CN102224169A

CN102224169A - 多肽、抗体可变结构域和拮抗剂

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Publication number: CN102224169A
Application number: CN2009801469998A
Authority: CN
Inventors: I·R·凯奇波尔; F·库克; G·W·高夫; L·耶斯佩斯; M·斯图尔德
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2009-11-04
Publication date: 2011-10-19
Also published as: JP2012509852A; MX2011005540A; CA2744055A1; IL212333A0; ZA201103588B; BRPI0921319A2; AU2009319175A1; KR20110091777A; WO2010060768A1; EP2356147A1

Abstract

本发明涉及免疫球蛋白单个可变结构域（dAbs），例如其为蛋白酶抗性的dAbs，并且还涉及用于眼递送的包括此种dAbs的制剂和组合物，及其治疗眼疾病和状况的用途。

Description

多肽、抗体可变结构域和拮抗剂

本发明涉及免疫球蛋白单个可变结构域（dAbs），例如蛋白酶抗性的dAbs，并且还涉及用于眼递送的包括此种dAbs的制剂和组合物，及其治疗眼疾病和状况的用途。

发明背景

治疗眼疾病和状况的困难是治疗试剂递送至眼的无效率。当药物递送至眼时，它经非常快速地从眼组织中清除。另外，当治疗剂局部递送至眼时，问题是它们可能不到达眼的后段（视网膜、玻璃体和脉络膜）。因此，许多后段眼状况已通过静脉内施用药物或通过玻璃体内施用进行治疗。这些疾病中的许多，例如AMD、青光眼、糖尿病性视网膜病，不能得到最佳治疗。因此，需要提供进一步试剂，其可以适合于眼递送并且可以治疗或预防眼疾病和状况。

多肽和肽已成为用于作为医学、治疗和诊断试剂使用的越来越重要的试剂。然而，在特定体内环境例如眼和特定生理学状态例如癌症和炎症状态中，组织、器官或动物中存在的蛋白酶的量可以增加。蛋白酶中的这种增加可以导致内源蛋白质以及进行施用以治疗疾病的治疗用肽、多肽和蛋白质的加速降解和灭活。因此，具有用于体内使用（例如，用于治疗、诊断或预防疾病）的潜力的一些试剂仅具有有限功效，这是因为它们由蛋白酶快速降解且灭活。

蛋白酶抗性多肽提供了几个优点。例如，蛋白酶抗性多肽在体内保持活性长于蛋白酶敏感性试剂，并且因此保留功能足以产生生物学作用的时间段。

VEGF是由于其初级转录物的可变剪接以几种可变形式存在的分泌的、肝素结合、同二聚糖蛋白（Leung等人，1989，Science 246：1306）。VEGF也称为血管通透因子（VPF），这是由于其诱导血管渗漏－－在炎症中重要的过程的能力。

在眼中，已知VEGF和VEGF受体刺激脉络膜和视网膜血管的血管发生且调节此种血管的血管通透性。这两个特征促成视网膜损害和随之发生的视敏度退化，这起因于许多视网膜炎症状况、血管病变和黄斑病。调节VEGF活性或VEGF受体活性的尝试先前已显示有效管理动物模型和人疾病中的血管通透性（Gragoudas等人，2004：N. Engl. J. Med 351：2805）

用目前可用的治疗剂靶向VEGF并非在所有患者中都是有效的。因此，需要改良的试剂用于治疗由VEGF介导的病理学状况，例如血管增殖性疾病（例如年龄相关性黄斑变性（AMD））。

TNF-α（肿瘤坏死因子-α）是促炎细胞因子，其已牵涉于许多眼炎症状况例如葡萄膜炎和AMD，和其中存在炎症组分的视网膜血管病变的生成。与年龄相关性黄斑疾病相关的脉络膜新生血管损伤的生成已证实具有相关的炎症组分。这种相关炎症组分的有效管理已证实直接影响脉络膜新血管生成损害和血管通透性的发展，这两者可以影响人疾病。人AMD患者中的近期证据已暗示抗TNFα治疗剂的使用可以影响患者中的疾病，所述患者对抗VEGF治疗无反应（Theodossiadis等人，2009：Am. J. Ophthalmol. 147：825-830）。

白细胞介素1（IL-1）是免疫应答的重要介质，其对几种类型的细胞具有生物学作用。白细胞介素1与2种受体结合――白细胞介素1受体1型（IL-1R1，CD121a，p80）（其在结合IL-1后将信号转导到细胞内），和白细胞介素1受体2型（IL-1R1，CDw121b）（其在结合IL-1后不转导信号且充当IL-1的内源调节剂）。调节IL-1与IL-1R1的相互作用的另一种内源蛋白质是白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1ra）。IL-1ra结合IL-1R1，但不激活IL-1R1以转导信号。

在结合IL-1（例如，IL-1α或IL-1β）后通过IL-1R1转导的信号诱导可以是致病性的广谱生物活性。例如，在结合IL-1后通过IL-1R1转导的信号可以导致局部或全身炎症，以及另外炎症介质（例如，IL-6、Il-8、TNF）的确立。因此，IL-1与IL-1R1的相互作用已牵涉于眼疾病的发病机理。

结合白细胞介素1受体1型（IL-1R1）且中和其活性的特定试剂（例如，IL-1ra）已证明是用于特定炎症状况的有效治疗试剂。

发明概述

在第一个方面，本发明提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域（或dAb）或由免疫球蛋白单个可变结构域（或dAb）组成的组合物，所述免疫球蛋白单个可变结构域可以例如在递送部位与所需靶分子（例如VEGF、IL-1或TNF-α）结合，用于施用于眼。

本发明还提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域（或dAb）或由免疫球蛋白单个可变结构域（或dAb）组成的组合物，所述免疫球蛋白单个可变结构域可以与所需靶分子（例如VEGF、IL-1或TNF-α、TNFR1、TNFR2、IL-1r）结合，用于治疗、预防或诊断眼疾病或状况的用途，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病和糖尿病性黄斑水肿。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域可以是蛋白酶抗性的，例如对下述一种或多种有抗性：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶制剂、凝血酶、纤溶酶、组织蛋白酶（例如，组织蛋白酶G）、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3）、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13）、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶（ficain）、梭菌蛋白酶、猕猴桃蛋白酶（actinidain）、菠萝蛋白酶和分离酶（separase）。在特定实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme。此种蛋白酶抗性多肽尤其适合于递送给体内的富蛋白酶环境例如眼。蛋白酶还可以由生物提取物、生物匀浆或生物制剂提供。在一个实施方案中，蛋白酶是在眼和/或眼泪中发现的蛋白酶。在眼中发现的此种蛋白酶的例子包括胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶（ADAMs）和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B和D、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶PRSS1、泛蛋白蛋白体途径（UPP）。在一个实施方案中，蛋白酶是非细菌蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是动物例如哺乳动物例如人蛋白酶。

组合物可以递送给眼的不同区域，例如眼的表面、角膜、或泪管（tear duct）或泪腺，或可以存在眼内递送（例如，眼前房或后房例如玻璃体液）和递送给眼结构例如虹膜、睫状体、泪腺，并且组合物可以在眼的这些部分中与靶分子（例如，VEGF、IL-1或TNF-α）结合。组合物还可以递送给眼的眼周区域。

靶分子可以例如是VEGF、IL-1或TNF-α，或它可以是任何其他所需靶，例如在眼中存在的靶分子，例如在眼的表面上、在眼内或在泪管或泪腺中，例如靶可以是IL-1、IL-17或TNF受体例如TNFR1、TGFβ、IL-6、IL-8、IL-21、IL-23、CD20、Nogo-a、髓鞘相关糖蛋白（MAG）或β淀粉状蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供了用于施用于眼的蛋白酶抗性免疫球蛋白单个可变结构域（或dAb），例如以滴眼剂的形式或作为凝胶或例如在植入体中。dAb可以例如与眼中存在的靶分子结合，例如VEGF、IL-1或TNF-α。

施用于眼可以例如通过局部施用，例如以滴眼剂的形式；或可替代地，它可以通过注射到眼内。

使免疫球蛋白单个可变结构域的递送靶向进入眼的特定区域内可以是有用的，例如眼的表面、或泪管或泪腺，或可以存在眼内递送（例如，眼前房或后房例如玻璃体液）。因此，本发明进一步提供了将组合物直接递送给眼的方法，其包括通过选自下述的方法将所述组合物施用于眼：眼内注射、局部递送、滴眼剂、眼周施用和缓释制剂（例如聚合纳米（nano）或微粒或凝胶）的使用或通过使用利用离子电渗疗法的递送装置。

如果免疫球蛋白单个可变结构域例如通过局部递送例如作为滴眼剂递送给眼，连同眼穿透增强剂例如癸酸钠，或连同粘度增强剂例如羟丙基甲基纤维素（HPMC），那么这也可以是有用的。因此，本发明进一步提供了包括下述的组合物：（a）与例如眼中的靶分子（例如VEGF、IL-1或TNF-α）结合的免疫球蛋白单个可变结构域，以及（b）眼穿透增强剂和/或（c）粘度增强剂，例如用于局部递送给眼。

在一个方面，待递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是WO 2008/149146、WO 2008149147或WO 2008149150中公开的任何一种VEGF dAbs，其与VEGF结合。例如它可以是由氨基酸序列编码的多肽，所述氨基酸序列与DOM15-26-593的氨基酸序列（图1a中所示：SEQ ID NO 1）至少80％等同。在一个实施方案中，同一性百分比是至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％或100％。在一个实施方案中，蛋白酶抗性多肽可通过本文描述的用于分离蛋白酶抗性多肽的方法获得。用于递送给眼的DOM15-26-593还可以进一步包括抗体恒定区的结构域。例如，它可以具有与DOM15-26-593-Fc融合物的氨基酸序列（图1b中所示：SEQ ID NO 2）等同的氨基酸序列，或同一性百分比可以是与图1b：SEQ ID NO 2中所示的那种至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。

在一个方面，通过与DOM15-26-593的氨基酸序列至少80％等同的氨基酸序列（例如，通过97％等同或更多的氨基酸序列）编码的VEGF dAb可以包括在位置6上的缬氨酸和/或在位置99上的亮氨酸，和/或在位置30上的赖氨酸（Kabat编号），如WO 2008149150和 WO 2008149147（其内容引入本文作为参考）中所述的。

在进一步的方面，待递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是WO 2008/149144或WO 2008/149148中公开的任何一种抗TNFR1 dAbs。

在一个实施方案中，与α-TNF-αR1结合的免疫球蛋白单个可变结构域可以包括与Dom 1h-131-206的氨基酸序列（图4中所示；SEQ ID NO 6）至少97％（例如 98％、99％或100％等同）等同的氨基酸序列。Dom 1h-131-206的制备和选择在WO2008149148中描述。

在再进一步的方面，待递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是WO 2008/149149中公开的任何一种抗IL-1R1 dAbs。

在一个实施方案中，与IL-1结合的免疫球蛋白单个可变结构域可以包括与下述至少97％（例如 98％、99％或100％等同）等同的氨基酸序列：（a）DOM 4-130-54的氨基酸序列（图3中所示；SEQ ID NO 5）；或（b）DOM 0400 PEG的氨基酸序列（图2中所示；SEQ ID NO 4）。

DOM 4-130-54的制备和选择在WO 2007063311以及WO2008149149中描述。为了制备Dom 0400，获得DOM 4-130-54 dAb序列且这样突变，从而使得在位置80上的半胱氨酸替换DOM 4-130-54中存在的脯氨酸，随后通过与在dAb的位置80上的游离半胱氨酸的标准马来酰亚胺偶联，使这种dAb与40KDa线性PEG分子（得自NOF Corporation，欧洲）附着。

本发明还提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域或由免疫球蛋白单个可变结构域组成的任何组合物在制备用于治疗、预防或诊断眼状况或疾病的药物中的用途，例如其中所述眼疾病是年龄相关性黄斑变性（AMD）、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病或糖尿病性黄斑水肿。

本发明还提供了包括免疫球蛋白单个可变结构域或由免疫球蛋白单个可变结构域组成的组合物，例如VEGF、IL-1或TNF-α dAb，用于在治疗、预防或诊断眼状况或疾病中使用，例如AMD、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病或糖尿病性黄斑水肿。

在一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是DOM15-26-593的氨基酸序列（图1a中所示；SEQ ID NO 1）或不是DOM15-26-593-Fc融合物的氨基酸序列（图1b中所示；SEQ ID NO 2）。

