CN112646035A - Egfr的亲和力成熟结合蛋白及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人EGFR的亲和力成熟结合蛋白及应用。该亲和力成熟结合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白；或是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的aEG12E2亲和力成熟结合蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的aEG13E8亲和力成熟结合蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白中的至少一种与aEG22C4亲和力成熟结合蛋白组合形成的结合蛋白。该亲和力成熟结合蛋白具有高亲和力、高特异性和低免疫原性，并且具有较好的稳定性，结构简单，易于进行工程化改造等优点，可更好地应用于结合蛋白药物的开发。

Description

EGFR的亲和力成熟结合蛋白及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人EGFR的亲和力成熟结合蛋白及应用。

背景技术

癌症这一名词在公元前400多年就被提出，经过2000多年依然没有被攻克，如今对人类健康的威胁愈加明显。近年来，研究发现表皮生长因子(EGFR)在多种实体瘤细胞中过表达，并在癌症的发生、发展过程中发挥重要的作用。EGFR过表达与多种癌症预后差和耐药性正相关。EGFR在癌细胞中过表达导致EGFR/EGF信号通路的持续性激活，从而促进癌细胞的增殖、迁移及侵袭活动，还可以促进VEGF因子的分泌，诱导癌组织微环境血管形成。目前，靶向EGFR的单克隆抗体在非小细胞肺癌的临床治疗取得了较好的效果，但由于是嵌合型抗体，所以存在一定的免疫源性，并且由于其分子量大渗透能力差，不能有效清除微小病灶。

亲和力成熟结合蛋白是一种只含有单个结构域的基因工程抗体，能够以高亲和力和特异性与抗原结合。亲和力成熟结合蛋白由于其分子量小，便于在大肠杆菌中表达，大大降低了生产的成本。同时，亲和力成熟结合蛋白结构简单，具有较高的组织渗透能力，也利于对其进一步改造。因此，抗EGFR亲和力成熟结合蛋白在EGFR靶向的癌症治疗中，具有很高的医学应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗人EGFR的亲和力成熟结合蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述抗人EGFR的亲和力成熟结合蛋白的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人EGFR的亲和力成熟结合蛋白，是aEG22C4亲和力成熟结合蛋白；或是aEG12E2亲和力成熟结合蛋白、aEG13E8亲和力成熟结合蛋白和aEG11A6亲和力成熟结合蛋白中的至少一种与aEG22C4亲和力成熟结合蛋白组合形成的结合蛋白；

所述的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

编码上述抗人EGFR的亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列，是编码所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列；或是编码所述的aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种与编码所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列组合形成的核苷酸序列。

编码所述的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:8所示。

编码所述的aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:9所示。

编码所述的aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:10所示。

编码所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:11所示。

aEG11A6：

MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDMLIPDNMSWVRQAPGKGLEWVSTIHKTNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALRSRGLSSKYEYWGQGTLVTVSSAAA；

aEG12E2：

MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDMLIPDNMSWVRQAPGKGLEWVSTIHKTNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGLRSRGLSSKYYCGQGTLVTVSSAAA；

aEG13E8：

MAQVQLLEAGGGLIQPGGSLRLSCAASGDMLIPDNMSWVRQAPGKGLEWVSTIHKTHGSTYYADSVKGRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGLRSRGLSSKYYWGQGTLVTVSSAAA；

aEG22C4：

MAQVQLLESGGGLVEPGGSLSLSCAASGDMLSPDNMTWVRQAPGKGLEWVSTIHKTDGSTYYADSVKGRFTISRENSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGLRSRGLSSKYLEYWGQGTPVTVSSAAA；

编码aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列：

ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGATATGCTTATCCCTGACAATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAACCATTCATAAGACTAACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGTTGCGTAGTAGGGGGCTTAGTTCGAAGTATGAGTATTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCA；

编码aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列：

ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGATATGCTTATCCCTGACAATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAACCATTCATAAGACTAACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGGGATTGCGTAGTAGGGGGCTTAGTTCGAAGTACTATTGTGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCA；

编码aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列：

ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGGCTGGGGGAGGCTTGATACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGATATGCTTATCCCTGACAATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTAGAGTGGGTATCAACCATTCATAAGACTCACGGGAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGGTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGGGATTGCGTAGTAGGGGGCTTAGTTCGAAGTACTATTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCA；

编码aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列：

ATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAGAGCCTGGGGGGTCCCTGAGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGAGATATGCTTAGCCCTGACAATATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTATCAACCATTCATAAGACTGACGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGAGAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGCGGGATTGCGTAGTAGGGGGCTTAGTTCGAAGTACCTGGAGTATTGGGGTCAGGGAACCCCGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCA。

编码所述的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白、aEG12E2亲和力成熟结合蛋白、aEG13E8亲和力成熟结合蛋白和aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列分别由375、375、375和381个碱基组成，对应编码的氨基酸分别为125、125、125和127个。

aEG11A6亲和力成熟结合蛋白含有3个互补决定簇，其中，编码CDR1的氨基酸为DMLIPDNMS，编码CDR2的氨基酸为TIHKTN，编码CDR3的氨基酸为LRSRGLSSKYEY。aEG12E2亲和力成熟结合蛋白含有3个互补决定簇，其中，编码CDR1的氨基酸为DMLIPDNMS，编码CDR2的氨基酸为TIHKTN，编码CDR3的氨基酸为GLRSRGLSSKYY。aEG13E8亲和力成熟结合蛋白含有3个互补决定簇，其中，编码CDR1的氨基酸为DMLIPDNMS，编码CDR2的氨基酸为TIHKTH，编码CDR3的氨基酸为GLRSRGLSSKYY。aEG22C4亲和力成熟结合蛋白含有3个互补决定簇，其中，编码CDR1的氨基酸为DMLSPDNMT，编码CDR2的氨基酸为TIHKTD，编码CDR3的氨基酸为GLRSRGLSSKYLEY。

aEG11A6亲和力成熟结合蛋白含有4个骨架区：编码FR1的氨基酸为MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG，编码FR2的氨基酸为WVRQAPGKGLEWVS，编码FR3的氨基酸为

