CN113354715A

CN113354715A - Egfr的改造的结合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN113354715A
Application number: CN202110493512.6A
Authority: CN
Inventors: 魏星; 陈柔
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-05-07
Also published as: CN113354715B

Abstract

本发明公开了一种EGFR的改造的结合蛋白及其应用。该EGFR的改造的结合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的改造的结合蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的改造的结合蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的改造的结合蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的改造的结合蛋白中的至少一种。EGFR的改造的结合蛋白具有高度亲和力、特异性和低免疫原性，并且具有较好的稳定性，结构简单，易于进行大规模生产等优点，可更好地应用于结合蛋白药物的开发。

Description

EGFR的改造的结合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于结合蛋白领域，涉及一种EGFR的改造的结合蛋白及其应用。

背景技术

由于传统的癌症治疗方法存在脱靶、癌组织中药物浓度不足和严重的系统毒性甚至耐药性等缺点。为了解决这些问题，可以采用靶向治疗癌症，即使用结合蛋白特异性的靶向肿瘤细胞表面蛋白分子，从而抑制肿瘤细胞的活性。

EGFR是一种170kDa的跨膜蛋白，参与调节多种类型细胞的生长和分化。近年研究发现，EGFR在大多数人类恶性肿瘤中均过度表达，并与不良预后相关。异常过表达的EGFR被激活后，会导致其下游信号通路活化，从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管生成和抑制凋亡等作用。因此，EGFR成为癌症治疗的极好靶标。

本发明采用的EGFR结合蛋白对照是一种只含有单个结构域的基因工程抗体，分子量约为15kDa，具有良好的溶解性、高稳定性、良好的组织穿透性等优点，使其在诊断和靶向治疗肿瘤等方面有广阔的前景。但是，越来越多证据表明，由于EGFR信号传导途径活化的复杂机制，及其自主性和依赖性，因此有必要对结合蛋白进行改造来实现治疗过程中的协同效应。因此，对EGFR结合蛋白改造得到的改造的蛋白，拥有广阔的应用前景和具有极高的医学价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种EGFR的改造的结合蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述EGFR的改造的结合蛋白的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种EGFR的改造的结合蛋白，是名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白、名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白、名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白和名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白中的至少一种；

所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；

所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示；

所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

上述EGFR的改造的结合蛋白的编码核苷酸序列，是编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种核苷酸序列。

编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示。

编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示。

编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.11所示。

编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.12所示。

编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白、名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白、名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白和名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列分别由801、1884、807和1521个碱基组成，对应的氨基酸分别为267、628、269和507个。pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白含有1个EGFR结合蛋白对照aEG4D9、1个(G₄S)₃linker和1个EGFR结合蛋白对照aEG2E12。其中，aEG2E12结合蛋白对照的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，(G₄S)₃linker的氨基酸为GGGGSGGGGSGGGGS；aEG4D9结合蛋白对照的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE改造的结合蛋白含有1个EGFR结合蛋白对照aEG4D9、2个(G₄S)₃linker、1个EGFR结合蛋白对照aEG2E12和1个PE(氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示)。pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9改造的结合蛋白含有2个EGFR结合蛋白对照aEG4D9和1个(G₄S)₃linker。pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9改造的结合蛋白含有2个EGFR结合蛋白对照aEG4D9、1个anti-CD3单链抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示)和2个(G₄S)linker，(G₄S)linker的氨基酸为GGGGS。

上述4个EGFR的改造的结合蛋白中，aEG4D9结合蛋白对照的氨基酸序列都相同，aEG2E12结合蛋白对照的氨基酸序列也都相同。

所述的EGFR的改造的结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：通过基因(DNA)合成的方法合成所述的EGFR的改造的结合蛋白的编码核苷酸，然后分别将它们克隆到表达质粒载体上，转化或转染到原核或真核表达系统中进行表达、纯化，获得EGFR的改造的结合蛋白；也可以通过多肽合成的方法，直接合成得到EGFR的改造的结合蛋白。

所述的EGFR的改造的结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的结合蛋白药物中的应用。

所述的EGFR过表达为特征的疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。

所述的癌症为EGFR高表达肿瘤。

所述的EGFR高表达肿瘤具体可为肺癌、头颈癌、结肠癌及脑肿瘤。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明通过基因合成和分子克隆方法分别构建了4个含有EGFR的改造的结合蛋白的表达质粒。该改造的结合蛋白具有高度亲和力、特异性和低度致人免疫性；另外，该改造的结合蛋白可以在原核或真核宿主中进行高表达，能显著降低生产成本和促进改造的结合蛋白的应用。

