CN116178542A - 抗VEGF单域抗体及其人源化、单域抗体和IgG1-Fc构建的融合蛋白和应用 - Google Patents

抗VEGF单域抗体及其人源化、单域抗体和IgG1-Fc构建的融合蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗VEGF单域抗体及其人源化、单域抗体和IgG1‑Fc构建的融合蛋白和应用。本发明筛选得到一组VEGF的单域抗体，其活性高、具有较强的中和或结合能力。该组单域抗体能特异性结合人VEGF165和VEGF121抗原、结合细胞表面表达VEGF的肿瘤细胞株，有效阻断VEGF抗原与VEGFR结合以及产生相应的信号级联效应。本发明进一步将单域抗体进行人源化改造得到提高亲和力提高的人源化抗体。本发明还将单域抗体或人源化的单域抗体与IgG‑Fc构建得到的融合蛋白。本发明的人源化单域抗体和/或融合蛋白可用于检测或诊断VEGF、阻断VEGF与VEGFR之间相互作用以及用于治疗VEGF表达异常相关疾病。

Description

抗VEGF单域抗体及其人源化、单域抗体和IgG1-Fc构建的融合 蛋白和应用
本申请是申请号为“202011140451.7”，申请日为“2020年10月22日”，发明名称为“抗VEGF单域抗体及其人源化、单域抗体和IgG1-Fc构建的融合蛋白和应用”的分案申请
技术领域
本发明涉及单域抗体，尤其涉及抗VEGF的单域抗体以及用该单域抗体或人源化的单域抗体与IgG1-Fc融合构建的融合蛋白，本发明进一步涉及它们在检测VEGF以及治疗VEGF表达异常相关疾病中的应用，属于抗VEGF的单域抗体、人源化的单域抗体及其应用领域。
背景技术
血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)家族是一类多功能的细胞因子,在血管生成和淋巴管生成中具有直接和间接的调控作用,可促进内皮细胞增殖、促进血管生成以及增加血管的通透性。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D等，其中VEGF-A编码区域，经转录、剪接等步骤后形成5种单体,因单体中所含氨基酸数目不同，分别被命名为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，相应的含有121个、145个、165个、189个和206个氨基酸。在8个外显子中，1～5被认为具有重要意义，因其能够编码VEGF受体识别的结构域,VEGF121、VEGF145、VEGF165三种单体是分泌性蛋白质,可以从细胞浆中分泌到细胞外。VEGF145和VEGF165可以和所有内皮细胞的KDR/flk-1受体结合。VEGF-B编码VEGF-B mRNA的剪接方式不尽相同，因而产生了2种不同的转录子，根据其含有的氨基酸残基数目分别被命名为VEGF-B167和VEGF-B186。VEGF-B的相关受体为VEGFR-1/FLT-1,在血管生成的过程中可起到促进作用。VEGF-C又称相关蛋白(VRP)，在人类的胚胎及成熟的组织中，均有VEGF-C mRNA表达,成人的VEGF-C除少量表达于脑、肝、胸腺及外周血白细胞外，其余大部分在胎盘、卵巢、心脏及小腺体中表达。VEGF-C与淋巴管的关系较为密切，包括对淋巴管增生的诱导及对淋巴细胞内皮进行有效的调节，而肿瘤往往最先通过淋巴管进行转移，因此，VEGF-C与肿瘤转移密切相关。VEGF-C在发育的胚胎中即能促进血管进行分化、生长，因此与其他促进血管生成的因子相比，其发挥作用的时间的更早。VEGF-C可作用于VEGFR-2和VEGFR-3,诱导内皮细胞增生,尤其是微血管细胞增生。VEGF-D，其mRNA在人体内的表达部位与VEGF-C类似，尤其在骨骼肌与结肠中表达较为丰富，但在胎盘中少见其表达。VEGF-D具有促进内皮细胞迁移的作用，可作为VEGF受体(VGEFRs)、VEGFR-2(Flk-1)及VEGFR-3(Flt-4)的配体，这些配体与VEGF-D结合后发挥促内皮迁移作用，从而促进血管生成。
VEGF能增强微血管的渗透性，血管渗透性增高后可导致血液成分的外漏，包括纤维蛋白原及其他凝固蛋白。当纤维蛋白在血管外聚积后,可使细胞间水肿液体的吸收与清除速度明显减慢,不仅改变了正常组织周围的环境，降低了其抗血管生成的功能，且具备了促血管生成的作用。VEGF还可增加皮肤、胸膜、腹膜、肠系膜等的血管床渗透性,是导致恶性胸腹水的重要原因。VEGF可促使细胞骨架发生变化，从而改变细胞形态。释放氧化亚氮和前列腺素是VEGF激活内皮细胞的重要方式。内皮细胞被激活后即可进行生长与迁移。VEGF也是一种上皮细胞分裂素，可促进细胞进行有丝分裂，其原理可能涉及到蛋白激酶c途径及氧化亚氮调节途径。在血管生成的早期，最关键的变化是降解基底膜，降解过程中需要的酶和蛋白,大部分可由VEGF诱导生成。包括基质降解金属蛋白酶,金属蛋白酶间质胶原酶及丝氨酸蛋白酶,激活这些物质，可改变局部的微环境，创造出了适宜内皮细胞的迁移条件.研究证明VEGF可促进内皮细胞uPA受体的表达。此种受体表达增加，可加强蛋白水解作用和组织重塑,这些发现从侧面也证明了VEGF具有促血管生成的作用。此外,uPA本身也可诱导VEGF表达的增加，这就形成了一个表达环路。肿瘤的生长需要源源不断地供血，而VEGF因其能促进血管生成，故在肿瘤生长中必不可少。VEGF也是介导新生血管生成的重要因素，可强烈促使血管内皮细胞进行有丝分裂，进而形成新的血管，已被认为是促进肿瘤血管生成最强的细胞因子，对于新生血管是必要的。VEGF-C诱导的血管和淋巴管数量几乎相同,内皮穿透仅存在于毛细血管，表明VEGF-C不仅在促血管生成方面起作用，在促淋巴管方面也具有同样的作用。VEGF-C在肿瘤细胞和淋巴管上皮细胞之间起到了一定的作用，使两者进行相互调节，可促使新的淋巴管生成，淋巴管的增加是肿瘤更容易进行转移在许多实体瘤中，肿瘤的恶性程度与瘤体内血管化程度呈正相关。过量表达VEGF与多种肿瘤病情及预后相关,包括结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌和黑素瘤等。通过阻断VEGF信号途径，可从血管、淋巴管两方面抑制肿瘤的生长和转移。VEGF已成为一种重要的抗血管生成的治疗靶点。