在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是包括下述申请中公开的任何分子或由下述申请中公开的任何分子组成的分子：PCT/GB2008/050399、PCT/GB2008/050400、PCT/GB2008/050406、PCT/GB2008/050405、PCT/GB2008/050403、PCT/GB2008/050404、PCT/GB2008/050407。

在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是如PCT/GB2008/050400中公开的Dom1h-131-511、Dom1h-131-201、Dom1h-131-202、Dom1h-131-203、Dom1h-131-204、Dom1h-131-205的氨基酸序列。

在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是如PCT/GB2008/050406中公开的Dom4-130-202的氨基酸序列。

在另一个可替代实施方案中，用于递送给眼的免疫球蛋白单个可变结构域可以是这样的，其不是如PCT/GB2008/050405中公开的Dom1h-131-206的氨基酸序列。

与免疫球蛋白单个可变结构域组合或结合将其他试剂递送给眼，也可以是有用的，例如递送眼穿透增强剂例如癸酸钠或粘度增强剂例如羟丙基甲基纤维素（HPMC），可以是有用的。

用于眼递送的单个免疫球蛋白可变结构域（dAbs）（例如，与VEGF、IL-1或TNF-α结合的那种）可以格式化为具有较大的流体动力学大小，例如通过附着PEG基团、血清清蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与抗体结构域缀合。例如，dAb单体（例如，VEGF dAb）可以格式化为抗体的较大抗原结合片段（例如，格式化为Fab、Fab’、F（ab）₂、F（ab’）₂、IgG、scFv）。dAb的流体动力学大小及其血清半衰期也可以通过使其与结合结构域（例如，抗体或抗体片段）缀合或连接得到增加，所述结合结构域与增加体内半衰期的抗原或表位结合，如本文描述的（参见，整体引入本文作为参考的WO2006038027的附录1）。例如，VEGF dAb可以与抗血清清蛋白或抗新生Fc受体抗体或抗体片段缀合或连接，例如抗SA或抗新生Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv，或与抗SA亲和体（affibody）或抗新生Fc受体亲和体缀合或连接。

用于在本文描述的组合物中使用的例如与VEGF结合dAbs连接的合适清蛋白、清蛋白片段或清蛋白变体的例子在WO 2005/077042A2和WO2006038027中描述，其整体引入本文作为参考。

格式化的dAbs（例如由加入聚乙二醇格式化的dAbs）可以具有例如30KDa - 100 KDa例如约50-60 KDa的分子量，并且可以用于递送给视网膜和/或脉络膜和/或泪液。

具有约15 KDa分子量的裸（未格式化的）dAbs可以用于递送给玻璃体液和/或房水和/或视网膜和/或脉络膜。

在本公开内容自始至终描述的本发明的其他实施方案中，代替在本发明的拮抗剂或配体中使用单个免疫球蛋白可变结构域或“dAb”，预期技术人员可以使用包括dAb的CDRs的结构域，其结合例如VEGF、IL-1或TNF-α（例如，嫁接到合适的蛋白质支架或骨架上的CDRs，例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域），或可以是包括关于VEGF、IL-1或TNF-α的结合位点的蛋白质结构域，例如，其中结构域选自亲和体、SpA结构域、LDL受体A类结构域或EGF结构域。公开内容就整体而言应相应解释为提供使用此种结构域代替dAb的拮抗剂、配体和方法的公开内容。

本文描述的蛋白酶抗性dAbs可以使用WO 2008149143中描述的方法和教导进行选择，其内容引入本文作为参考。

在一个方面，本发明提供了包括例如VEGF、IL-1或TNF-α结合位点的蛋白酶抗性免疫球蛋白单个可变结构域，其中所述可变结构域当与下述温育时对蛋白酶有抗性：

（i）在37℃至少10微克/ml蛋白酶的浓度（c）进行至少1小时的时间（t）；或

（ii）在30℃至少40微克/ml蛋白酶的浓度（c’）进行至少1小时的时间（t）。在一个实施方案中，蛋白酶例如胰蛋白酶与可变结构域的比（基于摩尔/摩尔）是8,000 - 80,000蛋白酶:可变结构域，例如当C是10微克/ml时，比是800 - 80,000蛋白酶:可变结构域；或当C或C’是100微克/ml时，比是8,000 - 80,000蛋白酶:可变结构域。在一个实施方案中，蛋白酶（例如胰蛋白酶）与可变结构域的比（基于重量/重量，例如微克/微克）是16,000 - 160,000蛋白酶:可变结构域，例如当C是10微克/ml时，比是1,600 - 160,000蛋白酶:可变结构域；或当C或C’是100微克/ml时，比是1,6000 - 160,000蛋白酶:可变结构域。在一个实施方案中，浓度（c或c’）是至少100或1000微克/ml蛋白酶。在一个实施方案中，浓度（c或c’）是至少100或1000微克/ml蛋白酶。参考当与肽或多肽的谱（repertoires）或文库一起作用时（例如，w/w参数），用于使用的适合于蛋白酶的蛋白酶解活性条件的本文描述。这些条件可以用于测定特定免疫球蛋白单个可变结构域的蛋白酶抗性的条件。在一个实施方案中，时间（t）是或是约1、3或24小时或过夜（例如，约12-16小时）。在一个实施方案中，可变结构域在条件（i）下是抗性的，并且浓度（c）是或是约10或100微克/ml蛋白酶，并且时间（t）是1小时。在一个实施方案中，可变结构域在条件（ii）下是抗性的，并且浓度（c’）是或是约40微克/ml蛋白酶，并且时间（t）是或是约3小时。在一个实施方案中，蛋白酶选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶制剂。在一个实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是在痰、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、支气管粘液）、支气管肺泡灌洗、肺匀浆、肺提取物、胰提取物、胃液、唾液或眼泪或眼中发现的蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是在眼和/或眼泪中发现的蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是非细菌蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是动物例如哺乳动物例如人蛋白酶。

在一个实施方案中，可变结构域对胰蛋白酶和/或选自弹性蛋白酶、leucozyme和胰酶制剂的至少一种其他蛋白酶有抗性。例如，抗性针对胰蛋白酶和弹性蛋白酶；胰蛋白酶和leucozyme；胰蛋白酶和胰酶制剂；胰蛋白酶、弹性蛋白酶和leucozyme；胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰酶制剂；胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰酶制剂和leucozyme；或胰蛋白酶、胰酶制剂和leucozyme。

在一个实施方案中，当在条件（i）或（ii）下例如以10⁶- 10¹³例如10⁸- 10¹²复制单位（感染性病毒体）的噬菌体文库大小温育时，可变结构域展示在噬菌体上。

在一个实施方案中，在条件（i）或（ii）下温育后，可变结构域特异性结合VEGF、IL-1或TNF-α，例如使用BiaCore TM或ELISA，例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA评估的。

在一个实施方案中，可变结构域特异性结合A蛋白或L蛋白。在一个实施方案中，与A或L蛋白特异性结合在条件（i）或（ii）下温育后存在。

在一个实施方案中，例如在条件（i）或（ii）下温育后，可变结构域在ELISA例如噬菌体ELISA或单克隆噬菌体ELISA）中可以具有至少0.404的OD₄₅₀读数。

在一个实施方案中，例如在条件（i）或（ii）下温育后，可变结构域在凝胶电泳中展示出（基本上）单一条带。

在另一个实施方案中，试剂（dAb）可以经由可植入递送设备局部施用于眼。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含例如VEGF、IL-1或TNF-α dAb的可植入递送设备用于眼递送

在进一步的方面，本发明提供了药物组合物，其包括免疫球蛋白单个可变结构域（例如VEGF、IL-1或TNF-α dAb），和药学或生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂用于眼递送。

附图简述

图1a：描述了DOM15-26-593的氨基酸序列

图1b：描述了DOM15-26-593-Fc融合物的氨基酸序列

图1c：描述了抗体Fc的氨基酸序列

图2：描述了DOM 0400 PEG（加入聚乙二醇的抗IL1 dAb，分子量约52 KDa）的氨基酸序列

图3：描述了DOM4-130-54（抗IL1 dAb）的氨基酸序列

图4：描述了Dom 1h-131-206（抗TNFα R1 dAb）的氨基酸序列

发明详述

在本说明书内已参考实施方案描述了本发明，其方式使得能够书写清楚和简明说明书。预期且应当认识到实施方案可以在不背离本发明的情况下不同组合或分开。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与由本领域普通技术人员通常理解相同的含义（例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学中）。标准技术用于分子、遗传学和生物化学方法（一般参见，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology（1999）第4版，John Wiley & Sons，Inc.，其引入本文作为参考）和化学方法。

如本文使用的，术语“血管内皮生长因子（VEGF）的拮抗剂”或“抗VEGF拮抗剂”等指结合VEGF且可以抑制VEGF的（即一种或多种）功能的试剂（例如，分子、化合物）。

如本文使用的，“肽”指经由肽键连接在一起的约2个到约50个氨基酸。

如本文使用的，“多肽”指通过肽键连接在一起的至少约50个氨基酸。多肽一般包括三级结构且折叠成功能结构域。

如本文使用的，当在适合于蛋白酶活性的条件下与蛋白酶温育时，“对蛋白酶降解有抗性的”肽或多肽（例如，结构域抗体（dAb））基本上不由蛋白酶降解。当在适合于蛋白酶活性的温度与蛋白酶温育约1小时后，不超过约25％、不超过约20％、不超过约15％、不超过约14％、不超过约13％、不超过约12％、不超过约11％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％、或基本上无一蛋白质由蛋白酶降解时，多肽（例如，dAb）基本上不降解。例如在37或50℃。蛋白质降解可以使用任何合适的方法例如通过SDS-PAGE或如本文描述的功能测定（例如配体结合）进行评估。

如本文使用的，“靶配体”指由多肽或肽特异性或选择性结合的配体。例如，当多肽是抗体或其抗原结合片段时，靶配体可以是任何所需抗原或表位。与靶抗原结合依赖于多肽或肽是功能的。

如本文使用的，抗体指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段（例如Fab 、F（ab’）2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双抗体），无论是衍生自天然产生抗体的任何物种，还是通过重组DNA技术生成的；无论是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是细菌中分离的。

如本文使用的，“抗体形式”指任何合适的多肽结构，其中可以掺入一个或多个抗体可变结构域，以便对结构赋予对于抗原的结合特异性。多种合适的抗体形式是本领域已知的，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、前述任何一种的抗原结合片段（例如Fv片段（例如，单链Fv（scFv）、二硫键键合的Fv）、Fab片段、Fab’片段、F（ab’）₂片段）、单个抗体可变结构域（例如，dAb、V_H、V_HH、V_L）和前述任何一种的修饰形式（例如通过聚乙二醇或其他合适聚合物的共价附着修饰的或人源化V_HH）。

短语“免疫球蛋白单个可变结构域”指抗体可变结构域（V_H、V_HH、V_L），其不依赖于其他V区或结构域特异性结合抗原或表位。免疫球蛋白单个可变结构域可以以具有其他可变区或可变结构域的形式（例如，同或异多聚体）存在，其中所述其他区或结构域不是通过单个免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所需的（即，其中免疫球蛋白单个可变结构域不依赖于另外的可变结构域结合抗原）。“结构域抗体”或“dAb”与“免疫球蛋白单个可变结构域”相同，如该术语在本文中使用的。“单个抗体可变结构域”与“免疫球蛋白单个可变结构域”相同，如该术语在本文中使用的。免疫球蛋白单个可变结构域在一个实施方案中是人抗体可变结构域，但还包括来自其他物种例如啮齿类动物（例如，如WO 00/29004中公开的，其内容整体引入本文作为参考）、护士鲨（nurse shark）和骆驼科物种（Camelid）V_HH dAbs的单个抗体可变结构域。骆驼科物种V_HH是免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其衍生自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼的物种，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。V_HH可以是人源化的。

“结构域”是具有不依赖于蛋白质的其余的三级结构的折叠蛋白质结构。一般地，结构域负责蛋白质的不连续功能性质，并且在许多情况下可以添加、去除或转移至其他蛋白质，而不丧失蛋白质和/或结构域的剩余部分的功能。“单个抗体可变结构域”是包括抗体可变结构域特有的序列的折叠的多肽结构域。它因此包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已由并非抗体可变结构域特有的序列替换，或已截短或包括N或C末端延伸的抗体可变结构域，以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。