2.本发明提供的EGFR的改造的结合蛋白，具有稳定性好、较高的亲和力，具有较好的组织渗透能力等优点。

3.本发明提供的EGFR的改造的结合蛋白是人源的，因而在人体无免疫原性，可更好地应用于抗肿瘤结合蛋白药物的开发。

4.本发明提供的EGFR的改造的结合蛋白可以在原核或真核宿主进行高表达，能显著降低生产成本，促进改造的结合蛋白的应用。

附图说明

图1是4个EGFR的改造的结合蛋白表达纯化后的SDS-PAGE图；其中，A-D分别代表pET22b-aEG2E12、pET22b-aEG4D9、pET22b-aEG4D9-aEG2E12和pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的电泳图，目标条带的位置用箭头标注；电泳图中的泳道从左到右分别为：M-蛋白质marker、1-未诱导菌体总蛋白、2-诱导菌体总蛋白、3-诱导后破碎菌体上清、4-诱导后破碎菌体沉淀、5-过柱液、6-洗杂液、7-11是洗脱液；E-G分别代表pcDNA3.1-aEG4D9、pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9和pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的电泳图，目标条带的位置用箭头标注；泳道从左到右分别为：M-蛋白质marker、1-未转染的细胞上清、2-转染的细胞上清、3-过柱液、4-洗杂液、5-9是洗脱液。结果表明，从SDS-PAGE电泳图可看出，在箭头指出的目的蛋白的位置，诱导后全蛋白比未诱导全蛋白目的条带颜色更深，说明改造的结合蛋白被成功诱导表达。每幅SDS-PAGE电泳图最后5条是经Ni-NTA His·Bind Resin纯化柱纯化后收集的目的蛋白洗脱液电泳条带，从图中可看出，目的条带单一且颜色较深，说明在过柱纯化时已将大部分杂蛋白洗掉，洗脱液中主要含有我们所需的目的蛋白。

图2是采用ELISA检测4个EGFR的改造的结合蛋白的抗原结合情况图；其中，*P<0.05相对于PBS，**P<0.01相对于PBS(n＝3)；##P<0.01(n＝3)，分别在Nunc MaxiSorb酶标板上包被PBS、7个无关抗原、EGFR胞外段和EGFR抗原片段。结果表明：4个EGFR的改造的结合蛋白均能特异性的与EGFR胞外段及其抗原片段结合。与对应EGFR结合蛋白对照(pET22b-aEG2E12和pET22b-aEG4D9)相比，pET22b-aEG4D9-aEG2E12对EGFR抗原片段的结合能力有显著提高；与对应EGFR结合蛋白对照(pcDNA3.1-aEG4D9)相比，pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9对EGFR抗原片段的结合能力也有显著提高。此外，4个改造的结合蛋白均与无关抗原没有结合能力。

图3是采用LDH检测2个EGFR的改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9和pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9)对细胞毒性作用的影响结果图；A～D是EGFR的改造的结合蛋白分别对A549、DU145、MCF-7和293T细胞毒性作用影响的结果图，pET22b-aHER2-13C1作为阴性对照结合蛋白，每孔均加入效应细胞PBMC；*P<0.05相对于pET22b-aHER2-13C1,**P<0.01相对于pET22b-aHER2-13C1,***P<0.001相对于pET22b-aHER2-13C1，****P<0.0001相对于pET22b-aHER2-13C1(n＝3)。##P<0.01相对于pcDNA3.1-aEG4D9,###P<0.001相对于pcDNA3.1-aEG4D9，####P<0.0001相对于pcDNA3.1-aEG4D9(n＝3)。+P<0.05相对于pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9,+++P<0.001相对于pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9，++++<0.0001相对于pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9(n＝3)。结果表明：在3个肿瘤细胞中，与阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1相比，随着2个EGFR的改造的结合蛋白浓度的增加，它们对肿瘤细胞毒性作用逐渐增强。在3种浓度下，与EGFR结合蛋白对照pcDNA3.1-aEG4D9相比，pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9对细胞毒性作用有显著增强。2个EGFR的改造的结合蛋白对正常细胞293T不会产生毒性作用。

图4是采用ELISA检测2个EGFR的改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9和pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9)对激活T细胞，使其释放IFN-γ和TNF-α细胞因子的影响结果图；其中，A是EGFR的改造的结合蛋白分别对A549、DU145，MCF-7和293T细胞作用后激活T细胞释放细胞因子IFN-γ的数据分析结果图，B是EGFR的改造的结合蛋白分别对A549、DU145，MCF-7和293T细胞作用后激活T细胞释放细胞因子TNF-α的数据分析结果图；pET22b-aHER2-13C1作为阴性对照结合蛋白，每孔均加入效应细胞PBMC，且使用100ng/mL的给药浓度；****P<0.0001相对于pET22b-aHER2-13C1(n＝3)。结果表明：在3个肿瘤细胞中，与阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1相比，pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9对细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ和TNF-α的含量有显著增加，并且它们的含量分别在350pg/mL左右和150pg/mL左右。EGFR结合蛋白对照pcDNA3.1-aEG4D9不能增加上清液中IFN-γ和TNF-α的含量。在正常细胞293T中，2个EGFR的改造的结合蛋白都不能激活T细胞释放细胞因子IFN-γ和TNF-α。

图5是采用MTT方法检测2个EGFR的改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9和pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9)对DU145细胞增殖的影响结果图；pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201作为阴性对照结合蛋白；*P<0.05相对于0μg/mL，**P<0.01相对于0μg/mL，***P<0.001相对于0μg/mL，****P<0.0001相对于0μg/ml(n＝3)；#P<0.05(n＝3)。结果表明：在DU145细胞中，与0μg/mL相比，2个EGFR的改造的结合蛋白能在3个浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)下对肿瘤细胞增殖有显著的抑制作用，并且随着浓度增加对细胞增殖的抑制作用越强。与100μg/mL pcDNA3.1-aEG4D9相比，pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9对细胞增殖有显著的抑制作用。

具体实施例

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1获得EGFR结合蛋白对照和4个EGFR的改造的结合蛋白质粒的构建