专利申请WO9410202A中首次公开了罗氏公司筛选获得VEGF的鼠源A4.6.1抗体，但鼠源单抗对人体有较强的免疫原性，可能会诱发人抗鼠抗体(HAMA)反应，并且其在人体循环系统中往往很快地会被清除掉。在WO9845331A和WO9845332A专利申请中通过将A4.6.1产生的6个鼠源CDR与人源VLK1Cl轻链恒定区和VHⅢ-CH1重链恒定区相结合，构建获得了人源化的VEGF抗体。所获得的人源化抗VEGF单克隆抗体与VEGF的亲和力与原抗体相似。罗氏公司贝伐珠单抗就是一种重组人源化单克隆抗体，分子量约为149kD，含有人源抗体的框架区和可结合VEGF的鼠源抗体的互补决定区。它能与VEGF结合并阻止其与内皮细胞表面上的受体结合，从而阻断VEGF导致的内皮细胞扩增和新血管的形成，可减少微血管生成并抑制转移病灶进展，2004年获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，成为美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的抗体药物。目前FDA已批准用于6种适应症，包括转移性结直肠癌，非小细胞肺癌，胶质母细胞瘤，转移性肾细胞癌，宫颈癌、复发性或转移性癌，复发性上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌。2010年经国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准进入中国，商品名为安维汀。WO9845331A和WO9845332A专利申请中，对抗VEGF抗体进行了片段化处理，并通过突变提高其亲和性，以便药物直接递送到眼内发挥作用，从而制备获得了雷珠单抗。雷珠单抗是重组的VEGF人源化单抗IgG1的抗体片段，不具有抗体Fc区，分子量约为48kD，具有治疗过度血管增生导致的湿性老年性黄斑，是用于眼内治疗的抗体药物。2006年被FDA批准用于治疗老年性黄斑，2012年又被FDA批准用于治疗糖尿病黄斑水肿。
然而，上述单克隆抗体结构复杂，生产周期长，其成本高，价格昂贵。1993年Hamers-Casterman等发现，骆驼抗体有天然缺失轻链，只含有重链，且该重链缺失恒定区的CH1区，因此其可变区直接与铰链区相连接，故又称重链抗体。克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体(variable domain of heavy chainof heavy-chain antibody，VHH)。VHH晶体直径2.5nm，长4nm，因此,又称为纳米抗体(nanobody)，是自然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米抗体一般结构呈椭圆形，体积很小，分子质量为单克隆抗体的1/10(15kD左右)，与普通抗体相比，其稳定性好、亲和力较高，克服了小分子功能抗体的缺点，同时又具有分子质量小免疫原性弱、组织穿透力强，可在酵母菌、大肠杆菌等微生物中大量表达，可进行大规模生产，易于普及和应用，相对价格低廉等单克隆抗体、多克隆抗体不具备的优点，适应用于检测、疾病治疗等方面。因此应用单域抗体技术研发VEGF抗体具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供一组抗VEGF的单域抗体及其编码基因；
本发明的目的之二是将抗VEGF的单域抗体进行人源化改造得到人源化的单域抗体；
本发明的目的之三是将所述的单域抗体或人源化的单域抗体与人IgG1-Fc融合得到融合蛋白；
本发明的目的之四是将所述的单域抗体或人源化的单域抗体与酶相、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物中的一种或多种相偶联得到缀合物；
本发明的目的之四将所述的抗VEGF的单域抗体、抗VEGF的人源化的单域抗体、融合蛋白以及缀合物应用于制备检测VEGF的试剂或治疗VEGF表达异常相关疾病；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了抗VEGF的单域抗体，所述单域抗体均由框架区和3个互补决定区组成；所述单域抗体是NBV11；其中，单域抗体NBV11的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能，这些蛋白突变体均属本发明的保护范畴之内；此外，与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列也属于本发明保护范畴之内。
本发明进一步提供了所述单域抗体的氨基酸序列，其中，单域NBV11的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。