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA，编码FR4的氨基酸为WGQGTLVTVSSAAA。aEG12E2亲和力成熟结合蛋白含有4个骨架区：编码FR1的氨基酸为MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG，编码FR2的氨基酸为WVRQAPGKGLEWVS，编码FR3的氨基酸为GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA，编码FR4的氨基酸为CGQGTLVTVSSAAA。aEG13E8亲和力成熟结合蛋白含有4个骨架区：编码FR1的氨基酸为MAQVQLLEAGGGLIQPGGSLRLSCAASG，编码FR2的氨基酸为WVRQAPGKGLEWVS，编码FR3的氨基酸为GSTYYADSVKGRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA，编码FR4的氨基酸为WGQGTLVTVSSAAA。aEG22C4亲和力成熟结合蛋白含有4个骨架区：编码FR1的氨基酸为MAQVQLLESGGGLVEPGGSLSLSCAASG，编码FR2的氨基酸为WVRQAPGKGLEWVS，编码FR3的氨基酸为GSTYYADSVKGRFTISRENSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA，编码FR4的氨基酸为WGQGTPVTVSSAAA。

所述的抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：通过基因(DNA)合成的方法合成编码所述抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白的核苷酸，然后将其克隆到表达质粒载体上，转化至宿主细胞中进行表达、纯化，得到抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白；也可以通过多肽合成的方法，直接合成得到抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白。

所述的抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征的疾病的结合蛋白药物中的应用。

所述的EGFR过表达为特征的疾病为自身免疫病和/或癌症。

所述的癌症为EGFR高表达肿瘤。

所述的EGFR高表达肿瘤包括胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌，头颈癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌，卵巢瘤，宫颈癌，子宫癌，肝癌，脾脏癌，肾脏癌和脑肿瘤。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明通过噬菌体展示的方法在人源亲和力成熟结合蛋白文库中筛选出的与EGFR胞外部分结构域(domain)III相互作用的亲和力成熟结合蛋白可在无需使用抗原免疫人体的情况下获得全人源单克隆亲和力成熟结合蛋白，其分子量约为13kDa，只含有单个结构域，具有高度亲和力、特异性和低度致人免疫性，并且，结合蛋白高表达的原核宿主进行结合蛋白表达，能显著降低结合蛋白的生产成本，促进结合蛋白的应用。

2.本发明提供的亲和力成熟结合蛋白，具有稳定性好、易于改造，具有较好的组织渗透能力等优点。

3.本发明提供的亲和力成熟结合蛋白是人源的，因而在人体无免疫原性，可更好地应用于抗肿瘤结合蛋白药物的开发。

4.本发明提供的亲和力成熟结合蛋白高表达的原核宿主进行结合蛋白表达，能显著降低结合蛋白的生产成本，促进结合蛋白的应用。

附图说明

图1为多克隆ELISA分析结合蛋白库的筛选富集结果图；其中，PBS孔为空白对照，CXCR4孔包被了合成的CXCR4多肽(作为无关抗原对照)，EpCAM孔包被了合成的EpCAM多肽(作为无关抗原对照)，EGFR孔包被了合成的EGFR多肽；一抗为各轮文库筛选后扩增纯化获得的多克隆噬菌体结合蛋白，二抗为HRP标记的抗噬菌体M13的抗体。结果表明：从第1轮至第5轮筛选抗体文库过程中，采用EGFR多肽筛选文库得到的OD450nm值逐轮升高，说明每轮采用EGFR多肽筛选得到的文库中EGFR抗体克隆的富集逐渐升高。

图2为单克隆噬菌体ELISA筛选与EGFR多肽结合的阳性克隆结果图；其中，A为32个单克隆噬菌体的ELISA结果图，每个单克隆包括：PBS(空白对照孔)，EpCAM多肽(无关抗原对照孔)，EGFR多肽(目的抗原孔)；B为筛选得到的5个结合蛋白的特异性检测结果图，每个单克隆包括：PBS(空白对照孔)，IFN蛋白(无关抗原对照孔)，NGF蛋白(无关抗原对照孔)，CD28蛋白(无关抗原对照孔)，CD31蛋白(无关抗原对照孔)，CSF1R蛋白(无关抗原对照孔)，ICAM-1蛋白(无关抗原对照孔)，EpCAM胞外段蛋白(无关抗原对照孔)，EGFR胞外段蛋白(目的抗原孔)，EGFR多肽(目的抗原孔)。图2B结果表明：与野生型结合蛋白aEG4D9相比，4种亲和力成熟结合蛋白与EGFR多肽具有较高的结合能力。

图3为亲和力成熟结合蛋白aEG11A6、aEG12E2、aEG13E8和aEG22C4表达纯化后的SDS-PAGE蛋白电泳图；泳道1是Marker，泳道2是未诱导的全蛋白，泳道3是诱导的全蛋白，泳道4是诱导的破碎沉淀，泳道5是诱导的破碎上清，泳道6是过柱液蛋白，泳道7是洗杂液蛋白，泳道8-12均为洗脱蛋白。

图4为采用ELISA方法检测纯化的抗EGFR亲和力成熟结合蛋白与EGFR多肽的结合情况图；其中，包括PBS(空白对照孔)，7个无关抗原对照孔：IFN蛋白、NGF蛋白、CD28蛋白、CD31蛋白、CSF1R蛋白、ICAM-1蛋白和EPCAM-His蛋白，2个目的抗原孔：EGFR-His蛋白和EGFR多肽。结果表明：与野生型结合蛋白aEG4D9相比，aEG22C4与EGFR多肽具有较高的结合能力，aEG11A6、aEG12E2和aEG13E8与EGFR多肽具有类似的结合能力。此外，4个亲和力成熟结合蛋白与无关抗原的结合并不明显，说明4个亲和力成熟结合蛋白能够特异性地与EpCAM结合。

图5为MTT法检测抗EGFR亲和力成熟结合蛋白对癌细胞增殖的影响结果图；其中，A是抗EGFR亲和力成熟结合蛋白对A549细胞增殖的影响结果图，B是抗EGFR亲和力成熟结合蛋白对DU145细胞增殖的影响结果图，C是抗EGFR亲和力成熟结合蛋白对MCF-7细胞增殖的影响结果图；aHER2-13C1和aVE201作为阴性对照结合蛋白；*：p<0.05相对于0μg/mL，**：p<0.01相对于0μg/mL，***：p<0.001相对于0μg/mL，****：p<0.0001相对于0μg/mL(n＝3)。结果表明：对于A549细胞，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，在使用25μg/mL浓度时，aEG12E2、aEG13E8和aEG22C4能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖。对于DU145细胞，与aEG4D9相比，4种亲和力成熟结合蛋白具有类似的抑制肿瘤细胞的增殖作用。对于MCF-7细胞，与aEG4D9相比，在使用25μg/mL浓度时，aEG11A6和aEG22C4能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖。