(1)本实验室前期已经通过人源非免疫文库筛选得到2个EGFR结合蛋白对照：pET22b-aEG2E12和pET22b-aEG4D9，EGFR结合蛋白对照pET22b-aEG2E12具有如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列，pET22b-aEG4D9具有如SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。编码pET22b-aEG2E12的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码pET22b-aEG4D9的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。并通过基因测序得到它们的全基因序列。本研究通过使用(G₄S)₃linker，将以上2个EGFR结合蛋白对照的基因序列连接在一起，合成出双价结合蛋白的全基因序列，并在此双价结合蛋白基因序列的3’端通过(G₄S)₃linker连接PE38，合成另一个EGFR的改造的结合蛋白的基因序列。由金唯智公司将以上2个EGFR的改造的结合蛋白的基因插入原核表达质粒pET22b中，从而构建出它们的表达质粒pET22b-aEG4D9-aEG2E12和pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE。

(2)本研究将前期获得的EGFR结合蛋白对照aEG4D9的基因序列；通过(G₄S)₃linker连接2个aEG4D9的基因序列，合成双价结合蛋白的全基因序列；和利用(G₄S)linker在双价结合蛋白的中间插入anti-CD3单链抗体，合成EGFR的改造的结合蛋白的全基因序列；由金唯智公司分别将这3个蛋白的基因序列插入到pcDNA3.1(+)/myc-his A质粒中，从而构建出它们的表达质粒，分别为：pcDNA3.1-aEG4D9、pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9和pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9。

实施例2获得阴性对照结合蛋白

本实验室前期实验通过噬菌体展示技术，采用人表皮生长因子受体2(Her2)和血管内皮生长因子(VEGF)合成多肽为抗原，采用以上方法筛选人源结合蛋白噬菌体文库，通过ELISA挑选2个不与对应抗原结合的克隆，分别获得阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201。

实施例中作为阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1(以Her2为抗原)和pET22b-aVE201(以VEGF为抗原)分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示氨基酸序列；编码pET22b-aHER2-13C1和pET22b-aVE201的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

实施例3 4个EGFR的改造的结合蛋白的表达和纯化

(1)原核表达质粒的抽提：按照质粒小量提取试剂盒的说明书进行操作。

(2)原核蛋白的表达和纯化

1)从-80℃中取出BL21(DE3)大肠杆菌感受态细菌，在冰上化冻。向感受态细菌中加入0.1μg构建好的表达质粒，手指轻弹EP管使它们混匀。置于冰上30min后，转入42℃水浴锅中水浴2min，立即转移到冰上，静置2min。在EP管中加入900μL的LB液体培养基，37℃、220rpm震荡培养1h。取出EP管，1000g离心1min，弃掉900μL的上清，将剩下的液体涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基中，并置于37℃培养箱中培养过夜。

2)用枪头挑取LB固体培养基中长出的1个单克隆，接种到含有氨苄青霉素的5mLLB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养过夜。

3)按照1:100的比例，取4mL的菌液接种到含有氨苄青霉素的400mL LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养2.5h，测定菌液的OD 600nm达到0.6即可。吸取1mL该菌液作为未诱导的样品。

4)将IPTG加入到菌液中，终浓度为0.5mM；25℃、220rpm震荡培养6h。吸取1mL该菌液作为诱导表达的样品。剩下的菌液4℃、5000g离心5min，弃上清，保留沉淀。

5)用20mL破菌缓冲液重悬菌体沉淀，吸到50mL烧杯中。将烧杯置于冰上，利用超声波破碎仪进行破碎。仪器参数设置为：功率40％，工作4s，停8s，时长为40min。将破碎后的菌液在4℃、15000g下离心30min，保留上清。并对沉淀与上清液分别取样。

6)取出Ni-NTA纯化柱，向柱子中加入10mL的去离子水，过柱后再加10mL的破菌缓冲液以平衡柱子。将收集的上清液过柱，收集约1mL的样品，作为过柱液。过柱完上清液后，加入10mL含有20mM咪唑的破菌缓冲液制备而成的洗杂液过柱，收集约1ml的样品，作为洗杂液。最后向柱子内加入10mL含有20mM咪唑的破菌缓冲液制备而成的洗脱液过柱，并立即收集5管样品，共5mL。再分别取少量的样品用Nanodrop2000测定蛋白浓度。

7)向柱子中加入5mL的8M尿素洗涤柱子，过柱后。再使用10mL的去离子水过柱洗涤2次，封闭纯化柱，4℃保存。

8)将5管1mL的蛋白洗脱液混匀加入到透析袋中，封住袋口悬浮于预冷的PBS中，在4℃下低速搅拌透析过夜后，收集袋中的蛋白溶液。取少量的样品用Nanodrop2000测定蛋白浓度。

9)将5管蛋白溶液混匀加入超滤管中，4000g、4℃离心40min浓缩蛋白。取少量浓缩后的样品用Nanodrop2000测定蛋白浓度。剩余的蛋白溶液按照每管2mg/mL分装，并保存于-80℃备用。

10)聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳鉴定目的蛋白的大小：取80μL以上步骤中的蛋白样品，并加入20μL的上样缓冲液，充分混匀，在95℃下煮沸10分钟。配置好SDS-PAGE凝胶，并在上样孔中分别加入10μL对应的样品，第1个上样孔加入3μL的蛋白Marker。设置电压80V，30min至样品跑过浓缩胶，切换电压至120V，直至样品跑到凝胶底部，即可停止电泳。取出凝胶，室温下用考马斯亮蓝染色40min，随即用脱色液在室温下进行脱色，期间可以更换脱色液，直至凝胶脱色到可以看清楚条带，用手机对凝胶进行拍照。