将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能，这些蛋白突变体均属本发明保护范畴之内；此外，与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列也属于本发明保护范畴之内。
根据单域抗体亲和力测定实验结果可见，本发明的所有VEGF单域抗体的亲和力在50nm、20nm、10nm、1nm、0.1nm、0.01nm，部分VEGF单域抗体亲和力的范围在0.001-37.5nM。根据与VEGF-165抗原和其它相关抗原的结合试验可见，本发明的VEGF单域抗体与人VEGF-165抗原特异性结合,与其它相关蛋白基本不结合，说明本发明的VEGF单域抗体特异性良好。
根据本发明VEGF单域抗体对VEGF与VEGFR的结合竞争抑制作用试验结果可见，不同VEGF单域抗体能够竞争抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白的结合，其中有4株单域抗体(NBV5、NBV6、NBV14以及NBV16)与阳性对照贝划单抗的竞争抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白结合的抑制效率相同。
本发明进一步对单域抗体NBV11进行了人源化改造，得到人源化的抗体；所有人源化后的VEGF单域抗体，其亲和力均没有产生明显的变化；其中，将单域抗体NBV11进行了人源化改造得到了4个人源化的抗体，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.7和SEQ ID No.8所示。
本发明还进一步提供了所述单域抗体的编码基因序列，其中，单域抗体NBV11的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示。
其中，与上述所示的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列也属于本发明的保护范畴之列；另外，与上述任何一种所示的多核苷酸序列至少有90％以上同一性的多核苷酸序列也属于本发明的保护范畴之列。
本发明进一步提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述单域抗体的编码基因中的一个或多个；优选的，所述重组表达载体可以是重组原核细胞表达载体、重组酵母表达载体、重组真核细胞表达载体或其它重组细胞表达载体。
本发明还提供了重组宿主细胞，其包含上面所述的重组表达载体。
优选的，所述的重组宿主细胞为重组原核表达细胞、重组真核表达细胞，重组真菌细胞或酵重组母细胞，所述重组原核表达细胞优选大肠杆菌。
本发明进一步将所述的抗VEGF的单域抗体或人源化的单域抗体与IgG-Fc构建融合蛋白；其中，所述Fc基因序列可以是来源于IgG，IgA，IgM的Fc基因序列或来源于IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。所述的IgG优选是人IgG及其IgG1、2、3、4的亚类，还可以是人IgM、人IgA或其它动物(如鼠，兔，猴等)免疫球蛋白的Fc片段基因及氨基酸序列。
本发明进一步将所述单域抗体或人源化的单域抗体与酶相(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物中的一种或多种相偶联得到缀合物，这些缀合物可用于检测VEGF或治疗多种与VEGF表达异常相关疾病。
本发明所提供的抗VEGF的单域抗体、人源化的抗VEGF的单域抗体、VEGF的单域抗体或人源化的单域抗体与IgG-Fc构建的融合蛋白、单域抗体或人源化的单域抗体与酶相、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物相偶联得到缀合物主要具有如下几方面的用途：
(1)制备检测VEGF中有关的药物或试剂；
(2)制备阻断VEGF与VEGFR之间相互作用的药物或试剂。
(3)制备用于治疗VEGF表达异常相关疾病的药物的应用。优选地，所述的VEGF表达异常相关不同疾病，如肺癌、直结肠癌、乳腺癌、头颈癌等肿瘤疾病，老年眼底黄斑病变等，包括但不仅仅限于这些疾病的检测和治疗的应用。
本发明筛选得到一组VEGF的单域抗体及其人源化单域抗体和融合蛋白。与现有的抗体相比，本发明筛选得到的抗VEGF的单域抗体活性高、具有较强的中和或结合能力。该组单域抗体能特异性结合人VEGF165和VEGF121抗原、结合细胞表面表达VEGF的肿瘤细胞株，有效阻断VEGF抗原与VEGFR结合以及产生相应的信号级联效应，可用于检测和/或治疗多种与VEGF表达异常相关疾病。本发明的VEGF人源化单域抗体和/或融合蛋白可用于治疗老年性眼底湿性黄斑病变疾病，还可用于治疗多种相关肿瘤疾病。
附图说明
图1抗VEGF单域抗体在大肠杆菌中表达试验SDS-PAGE电泳结果，结果显示，8个克隆有6个可以高效表达，另外2个克隆需要优化表达条件后，在进行表达。
图2抗VEGF单域抗体在大肠杆菌中表达后，经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳结果，其纯化后蛋白纯度达90％左右。
图3纯化的VEGF单域抗体与人VEGF-165抗原和其它相关抗原的结合试验(ELISA)；结果显示该组抗VEGF单域抗体具有较高的特异性，只与人VEGF165蛋白结果，不与其它相关因子蛋白结合。
图4结果显示VEGF单域抗体能够竞争抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白的结合。
