MX2011005540A - Polipeptidos dominios variables de anticuerpos, y antagonistas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a dominios variables individuales de inmunoglobulina (dAbs), por ejemplo, los dAbs que son resistentes a la proteasa, y también a formulaciones y composiciones que comprenden estos dAbs para suministro ocular, y a sus usos para el tratamiento de enfermedades y condiciones oculares.

Description

POLIPÉPTIDOS, DOMINIOS VARIABLES DE ANTICUERPOS, Y ANTAGONISTAS La presente invención se refiere un dominios variables individuales de inmunoglobulina (dAbs), por ejemplo, dAbs que son resistentes a la proteasa, y también a formulaciones y composiciones que comprenden estos dAbs para suministro ocular y a su usos para tratar enfermedades y condiciones oculares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una dificultad en el tratamiento de las enfermedades y condiciones oculares ha sido la ineficiencia para suministrar los agentes terapéuticos al ojo. Cuando un fármaco se suministra al ojo, con mucha frecuencia se elimina extremadamente rápido de los tejidos oculares. Adicionalmente, cuando se suministran productos terapéuticos tópicamente al ojo, un problema ha sido que pueden no llegar hasta los segmentos posteriores del ojo (la retina, el vitreo, y la coroides). Por consiguiente, muchas condiciones oculares del segmento posterior se han tratado mediante la administración de fármacos intravenosamente o mediante administración intravítrea. Muchas de estas enfermedades, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), glaucoma, y retinopatías diabéticas, no se pueden tratar de una manera óptima. Por consiguiente, existe una necesidad de proporcionar agentes adicionales que puedan ser adecuados para suministro ocular, y que puedan tratar o prevenir las enfermedades y condiciones oculares.

Los polipéptidos y péptidos han llegado a ser agentes cada vez más importantes para utilizarse como agentes médicos, terapéuticos, y de diagnóstico. Sin embargo en ciertos medios ambientes in vivo, por ejemplo, el ojo, y en ciertos estados fisiológicos, tales como cáncer y estados inflamatorios, puede aumentar la cantidad de proteasas presentes en un tejido, órgano o animal. Este aumento en las proteasas puede dar como resultado una degradación acelerada y una inactivación de las proteínas endógenas y de los péptidos, polipéptidos y proteínas terapéuticas que se administren para tratar la enfermedad. De conformidad con lo anterior, algunos agentes que tienen potencial para su uso in vivo (por ejemplo, para su uso en el tratamiento, diagnóstico o prevención de la enfermedad) tienen una eficacia solamente limitada, debido a que son rápidamente degradados e inactivados por las proteasas.

Los polipéptidos resistentes a las proteasas proporcionan varias ventajas. Por ejemplo, los polipéptidos resistentes a las proteasas siguen siendo activos in vivo durante más tiempo que los agentes sensibles a la proteasa y, de conformidad con lo mismo, siguen siendo funcionales durante un período de tiempo que es suficiente para producir efectos biológicos.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una glicoproteína homodimérica secretada que se enlaza con la heparina que existe en varias formas alternativas debido al empalme alternativo de su transcripción primaria (Leung y colaboradores, 1989, Science 246: 1306). El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) también es conocido como factor de permeabilidad vascular (VPF) debido a su capacidad para inducir la filtración vascular, un proceso importante en la inflamación.

En el ojo, se sabe que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) estimulan la angiogénesis tanto coroidal como retinal, y regulan la permeabilidad vascular de estos vasos. Ambas características contribuyen al daño retinal, y al deterioro consecuente de la agudeza visual que resulta por un número de condiciones inflamatorias retínales, vasculopatías, y maculopatías. Anteriormente se ha demostrado que los intentos por regular la actividad del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o la actividad de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) efectivamente manejan la permeabilidad vascular tanto en modelos animales como en la enfermedad humana (Gragoudas y colaboradores, 2004: N. Engl. J. Med 351: 2805).

La dirección al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con los productos terapéuticos actualmente disponibles no es efectiva en todos los pacientes. Por consiguiente, existe una necesidad de mejores agentes para el tratamiento de las condiciones patológicas mediadas por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, las enfermedades vasculares proliferativas (por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (AMD)).

El TNF-a (factor de necrosis tumoral-a) es una citoquina pro-inflamatoria que se ha implicado en un número de condiciones inflamatorias oftálmicas, tales como uveítis y degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y en la generación de las vasculopatías retínales en donde haya un componente inflamatorio. Se ha demostrado que la generación de lesiones neovasculares coroidales asociadas con la enfermedad macular relacionada con la edad tiene un componente inflamatorio asociado. Se ha demostrado que el manejo efectivo de este componente inflamatorio asociado afecta directamente al desarrollo de la lesión neo-angiogénica coroidal y de la permeabilidad vascular ambas de las cuales pueden impactar a la enfermedad humana. La evidencia reciente en los pacientes humanos con degeneración macular relacionada con la edad (AMD) ha sugerido que el uso de productos terapéuticos anti-TNFa puede impactar a la enfermedad en los pacientes que no respondan a las terapias anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Theodossiadis y colaboradores, 2009: Am. J. Ophtalmol. 147: 825-830).

La Interleucina 1 (IL- ) es un mediador importante de la respuesta inmunitaria que tiene efectos biológicos sobre varios tipos de células. La Interleucina 1 se enlaza a dos receptores: receptor de interleucina 1 tipo 1 (IL-1R1, CD121a, p80), el cual transduce la señal en las células después de enlazarse a la IL-1, y el receptor de interleucina 1 tipo 2 (IL-1R2, CDw121b), el cual no transduce las señales después de enlazarse a la IL-1, y actúa como un regulador endógeno de la IL-1. Otra proteína endógena que regula la interacción de IL-1 con IL-1 R 1 es el antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1ra). IL-1ra se enlaza a IL-1R1, pero no activa IL-1R1 para transducir las señales. Las señales transducidas a través de IL-1R1, después de enlazarse a la IL-1 (por ejemplo, IL-1a o IL-13), inducen un amplio espectro de actividades biológicas que pueden ser patogénicas. Por ejemplo, las señales transducidas a través de IL-1 R 1 , después de enlazarse a la IL-1, pueden conducir a inflamación local o sistémica, y a la elaboración de mediadores inflamatorios adicionales (por ejemplo, IL-6, IL-8, TNF). De conformidad con lo anterior, la interacción de la IL-1 con IL-1 R 1 se ha implicado en la patogénesis de las enfermedades oculares.

Ciertos agentes que se enlazan al receptor de interleucina 1 Tipo 1 (IL-1R1), y neutralizan su actividad (por ejemplo, IL-1ra) han probado ser agentes terapéuticos efectivos para ciertas condiciones inflamatorias.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende o que consiste en un solo dominio variable de inmunoglobulina (o dAb), el cual puede enlazarse a una molécula objetivo deseada (por ejemplo, VEGF, IL-1, o TNF-a), por ejemplo, en el sitio de suministro, para su administración al ojo.

La invención también proporciona composiciones que comprenden o que consisten en un solo dominio variable de inmunoglobulina (o dAb), el cual puede enlazarse a una molécula objetivo deseada (por ejemplo, VEGF, IL-1, o TNF-a, TNFR1, TNFR2, IL-1 r) , para utilizarse con el fin de tratar, prevenir o diagnosticar las enfermedades o condiciones oculares, tales como degeneración macular relacionada con la edad (AMD), uveítis, glaucoma, ojo seco, retinopatía diabética, y edema macular diabético.

En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina puede ser resistente a la proteasa, por ejemplo, resistente a una o más de las siguientes: proteasa de serina, proteasa de cisteína, proteasas de aspartato, proteasas de tiol, metaloproteasa de matriz, carboxipeptidasa (por ejemplo, carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B), tripsina, quimiotripsina, pepsina, papaína, elastasa, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (por ejemplo, catepsina G), proteinasa (por ejemplo, proteinasa 1, proteinasa 2, proteinasa 3), termolisina, quimosina, enteropeptidasa, caspasa (por ejemplo, caspasa 1, caspasa 2, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 9, caspasa 12, caspasa 13), calpaína, fícaína, clostripaína, actinidaína, bromelaína, y separasa. En las modalidades particulares, la proteasa es tripsina, elastasa o leucozima. Los polipéptidos resistentes a las proteasas son en especial adecuados para suministrarse a los medios ambientes ricos en proteasa in vivo, tales como el ojo. La proteasa también puede ser proporcionada por un extracto biológico, un homogenato biológico, o una preparación biológica. En una modalidad, la proteasa es una que se encuentra en el ojo y/o en las lágrimas. Los ejemplos de estas proteasas que se encuentran en el ojo incluyen caspasas, calpaínas, metaloproteasas de matriz, desintegrina, metaloproteinasas (ADAMs), y ADA con motivos de trombospondina, los proteasomas, activador de plasminógeno de tejido, secretasas, catepsina B y D, cistatina C, proteasa de serina PRSS1, la senda de proteasoma de ubiquitina (UPP). En una modalidad, la proteasa es una proteasa no bacteriana. En una modalidad, la proteasa es una proteasa de un animal, por ejemplo, de un mamífero, por ejemplo, de un ser humano.

La composición se puede suministrar a diferentes regiones del ojo, por ejemplo, hacia la superficie del ojo, la córnea, o los conductos lagrimales o glándulas lagrimales, o puede haber un suministro intraocular (por ejemplo, hacia las cámaras anteriores o posteriores de los ojos, tales como el humor vitreo), y a las estructuras oculares, tales como el iris, cuerpo ciliar, glándula lagrimal, y la composición puede enlazarse a las moléculas objetivo (por ejemplo, VEGF, IL-1, o TNF-a) en estas partes del ojo. La composición también se puede suministrar a la región peri-ocular del ojo.

La molécula objetivo, por ejemplo, puede ser VEGF, IL-1, o TNF-a, o puede ser cualquier otro objetivo deseado, por ejemplo, una molécula objetivo presente en el ojo, por ejemplo, sobre la superficie del ojo, dentro del ojo, o en los conductos lagrimales o en las glándulas lagrimales, por ejemplo, el objetivo puede ser IL-1, IL-17 o un receptor de TNF tal como TNFR1, TGFbeta, IL-6, IL-8, IL-21, IL-23, CD20, Nogo-a, glicoproteína asociada con mielina (MAG) o Beta-amiloide.

En una modalidad, la invención proporciona un solo dominio variable de inmunoglobulina (o dAb) resistente a la proteasa para su administración al ojo, por ejemplo, en la forma de gotas para los ojos o como un gel o, por ejemplo, en un implante. El dAb , por ejemplo, se puede enlazar a una molécula objetivo presente en el ojo, por ejemplo, VEGF, IL-1, o TNF-a.

La administración al ojo puede ser, por ejemplo, mediante administración tópica, por ejemplo, en la forma de gotas para los ojos; o de una manera alternativa, puede ser mediante inyección en el ojo.

Puede ser útil dirigir el suministro del único dominio variable de inmunoglobulina a regiones particulares de los ojos, tales como la superficie del ojo, o los conductos lagrimales o las glándulas lagrimales, o puede haber un suministro intra-ocular (por ejemplo, hacia las cámaras anteriores o posteriores de los ojos, tales como el humor vitreo). Por consiguiente, la invención proporciona además un método para suministrar una composición directamente al ojo, el cual comprende administrar la composición mencionada al ojo mediante un método seleccionado a partir de: inyección intra-ocular, suministro tópico, gotas para los ojos, administración peri-ocular, y el uso de una formulación de liberación lenta (tal como un nano- o micro-partícula polimérica o un gel), o mediante la utilización de dispositivos de suministro que hacen uso de la iontoforesis.

También puede ser útil si el único dominio variable de inmunoglobulina se suministra al ojo, por ejemplo, mediante suministro tópico, por ejemplo, como gotas para los ojos, junto con un potenciador de la penetración ocular, por ejemplo, caprato de sodio, o con un potenciador de viscosidad, por ejemplo, hidroxi-propil-metil-celulosa (HPMC). De conformidad con lo anterior, la invención proporciona además composiciones que comprenden: (a) un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlazan a una molécula objetivo, por ejemplo, en el ojo (por ejemplo, al VEGF, IL-1, o TNF-a), y también (b) un potenciador de la penetración ocular y/o (c) un potenciador de viscosidad, por ejemplo, para suministro tópico al ojo.

En un aspecto, el único dominio variable de inmunoglobulina que se va a suministrar al ojo puede ser cualquiera de los dAbs de VEGF, dados a conocer en la Publicación Internacional Número WO 2008/149146, en la Publicación Internacional Número WO 2008149147, o en la Publicación Internacional Número WO 2008149150, que se enlazan al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Por ejemplo, puede ser un polipéptido codificado por una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593 (mostrada en la Figura 1a: SEQ ID NO: 1). En una modalidad, el porcentaje de identidad es cuando menos el 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento ó el 100 por ciento. En una modalidad, el polipéptido resistente a la proteasa se puede obtener mediante el método descrito en la presente para el aislamiento de los polipéptidos resistentes a las proteasas. El DOM15-26-593 para suministro al ojo también puede comprender además un dominio de una región constante de anticuerpo. Por ejemplo, puede tener una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de la fusión de DOM15-26-593-Fc (mostrada en la Figura 1b: SEQ ID NO: 2) o el porcentaje de identidad puede ser de cuando menos el 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 por ciento de aquélla mostrada en la Figura 1b: SEQ ID NO: 2.

En un aspecto el dAb de VEGF que es codificado por una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593 (por ejemplo, por una que es el 97 por ciento idéntica o más), puede comprender valina en la posición 6 y/o leucina en la posición 99, y/o lisina en la posición 30 (Numeración de Kabat), como se describe en las Publicaciones Internacionales Números WO 2008149150 y WO 2008149147 (el contenido de las cuales se incorpora a la presente como referencia).

En un aspecto adicional, el único dominio variable de inmunoglobulina que se va a suministrar al ojo puede ser cualquiera de los dAbs anti-TNFR1 que se dan a conocer en las Publicaciones Internacionales Números WO 2008/149144 o WO 2008/149148.

En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza al a-TNF-aR1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento (por ejemplo, el 98 por ciento, el 99 por ciento ó el 100 por ciento idéntica) idéntica a la secuencia de aminoácidos de Dom 1h-131-206 (mostrada en la Figura 4; SEQ ID NO: 6). La preparación y selección de Dom 1h-131-206 se describe en la Publicación Internacional Número WO2008149148.

En todavía un aspecto adicional, el único dominio variable de inmunoglobulina que se va a suministrar al ojo puede ser cualquiera de los dAbs anti- 1 L- 1 R 1 que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 2008/149149.

En una modalidad, el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a IL-1 puede comprender una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento (por ejemplo, el 98 por ciento, el 99 por ciento ó el 100 por ciento idéntica) idéntica a: (a) la secuencia de aminoácidos de DOM 4-130-54 (mostrada en la Figura 3; SEQ ID NO: 5); o a (b) la secuencia de aminoácidos de DOM 0400 PEG (mostrada en la Figura 2; SEQ ID NO: 4).

La preparación y selección de DOM 4-130-54 se describe en la Publicación Internacional Número WO 2007063311 y también en la Publicación Internacional Número WO2008149149. Para preparar Dom 0400, se toma la secuencia del dAb de DOM 4-130-54 y se muta de tal manera que una cisteína en la posición 80 reemplaza a la prolina presente en DOM 4-130-54, este dAb se une entonces a una molécula de PEG lineal de 40 kDa (obtenida en NOF Corporation, Europa) mediante un acoplamiento de maleimida convencional con la cisteína libre en la posición 80 del dAb.

La invención también proporciona el uso de cualquiera de las composiciones que comprenden o que consisten en un solo dominio variable de mmunoglobulina, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento, prevención o diagnóstico de una condición o enfermedad de los ojos, por ejemplo, en donde la enfermedad de los ojos es degeneración macular relacionada con la edad (AMD), uveítis, glaucoma, ojo seco, retinopatía diabética, o edema macular diabético.

La invención también proporciona una composición que comprende o que consiste en un solo dominio variable de mmunoglobulina, por ejemplo, un dAb de VEGF, IL-1, o TNF-a, para utilizarse en el tratamiento, prevención o diagnóstico de una condición o enfermedad de los ojos, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), uveítis, glaucoma, ojo seco, retinopatía diabética, o edema macular diabético.

En una modalidad alternativa, el único dominio variable de mmunoglobulina para suministro al ojo puede ser uno que no es la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593 (mostrada en la Figura 1a; SEQ ID NO: 1) o que no es la secuencia de aminoácidos de la fusión de DOM 15-26-593-Fc (mostrada en la Figura 1b; SEQ ID NO: 2).

En otra modalidad alternativa, el único dominio variable de inmunoglobulina para suministro al ojo puede ser uno que no es una molécula que comprende o que consiste en cualquiera de las moléculas que se dan a conocer en las siguientes solicitudes: PCT/GB2008/050399, PCT/GB2008/050400, PCT/GB2008/050406, PCT/GB2008/050405, PCT/GB2008/050403, PCT/GB2008/050404, En otra modalidad alternativa, el único dominio variable de inmunoglobulina para suministro al ojo puede ser uno que no es la secuencia de aminoácidos de Dom1 h-131 -511 , Dom1 h-131 -201 , Dom1h-131-202, Dom1 h-13 -203, Dom1 h-131 -204, Dom1 h-131 -205 como se da a conocer en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/GB2008/050400.