图6为流式细胞仪及Annexin V/PI双染色法检测抗EGFR亲和力成熟结合蛋白对癌细胞凋亡的影响结果图；其中，A、C、E分别是凋亡的A549、DU145和MCF-7细胞的二维散点图，B、D、F分别是从A、C、E得到的凋亡比例结果图；每种细胞包括无结合蛋白对照组(PBS)，实验结合蛋白组(50μg/mL)：aEG11A6、aEG12E2、aEG13E8和aEG22C4，野生型结合蛋白组(50μg/mL)：aEG4D9，阴性对照结合蛋白组(50μg/mL)：aHER2-13C1和aVE201；*：p<0.05相对于0μg/mL，**：p<0.01相对于0μg/mL，***：p<0.001相对于0μg/mL，****：p<0.0001相对于0μg/mL(n＝3)。结果表明：，对于A549细胞，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，4个亲和力成熟结合蛋白具有类似的诱导凋亡能力。对于DU145细胞，与aEG4D9相比，4个亲和力成熟结合蛋白具有较高的诱导凋亡能力。对于MCF-7细胞，与aEG4D9相比，aEG22C4具有较高的诱导凋亡能力。

图7为Transwell法检测结合蛋白对癌细胞迁移的影响结果图；其中，A、C、E分别是各浓度结合蛋白处理后的A549、DU145和MCF-7细胞迁移结果照片图；B、D、F分别是依据A、C、E得到的吸光值变化趋势图。结果表明：4个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白能够抑制A549、MCF-7和DU145细胞的迁移，随着4个亲和力成熟结合蛋白浓度升高，癌细胞的迁移能力能够逐步地降低。

图8为采用肺癌小鼠模型验证结合蛋白对肿瘤大小的抑制作用结果图；其中，A是给药后肿瘤的体积变化曲线图，B是给药周期结束时各组的肿瘤照片图，C是给药周期结束后各组的肿瘤重量统计图，D是给药周期结束后各组肿瘤的H&E染色和免疫组化染色结果图，E是根据D计算得到积分光密度结果；*：p<0.05相对于0μg/mL、**：p<0.01相对于0μg/mL，***：p<0.001相对于0μg/mL，****：p<0.0001相对于0μg/mL(n＝4，aEG4D9(n＝3))。结果表明：根据图8A肿瘤体积图，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白具有较好地抑制体内肿瘤细胞生长的能力。根据图8B肿瘤图，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白具有较小的肿瘤。根据图8C肿瘤重量图，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白具有较低的肿瘤重量。根据图8E免疫组化染色的积分光密度结果，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白能够较有效地在体内诱导肿瘤细胞凋亡(C-caspase-3)。2个亲和力成熟结合蛋白能够在体内抑制肿瘤细胞增殖(Ki67)，对肿瘤组织血管生成没有明显影响(CD31)。

具体实施例

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1构建亲和力成熟结合蛋白文库

(1)以野生型结合蛋白aEG4D9(具有如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列)为模板构建突变体文库。按照GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(GeneMorphII，Stratagene)说明书进行易错配PCR。通过易错配PCR扩增结合蛋白DNA并引入SfiI酶切位点，引物为errorF1(具有如SEQ ID NO：16所示核苷酸序列)和errorR1(具有如SEQ ID NO：17所示核苷酸序列)。

(2)上述PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化。

(3)分离正确的大小的条带后，按照

Gel Extraction Kit说明书操作胶回收。

(4)回收的DNA产物备用。

(5)分别向易错配PCR产物和pComb3XSS噬菌粒载体中加入SfiI酶，50℃消化过夜。

(6)将酶切后的易错配PCR产物和pComb3XSS噬菌粒载体经琼脂糖凝胶电泳纯化。

(7)按照

Gel Extraction Kit说明书操作回收正确大小的酶切后易错配PCR产物和酶切后pComb3XSS噬菌粒载体。

(8)用T4酶将酶切后的易错配PCR产物连接入pComb3XSS载体。

(9)将连接产物转化到电转感受态细菌中。

(10)完成电转后，将电转感受态细菌迅速转移到SOC培养基中，37℃培养1h。

(11)将转化的细菌接种到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。

(12)随机挑选培养基上的单克隆，通过菌落PCR和DNA测序来确认文库是否构建成功。

(13)克隆计数法计算文库大小。

实施例2制备辅助噬菌体

(1)从-80℃冰箱中取出甘油保存的TG1大肠杆菌克隆菌株，采用四区划线的方法涂布到不含抗生素的TYE平板上，37℃倒置过夜培养。

(2)从平板上挑取一个TG1单克隆菌株接种到5mL的2×TY(不含抗生素)液体培养基中，37℃、230rpm过夜培养。

(3)将TG1菌液以体积比1:100转接到5mL的2×TY不含抗生素的体培养基中，37℃、230rpm培养2h(菌液OD₆₀₀＝0.5左右)。

(4)取200μL TG1菌液(OD₆₀₀＝0.5左右)到1.5mL离心管中，加入10μLKM13辅助噬菌体(1×10¹³pfu/mL)，放入预热的37℃水中温浴30min。

(5)配制软琼脂，使其冷却到40℃左右后，将步骤(4)处理的TG1菌液倒入，混合，再倒入预先配好的含50μg/mL卡那霉素抗性的TYE固体培养平板上，室温静置使其凝固，37℃倒置培养13h。

(6)挑取一个空斑，放入5mLTG1菌液(OD₆₀₀＝0.5)中，37℃、230rpm摇床培养2h。

(7)将步骤(6)得到的菌液全部转接到500mL2×TY培养基中，37℃、230rpm摇床培养2h，再加卡那霉素500μL(在培养基中的浓度为50μg/mL)，30℃、230rpm培养20h。