如本文使用的，术语“剂量”指一次（单位剂量）全部或经过限定时间间隔以2次或更多次施用施用于受试者的配体的量。例如，剂量可以指在1天（24小时）（日剂量）、2天、1周、2周、3周或一个或多个月（例如，通过单次施用，或通过2次或更多次施用）的过程期间施用于受试者的配体（例如，包括结合靶抗原的免疫球蛋白单个可变结构域的配体）的量。剂量之间的时间间隔可以是任何所需时间量。

短语“半衰期”指配体（例如，dAb、多肽或拮抗剂）的血清浓度在体内减少50％花费的时间，例如由于配体的降解和/或配体通过天然机制的清除或隔离。本发明的配体可以在体内稳定并且其半衰期通过与分子结合得到增加，所述分子抵抗降解和/或清除或整合。一般地，此种分子是天然存在的蛋白质，其自身具有长体内半衰期。配体的半衰期增加，如果其功能活性在体内持续长于相似配体的时间段的话，所述相似配体对于半衰期增加分子不是特异性的。例如，对于人血清清蛋白（HSA）特异的配体和靶分子与相同配体比较，在所述相同配体中不存在对于HSA的特异性，即不结合HSA但结合另一种分子。例如，它可以结合细胞上的第三种靶。一般地，半衰期增加10％、20％、30％、40％、50％或更多。半衰期2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或更多范围中的增加是可能的。可替代地或另外地，半衰期最高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x范围中的增加是可能的。

如本文使用的，“流体动力学大小”指基于分子通过水溶液的扩散，分子（例如蛋白质分子、配体）的表观大小。可以处理蛋白质通过溶液的扩散或运动，以得到蛋白质的表观大小，其中大小由蛋白质粒子的“斯托克斯（Stokes）半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白质的“流体动力学大小”依赖于质量和形状（构象），从而使得基于蛋白质的总体构象，具有相同分子量的2种蛋白质可以具有不同的流体动力学大小。

如本文提及的，术语“竞争”意指第一种靶与其关连靶结合结构域的结合在第二种结合结构域的存在下被抑制，所述第二种结合结构域对于所述关连靶特异。例如，结合可以在立体上被抑制，例如通过结合结构域的物理封闭或通过结合结构域的结构或环境的改变，从而使得其对于靶的亲和力或抗体亲抗原性减少。关于如何执行竞争ELISA和竞争BiaCore实验，以测定第一种和第二种结合结构域之间的竞争的细节，参见WO2006038027。

如下执行2个序列之间的“同源性”或“同一性”或“相似性”（该术语在本文中可互换使用）的计算。序列就最佳比较目的进行比对（例如，缺口可以引入第一个和第二个氨基酸或核酸序列的一个或两个中用于最佳比对，并且非同源序列为了比较目的可以被忽视）。在一个实施方案中，就比较目的比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、80％、90％、100％。随后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置由与第二个序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在那个位置上是等同的（如本文使用的，氨基酸或核酸“同源性”等价于氨基酸或核酸“同一性”）。2个序列之间的百分比同一性是由序列共享的等同位置数目的函数，其中考虑缺口数目和每个缺口的长度，这需要引入用于2个序列的最佳比对。如本文定义的，氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性可以使用算法BLAST 2 Sequences进行制备且测定，其中使用缺省参数（Tatusova，T. A.等人，FEMS Microbiol Lett，174:187-188（1999）。

蛋白酶抗性：

在一个实施方案中，本发明涉及已通过用于蛋白酶抗性dAbs的选择方法进行选择的dAbs，例如抗VEGF dAbs、TNFR1 dAbs、IL-1 dAbs，用于递送给眼，其具有所需生物活性例如与VEGF、TNFR1或IL-1结合。2种选择压力在方法中用于产生用于选择多肽的有效过程，所述多肽是高度稳定的且对蛋白酶降解有抗性，并且具有所需生物活性。如本文描述的，蛋白酶抗性肽和多肽一般保留生物活性。相比之下，蛋白酶敏感肽和多肽在本文描述的方法中被蛋白酶切割或降解，并且因此丧失其生物活性。因此，蛋白酶抗性肽或多肽一般基于其生物活性例如结合活性进行选择。

眼环境是富含蛋白酶的环境，并且因此如本文描述的蛋白酶抗性dAbs用于眼递送的用途提供了几个优点。例如，就对于通过一种蛋白酶（例如，胰蛋白酶）的蛋白酶解降解的抗性选择的可变结构域对于通过其他蛋白酶（例如，弹性蛋白酶、leucozyme）的降解也是有抗性的。蛋白酶抗性可以与肽或多肽的较高解链温度（Tm）相关。较高解链温度指示更稳定的可变结构域、拮抗剂、肽和多肽。对蛋白酶降解的抗性还可以与对于靶配体的高亲和力结合有关。因此，本文描述和提及的方法（在WO 2008149143中）提供了选择、分离和/或回收dAbs的有效方法，所述dAbs具有所需生物活性，并且充分适合于体内治疗和/或诊断眼用途，因为它们是蛋白酶抗性和稳定的。在一个实施方案中，蛋白酶抗性可以与改善的PK相关，例如改善超过并非蛋白酶抗性的可变结构域、拮抗剂、肽或多肽。改善的PK可以是改善的AUC（曲线下面积）和/或改善的半衰期。蛋白酶抗性还可以与可变结构域、拮抗剂、肽或多肽对于剪切和/或热应激改善的稳定性和/或在雾化过程中减少的聚集倾向相关，例如改善超过并非蛋白酶抗性的可变结构域、拮抗剂、肽或多肽。在一个实施方案中，蛋白酶抗性与改善的贮存稳定性相关，例如改善超过并非蛋白酶抗性的可变结构域、拮抗剂、肽或多肽。在一个方面，提供了一个、两个、三个、四个或所有优点，所述优点是对于蛋白酶降解的抗性、较高的Tm和与靶配体的高亲和力结合。

本文描述且提及的方法（在WO 2008/149143中）可以用作分离蛋白酶抗性肽或多肽例如dAbs的程序的部分，若需要则其可以包括其他合适的选择方法。在这些情况下，本文描述的方法可以在程序的任何所需点上采用，例如在其他选择方法使用之前或之后。

在特定实施方案中，用于眼递送的dAb就针对通过胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme的降解的抗性进行选择，并且特异性结合VEGF。在这些实施方案中，提供了包括dAbs的文库或谱，并且在适合于蛋白酶解消化的条件下，与胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme（或包括胰蛋白酶的生物制剂、提取物或匀浆）组合。选择结合VEGF的胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme抗性dAbs。例如，当在37℃在0.04％（w/w）蛋白酶溶液中温育至少约2小时的时间段时，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。在另一个例子中，当在37℃在0.04％（w/w）蛋白酶溶液中温育至少约3小时的时间段时，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。在另一个例子中，当在37℃在0.04％（w/w）蛋白酶溶液中温育至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约10小时、至少约11小时或至少约12小时的时间段时，蛋白酶抗性dAb基本上不降解。

在另一个方面，提供了产生蛋白酶抗性肽或多肽（例如dAbs）的谱的方法。该方法包括提供肽或多肽的谱；在适合于蛋白酶活性的条件下，使肽或多肽的谱和蛋白酶组合；和回收特异性结合VEGF的多种肽或多肽，由此产生蛋白酶抗性肽或多肽的谱。相对于其他方法，在本文中描述了蛋白酶、展示系统、用于蛋白酶活性的条件、和用于选择适合于用于在方法中使用的肽或多肽的方法。

在一些实施方案中，使用包括肽或多肽谱的展示系统（例如，使核酸的编码功能和由核酸编码的肽或多肽的功能特征连接的展示系统），并且该方法进一步包括扩增或增加编码多种所选择的肽或多肽的核酸拷贝数。核酸可以使用任何合适方法进行扩增，例如通过噬菌体扩增、细胞生长或聚合酶链反应。

在特定实施方案中，提供了产生包括抗VEGF dAbs的蛋白酶抗性多肽的谱的方法。该方法包括提供包括抗VEGF dAbs的多肽的谱；在适合于蛋白酶活性的合适条件下，使肽或多肽的谱和蛋白酶（例如，胰蛋白酶、弹性蛋白酶、leucozyme）组合；和回收包括对于VEGF具有结合特异性的dAbs的多种多肽。该方法可以用于产生首次用于实验的谱，或朝所需结合特异性偏倚的谱，例如基于对于VEGF具有结合特异性的亲本dAb的亲和力成熟谱。

选择/分离/回收

使用任何合适的方法可以从谱或文库（例如，在展示系统中）中选择、分离和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽（例如，蛋白酶抗性多肽的群体）。在一个实施方案中，基于可选择的特征（例如，物理特征、化学特征、功能特征），选择或分离蛋白酶抗性多肽。合适的可选择功能特征包括谱中肽或多肽的生物活性，例如与一般配体（例如超抗原）结合、与靶配体（例如，抗原、表位、底物）结合、与抗体结合（例如通过肽或多肽上表达的表位）、和催化活性。（参见例如，Tomlinson等人，WO 99/20749；WO 01/57065；WO 99/58655）。在一个实施方案中，选择基于与VEGF的特异性结合。在另一个实施方案中，选择基于选择的功能特征，以产生其中成员是蛋白酶抗性的第二个谱，随后从第二个谱中选择特异性结合VEGF的成员。

在一些实施方案中，从肽或多肽的文库或谱中选择和/或分离蛋白酶抗性肽或多肽，其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共享共同的可选择特征。例如，蛋白酶抗性肽或多肽可以选自文库或谱，其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽结合共同一般配体，结合共同靶配体，结合共同抗体（或由之结合），或具有共同催化活性。这类选择特别用于制备蛋白酶抗性肽或多肽的谱，其基于具有所需生物活性的亲本肽或多肽，例如当执行免疫球蛋白单个可变结构域的亲和力成熟时。

基于与共同一般配体的结合的选择可以获得包含所有或基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽集合或群体，所述肽或多肽是原始文库或谱的组分。例如，通过淘选或使用合适的亲和基质，可以选择、分离和/或回收结合靶配体或一般配体的肽或多肽，例如A蛋白、L蛋白或抗体。淘选可以这样完成：通过将配体（例如，一般配体、靶配体）溶液添加到合适容器（例如，管、培养皿），并且允许配体沉积或包被到容器的壁上。可以洗掉过量配体，并且可以将肽或多肽（例如，已与蛋白酶温育的谱）添加到容器中，并且使容器维持在适合于肽或多肽结合固定化配体的条件下。可以洗掉未结合的肽或多肽，并且使用任何合适的方法例如刮取或降低pH，可以回收结合的肽或多肽。

合适的配体亲和基质一般包含配体与之共价或非共价附着的固体支持体或珠（例如，琼脂糖）。在适合于肽或多肽与基质上的配体结合的条件下，使用分批过程、柱过程或任何其他合适过程，亲和基质可以与肽或多肽（例如，已与蛋白酶温育的谱）组合。可以洗掉不结合亲和基质的肽或多肽，并且可以使用任何合适方法洗脱且回收结合的肽或多肽，例如用较低pH的缓冲液洗脱、用温和的变性剂（例如，尿素）、或用与配体竞争结合的肽。在一个例子中，在适合于谱中的肽或多肽结合靶配体（VEGF）的条件下，使生物素化的靶配体与谱组合。使用固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白（例如，在珠上）回收结合的肽或多肽。

在一些实施方案中，一般配体是抗体或其抗原结合片段。结合肽或多肽的结构特征的抗体或抗原结合片段作为一般配体是特别有用的，所述结构特征在文库或谱的肽或多肽中基本上保守的。适合于用作配体用于分离、选择和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽的抗体和抗原结合片段可以是单克隆或多克隆的，并且可以使用任何合适的方法进行制备。

用于产生蛋白酶抗性多肽的核酸、宿主细胞和方法：

通过本文描述的方法选择的蛋白酶抗性肽或多肽还可以在合适的体外表达系统中，例如大肠杆菌（E.coli）或毕赤氏酵母属（Pichia）物种例如巴斯德毕赤氏酵母（P. pastoris），通过化学合成或通过任何其他合适方法产生。