En otra modalidad alternativa, el único dominio variable de inmunoglobulina para suministro al ojo puede ser uno que no es la secuencia de aminoácidos de Dom4-130-202 como se da a conocer en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/GB2008/ 050406.

En otra modalidad alternativa, el único dominio variable de inmunoglobulina para suministro al ojo puede ser uno que no es la secuencia de aminoácidos de Dom1 h-131-206 como se da a conocer en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/GB2008/ 050405.

También puede ser útil suministrar otros agentes al ojo en combinación o en asociación con los dominios variables individuales de inmunoglobulina, por ejemplo, puede ser útil suministrar potenciadores de penetración, tales como caprato de sodio o un agente de viscosidad, tal como hidroxi-propil-metil-celulosa (HPMC).

Los únicos dominios variables de inmunoglobulina (dAbs) para suministro ocular (por ejemplo, que se enlazan al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), IL-1, o TNF-a), se pueden formatear para tener un tamaño hidrodinámico más grande, por ejemplo, mediante la unión de un grupo PEG, albúmina de suero, transferrina, receptor de transferrina o cuando menos la porción de enlace de transferrina del mismo, una región Fe de anticuerpo, o mediante la conjugación con un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, el monómero de dAb (por ejemplo, dAb de VEGF), se puede formatear como un fragmento de enlace de antígeno más grande de un anticuerpo (por ejemplo, se puede formatear como un Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). El tamaño hidrodinámico del dAb y su vida media en suero también se pueden aumentar mediante su conjugación o ligadura con un dominio de enlace (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se enlace a un antígeno o epítopo que aumente la vida media ¡n vivo, como se describe en la presente (véase el Anexo 1 de la Publicación Internacional Número WO2006038027 incorporada a la presente como referencia en su totalidad). Por ejemplo, el dAb de VEGF se puede conjugar o enlazar a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-albúmina de suero o anti-receptor de Fe neonatal, por ejemplo, un dAb, Fab, Fab' o scFv anti-albúmina de suero (SA) o anti-receptor de Fe neonatal, o a un Aficuerpo anti-albúmina de suero (SA) o a un Aficuerpo anti-receptor de Fe neonatal.

Los ejemplos adecuados de albúmina, fragmentos de albúmina, o variantes de albúmina, para utilizarse en las composiciones descritas en la presente, por ejemplo, enlazadas con los dAbs de enlace del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), se describen en las Publicaciones Internacionales Números WO 2005/077042A2 y WO2006038027, las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad.

Los dAbs formateados (por ejemplo, los dAbs formateados mediante PEGilación) pueden tener un peso molecular que es, por ejemplo, de entre 30 KDa y 100 KDa, por ejemplo, de alrededor de 50 a 60 KDa, y pueden ser útiles para su suministro a la retina y/o la coroides y/o el fluido lagrimal.

Los dAbs desnudos (no formateados), los cuales tienen un peso molecular de alrededor de 15 KDa, pueden ser útiles para su suministro al humor vitreo y/o acuoso y/o a la retina y/o a la coroides.

En otras modalidades de la invención descrita a través de toda esta divulgación, en lugar del uso de un solo dominio variable de inmunoglobulina o "dAb" en un antagonista o ligando de la invención, se contempla que el experto aludido puede usar un dominio que comprenda las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un dAb que se enlace, por ejemplo, al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), IL-1, o TNF-a (por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) injertadas sobre un andamiaje o esqueleto adecuado de proteína, por ejemplo, un Aficuerpo, un andamiaje de SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, o un dominio de factor de crecimiento epidérmico (EGF)), o puede ser un dominio de proteína que comprenda un sitio de enlace para VEGF, IL-1, o TNF-a, por ejemplo, en donde el dominio se selecciona a partir de un Aficuerpo, un dominio de SpA, un dominio de receptor de LDL clase A, o un dominio de factor de crecimiento epidérmico (EGF). La divulgación como un todo se debe interpretar de conformidad con lo anterior, para proporcionar la divulgación de antagonistas, ligandos y métodos utilizando estos dominios en lugar de un dAb.

Los dAbs resistentes a la proteasa descritos en la presente se pueden seleccionar empleando los métodos y las enseñanzas descritas en la Publicación Internacional Número WO 2008149143, el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia.

En un aspecto, la invención proporciona un solo dominio variable de inmunoglobulina resistente a la proteasa, el cual comprende, por ejemplo, un sitio de enlace de VEGF, IL-1, o TNF-a, en donde el dominio variable es resistente a la proteasa cuando se incuba con: (i) una concentración (C) de cuando menos 10 microgramos/ mililitro de proteasa a 37°C durante un tiempo (t) de cuando menos un hora; o (ii) una concentración (C) de cuando menos 40 microgramos/ mililitro de proteasa a 30°C durante un tiempo (t) de cuando menos un hora. En una modalidad, la proporción (sobre una base de mol/mol) de proteasa, por ejemplo, tripsina, al dominio variable es de 8,000 a 80,000 de proteasa : dominio variable, por ejemplo, cuando c es de 10 microgramos/mililitro, la proporción es de 800 a 80,000 de proteasa dominio variable; o cuando C o C es de 100 microgramos/mililitro, la proporción es de 8,000 a 80,000 de proteasa : dominio variable. En una modalidad, la proporción (sobre una base de peso/peso, por ejemplo, microgramos/microgramos) de proteasa (por ejemplo, tripsina) al dominio variable es de 16,000 a 160,000 de proteasa dominio variable, por ejemplo, cuando C es de 10 microgramos/mililitro, la proporción es de 1,600 a 160,000 de proteasa : dominio variable; o cuando C o C es de 100 microgramos/ mililitro, la proporción es de 16,000 a 160,000 de proteasa : dominio variable. En una modalidad, la concentración (C o C) es de cuando menos 100 ó 1,000 microgramos/mililitro de proteasa. En una modalidad, la concentración (C o C) es de cuando menos 100 ó 1,000 microgramos/mililitro de proteasa. Se hace referencia a la descripción en la presente, de las condiciones adecuadas para la actividad proteolítica de la proteasa para utilizarse cuando se trabaja con repertorios o bibliotecas de péptidos o polipéptidos (por ejemplo, los parámetros en peso/peso). Estas condiciones se pueden utilizar para las condiciones para determinar la resistencia a la proteasa de un solo dominio variable de inmunoglobulina particular. En una modalidad, el tiempo (t) es de, o es de aproximadamente una, tres o 24 horas, o durante la noche (por ejemplo, de aproximadamente 12 a 16 horas). En una modalidad, el dominio variable es resistente bajo las condiciones (i), y la concentración (C) es de, o es de aproximadamente 10 ó 100 microgramos/mililitro de proteasa, y el tiempo (t) es de 1 hora. En una modalidad, el dominio variable es resistente bajo las condiciones (ii), y la concentración (C) es de, o es de aproximadamente 40 microgramos/mililitro de proteasa, y el tiempo (t) es de, o es de aproximadamente 3 horas. En una modalidad, la proteasa se selecciona a partir de tripsina, elastasa, leucozima y pancreatina. En una modalidad, la proteasa es tripsina. En una modalidad, la proteasa es una proteasa que se encuentra en el esputo, moco (por ejemplo, moco gástrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogenato pulmonar, extracto pulmonar, extracto pancreático, fluido gástrico, saliva o lágrimas o el ojo. En una modalidad, la proteasa es una que se encuentra en el ojo y/o en las lágrimas. En una modalidad, la proteasa es una proteasa no bacteriana. En una modalidad, la proteasa es una proteasa de un animal, por ejemplo, de un mamífero, por ejemplo, de un ser humano.

En una modalidad, el dominio variable es resistente a la tripsina y/o cuando menos a otra proteasa seleccionada a partir de elastasa, leucozima y pancreatina. Por ejemplo, la resistencia es a tripsina y elastasa; tripsina y leucozima; tripsina y pancreatina; tripsina, elastasa y leucozima; tripsina, elastasa y pancreatina; tripsina, elastasa, pancreatina y leucozima; o tripsina, pancreatina y leucozima.

En una modalidad, el dominio variable se exhibe sobre un bacteriófago cuando se incuba bajo las condiciones (i) o (ii), por ejemplo, en un tamaño de biblioteca de fagos de 106 a 1013, por ejemplo, de 108 a 1012 unidades replicativas (viriones infecciosos).

En una modalidad, el dominio variable se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), IL-1, o TNF-a en seguida de la incubación bajo las condiciones (i) o (ii), por ejemplo, evaluándose utilizando BiaCoreMR o ELISA, por ejemplo, ELISA de fagos, o ELISA de fagos monoclonales.

En una modalidad, los dominios variables se enlazan específicamente a la proteína A o a la proteína L. En una modalidad, está presente un enlace específico a la proteína A o L en seguida de la incubación bajo las condiciones (i) o (ii).

En una modalidad, los dominios variables pueden tener una lectura de OD 450 ©n el ELISA, por ejemplo, ELISA de fagos o ELISA de fagos monoclonales) de cuando menos 0.404, por ejemplo, en seguida de la incubación bajo las condiciones (i) o (ii).

En una modalidad, los dominios variables exhiben (sustancialmente) una sola banda en la electroforesis en gel, por ejemplo, en seguida de la incubación bajo las condiciones (i) o (¡i).

En otra modalidad, un agente (dAb) se puede administrar localmente al ojo por medio de un dispositivo de suministro implantable. Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un dispositivo de suministro implantable que contiene, por ejemplo, el dAb de VEGF, IL-1, o TNF-a, para suministro ocular.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina (por ejemplo, dAb de VEGF, IL-1, o TNF-a), y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable para suministro ocular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1a ilustra la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593.

La Figura 1b ilustra la secuencia de aminoácidos de la fusión de DOM15-26-593-Fc.

La Figura 1c ilustra la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo Fe.

La Figura 2 ilustra la secuencia de aminoácidos de DOM 0400 PEG (un dAb anti-IL-1 pegilado, peso molecular de aproximadamente 52 KDa).

La Figura 3 ilustra la secuencia de aminoácidos de DOM4-130-54 (un dAb anti-IL-1).

La Figura 4 ilustra la secuencia de aminoácidos de Dom 1 h-131-206 (un dAb anti-TNF-alfa-R1 ).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Dentro de esta memoria descriptiva, la invención se ha descrito con referencia a las modalidades, de una manera que hace posible que se escriba una memoria descriptiva clara y concisa. Se pretende y se debe apreciar que las modalidades se pueden combinar diversamente o separar sin apartarse de la invención. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto ordinario en este campo (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación, y bioquímica). Se emplean técnicas convencionales para los métodos molecular, genético y bioquímico (véase en general, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel y colaboradores, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Edición, John Wiley & Sons, Inc., los cuales se incorporan a la presente como referencia), y para los métodos químicos.

Como se utiliza en la presente, el término "antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)" o "antagonista anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)", o similar, se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y puede inhibir una (es decir, una o más) función del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Como se utiliza en la presente, "péptido" se refiere a aproximadamente dos a aproximadamente 50 aminoácidos que se unen entre sí por medio de enlaces peptídicos.

Como se utiliza en la presente, "polipéptido" se refiere a cuando menos aproximadamente 50 aminoácidos que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos. Los polipéptidos, en términos generales, comprenden una estructura terciaria y se pliegan en dominios funcionales.

Como se utiliza en la presente, un péptido o polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo de dominio (dAb)) que es "resistente a la degradación por la proteasa" sustancialmente no se degrada mediante una proteasa cuando se incuba con la proteasa bajo las condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa. Un polipéptido (por ejemplo, un dAb) no se degrada sustancialmente cuando no más de aproximadamente el 25 por ciento, no más de aproximadamente el 20 por ciento, no más de aproximadamente el 15 por ciento, no más de aproximadamente el 14 por ciento, no más de aproximadamente el 13 por ciento, no más de aproximadamente el 12 por ciento, no más de aproximadamente el 11 por ciento, no más de aproximadamente el 10 por ciento, no más de aproximadamente el 9 por ciento, no más de aproximadamente el 8 por ciento, no más de aproximadamente el 7 por ciento, no más de aproximadamente el 6 por ciento, no más de aproximadamente el 5 por ciento, no más de aproximadamente el 4 por ciento, no más de aproximadamente el 3 por ciento, no más de aproximadamente el 2 por ciento, no más de aproximadamente el 1 por ciento, o sustancialmente nada de la proteína se degrada mediante la proteasa después de la incubación con la proteasa durante aproximadamente una hora a una temperatura adecuada para la actividad de la proteasa. Por ejemplo, a 37 ó 50 grados C. La degradación de la proteína se puede evaluar empleando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante SDS-PAGE o mediante un ensayo funcional (por ejemplo, enlace de ligando), como se describe en la presente.

Como se utiliza en la presente, "ligando objetivo" se refiere a un ligando que se enlaza específicamente o selectivamente mediante un polipéptido o péptido. Por ejemplo, cuando un polipéptido es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo, el ligando objetivo puede ser cualquier antígeno o epítopo deseado. El enlace al antígeno objetivo depende de que el polipéptido o péptido sea funcional. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo se refiere a IgG, IgM, IgA, IgD o IgE o un fragmento (tal como un Fab, F(ab')2, Fv, Fv enlazado con disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv enlazado con disulfuro, diacuerpo) ya sea derivados a partir de cualquier especie que produzca naturalmente un anticuerpo, o creados mediante la tecnología de ADN recombinante; ya sea aislados a partir de suero, células-B, hibridomas, transfectomas, levadura, o bacterias.

Como se utiliza en la presente, "formato de anticuerpo" se refiere a cualquier estructura de polipéptido adecuada en donde se pueden incorporar uno o más dominios variables de anticuerpo como para conferir especificidad de enlace para el antígeno sobre la estructura. Una variedad de formatos de anticuerpos adecuados son conocidos en la materia, tales como los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos humanos, los anticuerpos de una sola cadena, los anticuerpos biespecíficos, las ^cadenas pesadas de anticuerpos, las cadenas ligeras de anticuerpos, los homodímeros y heterodímeros de las cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpos, los fragmentos de enlace de antígeno de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, un fragmento Fv (por ejemplo, Fv de una sola cadena (scFv), un Fv enlazado con disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un solo dominio variable de anticuerpo (por ejemplo, un dAb, VH, VHH, Vl), y las versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, modificadas mediante la unión covalente de polietilenglicol u otro polímero adecuado, o un VHH humanizado).

La frase "un solo dominio variable de inmunogiobulina" se refiere a un dominio variable de anticuerpo (VH, VHH. VL) que se enlaza específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V. Un solo dominio variable de inmunogiobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables o dominios variables en donde las otras regiones o dominios no sean requeridas para el enlace de antígeno mediante el único dominio variable de inmunogiobulina (es decir, en donde el único dominio variable de inmunogiobulina se enlace al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es el mismo que un "solo dominio variable de inmunogiobulina" como se utiliza el término en la presente. Un "único dominio variable de inmunogiobulina" es el mismo que un "solo dominio variable de inmunogiobulina" como se utiliza el término en la presente. Un "solo dominio variable de anticuerpo" es el mismo que un "solo dominio variable de inmunogiobulina" como se utiliza el término en la presente. Un solo dominio variable de inmunogiobulina es, en una modalidad, un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye los únicos dominios variables de anticuerpo a partir de otras especies, tales como roedor (por ejemplo, como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/29004, el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad), dAbs de tiburón nodriza y VHH de camélido. Los VHH de camélido son polipéptidos de un solo dominio variable de inmunoglobulina que se derivan a partir de las especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario, y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. El VHH puede ser humanizado. Un "dominio" es una estructura de proteína plegada que tiene una estructura terciaria independiente del resto de la proteína. En términos generales, los dominios son responsables de las propiedades funcionales separadas de las proteínas, y en muchos casos se puede agregar, remover o transferir a otras proteínas sin pérdida de la función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "solo dominio variable de anticuerpo" es un dominio de polipéptido plegado que comprende secuencias características de los dominios variables de anticuerpo. Por consiguiente, incluye los dominios variables de anticuerpo completos y los dominios variables modificados, por ejemplo, en donde uno o más ciclos han sido reemplazados por secuencias que no son características de los dominios variables de anticuerpo, o los dominios variables de anticuerpo que se han truncado o que comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos de dominios variables plegados que retienen cuando menos la actividad de enlace y la especificidad del dominio de longitud completa.

Como se utiliza en la presente, el término "dosis" se refiere a la cantidad de ligando administrada a un sujeto todo a la vez (dosis unitaria), o en dos o más administraciones durante un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, la dosis puede referirse a la cantidad de ligando (por ejemplo, el ligando que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza al antígeno objetivo) administrada a un sujeto durante el transcurso de un día (24 horas) (dosis diaria), dos días, una semana, dos semanas, tres semanas o uno o más meses (por ejemplo, mediante una sola administración, o mediante dos o más administraciones). El intervalo entre dosis puede ser cualquier cantidad de tiempo deseada.