(3)真核细胞表达质粒的抽提：按照Endo-Free Plasmid Maxi Kit说明书进行操作。

(4)真核蛋白的表达和纯化

1)将处于指数生长期的293f细胞(来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)悬液取100mL置于新的细胞培养瓶中，并加入300mL新鲜的293细胞培养液(KOP293，来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)，在震荡培养箱中继续培养。当细胞密度为3×10⁶个/mL时，取1mL细胞悬液作为未转染样品。此时细胞可以用于转染。

2)准备两支50mL无菌的离心管，离心管1中加入20mL KPM(转染缓冲溶液，来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)和400μg无菌质粒DNA，轻柔吹打至混匀；离心管2中加入20mLKPM和2mL TA-293转染试剂(来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)，轻柔吹打至混匀；将含有TA-293转染试剂的离心管中的液体转移至含质粒的离心管中，轻柔吹打至混匀；

3)室温静置10min，制备出质粒-载体复合物。从恒温震荡培养箱中取出293f细胞，然后边摇边加入质粒-载体复合物。将三角培养瓶放回37℃、5％的CO₂、110rpm的震荡培养箱中培养。

4)转染24h后，加入2.4mL KE-293(293蛋白表达增强剂，来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)。

5)待转染后的第6天，细胞活率不低于70％，离心，收集上清液。吸取1mL上清液作为诱导的样品。

6)取出Ni-NTA纯化柱，向柱子中加入40mL的去离子水，过柱后再加40mL的破菌缓冲液以平衡柱子。将收集的上清液过柱，收集约1mL的样品，作为过柱液。过柱完上清液后，加入40mL含有20mM咪唑的破菌缓冲液制备而成的洗杂液过柱，收集约1mL的样品，作为洗杂液。最后向柱子内加入40mL含有20mM咪唑的破菌缓冲液制备而成的洗脱液过柱，并立即收集5管样品，共25mL。分别将5管蛋白溶液放入超滤管中，4000g、4℃离心40min浓缩蛋白，每管均用PBS定容至1mL。再分别取少量的样品用Nanodrop2000测定蛋白浓度。

7)向柱子中加入20mL的8M尿素洗涤柱子，过柱后。再使用40mL的去离子水过柱洗涤2次，封闭纯化柱，4℃保存。

8)将5管1mL的蛋白洗脱液混匀加入到透析袋中，封住袋口悬浮于预冷的PBS中，在4℃下低速搅拌透析过夜后，收集袋中的蛋白溶液，取少量的样品用Nanodrop2000测定蛋白浓度。蛋白溶液按照每管2mg/mL分装，并保存于-80℃备用。

9)聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳鉴定目的蛋白的大小：取80μL以上步骤中的蛋白样品，并加入20μL的上样缓冲液，充分混匀，在95℃下煮沸10分钟。配置好SDS-PAGE凝胶，并在上样孔中分别加入10μL对应的样品，保留第1个上样孔加入3μL的蛋白Marker。设置电压80V、30min至样品跑过浓缩胶，切换电压至120V，直至样品跑到凝胶底部，即可停止电泳。取出凝胶，室温下用考马斯亮蓝染色40min，随即用脱色液在室温下进行脱色，期间可以更换脱色液，直至凝胶脱色到可以看清楚条带，用手机对凝胶进行拍照。

注：可根据细胞活率，提前结束转染。

结果如图1所示，从SDS-PAGE电泳图可看出，在箭头指出的目的蛋白位置，诱导后全蛋白比未诱导全蛋白目的条带颜色更深，说明结合蛋白被成功诱导表达。每幅SDS-PAGE电泳图最后5条是经Ni-NTA His·Bind Resin纯化柱纯化后收集的目的蛋白洗脱液电泳条带，从图中可看出，目的条带单一且颜色较深，说明在过柱纯化时已将大部分杂蛋白洗掉，洗脱液中主要含有我们所需的目的蛋白。

实施例4ELISA检测4个EGFR的改造的结合蛋白与EGFR抗原的结合

(1)使用100μL的抗原-PBS缓冲液(浓度为2μg/ml)包被于NΜNC 96孔酶标板中，将板置于4℃过夜。其中，用PBS作为空白对照，包被的抗原包括：IFN、NGF、CD28、CD31、CSF1R、ICAM-1、EpCAM、EGFR完整胞外段、EGFR抗原片段(以上蛋白均由北京义翘神州科技股份有限公司提供，片段由上海波泰生物公司提供)。

(2)第2天，甩掉板内所有的液体，用PBS洗涤3次，每次都需要在吸水纸上反复的拍打，以甩走剩余的液体。再在每孔中加入200μL 2％BSA溶液，37℃下封闭2h。

(3)甩掉板内所有的液体，用PBS洗涤3次，每次都需要在吸水纸上反复的拍打干净。每孔加入100μL的2μg/mL EGFR的结合蛋白(实施例3制备得到)，置于室温下孵育1h。

(4)甩掉板内所有的液体，用PBST洗涤3次，每次都需要在吸水纸上反复的拍打干净。每孔加入100μL稀释(1:5000)后的Protein A-HRP，置于室温下孵育1h。

(5)甩掉板内所有的液体，用PBST洗涤3次，每次都需要在吸水纸上反复的拍打干净。每孔加入100μL的TMB显色液，置于黑暗条件下显色10min。再用50μl稀硫酸(浓度为1M)终止反应，并用酶标仪测量OD 450nm的吸光值。

结果如图2所示：4个EGFR的改造的结合蛋白均能特异性的与EGFR胞外段及其抗原片段结合。与对应EGFR结合蛋白对照(pET22b-aEG2E12和pET22b-aEG4D9)相比，pET22b-aEG4D9-aEG2E12对EGFR抗原片段的结合能力有显著提高；与对应EGFR结合蛋白对照(pcDNA3.1-aEG4D9)相比，pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9对EGFR抗原片段的结合能力也有显著提高。此外，4个改造的结合蛋白均与无关抗原没有结合能力