多肽、dAbs和拮抗剂：

如本文描述的，蛋白酶抗性dAbs一般以高亲和力结合其靶配体。

例如，VEGF dAb可以以300 nM - 1 pM（即3 x 10^-7- 5 x 10^-12M）的亲和力（KD；KD=K_off（kd）/K_on（ka），如通过表面等离振子共振测定的）结合VEGF，例如50 nM - 1 pM、例如5 nM - 1 pM和例如1 nM - 1 pM；例如1 x 10^-7 M或更少、例如1 x 10^-8 M或更少、例如1 x 10^-9 M或更少、例如1 x 10^-10 M或更少和例如1 x 10^-11 M或更少的K_D；和/或5 x 10^-1 s^-1 - 1 x 10^-7s^-1、例如1 x 10^-2 s^-1 - 1 x 10^-6 s^-1、例如5 x 10^-3 s^-1 - 1 x 10^-5 s^-1、例如5 x 10^-1 s^-1或更少、例如1 x 10^-2 s^-1或更少、例如1 x 10^-3 s^-1或更少、例如1 x 10^-4 s^-1或更少、例如1 x 10^-5 s^-1或更少、和例如1 x 10^-6s^-1或更少的K_off速率常数，如通过表面等离振子共振测定的。

尽管我们不受任何具体理论束缚，但对蛋白酶抗性的肽和多肽被认为具有较低的熵和/或较高的稳定能量。因此，蛋白酶抗性和高亲和力结合之间的关联可以涉及肽和多肽表面与通过本文描述的方法选择的dAbs的紧密性和稳定性。

在一个实施方案中，VEGF dAb以约1 μM或更少、约500 nM或更少、约100 nM或更少、约75 nM或更少、约50 nM或更少、约10 nM或更少或约1 nM或更少的IC50的浓度50（IC50）抑制VEGF的结合。

在特定实施方案中，VEGF dAb特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以300 nM - 1pM、或300nM - 5pM、或50nM - 1pM、或50nM - 5pM、或50nM - 20 pM、或约10 pM、或约15pM、或约20pM的解离常数（K_D）与人VEGF解离，如通过表面等离振子共振测定的。在特定实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以5 x 10^-1 s^-1 - 1 x 10^-7s^-1、例如1 x 10^-2 s^-1 - 1 x 10^-6 s^-1、例如5 x 10^-3 s^-1 - 1 x 10^-5 s^-1、例如5 x 10^-1 s^-1或更少、例如1 x 10^-2 s^-1或更少、例如1 x 10^-3 s^-1或更少、例如1 x 10^-4 s^-1或更少、例如1 x 10^-5 s^-1或更少、和例如1 x 10^-6s^-1或更少的K_off速率常数与人VEGF解离，如通过表面等离振子共振测定的。

在特定实施方案中，VEGF dAb以1x10^-3 M^-1s^-1- 1x10^-7 M^-1s^-1、或1x10^-3 M^-1s^-1- 1x10^-6 M^-1s^-1、或约1x10^-4 M^-1s^-1、或约1x10^-5 M^-1s^-1的K_on特异性结合VEGF，例如人VEGF。在一个实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以如这个段落中限定的解离常数（K_D）和K_off与人VEGF解离。在一个实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂特异性结合VEGF，例如人VEGF，并且以如这个段落中限定的解离常数（K_D）和K_on与人VEGF解离。在一些实施方案中，多肽或dAb以如这个段落中所述的K_D和/或K_off和/或K_on特异性结合VEGF（例如人VEGF），并且包括与dAb的氨基酸序列至少或至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等同的氨基酸序列，所述dAb具有DOM15-26-593的氨基酸序列。

dAb可以在大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种（例如巴斯德毕赤氏酵母）中表达。在一个实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种（例如巴斯德毕赤氏酵母）中表达时，配体或dAb单体以至少约0.5 mg/L的量分泌。尽管当在大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种（例如巴斯德毕赤氏酵母）中表达时，本文描述的配体和dAb单体可以是可分泌的，但它们可以使用不采用大肠杆菌或毕赤氏酵母属物种的任何合适方法产生，例如合成化学方法或生物生产方法。

在一些实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂不包括骆驼科动物免疫球蛋白可变结构域，或由骆驼科动物种系抗体基因区段编码的免疫球蛋白可变结构域独特的一个或多个构架氨基酸，例如在位置108、37、44、45和/或47上。

VEGF的拮抗剂可以是单价或多价的。在一些实施方案中，拮抗剂是单价的，并且包含与VEGF相互作用的一个结合位点，所述结合位点由本发明的多肽或dAb提供。多价拮抗剂结合一个VEGF，并且可以不诱导VEGF在细胞表面上的交联或聚簇，这可以导致受体激活和信号转导。

可替代地，VEGF的拮抗剂是多价的。VEGF的多价拮抗剂可以包含关于VEGF的特定结合位点的2个或更多个拷贝，或包含结合VEGF的2种或更多种不同结合位点，至少一种结合位点由本发明的dAb提供。例如，如本文描述的，VEGF的拮抗剂可以是包括结合VEGF的dAb的2个或更多个拷贝，或结合VEGF的2种或更多种不同dAbs的二聚体、三聚体或多聚体。

在其他实施方案中，dAb以本文描述的K_D特异性结合VEGF，并且在标准鼠异种移植物模型中抑制肿瘤生长（例如，与合适对照相比较，使肿瘤生长抑制至少约10％）。在一个实施方案中，当以约1 mg/kg或更多例如约5或10 mg/kg施用时，与标准鼠异种移植物模型中的合适对照相比较，多肽、dAb或拮抗剂使肿瘤生长抑制至少约10％或至少约25％、或至少约50％。

在其他实施方案中，多肽、dAb或拮抗剂结合VEGF，并且在标准细胞测定中以≤ 100 nM的ND₅₀拮抗VEGF的活性。

在特定实施方案中，当施用有效量时，dAbs在眼疾病的动物模型中是有效的。一般地，有效量是约1 mg/kg - 约10 mg/kg（例如约1 mg/kg、约2 mg/kg、约3 mg/kg、约4 mg/kg、约5 mg/kg、约6 mg/kg、约7 mg/kg、约8 mg/kg、约9 mg/kg或约10 mg/kg）。dAb可以以例如每天一次或两次、每周一次或两次、每月一次或两次的给药频率施用。

一般地，dAbs将以纯化形式连同用于眼递送的药理学上合适的载体一起利用。一般地，这些载体可以包括水或醇/水溶液、乳状液或悬浮液、包括盐水和/或缓冲介质的任何一种。维持悬浮液中的多肽复合物所需的合适的生理学上可接受的佐剂，可以选自增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐。

还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体（Mack（1982）Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版）。可以使用多种合适制剂，包括延长释放制剂。这些可以包括植入体、凝胶、纳米颗粒（nanoparticle）和微粒。药物装载的PLA纳米颗粒和微粒已用于在制剂的结膜下递送后将药物递送给眼的后段（Kompella等人IOVS 2003 44（3）1192-1201）。具体地，小球体保留在递送部位，并且与可以更快速清除的纳米颗粒相比较，看起来更适合于视网膜药物递送（Amrite等人ARVO摘要 #5067/B391 2003）。

本发明的配体（例如，拮抗剂）可以作为分开施用的组合物或与其他试剂一起使用。这些可以包括用于眼递送给眼的各种药物和/或眼穿透增强剂和/或粘度增强剂。

药物组合物可以包括与本发明的配体一起的各种其他试剂的“混合物（cocktails）”，或甚至具有不同特异性的根据本发明的配体的组合，例如使用不同靶抗原或表位选择的配体，无论它们是否在施用前合并。

dAbs对于眼的施用的精确剂量和频率将依赖于患者的年龄、性别和状况，其他药物的同时施用，禁忌症和由临床医生考虑的其他参数。

本发明的dAbs可以冻干用于贮存且在使用前在合适载体中重构。这种技术已显示对于常规免疫球蛋白是有效的，并且可以采用领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将认识到冻干和重构可以导致不同程度的抗体活性丧失（例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体趋于具有比IgG抗体更大的活性丧失），并且使用水平可能必须向上调整以补偿。

包含本文的dAbs或其混合物的组合物可以施用用于预防和/或治疗处理。在特定治疗应用中，实现所选细胞群体的至少部分抑制、阻抑、调节、杀死或一些其他可测量参数的足够量可以被定义为“治疗有效剂量”。达到这个剂量所需的量将依赖于疾病的严重程度和患者的自身免疫系统的一般状态。有经验的临床医生将能够确定治疗、阻抑或预防疾病的合适给药时间间隔。

如果相对于治疗前存在的此种症状，或相对于未用此种组合物治疗的个体（人或模型动物）中的此种症状或其他合适对照，一种或多种症状减少（例如，在临床评估规模上至少10％或至少1个点），那么使用本文描述的组合物进行的治疗或疗法被视为“有效的”。症状将明显依赖于靶向的疾病或病症而改变，但可以通过普通有经验的临床医生或技术员进行测量。例如通过监控疾病或病症的一种或多种生物化学指示剂的水平（例如，与疾病相关的酶或代谢物的水平、受累细胞数目等），通过监控物理表现或通过公认的临床评估量表，可以测量此种症状。

类似地，如果相对于未用此种组合物治疗的相似个体（人或模型动物）中的此种症状，一种或多种症状的发作或严重程度延迟、减少或取消，那么使用如本文描述的组合物执行的预防是“有效的”。

在一个实施方案中，本发明是用于治疗、阻抑或预防眼疾病或状况的方法，所述眼疾病或状况选自例如癌症（例如实体瘤）、炎性疾病、自身免疫性疾病、血管增殖性疾病（例如AMD（年龄相关性黄斑变性）），所述方法包括给有此需要的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的根据本发明的多肽、与VEGF结合的dAb或VEGF的拮抗剂，或IL-1、或TNF-α或TNF-αR。此种眼疾病或状况的例子包括AMD、葡萄膜炎、干眼病、糖尿病性视网膜病和糖尿病性黄斑水肿。

形式：

增加的半衰期在免疫球蛋白的体内应用中是有用的，特别是抗体且最特别是小尺寸的抗体片段。此种片段（Fvs、二硫键键合的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs）可以遭受从身体快速清除的缺点；因此，虽然它们能够快速到达身体的大多数部分，并且快速生产且更易于处理，但它们的体内应用已受其在体内的仅短暂持续限制。因此，本文描述的dAbs可以进行修饰，以提供增加的体内半衰期和因此体内更长的持续时间。

用于药物代谢动力学分析和配体半衰期测定的方法将是本领域技术人员熟悉的。细节可以在Kenneth，A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists 和 Peters等人，Pharmacokinetic analysis：A Practical Approach（1996）中找到。还参考“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，published by Marcel Dekker，2^nd Rev. ex edition（1982），其描述了药物代谢动力学参数，例如tα和tβ半衰期和曲线下面积（AUC）。

半衰期（t? α和t? β）和AUC可以由配体血清浓度针对时间的曲线进行测定。WinNonlin分析包（可从Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA获得）可以例如用于给曲线建模。在第一个相（α相）中，配体经历在患者中的主要分布，伴随一些消除。第二个相（β相）是终末相，那时配体已分布且血清浓度随着配体从患者中清除而减少。tα半衰期是第一个相的半衰期，并且tβ半衰期是第二个相的半衰期。因此，在一个实施方案中，本发明提供了配体或包括根据本发明的配体的组合物，所述配体具有在15分钟或更多的范围中的tα半衰期。在一个实施方案中，范围的下端是30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物将具有在最高达且包括12小时的范围中的tα半衰期。在一个实施方案中，范围的上端是11、10、9、8、7、6或5小时。合适范围的例子是1 - 6小时、2 - 5小时或3 - 4小时。

在一个实施方案中，dAb或包括根据本发明的dAb的组合物具有在30分钟或更多的范围中的tβ半衰期。在一个实施方案中，范围的下端是45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物具有在最高达且包括21天的范围中的tβ半衰期。在一个实施方案中，范围的上端是12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天或20天。在一个实施方案中，根据本发明的配体或组合物将具有在12 - 60小时的范围中的tβ半衰期。在进一步的实施方案中，它将在12 - 48小时的范围中。在再一个进一步的实施方案中，它将在12 - 26小时的范围中。

对于上述标准另外或可替代地，本发明提供了dAb或包括根据本发明的配体的组合物，所述配体具有在1 mg.分钟/ml或更多的范围中的AUC值（曲线下面积）。在一个实施方案中，范围的下端是5、10、15、20、30、100、200或300 mg.分钟/ml。此外或可替代地，根据本发明的配体或组合物具有在最高达600 mg.分钟/ml的范围中的AUC。在一个实施方案中，范围的上端是500、400、300、200、150、100、75或50 mg.分钟/ml。在一个实施方案中，根据本发明的配体将具有在选自下述的范围中的AUC：15 - 150 mg.分钟/ml、15 - 100 mg.分钟/ml、15 - 75 mg.分钟/ml、和15 - 50mg.分钟/ml。