La frase "vida media" se refiere al tiempo que se necesita para que la concentración en suero del ligando (por ejemplo, dAb, polipéptido o antagonista) se reduzca por el 50 por ciento, in vivo, por ejemplo, debido a la degradación del ligando y/o la eliminación o secuestramiento del ligando mediante los mecanismos naturales. Los ligandos de la invención se pueden estabilizar in vivo y su vida media se puede aumentar mediante el enlace con moléculas que resistan a la degradación y/o a la eliminación o al secuestramiento. Típicamente, estas moléculas son proteínas que se presentan naturalmente, las cuales tienen ellas mismas una larga vida media in vivo. La vida media de un ligando aumenta si su actividad funcional persiste, in vivo, durante un período más largo que un ligando similar que no sea específico para la molécula que aumenta la vida media.

Por ejemplo, un ligando específico para la albúmina de suero humano (HSA), y una molécula objetivo se compara con el mismo ligando en donde no está presente la especificidad con la albúmina de suero humano (HSA), es decir, no se enlaza HSA a la albúmina de suero humano (HSA) pero se enlaza a otra molécula. Por ejemplo, se puede enlazar a un tercer objetivo sobre la célula. Típicamente, la vida media aumenta por el 10 por ciento, 20 por ciento, 30 por ciento, 40 por ciento, 50 por ciento o más. Es posible un aumento en el intervalo de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o más de la vida media. De una manera alternativa, o en adición, es posible un aumento en el intervalo de hasta 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 150 veces de la vida media. Como se utiliza en la presente, "tamaño hidrodinámico" se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína, ligando), basándose en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión o el movimiento de una proteína a través de solución se puede procesar para derivar un tamaño aparente de la proteína, en donde el tamaño se da por el "radio de Stokes" o el "radio hidrodinámico" de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de tal manera que dos proteínas que tengan la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos, basándose en la conformación global de la proteína.

Como es referido en la presente, el término "compite" significa que el enlace de un primer objetivo con su dominio de enlace objetivo cognado es inhibido en la presencia de un segundo dominio de enlace que es específico para ese objetivo cognado. Por ejemplo, el enlace puede ser inhibido estéricamente, por ejemplo, mediante el bloqueo físico de un dominio de enlace o mediante la alteración de la estructura o del medio ambiente de un dominio de enlace, de tal manera que se reduce su afinidad o su avidez por un objetivo. Véase la Publicación Internacional Número WO2006038027 para conocer los detalles sobre la manera de llevar a cabo un ELISA de competencia y los experimentos BiaCore de competencia, para determinar la competencia entre el primero y el segundo dominios de enlace. Los cálculos de "homología" o "identidad" o "similitud" entre dos secuencias (los términos se utilizan indistintamente en la presente) se llevan a cabo como sigue. Las secuencias se alinean para el propósito de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos para una alineación óptima, y se pueden pasar por alto las secuencias no homologas para el propósito e la comparación). En una modalidad, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación, es de cuando menos el 30 por ciento, o cuando menos el 40 por ciento, o cuando menos el 50 por ciento, o cuando menos el 60 por ciento, o cuando menos el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 100 por ciento de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en la presente, "homología" de aminoácido o de ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o de ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. Las alineaciones de secuencias, y la homología, similitud o identidad de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos, como se definen en la presente, se pueden preparar y determinar utilizando el algoritmo de Secuencias BLAST 2, utilizando los parámetros por omisión (Tatusova, T. A. y colaboradores, FEMS Microbiol Lett, 774: 187-188 (1999).

Resistencia a la proteasa: La invención, en una modalidad, se refiere a dAbs, por ejemplo, dAbs anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), dAbs de TNFR1, dAbs de IL-1, para suministro al ojo, los cuales se han seleccionado mediante un método de selección para los dAbs resistentes a la proteasa que tienen una actividad biológica deseada, por ejemplo, que se enlazan al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), TNFR1 o IL-1. Se utilizan dos presiones selectivas en el método para producir un proceso eficiente para seleccionar polipéptidos que sean altamente estables y resistentes a la degradación por la proteasa, y que tengan la actividad biológica deseada. Como se describe en la presente, los péptidos y polipéptidos resistentes a la proteasa, en términos generales, retienen la actividad biológica. En contraste, los péptidos y polipéptidos sensibles a la proteasa se disocian o son digeridos por la proteasa en los métodos descritos en la presente, y, por consiguiente, pierden su actividad biológica. De conformidad con lo anterior, los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa se seleccionan en general basándose en su actividad biológica, tal como su actividad de enlace.

El medio ambiente ocular es uno que es rico en proteasas y, por consiguiente, el uso de dAbs resistentes a la proteasa para suministro ocular, como se describe en la presente, proporciona varias ventajas. Por ejemplo, los dominios variables que se seleccionan para la resistencia a la degradación proteolítica mediante una proteasa (por ejemplo, tripsina), son también resistentes a la degradación mediante otras proteasas (por ejemplo, elastasa, leucozima). La resistencia a la proteasa puede correlacionarse con una temperatura de fusión más alta (Tm) del péptido o polipéptido. Las temperaturas de fusión más altas indican dominios variables, antagonistas, péptidos y polipéptidos más estables. La resistencia a la degradación por la proteasa también puede correlacionarse con un enlace de alta afinidad a los ligandos objetivo. Por consiguiente, los métodos descritos y referenciados en la presente (en la Publicación Internacional Número WO 2008149143) proporcionan una manera eficiente de seleccionar, aislar y/o recuperar los dAbs que tengan una actividad biológica deseada y que sean adecuados para los usos terapéuticos y/o de diagnóstico ocular in vivo, debido a que son resistentes a la proteasa y estables. En una modalidad, la resistencia a la proteasa puede correlacionarse con una mejor farmacocinética (PK), por ejemplo, mejor sobre un dominio variable, antagonista, péptido o polipéptido que no sea resistente a la proteasa. La mejor farmacocinética (PK) puede ser una mejor AUC (área debajo de la curva) y/o una mejor vida media. La resistencia a la proteasa también puede correlacionarse con una mejor estabilidad del dominio variable, antagonista, péptido o polipéptido, al desgarre y/o a la tensión térmica y/o una propensión reducida a la aglomeración durante la nebulización, por ejemplo, mejor sobre un dominio variable, antagonista, péptido o polipéptido que no sea resistente a la proteasa. En una modalidad, la resistencia a la proteasa se correlaciona con una mejor estabilidad al almacenamiento, por ejemplo, mejor sobre un dominio variable, antagonista, péptido o polipéptido que no sea resistente a la proteasa. En un aspecto, se proporcionan una, dos, tres, cuatro o todas las ventajas, siendo las ventajas, la resistencia a la degradación por la proteasa, una Tm más alta, y un enlace de alta afinidad con el ligando objetivo.

Los métodos descritos y referenciados en la presente (en la Publicación Internacional Número WO 2008/149143) se pueden emplear como parte de un programa para aislar los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa, por ejemplo, dAbs que pueden comprender, si se desea, otros métodos de selección adecuados. En estas situaciones, los métodos descritos en la presente se pueden emplear en cualquier punto deseado del programa, tal como antes o después de emplear otros métodos de selección.

En ciertas modalidades, el dAb para suministro ocular se selecciona para la resistencia a la degradación mediante tripsina, elastasa o leucozima, y se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En estas modalidades, se proporciona una biblioteca o repertorio que comprende dAbs, y se combina con tripsina, elastasa o leucozima (o una preparación, extracto u homogenato biológico que comprende tripsina) bajo las condiciones adecuadas para la digestión proteolítica. Se seleccionan dAbs resistentes a tripsina, elastasa o leucozima que se enlazan al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Por ejemplo, el dAb resistente a la proteasa no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37°C en una solución de proteasa al 0.04 por ciento (peso/peso) durante un período de cuando menos aproximadamente 2 horas. En otro ejemplo, el dAb resistente a la proteasa no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37°C en una solución de proteasa al 0.04 por ciento (peso/peso) durante un período de cuando menos aproximadamente 3 horas. En otro ejemplo, el dAb resistente a la proteasa no se degrada sustancialmente cuando se incuba a 37°C en una solución de proteasa al 0.04 por ciento (peso/peso) durante un período de cuando menos aproximadamente 4 horas, de cuando menos aproximadamente 5 horas, de cuando menos aproximadamente 6 horas, de cuando menos aproximadamente 7 horas, de cuando menos aproximadamente 8 horas, de cuando menos aproximadamente 9 horas, de cuando menos aproximadamente 10 horas, de cuando menos aproximadamente 11 horas, o de cuando menos aproximadamente 12 horas.

En otro aspecto, se proporciona un método para la producción de un repertorio de los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa (por ejemplo, dAbs). El método comprende proporcionar un repertorio de péptidos o polipéptidos; combinar el repertorio de péptidos o polipéptidos y una proteasa bajo las condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa; y recuperar una pluralidad de péptidos o polipéptidos que se enlazan específicamente con el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), en donde se produce un repertorio de los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa. En la presente se describen proteasas, sistemas de exhibición, condiciones para la actividad de la proteasa, y métodos para seleccionar los péptidos o polipéptidos que sean adecuados para utilizarse en el método, con respecto a los otros métodos.

En algunas modalidades, se utiliza un sistema de exhibición (por ejemplo, un sistema de exhibición que se enlaza con la función de codificación de un ácido nucleico y las características funcionales del péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico) que comprende un repertorio de péptidos o polipéptidos, y el método comprende además amplificar o aumentar el número de copias de los ácidos nucleicos que codifican la pluralidad de los péptidos o polipéptidos seleccionados. Los ácidos nucleicos se pueden amplificar empleando cualquier método adecuado, tal como mediante amplificación de fagos, crecimiento celular, o reacción en cadena de la polimerasa.

En las modalidades particulares, se proporciona un método para la producción de un repertorio de los polipéptidos resistentes a las proteasas que comprenden dAbs anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El método comprende proporcionar un repertorio de polipéptidos que comprenden dAbs anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); combinar el repertorio de péptidos o polipéptidos y una proteasa (por ejemplo, tripsina, elastasa, leucozima) bajo las condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa; y recuperar una pluralidad de polipéptidos que comprenden dAbs que tienen especificidad de enlace para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El método se puede emplear para producir un repertorio puro, o un repertorio que se incline hacia una especificidad de enlace deseada, tal como un repertorio de maduración de afinidad basándose en un dAb progenitor que tenga especificidad de enlace para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Selección/ Ai si a miento/Recuperación Un péptido o polipéptido resistente a la proteasa (por ejemplo, una población de los polipéptidos resistentes a las proteasas) se puede seleccionar, aislar y/o recuperar a partir de un repertorio o biblioteca (por ejemplo, en un sistema de exhibición) empleando cualquier método adecuado. En una modalidad, un polipéptido resistente a la proteasa se selecciona o se aisla basándose en una característica seleccionable (por ejemplo, una característica física, una característica química, o una característica funcional). Las características funcionales seleccionables adecuadas incluyen las actividades biológicas de los péptidos o polipéptidos en el repertorio, por ejemplo, que se enlazan a un ligando genérico (por ejemplo, un súper-antígeno), que se enlazan a un ligando objetivo (por ejemplo, un antígeno, un epítopo, un sustrato), que se enlazan a un anticuerpo (por ejemplo, a través de un epítopo expresado sobre un péptido o polipéptido), y la actividad catalítica. (Véase, por ejemplo, Tomlinson y colaboradores, Publicaciones Internacionales Números WO 99/20749; WO 01/57065; y WO 99/58655). En una modalidad, la selección se basa en un enlace específico para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En otra modalidad, la selección se hace con base en la característica funcional seleccionada para producir un segundo repertorio en donde los miembros son resistentes a la proteasa, seguida por la selección de un miembro a partir del segundo repertorio que se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

En algunas modalidades, el péptido o polipéptido resistente a la proteasa se selecciona y/o se aisla a partir de una biblioteca o repertorio de péptidos o polipéptidos en donde sustancialmente todos los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa comparten una característica seleccionable común. Por ejemplo, el péptido o polipéptido resistente a la proteasa se puede seleccionar a partir de una biblioteca o repertorio en donde sustancialmente todos los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa se enlazan a un ligando genérico común, se enlazan a un objetivo de ligando común, se enlazan (o son enlazados por) a un anticuerpo común, o poseen una actividad catalítica común. Este tipo de selección es en particular útil para la preparación de un repertorio de los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa que se basan en un péptido o polipéptido progenitor que tiene una actividad biológica deseada, por ejemplo, cuando se lleva a cabo la maduración de afinidad de un solo dominio variable de inmunoglobulina.

La selección basada en el enlace a un ligando genérico común puede proporcionar una colección o población de péptidos o polipéptidos que contengan todos o sustancialmente todos los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa que eran los componentes de la biblioteca o repertorio original. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos que se enlazan a un ligando objetivo o a un ligando genérico, tales como la proteína A, la proteína L, o un anticuerpo, se pueden seleccionar, aislar y/o recuperar mediante paneo o utilizando una matriz de afinidad adecuada. El paneo se puede llevar a cabo mediante la adición de una solución de ligando (por ejemplo, ligando genérico, ligando objetivo) a un recipiente adecuado (por ejemplo, tubo, caja de Petri), y permitiendo que el ligando llegue a depositarse o a recubrirse sobre las paredes del recipiente. El exceso de ligando se puede lavar, y se pueden agregar los péptidos o poíipéptidos (por ejemplo, un repertorio que se ha incubado con la proteasa) al recipiente, y el recipiente se mantiene bajo las condiciones adecuadas para que los péptidos o poíipéptidos se enlacen al ligando inmovilizado. Los péptidos o poíipéptidos no enlazados se pueden lavar, y los péptidos o poíipéptidos enlazados se pueden recuperar empleando cualquier método adecuado, tal como raspando o disminuyendo el pH, por ejemplo.

Las matrices de afinidad de ligando adecuadas en términos generales contienen un soporte sólido o grano (por ejemplo, agarosa) al que se une covalentemente o no covalentemente un ligando. La matriz de afinidad se puede combinar con los péptidos o poíipéptidos (por ejemplo, un repertorio que se haya incubado con proteasa) empleando un proceso por lotes, un proceso en columna, o cualquier otro proceso adecuado, bajo las condiciones adecuadas para enlazar los péptidos o poíipéptidos al ligando sobre la matriz. Los péptidos o poíipéptidos que no se enlacen a la matriz de afinidad se pueden lavar, y los péptidos o poíipéptidos enlazados se pueden eluir y recuperar empleando cualquier método adecuado, tal como elución con un regulador a un pH más bajo, con un agente desnaturalizante ligero (por ejemplo, urea), o con un péptido que compita para enlazarse al ligando. En un ejemplo, se combina un ligando objetivo biotinilado con un repertorio bajo las condiciones adecuadas para que los péptidos o polipéptidos en el repertorio se enlacen al ligando objetivo (VEGF). Los péptidos o polipéptidos enlazados se recuperan utilizando avidina o estreptavidina inmovilizada (por ejemplo, sobre un grano). En algunas modalidades, el ligando genérico es un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo. Los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno que se enlazan a las características estructurales de los péptidos o polipéptidos que están sustancialmente conservados en los péptidos o polipéptidos de una biblioteca o repertorio son particularmente útiles como ligandos genéricos. Los anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno adecuados para utilizarse como ligandos para el aislamiento, selección y/o recuperación de los péptidos o polipéptidos resistentes a la proteasa, pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar empleando cualquier método adecuado. Ácidos nucleicos, células huésped y métodos para producir los polipéptidos resistentes a las proteasas: El péptido o polipéptido resistente a la proteasa seleccionado por el método descrito en la presente también se puede producir en un sistema de expresión in vitro adecuado, por ejemplo, E.coli o las especies de Pichia, por ejemplo, P. pastoris, mediante síntesis química, o mediante cualquier otro método adecuado.

Polipéptidos, dAbs y Antagonistas: Como se describe en la presente, los dAbs resistentes a la proteasa en términos generales se enlazan a su ligando objetivo con una alta afinidad.

Por ejemplo, el dAb de VEGF puede enlazarse al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con una afinidad (KD; KD=Kd9sactivada (kd) / Kactivada (ka), como se determina mediante resonancia de plasmón superficial) de 300 nM a 1 pM (es decir, 3 x 10"7 a 5 x 10"12M), por ejemplo, de 50 nM a 1 pM, por ejemplo, de 5 nM a 1 pM, y, por ejemplo, de 1 nM a 1 pM; por ejemplo, KD de 1 x 10'7 M o menos, por ejemplo, 1 x 10"8 M o menos, por ejemplo, 1 x 10'9 M o menos, por ejemplo, 1 x 10'10 M o menos, y, por ejemplo, 1 x 10'11 M o menos; y/o una constante de índice de Kdesactivada de 5 x 10"1s"1 a 1 x 10'7s"\ por ejemplo, 1 x 10"2s"1 a 1 x 10'6s"1, por ejemplo, 5 x 10"3s'1 a 1 x 10"5s"1, por ejemplo, 5 x 10"1s'1 o menos, por ejemplo, 1 x 10"2s"' o menos, por ejemplo, 1 x 10"3s"1 o menos, por ejemplo, 1 x 10"4s"1 o menos, e. 1 x 10"5s"1 o menos, y por ejemplo, 1 x 10"6s'1 o menos, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

Aunque no nos obligamos por ninguna teoría en particular, se cree que los péptidos y polipéptidos que son resistentes a las proteasas tienen una entropía más baja y/o una energía de estabilización más alta. Por consiguiente, la correlación entre la resistencia a la proteasa y un enlace de alta afinidad puede estar relacionado con lo compacto y la estabilidad de las superficies de los péptidos y polipéptidos, y los dAbs seleccionados mediante el método descrito en la presente.