实施例5PBMC的提取

(1)用10mL抗凝真空采血管静脉取健康人血，在离心管中用等体积的PBS稀释抗凝全血；

(2)在15/50mL离心管中先加入等体积的分离液(注：当稀释全血后的总体积小于3mL时，加入分离液的体积为3mL)，然后将稀释后的全血小心的平铺到分离液上，需要保持两种液体的界面清晰(注：平铺后的总体积不能超过离心管的2/3)。

(3)室温下，800g离心25min，离心管种出现明显的分层。从上往下分别为：血浆层、淋巴细胞层(白膜层)、分离液层(透明层)、红细胞层。

(4)吸取淋巴细胞层到15mL的离心管中，并加入10mL的PBS洗涤，室温，250g离心10min后，弃上清。

(5)再加入5mL的PBS重悬细胞，室温，250g离心10min，弃上清。此步骤重复1次。弃上清后，将PBMC重悬备用。

实施例6

LDH法检测2个EGFR的改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9和pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9)对人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人前列腺癌细胞DU145和人肾上皮细胞293T细胞的毒性作用(A549、MCF-7、DU145和293T购自上海信裕生物科技有限公司)。

(1)消化收集处于对数生长期的肿瘤细胞或者293T细胞，并用含有5％(v/v)FBS的细胞培养基(A549和DU145使用RPMI-1640培养基，MCF-7和293T使用DMEM培养基)重悬细胞，在细胞计数板中计数，调整浓度为2.0×10⁵个/mL。将提取出来的PBMC细胞计数，调整浓度为2.0×10⁶个/mL。

(2)使用96孔板，分别设置以下对照孔及实验孔：

效应细胞自发LDH释放孔：向孔中加入1.0×10⁵个PBMC(体积为100μL)。

靶细胞自发LDH释放孔：向孔中加入1.0×10⁴个肿瘤细胞或293T细胞(体积为100μL)。

靶细胞最大LDH释放孔：向孔中加入1.0×10⁴个肿瘤细胞或293T细胞(体积为100μL)，在收集上清前加入10μL 10倍浓度的裂解溶液。

培养基背景自发LDH释放孔：加入100μL对应的培养基。

体积校正对照孔：加入100μL对应的细胞培养基，在收集上清前加入10μL 10倍浓度的裂解溶液。

实验孔：向每孔中加入1.0×10⁴个肿瘤细胞或293T细胞后(体积为50μL)，并加入1.0×10⁵个PBMC(体积为50μL)。

(3)向每个实验孔中分别加入不同终浓度的EGFR的结合蛋白(10、100和1000ng/mL)，然后将96孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养18h。

(4)在放入培养箱孵育17小时15分钟时,向靶细胞最大释放孔加入10μL 10倍浓度的裂解溶液(10×Lysis Solution)以充分裂解靶细胞。

(5)培养18h后，250g离心4min，收集上清液。按照CytoTox

非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书要求使用Assay Buffer充分溶解底物。

(6)向以上每孔中加入50μL终止液后，1h内用酶标仪检测OD490。

(7)实验结果的计算：

将所有效应细胞自发LDH释放孔、靶细胞自发LDH释放孔和实验孔的吸光值减去培养基背景吸光值；

将靶细胞最大LDH释放孔的吸光值减去体积校正对照吸光值；

将以上获得的经过校正的值代入公式，计算细胞裂解百分数(％)＝(实验组–效应细胞自发–靶细胞自发)/(靶细胞最大自发–靶细胞自发)×100％。

结果如图3所示：在3个肿瘤细胞中，与阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1相比，随着2个EGFR的改造的结合蛋白浓度的增加，它们对肿瘤细胞毒性作用逐渐增强。在3种浓度下，与EGFR结合蛋白对照pcDNA3.1-aEG4D9相比，pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9对细胞毒性作用有显著增强。2个EGFR的改造的结合蛋白对正常细胞293T不会产生毒性作用。

实施例7

ELISA检测在A549、MCF-7、DU145和293T细胞中，2个EGFR的改造的结合蛋白(pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9和pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9)对激活T细胞释放细胞因子IFN-γ和TNF-α的作用。

(1)消化收集处于对数生长期的肿瘤细胞或者293T细胞，并用含有10％(v/v)FBS的细胞培养基(A549和DU145使用RPMI-1640培养基，MCF-7和293T使用DMEM培养基)重悬细胞，在细胞计数板中计数，调整浓度为1.0×10⁵个/mL。将提取出来的PBMC细胞计数，调整浓度为7.0×10⁵个/mL。

(2)向96孔板中加入1.0×10⁴个/100μL/孔的肿瘤细胞或者293T细胞(作为靶细胞)，加入7.0×10⁴个/100μL/孔的PBMC(作为效应细胞)，和终浓度为100ng/mL的EGFR的结合蛋白，然后将板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养24h。

(3)300g离心10分钟，收集上清液。分别按照Human IFN-γELISA kit和HumanTNF-αELISA Kit说明书操作。

(4)用酶标仪检测相应波长下的吸光值。绘制标准曲线，即可算出上清中细胞因子IFN-γ和TNF-α的浓度。

图4结果表明：在3个肿瘤细胞中，与阴性对照结合蛋白pET22b-aHER2-13C1相比，pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9对细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ和TNF-α的含量有显著增加，并且它们的含量分别在350pg/mL左右和150pg/mL左右。EGFR结合蛋白对照pcDNA3.1-aEG4D9不能增加上清液中IFN-γ和TNF-α的含量。在正常细胞293T中，2个EGFR的改造的结合蛋白都不能激活T细胞释放细胞因子IFN-γ和TNF-α。