本发明的dAbs可以格式化为具有较大的流体动力学大小，例如通过附着PEG基团、血清清蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与抗体结构域缀合。例如，dAbs可以格式化为抗体的较大抗原结合片段或抗体（例如，格式化为Fab、Fab’、F（ab）₂、F（ab’）₂、IgG、scFv）。在另一个实施方案中，根据本发明的dAbs可以格式化为具有另一种多肽或肽的融合物或缀合物。

本发明的配体（例如，dAb单体和多聚体）的流体动力学大小可以使用本领域众所周知的方法进行测定。例如，凝胶过滤层析可以用于测定配体的流体动力学大小。用于测定配体的流体动力学大小的合适凝胶过滤基质例如交联琼脂糖基质是众所周知且可容易获得的。

配体即dAb形式的大小（例如，与dAb单体附着的PEG部分的大小）可以依赖于所需应用而改变，例如如果需要dAb保留在体循环中更长时间段，那么可以例如通过格式化为Ig样蛋白质来增加大小。

通过靶向增加体内半衰期的抗原或表位的半衰期延长

配体的流体动力学大小及其血清半衰期还可以通过使dAb与结合结构域（例如，抗体或抗体片段）缀合或结合得到增加，所述结合结构域结合增加体内半衰期的抗原或表位，如本文描述的。例如，VEGF dAb可以与抗血清清蛋白或抗新生Fc受体抗体或抗体片段缀合或连接，例如抗SA或抗新生Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv，或与抗SA亲和体或抗新生Fc受体亲和体或抗SA avimer、或抗SA结合结构域缀合或连接，其包括选自但优选不限于下述的支架：CTLA-4、脂质运载蛋白（lipocallin）、SpA、亲和体、avimer、GroEl和纤连蛋白（关于这些结合结构域的公开内容，参见于2008年2月8日提交的PCT/GB2008/000453，所述结构域及其序列引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分）。缀合指包括与结合结构域键合（共价或非共价）的本发明的多肽、dAb或拮抗剂的组合物，所述结合结构域结合血清清蛋白。

增强体内血清半衰期的合适多肽包括例如运铁蛋白受体特异性配体-神经药物试剂融合蛋白质（参见美国专利号5,977,307，其教导引入本文作为参考）、脑毛细血管内皮细胞受体、运铁蛋白、运铁蛋白受体（例如，可溶性运铁蛋白受体）、胰岛素、胰岛素样生长因子1（IGF 1）受体、胰岛素样生长因子2（IGF 2）受体、胰岛素受体、凝血因子X、αl-抗胰蛋白酶和HNF 1α。增强血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白（血清类粘蛋白；AAG）、α-1抗胰凝乳蛋白酶（ACT）、α-1微球蛋白（蛋白质HC；AIM）、抗凝血酶III（AT III）、脱脂载脂蛋白A-1（Apo A-1）、脱脂载脂蛋白B（Apo B）、血浆铜蓝蛋白（Cp）、补体成分C3（C3）、补体成分C4（C4）、C1酯酶抑制剂（C1 INH）、C反应蛋白（CRP）、铁蛋白（FER）、血红素结合蛋白（HPX）、脂蛋白（a）（Lp（a））、甘露糖结合蛋白（MBP）、肌红蛋白（Myo）、前清蛋白（运甲状腺素蛋白；PAL）、视黄醇结合蛋白（RBP）和类风湿因子（RF）。

来自细胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原是细胞外基质的主要蛋白质。约15种类型的胶原分子是目前已知的，在身体的不同部分中发现，例如在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现的I型胶原（占90％的身体胶原），或在软骨、脊椎盘、脊索和眼的玻璃体液中发现的II型胶原。

来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白质（例如，血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清清蛋白、纤维蛋白原（例如，纤维蛋白原A、纤维蛋白原B）、血清淀粉状蛋白A蛋白、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白和β-2-微球蛋白）、酶和酶抑制剂（例如，纤溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂）、免疫系统的蛋白质例如免疫球蛋白蛋白质（例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链（κ/λ））、转运蛋白（例如，视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白）、防卫素（例如，β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素2和嗜中性粒细胞防卫素3）等。

在血脑屏障处或在神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸盐转运蛋白等。

增强体内血清半衰期的合适多肽还包括定位至肾的蛋白质（例如，多囊蛋白、IV型胶原、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann氏抗原）、定位至肝的蛋白质（例如，醇脱氢酶、G250）、定位至肺的蛋白质（例如，分泌成分，其结合IgA）、定位至心脏的蛋白质（例如，HSP 27，其与扩张型心肌病相关）、定位至皮肤的蛋白质（例如，角蛋白）、骨特异性蛋白质例如形态发生蛋白质（BMPs），其是显示生骨活性的蛋白质的转化生长因子β超家族亚群（例如，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8）、肿瘤特异性蛋白质（例如，滋养层抗原、赫赛汀（herceptin）受体、雌激素受体、组织蛋白酶（例如，组织蛋白酶B，其可以在肝和脾中发现））。

合适的疾病特异性蛋白质包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原，包括LAG-3（淋巴细胞活化基因）、护骨蛋白配体（OPGL；参见Nature 402，304-309（1999））、OX40（TNF受体家族成员，在活化T细胞上表达且在人T细胞白血病病毒I型（HTLV-I）生产细胞中特异性上调；参见Immunol. 165（1）:263-70（2000））。合适的疾病特异性蛋白质还包括例如金属蛋白酶（与关节炎/癌症相关），包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH；和生血管生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子（FGF-1）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）、血管内皮生长因子/血管通透因子（VEGF/VPF）、转化生长因子-α（TGF α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血管生成素、白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-8（IL-8）、血小板衍生内皮生长因子（PD-ECGF）、胎盘生长因子（P1GF）、中期因子（midkine）血小板衍生生长因子-BB（PDGF）、和CXXXC趋化因子（fractalkine）。

增强体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白质例如热休克蛋白（HSPs）。HSPs通常在细胞内发现。当它们在细胞外发现时，它是细胞已死亡且溢出其内容物的指示剂。当由于创伤、疾病或损伤，细胞外HSPs触发来自免疫系统的应答时，这种非程序性细胞死亡（坏死）发生。与细胞外HSP结合可以导致本发明的组合物定位至疾病部位。

与及Fc转运有关的合适蛋白质包括例如Brambell受体（也称为FcRB）。这种Fc受体具有2种功能，这两者对于递送都潜在有用。功能是（1）IgG从母亲跨越胎盘转运到孩子，（2）保护IgG不受降解，从而延长其血清半衰期。认为受体使来自内体的IgG再循环。（参见，Holliger等人，Nat Biotechnol 15（7）:632-6（1997）.）

结合血清清蛋白的dAbs

在一个实施方案中，本发明与眼靶分子例如VEGF、IL-1或TNF-α结合的第一种dAb，和结合血清清蛋白（SA）的第二种dAb，如通过表面等离振子共振测定的，所述第二种dAb以1nM - 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400或500 μ M（即x 10^-9 - 5 x 10^-4），或100 nM - 10 μ M，或1 - 5 μ M，或3 - 70 nM，或10nM - 1、2、3、4或5μ M的K_D结合SA。例如，如通过表面等离振子共振测定的30 - 70 nM。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测定的，第一种dAb（或dAb单体）以约1、50、70、100、150、200、300 nM或1、2或3 μ M的K_D结合SA（例如HSA）。在一个实施方案中，对于包括第一种抗SA dAb和针对VEGF的第二种dAb的双重特异性配体，第二种dAb对于其靶的亲和力（例如，如通过表面等离振子共振测量的K_D和/或K_off，例如使用BiaCore）是第一种dAb对于SA的亲和力的1 - 100000倍（例如100 - 100000、或1000 - 100000、或10000 - 100000倍）。在一个实施方案中，血清清蛋白是人血清清蛋白（HSA）。例如，第一种dAb以约10 μM的亲和力结合SA，而第二种dAb以100 pM的亲和力结合其靶。在一个实施方案中，血清清蛋白是人血清清蛋白（HSA）。在一个实施方案中，第一种dAb以约50，例如70、100、150或200 nM的K_D结合SA（例如HSA）。双重特异性配体的细节在WO03002609、WO04003019 和WO04058821中找到。

在一个实施方案中，本发明的dAbs可以包括dAb，如通过表面等离振子共振测定的，所述dAb以1nM - 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400或500 μ M（即x 10-9 - 5 x 10-4），或100 nM - 10 μ M，或1 - 5 μ M，或3 - 70 nM，或10nM - 1、2、3、4或5μ M的K_D结合血清清蛋白（SA）。例如，如通过表面等离振子共振测定的30 - 70 nM。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测定的，第一种dAb（或dAb单体）以约1、50、70、100、150、200、300 nM或1、2或3 μ M的K_D结合SA（例如HSA）。在一个实施方案中，第一种和第二种dAbs通过接头连接，例如1-4个氨基酸或1-3个氨基酸，或超过3个氨基酸或超过4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的接头。在一个实施方案中，较长接头（超过3个氨基酸）用于增强效价（拮抗剂中的一种或两种dAbs的K_D）。

在特定实施方案中，dAb结合人血清清蛋白且与选自下述的dAb竞争与清蛋白的结合

MSA-16、MSA-26（关于这些序列的公开内容参见WO04003019，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分），

（关于这些序列的公开内容参见WO2007080392，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分；这个段落中的SEQ ID No’s是WO2007080392中出现的那些），

（关于这些序列的公开内容参见于2008年2月8日提交且作为WO 2008/096158公开的PCT/GB2008/000453，所述序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分）。备选名称显示于dAb后的括号中，例如dAb8具有其为dAb10的备选名称，即dAb8（dAb10）。

在特定实施方案中，dAb结合人血清清蛋白，并且包括与选自下述的dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列

。

例如，结合人血清清蛋白的dAb可以包括与下述具有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：

。

。

在更特定的实施方案中，dAb是Vκ dAb，其结合人血清清蛋白，并且具有选自下述的氨基酸序列

DOM7h-2（SEQ ID NO:482）、DOM7h-6（SEQ ID NO:485）、DOM7h-1（SEQ ID NO:486）、DOM7h-7（SEQ ID NO:487）、DOM7h-8（SEQ ID NO:496）（这个段落中的SEQ ID No’s是WO2007080392中出现的那些），

dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13和dAb7h14。

在更特定的实施方案中，dAb是V_H dAb，其结合人血清清蛋白，并且具有选自dAb7h30和dAb7h31的氨基酸序列。

在更特定的实施方案中，dAb是dAb7h11或dAb7h14。

在其他实施方案中，dAb、配体或拮抗剂结合人血清清蛋白，并且包括任何前述氨基酸序列的一个、两个或三个CDRs，例如dAb7h11或dAb7h14的一个、两个或三个CDRs。

结合血清清蛋白的合适骆驼科物种V_HH包括WO 2004/041862（Ablynx N.V.）和WO2007080392中公开的那些（所述V_HH序列及其核酸配对物引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分），例如序列A（SEQ ID NO:518）、序列B（SEQ ID NO:519）、序列C（SEQ ID NO:520）、序列D（SEQ ID NO:521）、序列E（SEQ ID NO:522）、序列F（SEQ ID NO:523）、序列G（SEQ ID NO:524）、序列H（SEQ ID NO:525）、序列I（SEQ ID NO:526）、序列J（SEQ ID NO:527）、序列K（SEQ ID NO:528）、序列L（SEQ ID NO:529）、序列M（SEQ ID NO:530）、序列N（SEQ ID NO:531）、序列O（SEQ ID NO:532）、序列P（SEQ ID NO:533）、序列Q（SEQ ID NO:534），这些序列编号与WO2007080392 或WO 2004/041862（Ablynx N.V.）中引用的那些对应。在特定实施方案中，骆驼科物种V_HH结合人血清清蛋白，并且包括与WO2007080392中公开的ALB1或SEQ ID NOS:518-534中的任何一个具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，这些序列编号与WO2007080392 或WO 2004/041862中引用的那些对应。

在一某些实施方案中，dAb组合物包括与本文公开的任何抗血清清蛋白dAb竞争结合血清清蛋白（例如人血清清蛋白）的抗血清清蛋白dAb。

与半衰期延长部分（例如，清蛋白）缀合

在一个实施方案中，（一个或多个）半衰期延长部分（例如，清蛋白、运铁蛋白及其片段和类似物）与VEGF结合（或IL-1、或TNF-α结合或TNF-αR结合）dAb缀合或结合。用于在VEGF（或IL-1、或TNF-α 或TNF-αR）结合形式中使用的合适清蛋白、清蛋白片段或清蛋白变体的例子在WO 2005077042中描述，其公开内容引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分。特别地，下述清蛋白、清蛋白片段或清蛋白变体可以在本发明中使用：