图5VEGF人源化单域抗体-HIgGfc融合蛋白表达纯化SDS-PAGE。
图6NBV20Hm1蛋白的荧光素标记物+辅料多肽实验动物组A眼组织切片荧光强度检测结果。
图7用PET-CT检测兔眼底铜64标记VEGF单域抗体-TAT穿膜肽融合蛋白的含量结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1抗VEGF抗原特异性的单域抗体库构建
1)VEGF抗原免疫羊驼
按照常规免疫方法进行，以购买的VEGF抗原(Human VEGF Protein,Human,Recombinant,厂家北京义翘神州，货号HPLC-11066-HNAH)，选择成年健康的羊驼，在颈背部皮下多点注射抗原，加入抗原和等体积福氏佐剂，分4-8次免疫，跟踪观察注射部位包块吸收情况，以确认免疫正确。免疫间隔时间为7-15天，第4次免疫后，采血清，测定抗原免疫效价，当效价达到1-5万倍以上时(ELISA方法)，采全血100ml左右，分离淋巴细胞，-80℃保存备用。
2)羊驼外周血淋巴细胞的分离和RNA的提取
分离羊驼外周血白细胞，应用QIAGEN试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)，货号，52304)，按照说明书进行，简述之：1.5ml全血，加入红细胞裂解液5～10ml，混匀，放冰浴中30分钟，待红细胞裂解后，2000rpm，离心10分钟，去上清，再加入红细胞裂解液1～2ml，混匀，放冰浴中10分钟，以裂解残余红细胞，2000rpm，离心10分钟，去净上清，加入0.3ml的裂解液，把白细胞混匀，-80℃保存，备用。
RNA纯化，应用QIAGEN试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)，货号，52304)，按照说明书进行，测定得到的RNA浓度。
3)重链抗体可变区-VHH
合成cDNA第一链：用cDNA合成试剂盒(MiniBESTAgarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0，TAKARA公司)，按照说明书进行。以此模板，分别用两套引物进行PCR扩增重链抗体VHH基因片段。采用巢式PCR方法，第一次PCR扩增中大于800bp的为普通重链基因片段，在800～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，切胶回收缺失轻链重链抗体基因片段，以此为模板用VHH特异性引物经PCR扩增得到VHH目的基因(～500bp)。
所用引物：
第一轮PCRFd5’引物:YF:CGC CAT CAA GGT ACC AGT TGA
第一轮PCR Bd3’引物:YBN:CAG CCG GCC ATG GCC SMK GTR CAG CTG GTG GAKTCT GGG GGA G
第二轮PCR引物：
YV-BACK：CAT GTG CATGGCCTA GAC TCG CGG CCCAGC CGG CCA TGG CC；YV-FOR：CAT GTG TAG ATT CCT GGC CGG CCT GGC CTG AGG AGA CGG TGA CCT GG
4)VHH片段和噬菌体展示载体的连接及电转化TG1感受态
SfI单酶切VHH片段和pHEN6载体质粒后，将VHH片段及pHEN6载体(Conrath,KEMother.Antimicrob Agents Chemother(Antimicrobial Chemotherapy)2001,45:(10)2807-12.，中国专利ZL20111028003.1)经连接酶连接，电转化至TG1感受态细胞中，涂布平板，经菌落PCR验证抗体插入率。重组基因克隆效率检测：取电转化菌液涂布LB/Amp平板上，32℃，过夜培养，次日用菌落PCR的方法验证抗体的连接效率，噬菌体抗体库的连接效率在90％以上。将电转化菌液涂布LB/Amp平板上，32℃，过夜培养物，用2YT培养基洗下，加入15％甘油，-80℃保存。噬菌体库大约0.5-1.0x108；随机挑选30-50个克隆，进行基因测序，其VHH的序列中三个CDR序列重复率小于10％。
5)VHH噬菌体抗体库的制备
抗体库加入辅助噬菌体M13K07(Invitrogen)进行拯救：按照常规方法进行噬菌体抗体库的制备，并保存于-80℃备用。
实施例2抗VEGF的单域抗体的获得
1.针对VEGF特异性单域抗体的筛选
第一轮VEGF蛋白浓度150μg/ml，150μl/孔，1个微孔，4℃过夜孵育。
第二轮VEGF蛋白浓度10～100μg/ml，150μl/孔，5个微孔，4℃过夜孵育。
第三轮VEGF蛋白浓度10～50μg/ml，150μl/孔，5个微孔，4℃过夜孵育。
封闭：1％CPBS，300μl/孔，37℃，孵育2小时。
表1针对VEGF特异性单域抗体的筛选结果
筛选次数 加入噬菌体抗体库总量 洗脱液+Tris-HCl 单菌落个数 洗脱滴度
第一轮 5.6×1011 300μl+200μl 10 50/μl
第二轮 5.25×1011 150μl/孔+350μl 约2500 2.5×104/μl
第三轮 5.32×1011 150μl/孔+350μl 约3100 3.1×104/μl
2.噬菌体ELISA方法挑选阳性克隆
从第3轮筛选生长菌落的琼脂平板上随机挑取单个菌落，接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔培养板中培养，用辅助噬菌体超感染诱导表达噬菌体抗体。收获表达上清，以VEGF为抗原进行ELISA测定，挑选出VEGF阳性孔，经DNA测序以鉴定抗VEGF单域抗体克隆的基因序列。得到包括序列表所示基因序列在内的一系列单域抗体基因序列，用于进一步表达和筛选特异性、高活性的单域抗体。