(8)将菌液于3300g离心20min，收集上清到一个无菌管中，用浓度为20％(w/v)的PEG/NaCl溶液按体积比1:4的比例和上清混匀，冰上放置4h。

(9)然后于3300g离心30min，收集沉淀，用1mL无菌PBS(pH＝7.4、0.01M)溶液重悬沉淀，4000g离心5min，收集上清，即为辅助噬菌体。

实施例3亲和力成熟结合蛋白文库的扩增

(1)在冰上解冻5mL含有结合蛋白文库的细菌，转接到500mLLB液体培养基(含有质量体积比0.1％的氨苄青霉素和质量体积比1％的葡萄糖)中，37℃摇床培养2.5h。

(2)加入数量为2×10¹²pfu辅助噬菌体KM13，37℃培养30min。

(3)3200g离心10min，弃去上清。

(4)用新鲜的LB液体培养基(含有质量体积比0.1％的氨苄青霉素和质量体积比1％的葡萄糖)重悬。25℃摇床培养20h。

(5)3200g离心20min，收集上清。

(6)加入浓度为20％(w/v)的PEG/NaCl溶液沉淀溶液中的噬菌体，置于冰上4h。

(7)3200g离心30min，收集噬菌体沉淀。

(8)无菌PBS重悬得到的噬菌体沉淀。

(9)制备好的库噬菌体保存在-80℃。

(10)测结合蛋白库滴度。使用克隆技术法估计，将噬菌体稀释到一定浓度后，侵染对数生长期的TG1大肠杆菌。将侵染后的TG1菌涂布到含氨苄青霉素的固体平板上，37℃过夜培养，通过克隆的数目推算结合蛋白库的滴度。扩增出的结合蛋白库滴度为2.1×10¹³pfu/mL。

实施例4从亲和力成熟结合蛋白文库中筛选抗EGFR片段的亲和力成熟结合蛋白

(1)抗EGFR亲和力成熟结合蛋白噬菌体的筛选

1)将EGFR多肽(购自上海波泰生物公司，具有如SEQ ID NO：15所示氨基酸序列)加入免疫管(Nunc)中，另一支免疫管中加入等体积PBS(对照)，4℃过夜包被。

2)弃去所有溶液，用PBS洗涤免疫管。

3)向免疫管中加入浓度为2％(w/v)的BSA溶液，室温放置2h，封闭免疫管。

4)弃去所有溶液，PBS洗涤免疫管。

5)向免疫管中加入5×10¹²PFU噬菌体，室温放置1h。

6)弃去所有溶液，PBST洗涤免疫管，洗去未结合的噬菌体。

7)向免疫管中加入500μL 1mg/mL胰酶溶液，室温翻转10min，收集噬菌体洗脱液。

8)取收集到的125μL噬菌体洗脱液加入到875μL TG1大肠杆菌菌液中混匀，37℃培养30min。

9)将菌液以合适稀释倍数涂布到TYE固体培养基(含有质量体积比0.1％的氨苄青霉素和质量体积比1％的葡萄糖)上，计算筛选结果。

10)将步骤9)中剩余的菌液全部涂布到另1个TYE固体培养基(含有质量体积比0.1％的氨苄青霉素和质量体积比1％的葡萄糖)上，37℃过夜培养。

11)加入2mL 2×TY(其中含有15％v/v甘油)培养基到步骤10)中的固体培养基上，将全部细菌刮下收集。

12)将步骤11)中得到的50μL菌液接种到50mL新鲜2×TY液体培养基(含有质量体积比0.1％的氨苄青霉素和质量体积比1％的葡萄糖)，37℃摇床培养2h。

13)3000g离心15min，弃去上清，用2×TY液体培养基(含有0.1％w/v葡萄糖、0.1％w/v氨苄青霉素、0.05％w/v卡那霉素)，重悬菌体沉淀，25℃、230rpm震荡培养20h。

14)3000g离心20min，取上清40mL倒入无菌的50mL离心管中，再向离心管中加10mL浓度为20％(w/v)的PEG/NaCl溶液，上下颠倒混匀，冰浴4h。

15)4h后，4℃、4000g离心30min，倒掉上清。加入1mL PBS重悬沉淀，转到1.5mL离心管，再次4℃、10000g离心10min，收集上清，4℃保存。

16)5轮富集过程，重复上述步骤1)～15)的步骤。依次从上一轮的到的噬菌体中进行筛选。

(2)多克隆噬菌体ELISA

1)向96孔板中加入0.2μg/孔EGFR多肽，同时设置空白对照孔(PBS)、CXCR4多肽(购自上海波泰生物公司)无关抗原对照孔和EpCAM多肽(购自上海波泰生物公司)无关抗原对照孔。

2)弃去所有溶液，PBS洗涤。

3)加入浓度为2％(w/v)的BSA溶液，室温放置封闭2h。

4)弃去所有溶液，PBS洗涤。

5)分别将实施例4第(1)部分步骤16)中得到的5轮筛选富集的噬菌体加入96孔板，每轮噬菌体溶液与2％(w/v)BSA封闭液以体积1:3比例混匀，每个孔含有100μL混合液，室温放置孵育1h。

6)弃去所有溶液，PBST洗涤。

7)每孔加入100μL M13-HRP(HRP标记的M13噬菌体鼠单抗，用2％(w/v)BSA封闭液以体积比1:10000稀释)，室温放置孵育1h。

8)弃去所有液体，PBST洗涤。

9)每孔加入TMB溶液(碧云天，P0209)进行显色，室温避光放置5min。

10)每孔加入50μL浓度为1M的稀硫酸终止反应。

11)在酶标仪上测定OD450nm吸光值。

12)图1为多克隆ELISA分析结合蛋白库的筛选富集结果图。图1结果表明：从第1轮至第5轮筛选抗体文库过程中，采用EGFR多肽筛选文库得到的OD450nm值逐轮升高，说明每轮采用EGFR多肽筛选得到的文库中EGFR抗体克隆的富集逐渐升高。

实施例5从第5轮富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行ELISA验证

(1)稀释第5轮筛选得到的噬菌体。

(2)取100μL稀释液感染对数生长期的TG1菌液涂板，从板中随机挑选992个单克隆菌株分别置于96孔培养板中培养，每孔200μL2×TY培养基和一个克隆，37℃、230rpm摇床过夜培养。