· SEQ ID NO:1（如WO 2005077042中公开的，这个序列明确引入本公开内容作为参考）；

· 包括WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸1-387或由WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸1-387组成的清蛋白片段或变体；

· 包括选自下述的氨基酸序列的清蛋白、或其片段或变体：（a）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸54 - 61；（b）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸76 - 89；（c）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸92 - 100；（d）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸170 - 176；（e）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸247 - 252；（f）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸266 - 277；（g）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸280 - 288；（h）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸362 - 368；（i）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸439 - 447；（j）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸462 - 475；（k）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸478 - 486；和（l）WO 2005077042中的SEQ ID NO:1的氨基酸560 - 566。

用于以VEGF结合形式使用的合适清蛋白、片段和类似物的进一步例子在WO 03076567中描述，其公开内容引入本文作为参考且构成本文正文的公开内容的部分。特别地，下述清蛋白、片段或变体可以在本发明中使用：

· 如 WO 03076567中例如在图3中描述的人血清清蛋白（这个序列信息明确引入本公开内容作为参考）；

· 由具有式分子量66,500的585个氨基酸的单条非糖基化多肽链组成的人血清清蛋白（HA）（参见，Meloun,等人，FEBS Letters 58:136（1975）；Behrens,等人，Fed. Proc. 34:591（1975）；Lawn,等人，Nucleic Acids Research 9:6102-6114（1981）；Minghetti,等人，J. Biol. Chem. 261:6747（1986））；

· 如Weitkamp,等人，Ann. Hum. Genet. 37:219（1973）中描述的清蛋白的多态变体或类似物或片段；

· 如EP 322094中描述的清蛋白片段或变体，例如HA（1-373.、HA（1-388）、HA（1-389）、HA（1-369）和HA（1-419）和在1-369和1-419之间的片段；

· 如EP 399666中描述的清蛋白片段或变体，例如HA（1-177）和HA（1-200）和在HA（1-X）之间的片段，其中X是从178到199的任何数目。

当（一个或多个）半衰期延长部分（例如，清蛋白、运铁蛋白及其片段和类似物）用于格式化本发明的dAbs时，它可以使用任何合适方法进行缀合，例如通过直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中所述融合蛋白作为具有位于dAb的N或C末端的半衰期延长部分的单条多肽链编码。可替代地，缀合可以通过使用部分之间的肽接头来达到，例如如WO 03076567或WO 2004003019中描述的肽接头（这些接头公开内容引入本公开内容作为参考，以提供用于在本发明中使用的例子）。一般地，增强体内血清半衰期的多肽是这样的多肽，其在体内天然存在并且抵抗通过内源机制的降解或去除，所述内源机制去除来自生物（例如，人）的不希望有的材料。例如，增强体内血清半衰期的多肽可以选自来自细胞外基质的蛋白质，在血液中发现的蛋白质，在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白质，定位至肾、肝、肺、心脏、皮肤或骨的蛋白质，应激蛋白质，疾病特异性蛋白质或与Fc转运有关的蛋白质。

本发明的dAbs可以格式化为包含与第二种免疫球蛋白单个可变结构域直接融合的第一种免疫球蛋白单个可变结构域的融合蛋白。若需要，则此种格式化可以进一步包括半衰期延长部分。例如，配体可以包括与与第二种免疫球蛋白单个可变结构域直接融合的第一种免疫球蛋白单个可变结构域，所述第二种免疫球蛋白单个可变结构域与结合血清清蛋白的免疫球蛋白单个可变结构域直接融合。

一般地，具有对于靶具有结合特异性的结合位点的多肽结构域的定向，和配体是否包括接头，是设计选择的问题。然而，一些定向连同或不连同接头，可以提供比其他定向更好的结合特征。由本发明包含的所有定向（例如，dAb1-接头- dAb2；dAb2-接头- dAb1）是包含提供所需结合特征的定向的配体，可以通过筛选容易地鉴定。

根据本发明的dAbs包括dAb单体、二聚体和三聚体，可以与抗体Fc区连接，包括C_H2和C_H3结构域中的一个或两个，和任选地铰链区。例如，编码作为单个核苷酸序列与Fc区连接的配体的载体可以用于制备此种多肽。

在本发明的一个实施方案中，dAbs可以由密码子最优化的核苷酸序列编码，例如对于由巴斯德毕赤氏酵母或大肠杆菌表达最优化，例如如WO2008149147中描述的。

例证

实施例1：

DOM15-26-593（myc标记的抗VEGF dAb）对于兔的眼的局部递送：

DOM 15-26-593可以如WO2008149147中所述进行选择且制备，并且具有图1a中所示的氨基酸序列（SEQ ID NO 1）。

Myc标记的DOM15-26-593（具有图1a中所示的氨基酸序列（SEQ ID NO 1）的Dom 15-26-593 dAb在这个实验中作为c-myc-标记的抗VEGF dAb制备且使用）作为无内毒素制剂以在50 mM乙酸钠缓冲液（pH 7.0）中配制的2 mg/ml浓度制备，所述乙酸钠缓冲液补加有104 mM氯化钠、0.02％（w/v）Tween 80、0.5％（w/v）癸酸钠和0.3％或1.5％（w/v）羟丙基甲基纤维素（HPMC）。成年Chinchilla Bastard兔得自Charles River，德国。在使用前允许动物适应新环境。在4小时时间段期间每20分钟用50微升2 mg/ml抗VEGF dAb溶液，对6只雌兔的左眼进行给药。每个剂量置于结膜下囊中。3只兔接受在0.3％HPMC中配制的抗VEGF dAb，并且3只用在1.5％HPMC中配制的药物。最后一次给药后2小时挑选动物。尽可能接近于已证实安乐死的时间，摘出来自每只动物的双眼。每只眼在PBS中洗涤，以去除来自表面的任何过量药物。收集房水和玻璃体液的样品且在分析前冷冻贮存（-20℃）。使用夹心ELISA测定就存在的DOM15-26-593（抗VEGF-dAb）浓度测试房水和玻璃体液的样品，其中dAb捕获在重组人VEGF蛋白质包被的板上，并且使用对于c-myc标记具有特异性的抗体检测。

如下执行上文描述的VEGF dAb ELISA测定：

测定使用包被在Immunsorb板（得自Nunc）表面上的重组人VEGF（rVEGF，得自R&D Systems），以捕获VEGF dAb。洗涤板以去除任何未结合的dAb。随后使用针对VEGF dAb的Myc标记的抗体（得自Sigma）检测结合的dAb。通过洗涤去除过量抗体，并且使用抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物（Sigma）检测结合的抗myc抗体。使用TMB溶液使测定显色并且使用酸停止。来自测定的信号与dAb的量成比例。如下概括测定中的阶段：

包被板：

1. 制备0.25μg/mL的足够rVEGF以包被板（5 ml用于每块ELISA板）。这对于每块板通过下述完成：将25 μL原液VEGF添加到5 mL碳酸盐包被缓冲液（0.2M碳酸钠-碳酸氢钠包被缓冲溶液pH 9.4（Pierce，目录号：28382））且通过倒置混合。

2. 使用多道移液管，将50μL rVEGF（0.25μg/mL）溶液添加到Immunsorb 96孔ELISA板的每个孔中。

3. 用塑料盖覆盖板，并且在4℃贮存约42小时。

洗涤且封闭板：

4. 从4℃贮存取出板

5. 每块板用PBS+0.1％Tween 20洗涤6次。

6. 将100μL测定封闭缓冲液（1％BSA/PBS）添加到每块板的所有孔中。

7. 板在室温伴随搅动温育1小时。

样品和标准的制备：

8. 在板封闭时，在测定稀释剂（0.1％BSA/0.05％Tween20/PBS）中稀释标准和样品。使标准（参考材料即Dom15-26-593）连续（10倍）稀释，以产生对数稀释曲线。

样品添加：

9. 洗涤封闭的板（如上文6中）。

10. 将50μl稀释的样品或标准添加到合适孔中。将50 μl/孔测定稀释剂添加到孔中，以充当阴性对照。

11. 板在室温伴随搅动温育2小时。

12. 板洗涤6次并且吸干（如上文6中）。

13. 将1:500稀释的（在测定稀释剂中：0.1％BSA/0.05％Tween20/PBS）50μL抗myc抗体（9E10 Sigma M5546）添加到所有孔中（即，对于每块板将10μL抗myc抗体（9E10）添加到5 ml测定稀释剂中）。

14. 板在振荡器上在室温温育至少1小时。

15. 板洗涤6次并且吸干（如上文6中）。

16. 将1:10000的50μL抗小鼠Ig HRP（Sigma A9309）添加到所有孔中。（即，通过将5μL抗小鼠Ig HRP抗体添加到45μL测定稀释剂（0.1％BSA/0.05％Tween20/PBS）中1:10稀释原液抗体）。对于每块板，将5 μL 1:10稀释的原液添加到5ml测定稀释剂中。

17. 板在振荡器上在室温温育至少1小时。

18. 板洗涤6次并且吸干（如上文6中）。

19. 将50μL TMB底物添加到所有孔中。因为这种测定的显色非常快速，所以每次将TMB添加到不超过3块板是可取的。TMB可以直接来自冰箱或在室温使用。

20. 通过将50μL 1M HCl添加到每个孔中停止反应（一旦足够颜色已显色）。

21. 在96孔板阅读器上在450nm阅读板。

结果：

结果显示于表1中。

给药方案是良好耐受的，没有观察到发红、刺激或异常动物行为的病征。为研究得自经处理和对侧（未经处理）的眼的玻璃体液和房水样品中存在的抗VEGF dAb（DOM15-26-593）水平执行的ELISA测定的结果，显示检测出的大多数dAb存在于经处理的眼的玻璃体液中。在玻璃体液中具有最高浓度的兔（动物3）也具有经处理的眼的房水中存在的可检测水平的抗VEGF dAb。

观察到在1.5％HPMC中配制的dAb（其是更粘稠的溶液）看起来在每次给药后比更流动的含0.3％HPMC制剂更有效地保留在眼中。用较低HPMC浓度给药的兔看起来通过将其眨眼挤出丧失一些后来给药的材料。

表1：来自局部处理和对侧的眼的玻璃体液和房水中存在的抗VEGF dAb（DOM15-26-593）浓度。处理由施用到结膜下囊的12次给药组成（各自由50 μL体积的2 mg/ml溶液组成）（在4小时时间段期间每20分钟）

ND* = 未检测出（</= 2 ng/ml）

结论：

抗VEGF dAb的剂量置于结膜囊中。预期一些dAb可以穿透通过角膜且随后将在房水中检测出。令人惊讶的是，检测出的大多数抗VEGF dAb存在于玻璃体液中，并且这个观察与通过从眶扩散经过巩膜和脉络膜以进入后房而进入眼的抗VEGF dAb一致。

羟丙基纤维素（HPMC）已作为粘度增强剂包括在制剂中。1.5％制剂看起来更有效地保留在经处理的眼中。更流动的0.3％制剂保留较不良好，并且这可以促成在这个组中的3只兔的2只中观察到的抗VEGF dAb移动至对侧的眼。

实施例2：

在玻璃体内施用于兔的眼后，DOM15-26-593的药物代谢动力学：

执行实验以研究抗VEGF免疫球蛋白单个可变结构域抗体（抗VEGF dAb）DOM15-26-593在DOM15-26-593直接注射到玻璃体液内后保留在眼中的持续时间。制备具有图1a中所示的氨基酸序列（SEQ ID NO 1）的Dom 15-26-593 dAb（在补加有104 mM氯化钠、0.02％（w/v）Tween 80的50 mM乙酸钠缓冲液（pH 7.0）中配制的2 mg/ml浓度），并且在这个实验中用作c-myc标记的抗VEGF dAb。成年Chinchilla Bastard兔得自Charles River，德国。在使用前允许动物适应新环境。使每只兔麻醉，并且将10微升c-myc标记的抗VEGF dAb（DOM15-26-593）的2 mg/ml溶液（如实施例1中所述制备的溶液）（总共20 μg）直接注射到左眼的玻璃体液内。在注射后的各个时间（2、24和30小时），对兔实施安死术，并且摘出双眼，并且收集房水和玻璃体液的样品。这些样品在分析前冷冻贮存（-20℃）。使用夹心ELISA测定就存在的DOM15-26-593浓度测试房水和玻璃体液的样品，其中dAb捕获在重组VEGF蛋白质包被的板上，并且使用对于c-myc标记具有特异性的抗体检测。