实施例3特异性VEGF单域抗体表达质粒的构建
PCR扩增实施例3所获得的特异性的VEGF单域抗体基因，而获得带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点PCR产物，用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理PCR产物和载体(pSJF2载体)(kim Is.Biosic Biochem.2002,66(5):1148-51，中国专利ZL 201110280031)，经T4连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb-pSJF2，并进行基因序列测定以确定其序列的正确性。
1)获得VHH目的基因的PCR扩增条件，50μl PCR体系的组成：
Figure BDA0003903517160000051
5’引物—GAA GAAGAA GAC AA CAG GCC SVK GTG MAG CTG GWG GAK TCT
3’引物—gaagatctccggatccTGAGGAGACGGTGACCTGGGT
2)目的基因和载体酶切，连接目的基因与载体，转化TG1，PCR鉴定含有目的片段的克隆，基因测序，获得基因序列正确的VEGF单域抗体表达质粒。
实施例4抗VEGF单域抗体的表达和纯化
将实施例3所述的含有质粒VEGFsdAb-pSJF2的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上，37℃过夜。挑选单个菌落接种于15ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜。转种10ml过夜培养物于1L含氨基苄青霉素的2YT培养液中，37℃摇床培养，240转/分，培养到OD值达0.4～0.6时，加入0.5～1.0mM IPTG，继续培养过夜。离心，收菌。加溶菌酶裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白。经Ni+离子亲和层析获得纯度达90％以上的蛋白。图1为表达的抗VEGF单域抗体蛋白SDS-PAGE电泳结果，图2为表达的VEGF-sdAbs经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳结果。
实验例1抗VEGF单域抗体亲和力测定实验
1)样品制备
抗原：Bio-VEGF用1×动态缓冲液(1×PBS，含0.05％ Tween 20、0.1％ BSA，pH7.2)稀释至10μg/ml；
单域抗体：用1×kinetic缓冲液依次稀释为400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM；
2)样品测试
待测抗原通过SA sensor进行加载，抗原稀释5个稀释度，所有VEGF单域抗体的亲和力在50nm、20nm、10nm、1nm、0.1nm、0.01nm。部分VEGF单域抗体亲和力见表2,其亲和力范围在0.001-37.5nM。
表2部分VEGF单域抗体亲和力检测结果
单域抗体编号 KD(nM) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
NBV1 18.36 2.81E+5 2.35E-3
NBV2 1.78 6.6E+4 1.18E-4
NBV3 1.56 6.8E+4 1.06E-4
NBV4 3.14 6.7E+4 2.08E-4
NBV5 1.50 6.9E+4 1.03E-4
NBV6 18.48 2.89E+5 2.45E-3
NBV7 8.65 2.81E+5 2.43E-3
NBV8 8.85 2.79E+5 2.47E-3
NBV9 1.59 6.76E+4 1.08E-4
NBV10 10.08 2.39E+5 2.41E-3
NBV11 8.98 1.28E+5 1.15E-3
NBV12 11.96 1.38E+5 1.65E-3
NBV13 15.90 1.17E+5 1.86E-3
NBV14 10.82 1.10E+5 1.19E-3
NBV15 20.28 1.06E+5 2.15E-3
NBV16 1.97 1.19E+5 2.35E-4
NBV17 2.72 1.16E+5 3.15E-4
NBV18 5.01 1.03E+5 5.16E-4
NBV19 7.48 8.18E+4 6.12E-4
NBV20 1.20 3.21E+5 3.85E-4
NBV21 0.20 1.28E+5 2.51E-5
NBV22 0.19 1.36E+5 2.56E-5
NBV23 6.67 9.19E+4 6.13E-4
NBV24 7.71 5.38E+4 4.15E-4
NBV25 9.13 7.58E+4 6.92E-4
NBV26 0.11 2.39E+5 2.58E-5
NBV27 0.19 1.96E+5 2.56E-5
NBV28 0.82 3.36E+4 2.76E-5
NBV29 0.001 1.42E+5 1.00E-7
NBV30 0.89 9.72E+4 8.68E-6
NBV31 0.70 5.43E+4 3.79E-6
NBV32 0.86 9.02E+4 7.75E-6
NBV33 1.52 8.92E+4 1.36E-4