En una modalidad, un dAb de VEGF inhibe el enlace del factor de crecimiento endotelial vascular en una concentración 50 (IC50) de IC50 de aproximadamente 1 µ? o menos, de aproximadamente 500 nM o menos, de aproximadamente 100 nM o menos, de aproximadamente 75 nM o menos, de aproximadamente 50 nM o menos, de aproximadamente 10 nM o menos, o de aproximadamente 1 nM o menos.

En ciertas modalidades, el dAb de VEGF se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano, y se disocia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano con una constante de disociación (KD) de 300 nM a 1 pM, ó de 300 nM a 5 pM, ó de 50 nM a 1 pM, ó de 50 nM a 5 pM, ó de 50 nM a 20 pM, o de aproximadamente 10 pM, o de aproximadamente 15 pM, o de aproximadamente 20 pM, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. En ciertas modalidades, el polipéptido, dAb, o antagonista se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano, y se disocia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano con una constante de índice de Kdesact¡vada de 5 x 10"1S"1 a 1 x 10"7s"1, por ejemplo, de 1 x 10"2s"1 a 1 x 10'6s"\ por ejemplo, de 5 x 10'3s'1 a 1 x 10"5s'1, por ejemplo, de 5 x 10'1s"1 o menos, por ejemplo, de 1 x 10"2s"1 o menos, por ejemplo de 1 x 10"3s'1 o menos, por ejemplo, de 1 x 10"4s"1 o menos, por ejemplo, de 1 x 10"5s"1 o menos, y por ejemplo, de 1 x 10"6s'1 o menos, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

En ciertas modalidades, el dAb de VEGF se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano, con una Kaclivada de 1 x 10'3M'1s"1 a 1 x 10"7M'1s"1 , o de 1 x 10"3M"1s"1 a 1 x 10"6M"1s"1, o de aproximadamente 1 x 10"4M'1s'1 , o de aproximadamente 1 x 10'5M"1s"1. En una modalidad, el polipéptido, dAb, o antagonista se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano, y se disocia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano con una constante de disociación (KD) , y una Kdesact¡vada como se define en este párrafo. En una modalidad, el polipéptido, dAb, o antagonista se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), por ejemplo, al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano, y se disocia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano con una constante de disociación ( D), y una Kactivada como se define en este párrafo. En algunas modalidades, el polipéptido o dAb se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano) con una KD y/o Kdesactivada y/o Kactil/ada como se menciona en este párrafo, y comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos o cuando menos aproximadamente, el 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, o 99 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dAb con la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593.

El dAb se puede expresar en E. coli o en las especies de Pichia (por ejemplo, P. pastoris). En una modalidad, el ligando o el monómero de dAb se secreta en una cantidad de cuando menos aproximadamente 0.5 miligramos/litro cuando se expresa en E. coli o en las especies de Pichia (por ejemplo, P. pastoris). Aunque los ligandos y monómeros de dAb descritos en la presente pueden ser secretables cuando se expresan en E. coli o en las especies de Pichia (por ejemplo, P. pastoris), se pueden producir empleando cualquier método adecuado, tal como los métodos químicos sintéticos o los métodos de producción biológicos que no emplean E. coli o las especies de Pichia.

En algunas modalidades, el polipéptido, dAb, o antagonista no comprende un dominio variable de inmunoglobulina de camélido, o uno o más aminoácidos de estructura que son únicos para los dominios variables de inmunoglobulina codificados por los segmentos de genes de anticuerpos de la línea germinal de camélido, por ejemplo, en la posición 108, 37, 44, 45 y/o 47.

Los antagonistas del factor de crecimiento endotelial vascular pueden ser monovalentes o multivalentes. En algunas modalidades, el antagonista es monovalente y contiene un sitio de enlace que interactúa con el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el sitio de enlace proporcionado por un polipéptido o dAb de la invención. Los antagonistas monovalentes se enlazan a un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y no pueden inducir reticulación o formación de racimo con el factor de crecimiento endotelial vascular sobre la superficie de las células, lo cual puede conducir a la activación del receptor y a la transducción de señales.

De una manera alternativa, el antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular es multivalente. Los antagonistas multivalentes del factor de crecimiento endotelial vascular pueden contener dos o más copias de un sitio de enlace particular para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o contienen dos o más diferentes sitios de enlace que se enlazan al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), siendo cuando menos uno de los sitios de enlace proporcionado por un dAb de la invención. Por ejemplo, como se describe en la presente, el antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular puede ser un dímero, trímero o multímero que comprende dos o más copias de un dAb que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o dos o más dAbs diferentes que se enlazan al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

En otras modalidades, el dAb se enlaza específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) con una KD descrita en la presente, e inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xeno-injerto de murino convencional (por ejemplo, inhibe el crecimiento tumoral por cuando menos aproximadamente el 10 por ciento, comparándose con un control adecuado). En una modalidad, el polipéptido, dAb, o antagonista inhibe el crecimiento tumoral por cuando menos aproximadamente el 10 por ciento, o por cuando menos aproximadamente el 25 por ciento, o por cuando menos aproximadamente el 50 por ciento, comparándose con un control adecuado en un modelo de xeno-injerto de murino convencional, cuando se administra a aproximadamente 1 miligramo/kilogramo o más, por ejemplo, a aproximadamente 5 ó 10 miligramos/kilogramo.

En otras modalidades, el polipéptido, dAb, o antagonista se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y antagoniza la actividad del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en un ensayo celular convencional con una ND50 de < 100 nM.

En ciertas modalidades, los dAbs son eficaces en modelos animales de enfermedad ocular cuando se administra una cantidad efectiva. En términos generales, una cantidad efectiva es de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo (por ejemplo, de aproximadamente 1 miligramo/ kilogramo, de aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, de aproximadamente 9 miligramos/kilogramo, o de aproximadamente 10 miligramos/kilogramo). El dAb se puede administrar a una frecuencia de dosificación, por ejemplo, de una o dos veces al día, una o dos veces por semana, o una o dos veces al mes.

En términos generales, los dAbs se utilizarán en una forma purificada junto con vehículos farmacéuticamente apropiados para suministro ocular. Típicamente, estos vehículos pueden incluir soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, cualquiera incluyendo una solución salina y/o un medio regulado. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si es necesario mantener un complejo de polipéptido en suspensión, se pueden seleccionar a partir de espesantes, tales como carboxi-metil-celulosa, polivinil-pirrolidona, gelatina, y alginatos. También puede haber presentes conservadores y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición). Se puede utilizar una variedad de formulaciones adecuadas, incluyendo formulaciones de liberación prolongada. Éstas podrían comprender implantes, geles, nanopartículas, y micropartículas. Las nano- y micro-partículas de PLA cargadas con fármaco se han utilizado para suministrar el fármaco al segmento posterior del ojo después del suministro sub-conjuntival de la formulación (Kompella y colaboradores, IOVS 2003 44(3) 1192-1201). En particular, las microesferas se retienen en el sitio de suministro y parecen ser más apropiadas para el suministro retinal del fármaco, comparándose con las nanopartículas, las cuales se pueden eliminar más fácilmente (Amrite y colaboradores, ARVO Extracto #5067/B391, 2003).

Los ligandos (por ejemplo, antagonistas) de la presente invención se pueden utilizar como composiciones administradas por separado o en conjunto con otros agentes. Éstos pueden incluir diferentes fármacos para suministro ocular al ojo, y/o potenciadores de penetración oculares, y/o potenciadores de viscosidad.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de otros diferentes agentes en conjunto con los ligandos de la presente invención, o inclusive combinaciones de ligandos de acuerdo con la presente invención, que tengan diferentes especificidades, tales como los ligandos seleccionados utilizando diferentes objetivos o epítopos de antígeno, ya sea que se reserven o no antes de su administración.

La dosificación precisa y la frecuencia de administración de los dAbs al ojo dependerán del a edad, del sexo, y de la condición del paciente, de la administración concurrente de otros fármacos, de las contra-indicaciones y otros parámetros que deben ser tomados en cuenta por el médico.

Los dAbs de esta invención se pueden liofilizar para el almacenamiento, y se pueden reconstituir en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es efectiva con las inmunoglobulinas convencionales, y se pueden emplear las técnicas de liofilizacion y reconstitución conocidas en este campo. Será apreciado por los expertos en la materia que la liofilizacion y la reconstitución pueden conducir a diferentes grados de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con las inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos de IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos de IgG), y que se puede tener que ajustar hacia arriba los niveles de uso para compensarlo.

Las composiciones que contienen los presentes dAbs o un cóctel de los mismos, se pueden administrar para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para llevar a cabo la inhibición, supresión, modulación, aniquilación, cuando menos parcial, o algún otro parámetro mensurable, de una población de células seleccionadas, se pueden definir como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades necesarias para alcanzar esta dosificación dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunológico del paciente. El médico experto será capaz de determinar el intervalo de dosificación apropiado para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad.

El tratamiento o la terapia que se lleva a cabo utilizando las composiciones descritas en la presente, se considera "efectiva" si se reducen uno o más síntomas (por ejemplo, por cuando menos el 10 por ciento o por cuando menos un punto en una escala de evaluación clínica), en relación con los síntomas presentes antes del tratamiento, o en relación con los síntomas en un individuo (un ser humano o un modelo animal) no tratado con esa composición, o con otro control adecuado. Los síntomas obviamente variarán dependiendo de la enfermedad o del trastorno dirigido, pero pueden ser medidos por un médico o técnico ordinariamente experto. Estos síntomas se pueden medir, por ejemplo, mediante el monitoreo del nivel de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o del trastorno (por ejemplo, los niveles de un enzima o metabolito correlacionado con la enfermedad, los números de células afectadas, etc.), mediante el monitoreo de las manifestaciones físicas, o mediante una escala de evaluación clínica aceptada.

De una manera similar, la profilaxis que se lleva a cabo utilizando una composición como se describe en la presente es "efectiva" si el establecimiento o la gravedad de uno o más síntomas se demora, se reduce, o se elimina en relación con esos síntomas en un individuo similar (un ser humano o un modelo animal) no tratado con la composición.

En una modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad o condición ocular, seleccionada a partir de, por ejemplo, cáncer (por ejemplo, un tumor sólido), enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, enfermedad proliferativa vascular (por ejemplo, AMD (degeneración macular relacionada con la edad)), el cual comprende administrar a un mamífero que lo necesite, una dosis o cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido, un dAb que se enlace al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), o un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular de acuerdo con la invención, o a la IL-1, o al TNF-a o TNF-aR. Los ejemplos de estas enfermedades o condiciones oculares incluyen degeneración macular relacionada con la edad (AMD), Uveítis, ojo seco, retinopatía diabética, y edema macular diabético.

Formatos: El aumento de la vida media es útil en las aplicaciones in vivo de las inmunoglobulinas, en especial de los anticuerpos, y más especialmente de los fragmentos de anticuerpos de tamaño pequeño. Estos fragmentos (Fvs, Fvs enlazados con disulfuro, Fabs, scFvs, dAbs) pueden experimentar una rápida eliminación del cuerpo; por consiguiente, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo rápidamente, y son rápidos de producirse y manejarse, sus aplicaciones in vivo han sido limitadas por su persistencia sólo breve in vivo. Por consiguiente los dAbs descritos en la presente se pueden modificar para proporcionar un aumento de su vida media in vivo y, en consecuencia, tiempos de persistencia más largos en el cuerpo.

Los métodos para el análisis farmacocinético y para la determinación de la vida media del ligando serán familiares para los expertos en este campo. Los detalles se pueden encontrar en Kenneth, A y colaboradores: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, y en Peters y colaboradores, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Revisión, ex-Edición (1982), los cuales describen los parámetros farmacocinéticos, tales como las vidas medias t-alfa y t-beta, y el área debajo de la curva (AUC).

Las vidas medias (t½-alfa y t½-beta), y el área debajo de la curva (AUC) se pueden determinar a partir de una curva de la concentración en suero del ligando contra el tiempo. Se puede utilizar el paquete de análisis WinNonlin (disponible en Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EUA), por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (la fase alfa), el ligando experimenta principalmente la distribución en el paciente, con alguna eliminación. Una segunda fase (la fase beta) es la fase terminal cuando el ligando ya se ha distribuido, y la concentración en suero está disminuyendo a medida que se elimina el ligando del paciente. La vida media t-alfa es la vida media de la primera fase, y la vida media t-beta es la vida media de la segunda fase. Por consiguiente, en una modalidad, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene una vida media t-a en el intervalo de 15 minutos o más. En una modalidad, el extremo más bajo del intervalo es de 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas ó 12 horas. En adición, o de una manera alternativa, un ligando o una composición de acuerdo con la invención, tendrá una vida media t-a en el intervalo de hasta e incluyendo 12 horas. En una modalidad, el extremo más alto del intervalo es de 11, 10, 9, 8, 7, 6 ó 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es de 1 a 6 horas, de 2 a 5 horas, o de 3 a 4 horas.

En una modalidad, el dAb, o una composición que comprende un dAb de acuerdo con la invención, tiene una vida media t-ß en el intervalo de 30 minutos o más. En una modalidad, el extremo más bajo del intervalo es de 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas, ó 12 horas. En adición, o de una manera alternativa, un ligando, o una composición de acuerdo con la invención, tiene una vida media t-ß en el intervalo de hasta e incluyendo 21 días. En una modalidad, el extremo más alto del intervalo es de 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, o 20 días. En una modalidad, un ligando, o una composición de acuerdo con la invención, tendrá una vida media t-ß en el intervalo de 12 a 60 horas. En una modalidad adicional, estará en el intervalo de 12 a 48 horas. En una modalidad todavía adicional, estará en el intervalo de 12 a 26 horas.

En adición, o de una manera alternativa a los criterios anteriores, la presente invención proporciona un "dAb, o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención, que tiene un valor AUC (área debajo de la curva) en el intervalo de 1 miligramo*min/mililitro o más. En una modalidad, el extremo más bajo del intervalo es de 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ó 300 miligramos^min/mililitro. En adición, o de una manera alternativa, un ligando, o una composición de acuerdo con la invención, tiene una AUC en el intervalo de hasta 600 miligramos«min/mililitro. En una modalidad, el extremo más alto del intervalo es de 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 miligramos»min/mililitro. En una modalidad, un ligando de acuerdo con la invención tendrá una AUC en el intervalo seleccionado a partir del grupo que consiste en los siguientes: de 15 a 150 miligramos«min/mililitro, de 15 a 100 miligramos»min/mililitro, de 15 a 75 miligramos»min/mililitro, y de 15 a 50 miligramos»min/ mililitro.

Los dAbs de la invención se pueden formatear para tener un tamaño hidrodinámico más grande, por ejemplo, mediante la unión de un grupo PEG, albúmina de suero, transferrina, receptor de transferrina, o cuando menos la porción de enlace de transferrina del mismo, una región Fe de anticuerpo, o mediante la conjugación con un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, los dAbs se pueden formatear como un fragmento de enlace de antígeno más grande de un anticuerpo, o como un anticuerpo (por ejemplo, se pueden formatear como un Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). En otra modalidad, los dAbs de acuerdo con la invención se pueden formatear como una fusión, o se pueden conjugar con otro polipéptido o péptido.

El tamaño hidrodinámico de los ligandos (por ejemplo, monómeros y multímeros de dAb) de la invención se puede determinar empleando los métodos que son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, se puede utilizar cromatografía de filtración de gel para determinar el tamaño hidrodinámico de un ligando. Las matrices de filtración de gel adecuadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de los ligandos, tales como las matrices de agarosa reticulada, son bien conocidas y están fácilmente disponibles.

El tamaño de un ligando es decir, el formato del dAb (por ejemplo, el tamaño de una fracción de PEG unida a un monómero de dAb), se puede variar dependiendo de la aplicación deseada, por ejemplo, si se desea que el dAb permanezca en la circulación sistémica durante un período de tiempo más largo, se puede aumentar el tamaño, por ejemplo, mediante su formateo como una proteína de tipo Ig.

Extensión de la vida media mediante la dirección de un antíqeno o epítopo que aumenta la vida media in vivo El tamaño hidrodinámico de un ligando y su vida media en suero también se pueden aumentar mediante la conjugación o asociación de un dAb con un dominio de enlace (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se enlace a un antígeno o epítopo que aumente la vida media in vivo, como se describe en la presente. Por ejemplo, el dAb de VEGF se puede conjugar o enlazar a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-albúmina de suero o anti-receptor de Fe neonatal, por ejemplo, a un dAb, Fab, Fab' o scFv anti-albúmina de suero (SA) o anti-receptor de Fe neonatal, o a un Aficuerpo anti-albúmina de suero (SA) o a un Aficuerpo antireceptor de Fe neonatal Fe, o a un avímero anti-albúmina de suero (SA), o a un dominio de enlace anti-albúmina de suero (SA) que comprenda un andamiaje seleccionado a partir de, pero de preferencia no limitándose a, el grupo que consiste en CTLA-4, lipocalina, SpA, un Aficuerpo, un avímero, un GroEl, y fibronectina (véase la Publicación Internacional del TCP Número PCT/GB2008/000453 presentada el 8 de Febrero de 2008 para una divulgación de estos dominios de enlace, cuyos dominios y sus secuencias se incorporan a la presente como referencia y forman parte de la divulgación del presente texto). La conjugación se refiere a una composición que comprende un polipéptido, dAb o antagonista de la invención, que se enlaza (covalentemente o no covalentemente) a un dominio de enlace que se enlaza a la albúmina de suero.