结果：

DOM15-26-593（抗VEGF dAb）浓度显示于下表2中：

表2：来自玻璃体内给药和对侧的眼的玻璃体液和房水中存在的抗VEGF dAb（DOM15-26-593）浓度。处理由单次玻璃体内注射（10 μL 2 mg/ml溶液）至左眼组成 – 允许兔从麻醉恢复，并且在给药后2、24和30小时挑选。

ND* = 未检测出（< 0.1 ng/ml）

浓度舍入至2个小数位。

结论：

实验的结果指出DOM15-26-593的浓度在给药后24小时时维持在接近于注射浓度的水平下。结构域抗体在给药后24和30小时时存在于玻璃体液中。

在一些经处理的眼的房水中检测出低浓度的DOM15-26-593（抗VEGF dAb）。然而，存在DOM15-26-593至对侧未经处理的眼的最低限度转移。

实施例3：

兔激光诱导的脉络膜新生血管形成（CNV）模型：

在5只2-4个月大的雌性Dark Agouti（DA）大鼠组中单侧诱导实验性脉络膜新生血管形成（CNV）。激光光凝术（PC）用于使被麻醉的大鼠的玻璃（Bruch’s）膜破裂。使用与狭缝灯眼底镜附着的二极管泵浦、532 nm氩激光器（Novus Omni，Coherent Inc.，Santa Clara，CA）执行染料激光PC，并且手提式平凹接触透镜（Moorfields Eye hospital，London，UK）应用于角膜以中和眼能力。在每只实验动物的单个眼中造成5处损害（532 nm，150 mW，0.2秒，200 μm直径）。以500μm半径以集中于视神经且避开大脉管的视乳头周围分布和标准化的方式造成损害。激光伤的形态终点鉴定为空化气泡的暂时出现，与玻璃膜破坏相关的病征。未导致气泡形成的激光点被从分析排除。在激光CNV诱导后，每只动物立即用5μL体积进行玻璃体内给药（集中于视盘）。（选择这个体积是因为计算出存在覆盖其中已造成损害的视网膜区域的足够体积）。dAb在补加有104 mM氯化钠、0.02％（w/v）Tween 80）的50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.5）中配制为2 mg/ml浓度。5μL体积包含50 μg抗VEGF dAb（DOM15-26-593；具有图1a中所示的氨基酸序列；SEQ ID NO 1）、50 μg抗VEGF DOM15-26-593-Fc融合物（具有图1b中所示的氨基酸序列；SEQ ID NO 2）（或无化合物（仅载体，阴性对照）。在损害生成和注射后7和14天时，使用共焦高分辨率SLO荧光素血管造影术（0.2ml 10％腹内注射的荧光素钠，FS）和OCT（Heidelberg Spectralis，Heidelberg，德国）生成CNV和相关渗漏的体内图像数据。在FS注射前获得基线反射度（在488nm和790nm下）和自身荧光（ex. 488nm，em. >498nm）图像，以帮助定位荧光素血管造影图像中的损伤。在FS注射后立即记录动-静脉相。其后在注射后1分钟并且再次在注射后4分钟记录荧光素血管造影照片。通过晚期荧光素血管造影术的半定量评估来评价药物处理的作用。渗漏定义为在晚期血管造影照片中随着时间过去大小增加的强荧光损害的存在。晚期荧光素血管造影术中染色的强度和区域通过2个检查者以掩蔽方式（masked fasion）进行分级。当对于特定损害给出的2个得分不一致时，较高得分用于分析。在分析的<10％损害中观察到此种差异评分，并且差异从不超过1个级别。研究以掩蔽方式执行，并且物质仅在所有数据已收集的情况下才揭露。

结果：

结果显示于下表3中。

在使用激光灼伤对大鼠视网膜诱导脉络膜新生血管形成（CNV）后7和14天时，荧光素血管造影术用于观察每个损害。损害如下分级：0级 = 无渗漏，1级 = 小渗漏，2级 = 中等渗漏，和3级 = 大渗漏。关于用抗血管内皮生长因子结构域抗体（抗VEGF dAb，DOM15-26-593）、DOM15-26-593-FC融合物玻璃体内处理的大鼠组和阴性对照载体给药组的结果在下文制表。结果指出与对照（假处理的）大鼠相比较，用抗VEGF dAb（DOM15-26-593）或DOM15-26-593-FC融合物处理减少新生血管形成和渗漏程度。

表3：在通过光凝术诱导后7和14时在大鼠眼中的CNV损害评分。

** = 在2个时间点时的数据在统计学上显著不同于对照（P < 0.05）

结论：

结果指出DOM15-26-593 –Fc融合物,（抗VEGF dAb-Fc）在大鼠模型中是有效的，其中通过荧光素血管造影术表征通过RPE-脉络膜的激光光凝术诱导的实验性脉络膜新生血管形成（CNV）。在7和14天时，关于DOM15-26-593 –Fc融合物的结果显著优于对照载体给药组。这个组看起来保留比抗VEGF dAb（DOM15-26-593）组略微更多的活性。然而，抗VEGF dAb（DOM15-26-593）也是有效的（在激光诱导的损伤后7和14天时显著优于对照）。

这些结果指出抗VEGF dAb（DOM15-26-593）和抗VEGF dAb-Fc在实验性大鼠CNV模型中是有效的。在眼疾病的体内啮齿类动物模型中的这种功效证实指出结构域抗体在年龄相关性黄斑变性（AMD）中的脉络膜新生血管形成治疗中可能是有利的。

实施例4：

抗TNF-α抗体、Fc格式化抗VEGF dAb、加入聚乙二醇的抗IL-1 dAb和抗IL-1 dAb局部递送给兔：

方法

雌性、成年Chinchilla Bastard兔得自Charles River，德国。在使用前允许动物适应新环境。在给药开始前5天从每只兔的边缘耳静脉中收集血样。允许血液在室温凝结且离心（12000 rpm/2分钟）以分离血清。将血清转移至新鲜管且冷冻贮存（-20℃）。

在20 mM琥珀酸盐、5％山梨糖醇，pH 6.0中分别以8.5和10.4 mg/ml配制裸形式（DOM4-130-54；IL-1裸dAb，12.026 kDa；具有图3中所示的氨基酸序列；SEQ ID NO 5）或加入聚乙二醇的形式（DOM0400PEG；IL-1 加入聚乙二醇的dAb，52.032 kDa；具有图2中所示的氨基酸序列；SEQ ID NO 4）的对于IL-1具有特异性的结构域抗体（dAbs）。在50 mM磷酸盐、1％L-精氨酸、0.05 mM EDTA.0.02％聚山梨醇酯和0.3％NaCl pH 7.0中以9.1 mg/ml配制Fc格式化的α-VEGF dAb（VEGF 15-26-593，具有图1b中所示的氨基酸序列；SEQ ID NO 2）。使用无菌蒸馏水以10 mg/ml由冷冻干燥制剂重构对于TNF-α具有特异性的单克隆抗体（商购可得的）。4只兔的组的左眼在4.2天的时间段期间每天给药5次（以3小时时间间隔）。在每个给药日之间允许动物12小时的休息时间段（过夜）。每个剂量由置于上眼睑下的25微升相关化合物溶液组成。动物在给药后保持静止不动至少30秒。在给药方案前的各个时间和在给药方案过程中，通过将小吸收剂纸条置于眼睑下以吸收一些流体来收集泪（眼泪）液样品。由眼泪流体浸渗的纸区域置于包含200 μL磷酸缓冲盐水的管内。使管离心（12000 rpm/2分钟），取出纸，并且在分析前将回收的样品冷冻贮存（-20℃）。

最后一次给药后1小时，从每只兔的边缘耳静脉中收集血样。允许血液凝结，从而使得可以通过上文描述的方法分离且贮存血清。其后立即对动物实施安死术。尽可能接近于已证实安乐死的时间，摘出来自每只动物的双眼。每只眼在PBS中洗涤，以去除来自表面的任何过量药物。收集房水和玻璃体液的样品且在分析前冷冻贮存（-20℃）。在测定中测试前，对玻璃体液实施单个冷冻/融化循环。将眼解剖并且收集视网膜/脉络膜。将视网膜/脉络膜样品称重，并且将100微升裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.4；0.1％SDS；具有蛋白酶抑制剂混合物，（Roche））添加到各15 mg视网膜/脉络膜组织中。使用重复高和低频率裂解的2分钟循环，使用超声破裂（Covaris S2 Sonolab Single）使样品匀浆。使视网膜/脉络膜样品在微量离心机（microfuge）（Heraeus）中离心（12000 rpm/2分钟）。将上清液转移至新鲜管且冷冻贮存（-20℃）。

使用夹心形式ELISA测定测试且测量每种样品的药物含量。使用由重组人TNF-α蛋白质（Peprotech）包被的板捕获α-TNF-α抗体，并且使用碱性磷酸酶缀合的抗人IgG（Fc特异性）抗体（Sigma）检测。使用由重组人IL-1受体1型Fc（Axxora）包被的板捕获IL-1和加入聚乙二醇的IL-1 dAbs，并且使用蛋白质L-过氧化物酶（Sigma）检测。使用重组VEGF蛋白质的内部制剂捕获VEGF-Fc格式化的dAb，并且用抗人IgG（Fc特异性）碱性磷酸酶缀合的抗体（Sigma）检测。

结果

在所有情况下，药物给药都是良好耐受的，没有发红、刺激或异常动物行为的病征。

在房水和玻璃体液以及视网膜/脉络膜中各种形式的结构域抗体和α-TNF-α抗体的结果显示于下表中。显示了关于平均浓度（来自3次独立测定，其中每种样品一式三份地进行测试）+/-标准差（在括号中显示）的结果

表4：在局部给药后在房水中的浓度（ng/ml）

ND = 未检测出– 低于定量限度（在3次重复测定的至少2次中）

这个表中的结果舍入至1个小数位。

表5：在局部给药后在玻璃体液中的浓度（ng/ml）：

这个表中的结果舍入至1个小数位。

表6：在局部给药后在视网膜/脉络膜中的浓度（在其中100μL裂解缓冲液已添加到15 mg组织中的样品中ng/ml）：

这个表中的结果舍入至1个小数位。

正好在剂量20和21前从兔中收集泪液（眼泪）样品，关于存在的药物浓度的结果分别显示于表4和5中。在所有左（给药的）眼中检测出给药的材料（尽管在个别兔之间检测出的浓度中存在相当大的变异），并且对于大多数对侧的（未给药的右）眼的一些转移也已发生。在剂量20后12小时时，给药材料仍存在于眼中。在剂量20和21之间在12小时时间段期间，DOM0400PEG（加入聚乙二醇的IL-1 dAb）和VEGF-Fc（15-26-593）看起来以比裸露IL-1 dAb（DOM4-130-54）更高的浓度保留在眼泪中。

关于各种形式的结构域抗体和泪液（眼泪）中的抗体的浓度的结果显示于下表中（仅左眼给药）：

表7：在剂量20前（先前剂量后3小时）收集的泪液样品中的浓度（μg/ml）。标准差在括号中：

这个表中的结果舍入至1个小数位。

表8：在剂量21前（先前剂量后12小时）收集的泪液样品中的浓度（μg/ml）。标准差在括号中：

这个表中的结果舍入至1个小数位。

关于各种形式的结构域抗体以及预放血（prebleeds）和血清中的抗体的浓度的结果显示于下表中：

表9：正好在安乐死前收集的预放血和血清中的浓度

浓度（ng/ml）连同在括号中的标准差：

这个表中的结果舍入至1个小数位。

* 在α-TNF-α抗体处理的组中的兔3具有由于裂解在颜色中是红色的预放血，并且这可能已促成明显地高结果。

实施例5：

α-TNF-αR1 dAb的局部递送

方法

成年雄性Chinchilla Bastard兔得自Charles River，德国。在使用前允许动物适应新环境。在给药开始前7天从每只兔的边缘耳静脉中收集血样。在离心（12000 rpm/2分钟）前允许血液在室温凝结，以分离血清。将血清转移至新鲜管且冷冻贮存（-20℃）。