实施例8

MTT法检测2个EGFR的改造的结合蛋白对DU145细胞增殖的抑制作用。

(1)消化收集处于对数生长期的DU145细胞，并用含有10％(v/v)FBS的RPMI-1640细胞培养基重悬细胞，在细胞计数板中计数，调整浓度为2.5×10⁴个/ml。

(2)向96孔板中加入5.0×10³个/200μl/孔的细胞，然后将板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养过夜，使细胞贴壁。

(3)第2天，弃掉旧的培养基，并替换成含1％(v/v)FBS的RPMI-1640细胞培养基，将板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中饥饿培养6h。

(4)在每孔中加入对应的不同终浓度的EGFR的改造的结合蛋白(0、25、50和100μg/ml)，在细胞培养箱中继续培养72h。

(5)每孔中均加入30μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，细胞培养箱中继续培养4h后，弃掉培养基，每孔中均加入200μL DMSO，摇床快速摇培养板10min后，使用酶标仪上测量OD570nm的吸光值。

图5结果表明：在DU145细胞中，与0μg/mL相比，2个EGFR的改造的结合蛋白能在3个浓度(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)下对肿瘤细胞增殖有显著的抑制作用，并且随着浓度增加对细胞增殖的抑制作用越强。与100μg/mL pcDNA3.1-aEG4D9相比，pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9对细胞增殖有显著的抑制作用。

实施例中所用到的试剂的配置方法如下：

(1)LB液体培养基(1L)

注：使用去离子水溶解并定容至1L，高压蒸汽灭菌20min后，室温保存备用。

(2)LB固体培养基配方(200ml)

注：使用去离子水溶解并定容至200ml，高压蒸汽灭菌20min后，待培养基冷却至50℃左右倒平板，凝固后4℃保存备用。

(3)PBS(pH＝7.4)

注：使用去离子水溶解以上试剂，调节pH至7.4，再定容至500ml，高压蒸汽灭菌20min后，室温保存备用。如需配制PBST，在未灭菌的PBS中加入0.5ml的Tween-20，高压蒸汽灭菌20min后，保存于4℃备用。

(4)10×SDS-PAGE电泳缓冲液(100ml)

注：使用去离子水溶解并定容至100ml，4℃保存备用。

(5)破菌缓冲液(500ml)

注：使用去离子水溶解并定容至500ml，4℃保存备用。使用前加入终浓度为2mM的PMSF。

(6)脱色液

注：使用去离子水溶解并定容至1L，4℃保存备用。

(7)12％SDS-PAGE分离胶(5ml)

(8)12％SDS-PAGE浓缩胶(2ml)

(9)10×SDS-PAGE loading bμffer

超纯水定容至10ml，室温保存。

(10)氨苄青霉素溶液(100mg/ml)

将1g氨苄青霉素粉末充分溶解于10ml去离子水中后，使用0.22μm过滤器除菌，4℃保存备用。

(11)IPTG溶液(0.5M)

将1.2g IPTG粉末溶解于5ml的去离子水中，使用0.22μm过滤器除菌，-20℃保存备用。

(12)PMSF溶液(100×)：在50ml异丙醇中加入1.74g PMSF，充分溶解。

(13)考马斯亮蓝染色液(1L)：将1g考马斯亮蓝R-250置于烧杯中，加入250ml异丙醇，100ml冰醋酸，使用去离子水溶解并定容至1L后，滤纸滤除颗粒物置于室温备用。

(14)10％过硫酸铵：在5ml去离子水中加入0.5g过硫酸铵粉末，充分溶解。

(15)2％BSA溶液：将1g BSA粉末加入到50ml PBS缓冲液中，充分溶解，使用0.22μm过滤器除菌，4℃保存备用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> EGFR的改造的结合蛋白及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 267

<223> pET22b-aEG4D9-aEG2E12改造的结合蛋白的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser

20 25 30

Pro Asp Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala

130 135 140

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ser Asn Asn Glu

165 170 175

Phe Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

180 185 190

Ser Ala Ile Ser Thr Arg Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

195 200 205

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Gly Val Ser Tyr Arg Arg Pro Gln Gln Leu Lys Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

260 265

<210> 2

<211> 628

<223> pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE改造的结合蛋白的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser

20 25 30

Pro Asp Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala

130 135 140

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ser Asn Asn Glu

165 170 175

Phe Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

180 185 190

Ser Ala Ile Ser Thr Arg Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

195 200 205

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Gly Val Ser Tyr Arg Arg Pro Gln Gln Leu Lys Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Glu Gly Gly Ser Leu

275 280 285

Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe

290 295 300

Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly

305 310 315 320

Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser

325 330 335

Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly

340 345 350

Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala

355 360 365

Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg

370 375 380

Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Pro Ala Asp

385 390 395 400

Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe

405 410 415

Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn

420 425 430

Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg

435 440 445

Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln

450 455 460

Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala

465 470 475 480

Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly

485 490 495

Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly

500 505 510

Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr

515 520 525

Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu

530 535 540

Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly

545 550 555 560

Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu

565 570 575

Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg

580 585 590

Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln

595 600 605

Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro

610 615 620

Lys Asp Glu Leu

625

<210> 3

<211> 269

<223> pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9改造的结合蛋白的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser

20 25 30

Pro Asp Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala

130 135 140

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser Pro Asp

165 170 175

Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

180 185 190

Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

195 200 205

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

260 265

<210> 4

<211> 507

<223> pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9改造的结合蛋白的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser

20 25 30

Pro Asp Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

130 135 140

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr

145 150 155 160

Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr

180 185 190

Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser

195 200 205

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

225 230 235 240

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln

260 265 270

Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val

275 280 285

Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr

290 295 300

Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser

305 310 315 320

Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

325 330 335

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

340 345 350

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala

355 360 365

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gln Val

370 375 380

Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

385 390 395 400

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser Pro Asp Asn Met

405 410 415

Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr

420 425 430

Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

435 440 445

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

450 455 460

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly

465 470 475 480

Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu Tyr Trp Gly Gln

485 490 495

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

500 505

<210> 5

<211> 125

<223> pET22b-aEG2E12结合蛋白对照的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ser Asn

20 25 30

Asn Glu Phe Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ala Ile Ser Thr Arg Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Val Ser Tyr Arg Arg Pro Gln Gln Leu Lys Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<210> 6

<211> 127

<223> pET22b-aEG4D9结合蛋白对照的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Leu Ser

20 25 30

Pro Asp Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Thr Ile His Lys Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Gly Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Leu Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<210> 7

<211> 129

<223> pET22b-aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Val Ser

20 25 30

Ser Glu Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Phe Thr Ser Gly Gln Gly Ser Leu Arg Ser Asp Pro

100 105 110

Ile Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

115 120 125

Ala

<210> 8

<211> 128

<223> pET22b-aVE201阴性对照结合蛋白的氨基酸序列

Met Ala Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Val Ser

20 25 30

Asn Glu Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Gln Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Gly Gln Arg Arg Arg Gln Met His Ser Tyr Lys Val

100 105 110

Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala

115 120 125

<210> 9

<211> 801

<223> 编码pET22b-aEG4D9-aEG2E12改造的结合蛋白的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gcgccgccgc aggaggtggc ggctccggag gtggaggcag cggagggggc 420

ggatcgatgg cccaggtgca gctgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 480

tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga tatagctcta acaatgagtt tatggcctgg 540

gtccgccagg ctccagggaa gggtctagag tgggtatcag ccatttctac gagaaacggt 600

agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctcccgtga caattccaag 660

aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc 720

gcgggtgtgt cttataggag gccccagcag ttgaagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 780

accgtctcga gcgcggccgc a 801

<210> 10

<211> 1884

<223> 编码pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE改造的结合蛋白的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gcgccgccgc aggaggtggc ggctccggag gtggaggcag cggagggggc 420

ggatcgatgg cccaggtgca gctgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 480

tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga tatagctcta acaatgagtt tatggcctgg 540

gtccgccagg ctccagggaa gggtctagag tgggtatcag ccatttctac gagaaacggt 600

agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctcccgtga caattccaag 660

aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc 720

gcgggtgtgt cttataggag gccccagcag ttgaagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 780

accgtctcga gcgccgccgc aggaggtggc ggctccggag gtggaggcag cggagggggc 840

ggatcgcccg agggcggcag cctggccgcg ctgaccgcgc accaggcttg ccacctgccg 900

ctggagactt tcacccgtca tcgccagccg cgcggctggg aacaactgga gcagtgcggc 960

tatccggtgc agcggctggt cgccctctac ctggcggcgc ggctgtcgtg gaaccaggtc 1020

gaccaggtga tccgcaacgc cctggccagc cccggcagcg gcggcgacct gggcgaagcg 1080

atccgcgagc agccggagca ggcccgtctg gccctgaccc tggccgccgc cgagagcgag 1140

cgcttcgtcc ggcagggcac cggcaacgac gaggccggcg cggccaacgg cccggcggac 1200

agcggcgacg ccctgctgga gcgcaactat cccactggcg cggagttcct cggcgacggc 1260

ggcgacgtca gcttcagcac ccgcggcacg cagaactgga cggtggagcg gctgctccag 1320

gcgcaccgcc aactggagga gcgcggctat gtgttcgtcg gctaccacgg caccttcctc 1380

gaagcggcgc aaagcatcgt cttcggcggg gtgcgcgcgc gcagccagga cctcgacgcg 1440

atctggcgcg gtttctatat cgccggcgat ccggcgctgg cctacggcta cgcccaggac 1500

caggaacccg acgcacgcgg ccggatccgc aacggtgccc tgctgcgggt ctatgtgccg 1560

cgctcgagcc tgccgggctt ctaccgcacc agcctgaccc tggccgcgcc ggaggcggcg 1620

ggcgaggtcg aacggctgat cggccatccg ctgccgctgc gcctggacgc catcaccggc 1680

cccgaggagg aaggcgggcg cctggagacc attctcggct ggccgctggc cgagcgcacc 1740

gtggtgattc cctcggcgat ccccaccgac ccgcgcaacg tcggcggcga cctcgacccg 1800

tccagcatcc ccgacaagga acaggcgatc agcgccctgc cggactacgc cagccagccc 1860

ggcaaaccgc cgaaagatga atta 1884

<210> 11

<211> 807

<223> 编码pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9改造的结合蛋白的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gcgccgccgc aggaggtggc ggctccggag gtggaggcag cggagggggc 420