(3)每孔吸取5μL到一个新的96孔板中培养，每孔加入200μL新鲜的2×TY培养基，37℃摇床培养2h。

(4)旧板中每孔保留100μL菌液，再加入100μL浓度为30％(v/v)的甘油，-80℃保存备用。

(5)将菌液转移到1个1.5mL离心管，培养2h。

(6)向离心管中加入50μL含辅助噬菌体的2×TY培养基，混匀，置于37℃水浴30min。

(7)3000g离心10min，弃掉上清，用200μL2×TY培养基(含0.1％w/v葡萄糖、0.1％w/v氨苄青霉素、0.05％w/v卡那霉素)重悬菌体沉淀，将每管的菌液加入到一个新的96孔板，25℃、250rpm震荡培养20h。

(8)3000g离心10min，将每一孔上清分别收集到一个1.5mL离心管中，4℃暂存备用。

(9)取EGFR多肽包被96孔免疫板(每孔含有0.2μg EGFR多肽)，包被液为100μL/孔，同时设置空白对照孔(PBS)和EpCAM多肽无关抗原对照孔，4℃过夜包被。

(10)剩余步骤按实施例4第(2)部分步骤2)-11)进行。

(11)图2A为其中32个单克隆噬菌体的ELISA结果。

(12)将步骤(11)中得到的阳性克隆，按照步骤(3)-(10)采用多个无关抗原验证阳性噬菌体特异性，仅将步骤(9)中抗原改为IFN蛋白、NGF蛋白、CD28蛋白、CD31蛋白、CSF1R蛋白、ICAM-1蛋白、EpCAM胞外段蛋白、EGFR胞外段蛋白、EGFR片段(以上蛋白均从北京义翘神州科技股份有限公司购买，EGFR片段由上海波泰生物公司合成)，结果如图2B所示。将特异性较好的阳性克隆送华大基因公司进行DNA测序。在NCBI OFR中对测序的DNA结果进行分析，排除相同的核苷酸序列。最终得到4个不同的DNA序列，分别命名为aEG11A6、aEG12E2、aEG13E8及aEG22C4。图2B结果表明：与野生型结合蛋白aEG4D9相比，4种亲和力成熟结合蛋白与EGFR多肽具有较高的结合能力。

实施例6获得野生型结合蛋白和阴性对照结合蛋白

本实验室前期实验通过噬菌体展示技术，采用人表皮生长因子受体2(Her2)和血管内皮生长因子(VEGF)合成多肽为抗原，采用以上方法筛选人源结合蛋白噬菌体文库，通过ELISA挑选2个不与对应抗原结合的克隆，分别获得阴性对照结合蛋白aHER2-13C1和aVE201。

实验例中作为野生型结合蛋白aEG4D9具有如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列。编码所述的aEG4D9的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。实验例中作为阴性对照的结合蛋白aHER2-13C1(以Her2为抗原)和aVE201(以VEGF为抗原)分别具有如SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示氨基酸序列。编码所述的aHER2-13C12和aVE201的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。

实施例7表达抗EGFR的亲和力成熟结合蛋白的原核表达及纯化

(1)BL21感受态细胞制备

1)从冰箱中小心取出E.coil BL21(DE3)感受态细菌，放在冰上解冻。

2)用接种环蘸取菌液，在LB固体培养基上进行平板划线。将培养基放在37℃培养箱中，倒置过夜培养。

3)次日，挑取单个菌落接种到5mL新鲜LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床中过夜培养。

4)取500μL步骤3)过夜培养得到的菌液加入50mL新鲜LB液体培养基，37℃、220rpm摇床震荡培养至OD600＝0.5。

5)将步骤4)得到的菌液4℃、3200g离心5min后，弃去上清。

6)将菌体沉淀按照超级感受态细胞制备试剂盒(上海生工生物科技有限公司)说明书操作，得到感受态细菌。

(2)亲和力成熟结合蛋白重组载体构建

将编码抗EGFR亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列送到苏州金唯智生物科技有限公司合成，并通过5`NcoI和3`NotI克隆入表达载体pET22b中，并将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中进行筛选，得到结合蛋白质粒。

(3)亲和力成熟结合蛋白重组载体转化感受态细胞

1)从冰箱中小心取出E.coil BL21(DE3)感受态细菌，放在冰上解冻。

2)取1μL结合蛋白质粒加入到100μLE.coil BL21(DE3)感受态细菌菌液中，并用手指轻弹EP管帮助感受态细菌和质粒混匀，继续在冰上放置30min。

3)将EP管置于42℃水浴2min。

4)将EP管迅速转移到冰上，放置2min。

5)向EP管中加入900μL新鲜LB液体培养基，37℃、200rpm培养1h。

6)将EP管10000g离心1min后，弃去950μL上清。

7)将菌体沉淀重悬后，涂布到LB固体培养基(含有100μg/mL氨苄西林)上。在37℃培养箱中，倒置过夜培养。

(4)亲和力成熟结合蛋白的原核表达及纯化

1)挑取含有重组表达质粒载体的BL21(DE3)单克隆接种至5mL含1％(w/v)葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、230rpm摇床过夜培养。

2)将4mL菌液接种到400mL新鲜LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄西林)，在37℃培养箱中，培养约2.5h。

3)向菌液中加入IPTG(终浓度为0.5mM)，在25℃培养箱中继续震荡培养约6h。

4)将菌液5000g、4℃离心5min，弃去上清。

5)将菌体用超声波破碎仪进行破碎，仪器设定为：功率40％、保护温度10℃、时长40min、工作4s，停8s。

6)将破碎的菌液，13000g、4℃离心30min。转移上清用于亲和力成熟结合蛋白纯化。

7)向Ni-NTA纯化柱中加入10mL超纯水清洗柱体。

8)再加入10mL破菌缓冲液平衡柱子。

9)将上述破碎菌液上清加入Ni-NTA纯化柱。

10)向Ni-NTA纯化柱中加入20mL洗杂缓冲液，洗去杂蛋白。

11)向Ni-NTA纯化柱中加入10mL洗脱缓冲液，收集洗脱下的目的蛋白。

12)将含有目的蛋白的溶液转移到透析袋中。

13)将透析袋小心密封，放入PBS溶液中，4℃低速搅拌24h。

14)将透析后的蛋白溶液放入超滤管中，4000g、4℃离心40min浓缩蛋白。

15)浓缩后的蛋白放到-80℃冰箱保存备用。

16)测定抗EGFR亲和力成熟结合蛋白的浓度，将蛋白溶液用PBS调整为2mg/mL用以后续实验。

17)图3为亲和力成熟结合蛋白表达纯化后SDS-PAGE蛋白电泳图。

(5)采用ELISA方法检测纯化的抗EGFR亲和力成熟结合蛋白与EGFR多肽的结合。

1)分别取0.2μg IFN蛋白、NGF蛋白、CD28蛋白、CD31蛋白、CSF1R蛋白、ICAM-1蛋白、EpCAM蛋白、EGFR蛋白、EGFR片段(以上蛋白均由北京义翘神州科技股份有限公司提供，片段由上海波泰生物公司提供)包被96孔免疫板，包被液体积为100μL/孔，同时设置空白对照孔(PBS)，4℃过夜包被。