Los polipéptidos que mejoran la vida media en suero in vivo adecuados incluyen, por ejemplo, las proteínas de fusión de ligando-agente farmacéutico específicas del receptor de transferrina (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,977,307, cuyas enseñanzas se incorporan a la presente como referencia), del receptor de células endoteliales capilares del cerebro, transferrina, receptor de transferrina (por ejemplo, receptor de transferrina soluble), insulina, receptor de factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF 1), receptor de factor de crecimiento tipo insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina, factor de coagulación sanguínea X, a1 -antitripsina, y HFN 1a. Los polipéptidos que mejoran la vida media en suero adecuados también incluyen glicoproteína alfa-1 (orosomucoide; AAG), antiquimiotripsina alfa-1 (ACT), microglobulina alfa-1 (proteína HC; AIM), anti-trombina III (AT III), apolipoproteína A-1 (Apo A-1), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente de complemento C3 (C3), componente de complemento C4 (C4), inhibidor de esterasa C1 (C1 INH), proteína reactiva con C (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína(a) (Lp(a)), proteína de enlace de mañosa (MBP), mioglobina (Myo), pre-albúmina (transtiretina; PAL), proteína de enlace de retinol (RBP), y factor reumatoide (RF).

Las proteínas a partir de la matriz extracelular adecuadas incluyen, por ejemplo, colágenos, lamininas, integrinas y fibronectina. Los colágenos son las proteínas mayores de la matriz extracelular. Actualmente se conocen aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno, que se encuentran en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo, colágeno tipo I (que cuenta por el 90 por ciento de colágeno del cuerpo) que se encuentra en el hueso, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos, o colágeno tipo II, que se encuentra en el cartílago, disco vertebral, notocorda, y humor vitreo del ojo.

Las proteínas de la sangre adecuadas incluyen, por ejemplo, proteínas de plasma (por ejemplo, fibrina, macroglobulina a-2, albúmina de suero, fibrinógeno (por ejemplo, fibrinógeno A, fibrinógeno B), proteína amiloide de suero A, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y microglobulina B-2), enzimas e inhibidores de enzimas (por ejemplo, plasminógeno, lisozima, cistatina C, antitripsina alfa-1, e inhibidor de tripsina pancreática), proteínas del sistema inmunológico, tales como proteínas de inmunoglobulina (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cadenas ligeras de inmunoglobulina (kappa/lambda)), proteínas de transporte (por ejemplo, proteína de enlace de retinol, microglobulina a-1), defensinas (por ejemplo, beta-defensina 1, defensina de neutrófilos 1, defensina de neutrófilos 2, y defensina de neutrófilos 3), y similares.

Las proteínas que se encuentran en la barrera hematoencefálica o en el tejido neural adecuadas incluyen, por ejemplo, receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato, y similares.

Los polipéptidos que mejoran la vida media en suero in vivo adecuados también incluyen las proteínas localizadas en el riñon {por ejemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador de aniones orgánico K1, antígeno de Heymann), las proteínas localizadas en el hígado (por ejemplo, deshidrogenasa de alcohol, G250), las proteínas localizadas en el pulmón (por ejemplo, componente secretor que se enlaza a la IgA), proteínas localizadas en el corazón (por ejemplo, HSP 27, el cual está asociado con la cardiomiopatía dilatada), las proteínas localizadas en la piel (por ejemplo, queratina), las proteínas específicas de los huesos, tales como las proteínas morfogenéticas (BMPs), las cuales son un subconjunto de la súper-familia de proteínas del factor de crecimiento transformante ß, que demuestran actividad osteogénica (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), las proteínas específicas de tumores (por ejemplo, antígeno de trofoblasto, receptor de herceptina, receptor de estrógeno, catepsinas (por ejemplo, catepsina B, la cual se puede encontrar en el hígado y en el bazo)).

Las proteínas específicas de las enfermedades adecuadas incluyen, por ejemplo, los antígenos expresados solamente en las células-T activadas, incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocitos), ligando de osteoprotegerina (OPGL; véase Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (un miembro de la súper-familia de receptores de TNF, expresado en las células-T activadas y específicamente sobre-regulado en las células productoras del virus de leucemia de células-T humanas tipo-l (HTLV-I); véase Immunol. 165 (1): 263-70 (2000)). Las proteínas específicas de las enfermedades adecuadas también incluyen, por ejemplo, metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres), incluyendo CG6512 de Drosophila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, FtsH de murino; y factores de crecimiento angiogénico, incluyendo factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placentario (PIGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas de mídquina-BB (PDGF), y f ractalquina.

Los polipéptidos que mejoran la vida media en suero in vivo adecuados también incluyen las proteínas de estrés, tales como proteínas de choque por calor (HSPs). Las proteínas de choque por calor (HSPs) normalmente se encuentran intracelularmente. Cuando se encuentran extracelularmente, esto es un indicador de que una célula ha muerto y derramó su contenido hacia afuera. Esta muerte celular no programada (necrosis) ocurre cuando, como un resultado de un trauma, enfermedad o lesión, las proteínas de choque por calor extracelulares desencadenan una respuesta a partir del sistema inmunológico.

El enlace a las proteínas de choque por calor (HSPs) extracelulares puede dar como resultado la localización de las composiciones de la invención en un sitio de enfermedad.

Las proteínas involucradas en el transporte de Fe adecuadas incluyen, por ejemplo, el receptor de Brambell (también conocido como FcRB). Este receptor de Fe tiene dos funciones, ambas de las cuales son potencialmente útiles para el suministro. Las funciones son: (1) transporte de IgG desde la madre hasta el hijo a través de la placenta, (2) protección de la IgG de la degradación, prolongando de esta manera su vida media en suero. Se piensa que el receptor recicla la IgG a partir de los endosomas. (Véase Holliger y colaboradores, Nat Biotechnol 15(7): 632-6 (1997).) dAbs que se enlazan a la albúmina de suero La invención, en una modalidad, comprende un primer dAb que se enlaza a una molécula ocular objetivo, por ejemplo, VEGF, IL-1, o TNF-a, y un segundo dAb que se enlaza a la albúmina de suero (SA), enlazándose el segundo dAb con la albúmina de suero (SA) con una KD, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, de 1 nM a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ó 500 µ? (es decir, x 10'9 a 5 x 10"), ó de 100 nM a 10 µ?, ó de 1 a 5 µ?, ó de 3 a 70 nM, ó de 10 nM a 1, 2, 3, 4 ó 5 µ?. Por ejemplo, de 30 a 70 nM, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. En una modalidad, el primer dAb (o un monómero de dAb) se enlaza a la albúmina de suero (SA) (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA)) con una KD, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, de aproximadamente 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM ó , 2 ó 3 µ?. En una modalidad, para un ligando específico doble que comprende un primer dAb anti-albúmina de suero (SA) y un segundo dAb para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la afinidad (por ejemplo, la KD y/o desaotivada. como se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando BiaCore) del segundo dAb por su objetivo es de 1 a 100,000 veces (por ejemplo, de 100 a 100,000, ó de 1,000 a 100,000, ó de 10,000 a 100,000 veces) la afinidad del primer dAb por la albúmina de suero (SA). En una modalidad, la albúmina de suero es albúmina de suero humano (HSA). Por ejemplo, el primer dAb se enlaza a la albúmina de suero (SA) con una afinidad de aproximadamente 10 µ?, mientras que el segundo dAb se enlaza a su objetivo con una afinidad de 100 pM. En una modalidad, la albúmina de suero es albúmina de suero humano (HSA). En una modalidad, el primer dAb se enlaza a la albúmina de suero (SA) (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA)) con una KD de aproximadamente 50, por ejemplo, 70, 100, 150 ó 200 nM. Los detalles de los ligandos específicos dobles se encuentran en las Publicaciones Internacionales Números WO03002609, WO04003019 y WO04058821.

Los dAbs de la invención, en una modalidad, pueden comprender un dAb que se enlaza a la albúmina de suero (SA) con una KD, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, de 1 nM a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ó 500 µ? (es decir, de 1 x 10"9 a 5 x 10"4), ó de 100 nM a 10 µ?, ó de 1 a 5 µ?, ó de 3 a 70 nM, ó de 10 nM a 1, 2, 3, 4 ó 5 µ?. Por ejemplo, de 30 a 70 nM, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. En una modalidad, el primer dAb (o un monómero de dAb) se enlaza a la albúmina de suero (SA) (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA)) con una KD, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, de aproximadamente 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM ó 1 , 2 ó 3 µ?. En una modalidad, los primero y segundo dAbs se enlazan mediante un enlazador, por ejemplo, un enlazador de 1 a 4 aminoácidos, o de 1 a 3 aminoácidos, o mayor de 3 aminoácidos, o mayor de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20 aminoácidos. En una modalidad, se utiliza un enlazador más largo (mayor de 3 aminoácidos) para mejorar la potencia (KD de uno o ambos dAbs en el antagonista).

En las modalidades particulares, el dAb se enlaza a la albúmina de suero humano, y compite para enlazarse a la albúmina con un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en: MSA-16, MSA-26 (véase la Publicación Internacional Número WO04003019 para una divulgación de estas secuencias, cuyas secuencias y su contraparte de ácido nucleico se incorporan a la presente como referencia y forman parte de la divulgación del presente texto), DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-1 (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7 -8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (véase la Publicación Internacional Número WO2007080392 para una divulgación de estas secuencias, cuyas secuencias y su contraparte de ácido nucleico se incorporan a la presente como referencia y forman parte de la divulgación del presente texto; las SEQ ID NOs en este párrafo son aquéllas que aparecen en la Publicación Internacional Número WO2007080392), dAb8 (dAb10), dAb10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r25 (DOM7r25), dAb7r26 (DOM7r26), dAb7r27 (DOM7r27), dAb7r28 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r31), dAb7r32 (DOM7r32), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7h22 (DOM7h22), dAb7h23 (DO 7h23), dAb7h24 (DO 7h24), dAb7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAbs 4,7,41), dAb4, dAb7, dAb11, dAb12 (dAb7m12), dAb13 (dAb15), dAb15, dAb16 (dAb21, dAb7m16), dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 (dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54), dAb41, dAb46 (dAbs 47, 52 y 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 (DOM7r1), dAb7r3 (DOM7r3), dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), dAb7r7 (DOM7r7), dAb7r8 (DOM7r8), dAb7r13 (DOM7r13), dAb7r14 (DOM7r14), dAb7r15 (DOM7r15), dAb7r16 (DOM7r16), dAb7r17 (DOM7r17), dAb7r18 (DOM7r18), dAb7r19 (DOM7r19), dAb7h1 (DOM7h1), dAb7h2 (DOM7h2), dAb7h6 (DOM7h6), dAb7h7 (DOM7h7), dAb7h8 (DOM7h8), dAb7h9 (DOM7h9), dAb7h10 (DOM7h10), dAb7h11 (DOM7h11), dAb7h12 (DOM7h12), dAb7h13 (DOM7h13), dAb7h14 (DOM7h14), dAb7p1 (DOM7p1), y dAb7p2 (DOM7p2) (véase la Publicación Internacional del TCP Número PCT/GB2008/000453 presentada el 8 de Febrero de 2008 y publicada como la Publicación Internacional Número WO 2008/096158 para una divulgación de estas secuencias, cuyas secuencias y su contraparte de ácido nucleico se incorporan a la presente como referencia y forman parte de la divulgación del presente texto). Los nombres alternativos se muestran entre paréntesis después del dAb, por ejemplo, dAb8 tiene un nombre alternativo que es dAb10, es decir, dAb8 (dAb10).

En ciertas modalidades, el dAb se enlaza a la albúmina de suero humano y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, o cuando menos apro imadamente el 95 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 99 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en MSA-16, MSA-26, DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-1 (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h- 25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r- 26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (las SEQ ID NOs en este párrafo son aquéllas que aparecen en la Publicación Internacional Número WO2007080392), dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, y dAb7p2.

Por ejemplo, el dAb que se enlaza a la albúmina de suero humano puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 99 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DO 7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: :493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: :494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495) (las SEQ ID NOs en este párrafo son aquéllas que aparecen en la Publicación Internacional Número dAb8, dAblO, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb1 , dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En ciertas modalidades, el dAb se enlaza a la albúmina de suero humano y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 99 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado a partir del grupo que consiste en: DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DO 7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495) (las SEQ ID NOs en este párrafo son aquéllas que aparecen en la Publicación Internacional Número WO2007080392), dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h.11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En las modalidades más particulares, el dAb es un dAb de VK que se enlaza a la albúmina de suero humano y que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en: DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO:486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496) (las SEQ ID NOs en este párrafo son aquéllas que aparecen en la Publicación Internacional Número WO2007080392) , dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En las modalidades más particulares, el dAb es un dAb de VH que se enlaza a la albúmina de suero humano y que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de dAb7h30 y dAb7h31.

En las modalidades más particulares, el dAb es dAb7h11 o dAb7h14.

En otras modalidades, el dAb, ligando o antagonista se enlaza a la albúmina de suero humano y comprende una, dos o tres de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, por ejemplo, una, dos o tres de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de dAb7h11 o dAb7h14.

Los VHH de camélido adecuados que se enlazan a la albúmina de suero incluyen aquéllos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 2004/041862 (Ablynx N.V.), y en la Publicación Internacional Número WO2007080392 (cuyas secuencias de VHH y su contraparte de ácido nucleico se incorporan a la presente como referencia y forman parte de la divulgación del presente texto), tales como la Secuencia A (SEQ ID NO: 518), Secuencia B (SEQ ID NO: 519), Secuencia C (SEQ ID NO: 520), Secuencia D (SEQ ID NO: 521), Secuencia E (SEQ ID NO: 522), Secuencia F (SEQ ID NO: 523), Secuencia G (SEQ ID NO: 524), Secuencia H (SEQ ID NO: 525), Secuencia I (SEQ ID NO: 526), Secuencia J (SEQ ID NO: 527), Secuencia K (SEQ ID NO: 528), Secuencia L (SEQ ID NO: 529), Secuencia M (SEQ ID NO: 530), Secuencia N (SEQ ID NO: 531), Secuencia O (SEQ ID NO: 532), Secuencia P (SEQ ID NO: 533), Secuencia Q (SEQ ID NO: 534), correspondiendo estos números de secuencias a aquéllos que se citan en las Publicaciones Internacionales Números WO2007080392 o WO 2004/041862 (Ablynx N.V.). En ciertas modalidades, El VHH de camélido se enlaza a la albúmina de suero humano y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos aproximadamente el 80 por ciento, 0 cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 95 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 96 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 97 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 98 por ciento, o cuando menos aproximadamente el 99 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con el ALB1 que se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO2007080392, o con cualquiera de las SEQ ID NOs: 518-534, correspondiendo estos números de secuencias a aquéllos que se citan en las Publicaciones Internacionales Números WO2007080392 o WO 2004/041862. En algunas modalidades, la composición del dAb comprende un dAb anti-albúmina de suero que compite con cualquier dAb anti-albúmina de suero dado a conocer en la presente para enlazarse a la albúmina de suero {por ejemplo, albúmina de suero humano).

Conjugación con una fracción que prolonga la vida media (por ejemplo, albúmina) En una modalidad, una (una o más) fracción que prolonga la vida media (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de la misma) se conjuga o se asocia con el dAb que se enlaza con el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (o de IL-1, o que se enlaza con el TNF-a, o que se enlaza con el TNF-aR).

Los ejemplos adecuados de albúmina, fragmentos de albúmina, o variantes de albúmina, para utilizarse en un formato de enlace con el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (o con IL-1, o con TNF-a, o con TNF-aR) se describen en la Publicación Internacional Número WO 2005077042, cuya divulgación se incorpora a la presente como referencia y forma parte de la divulgación del presente texto. En particular, se pueden utilizar los siguientes: albúmina, fragmentos de albúmina, o variantes de albúmina, en la presente invención: · SEQ ID NO: 1 (como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 2005077042, siendo esta secuencia explícitamente incorporada dentro de la presente divulgación como referencia); • Fragmento o variante de albúmina, el cual comprende o consiste en los aminoácidos 1-387 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; • Albúmina, o fragmento o variante de la misma, la cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en: (a) aminoácidos 54 a 61 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (b) aminoácidos 76 a 89 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (c) aminoácidos 92 a 100 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (d) aminoácidos 170 a 176 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (e) aminoácidos 247 a 252 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (f) aminoácidos 266 a 277 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (g) aminoácidos 280 a 288 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (h) aminoácidos 362 a 368 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (i) aminoácidos 439 a 447 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (j) aminoácidos 462 a 475 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; (k) aminoácidos 478 a 486 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042; y (I) aminoácidos 560 a 566 de la SEQ ID NO: 1 de la Publicación Internacional Número WO 2005077042.

