.权利要求1至20中任一项的双特异性抗原结合分子或权利要求25的药物组合物,其用作药物。
27.权利要求1至20中任一项的双特异性抗原结合分子或权利要求25的药物组合物,其用于在有需要的个体中治疗疾病。
28.权利要求27的双特异性抗原结合分子或药物组合物,其中所述疾病是癌症。
29.权利要求1至20中任一项的双特异性抗原结合分子在制备用于在有需要的个体中治疗疾病的药物中的用途。
30.权利要求29的用途,其中所述疾病是癌症。
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