NBV34 2.54 8.45E+4 2.15E-4
NBV35 0.11 8.72E+4 9.78E-6
NBV36 0.10 8.02E+4 8.09E-6
NBV37 2.04 2.67E+5 5.45E-4
NBV38 37.5 1.22E+5 4.56E-3
NBV40 2.10 2.69E+5 5.64E-4
实验例2纯化的VEGF单域抗体与VEGF-165抗原和其它相关抗原的结合实验(ELISA)
1实验过程
分别包被Human VEGF-B Protein(Fc)、Human VEGF-C Protein(His)、HumanVEGF-D Protein(His)、Human PIGF Protein(Fc)、Mouse VEGF164 Protein、Mouse PIGFProtein、Rat VEGF164 Protein、对照VEGF 165(His)，浓度2ug/ml，100ul/孔，34个微孔，4℃孵育过夜；加入1％CPBS封闭，300ul/孔。37℃，孵育2h；稀释不同编码的VEGF单域抗体至终浓度为1ug/ml，100ul/孔；稀释Anti-Myc tag antibody(HRP)(1:5000)，100ul/孔，37℃孵育1h；加入TMB显色液，100ul/孔，避光反应10min；加入50ul/孔2M H2SO4终止反应；在450nm波长测OD值。
2实验结果
实验结果见图3，根据实验结果可见纯化的VEGF单域抗体与人VEGF-165抗原特异性结合,与其它相关蛋白基本不结合。
实验例3抗VEGF单域抗体对VEGF与VEGFR的结合竞争抑制作用实验
由于VEGF能够结合VEGFR，产生信号传导和血管内皮细胞后续一系列生物功能和细胞增殖，有功能的VEGF单域抗体应该能够竞争抑制VEGF与VEGFR的结合。按照1μg/ml，100μl/孔包被VEGFR蛋白在可拆酶标板，4℃孵育过夜。加入2％BSA封闭，300μl/孔，37℃，孵育2小时。稀释VEGF单域抗体至终浓度为10μg/ml。加入100μl VEGF(10μg/ml)单域抗体，每孔加入VEGF(5μg/ml)蛋白2μl，混匀。稀释鼠抗myc-IgG-HRP(1:5000)，100μl/孔，37℃孵育1小时。加入TMB显色液，100μl/孔，避光反应10分钟。加入50μl/孔2M H2SO4终止反应。在450nm波长测OD值。
图4的结果显示VEGF单域抗体能够竞争抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白的结合。不同VEGF单域抗体能够竞争抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白的结合，有4株单域抗体(NBV5、NBV6、NBV14以及NBV16)与阳性对照贝划单抗的竞争抑制VEGF蛋白与VEGFR蛋白结合的抑制效率相同，还有3株单域抗体只有较弱的竞争抑制作用。
实验例4纯化的部分VEGF单域抗体与人VEGF-165抗原和人VEGF-121抗原的结合实验(ELISA)
实验过程同实验例2，实验结果见表3。实验结果显示，所检测的部分VEGF单域抗体与人VEGF-165和人VEGF-121抗原结合能力基本相同，从侧面证明这部分测试的VEGF单域抗体结合的抗原表面是人VEGF-165和人VEGF-121抗原共有的。
表3抗VEGF单域抗体特异性结合人VEGF-165和人VEGF-121抗原的实验结果
单域抗体编号 H-VEGF-165(OD450) H-VEGF-121(OD450)
NBV3 4.567 4.267
NBV4 4.004 4.088
NBV5 4.615 4.238
NBV6 4.019 3.795
NBV7 4.438 4.070
NBV8 4.456 4.106
NBV9 4.652 4.030
NBV10 1.753 0.192
NBV11 4.792 4.342
NBV12 3.091 0.859
NBV13 3.995 2.628
NBV14 4.562 2.654
NBV15 4.673 4.206
NBV16 4.693 3.949
NBV17 4.325 4.405
NBV18 4.583 3.331
BSA 0.061 0.082
实验例5抗VEGF单域抗体的人源化改造实验
人源化方法采用蛋白表面氨基酸人源化(Resurfacing)的方法及VHH人源化通用的抗原结合互补区移植法(CDR grafting to a universal framework)完成。
人源化步骤如下：对抗VEGF单域抗体NBV11、20、32和35同源建模，建模软件为Modeller9。参考可溶性好的人抗体DP-47和同源序列NBBcII10抗体的氨基酸序列，把抗VEGF单域抗体NBV11、20、32和35进行人源化，改造后的序列见表4。
表4抗VEGF单域抗体11、20、32和35的人源化改造
Figure BDA0003903517160000081
/>
Figure BDA0003903517160000091
X*：表示该氨基酸可能继续人源化变化。
将上述的这些VEGF单域抗体人源化后与抗原结合的特性测试，测试结果见表5。
表5 VEGF单域抗体人源化改造后与抗原结合的特性测试结果
Figure BDA0003903517160000092
从表5中的结果可见，所有人源化后的VEGF单域抗体，其亲和力基本上都无明显产生变化，且框架区人源化率符合设计要求。
实验例6人源化的VEGF单域抗体与人IgG1-Fc连接构建融合蛋白实验