ggatcgatgg cccaggtgca gctgttggag tctgggggag gcttggtaca gcctgggggg 480

tccctgcgtc tctcctgtgc agcctccgga gatatgctta gccctgacaa tatgacctgg 540

gtccgccagg ctccagggaa gggtctagag tgggtatcaa ccattcataa gactgacggt 600

agcacatact acgcagactc cgtgaagggc cggttcacca tctcccgtga caattccaag 660

aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg cgtgccgagg acaccgcggt atattattgc 720

gcgggattgc gtagtagggg gcttagttcg aagtacctgg agtattgggg tcagggaacc 780

ctggtcaccg tctcgagcgc cgccgcg 807

<210> 12

<211> 1521

<223> 编码pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9改造的结合蛋白的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gcgccgccgc aggaggtggt ggatccgaca tcaaactgca gcagtcaggg 420

gctgaactgg caagacctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaagacttc tggctacacc 480

tttactaggt acacgatgca ctgggtaaaa cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt 540

ggatacatta atcctagccg tggttatact aattacaatc agaagttcaa ggacaaggcc 600

acattgacta cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc aactgagcag cctgacatct 660

gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tattatgatg atcattactg ccttgactac 720

tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagtcgaag gtggaagtgg aggttctggt 780

ggaagtggag gttcaggtgg agtcgacgac attcagctga cccagtctcc agcaatcatg 840

tctgcatctc caggggagaa ggtcaccatg acctgcagag ccagttcaag tgtaagttac 900

atgaactggt accagcagaa gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc 960

aaagtggctt ctggagtccc ttatcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcatactct 1020

ctcacaatca gcagcatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca acagtggagt 1080

agtaacccgc tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaggagg tggtggatcc 1140

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 1200

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 1260

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 1320

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 1380

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 1440

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 1500

accgtctcga gcgccgccgc g 1521

<210> 13

<211> 375

<223> 编码pET22b-aEG2E12结合蛋白对照的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggatatagc tctaacaatg agtttatggc ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcagccattt ctacgagaaa cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgggt 300

gtgtcttata ggaggcccca gcagttgaag tattggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagcgcgg ccgca 375

<210> 14

<211> 381

<223> 编码pET22b-aEG4D9结合蛋白对照的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagatatg cttagccctg acaatatgac ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaaccattc ataagactga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcggga 300

ttgcgtagta gggggcttag ttcgaagtac ctggagtatt ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gcgcggccgc a 381

<210> 15

<211> 387

<223> 编码pET22b-aHER2-13C1阴性对照结合蛋白的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggatatagc gttagctctg agaatatggg ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaggcattt tggcgggaga cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300

tttacgtcgg gtcaggggtc gttgcggtcc gaccccatcc ggtcttgggg tcagggaacc 360

ctggtcaccg tctcgagcgc ggccgca 387

<210> 16

<211> 384

<223> 编码pET22b-aVE201阴性对照结合蛋白的核苷酸序列

atggcccagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60

cgtctctcct gtgcagcctc cggagttagc gttagcaatg aggctatggg ctgggtccgc 120

caggctccag ggaagggtct agagtgggta tcaagcatta ctgaccaaag cggtagcaca 180

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctccc gtgacaattc caagaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgcgtgcc gaggacaccg cggtatatta ttgcgcgaga 300

gggcagcgtc gtaggcagat gcattcgtac aaggtcagct cttggggtca gggaaccctg 360

gtcaccgtct cgagcgcggc cgca 384

<210> 17

<211> 346

<223> PE的氨基酸序列

Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His

1 5 10 15

Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu

20 25 30

Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr

35 40 45

Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn

50 55 60

Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu

85 90 95

Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala

100 105 110

Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr

115 120 125

Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser

130 135 140

Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His

145 150 155 160

Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

165 170 175

Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg

180 185 190

Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp

195 200 205

Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg

210 215 220

Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

245 250 255

Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg

260 265 270

Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr

275 280 285

Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala

290 295 300

Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser

305 310 315 320

Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

325 330 335

Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

340 345

<210> 18

<211> 243

<223> anti-CD3单链抗体的氨基酸序列

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser

165 170 175

Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Leu Lys

Claims

1.一种EGFR的改造的结合蛋白，其特征在于：所述的EGFR的改造的结合蛋白是名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白、名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白、名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白和名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白中的至少一种；

所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；

所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；

所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述的EGFR的改造的结合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于：是编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白的核苷酸序列、编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列和编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列中的至少一种核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的EGFR的改造的结合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于：

编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12的改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；

编码所述的名称为pET22b-aEG4D9-aEG2E12-PE的改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.10所示；

编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.11所示；

编码所述的名称为pcDNA3.1-aEG4D9-anti-CD3-aEG4D9的改造的结合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.权利要求1所述的EGFR的改造的结合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：通过基因合成的方法合成所述的EGFR的改造的结合蛋白的编码核苷酸，然后将其克隆到表达质粒载体上，转化或转染至宿主细胞中进行表达、纯化，得到EGFR的改造的结合蛋白；或是通过多肽合成的方法，直接合成得到EGFR的改造的结合蛋白。

5.权利要求1所述的EGFR的改造的结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的结合蛋白药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的EGFR的改造的结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的结合蛋白药物中的应用，其特征在于：所述的EGFR过表达为特征的疾病包括但不限于：自身免疫病和癌症。

7.根据权利要求6所述的EGFR的改造的结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的结合蛋白药物中的应用，其特征在于：所述的癌症为EGFR高表达肿瘤。

8.根据权利要求7所述的EGFR的改造的结合蛋白在制备治疗EGFR过表达为特征疾病的结合蛋白药物中的应用，其特征在于：所述的EGFR高表达肿瘤为肺癌、头颈癌、结肠癌或脑肿瘤。