Los ejemplos adecuados adicionales de albúmina, fragmentos y análogos para utilizarse en un formato de enlace del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se describen en la Publicación Internacional Número WO 03076567, cuya divulgación se incorpora a la presente como referencia, y que forma parte de la divulgación del presente texto. En particular, se pueden utilizar los siguientes: albúmina, fragmentos o variantes, en la presente invención: • La albúmina de suero humano como se describe en la Publicación Internacional Número WO 03076567, por ejemplo, en la Figura 3 (incorporándose la información de esta secuencia explícitamente dentro de la presente divulgación como referencia); • La albúmina de suero humano (HA) que consiste en una sola cadena de polipéptido no glicosilado de 585 aminoácidos con un peso molecular de la fórmula de 66,500 (véase Meloun y colaboradores, FEBS Letters 58: 136 (1975); Behrens y colaboradores, Fed. Proc. 34: 591 (1975); Lawn, y colaboradores, Nucleic Acids Research 9: 6102-6114 (1981); inghetti y colaboradores, J. Biol. Chem.261: 6747 (1986)); • Una variante polimórfica, o un análogo, o un fragmento de albúmina, como se describe en Weitkamp y colaboradores, Ann. Hum. Genet. 37: 219 (1973); • Un fragmento o variante de albúmina como se describe en la Patente Europea Número EP 322094, por ejemplo, HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), y HA(1-419), y los fragmentos entre 1-369 y 1-419; · Un fragmento o variante de albúmina como se describe en la Patente Europea Número EP 399666, por ejemplo, HA(1-177), y HA(I -200), y los fragmentos entre HA(1-X), en donde X es cualquier número de 178 a 199.

Cuando se utiliza una (una o más) fracción que prolonga la vida media (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de la misma) para formatear los dAbs de la invención, se puede conjugar empleando cualquier método adecuado, tal como, mediante fusión directa, por ejemplo, utilizando una construcción de un solo nucleótido que codifique una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se codifica como una sola cadena de polipéptido con la fracción que prolonga la vida media localizada N- o C-terminalmente para el dAb. De una manera alternativa, la conjugación se puede lograr utilizando un enlazador peptídico entre las fracciones, por ejemplo, un enlazador peptídico como se describe en las Publicaciones Internacionales Números WO 03076567 o WO 2004003019 (incorporándose las divulgaciones de estos enlazadores como referencia a la presente divulgación con el objeto de proporcionar ejemplos para utilizarse en la presente invención). Típicamente, un polipéptido que mejora la vida media en suero in vivo es un polipéptido que se presenta naturalmente in vivo y que resiste la degradación o la remoción mediante los mecanismos endógenos que remueven el material indeseado del organismo (por ejemplo, un ser humano). Por ejemplo, un polipéptido que mejora la vida media en suero in vivo se puede seleccionar a partir de las proteínas de la matriz extracelular, las proteínas que se encuentran en la sangre, las proteínas que se encuentran en la barrera hematoencefálica o en el tejido neural, las proteínas localizadas en el riñon, hígado, pulmón, corazón, piel o hueso, las proteínas de estrés, las proteínas específicas de las enfermedades, o las proteínas involucradas en el transporte de Fe.

Los dAbs de la invención se pueden formatear como una proteína de fusión que contiene un primer dominio variable individual de ¡nmunoglobulina que se fusiona directamente con un segundo dominio variable individual de ¡nmunoglobulina. Si se desea este formato puede comprender además una fracción que prolonga la vida media. Por ejemplo, el ligando puede comprender un primer dominio variable individual de inmunoglobulina que se fusiona directamente con un segundo dominio variable individual de inmunoglobulina que se fusiona directamente a un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a la albúmina de suero.

En términos generales, la orientación de los dominios de polipéptido que tienen un sitio de enlace con especificidad de enlace por un objetivo, y si el ligando comprende un enlazador, es un asunto de elección de diseño. Sin embargo, algunas orientaciones, con o sin enlazadores, pueden proporcionar mejores características de enlace que otras orientaciones. Todas las orientaciones (por ejemplo, dAb1 -enlazador-dAb2; dAb2-enlazador-dAb1 ) están abarcadas por la invención, y los ligandos que contengan una orientación que proporcione las características de enlace deseadas pueden ser fácilmente identificados mediante un rastreo.

Los dAbs de acuerdo con la invención, incluyendo los monómeros, dímeros y trímeros de dAb, se pueden enlazar a una región Fe de anticuerpo, la cual comprende uno o ambos de los dominios CH2 y CH3, y opcionalmente una región de articulación. Por ejemplo, los vectores que codifican los ligandos enlazados como una secuencia de un solo nucleótido a una región Fe, se pueden utilizar para preparar estos polipéptidos.

En algunas modalidades de la invención, los dAbs pueden ser codificados por secuencias de nucleótidos de codones optimizados, por ejemplo, optimizados para la expresión por Pichia pastoris o E. coli, por ejemplo, como se describe en la Publicación Internacional Número WO2008149147.

EJEMPLIFICACION Ejemplo 1: Suministro tópico de DOM15-26-593 (dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) marcado con myc) a los ojos de conejos: El DOM15-26-593 se puede seleccionar y preparar como se describe en la Publicación Internacional Número WO2008149147, y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1a (SEQ ID NO: 1).

El DOM15-26-593 marcado con myc (el dAb DOM15-26-593 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1a (SEQ ID NO: 1) se preparó y se utilizó como un dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) marcado con c-myc en este experimento) se preparó como una preparación libre de endotoxina en una concentración de 2 miligramos/mililitro, formulada en un regulador de acetato de sodio 50 mM (pH de 7.0) complementado con cloruro de sodio 104 mM, Tween 80 al 0.02 por ciento (peso/volumen), caprato de sodio al 0.5 por ciento (peso/volumen), e hidroxi-propil-metil-celulosa (HPMC) ya sea al 0.3 por ciento o bien al 1.5 por ciento (peso/volumen). Los conejos Chinchilla Bastardos adultos se obtuvieron en Charles River, Alemania. Los animales se dejaron aclimatarse antes de usarse. Los ojos izquierdos de seis conejos hembras se dosificaron cada 20 minutos durante un período de cuatro horas con 50 microlitros de una solución de 2 miligramos/ mililitro del dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Cada dosis se colocó en el saco subconjuntival. Tres conejos recibieron el dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) formulado en HPMC al 0.3 por ciento, y tres con el fármaco formulado en HPMC al 1.5 por ciento. Dos horas después de la última dosis, los animales se sacrificaron. Tan cerca como fuera posible al tiempo en que se hubiera confirmado la eutanasia, ambos ojos de cada animal fueron enucleados. Cada ojo se lavó en suero regulado con fosfato (PBS) para remover cualquier exceso de fármaco de la superficie. Las muestras de humor acuoso y vitreo se recolectaron y se almacenaron congeladas (-20°C) antes del análisis. Las muestras de humor acuoso y vitreo se probaron para determinar la concentración de DOM15-26-593 (dAb anti-VEGF) presente utilizando un ensayo ELISA de emparedado, en donde el dAb se capturó sobre las placas recubiertas de proteína recombinante del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano, y se detectó utilizando un anticuerpo con especificidad para una marca c-myc.

El ensayo ELISA del dAb de VEGF descrito anteriormente se llevó a cabo como sigue: El ensayo utiliza el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano recombinante (rVEGF, obtenido en R&D Systems) recubierto sobre la superficie de las placas Immunsorb (obtenidas en Nunc) para capturar el dAb de VEGF. Las placas se lavaron para remover cualquier dAb no enlazado. El dAb enlazado se detectó subsiguientemente utilizando un anticuerpo para la marca Myc del dAb de VEGF (obtenida en Sigma). El exceso de anticuerpo se removió mediante lavado, y el anticuerpo anti-myc enlazado se detectó utilizando un conjugado de peroxidas de IgG anti-ratón (Sigma). El ensayo se reveló utilizando una solución de TMB, y se detuvo utilizando ácido. La señal a partir del ensayo es proporcional a la cantidad de dAb. Las etapas en el ensayo se resumen como sigue: Recubrimiento de la placa: 1. Se preparó suficiente rVEGF a 0.25 microgramos/mililitro para recubrir las placas (5 mililitros para cada placa ELISA). Esto se hizo para cada placa, mediante la adición de 25 microlitros del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de suministro a 5 mililitros de regulador de recubrimiento de carbonato (solución reguladora de recubrimiento de carbonato-bicarbonato de sodio 0.2 M, pH de 9.4 (Pierce, Cat. No: 28382)), y mezclando mediante inversión. 2. Se agregaron 50 microlitros de la solución de rVEGF (0.25 microgramos/mililitro) a cada pozo de una placa ELISA Immunsorb de 96 pozos, utilizando una pipeta de múltiples canales. 3. La placa se cubrió con una tapa de plástico, y se almacenó a 4°C durante aproximadamente 42 horas.

Lavado y bloqueo de las placas: 4. Las placas se removieron del almacenamiento a 4°C. 5. Cada placa se lava 6 veces con suero regulado con fosfato + Tween 20 al 0.1 por ciento. 6. Se agregaron 100 microlitros de regulador de bloqueo de ensayo (BSA/PBS al 1 por ciento) a todos los pozos de cada placa. 7. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora.

Preparación de muestras y estándares: 8. Los estándares y las muestras se diluyeron en el diluyente de ensayo (BSA al 0.1 por ciento/Tween 20 al 0.05 por ciento/PBS) mientras que se bloqueaban las placas. El estándar (material de referencia, es decir, Dom15-26-593) se diluyó en serie (10 veces) para producir una curva de dilución de registro (log).

Adición de muestras: 9. Las placas bloqueadas se lavaron (como en el 6 anterior). 10. Se agregaron 50 microlitros de la muestra diluida o del estándar a los pozos apropiados. Se agregaron 50 microlitros/pozo del diluyente de ensayo a los pozos, para actuar como controles negativos. 11. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. 12. Las placas se lavaron 6 veces, y se secaron por transferencia (como en el 6 anterior). 13. Se agregaron 50 microlitros del anticuerpo anti-myc (9E10 Sigma M5546) diluido a 1 : 500 (en el diluyente de ensayo: BSA al 0.1 por ciento/Tween 20 al 0.05 por ciento/PBS) a todos los pozos (es decir, se agregan 10 microlitros del anticuerpo anti-myc (9E10) a 5 mililitros del diluyente del ensayo para cada placa). 14. Las placas se incubaron sobre el oscilador durante cuando menos el 1 hora a temperatura ambiente. 15. Las placas se lavaron 6 veces y se secaron por transferencia (como en el 6 anterior). 16. Se agregaron 50 microlitros de HRP de Ig anti-ratón a 1 : 10,000 (Sigma A9309) a todos los pozos (es decir, se diluye el anticuerpo de suministro a 1 : 10 mediante la adición de 5 microlitros del anticuerpo de HRP de Ig anti-ratón a 45 microlitros del diluyente del ensayo (BSA al 0.1 por ciento/Tween 20 al 0.05 por ciento/PBS). Para cada placa se agregan 5 microlitros del suministro diluido a 1 : 10 a 5 mililitros del diluyente del ensayo. 17. Las placas se incubaron sobre el oscilador durante cuando menos 1 hora a temperatura ambiente. 18. Las placas se lavaron 6 veces y se secaron por transferencia (como en el 6 anterior). 19. Se agregaron 50 microlitros del sustrato de TMB a todos los pozos. Debido a que el desarrollo de este ensayo es muy rápido, es recomendable agregar TMB a no más de 3 placas a la vez. El TMB se puede utilizar directamente del refrigerador o bien a temperatura ambiente. 20. La reacción se detuvo (una vez que se desarrollo un color suficiente) mediante la adición de 50 microiitros de HCI 1 M a cada pozo . 21 . Las placas se leyeron en un lector de placas de 96 pozos a 450 nanómetros.

Resu ltados: Los resu ltados se m uestran en la Tabla 1 .

El programa de dosificación fue bien tolerado sin signos de enrojecimiento, irritación , o comportamiento anormal del animal observado. Los resultados del ensayo E LI SA llevado a cabo para i nvestigar el nivel de dAb anti-factor de crecimi ento endotelial vascular (VEGF) (DOM 1 5-26-593) presente en las m uestras de humor vitreo y acuoso obtenidas en los ojos tratados y contralaterales (no tratados) mostraron que la mayor parte del dAb detectado estuvo presente en el h umor vitreo de los ojos tratados . El conejo (animal 3) que tuvo la concentración más alta en el humor vitreo tam bién tuvo niveles detectables de dAb anti-factor de creci miento endotelial vascular (VEG F) presentes en el humor acuoso del ojo tratado.

Se observó que el dAb form ulado en HPMC al 1 .5 por ciento (que era u na sol ución más viscosa) pareció ser retenido en el ojo en seguida de cada dosis más efectivamente que la formulación que contenía más HP MC al 0.3 por ciento más fluida. Los conejos dosificados con la concentración más baja de HPMC parecieron perder algo del último material de dosificación mediante el parpadeo hacia afuera.

Tabla 1 Concentraciones de dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (DOM 15-26-593) presentes en el humor vitreo y acuoso a partir de los ojos tópicamente tratados y contralaterales. El tratamiento consistió en 12 dosis (cada una consistente en un volumen de 50 microlitros de una solución de 2 miligramos/mililitro) administradas en el saco subconjuntival (cada 20 minutos durante un período de 4 horas).

ND* = No Detectado (</= 2 ng/ml).

Conclusiones: La dosis del dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se colocó en el saco conjuntival. Se esperaba que algo del dAb pudiera penetrar a través de la córnea y subsiguientemente fuera detectado en el humor acuoso. De una manera sorprendente, la mayor parte del dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) detectado estuvo presente en el humor vitreo, y esta observación sería consistente con el dAb anti-VEG entrando al ojo mediante difusión desde el hueco del ojo a través de la esclera y de las membranas coroidales, con el objeto de entrar a la cámara posterior.

Se había incluido hidroxi-propil-celulosa (HPMC) en la formulación como un potenciador de viscosidad. La formulación al 1.5 por ciento pareció ser retenida en el ojo tratado más efectivamente. La formulación al 0.3 por ciento más fluida fue menos bien retenida, y esto puede contribuir al movimiento del dAb antifactor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) hacia los ojos contralaterales que se observó en dos de los tres conejos en este grupo.

Ejemplo 2: Farmacocinética del DOM15-26-593 en seguida de la administración intravítrea a los ojos de conejos: Se llevó a cabo un experimento para investigar la duración en que se retuvo en el ojo el anticuerpo de un solo dominio variable de inmunoglobulina anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) DOM15-26-593 en seguida de la inyección directa del DOM15-26-593 en el humor vitreo. El dAb DOM15-26-593 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1a (SEQ ID NO: 1) se preparó (concentración de 2 miligramos/mililitro formulado en un regulador de acetato de sodio 50 mM (pH de 7.0) complementado con cloruro de sodio 104 mM, Tween 80 al 0.02 por ciento (peso/volumen)), y se utilizó como un dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) marcado con c-myc en este experimento. Los conejos Chinchilla Bastardos adultos se obtuvieron en Charles River, Alemania. Los animales se dejaron aclimatarse antes de usarse. Cada conejo se anestesió, y se inyectaron 10 microlitros de una solución de 2 miligramos/mililitro (la solución se prepara como se describe en el Ejemplo 1) (total 20 microgramos) del dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) marcado con c-myc (DOM15-26-593) directamente en el humor vitreo del ojo izquierdo. Los conejos se sacrificaron en diferentes tiempos (2, 24 y 30 horas) después de la inyección y ambos ojos se enuclearon, y se recolectaron muestras de humor acuoso y vitreo. Estas muestras se almacenaron congeladas (-20°C) antes del análisis. Las muestras de humor acuoso y vitreo se probaron para determinar la concentración del DOM15-26-593 presente utilizando un ensayo ELISA de emparedado, en donde el dAb se capturó en las placas recubiertas de proteína recombinante del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y se detectó utilizando un anticuerpo con especificidad para una marca c-myc.

Resultados: Las concentraciones de DOM15-26-593 (dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) se muestran en la siguiente Tabla 2: Tabla 2 Concentraciones de dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (DOM15-26-593) presentes en el humor vitreo y acuoso a partir de los ojos intra-vítreamente dosificados y contralaterales. El tratamiento consistió en una sola inyección intravítrea (10 microlitros de una solución de 2 miligramos/mililitro) en el ojo izquierdo - los conejos se dejaron recuperarse de la anestesia, y se sacrificaron a las 2, 24 y 30 horas después de la dosificación.

Humor Humor Humor Humor Tiempo de Conejo Vitreo Vitreo Acuoso Acuoso Muestreo No. (ng/ml) Ojo (ng/ml) Ojo (ng/ml) Ojo (ng/ml) Ojo (horas) Tratado Contralateral Tratado Contralateral 1 2 121.48 ND* 0.75 ND* 2 2 115.43 ND* ND* ND* 3 24 88.61 0.10 1.58 ND* 4 24 157.79 ND* ND* ND* 5 30 88.90 ND* ND* ND* Humor Humor Humor Humor Tiempo de Conejo Vitreo Vitreo Acuoso Acuoso Muestreo No. (ng/ml) Ojo (ng/ml) Ojo (ng/ml) Ojo (ng/ml) Ojo Tratado Contralateral Tratado Contralateral 6 30 17.31 ND* 0.14 ND* ND* = No detectado (<0.1 nanogramos/mililitro).

Concentraciones redondeadas hasta 2 lugares decimales.

Conclusiones: Los resultados del experimento indicaron que la concentración del DOM 15-26-593 se mantuvo en niveles que se aproximaron a la concentración inyectada a las 24 horas después de la dosificación. El anticuerpo de dominio está presente en el humor vitreo a las 24 y 30 horas después de la dosificación.