1.构建步骤(1)NBV11Hm1(或NBV11Hm4)+人IgG1-Fc(简称NBV11Hmx-HIgG1fc)基因全合成；(2)NBV20Hm1(或NBV20Hm3)+人IgG1-Fc(简称NBV20Hmx+HIgGfc)基因全合成；(3)NBV32Hm1(或NBV32Hm2)+人IgG1-Fc(简称NBV32Hmx+HIgGfc)基因全合成；(4)NBV35Hm1(或NBV35Hm2)+人IgG1-Fc(简称NBV35Hmx+HIgGfc)基因全合成并加入XhoI-EcoRI双酶切，将(1)NBV11Hmx+HIgGfc、(2)NBV20Hmx+HIgGfc、(3)NBV32Hmx+HIgGfc、(4)NBV35Hmx+HIgGfc基因连接至p327.7表达载体(专利公布号CN 104195173 A)，并加入相应酶切位点和终止密码子，用XbaI-SalI双酶切，将另一相同的(1)(2)(3)(4)基因连接至已含有(1)NBV11Hmx+HIgGfc、(2)NBV20Hmx+HIgGfc、(3)NBV32Hmx+HIgGfc、(4)NBV35Hmx+HIgGfc基因(已XhoI-EcoRI双酶切连接)的p327.7表达载体中，最终使一个载体有2条(1)NBV11Hmx+HIgGfc、(2)NBV20Hmx+HIgGfc、(3)NBV32Hmx+HIgGfc、(4)NBV35Hmx+HIgGfc基因序列。
2.VEGF人源化单域抗体Fc融合蛋白的表达与纯化
将上述构建的各个表达载体，分别转染CHO/K1细胞，用MSX筛选稳定的蛋白高表达细胞株，共筛选到3株稳定表达细胞株，用稳定表达细胞株，在500ml摇瓶中培养进行蛋白表达。
蛋白质纯化：将上述细胞表达上清用蛋白A株亲和层析纯化，纯化蛋白置换为柠檬酸(0.05％Tween80，pH6.2)缓冲液。VEGF人源化单域抗体Fc融合蛋白所表达纯化的蛋白见图5(SDS-PAGE还原胶和非还原胶的电泳图)。
从图5的结果可见，VEGF人源化单域抗体融合蛋白表达纯化后鉴定结果与理论推算值接近一致，表达纯化后非还原胶的蛋白带与分子量马克相比，约76KD左右。
实验例7 VEGF单域抗体或VEGF人源化的单域抗体与能够用于眼科滴眼药物辅料多肽混合制备成滴眼液实验
制备过程：按照文献(Daniele Derossi等，Trojan peptides:the penetratinsystem forintracellular deliver.Trends in Cell Biology.1998(8):84-87.)方法合成穿膜肽penetratin的43-58肽、Pro50肽和3Pro肽三个多肽；以及按照文献(Eric Vives等，A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates throughthe plasma membrane and accumulates in the cell mucleus.The J.B.C.1997(272):16010-16017.)的方法合成Tat肽48-60,43-60,37-60三个多肽与①大肠杆菌表达纯化的NBV20Hm1蛋白的荧光素标记物的混合比例分别为1:1//1:10/1:20/1:30/1:50等不同比例进行配比制备。②大肠杆菌表达纯化NBV20Hm1+穿膜肽融合蛋白的铜64同位素标记物。
用激光将Balb/c小鼠和大耳白家兔眼底灼伤，将①②中制备的滴眼液，滴于灼伤的小鼠和兔眼内，分别於4小时、8小时和12小时各滴眼1次，于12小时后，取眼球冰冻切片，用荧光强度测试仪测试不同小鼠眼组织的含有标记荧光的VEGF单域抗体+辅料多肽的荧光强度，试验同时设有单独标记荧光的VEGF单域抗体，和非药物对照组。用PET-CT检测兔眼底铜64标记VEGF单域抗体-TAT穿膜肽融合蛋白的含量，试验同时设有铜64单独标光的VEGF单域抗体对照组。
实验结果见图6和7；根据图6的NBV20Hm1蛋白的荧光素标记物+辅料多肽实验动物组A眼组织切片荧光强度检测结果可见，眼角膜眼虹膜和视网膜眼底的荧光强度比单独NBV20Hm1蛋白的荧光素标记物组B和非药物对照组C分别高125倍和10-3070倍，有显著统计学差别。根据图7可见，用PET-CT检测兔眼底铜64标记VEGF单域抗体-TAT穿膜肽融合蛋白的含量(右眼)比铜64标记的VEGF单域抗体(左眼)的含量高，作用时间长，有显著差别。
实验例8 VEGF人源化单域抗体Fc融合蛋白抑制肿瘤细胞在小鼠体的生长实验
1.动物试验模型的建立：将培养的人结肠癌细胞(LS174T)吹打成单细胞悬液后800转/分钟离心5分钟，弃掉上清，用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为2*10^7cell/mL备用。接种Balb/c-nu裸鼠颈背部皮肤，用1mL注射器抽取细胞悬液，在肿瘤预期生长部位回抽无血后注入细胞100μL/只。接种完成后，当肿瘤体积在100-200mm3范围内的动物达到40％时，采用excel软件的RAND函数对瘤体积在该范围内的小鼠进行随机分组，每组10只，分为3组，分别标记为分Z1(NBV20Hm1组)、Z2(贝划珠单抗-阳性对照组)、Z3(PBS对照组)。分组当天为第0天，并开始给药，给药途径为腹腔注射(I.P.)，每周给药2次，连续给药6次，末次给药后3天处死小鼠，取肿瘤组织进行称重。给药方案见表6。
表6试验分组及给药方式
组别 动物数 注射样品 给药途径 剂量 频率/周期
Z1 10 NBV20Hm1 I.P. 5mg/Kg 2次/周×3周
Z2 10 贝伐株单抗注射液 I.P. 5mg/Kg 2次/周×3周