2)其余步骤按照实施例4中多克隆噬菌体ELISA过程中的步骤2)-11)，仅将步骤7)中HRP标记的抗噬菌体M13抗体替换为proteinA-HRP蛋白(按体积比1:5000稀释)，结果如图4所示。结果表明：与野生型结合蛋白aEG4D9相比，aEG22C4与EGFR多肽具有较高的结合能力，aEG11A6、aEG12E2和aEG13E8与EGFR多肽具有类似的结合能力。此外，4个亲和力成熟结合蛋白与无关抗原的结合并不明显，说明4个亲和力成熟结合蛋白能够特异性地与EpCAM结合。

实验例8亲和力成熟结合蛋白对A549、DU145和MCF-7细胞增殖的作用

(1)收集处于对数生长期的细胞，用含有10％(v/v)FBS的DMEM培养基将细胞浓度调整为50000个/mL。

(2)分别向96孔板中加入100μL/孔的细胞悬液。5％CO₂、37℃细胞培养箱培养12h。

(3)弃去所有培养液，每孔加入100μL/孔含有1％(v/v)FBS的DMEM培养基，37℃细胞培养箱培养6h。

(4)每孔加入对应浓度的抗EGFR亲和力成熟结合蛋白、野生型结合蛋白(aEG4D9)或阴性对照结合蛋白(aHER2-13C1或aVE201)。每个抗体设置4个浓度：0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL及100μg/mL。

(5)将96孔板放入37℃细胞培养箱继续培养72h。

(6)弃去所有培养液，每孔加入100μL培养基和20μL的MTT溶液，37℃细胞培养箱继续培养4h。

(7)弃去所有培养液，每孔加入150μL的DMSO，将培养板置于脱色摇床孵育10min。

(8)在酶标仪测定OD570nm的吸光值。

图5结果表明：对于A549细胞，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，在使用25μg/mL浓度时，aEG12E2、aEG13E8和aEG22C4能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖。对于DU145细胞，与aEG4D9相比，4种亲和力成熟结合蛋白具有类似的抑制肿瘤细胞的增殖作用。对于MCF-7细胞，与aEG4D9相比，在使用25μg/mL浓度时，aEG11A6和aEG22C4能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖。

实验例9亲和力成熟结合蛋白对A549、DU145和MCF-7细胞凋亡的作用

(1)收集处于对数生长期的细胞。用含有10％(v/v)FBS的DMEM培养基调整细胞浓度为1.25×10⁵个/mL。

(2)向6孔培养板中加入2mL/孔的细胞悬液，将6孔板置于37℃细胞培养箱12h。

(3)弃去所有培养液，每孔加入含有1％(v/v)FBS的DMEM培养基，将6孔板置于37℃细胞培养箱6h。

(4)每孔加入2mL浓度为50μg/mL的抗EGFR亲和力成熟结合蛋白、野生型结合蛋白(aEG4D9)或阴性对照结合蛋白。

(5)将6孔板放置于37℃细胞培养箱48h。

(6)弃去所有培养液，胰酶消化后收集细胞。

(7)按照凋亡(Annexin V/PI双染色法试剂盒，上海生工生物工程股份有限公司)检测试剂盒说明书操作。

(8)使用流式细胞分析仪检测细胞凋亡。

结果如图6所示：图A、C、E分别是凋亡的A549、DU145和MCF-7细胞二维散点图，可以看出图中凋亡细胞比无结合蛋白对照和阴性对照结合蛋白均有增多(右半边)；图B、D、F分别是从图A、C、E得到的凋亡比例。图6结果表明：对于A549细胞，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，4个亲和力成熟结合蛋白具有类似的诱导凋亡能力。对于DU145细胞，与aEG4D9相比，4个亲和力成熟结合蛋白具有较高的诱导凋亡能力。对于MCF-7细胞，与aEG4D9相比，aEG22C4具有较高的诱导凋亡能力。

实验例10亲和力成熟结合蛋白对A549、DU145和MCF-7细胞迁移的作用

(1)将Transwell小室放入24孔细胞培养板。

(2)弃去细胞培养液，加入新鲜的含有1％(v/v)FBS的DMEM培养基，37℃细胞培养箱培养6h。

(3)胰酶消化收集细胞，用含有1％(v/v)FBS的DMEM培养基将细胞浓度调整为5×10⁵个/mL。

(4)向每个小室上层加入100μL细胞悬液和对应浓度的抗EGFR亲和力成熟结合蛋白、野生型结合蛋白(aEG4D9)或阴性对照结合蛋白。

(5)向小室下层加入含有20％(v/v)FBS的DMEM培养基。

(6)将24孔细胞培养板放在37℃细胞培养箱培养24h。

(7)弃去小室上层的培养基，棉签擦去小室上层的细胞。

(8)小室下层加入4％(w/v)多聚甲醛溶液，放置固定15min。

(9)弃去4％(w/v)多聚甲醛溶液。

(10)小室下层加入2％(w/v)结晶紫溶液，避光孵育30min。

(11)将小室放于载玻片上，显微镜拍照。

(12)小室下层加入33％乙酸溶液。在酶标仪测定OD570nm的吸光值。

图7结果表明：4个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白能够抑制A549、MCF-7和DU145细胞的迁移，随着4个亲和力成熟结合蛋白浓度升高，癌细胞的迁移能力能够逐步地降低。