在磷酸缓冲盐水中以10 mg/ml配制对于TNF-αR1具有特异性的结构域抗体（dAb）（即抗TNFα受体1型dAb），其是具有图4中所示的氨基酸序列的Dom 1h-131-206；SEQ ID NO 6；Dom 1h-131-206的制备和选择在WO2008149148中描述）。4只兔的组的左眼在单天给药10次（以每小时时间间隔）。每个剂量由置于上眼睑下的50微升10 mg/ml α-TNF-αR1 dAb溶液组成。动物在给药后保持静止不动至少30秒。在给药方案前的各个时间和在给药方案过程中，通过将小吸收剂纸条置于眼睑下以吸收一些流体来收集泪（眼泪）液样品。由眼泪流体浸渗的纸区域置于包含200 μL磷酸缓冲盐水的管内。使管离心（12000 rpm/2分钟），取出纸，并且在分析前将回收的样品冷冻贮存（-20℃）。

最后一次给药后1小时，从每只兔的边缘耳静脉中收集血样。允许血液凝结，从而使得可以通过上文描述的方法分离血清。其后立即对动物实施安死术。尽可能接近于已证实安乐死的时间，摘出来自每只动物的双眼。每只眼在PBS中洗涤，以去除来自表面的任何过量药物。收集房水和玻璃体液的样品且在分析前冷冻贮存（-20℃）。在测定中测试前，对玻璃体液实施单个冷冻/融化循环。将眼解剖并且收集视网膜/脉络膜。将视网膜/脉络膜样品称重，并且将900微升裂解缓冲液（10 mM Tris pH 7.4；0.1％SDS；具有蛋白酶抑制剂混合物，（Roche））添加到每种样品中。使用重复高和低频率裂解的2分钟循环，使用超声破裂（Covaris S2 Sonolab Single）使样品匀浆。使视网膜/脉络膜样品在微量离心机（Heraeus）中离心（12000 rpm/2分钟）。将上清液转移至新鲜管且冷冻贮存（-20℃）。通过夹心ELISA测定就α-TNF-αR1 dAb浓度测试样品，其中使用由重组人TNF R1/TNFRSF1A/Fc嵌合体（R+D Systems）包被的板捕获dAb，并且以对于人IgG（F（ab）2）片段（Thermo）的特异性检测。这种抗体是未缀合的，因此抗山羊/绵羊HRP试剂（Sigma）用于检测结合的抗体。

结果

药物给药是良好耐受的，没有观察到发红、刺激或异常动物行为的病征。

对于一式三份地测试的样品显示了在眼流体和血清中的α-TNF-αR1 dAb浓度。在测试的所有眼样品中检测出α-TNF-αR1 dAb。

表10：在眼样品中的α-TNF-αR1 dAb浓度：

表10中的结果舍入至1个小数位。

S.E. = 标准误

正好在剂量2、6、10前连同最后一次剂量后1小时从兔中收集泪液（眼泪）样品，并且样品中检测出的α-TNF-αR1 dAb浓度显示于表8中。在所有左（给药的）眼中检测出α-TNF-αR1 dAb，并且对于大多数对侧的（未给药的右）眼的一些转移也已发生。

表11：在泪液（眼泪）样品中的α-TNF-αR1 dAb浓度：

表11中的结果舍入至2个小数位。

S.E. = 标准误

在第一次给药前和在安乐死时收集血液用于血清。所得到的数据显示于图9中。在最后一次给药后1小时得自4只兔各自的血清中检测出低浓度的α-TNF-αR1 dAb。

表12：在血清样品中的α-TNF-αR1 dAb浓度：

表12中的结果舍入至2个小数位。

ND = 未检测出

S.E. = 标准误

序列表

<110> Gough, Gerald

Cook, Fiona

Jespers, Laurent

Steward, Michael

Glaxo Group Limited

<120> 多肽、抗体可变结构域和拮抗剂

<130> DB00063

<150> USSN 12/323,632

<151> 2009-06-11

<160> 6

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自智人（homo sapiens）序列的人工序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Leu Val Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Pro Arg Lys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自智人（homo sapiens）序列的人工序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Val Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Pro Arg Lys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

115 120 125

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

130 135 140

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

145 150 155 160

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

165 170 175

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

180 185 190

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

195 200 205

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

210 215 220

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

225 230 235 240

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

245 250 255

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

260 265 270

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

275 280 285

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

290 295 300

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

305 310 315 320

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340

<210> 3

<211> 225

<212> PRT

<213> 智人（homo sapiens）

<400> 3

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

35 40 45

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

50 55 60

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

85 90 95

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

100 105 110

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

130 135 140

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

165 170 175

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

180 185 190

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

195 200 205

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215 220

Lys

225

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自智人（homo sapiens）序列的人工序列

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Leu Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Asn Phe Gly Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Cys

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Pro Ser Phe Tyr Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自智人（homo sapiens）序列的人工序列

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Leu Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Asn Phe Gly Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Pro Ser Phe Tyr Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自智人（homo sapiens）序列的人工序列

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu

20 25 30

Thr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser His Ile Pro Pro Asp Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

Claims

1.一种组合物，其包括与靶分子结合的免疫球蛋白单个可变结构域，用于眼递送。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域对蛋白酶有抗性，其中所述蛋白酶选自：眼蛋白酶、胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶（ADAMs）和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶PRSS1、和泛蛋白蛋白体途径（UPP），用于眼递送。

3.根据任何前述权利要求的组合物，其包括与选自下述的靶分子结合的免疫球蛋白单个可变结构域：VEGF、TNFα 、TNFαR、IL-1、IL-1r、TNFαR1、TGFβ、IL-6、IL-8 IL-17、IL-21、IL-23、CD20、Nogo-a、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和β淀粉状蛋白，用于眼递送。

4.根据权利要求3的组合物，其中与VEGF结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与下述至少97％等同的氨基酸序列：（a）DOM15-26-593的氨基酸序列（SEQ ID NO 1中所示），或（b）DOM15-26-593-Fc的氨基酸序列（SEQ ID NO 2）。

5.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括在位置6上的缬氨酸，其中编号根据Kabat。

6.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括在位置99上的亮氨酸，其中编号根据Kabat。

7.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括在位置30上的赖氨酸，其中编号根据Kabat。

8.根据权利要求4的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与选自下述的序列等同的氨基酸序列：（a）DOM15-26-593的氨基酸序列（SEQ ID NO 1中所示），（b）DOM15-26-593-Fc的氨基酸序列（SEQ ID NO 2中所示）。

9.根据权利要求3的组合物，其中与IL-1结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与下述至少97％等同的氨基酸序列：（a）DOM 4-130-54的氨基酸序列（SEQ ID NO 5中所示）；或（b）DOM 0400 PEG的氨基酸序列（SEQ ID NO 4中所示）。

10.根据权利要求9的组合物，其中与IL-1结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与下述等同的氨基酸序列：（a）DOM 4-130-54的氨基酸序列（SEQ ID NO 5中所示），或（b）DOM 0400 PEG的氨基酸序列（SEQ ID NO 4中所示）。

11.根据权利要求3的组合物，其中与α-TNF-αR1结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与Dom 1h-131-206的氨基酸序列（SEQ ID NO 6中所示）至少97％等同的氨基酸序列。

12.根据权利要求3的组合物，其中与α-TNF-αR1结合的所述免疫球蛋白单个可变结构域包括与Dom 1h-131-206的氨基酸序列（SEQ ID NO 6中所示）等同的氨基酸序列。

13.根据前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包括抗体恒定区的结构域，其中所述抗体恒定区是抗体Fc区。

14.根据权利要求9的组合物，其中所述抗体Fc区具有SEQ ID NO 3中所示的氨基酸Fc序列。

15.根据权利要求9的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域作为具有Fc的融合物存在，并且具有与DOM15-26-593-Fc融合物的氨基酸序列（SEQ ID NO 2中所示）等同的氨基酸序列。

16.一种组合物，其包括裸免疫球蛋白单个可变结构域，其与靶分子结合用于递送至选自下述的一个或多个眼区域：玻璃体液、房水、视网膜和脉络膜。

17.根据权利要求16的组合物，其中所述靶分子选自VEGF、VEGF拮抗剂、TNFα 、TNFα受体、IL-1、α-TNF-αR1、IL-6、IL-8、IL-17、IL-21、IL-23、Nogo-a、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和β淀粉状蛋白。

18.根据权利要求16或17的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域对蛋白酶有抗性，其中所述蛋白酶选自：眼蛋白酶、胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶（ADAMs）和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶PRSS1、和泛蛋白蛋白体途径（UPP）。

19.根据权利要求16或17的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域选自：（a）与VEGF结合且包括与下述至少97％等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域：（i）DOM15-26-593的氨基酸序列（SEQ ID NO 1中所示），或（ii）DOM15-26-593-Fc的氨基酸序列（SEQ ID NO 2中所示），（b）与IL-1结合且包括与下述至少97％等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域：（i）DOM 4-130-54的氨基酸序列（SEQ ID NO 5中所示）；或（ii）DOM 0400 PEG的氨基酸序列（SEQ ID NO 4中所示）；（c）与α-TNF-αR1结合且包括与Dom 1h-131-206的氨基酸序列（SEQ ID NO 6中所示）至少97％等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域。

20.一种组合物，其包括格式化的免疫球蛋白单个可变结构域，其与靶分子结合用于递送至选自下述的一个或多个眼区域：视网膜、脉络膜和泪液。

21.根据权利要求20的组合物，其中所述靶分子选自：VEGF、VEGF拮抗剂、TNFα 、TNFα受体、IL-1、α-TNF-αR1、IL-17、IL-21、IL-23、Nogo-a、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和β淀粉状蛋白。

22.根据权利要求20或21的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域对蛋白酶有抗性，其中所述蛋白酶选自：眼蛋白酶、胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属蛋白酶（ADAMs）和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、丝氨酸蛋白酶PRSS1、和泛蛋白蛋白体途径（UPP）。

23.根据权利要求16或17的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域选自：（a）与VEGF结合且包括与下述至少97％等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域：（i）DOM15-26-593的氨基酸序列（SEQ ID NO 1中所示），或（ii）DOM15-26-593-Fc的氨基酸序列（SEQ ID NO 2中所示），（b）与IL-1结合且包括与下述至少97％等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域：（i）DOM 4-130-54的氨基酸序列（SEQ ID NO 5中所示）；或（ii）DOM 0400 PEG的氨基酸序列（SEQ ID NO 4中所示）；（c）与α-TNF-αR1结合且包括与Dom 1h-131-206的氨基酸序列（SEQ ID NO 6中所示）至少97％等同的氨基酸序列的免疫球蛋白单个可变结构域。

24.根据权利要求20-23的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域具有约50 KDa的分子量。

25.根据权利要求20-24的组合物，其中所述免疫球蛋白单个可变结构域通过加入聚乙二醇或与抗体Fc融合进行格式化。

26.根据前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包括选自下述的一种或多种增强剂：眼穿透增强剂和粘度增强剂。

27.根据前述权利要求中任一项的组合物，其进一步包括药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

28.一种将根据权利要求1-27中任一项的组合物直接递送给眼的方法，其包括通过选自下述的方法将所述组合物施用于所述眼：例如通过滴眼剂或眼内注射局部递送给眼、眼周施用或通过缓释制剂。

29.一种用于治疗、预防或诊断眼状况的方法，其包括通过选自下述的方法将根据权利要求1-27中任一项的组合物直接施用于眼：眼内注射、玻璃体内注射、例如通过滴眼剂局部递送给眼、或通过眼周施用和缓释制剂。

30.根据权利要求28或29的方法，其中所述组合物施用于选自下述的一个或多个眼区域：眼的表面、泪管、泪腺、眼内区域、前房、后房和玻璃体液。

31.一种将根据权利要求16-19和26-27的组合物递送给选自下述的一个或多个眼区域的方法：玻璃体液、房水、视网膜和脉络膜，所述方法包括通过局部递送例如通过使用滴眼剂将所述组合物施用于所述眼。

32.一种将根据权利要求20-27的组合物递送给选自下述的一个或多个眼区域的方法：视网膜、脉络膜和泪液，所述方法包括通过局部递送例如通过使用滴眼剂将所述组合物施用于所述眼。

33.一种用于产生药物组合物的方法，其包括：（a）使权利要求1-27中任一项的组合物与（b）药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。

34.根据权利要求33的方法，其中所述药物组合物用于治疗、预防或诊断眼状况或疾病。

35.根据权利要求34的方法，其中所述眼状况或疾病选自：AMD、葡萄膜炎、青光眼、干眼病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿和葡萄膜炎。