Z3 10 PBS I.P. --------- 2次/周×3周
2.试验动物观察和试验结果统计
肿瘤成瘤后每周2次测量动物体重、肿瘤大小(肿瘤块的最长径和最短径)。动物处死后剥离肿瘤，称量瘤重并拍照。(1)瘤体积计算：肿瘤成瘤后测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，每周测量2次，通过公式V＝1/2×a×b2计算瘤体积。以时间为横坐标，瘤体积为纵坐标绘制肿瘤生长曲线。
(2)相对肿瘤增殖率T/C(％)：通过计算T/C(％)来评价药物的抗肿瘤作用，T/C(％)＞40％为无效，T/C(％)≤40％，并经统计学处理p＜0.05为有效。T/C(％)的计算方法如下：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV治疗组RTV；CRTV阴性对照组RTV)，相对肿瘤体积RTV＝VT/V0，V0为分笼给药时(D 0)测量所得的肿瘤体积，VT为每一次测量所得的肿瘤体积。(3)瘤重抑制率：给药结束后处死小鼠，称瘤重，计算瘤重抑制率。瘤重抑制率％＝(1-T/C)×100％(T为治疗组平均瘤重；C为阴性对照组平均瘤重)(4)统计分析：采用excel软件的TTEST函数对瘤体积、瘤重进行统计学分析，p＜0.05有显著性差异，p≥0.05无显著性差异。从表9结果可见：VEGF人源化单域抗体Fc融合蛋白-NBV20Hm1试验动物组与阴性对照动物组对于小鼠体内肿瘤生长抑制率有显著差别，与贝伐株单抗注射液阳性对照组动物试验结果相比，没有显著性差别。
表7对Balb/c-nu裸鼠移植LS174T细胞的抗肿瘤作用结果(平均肿瘤体积统计结果
Figure BDA0003903517160000111
)
Figure BDA0003903517160000112
备注：1.与Z3(PBS对照组)进行比较时，a代表p＜0.05，b代表p≥0.05；与Z2(阳性对照组)比较时c代表p＜0.05，d代表p≥0.05；days：给药天数；T/C(％)：相对肿瘤增殖率。

Claims (10)

1.一组抗VEGF的单域抗体，所述单域抗体均由框架区和3个互补决定区组成，其特征在于，所述单域抗体是NBV11；其中，单域抗体NBV11的3个互补决定区的氨基酸序列分别为SEQID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；
或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
2.按照权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，单域NBV11的氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示；或者将上述所示的任何一种氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行缺失、取代、插入和/或添加所得到的蛋白突变体，该蛋白突变体与突变前的蛋白具有相同的功能；或者与上述所示的任何一种氨基酸序列至少有90％以上同一性的氨基酸序列。
3.人源化后的抗VEGF的单域抗体，其特征在于，将单域抗体NBV11进行了人源化改造得到了4个人源化的抗体，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
4.权利要求1或2任何一项所述单域抗体的编码基因；优选的，单域抗体NBV11的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；或者与上述所示的任何一种多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列；或者与上述所示的任何一种的多核苷酸序列至少有90％以上同一性的多核苷酸序列。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求4或5所述的编码基因中的一个或多个。
6.一种融合蛋白，其特征在于，将权利要求1-3任何一种的单域抗体与IgG-Fc构建得到的融合蛋白；优选的，所述Fc基因序列是来源于IgG，IgA，IgM的Fc基因序列或来源于IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；所述的IgG优选是人IgG及其IgG1、2、3、4的亚类、人IgM、人IgA或其它动物免疫球蛋白的Fc片段。
7.一种缀合物，其特征在于，将权利要求1-3任何一种的单域抗体与酶相、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物中的一种或多种相偶联得到缀合物。
8.权利要求1-3任何一项所述的单域抗体、权利要求4所述的编码基因、权利要求6所述的融合蛋白以及权利要求7所述的缀合物在制备检测或诊断与VEGF有关的的药物或试剂中的用途。
9.权利要求1-3任何一项所述的单域抗体、权利要求4所述的编码基因、权利要求6所述的融合蛋白以及权利要求7所述的缀合物在制备阻断VEGF与VEGFR之间相互作用的药物或试剂中的用途。
10.权利要求1-3任何一项所述的单域抗体、权利要求4所述的编码基因、权利要求6所述的融合蛋白以及权利要求7所述的缀合物在制备用于治疗VEGF表达异常相关疾病的药物的应用；优选的，所述的VEGF表达异常相关疾病包括各种肿瘤疾病或老年眼底黄斑病变。
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