实验例11亲和力成熟结合蛋白对小鼠肺癌模型的作用

(1)胰酶消化收集对数生长期的A549细胞。

(2)无菌PBS溶液洗涤细胞2次。

(3)细胞重悬于不含FBS的DMEM培养基中，密度调整为5×10⁷个/mL。

(4)选取4周龄雄性Balb/C裸鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)，用一次性注射器吸取100μL细胞悬液注射到小鼠右侧腋下。

(5)每3天测定一次小鼠肿瘤体积，小鼠肿瘤体积(mm³)＝a×b²×0.5。

(6)当小鼠肿瘤体积平均值约为100mm³后，将小鼠随机分为6组，每组5只。分别注射对应药物，包括PBS、阴性对照结合蛋白(aHER2-13C1)、野生型结合蛋白(aEG4D9)、抗EGFR亲和力成熟结合蛋白(aEG11A6或aEG22C4)或顺铂(DDP)。注射时通过胰岛素针经尾静脉给药。注射体积均为100μL，每3天给药一次。

(7)实验结束后，脱颈处死小鼠。剥离肿瘤组织后拍照，并测量肿瘤重量。

(8)将肿瘤组织浸泡于4％(w/v)多聚甲醛固定。

(9)将肿瘤组织转移到梯度乙醇(50％、70％、85％、95％、100％)进行脱水。

(10)将肿瘤组织置于二甲苯-乙醇(体积比1:1)中浸泡2h。

(11)将肿瘤组织置于二甲苯中浸泡1h。

(12)将肿瘤组织置于石蜡中包埋。

(13)切片机上将包埋肿瘤组织的石蜡切成6μm厚度。

(14)将石蜡切片脱蜡。

(15)将切片置于苏木精染料5min。冲洗多余的染料。

(16)将切片置于分化液中30s。

(17)将切片置于伊红染料1min。

(18)将切片置于梯度乙醇(70％、85％、95％、100％、100％)中脱水。

(19)滴加树胶封片。

(20)将步骤(14)得到的切片置于pH＝6.0的柠檬酸钠修复液中进行抗原修复。

(21)将切片置于双氧水中室温孵育。

(22)将切片置于封闭液，室温封闭10min。

(23)将切片置于一抗(Ki67、CD31或Caspase3)工作液，4℃过夜孵育。

(24)将切片置于二抗工作液，37℃孵育30min。

(25)将切片置于DAB显色液，室温孵育10min。

(26)加入苏木精衬染。

(27)脱水及封片步骤同步骤(18)-(19)。

(28)显微镜下拍照，通过Image pro plus软件分析。

图8结果表明：根据图8A肿瘤体积图，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白具有较好地抑制体内肿瘤细胞生长的能力。根据图8B肿瘤图，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白具有较小的肿瘤。根据图8C肿瘤重量图，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白具有较低的肿瘤重量。根据图8E免疫组化染色的积分光密度结果，与野生型结合蛋白aEG4D9相比，2个抗EGFR亲和力成熟结合蛋白能够较有效地在体内诱导肿瘤细胞凋亡(C-caspase-3)。2个亲和力成熟结合蛋白能够在体内抑制肿瘤细胞增殖(Ki67)，对肿瘤组织血管生成没有明显影响(CD31)。

实施例中所用到的试剂的配置方法如下：

(1)PBS/PBST(pH7.4)：KH₂PO₄0.24g、NaCl8g、KCl0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O9.07g。

称取上述试剂，加入900mL去离子水溶解，定容至1L。若要求无菌可121℃高温高压灭菌，4℃保存。

PBST：配制好的PBS缓冲液中加入终浓度为0.1％的吐温-20，充分混匀，121℃高温高压灭菌，4℃保存。

(2)TBS/TBST：Tris碱6.05g、NaCl21.93g。

将上述试剂用400mL去离子水溶解，用稀盐酸调pH至7.4，定容至500mL。

TBST：在500mL TBS缓冲液中加入500μL吐温-20，充分混匀。

(3)LB液体培养基：NaCl2g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、超纯水200mL。

将上述试剂充分混匀后，置于121℃高压灭菌，保存于4℃。

LB固体培养基：LB液体培养基配方中加入4g琼脂粉。

(4)20％葡萄糖：称取200g葡萄糖粉末，溶解于1L去离子水，使用0.22μM滤器过滤除菌，-4℃存储。

(5)100μg/mL氨苄青霉素溶液：称取1g粉末，溶解于10mL去离子水中配制成100mg/mL的溶液，使用0.22μM的滤器过滤除菌，分装成1mL每管，-20℃存储。

(6)SDS-PAGE电泳液：甘氨酸94g、Tris碱30.2g、SDS5g。

将试剂用900mL去离子水溶解，定容至1L。此试剂为5×电泳液配方，4℃保存。使用时用ddH₂O稀释成1×。

(7)SDS-PAGE转膜液：Tris碱15.14g、甘氨酸72g。

将试剂用900mL去离子水溶解，定容至1L，4℃保存。此试剂为5×电泳液配方，使用时用超纯水稀释成1×。

(8)500M IPTG：称取IPTG粉末11.915g，溶解于100mL去离子水，使用0.2μm滤器过滤除菌，分装成1mL每管，-20℃保存。

(9)1MH₂SO₄：在187mL去离子水中缓慢加入10mL浓硫酸。

(10)100×PMFS：称取1.74g PMSF，溶解于100mL异丙醇，-20℃保存。

(11)蛋白表达纯化缓冲液

破菌缓冲液：Tris碱2.42g、NaCl14.6g、100×PMSF10mL。

将上述试剂溶解于900mL超纯水，使用稀盐酸调节pH值到7.45，定容至1L，4℃保存。

上样缓冲液：同破菌缓冲液。

洗杂缓冲液：取上样缓冲液20mL，添加200μL咪唑母液(2M)。

洗脱缓冲液：取上样缓冲液9mL，添加1mL咪唑母液(2M)。

(12)2％BSA：在PBS缓冲液中加入2％的牛血清白蛋白粉末(w/v)。

(13)30％甘油溶液(甘油-PBS)：量取15mL丙三醇，加入35mLPBS缓冲液(PH＝7.4)，使用0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。