Se detectaron bajas concentraciones del DOM15-26-593 (dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)) en el humor acuoso de algún ojo tratado. Sin embargo, hubo una transferencia mínima del DOM15-26-593 al ojo contralateral no tratado.

Ejemplo 3 : Modelo de neovascularización coroidal de rata inducida por láser (CNV): Se indujo una neovascularización coroidal (CNV) experimental unilateralmente en grupos de cinco ratas Dark Agouti (DA) hembras de 2 a 4 meses de edad. Se utilizó fotocoagulación (PC) con luz de láser para romper la membrana de Bruch de las ratas anestesiadas.

La fotocoagulación (PC) con láser de tinte se llevó a cabo utilizando un dispositivo de láser de argón bombeado con diodos, a 532 nanómetros (Novus Omni, Coherent Inc., Santa Clara, CA) conectado a un funduscopio de foco de ranura, y un lente de contacto plano-cóncavo manual (Moorfields Eye Hospital, Londres, Reino Unido) aplicado a la córnea para neutralizar la potencia ocular. Se hicieron cinco lesiones (532 nanómetros, 150 mW, 0.2 segundo, 200 mieras de diámetro) en un solo ojo de cada animal experimental. Las lesiones se hicieron en una forma peripapilar distribuida y estandarizada centradas sobre el nervio óptico en un radio de 500 mieras, y evitando los vasos mayores. El punto final morfológico de la lesión con láser se identificó como la aparición temporal de una burbuja de cavitación, un signo asociado con la alteración de la membrana de Bruch. Los puntos de láser que no dieron como resultado la formación de una burbuja se excluyeron del análisis. Inmediatamente después de la inducción de la neovascularización coroidal (CNV) con láser, cada animal se dosificó ¡ntra-vítreamente con un volumen de 5 microlitros (centrado en el disco óptico). (Este volumen se seleccionó debido a que se calculó que sería un volumen suficiente para cubrir el área retinal en donde se habían hecho las lesiones). El dAb se formuló as una concentración de 2 miligramos/mililitro en un regulador de acetato de sodio 50 mM (pH de 5.5) complementado con cloruro de sodio 104 mM, Tween 80 al 0.02 por ciento (peso/volumen)). El volumen de 5 microlitros contenía 50 microgramos del dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (DOM15-26-593; con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1a; SEQ ID NO: 1), 50 microgramos de la fusión de DOM15-26-593-Fc anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1b; SEQ ID NO: 2) (o ningún compuesto (vehículo solamente, controles negativos). Los datos de imágenes in vivo de la neovascularización coroidal (CNV) y de la filtración asociada, se generaron utilizando Angiografía de Fluoresceína SLO confocal de alta resolución (0.2 mililitros de Fluoresceína de Sodio (FS) al 10 por ciento inyectados intra-abdominalmente), y OCT (Heidelberg Spectralis, Heidelberg, Alemania) a los 7 y 14 días después de la generación de la lesión y de las inyecciones. Las imágenes de reflectancia de la línea base (a 488 nanómetros y a 790 nanómetros), y de auto-fluorescencia (excitación a 488 nanómetros, emisión a >498 nanómetros) se hicieron antes de la inyección de la Fluoresceína de Sodio (FS), para ayudar a localizar las lesiones en las imágenes angiográficas de fluoresceína. La fase arterio-venosa se registró inmediatamente después de la inyección de Fluoresceína de Sodio (FS). Posteriormente se registraron los angiogramas de Fluoresceína, un minuto después de la inyección, y nuevamente cuatro minutos después de inyección. El efecto del tratamiento con el fármaco se evaluó mediante una evaluación semi-cuantitativa de de la angiografía de fluoresceína en fase tardía. La filtración se definió como la presencia de una lesión híper-fluorescente que aumentó de tamaño con el tiempo en el angiograma en fase tardía. La intensidad y el área de teñido en la angiografía de fluoresceína en fase tardía fueron calificadas por dos examinadores en una forma enmascarada. Cuando no coincidieron las dos calificaciones dadas para una lesión particular, se utilizó la calificación más alta para el análisis. Esta calificación discrepante se observó en <10 por ciento de las lesiones analizadas, y la discrepancia nunca fue por más de un grado. El estudio se llevó a cabo de una manera enmascarada, y las sustancias solamente se desenmascararon una vez que se hubieron recolectado todos los datos.

Resultados: Los resultados se muestran más adelante en la Tabla 3.

A los 7 y 14 días después de la inducción de la neovascularización coroidal (CNV) utilizando quemaduras con láser en la retina de la rata, se utilizó angiografía de fluoresceína para observar cada lesión. Las lesiones se calificaron como sigue: Calificación 0 = Ninguna filtración, Calificación 1 = Filtración pequeña, Calificación 2 = Filtración media, y Calificación 3 = Filtración grande. En seguida se tabulan los resultados para los grupos de ratas tratadas intra-vítreamente con el anticuerpo de dominio anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), DOM15-26-593), para la fusión de DOM15-26-593-Fc, y para los grupos dosificados con vehículo de control negativo. Los resultados indican que el tratamiento con el dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (DOM15-26-593) o con la fusión de DOM15-26-593-Fc redujo el grado de neovascularización y filtración, comparándose con las ratas de control (tratadas simuladamente).

Tabla 3 Calificaciones de lesión de neovascularización coroidal (CNV) en los ojos de las ratas a los 7 y 14 días después de la inducción mediante fotocoagulación.

** = Datos en ambos puntos del tiempo estadísticamente significativos a partir de los controles (P < 0.05).

Conclusiones: Los resultados indicaron que la fusión de DO 15-26-593-Fc (dAb anti-VEGF-Fc) fue eficaz en un modelo de rata en donde se caracterizó la neovascularización coroidal experimental (CNV) inducida mediante fotocoagulación con láser del RPE-coroides, mediante angiografía de fluorescencia. Los resultados para la fusión de DOM15-26-593-Fc fueron significativamente mejores que para el grupo dosificado con vehículo de control tanto a los 7 como a los 14 días. Este grupo pareció retener ligeramente más actividad que el grupo con el dAb anti-VEGF (DOM15-26-593). Sin embargo, el dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (DO 15-26-593) también fue eficaz (significativamente mejor que el control tanto a los 7 como a los 14 días después de la lesión inducida por láser).

Estos resultados indican que el dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (DOM15-26-593), y el dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)-Fc, fueron eficaces en un modelo de neovascularización coroidal (CNV) experimental de rata. Esta demostración de eficacia en un modelo de enfermedad oftálmica de roedor in vivo indica que los anticuerpos de dominio pueden ser benéficos en el tratamiento de la neovascularización coroidal en la degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

Ejemplo 4: Suministro tópico de un anticuerpo anti-TNF-a, un dAb anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) formateado con Fe, un dAb anti-IL-1 pegilado, y un dAb anti-IL-1 en conejos: Método Los conejos Chinchilla Bastardos hembras adultos se obtuvieron en Charles River, Alemania. Los animales se dejaron aclimatarse antes de usarse. Se recolectó una muestra de sangre a partir de la vena marginal de la oreja de cada conejo cinco días antes del comienzo de la dosificación. La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente, y se centrifugó (12,000 revoluciones por minuto/2 minutos) para separar el suero. El suero se transfirió a tubos frescos y se almacenó congelado (-20°C).

La preparación y selección del DOM 4-130-54 se describe en la Publicación Internacional Número WO 2007063311 y también en la Publicación Internacional Número WO2008149149. Para preparar el Dom 0400, se toma la secuencia del dAb del DOM 4-130-54, y se muta de tal manera que una cisteína en la posición 80 reemplaza a la prolina presente en el DOM 4-130-54; este dAb se une entonces a una molécula de PEG lineal de 40 kDa (obtenida en NOF Corp., Europa) mediante un acoplamiento de maleimida convencional con la cisteína libre en la posición 80 del dAb.

Se formularon anticuerpos de dominio (dAbs) con especificidad para IL-1 ya sea en un formato desnudo (DOM4-130-54; dAb desnudo de IL-1, 12.026 kDa; con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3; SEQ ID NO: 5), o bien en un formato pegilado (DOM0400PEG; dAb pegilado de IL-1, 52.032 kDa; con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2; SEQ ID NO: 4), a 8.5 y 10.4 miligramos/mililitro, respectivamente, en succinato 20 mM, sorbitol al 5 por ciento, pH de 6.0.

Se formuló un dAb de a-VEGF formateado con Fe (VEGF 15-26-593 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1b; SEQ ID NO: 2) a 9.1 miligramos/mililitro en fosfato 50 mM, L-arginina al 1 por ciento, EDTA 0.05 mM, polisorbato al 0.02 por ciento, y NaCI al 0.3 por ciento, pH de 7.0. El anticuerpo monoclonal con especificidad para TNF-a (comercialmente disponible) se reconstituyó a partir de una preparación secada por congelación a 10 miligramos/mililitro, utilizando agua destilada estéril. Los ojos izquierdos de los grupos de cuatro conejos se dosificaron cinco veces al día (a intervalos de 3 horas) durante un período de 4.2 días. Los animales se dejaron en reposo durante un período de 12 horas (durante la noche) entre cada día de dosificación. Cada dosis consistió en 25 microlitros de una solución del compuesto relevante colocado debajo del párpado superior. Los animales se mantuvieron todavía durante cuando menos 30 segundos después de la dosificación. En diferentes tiempos antes y durante el programa de dosificación, se recolectaron muestras de fluido lagrimal (lágrimas) colocando una pequeña tira de papel absorbente debajo del párpado para absorber algo de fluido. El área del papel impregnada con el fluido lagrimal se colocó en un tubo que contenía 200 microlitros de suero regulado con fosfato. El tubo se centrifugó (12,000 revoluciones por minuto/2 minutos), el papel se removió, y la muestra recuperada se almacenó congelada (-20°C) antes del análisis.

Una hora después de la última dosis, se recolectó una muestra de sangre a partir de la vena marginal de la oreja de cada conejo. La sangre se dejó coagular de tal manera que se pudiera separar el suero, y se almacenó mediante los métodos descritos anteriormente. Inmediatamente después, los animales se sacrificaron. Tan cerca como fuera posible del tiempo en que se hubo confirmado la eutanasia, se enuclearon ambos ojos de cada animal. Cada ojo se lavó in suero regulado con fosfato para remover cualquier exceso de fármaco de la superficie. Las muestras de humor acuoso y vitreo se recolectaron y se almacenaron congeladas (-20°C) antes del análisis. El humor vitreo se sometió a un solo ciclo de congelación/descongelación antes de probarse en un ensayo. Los ojos se disectaron, y se recolectó la retina/coroides. Las muestras de retina/coroides se pesaron, y se agregaron 100 microlitros de regulador de lisis (Tris 10 m , pH de 7.4; SDS al 0.1 por ciento; con cóctel inhibidor de proteinasa, (Roche)) a cada 15 miligramos de tejido de retina/coroides. Las muestras se homogeneizaron utilizando alteración ultrasónica (Covaris S2 Sonolab Single) empleando un ciclo de 2 minutos de ráfagas de frecuencia alta y baja repetidas. Las muestras de retina/coroides se centrifugaron (12,000 revoluciones por minuto/2 minutos) en un microcentríf ugo (Heraeus). Los sobrenadantes se transfirieron a tubos frescos, y se almacenaron congelados (-20°C).

El contenido de fármaco de cada muestra se probó y se midió utilizando ensayos ELISA en formato de emparedado. El anticuerpo a-TNF-a se capturó utilizando placas recubiertas con la proteína de TNF-a humano recombinante (Peprotech), y se detectó utilizando un anticuerpo de IgG anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina (específico de Fe) (Sigma). Los dAbs de IL-1 y de IL-1 pegilado, se capturaron utilizando placas recubiertas con el Fe de Receptor de IL-1 Tipo 1 humano recombinante (Axxora), y se detectaron utilizando la proteína de L-peroxidasa (Sigma). El dAb de VEGF-formateado con Fe se capturó utilizando una preparación de la proteína del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) recombinante de la empresa, y se detectó con un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (específico de Fe) de IgG anti-humano (Sigma).

Resultados En todos los casos, la dosificación del fármaco fue bien tolerada sin signos de enrojecimiento, irritación, o comportamiento anormal del animal.

Los resultados de los diferentes formatos de anticuerpos de dominio y para el anticuerpo de a-TNF-a en el humor acuoso y vitreo, y en la retina/coroides, se muestran en las siguientes tablas. Los resultados se muestran con respecto a las concentraciones promedio (a partir de tres ensayos independientes, en donde cada muestra se probó por triplicado) +/- Desviación Estándar (mostrada entre paréntesis) Tabla 4 Concentración en humor acuoso después de la dosificación tópica (nanogramos/mililitro) .

ND = No detectado - debajo del límite de cuantificación (en cuando menos 2 de 3 ensayos repetidos).

Los resultados de esta tabla están redondeados hasta un lugar decimal.

Tabla 5 Concentración en el humor vitreo después de la dosificación tópica (nanog ramos/mil i litro): ND = No detectado - debajo del límite de cuantificación (en cuando menos 2 de 3 ensayos repetidos).

Los resultados de esta tabla están redondeados hasta un lugar decimal.

Tabla 6 Concentración en la Retina/Coroides después de la dosificación tópica (nanogramos/mililitro en las muestras en donde se agregaron 100 microlitros de regulador de lisis a 15 miligramos de tejido): ND = No detectado - debajo del límite de cuantificación (en cuando menos 2 de 3 ensayos repetidos).

Los resultados de esta tabla están redondeados hasta un lugar decimal.

Se recolectaron muestras de fluido lagrimal (lágrimas) de conejos justo antes de las dosis 20 y 21. Los resultados para las concentraciones de fármaco presentes se muestran en las Tablas 4 y 5, respectivamente. El material dosificado se detectó en todos los ojos izquierdos (dosificados) (aunque hubo mucha variación en la concentración detectada entre los conejos individuales), y también se presentó alguna transferencia a la mayor parte de los ojos contralaterales (derechos, no dosificados). Todavía había material de dosificación presente en el ojo a las 12 horas después de la dosis 20. El DOM0400PEG (dAb de IL-1 pegilado), y el VEGF-Fc (15-26-593) parecieron ser retenidos en las lágrimas en las concentraciones más altas durante el período de 12 horas entre las dosis 20 y 21 que el dAb de IL-1 desnudo (DOM4-130-54) .

Los resultados para las concentraciones de los diferentes formatos de anticuerpos de dominio y para el anticuerpo en el fluido lagrimal (lágrimas) se muestran en las siguientes tablas (solamente se dosificó el ojo izquierdo): Tabla 7 Concentración en las muestras de fluido lagrimal recolectadas antes de la dosis 20 (3 horas después de la dosis anterior) (microgramos/ mililitro). La Desviación Estándar está entre paréntesis: 1 1 2 2 3 3 4 4 Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Anticuerpo 13.0 18.6 211.9 249.3 0.5 6.7 ND ND de a-TNF-a (1.0) (2.2) (46.2) (40.2) (0.3) (0.7) 1 1 2 2 3 3 4 4 Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho dAb de 28.6 47.7 19.4 0.3 32.5 0.2 ND ND VEGF-Fc (4.7) (7.0) (1.2) (0.06) (4.6) (0.02) DOM0400 1.0 3.4 0.5 25.0 21.1 PEG pegila- 0.3 (0) 0.3 (0) ND (0.2) (0.6) (0.2) (11.1) (6.4) do de IL-1 DOM4-130- 7.5 0.8 3.9 0.2 3.8 5.7 0.3 ND 54 de IL-1 (4.3) (0.1) (0.7) (0.02) (0.6) (1.8) (0.06) Los resultados de esta tabla están redondeados hasta un lugar decimal.

Tabla 8 Concentración en las muestras de fluido lagrimal recolectadas antes de la dosis 21 (12 horas después de la dosis anterior): Concentración (microgramos/mililitro). La Desviación Estándar está entre paréntesis: 1 1 2 2 3 3 4 4 Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Anticuerpo 17.2 5.3 81.7 0.3 2.9 24.2 ND ND de a-TNF-a (2.4) (3.0) (6.1) (0.2) (0.3) (1.2) 1 1 2 2 3 3 4 4 Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho Izquierdo Derecho dAb de 21.2 1.3 12.5 6.7 0.1 27.0 0.06 ND VEGF-Fc (1.3) (1.9) (0.7) (0.5) (0.03) (5.0) (0.02) DOM0400 0.4 43.1 0.3 102.3 44.2 1.5 0.3 PEG pegila- ND (0.2) (15.8) (0) (3.2) (39.1) (2.6) (0) do de IL-1 DOM4-130- 5.6 0.9 3.6 2.1 3.0 0.1 ND ND 54 de IL-1 (3.4) (0.1) (0.9) (0.2) (0.7) (0.01) Los resultados de esta tabla están redondeados hasta un lugar decimal.

Tabla 9 Concentración en las muestras recolectadas en las sangrías previas y en el suero justo antes de la eutanasia. Concentración (nanogramos/mililitro), con la Desviación Estándar entre paréntesis: 1 1 2 2 3 3 4 4 Pre-sangría Suero Pre-sangría Suero Pre-sangré Suero Pre-sangré Suero Anticuerpo 62.6 220.1 * 102.7 152.4 ND ND ND ND de a-TNF-a (49.0) (115.0) (115.6) (130.4) Los resultados de esta tabla están redondeados hasta un lugar decimal.