(14)10％过硫酸铵(APS)：硫酸铵0.5g、ddH₂O5mL。

将上述试剂充分混匀后，分装成500μL每管，-20℃保存。

(15)1M Tris-Hcl(PH＝8.8/PH＝6.8)：称取0.2g Tris-Base粉末，溶解于900mL去离子水中，使用稀盐酸调节pH值到6.8或8.8.定容至1L，高温高压灭菌，4℃保存。

(16)考马斯亮蓝染液：考马斯亮蓝R-2501g、异丙醇250mL、冰醋酸100mL、ddH₂O650mL。

(17)考马斯亮蓝染色脱色液：冰醋酸100mL、乙醇50mL、ddH₂O850mL。

(18)5×蛋白上样缓冲液(Loading buffer)：1M Tris-HCl _{PH 6.8}12.5mL、SDS5g、溴酚蓝0.25g、甘油25mL。

向上述试剂中加入ddH₂O，定容至50mL，室温保存。使用前取500μL，选择性加入25μL的β-巯基乙醇。

(19)TYE固体培养基(400mL)：蛋白胨5g、酵母粉2.5g、琼脂粉4g、ddH₂O400mL。

将上述试剂充分混匀后，121℃高温高压灭菌，待冷却至50℃时加入1％葡萄糖溶液和100μg/mL氨苄青霉素，混匀后倒平板，4℃冰箱保存。

(20)2×TY培养基(100mL)：蛋白胨1.6g、酵母粉1g、NaCl0.5g、ddH₂O100mL。

将上述试剂充分混匀后，121℃高温高压灭菌，4℃保存。

(21)20％PEG/NaCl溶液(500mL)：PEG600100g、NaCl73g、ddH₂O400mL。

去离子水溶解后，定容到500mL，121℃高温高压灭菌20min，常温保存。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> EGFR的亲和力成熟结合蛋白及应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<223> aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ile

20 25 30

Pro Asp Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Glu Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<223> aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ile

20 25 30

Pro Asp Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<223> aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 3

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ala Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ile

20 25 30

Pro Asp Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr His Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<223> aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser

20 25 30

Pro Asp Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<223> aEG4D9野生型结合蛋白的氨基酸序列

<400> 5

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser

20 25 30

Pro Asp Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<223> aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的氨基酸序列

<400> 6

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Val Ser

20 25 30

Ser Glu Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Phe Thr Ser Gly Gln Gly Ser Leu Arg Ser Asp Pro

100 105 110

Ile Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

115 120 125

Ala

<223> aVE201阴性对照结合蛋白的氨基酸序列

<400> 7

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Val Ser

20 25 30

Asn Glu Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Gln Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gln Arg Arg Arg Gln Met His Ser Tyr Lys Val

100 105 110

Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<223> 编码aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 8

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttatccctg acaatatgag ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactaa cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgttg 300

cgtagtaggg ggcttagttc gaagtatgag tattggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagcgcgg ccgca 375

<223> 编码aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 9

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttatccctg acaatatgag ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactaa cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac tattgtggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagcgcgg ccgca 375

<223> 编码aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 10

atggcccagg tgcagctgtt ggaggctggg ggaggcttga tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttatccctg acaatatgag ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggact agagtgggta tcaaccattc ataagactca cgggagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccgggtc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac tattggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagcgcgg ccgca 375

<223> 编码aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列

<400> 11

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tagagcctgg ggggtccctg 60

agtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgagaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccccggtc 360

accgtctcga gcgcggccgc a 381

<223> 编码aEG4D9野生型结合蛋白的核苷酸序列

<400> 12

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gcgcggccgc a 381

<223> 编码aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的核苷酸序列

<400> 13

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggatatagc gttagctctg agaatatggg ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaggcattt tggcgggaga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300

tttacgtcgg gtcaggggtc gttgcggtcc gaccccatcc ggtcttgggg tcagggaacc 360

ctggtcaccg tctcgagcgc ggccgca 387

<223> 编码aVE201阴性对照结合蛋白的核苷酸序列

<400> 14

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagttagc gttagcaatg aggctatggg ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaagcatta ctgaccaaag cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300

gggcagcgtc gtaggcagat gcattcgtac aaggtcagct cttggggtca gggaaccctg 360

gtcaccgtct cgagcgcggc cgca 384

<223> EGFR抗原的氨基酸序列

<400> 15

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

1 5 10 15

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser

20 25 30

<223> 引物errorF1

<400> 16

actggcccag gcggccatgg cccaggtgca gctg 34

<223> 引物errorR1

<400> 17

actggccggc ctggcctgcg gccgcgctcg agacg 35

Claims (8)

1.一种人EGFR的亲和力成熟结合蛋白，其特征在于：所述的人EGFR的亲和力成熟结合蛋白是aEG22C4亲和力成熟结合蛋白；或是aEG12E2亲和力成熟结合蛋白、aEG13E8亲和力成熟结合蛋白和aEG11A6亲和力成熟结合蛋白中的至少一种与aEG22C4亲和力成熟结合蛋白组合形成的结合蛋白；

所述的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.权利要求1所述的抗人EGFR的亲和力成熟结合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于：是编码所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列；或是编码所述的aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种与编码所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列组合形成的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的抗人EGFR的亲和力成熟结合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于：

编码所述的aEG11A6亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

编码所述的aEG12E2亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

编码所述的aEG13E8亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

编码所述的aEG22C4亲和力成熟结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

4.权利要求1所述的抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：通过基因合成的方法合成编码所述抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白的核苷酸，然后将其克隆到表达质粒载体上，转化至宿主细胞中进行表达、纯化，得到抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白；或是通过多肽合成的方法，直接合成得到抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白。

5.权利要求1所述的抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征的疾病的亲和力成熟结合蛋白药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征的疾病的结合蛋白药物中的应用，其特征在于：所述的EGFR过表达为特征的疾病包括自身免疫病和癌症。

7.根据权利要求6所述的抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征的疾病的结合蛋白药物中的应用，其特征在于：所述的癌症为EGFR高表达肿瘤。

8.根据权利要求7所述的抗人EGFR亲和力成熟结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征的疾病的结合蛋白药物中的应用，其特征在于：所述的EGFR高表达肿瘤包括胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌，头颈癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌，卵巢瘤，宫颈癌，子宫癌，肝癌，脾脏癌，肾脏癌和脑肿瘤。

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