El conejo 3 del grupo tratado con el anticuerpo de a-TNF-a tuvo una sangría previa que fue de un color rojo debido a la lisis, y esto puede haber contribuido al resultado aparentemente alto.

Ejemplo 5: Suministro tópico del dAb de o TNF-aR1 Métodos Los conejos Chinchilla Bastardos machos adultos se obtuvieron en Charles River, Alemania. Los animales se dejaron aclimatarse antes de usarse. Se recolectó una muestra de sangre a partir de la vena marginal de la oreja de cada conejo siete días antes del comienzo de la dosificación. La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente antes de la centrifugación (12,000 revoluciones por minuto/2 minutos) para separar el suero. El suero se transfirió a tubos frescos y se almacenó congelado (-20°C).

Se formuló un anticuerpo de dominio (dAb) con especificidad para TNF-aR1 (es decir, un dAb anti-receptor de TNFa tipo 1), el cual es Dom 1h-131-206 con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4; SEQ ID NO: 6; la preparación y selección del Dom 1 h-131-206 se describe en la Publicación Internacional Número WO2008149148) en suero regulado con fosfato a 10 miligramos/ mililitro. Los ojos izquierdos de un grupo de cuatro conejos se dosificaron 10 veces en un solo día (a intervalos por hora). Cada dosis consistió en 50 microlitros de la solución de 10 miligramos/ mililitro del dAb de a-TNF-aR1 colocados debajo del párpado superior. Los animales se mantuvieron todavía durante cuando menos 30 segundos después de la dosificación. En diferentes tiempos antes y durante el programa de dosificación, se recolectaron muestras del fluido lagrimal (lágrimas) colocando una pequeña tira de papel debajo del párpado para absorber algo de fluido. El área del papel impregnada con el fluido lagrimal se colocó en un tubo que contenía 200 microlitros de suero regulado con fosfato. El tubo se centrifugó (12,000 revoluciones por minuto/2 minutos), el papel se removió, y la muestra recuperada se almacenó congelada (-20°C) antes del análisis.

Una hora después de la última dosis, se recolectó una muestra de sangre a partir de la vena marginal de la oreja de cada conejo. La sangre se dejó coagular de tal manera que se pudiera separar el suero mediante los métodos descritos anteriormente. Inmediatamente después, los animales se sacrificaron. Tan cerca como fue posible del tiempo en que se hubo confirmado la eutanasia, se enuclearon ambos ojos de cada animal. Cada ojo se lavó en suero regulado con fosfato para remover cualquier exceso de fármaco de la superficie. Las muestras de humor acuoso y vitreo se recolectaron y se almacenaron congeladas (-20°C) antes del análisis. El humor vitreo se sometió a un solo ciclo de congelación/descongelación antes de probarse en un ensayo. Los ojos se disectaron, y se recolectó la retina/coroides. Las muestras de retina/coroides se pesaron, y se agregaron a cada muestra 900 microlitros de regulador de lisis (Tris 10 mM, pH de 7.4; SDS al 0.1 por ciento; con cóctel inhibidor de proteinasa (Roche)). Las muestras se homogeneizaron utilizando alteración ultrasónica (Covaris S2 Sonolab Single) utilizando un ciclo de 2 minutos de ráfagas de frecuencia alta y baja repetidas. Las muestras de retina/coroides se centrifugaron (12,000 revoluciones por minuto/2 minutos) en un microcentrífugo (Heraeus). Los sobrenadantes se transfirieron a tubos frescos, y se almacenaron congelados (-20°C). Las muestras se probaron para determinar la concentración del dAb de a-TNF-aR1 mediante un ensayo ELISA de emparedado, en donde el dAb se capturó utilizando placas recubiertas con la quimera humana recombinante de TNF R1/ TNFRSF1A/Fc (R + D Systems), y se detectó con especificidad para los fragmentos (F(ab)2) de IgG humana (Thermo). Este anticuerpo no se conjugó, de modo que se utilizó un reactivo de HRP anti- cabra/ oveja (Sigma) para detectar el anticuerpo enlazado.

Resultados La dosificación del fármaco fue bien tolerada sin signos de enrojecimiento, irritación, o comportamiento anormal del animal observado.

Se muestran las concentraciones del dAb de a-TNF-aR1 en los fluidos oculares y en el suero para las muestras probadas por triplicado. El dAb de a-TNF-aR1 se detectó en todas las muestras oculares probadas.

Tabla 10 Concentraciones de dAb de a-TNF-aR1 en las muestras oculares: Humor AcuoHumor Vitreo Retina/Coroiso (ng/ml +/- (ng/ml +/- des (ng/ml +/- S.E.) S.E.) S.E.) Conejo 1 Ojo izquierdo 2.6 +/- 0.4 0.7 +/- 0.2 209.1 +/- 7.5 (dosificado) Conejo 1 Ojo derecho 0.7 +/- 0.3 0.1 +/- 0.1 3.5 +/- 0.7 (no tratado) Humor AcuoHumor Vitreo Retina/Coroiso (ng/ml +/- (ng/ml +/- des (ng/ml +/- S.E.) S.E.) S.E.) Conejo 2 Ojo izquierdo 10.8 +/- 5.4 0.4 +/- 0.2 229.4 +/- 42.0 (dosificado) Conejo 2 Ojo derecho 0.3 +/- 0.1 0.4 +/- 0.1 63.9 +/- 1.8 (no tratado) Conejo 3 Ojo izquierdo 43.6 +/- 6.0 4.3 +/- 2.6 1086.6 +/- 20.7 (dosificado) Conejo 3 Ojo derecho 12.3 +/- 1.6 1.3 +/- 0.4 25.1 +/- 0.6 (no tratado) Conejo 4 Ojo izquierdo 12.3 +/- 1.4 0.7 +/- 0.2 88.1 +/- 4.2 (dosificado) Conejo 4 Ojo derecho 0.5 +/- 0.1 0.2 +/- 0.03 74.3 +/- 4.3 (no tratado) Los resultados de la Tabla 10 están redondeados hasta un lugar decimal.

S.E. = Error Estándar.

Las muestras de fluido lagrimal (lágrimas) se recolectaron a partir de los conejos justo antes de las dosis 2, 6, 10, así como 1 hora en seguida de la dosis final, y se muestran las concentraciones del dAb de a-TNF-aR1 detectadas en las muestras en la Tabla 8. El dAb de a-TNF-aR1 se detectó en todos los ojos izquierdos (dosificados), y también se presentó alguna transferencia a la mayoría de los ojos contralaterales (derechos, no dosificados.

Tabla 11 Concentraciones del dAb de a-TNF-aR1 en las muestras de fluido lagrimal (lágrimas): Ojo izquierdo Ojo derecho (dosificado) (Datos (contralateral) promedio para 4 (Datos promedio conejos) (pg/ml +/- para 4 conejos) S.E.) (pg/ml +/- S.E.) Antes de la 19.74 +/- 6.27 0.1 +/- 0.01 Segunda Dosis Antes de la Sexta 20.75 +/- 5.15 1.77 +/- 0.47 Dosis Antes de la Décima 21.83 +/- 5.81 1.11 +/- 0.41 Dosis Ojo izquierdo Ojo derecho (dosificado) (Datos (contralateral) promedio para 4 (Datos promedio conejos) (µ?/??? +/- para 4 conejos) S.E.) (pg/ml +/- S.E.) 1 Hora Después de 27.03 +/- 6.98 0.60 +/- 0.36 la Décima Dosis Los resultados de la Tabla 11 están redondeados hasta dos lugares decimales.

S.E. = Error Estándar.

Se recolectó sangre para el suero antes de la primera dosis y en el momento de la eutanasia. Los datos resultantes se muestran en la Tabla 9. Se detectaron bajas concentraciones del dAb de a-TNF-aR1 en el suero obtenido a partir de cada uno de los cuatro conejos 1 hora después de la dosis final.

Tabla 12 Concentraciones del dAb de a-TNF-aR1 en las muestras de suero Antes de la Primera 1 Hora Después de Dosis la Dosis Final (ng/ml +/- S.E.) (ng/ml +/- S.E.) Conejo 1 ND 0.36 +/- 0.21 Antes de la Primera 1 Hora Después de Dosis la Dosis Final (ng/ml +/- S.E.) (ng/ml +/- S.E.) Conejo 2 ND 0.44 +/- 0.18 Conejo 3 ND 0.51 +/- 0.08 Conejo 4 ND 1.02 +/- 0.12 Los resultados de la Tabla 12 están redondeados hasta dos lugares decimales.

ND = No Detectado.

S.E. = Error Estándar.

Claims (35)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un solo dominio variable de ¡nmunoglobulina que se enlaza a una molécula objetivo, para suministro ocular.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el único dominio variable de ¡nmunoglobulina es resistente a la proteasa, en donde la proteasa se selecciona a partir del grupo que consiste en: proteasa ocular, caspasas, calpaínas, metaloproteasas de matriz, desintegrinas, metaloproteinasas (ADAMs), y ADAM con motivos de trombospondina, proteasomas, activador de plasminógeno de tejido, secretasas, catepsina B, catepsina D, cistatina C, proteasa de serina PRSS1, y la senda de proteasoma de ubiquitina (UPP), para suministro ocular.

3. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual comprende un solo dominio variable de ¡nmunoglobulina que se enlaza a una molécula objetivo seleccionada a partir del grupo de: VEGF, TNFa, TNFaR, IL-1, IL-1r, TNFaFU, TGFbeta, IL-6, IL-8 IL- 7, IL-21, IL-23, CD20, Nogo-a, glicoproteína asociada con mielina (MAG), y Beta-amiloide, para suministro ocular.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el único dominio variable de ¡nmunoglobulina que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a: (a) la secuencia de aminoácidos del DO 15-26-593 (mostrada en la SEQ ID NO: 1) o (b) la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593-FC (SEQ ID NO: 2).

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina comprende valina en la posición 6, en donde la numeración es de acuerdo con Kabat.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina comprende leucina en la posición 99, en donde la numeración es de acuerdo con Kabat.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina comprende lisina en la posición 30, en donde la numeración es de acuerdo con Kabat.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia seleccionada a partir de: (a) la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593 (mostrada en la SEQ ID NO: 1), (b) la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593-Fc (mostrada en la SEQ ID NO: 2).

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a IL-1 comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a: (a) la secuencia de aminoácidos de DOM 4-130-54 (mostrada en la SEQ ID NO: 5); o a (b) la secuencia de aminoácidos de DOM 0400 PEG (mostrada en la SEQ ID NO: 4).

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a IL-1 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a: (a) la secuencia de aminoácidos de DOM 4-130-54 (mostrada en la SEQ ID NO: 5); o a (b) la secuencia de aminoácidos de DOM 0400 PEG (mostrada en la SEQ ID NO: 4).

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a a-TNF-aRI, comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de Dom 1h-131-206 (mostrada en la SEQ ID NO: 6).

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a a-TNF-aR1, comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica la secuencia de aminoácidos de Dom 1h-131-206 (mostrada en la SEQ ID NO: 6).

13. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual comprende además un dominio de una región constante de anticuerpo, en donde la región constante de anticuerpo es una región Fe de anticuerpo.

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la región Fe del anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de Fe mostrada en la SEQ ID NO: 3.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina está presente como una fusión con un Fe, y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de la fusión de DOM15-26-593-Fc (mostrada en la SEQ ID NO: 2).

16. Una composición que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina desnudo que se enlaza a una molécula objetivo para suministrarse a una o más de las regiones oculares seleccionadas a partir de: el humor vitreo, el humor acuoso, la retina y la coroides.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la molécula objetivo se selecciona a partir de VEGF, un antagonista de VEGF, TNFa, receptor de TNFa, IL-1, a-TNF-aR1, IL-6, IL-8, IL-17, IL-21, IL-23, Nogo-a, glicoproteína asociada con mielina (MAG), y Beta-amiloide.

18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina es resistente a la proteasa, en donde la proteasa se selecciona a partir del grupo de: proteasa ocular, caspasas, calpaínas, metaloproteasas de matriz, desintegrinas, metaloproteinasas (ADAMs), y ADAM con motivos de trombospondina, proteasomas, activador de plasminógeno de tejido, secretasas, catepsina B, catepsina D, cistatina C, proteasa de serina PRSS1, y la senda de proteasoma de ubiquitina (UPP).

19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina se selecciona a partir del grupo de: (a) un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a: (i) la secuencia de aminoácidos de DOM15-26- 593 (mostrada en la SEQ ID NO: 1) o (ii) la secuencia de aminoácidos de DOM15-26-593-Fc (mostrada en la SEQ ID NO: 2), (b) un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a IL-1 y comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a: (i) la secuencia de aminoácidos de DOM 4-130-54 (mostrada en la SEQ ID NO: 5); o a (ii) la secuencia de aminoácidos de DOM 0400 PEG (mostrada en la SEQ ID NO: 4); (c) un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a a-TNF-aR1, y que comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de Dom 1h-131-206 (mostrada en la SEQ ID NO: 6).

20. Una composición que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina formateado que se enlaza a una molécula objetivo para suministrarse a una o más de las regiones oculares seleccionadas a partir de: la retina, la coroides, y el fluido lagrimal.

21. La composición de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la molécula objetivo se selecciona a partir de: VEGF, un antagonista de VEGF, TNFa, receptor de TNFa, IL-1, a-TNF-aR1, IL-17, IL-21, IL-23, Nogo-a, glicoproteína asociada con mielina (MAG), y Beta-amiloide.

22. La composición de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina es resistente a la proteasa, en donde la proteasa se selecciona a partir del grupo de: proteasa ocular, caspasas, calpaínas, metaloproteasas de matriz, desintegrinas, metaloproteinasas (ADAMs), y ADAM con motivos de trombospondina, proteasomas, activador de plasminógeno de tejido, secretasas, catepsina B, catepsina D, cistatina C, proteasa de serina PRSS1, y la senda de proteasoma de ubiquitina (UPP).

23. La composición de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina se selecciona a partir del grupo de: (a) un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a: (i) la secuencia de aminoácidos de DOM15-26- 593 (mostrada en la SEQ ID NO: 1) o (ii) la secuencia de aminoácidos de DOM 15-26-593-Fc (mostrada en la SEQ ID NO: 2), (b) un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a IL-1 y comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a: (i) la secuencia de aminoácidos de DOM 4-130-54 (mostrada en la SEQ ID NO: 5); o a (ii) la secuencia de aminoácidos de DOM 0400 PEG (mostrada en la SEQ ID NO: 4); (c) un solo dominio variable de inmunoglobulina que se enlaza a a-TNF-aR1, y que comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 97 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de Dom 1h-131-206 (mostrada en la SEQ ID NO: 6).

24. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 23, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina tiene un peso molecular de alrededor de 50 KDa.

25. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 24, en donde el único dominio variable de inmunoglobulina se formatea mediante pegilación o fusión a un anticuerpo Fe.

26. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual comprende además uno o más potenciadores seleccionados a partir de: un potenciador de la penetración ocular y un potenciador de viscosidad.

27. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, la cual comprende además un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable.

28. Un método para suministrar una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 directamente al ojo, el cual comprende administrar la composición mencionada al ojo mediante un método seleccionado a partir del grupo de: suministro tópico al ojo, tal como mediante gotas para los ojos o inyección infraocular, administración peri-ocular, o mediante una formulación de liberación lenta.

29. Un método para el tratamiento, la prevención, o el diagnóstico de una condición de los ojos, el cual comprende administrar una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 directamente al ojo, mediante un método seleccionado a partir del grupo que consiste en: inyección intra-ocular, inyección intra-vítrea, suministro tópico al ojo, tal como mediante gotas para los ojos, o mediante administración peri-ocular, y una formulación de liberación lenta.

30. Un método de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29, en donde la composición se administra a una o más regiones del ojo seleccionadas a partir del grupo de: la superficie del ojo, los conductos lagrimales, las glándulas lagrimales, la región intra-ocular, la cámara anterior, la cámara posterior, y el humor vitreo.

31. Un método para suministrar una composición de acuerdo con las reivindicaciones 16 a 19 y 26 a 27, a una o más regiones del ojo seleccionadas a partir del grupo de: el humor vitreo, el humor acuoso, la retina, y la coroides, el cual comprende administrar la composición mencionada al ojo mediante suministro tópico, tal como utilizando gotas para los ojos.

32. Un método para suministrar una composición de acuerdo con las reivindicaciones 20 a 27 a una o más regiones del ojo seleccionadas a partir del grupo de: la retina, la coroides, y el fluido lagrimal, el cual comprende administrar la composición mencionada al ojo mediante suministro tópico, tal como utilizando gotas para los ojos.

33. Un proceso para producir una composición farmacéutica que comprende: (a) mezclar una composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 con (b) un vehículo, diluyente, o excipiente farmacéuticamente aceptable.

34. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la composición mencionada farmacéutica es para el tratamiento, la prevención, o el diagnóstico de una condición o una enfermedad de los ojos.

35. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la condición o enfermedad de los ojos mencionada se selecciona a partir del grupo de: degeneración macular relacionada con la edad (AMD), uveítis, glaucoma, ojo seco, retinopatía diabética, edema macular diabético, y Uveítis.